Programa de Ps-graduao Multicntrico em Qumicade

Minas Gerais Universidade Federal do Vale do Jequitinhonha e Mucuri

Isolamento e caracterizao de bactrias resistentes a

arsnio com potencial de aplicao em processos de

biorremediao.

Orientador: Prof. Dr. Jairo Lisboa Rodrigues

Co-orientadora: Prof.Dr.Cleide Aparecida Bomfeti

Aluna: Naidilene Chaves Aguilar

Tefilo Otoni, Fevereiro 2015

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I REVISO DA LITERATURA

1. Arsnio

O arsnico onipresente no ambiente e altamente txico para todas as formas de vida. um

"metalide" cristalino, um elemento natural com caractersticas intermedirias entre os metais e no-metais,

ocorre naturalmente como um elemento, classifica-se como a 20 maior ocorrncia de oligoelemento na crosta

da Terra, 14 na gua do mar, e 12 no corpo humano (MANDAL & SUZUKI, 2002).

O As pode ser encontrado em guas superficiais, guas subterrneas, sedimentos, solos e poeira, bem

como em plantas e animais (MAITY et al., 2004; BAIG et al., 2009; TUZEN et al., 2010). Ele est distribudo

em uma grande variedade de formas qumicas, podendo sofrer transformao por ao de microrganismos, por

mudanas nas condies geoqumicas ou envolver-se em outros equilbrios influenciados pela presena de

outros ons ou compostos no meio ambiente. Sabe-se que a toxicidade do As depende de sua forma qumica e

que as formas inorgnicas so mais txicas do que as espcies orgnicas, sendo que a trivalente (arsenito)

mais txica que a penta valente (arsenato) (TUZEN et al., 2010). O arsnio existe principalmente em quatro

estados de oxidao - arsenato(V ), Arsenito (III ), Arsnio ( 0 ), e arsina (-III ) Entre eles, o As V a forma

mais estvel ( SHARMA & SOHN, 2009 ; ZHAO et al, 2010. ; GUPTA et al, 2011. ) enquanto o AsIII

predominante no ambiente redox reduzido, sendo necessrio a especiao desse elemento para diferenciao

de suas formas.Assim como muitos elementos, o As tem um ciclo biogeoqumico (Figura 1) que envolve

diversos processos fsico-qumicos tais como xi-reduo, precipitao/solubilizao e adsoro/dessoro;

bem como biolgicos. A mobilizao do As pode ocorrer atravs de uma combinao de processos naturais,

tais como reaes de intemperismo, atividadebiolgica, emisses vulcnicas, e tambm por atividades

antropognicas.

Figura 1_Ciclo biogeoqumico do As no ambiente

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Aproximadamente 99% do As no ambiente esta associado a rochas eminerais. Ele est presente em

mais de 200 minerais, sendo que cerca de60% na forma de arsenato, 20% na forma de arsenossulfetos com

metais como Fe, Pb, Cu, Ag e Tl e o restante na forma de arsenitos, arsenetos, xidos e arsnio elementar

(MANDAL & SUZUKI, 2002; ASSIS, R., 2006). Ele e umelemento que apresenta alta afinidade pelo enxofre,

resultando em uma baixamobilidade para outros compartimentos ambientais quando como constituintede

minerais sulfetados (MANDAL & SUZUKI, 2002; FIGUEIREDO, 2010). Aliberao do As a partir das

rochas mineralizadas ocorre por oxidao da arsenopirita por O2 ou por Fe3+, por meio de processos biticos

ou abiticos (RODRIGUES, 2008).

Alguns fatores comobaixa porcentagem de granulometria fina do substrato, baixos valores de pH,calor

e exposio a gua e ao oxignio podem favorecer a oxidao domineral (ANDRADE et al., 2008), com

consequente liberao de As para asoluo do solo e para os cursos dgua, como mostra a Equao 1

(WELCH et al., 2000):

2FeAsS + 7O2 + 8H2O 2Fe(OH)3 + 2H3AsO4 + 2H2SO4 (Eq.1)

A principal fonte de As no ambiente (hidrosfera, pedosfera, biosfera e atmosfera) o lanamento a

partir de minrio, arsnio-enriquecido. O arsnio um dos elementos freqentemente associado

particularmente a minrios de ouro e prata, sendo o mais comum, a arsenopirita, que o principal minrio de

As (MANDAL & SUZUKI, 2002; DESCHAMPS & MATSCHULLAT, 2007). As fontes de As so naturais

ou atravs de dissoluo de compostos de As adsorvido em minrios de pirita na gua por fatores geoqumicos

e antropognicos atravs do uso de inseticidas, herbicidas e fertilizantes fosfatados, indstrias de

semicondutores, minerao e fundio pr-industrial, processos de combusto de carvo, conservantes de

madeira etc. (BUNDSCHUH et al, 2011.)

O arsnio pode ainda ser pr-enviado ao ambiente de vrias formas qumicas, tais como cido

monometilarsnico [MMA; CH3AsO(OH)2], cido dimetilarsnico [DMA; (CH3)2AsOOH], trimetil arsnio

xido [TMAO; (CH3)3AsO], arsenobetaine [AsB; (CH3)3 AsCH2COOH], arseno - colina [ASC], arsnio

acar [AsS], arsnio lipidis etc. ( TANGAHU et al.,2011 ).

Descobertas recentes sugeriram a seguinte ordem em termos de toxicidade aguda sendo como: MMA

(III) >As (III) >As (V) >DMA (V) >MMA (V), onde o metabolito do MMA (III) o composto mais txico e

alguns investigadores considerou ser o centro de modo de ao (EFSA, 2014 ;KILE et al., 2011 ; WEN et al,

2011. ).Com base em todas as evidncias que relacionam a ocorrncia de efeitos toxicolgicos crnicos e a

ingesto de gua contaminada por arsnio, vrios rgos governamentais de controle ambiental recomendam a

reduo nos limites mximos admissveis para arsnio em gua potvel.

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2.2. Contaminao por arsnio no Brasil

Amineraotemcontribudoparaa disperso ambiental de As e de outros elementos qumicos txicos

no ambiente. Umexemplodissoaaltaconcentraoemregiesdemineraocomooquadrilteroferrfero e

Amaznia(MATSCHULLAT,

2000).NoAmap(SerradoNavio),devidoatividademineradorademangans,ocorreu a contaminao de guas,

com valoresencontrados emguapotvel emtornode8,43g/L (SANTOS et al., 2003).

No Brasil, os primeiros registros de anlise da concentrao de arsnio no solo foram efetuados por

CURI & FRANZMEIER em 1987. Esses autores encontraram teores de As em Latossolo Vermelho

distrofrrico variando de 6 a 10mg kg-1. Teor mdio total de As de 5,92mg kg-1foi observado em 15

Latossolos localizados em reas experimentais da Embrapa e dois Latossolos do campus da UFLA, MG

(CAMPOS et al., 2007).

Em Minas Gerais, foram constatadas nas cidades de Nova Lima, Ouro Preto, Mariana e Santa Brbara

cursos de gua e aquferos com alta concentrao de As (at 7000 g L-1) (BUNDSCHUH et al., 2011).

Pesquisas realizadas com amostras de gua coletadas em minas subterrneas, poos artesianos e nascentes das

regies de Ouro Preto e Mariana, apresentaram concentraes de arsnio variando entre 2 a 2.980 g.L-1,

sendo que, na maioria das amostras, os valores so superiores ao valor mximo permitido para consumo

humano que de 10 g.L-1 (BRASIL, 2005) de arsnio (PIMENTEL et al., 2003).

Ainda em Minas Gerais, mais especificamente na cidade de Paracatu, a extrao mineral do ouro

iniciou suas atividades em meados de 1987 e, para sua extrao, so gerados rejeitos que contribuem

consideravelmente com a contaminao ambiental com As. O processo de minerao que ocorre na cidade de

Paracatu, conta com minrios que possuem um teor muito baixo de ouro, sendo aproximadamente 0,44 g de

ouro por tonelada de minrio. A composio mineral formada principalmente por sulfetos. Os

predominantes so arsenopirita (As) e pirita (ferro) com pirrotita (pirita magntica) e quantidades menores de

calcopirita (cobre), esfalerita (zinco) e galena (chumbo) (Costa Jnior, 1997). Para a recuperao do ouro, o

minrio britado, finamente modo e depois submetido a processos de separao gravimtrica e flotao, que

produzem um concentrado com a composio mdia de 58,3g de Au/t, 15.2% Fe, 21.9% S e 11% As. Esse

concentrado submetido a processos de hidrometalurgia, eletrlise e refino. Assim sendo, sempre h uma

grande quantidade de As no rejeito gerado com o beneficiamento para obteno do ouro.

A quantidade de As liberado das rochas da mina de ouro foi estimada em 300 mil toneladas, onde cerca de

70% esto em duas grandes barragens de rejeitos. Alm disso, em 2008 as concentraes de As detectadas no solo

de diferentes locais da cidade de Paracatu variaram entre 32 mg/kg a 2980 mg/kg (ONO et al., 2011). . Ono et al.

(2009, 2012a, 2012b) avaliaram a concentrao de As em solos prximos da rea de minerao no Morro do

Ouro e para efeitos de comparao tambm em uma rea afastada pertencente a uma Reserva Particular de

Preservao Natural (RPPN) no municpio. Na RPPN, a concentrao total de As foi de 25 mg/kg, acima do

valor de referencia de qualidade preconizado pelo CONAMA 420/2009 (3,5 mg/kg), j nas reas da mina, as

concentraes totais de As variaram de 200 a 1900 mg/kg, ultrapassando o limite para interveno em rea.

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Nota-se diferena significativa nas concentraes, mas deve-se perceber tambm que mesmo na RPPN, o

valor j e elevado, devido arsenopirita natural na regio. Essas elevadas concentraes podem aumentar o risco

da contaminao do ar, solo, gua e alimentos, comprometendo a sade da populao local.

A concentrao de As observada em alguns alimentos significativos amplamente varivel e

dependente de inmeros fatores. Em geral valores mdios desse elemento (em ng/g de peso mido) em peixes

podem variar entre 160 e 2.300 para peixes marinhos, ente 400 e 3.000 para crustceos (camaro), entre 20 e

500 para peixes de gua doce, e entre 200 e 500 para o arroz (JACKSON et al., 2012; BATISTA et al., 2011).

Dentre os alimentos de origem terrestre, o arroz tem significativa importncia, uma vez que capaz de

acumular esse elemento. Sendo um alimento capaz de concentrar o As e de amplo consumo, pois faz parte da

dieta bsica do brasileiro, o arroz contribui de maneira importante para a quantidade diria ingerida. Em

realidade existem muitas informaes sobre a concentrao de As e de suas formas qumicas principais no

arroz, mas muito pouca informao est disponvel sobre essa concentrao em seus produtos, como, por

exemplo, nos alimentos em que o arroz substitui o trigo (CUBADDA et al.,2010; BUNDSCHUH et al., 2012).

No Brasil, a anlise de 44 amostras de vrios tipos de arroz provenientes de diversas regies do Pas

mostraram concentraes mdias de As total de 222,8 ng/g, com cerca de 25% delas apresentando

concentraes superiores aos limites recomendados pelo Codex. As formas inorgnicas e o DMA foram as

espcies mais abundantes (BATISTA et al., 2011).

Por outro lado, o As geralmente encontrado em concentraes mais baixas no trigo (cerca de uma

ordem de grandeza menor) quando comparado ao arroz, mas no trigo predomina a forma inorgnica (at

70%). Isso corrobora a afirmao de que o trigo o maior contribuinte para a ingesto de As inorgnico

atravs da dieta, quando esta rica em seus derivados (CUBADDA et al., 2010; CODEX, 2012).

2.3.Biorremediao de Arsnio

Em solos contaminados por metais pesados, a biorremediao ocorre no sentido de transformar estes

metais em suas formas menos txicas ou inertes. Um dos grandes problemas da presena de metais pesados no

ambiente o fato de que eles no sofrem decomposio e, portanto, no podem ser destrudos. Alm disso,

eles so recalcitrantes e podem acumular nos seres vivos, causando distrbios nas cadeias alimentares

(GUEDES, 2011). Os metais representam um fator de estresse comunidade microbiana presenteno ambiente

impactado, podendo, inibir completamente as atividades metablicas dosorganismos. (LIVREMONT et al.,

2009).

A aplicao de processos biotecnolgicos envolvendo microrganismos com o objetivo de solucionar

ou minimizar problemas de poluio ambiental com metais txicos, tem se tornado crescente. So diversos os

mecanismos microbianos de remoo do arsnio, que podem ocorrer por adsoro, desmetilao,

biometilao, complexao, coprecipitao, e processos de oxido-reduo (TEWARI et al., 2009).

De modo geral, a remoo de metais pode ocorrer por mecanismos de adsoro na superfcie

microbiana. Essa adsoro resulta na interao entre foras atrativas que podem ser fsicas ou qumicas. A

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interao fsica envolve foras de van der Walls, e a qumica atravs de ligaes covalentes entre constituintes

funcionais presentes na parede celular bacteriana e o metal (FARAHAT et al., 2010).

Alm disso, existem polmeros bacterianos de superfcie que podem complexar ons metlicos. Entre

os principais polmeros da parede celular bacteriana envolvido em processos de adeso a minerais esto os

exopolissacardeos (EPS) que permitem o aprisionamento fsico de metais e a complexao de espcies

solveis por constituintes carregados dos polmeros (KIM et al., 2010; REN et al., 2010).

Estudos indicam ainda, que as atividades de algumas enzimas bacterianas tambm esto relacionadas

com a tolerncia a alguns metais, alm de exercer um importante papel de proteo por meio de aes

antioxidantes que evitam danos oxidativos celulares que podem ocasionar at a morte celular (AZCON et al.,

2010; MARTINS et al., 2010). As bactrias que utilizam os ons arsenato no processo de respirao anaerbia,

(bactrias redutoras de arsenato) apresentam o gene arrque codifica a enzima As5+ redutase que reduz o As5+

a As3+. As bactrias oxidantes de arsenito possuem o gene aoxque codifica a enzima As3+ oxidase,

responsvel pela oxidao do As3+ a As5+ (LIVREMONT, 2009).

O processo de bioacumulao ou acumulao intracelular de metais, ocorre via metablica e dentro

das clulas os metais podem sofrer transformaes como biometilao, desmetilao, complexao,

coprecipitao e processos de oxidao/reduo sendo ento convertidos em formas menos txicas (WANG &

ZAO, 2009).

O processo de bioacumulao mais lento que a biossoro superficial, no entanto, esse processo tem

se mostrado muito eficiente e a utilizao combinada desses dois permite aumentar o percentual de remoo

bacteriana do metal (VELSQUEZ e DUSSAN, 2009).

O uso de bactrias para a remediao de ambientes contaminados com arsnio desde recursos

aquferos, solos, lavras de minas e efluentes parece ser portanto, uma alternativa promissora, pois a biomassa

microbiana apresenta maior facilidade de tratamento e descarte em comparao com os demais organismos

vivos como as plantas, por exemplo. Alm disso, essa biomassa pode ser ainda utilizada em processos de

obteno do metal para aplicaes industriais (HUISMAN et al., 2006; MORIN et al., 2008).

Desse modo, a utilizao de bactrias no processo de biorremediao de ambientes contaminados com

metais txicos tem despertado um interesse tanto acadmico como de empresas ligadas ao ramo da minerao

e metalurgia, uma vez que as bactrias apresentam uma ampla diversificao metablica, possibilitando

inmeros estudos relacionados a esse grupo.

II OBJETIVOS E JUSTIFICATIVA

Geral

O presente trabalho tem como principal objetivo o isolamento, a identificao e a caracterizao de bactrias

resistentes ao Arsnio presentes em amostras de solo coletadas ao longo do Crrego Rico no municpio de

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Paracatu/MG, visando uma potencial aplicao na biorremediao de ambientes contaminados, utilizando a

tcnica da Espectrometria de Massas com Plasma Acoplado Indutivamente (ICP-MS).

Especficos

Este projeto possui metas bem determinadas que vo desde:

1 Isolar bactrias presentes em amostras de solo coletadas ao longo do Crrego Rico no municpio de Paracatu/MG.

2- Testar a capacidade de crescimento desses isolados durante o cultivo em meio contendo arsnio com

concentraes crescentes desse elemento.

3 Identificar os isolados com crescimento potencial em altas concentraes de arsnio por meio do sequenciamento do gene 16S rRNA.

4 Avaliar a capacidade dos isolados bacterianos em oxidar o arsnio.

5- Determinar a concentrao de As nos isolados de bactrias, no solo, nos exopolissacardeos, bem como no

meio de crescimento dos microrganismos.

6- Avaliar a capacidade das bactrias isoladas em acumular arsnio na clula e nos exopolissacardeos.

A alta toxicidade de As para homens e animais, aliado pequena disponibilidade de informao sobre

comportamento do arsnio em solos tropicais gera a necessidade de estudos do comportamento qumico do

arsnio nesses solos que possam auxiliar na mitigao de reas contaminadas com esse metal e sua interao

com micro-organismos ali presentes. Compreender estas relaes importante, pois podem promover avanos

biotecnolgicos no uso de bactrias para biorremediao. O isolamento e o estudo de bactrias resistentes ao

arsnio esto se tornando promissores e de grande importncia qumica, cientfica, tecnolgica e ambiental,

pois criam interessantes perspectivas para o desenvolvimento de biorreatores para aplicao em processos de

biorremediao de efluentes contaminados, como os lanados nas bacias de rejeitos nas mineradoras de

extrao de ouro como ocorre no municpio de Paracatu/MG.

III MATERIAIS E MTODOS

5.1. rea de Estudo e Amostragem

Sero escolhidos cinco pontos de coleta ao longo do Crrego Rico, desde a proximidade da sua nascente

(regio limite da entrada da mineradora KinRoss) at pontos mais distantes e prximos do ponto de desgua

no rio Paracatu. As amostras de solo sero coletadas na profundidade de 0-20 cm, e armazenadas em sacos

plsticos estreis (marca NASCO), que sero posteriormente mantidos sob refrigerao. Parte das amostras

sero utilizadas para posterior anlise qumica e outra parte para o isolamento de bactrias resistentes.

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5.2. Anlises Qumicas

Para determinao da concentrao de arsnio, as amostras de solo sero submetidas extrao cida

(cido ntrico concentrado e sub-destilado) por trs horas em bloco digestor 120oC(MEHARG and

RAHMAN, 2003), para posterior anlise. Para a determinao de As no solo, ser utilizado o mtodo analtico

proposto por (LAWRENCE et al., 2006), utilizando espectrmetro de massas com plasma acoplado

indutivamente (ICP-MS), modelo NexIon (PerkinElmer). A tcnica de ICP-MS fundamenta se no uso de altas

temperaturas do plasma para gerao de ons positivamente carregados (M+),a amostra introduzida num

plasma de argnio sob a forma de um aerossol de partculas lquidas muito pequenas. Para o efeito usa-se uma

bomba peristltica, um nebulizador e uma cmara de nebulizao. No seio do plasma (8000 - 9000oC) o

solvente evaporado e os componentes da amostra so decompostos nos seus tomos, que depois se ionizam,

os quais so posteriormente separados em um espectrmetro de massa e, finalmente conduzidos ate o detector.

A tcnica de IPC-MS tem como principal vantagem a possibilidade de anlise multielementar (isotpica)

seqencial rpida, associada a alta sensibilidade. Cerca de 90% dos elementos da tabela peridica podem ser

determinados, com limites de deteco na ordem de 0,001 a 0,1 g L-. O maior problema no preparo de uma

amostra para anlises na faixa de g L-1 o risco de contaminao, devido a diferentes causas. Uma adequada

tcnica de decomposio dever, de uma maneira geral, ser eficiente, evitando erros sistemticos provenientes

de contaminao, sendo por este motivo, importante o uso de reagentes de alta pureza (incluindo a gua

utilizada nas diluies) utilizados em tcnica de ICP-MS.

Sero utilizados reagentes de elevado grau de pureza, no mnimo grau analtico P.A, exceto o HNO3

que foi previamente purificado utilizando um destilador sub-boiling de quartzo Kurner (Analysentechnik,

Rosenheim, Alemanha) para eliminao de impurezas. Para o preparo das solues foi utilizado gua do Tipo

I (ultrapura) obtida em sistema de purificao Milli-Q Gradiente (Millipore, Bedford, USA).

Os frascos e todos os materiais utilizados no preparo das solues receberam limpeza cuidadosa com

HNO3 15%, enxaguados em gua do Tipo I e posteriormente secos em capela de fluxo laminar antes do uso,

pois a anlise de baixas concentraes de metais em qualquer matriz requer uma limpeza especial do material

a ser utilizado no preparo das amostras e armazenamento das solues.

5.3. Culturas de Enriquecimento e Isolamento de Bactrias

Uma alquota de 5 gramas de cada amostra de solo ser adicionada em um frasco contendo 100 mL de

meio PCA (5 g de triptona, 2,5g de glicose e 2,5 g de extrato de levedura por litro de gua destilada) e 6,75

mmol/L de arsenito de sdio (NaAsO2). Os frascos sero em seguida incubados a temperatura de 30 C em

condies estticas no escuro. Aps 2 semanas de cultivo as culturas turvas sero estriadas em placas de Petri

contendo o mesmo meio de cultura suplementado com arsnio utilizado anteriormente. Colnias bacterianas

apresentando diferentes formas, cores e bordas sero purificadas por estriamento e armazenadas a -80 C em

uma soluo de 30% de glicerol.

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5.4. Determinao da Concentrao Mnima Inibitria

As bactrias resistentes a arsnio isoladas de amostras de solo tero sua concentrao mnima

inibitria (MIC) de arsnio determinadas. Cada estirpe crescer em 30 mL de meio PCA sob agitao orbital

de 100 rpm a 30 oC. Aps 24 horas de crescimento, uma alquota de 1 mL de cultura de cada estirpe ser

transferida para microtubos de 1,5 mL esterilizados, e centrifugada a 8.000 rpm, a 25 oC, por quatro minutos.

O sobrenadante ser descartado, e as clulas sero ressuspensas em 1mL de soluo salina estril (NaCl 8,5

g/L) e centrifugadas novamente, repetindo este processo de lavagem por trs vezes. Posteriormente, alquotas

de 20 L de suspenses de clulas lavadas sero inoculadas e estriadas com ala de platina em placas

contendo meio mnimo de acetato (NH4Cl, 1.0g/L; CaCl2.H2O, 0.001g/L; MgSO4.7H2O, 0.2g/L; FeSO4

.7H2O, 0.001g/L; acetato de sdio, 5g/L; extrato de levedura, 0.5 g/L; K2HPO4, 0.5g/L) suplementado com

diferentes concentraes de arsnio variando de 0 a 133,47 mmol/L de arsenito de sdio. Para avaliar a

susceptibilidade dos isolados ao arsnio ser determinada a concentrao mnima inibitria (MIC) a qual

definida como a menor concentrao na qual no ocorreu a formao de unidades formadoras de colnias

(UFC) visveis, aps 3 dias de incubao a 30 oC. Nesta etapa do estudo ser determinado o nmero de

isolados que apresentaram crescimento em cada concentrao de metal a partir de trs repeties.

5.6. Identificao dos Isolados Bacterianos

Para a identificao molecular dos isolados bacterianos, o DNA genmico ser extrado utilizando-se

kits comerciais, e o gene 16S rRNA ser amplificado utilizando os primers (foward

5AAACTCAAATGAATTGACGG3e reverse 5ACGGGCGGTGTGTAC3). A reao de PCR ser

realizada por uma desnaturao inicial de 94 C por 5 minutos seguidos de 35 ciclos de desnaturao a 94 C

por 1 minuto, anelamento a 55 C por 1 minuto, extenso a 72 C por 2 minutos e extenso final a 72 c por 5

minutos. Aps confirmao da amplificao do gene em gel de agarose 1% o produto ser enviado para

sequenciamento para a empresa Macrogen (Korea). Os resultados dos fragmentos de bases obtidos sero

comparados aos previamente depositados no Genbank (NCBI), sendo possvel a determinao do nvel de

similaridade com vrios isolados bacterianos descritos na literatura.

5.7. Oxidao do arsnio pelos isolados bacterianos

A habilidade dos isolados bacterianos em oxidar o arsenito ser testada atravs da adio desse

composto em meio mnimo de acetato na concentrao de 100 g/mL de arsnio. O meio de cultura controle

ser feito, porm sem a adio do isolado bacteriano. As culturas sero incubadas por 24 horas a 30 C sendo

as clulas separadas do meio por centrifugao a 14000 rpm por 10 minutos e lavadas 2 vezes em tampo

fosfato 50mM e resuspendidas em 5mL desse tampo. As clulas sero ento rompidas por sonicao a 4 C

por 15 segundos e centrifugadas a 14000 rpm por 1 hora a 4 C. O pellet resuspendido em tampo fosfato

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representar a frao membranosa enquanto que o sobrenadante a frao solvel. A atividade da arsenito

oxidase ser determinada de acordo com a metodologia descrita por Anderson et al., (1992). A concentrao

de protena ser determinada pelo mtodo de Lowry (1951) depois da hidrlise das clulas em 0,4 N de NaOH

a 100 C por 10 minutos. Albumina bovina ser utilizada como padro.

5.8. Avaliao da capacidade de acumular arsnio pelas clulas bacterianas

Os isolados sero pr-cultivados em Meio Mnimo de Acetato a 30 oC por 24 horas sob agitao. Uma

alquota de 1mL da pr cultura ser transferida para 100 mL de meio com a concentrao mnima inibitria de

arsnio tolerada pelos isolados com maiores potenciais para emprego nos processos de biorremediao. Aps

cultivo a 30 oC por 72 horas sob agitao, as culturas sero centrifugadas a 10000 rpm por 20 minutos, sendo

o pellet bacteriano posteriormente lavado trs vezes com gua deionizada antes de ser usado para os

experimentos de biosoro. O pellet ser digerido em um tubo digestor usando HNO3 segundo a metodologia

de USEPA 3050B. A concentrao do arsnio ser determinada por um espectrmetro de massas com plasma

acoplado indutivamente (ICP-MS), modelo NexIon (PerkinElmer) (Perkin-Elmer).

5.9. Avaliao da produo de Exopolissacardeos (EPS) pelas bactrias isoladas

A extrao do EPS ser realizada para os isolados em meio Mnimo de acetato lquido suplementado

com as concentraes mnimas inibitrias determinadas previamente para cada isolado com potencial para

biorremediao. O EPS ser extrado do meio de cultura na fase estacionria do crescimento bacteriano

atravs de centrifugao a 13000 g, 4C por 30 min. Ao sobrenadante ser adicionado o mesmo volume de

etanol gelado, sendo posteriormente mantido por 24 horas em repouso sob refrigerao para precipitao do

EPS. Aps a filtragem e coleta do EPS, este ser mantido em estufa de secagem por 48 horas a 70 C. A

produo do EPS total ser avaliada pelo peso seco do produto, por peso seco das clulas.

IV FASES DO TRABALHO E CRONOGRAMA DE EXECUSO

As etapas do projeto proposto seguiro o seguinte cronograma:

Atividades Meses

3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36

1 X X X

2 X X X X

3 X X X X X

4 X X X

5 X X X X X X X X

11

6 X X X X X

7 X X X X X X X X X X X X

8 X X X X X X X X X X X X

9 X X X X X X X X X X

1 Coletas e anlises qumicas das amostras de solo.

2 Isolamento de bactrias resistentes a arsnio.

3 Determinao da concentrao mnima inibitria para os isolados bacterianos.

4 Identificao dos isolados bacterianos.

5 Determinaes da capacidade de oxidao do arsnio pelos isolados bacterianos.

6- Determinao da concentrao de As no solo, bactrias, Exopolissacardeos, meio de cultura por ICP-MS

7 - Determinao da produo de exopolissacardeos e capacidade das clulas em acumular arsnio.

8 Anlise dos resultados.

9-Elaborao de dissertao, e artigos cientficos.

Os resultados obtidos nessa pesquisa sero apesentados em revistas de alto fator de impacto, na rea

de Qumica Ambiental tais como Environmental Research, Journal of Hazardous Materials, Talanta e outras.

V REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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