UNIVERSIDADE DO OESTE PAULISTA– UnoesteCURSO DE FARMÁCIA

AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DO SISTEMA GLUTAMATÉRGICO NO EFEITO ANTIDEPRESSIVO DO EXTRATO DE ERVA MATE (Ilex paraguariensis) EM

CAMUNDONGOS

PRESIDENTE PRUDENTE2015

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AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DO SISTEMA GLUTAMATÉRGICO NO EFEITO ANTIDEPRESSIVO DO EXTRATO DE ERVA MATE (Ilex paraguariensis) EM

CAMUNDONGOS

Projeto de pesquisa apresentado como exigência para obtenção de bolsa de pesquisa Universidade do Oeste Paulista – Unoeste, sob orientação do professor MSc.

PRESIDENTE PRUDENTE2015

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SUMÁRIO

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1. APRESENTAÇÃO

A depressão é um transtorno grave e debilitante que afeta milhões de

pessoas em todo o mundo. É caracterizada por permanente tristeza, anedonia,

culpa, baixa auto-estima, distúrbios do sono, falta de concentração e pensamentos

suicidas. A Organização Mundial da Saúde elegeu a depressão maior como a quarta

causa de incapacidade em 1990 e acredita que em 2020, este transtorno de humor

seja o segundo causador de incapacidades em todo o mundo. Pacientes acometidos

por depressão maior ou transtorno bipolar apresentam uma taxa de suicídio em

torno de 15%, de forma que estes transtornos promovem sofrimento incalculável,

prejuízos funcionais que limitam a vida social do paciente e acarretam altos custos

financeiros.

A observação de que os sintomas clínicos dos pacientes com depressão são

influenciados com a manipulação farmacológica do sistema monoaminérgico trouxe

a hipótese de que a depressão resulta de uma deficiência funcional ou quantitativa

das monoaminas, em especial da serotonina e noradrenalina em regiões cerebrais.

Esta idéia suportou por mais de meio século a hipótese monoaminérgica da

depressão, e apoiados nesta teoria os antidepressivos comumente utilizados na

clínica foram desenvolvidos. Porém a hipótese monoaminérgica, por si só não pode

explicar a neuropsicofarmacologia da depressão, nem tão pouco o mecanismo de

ação dos antidepressivos clássicos, uma vez que apesar dos antidepressivos

utilizados na clínica aumentam os níveis das monoaminas em minutos ou horas, o

efeito terapêutico só é observado depois de algumas semanas. Em concordância,

apenas cerca de 50-60% dos pacientes com depressão atingem a remissão dos

sintomas clínicos com o primeiro antidepressivo clássico utilizado. Estas

inconsistências aliadas ao fato da manipulação de outros sistemas de

neurotransmissores, como o glutamatérgico, desencadearem efeito antidepressivos

abriram espaço para a pesquisa de novas estratégias no tratamento dessa doença.

Medicamentos que afetam o sistema glutamatérgico, podem desencadear um

efeito antidepressivo, tanto em animais, como em humanos. Além disso, apesar dos

antidepressivos clássicos desencadearem efeito terapêutico apenas após semanas

de uso, baixas doses de ketamina, um modulador do sistema glutamatérgico,

desencadeia efeito antidepressivo rápido e sustentado por uma semana com apenas

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uma administração. Apesar dessas vantagens, pequeno avanço no desenvolvimento

de drogas que modulem o sistema glutamatérgico tem sido feito, muito

provavelmente pela grande quantidade de efeitos colaterais desencadeados por

essas substâncias o que leva a busca por novas substâncias com atividade

antidepressiva.

A erva-mate (Ilex paraguriensis) tem sido extensivamente utilizada como

bebida nos países da América Latina e principalmente no sul do Brasil. É uma planta

com grande quantidade de compostos químicos identificados e efeitos benéficos

relatados. As ações do extrato de erva-mate no Sistema Nervoso Central (SNC) já

foram demonstradas por alguns pesquisadores, e o saber popular aponta para os

benefícios do uso da bebida preparada com as folhas da erva-mate no bem estar

psicológico.

Desta forma, este projeto tem como objetivo avaliar o efeito antidepressivo do

extrato aquoso de erva-mate em camundongos e a participação do sistema

glutamatérgico neste efeito.

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2. JUSTIFICATIVA

A depressão é uma doença crônica e recorrente que afeta cerca de 20% da

população mundial (YAN et al., 2010) acarreta em considerável morbidade

psiquiátrica, pode levar ao suicídio, perda de produtividade (EBMEIER et al., 2006) e

maior utilização de serviços de saúde (NEMEROFF, 2007). Os antidepressivos são a

classe de fármacos que tem sido amplamente utilizado nas últimas quatro décadas

para o tratamento da depressão. Uma variedade de drogas antidepressivas atua por

diferentes mecanismos, incluindo os sistemas serotonérgico, adrenérgico e

dopaminérgico (WONG e LICINIO, 2001). Contudo, os antidepressivos

convencionais produzem vários efeitos colaterais e requerem várias semanas de

tratamento para produzir efeito terapêutico (NESTLER et al., 2002). Desta forma, é

de interesse o desenvolvimento de terapias antidepressivas alternativas ou de

substâncias que possam aumentar a eficácia clínica no tratamento da depressão.

A erva-mate (Ilex paraguariensis) é uma planta popular em países da América

Latina, e foi introduzida a alimentação de regiões como o Brasil pelos nativos

guaranis por suas propriedades medicinais e também por uma questão cultural

(BRACESCO et al., 2011). Muitas propriedades medicinais dos extratos de erva-

mate têm sido relatadas, entre elas efeitos em nível de SNC. Estudos pré-clínicos

demonstraram o efeito desses extratos em nível de memória e aprendizado

(PREDIGER et al., 2008), e o conhecimento etnofarmacológico sugere a utilização

do “mate” como co-adjuvante no tratamento de transtornos do humor.

Assim, sendo a depressão uma doença de alta incidência mundial, cuja

terapia disponível para a remissão dos sintomas neuropsicológicos é pouco

satisfatória e considerando a erva-mate como uma potencial estratégia terapêutica

devido aos seus efeitos medicinais relatados ao longo dos anos, este projeto é

justificado. Considera-se ainda a necessidade do estudo dos efeitos de uma bebida

largamente utilizada por todo Brasil, contribuindo para o entendimento dos

mecanismos envolvidos nos efeitos benéficos dessa bebida. Ainda, uma vez que o

extrato aquoso de erva-mate seja capaz de desencadear efeito antidepressivo em

animais, é interessante ressaltar as vantagens da utilização das plantas medicinais

no tratamento de doenças em geral, não somente pela facilidade ao acesso, como

também pelo custo e pela aceitação.

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3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o efeito tipo-antidepressivo da administração aguda de extrato aquoso

de erva-mate (Ilex paraguariensis) em camundongos e a participação do sistema

glutamatérgico.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar o efeito tipo-antidepressivo da administração aguda do extrato aquoso

de erva-mate (Ilex paraguariensis) a camundongos submetidos ao TNF e ao

TSC;

Determinar o envolvimento do receptor NMDA no efeito tipo-antidepressivo

decorrente da administração aguda do extrato aquoso de erva-mate (Ilex

paraguariensis) a camundongos;

Estudar o envolvimento da NOS no efeito tipo-antidepressivo decorrente da

administração aguda do extrato aquoso de erva-mate (Ilex paraguariensis) a

camundongos;

Investigar o efeito da administração aguda do extrato aquoso de erva-mate

(Ilex paraguariensis) a camundongos nos níveis corticais e hipocampais de

NO.

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4. PRINCÍPIOS E FUNDAMENTOS

4.1 DEPRESSÃO

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 450 milhões de indivíduos

tem problemas mentais e psicossociais (BORDIN, 2006). A depressão é considerada

como problema de saúde pública, econômico e social. As pessoas com depressão

desencadeiam sentimento de inferioridade, contínua alteração do humor e rejeição

social, prejudicando suas relações pessoais (PETERSON, 2007) . Alguns fatores

estão relacionados ao aparecimento da depressão, entre eles: estresse, relações

conflituosas, desemprego, dificuldades financeiras, baixa renda e escolaridade além

de divórcio (MESQUITA, 2005; ZANATTA et al. 2010).

A depressão pode ser caracterizada como um transtorno mental do humor

que ocorre em todas as faixas etárias. Por razões ainda pouco esclarecidas vem se

tornando mais frequente. Estima-se que de 30 a 50% dos pacientes com depressão,

não se recuperam totalmente com a utilização de medicamentos para este fim

(ROZENTHAL,2004). Segundo WHO (2001,p.9), “A depressão grave é atualmente a

principal causa de incapacitação em todo mundo”, e ocupa o quarto lugar entre as

dez principais causas de doenças, a nível mundial (BARBOSA, 2011).

O fator genético-hereditário está presente nesta doença, que quando não

tratada corretamente, pode perdurar por muito tempo, com sério risco à vida,

trabalho, família e lazer, podendo acarretar em alto risco de suicídio (LAFER et al.,

2000).

Regiões do encéfalo como o córtex pré-frontal, córtex cingulado anterior,

complexo amigdalóide, giro parahipocampal e hipocampo estão envolvidas no

processamento da emoção e na integração desta com a cognição e as funções

viscerais (FRANGOU, 2006). A depressão está associada a alterações morfológicas

dessas regiões, como atrofia, vulnerabilidade seletiva a morte celular de neurônios

regionais, alterações neuroquímicas, mudanças na sinalização intracelular e na

expressão gênica (TSANKOVA et al., 2007). A patofisiologia da depressão envolve

fatores genéticos e ambientais que contribuem para a vulnerabilidade de um

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indivíduo ao desenvolvimento da depressão de forma que a etiologia e a

neurobiologia destes transtornos ainda não se encontram totalmente elucidados

(SHALTIEL et al., 2007).

A teoria de monoaminérgica da depressão (HENDLEY e SNIDER,1968) ainda

é a mais aceita para explicar a etiologia e a patogênese da depressão, atribuindo

esta psicopatologia a um prejuízo na neurotransmissão serotonérgica e

noradrenérgica e mais recentemente, dopaminérgica (KAPUR & MANN,1992). A

ação de antidepressivos tricíclicos (TCAs) e inibidores da monoamina oxidase

(MAOIs), eficazes em aumentar os níveis das monoaminas e o fato de drogas como

a reserpina induzirem depressão, suportaram por mais de meio século a hipótese

monoaminérgica da depressão, e apoiados nesta teoria os antidepressivos

comumente utilizados na clínica foram desenvolvidos (ORDWAY et al., 1999).

A primeira substancia antidepressiva foi identificada por acaso, em 1950.

Observou-se uma melhora do humor em pacientes que estavam sendo tratados com

medicamentos para tuberculose. Um derivado deste medicamento, um inibidor da

enzima monoamina oxidase (IMAO) – iproniazida - mostrou sua capacidade de

reduzir os sintomas depressivos, formando assim a primeira farmacoterapia efetiva

para este distúrbio. Depois os TCAs, inicialmente usado como anti-histamínicos,

foram usados na clínica para tratar transtornos depressivos. Outras classes de

drogas como antidepressivos, betabloqueadores, antipsicóticos e estratos de

espécies vegetais, têm sido utilizadas com sucesso em alguns casos. (FERREIRA,

2010).

A descoberta dos alvos moleculares para a primeira geração de

medicamentos antidepressivos levou ao desenvolvimento das drogas da segunda e

terceira geração, tais como os inibidores seletivos da recaptação de serotonina

(ISRS). Todos estes fármacos agem com o mesmo mecanismo farmacológico,

chamado monoaminérgico, caracterizado pela reversão do déficit que leva ao estado

de depressão. Estes fármacos exercem seu efeito antidepressivo por aumentarem a

disponibilidade de monoaminas na fenda sináptica, por inibirem sua recaptação,

agindo direta e indiretamente nos sistemas transportadores pré-sinápticos, ou por

inibirem a degradação dos mediadores (MANN,1999; PAUWELS, 2000).

A hipótese monoaminérgica, por si só não pode explicar a

neuropsicofarmacologia da depressão, nem tão pouco o mecanismo de ação dos

antidepressivos clássicos (SANACORA et al., 2012), e algumas inconsistências

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nesta teoria tem sido apontadas. Os antidepressivos utilizados na clínica aumentam

os níveis das monoaminas em minutos ou horas, enquanto o efeito terapêutico só é

observado depois de algumas semanas (RACAGNI e POPOLI, 2008). Em

concordância, apenas cerca de 50-60% dos pacientes com depressão atingem a

remissão dos sintomas clínicos com o primeiro antidepressivo clássico utilizado

(TRIVEDI et al., 2006). Ainda, o fato de que nem todas as drogas que aumentam os

níveis de monoaminas são necessariamente efetivas no tratamento da depressão dá

consistência à idéia da necessidade de outros sistemas neurotransmissores

envolvidos tanto na neurobiologia da depressão, quanto no mecanismo de ação dos

antidepressivos (LANNI et al., 2009). O sistema glutamatérgico, tem sido apontado

como responsável pelo efeito dos antidepressivos clássicos, uma vez que, apesar

desses medicamentos atuarem através do aumento rápido dos níveis das

monoaminas, parece que esta classe de medicamentos converge em última

instância para a regulação da plasticidade sináptica e do processo de informações

mediados por receptores de glutamato (SANACORA et al., 2008).

4.2 SISTEMA GLUTAMATÉRGICO

O sistema glutamatérgico envolve uma série de receptores que são ativados

pelo aminoácido glutamato que por sua vez é o principal neurotransmissor

excitatório e sinalizador químico utilizado no SNC. A exposição a eventos

estressores promove aumento na liberação de glutamato no cérebro.

Esse neurotransmissor pode se unir a uma grande variedade de receptores,

os quais são denominados ionotrópicos e metabotrópicos (GASIC e HOLLMAN,

1994). Os receptores ionotrópicos são uma família de canais iônicos caracterizados

de acordo com seu agonista mais seletivo: N-metil-D-aspartato (NMDA), alfa-amino-

3-hidróxi-metilisoxazole-propionato (AMPA) e kainato (Ka). Os receptores

metabotrópicos acoplam-se a proteínas ligantes de nucleotídeos da guanina

(proteínas-G) e modulam efetores intracelulares, como a hidrólise de fosfolipídeos

de membrana (Grupo I) e a atividade da adenilato ciclase (Grupos II e III)

(DUVOISIN et al., 1995). Em excesso, a liberação de glutamato leva a

despolarização da membrana celular, ativação de receptores permitindo assim a

entrada de Ca++ e conseqüente ativação de diversas rotas enzimáticas que

culminam em morte celular. Além disso, o influxo massivo de Ca++ aumenta a

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formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) pela ativação da enzima

dependente de cálcio-calmodulina, a óxido nítrico sintase (NOS), e a sobrecarga de

cálcio mitocondrial, o que contribui para o desequilíbrio da homeostase celular

(CAMACHO e MASSIEU, 2006). A NOS ativada produz óxido nítrico (NO) a partir da

L-arginina. Uma vez formado, o NO pode ainda interagir com o radical livre

superóxido levando a formação de peroxinitrito, um potente oxidante, que pode

causar nitração e/ou oxidação de proteínas, peroxidação de lipídeos e dano direto

ao DNA, levando a morte celular (RADI et al.,1991a; RADI et al., 1991b)

A modulação do sistema glutamatérgico, tem sido relatada como uma

interessante e promissora estratégia no tratamento da depressão (MACHADO-

VIEIRA, MANJI, ZARATE, 2009). Estudos post mortem demonstraram níveis

aumentados de glutamato no plasma (MAURI et al., 1998), no fluido cerebroespinhal

(FRYE et al., 2006) e no tecido cerebral (FRANCIS et al., 1989) de indivíduos com

transtornos do humor.

Estudos pré-clínicos têm demonstrado que medicamentos que afetam o

sistema glutamatérgico, podem desencadear um efeito antidepressivo, tanto em

animais (YILMAZ et al., 2011), como em humanos (LI et al., 2010). Antagonistas

não-competitivos do NMDA como a memantina e a amantadina, já demonstraram

efeitos antidepressivos em estudos prévios com humanos (FERSZT et al., 1999).

Além disso, a administração de uma única dose de ketamina, outro antagonista não

competitivo do NMDA, é capaz de desencadear um efeito antidepressivo rápido e

sustentado por pelo menos alguns dias (VALENTINE et al., 2011).

Ainda, muitos trabalhos têm demonstrado que a inibição da NOS pode,

dependendo da dose, promover um efeito tipo-antidepressivo (KASTER et al., 2005;

ZENI et al., 2011). Desta forma, acredita-se que a via de sinalização NMDA-L-

arginina-NO desempenha um importante papel na patofisiologia da depressão, como

também no mecanismo de ação dos antidepressivos (ZOMKOWSKI et al., 2010).

Apesar de consistentes evidências apontarem para o envolvimento do

sistema glutamatérgico na patofisiologia da depressão, um pequeno progresso no

desenvolvimento de medicamentos que atuem modulando este sistema foi realizado,

o que pode ser atribuído aos efeitos colaterais decorrentes da sua utilização. Deste

modo o entendimento de substâncias que atuem modulando este sistema

apresentam-se como uma promessa substancial no tratamento de transtornos do

humor.

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4.3 ERVA MATE (Ilex paraguariensis)

A erva mate (Ilex paraguariensis A.St.-Hil), pertence á família botânica

Aquifoliacea, é uma árvore nativa do Sul da América do Sul, cultivada no Paraguai,

Argentina, Uruguai e no Sul do Brasil, onde tem uma grande participação econômica

e cultural. Seu caule é um tronco de cor acinzentada e pode medir de 20 a 25 cm de

diâmetro nas plantas jovens. Sua altura dependendo da idade e do clima, pode

alcançar de 15 a 18 metros de altura (OLIVEIRA, OLIVEIRA, SANTOS,2005).

As folhas constituem a parte mais importante da planta. São altas, oblongas

com nervuras salientes e suas bordas são providas de pequenos dentes visíveis

principalmente da metade do limbo para a extremidade (OLIVEIRA, OLIVEIRA,

SANTOS,2005). Quando sapecadas e trituradas, as folhas são utilizadas para a

preparação de bebidas alimentícias e estimulantes, como o chimarrão, o chá e o

“tererê”, típicas de cada região. Também vem sendo consumida no mercado

europeu como matéria-prima para obtenção de produtos fitoterápicos (MARIOT et

al., 2004).

A produção e comercialização do produto no Brasil é regulamentada pelo

Ministério da Saúde, Divisão de Alimentos (Portaria 464|97) e os critérios de

qualidade encontram- se fixados nas portarias 233|98 e 234|98 da Secretaria de

Vigilância Sanitária (MARIOT et al., 2004).

4.3.1 Propriedades e ação medicinal

A erva mate apresenta constituição química rica em aminoácidos, alcaloides

(metilxantinas), flavonoides, vitaminas do complexo A, B, C e E, taninos, ácido

clorogênico e seus derivados, além de numerosas saponinas triterpênicas derivadas

do ácido ursólico (BASTOS et al., 2007; BRACESCOA et al., 2011). Os níveis de

polifenóis dos extratos de Ilex paraguariensis são maiores do que os encontrados no

chá verde e comparáveis com os níveis encontrados nos vinhos tintos (GUGLIUCCI

et al., 2009).

A pesquisa acerca das propriedades medicinais da erva-mate teve início a

muito tempo atrás, porém nos últimos 15 anos, numerosos estudos focaram nos

efeitos benéficos dessa planta (HECK e MEIJA, 2007). Efeitos antioxidantes

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(BRAVO et al., 2007), antiinflamatórios (LANZETTI et al., 2008), vasodilatadores,

hipocolesterolêmico (MATSUMOTO et al., 2009), anti-mutagênico (MIRANDA et al.,

2008) e hipoglicemiante tem sido apontados. Além disso, o efeito das saponinas do

mate como inibidor da NOS já foi relatado (PUANGPRAPHANDTAND e MEJIA,

2009).

Recentemente, tem-se dedicado muita atenção ao estudo do efeito das

plantas medicinais no tratamento de distúrbios depressivos. Em particular, o extrato

de Hypericum perforatum é conhecido por suas propriedades antidepressivas e

usado na terapia da depressão (SHIRAI et al., 2005). Extratos do Hypericum

perforatum têm sido usados na última década como antidepressivos na Alemanha e

estão hoje dentre os antidepressivos mais utilizados naquele país. Em 1997, com

mais de 3,7 milhões de prescrições, o Hypericum foi responsável por 25% das

prescrições de antidepressivos na Alemanha (LAAKMANN et al., 1998).

Recentemente, inúmeros outros estudos demonstram o efeito tipo-

antidepressivo de diversas plantas medicinais em modelos animais preditivos de

atividade antidepressiva. Já foi demonstrado que espécies como a Siphocampylus

verticillatus (RODRIGUES et al, 2002), Cissampelos sympodialis (MENDONÇA-

NETO et al., 2008), Rosmarinus officinalis (MACHADO et al., 2009), Tabebuia

avellanedae (FREITAS, A. E., 2010), Radix tenuifolia Willd (LIU et al., 2010) e

Crocus sativus (WANG et al., 2010) obtiveram resultados significativos.

O mate apresenta efeito fitoterápico e estimulante, possui propriedades sobre

o Sistema Nervoso Central (SNC). É indicado no tratamento de cefaléia, depressão

nervosa e reduz a fadiga (NEWAL, 2002). Além disso, o efeito do extrato aquoso de

erva-mate na melhora da memória de roedores já foi demonstrada (COLPO et al.,

2007).

A administração aguda do extrato hidroalcoolico de erva-mate foi capaz de

produzir um efeito “anti-Parkinsoniano” em diferentes modelos animais (MILIOLI et

al., 2007), além de reverter a catalepsia induzida pela injeção subcutânea de

reserpina em camundongos e melhorar o aprendizado e a memória (PREDIGER et

al., 2008).

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5 METODOLOGIA

5.1 MATERIAIS

5.1.1. Reagentes

MK-801 ((+) - 5 –metil –10, 11 – dihidro - 5H - dibenzo[a,d] ciclohepten - 5, 10

-imine maleato); Ketamina; Fluoxetina, 7-nitroindazol; fosfato de sódio

dibásico (NaH2PO4); cloreto de potássio (KCl), ácido tricloroacético;

bicarbonato de potássio; Reagente de Griess e nitrato de sódio (NaNO2).

5.1.2. Equipamentos

Balança analítica (Bel Engineerring® );

Leitora de Elisa ( Labsystems Multiskan MS®);

Centrífuga de tubos do tipo eppendorff;

Espectrofotômetro (Digimed® DME 21)

5.2 OBTENÇÃO E PREPARO DO EXTRATO DE ERVA MATE (Ilex paraguariensis)

A erva-mate (Ilex paraguariensis) serão compradas,e o preparo de um extrato

aquoso de erva-mate (mate). O extrato será obtido no Laboratório de farmacognosia

da Universidade do Oeste Paulista– Unoeste, seguindo protocolo de extração

previamente proposto por Andrade e colaboradores (2012).

5.3 ANIMAIS

Serão utilizados 30 camundongos Swiss machos adultos (60 a 90 dias) por

experimento, provenientes do Biotério da Unoeste, em ciclo claro/escuro de 12

horas, em temperatura entre 22 e 25°C, com água e ração ad libitum. Os

procedimentos adotados com os animais seguirão os Princípios Éticos, de acordo

com resolução numero 1.000 de 11 maio de 2012 do Conselho Federal de Medicina

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Veterinária. Os nossos protocolos para experimentos com animais serão projetados

de maneira que o animal tenha o mínimo de sofrimento possível (decapitação por

guilhotina) por motivo que a eutanásia vem alterar o resultado da pesquisa, pois

para avaliação dos níveis hipocampais e corticais de NO os animais.

5.3.1 Administração do extrato de erva mate aos animais

Os animais receberão por via oral, utilizando a metodologia de gavagem, uma

única administração de salina (animais controles) ou extrato de erva mate (animais

tratados) em diferentes concentrações (0,1 – 100 mg/mL) e após um período de 60

minutos serão submetidos a avaliação comportamental ou bioquímica. Um grupo de

animais será tratado com fluoxetina (antidepressivo clássico usado na clínica como

inibidor seletivo da recaptação de serotonina) na dose ativa (10mg/kg) a fim de

avaliar a validade dos testes preditivos (controle positivo). O tratamento será

realizado pela administração de 10µL/g de peso do animal, tanto para as soluções

de atorvastatina como para a solução de salina (LUDKA et al., 2012).

5.4 AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL

O efeito da administração do extrato de erva mate em camundongos será

avaliado através de dois testes comportamentais: Teste do Nado Forçado (TNF) e

Teste de Suspensão pela Cauda (TSC). Estes testes apresentam validade preditiva

e são utilizados no screening de drogas com potencial efeito antidepressivo. Ambos

os testes baseiam-se na diminuição do tempo de imobilidade de um animal que é

colocado em uma situação inescapável. Os antidepressivos clássicos diminuem o

tempo de imobilidade nestes dois testes.

5.4.1 Teste de suspensão da cauda (TSC)

O tempo total de duração da imobilidade será medida de acordo com o

método Steru et al. (1985). Os camundongos, acústica e visualmente isolados serão

suspensos 50 cm acima do chão por fita adesiva e a imobilidade será registrada

durante 6 minutos, conforme descrito anteriormente (MANTOVANI et al., 2003). Os

antidepressivos reduzem o tempo de imobilidade neste teste (STERU et al., 1985).

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5.4.2 Teste do nado forçado (TNF)

O teste será realizado durante um período de 6 minutos em um cilindro

plástico (altura 24 cm, diâmetro 10 cm) contendo 19 cm de água a 25 C. O tempo de

imobilidade será cronometrado, conforme descrito anteriormente (MANTOVANI et

al., 2003; ZOMKOWSKI et al., 2004). Os antidepressivos reduzem o tempo de

imobilidade neste teste (PORSOLT et al., 1977).

5.4.3 Avaliação da atividade locomotora pelo teste do campo aberto (TCA)

A fim de excluir a possibilidade de que um eventual efeito semelhante a

antidepressivo, ou seja, uma redução da imobilidade nos TNF e TSC seja devido a

um aumento na atividade locomotora causada pela administração do extrato de

erva-mate, os camundongos serão submetidos a uma sessão no TCA, como

descrito por Rodrigues et al. (1996) 60 minutos após a administração do extrato. O

teste será realizado em uma caixa de madeira medindo 40 x 60 x 50 cm altura, com

o chão dividido em 12 quadrados iguais. O número de quadrados cruzados com as

quatro patas (cruzamentos) será registrado em uma sessão de 6 minutos.

5.5 AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DO SISTEMA GLUTAMATÉRGICO NO

EFEITO TIPO-ANTIDEPRESSIVO DO EXTRATO DE ERVA-MATE IN VIVO

Para avaliação do envolvimento do sistema glutamatérgico no efeito tipo-

antidepressivo do extrato de erva-mate, será utilizado o teste preditivo, que

apresenta maior sensibilidade aos efeitos desencadeados pelo extrato de erva-mate

em camundongos. Desta forma, a análise da participação deste sistema será

realizada utilizando o TSC ou o TNF, seguido do TCA.

5.5.1 Avaliação da participação do receptor NMDA

Para avaliar a participação do receptor NMDA no efeito tipo-antidepressivo da

atorvastatina em camundongos, os animais serão tratados com uma dose sub

efetiva do extrato de erva-mate com uma dose sub efetiva de MK-801 (0,001 mg/kg,

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i.p, um antagonista NMDA) (ZOMKOWSKI et al., 2010; ZENI et al., 2011, LUDKA,

2012). O extrato de erva-mate ou salina serão administradas 30 minutos antes do

MK-801. Passados 30 minutos pós-administração do MK-801 os animais serão

submetidos ao TSC ou TNF, seguidos do TCA.

Para complementar este resultado, os animais serão tratados com uma dose

sub efetiva do extrato de erva-mate, em combinação com uma dose sub efetiva de

ketamina (0,1 mg/kg, intraperitoneal, um antagonista de receptor NMDA, que

apresenta efeito antidepressivo) (30 minutos após a administração do extrato)

(LUDKA et al., 2012). Após um período total de 60 minutos os animais serão

submetidos ao TSC ou ao TNF seguido do TCA.

5.5.2 Avaliação da participação da NOS

O efeito da administração combinada de doses subativas de 7-nitroindazol (50

mg/kg, i.p., inibidor da NOS) ou azul de metileno (20 mg/kg, i.p., um inibidor da NOS

e da GCs) (ZOMKOWSKI et al., 2010; ZENI et al., 2011; LUDKA., 2012) com uma

dose sub efetiva do extrato de erva mate será avaliado. Extrato de erva-mate ou

salina serão administradas 30 minutos antes do 7-nitroindazol e do azul de metileno.

Após 30 minutos da administração de 7- nitroindazol ou azul de metileno os animais

serão submetidos ao TSC ou ao TNF seguidos do TCA.

5.6 AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA DOS NÍVEIS CORTICAIS E HIPOCAMPAIS DE NO

Para avaliação dos níveis hipocampais e corticais de NO os animais serão

tratados com salina ou com a dose ativa do extrato de erva-mate (a dose que

apresentar melhor efeito antidepressivo no TSC ou TNF) e decorridos 60 minutos

serão mortos por decapitação, terão seu hipocampo e córtex retirados e submetidos

a análise da quantidade de NO a ser mensurada pelo método de Griess. Um pool de

3 hipocampos ou 2 córtex serão misturados com ácido tricloroacético a 25% e

centrifugados a 1800G por 10 minutos. O sobrenadante será imediatamente

neutralizado com bicarbonato de potássio 2M. O nitrato será reduzido a nitrito pela

nitrato redutase. O total de nitrito será mensurado por método colorimétrico a

540nm, baseado na reação de Griess. Uma curva padrão será construída utilizando

nitrato de sódio a fim de comparação.

16

5.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística será realizada através da análise de variância de uma ou

duas vias (ANOVA), seguida do teste de Tukey. Os dados serão expressos como a

média e desvio padrão. Para os experimentos comportamentais um número de 8 a

10 animais por grupo será utilizado. Já para as análises bioquímicas, os

experimentos serão realizados em triplicata com número mínimo de 5 experimentos.

Serão considerados significativos valores com p < 0,05.

17

6 . RECURSOS

6.1 RECURSOS FÍSICOS

O preparo do extrato aquoso de Ilex paraguariensis será realizado no

Laboratório de Farmacognosia da Universidade do Oeste Paulista – Unoeste,

Presidente Prudente. Todos os experimentos comportamentais e bioquímicos serão

realizados no laboratório de pesquisa da mesma instituição.

6.2 RECURSOS HUMANOS

Este trabalho será realizado por:

Um grupo de pesquisa do curso de Farmácia:

Um professor orientador:

6.3 RECURSOS MATERIAIS

Pipetas volumétricas de vidro e pipetas automáticas;

Tubos de ensaio;

Estante para tubos de ensaio;

Placas de Petri;

Bastão de vidro;

Balão volumétrico;

Becker;

Balança analítica (Bel Engineerring®);

Leitora de Elisa – Labsystems Multiskan MS

Material cirúrgico;

Reagentes : MK-801 ((+) - 5 –metil –10, 11 – dihidro - 5H - dibenzo[a,d]

ciclohepten - 5, 10 -imine maleato); Ketamina; Fluoxetina, 7-nitroindazol;

fosfato de sódio dibásico (NaH2PO4); cloreto de potássio (KCl), ácido

18

tricloroacético; bicarbonato de potássio; Reagente de Griess e nitrato de

sódio (NaNO2).

6.4 RECURSOS FINANCEIROS

Considerando que todos os equipamentos e reagentes que serão utilizados já

fazem parte dos recursos permanentes da Unoeste, e encontram-se disponíveis

para utilização, estima-se que não será necessário investimento financeiro para

execução deste projeto.

19

7 CRONOGRAMA

Atividades 2015 2016Jul/ago Set/out Nov/dez Jan/fev Mar/abr/mai Jun/jul

Ava

liaçã

o do

ef

eito

an

tidep

ress

ivo

do e

xtra

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e er

va-m

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Obtenção e preparo do extrato de erva-mate

X X

Determinação de dose ativa e subativa no TSC e TNF

X X

Ava

liaçã

o do

m

ecan

ism

o de

açã

o

Avaliação da participação do NMDAR

X X X

Avaliação da participação

da NOSX X X

Aná

lise

Bio

quím

ica

Análise dos níveis de NO/ hipocampo e

córtex

X X X

Aná

lise

Esta

tístic

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X X X X X X X X X X X

Elab

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Prep

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dos

X X X

20

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