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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO CIÊNCIAS EM ANIMAIS DE LABORATÓRIO
INSTITUTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA EM BIOMODELOS
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
ROBSON LAROCA DOMINGUES FILHO
DETERMINAÇÃO DA CURVA GLICÊMICA E ALTERAÇÕES HISTOLÓGICAS
(PANCREAS E FÍGADO) DE CAMUNDONGOS NOD PRODUZIDOS NO
ICTB/FIOCRUZ
Rio de Janeiro
2018
ROBSON LAROCA DOMINGUES FILHO
DETERMINAÇÃO DA CURVA GLICÊMICA E ALTERAÇÕES HISTOLÓGICAS
(PANCREAS E FÍGADO) DE CAMUNDONGOS NOD PRODUZIDOS NO
ICTB/FIOCRUZ
Dissertação apresentada, como um dos requisitos para obtenção do título de Mestre, ao Programa de Pós-graduação em Ciências em Animais de Laboratório, Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos – FIOCRUZ
Orientador: Javier Adolfo Sarria Perea Orientador: Luiz Ricardo Berbert
Abril
Rio de Janeiro
2018
Dedico este trabalho aos meus pais e
avós que sempre me apoiaram durante
toda minha vida.
AGRADECIMENTOS
À Deus por me guiar em toda minha vida.
Aos meus pais (Robson e Janine) pelo apoio, paciência e sempre acreditar
que poderia chegar cada vez mais longe.
À minha noiva, Alyne, pela paciência e apoio durante todo o meu trabalho,
sempre ao meu lado ajudando no que era preciso.
Aos meus orientadores, Javier Perea e Luiz Berbert, por terem comprado a
ideia do projeto e pela ajuda imensurável para que essa dissertação tenha se
concluído.
À diretoria do ICTB pela confiança e oportunidade de ingressar no mestrado.
Aos Chefes do SCRL/ICTB, por terem acreditado na minha capacidade em
fazer o mestrado, apoiado desde a liberação para inscrição até as etapas finais, em
especial à Klena Sarges pela confiança e credibilidade.
Aos colegas do SCRL/ICTB, que sempre me apoiaram entre uma
brincadeira e um café a tarde, sempre estiveram dispostos a ajudar.
Aos colegas do setor SPF/SCRL que deram grande apoio nos momentos de
minha ausência no trabalho para assistir as aulas, realizar a coleta de dados e para
escrever a dissertação.
Á equipe da Coordenação de Pesquisa e Experimentação Animal –
CPEA/ICTB, pelo apoio durante o trabalho, em especial a Margarida de Jesus
Barbosa, pela confecção do material para Histopatologia.
Aos meus colegas de turma, com os quais aprendi muito.
À coordenação de ensino do ICTB, pelo apoio durante todo o curso estando
ao nosso lado.
Aos professores do MPCAL.
Ao camundongo NOD, que através do estudo de suas características pude
enriquecer ainda mais a CAL.
Ao Professor Luiz Fernando Dias Medeiros, que fez a ponte para que eu
iniciasse meu estágio no antigo CECAL/Fiocruz.
À Profa. Flávia Jesus de Almeida, que sempre me incentivou durante meu
curso de Zootecnia e meu estágio no CECAL.
À Fiocruz por me proporcionar a possibilidade de realizar este mestrado
profissional.
Ao INCQS por ceder gentilmente o ácido pícrico para marcação dos animais.
RESUMO
O diabetes mellitus (DM) ou simplesmente diabetes é uma doença metabólica
crônica caracterizada por níveis elevados de glicose no sangue e que leva a sérios
danos em diversos órgãos do corpo. É considerada epidemia mundial, sendo
atualmente estimado em 425 milhões os adultos diabéticos (1 a cada 11). Seu
processo ocorre quando a produção da insulina é insuficiente ou inexistente ou
ainda quando o organismo não é capaz de utilizar a insulina que é produzida nas
células beta (β) do pâncreas. Há diversos tipos de DM, porém com maior frequência
encontramos a Diabetes mellitus tipo 2 (DM2), causada principalmente pela
insuficiência das células β do pâncreas; encontramos ainda os tipos: Latent
Autoimmune Diabetes in Adults (LADA); Diabetes Gestacional; Diabetes tipo MODY;
Diabetes mellitus tipo 1 (DM1) entre outras. A DM1 é geralmente diagnosticada
principalmente em crianças e jovens, tem como características a destruição das
células β, podendo ser considera uma das formas mais agressivas da doença. Um
dos principais biomodelos para o estudo da DM1 é o camundongo mutante natural,
Inbred, da linhagem Non Obese Diabetic (NOD), pois ele desenvolve o processo
autoimune clinica e geneticamente similar a doença em humanos. Porém, diversos
fatores podem influenciar no processo autoimune do camundongo NOD, fatores
ambientais, genéticos, manejo, sanitário entre outros, informações essas que são
extremamente importantes para a pesquisa com o biomodelo sendo necessária a
padronização do biomodelo utilizado. Este trabalho teve como objetivo caracterizar o
camundongo NOD criado no Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos
(ICTB-Fiocruz) fornecendo assim informações e características específicas dos
animais fornecidos para estudos dentro da Fundação Oswaldo Cruz e parceiros. No
desenho experimental proposto neste trabalho buscou-se caracterizar a linhagem
nas condições criadas no ICTB, a fim de proporcionar informações essenciais para
que sejam desenvolvidas as pesquisas com mais precisão e melhores resultados.
Os resultados demonstram que os fatores ambientais possuem grande influencia na
expressam fenotípica da linhagem. Observou-se que na colônia mantida no ICTB os
animais expressão alta glicêmica de forma tardia (após 20 semanas de vida) porém,
conforme a literatura tendem os animais possuem resultados histopatológicos
positivos para infiltrado inflamatório no pâncreas mostrando que se o trabalho for
realizado com animais mais velhos (após 30 semanas) teremos um resultado
tendendo a totalidade dos animais apresentando processo autoimune e diabetes.
Palavras-chave: Diabetes, Camundongo, NOD, Glicemia, Biomodelo
ABSTRACT
Diabetes mellitus (DM) or simply diabetes is a chronic metabolic disorder
characterized by high levels of glucose in the blood and leading to serious damage to
various organs of the body. Is considered a worldwide epidemic and it is currently
estimated at 425 million diabetic adults (1 in 11). Its process occurs when the
production of insulin is insufficient or nonexistent or even when the body is not able
to use the insulin that is produced in the beta (β) cells from pancreas. There are
several types of DM, but more frequently we find Type 2 diabetes mellitus (DM2),
caused mainly by the insufficiency of β cells of the pancreas; besides, we can also
find the types: LatentAutoimmune Diabetes in Adults (LADA); Gestational diabetes;
Diabetes type MODY; and the most aggressive type, Diabetes mellitus type 1 (DM1).
DM1 is usually diagnosed mainly in children and young people. It is characterizedby
the destruction of β-cells, which can be considered one of the most aggressive forms
of the disease. One of the main biomodels for the study of DM1 is the natural mutant
mouse, Inbred, of the Non Obese Diabetic (NOD) strain as it develops the clinical
and genetically similar autoimmune disease in humans. However, several factors
may influence the autoimmune process of the NOD mouse, environmental, genetic,
management, and sanitary factors among others, information that is extremely
important for research with the biomodel being necessary the standardization of the
biomodel used. This work aimed to characterize the NOD mouse created at the
Institute of Science and Technology in Biomodels (ICTB-Fiocruz) thus providing
information and specific characteristics of the animals provided for studies within the
Oswaldo Cruz Foundation and partners. The experimental design proposed in this
work was aimed at characterizing the lineage in the conditions created in the ICTB, in
order to provide essential information for the research to be developed with more
precision and better results. Our results demonstrate that the environmental factors
have a great influence on the phenotypic expression of the lineage. It was observed
that in the colony maintained in the ICTB, the animals expressed late glycemic (after
20 weeks of life), however, according to the literature, animals had positive
histopathological results for inflammatory infiltrate in pancreas, showing that if this
work would be performed with animals after 30 weeks,it could be possible to have a
totality of the animals presenting autoimmune process and diabetes.
Keywords: Diabetes, Mouse, NOD, Glycemia, Biomodel
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Camundongo da linhagem NOD criado no ICTB................................ 28
Figura 2 Gaiola microisoladora de criação de camundongo............................. 28
Figura 3 Itens utilizados para enriquecimento ambiental do NOD no ICTB..... 37
Figura 4 Identificação dos animais................................................................... 38
Figura 5 Coleta de sangue da ponta da cauda de camundongo...................... 39
Figura 6 Medição do peso vivo......................................................................... 40
Figura 7 Linha do tempo das medições glicêmicas e peso vivo dos animais
no estudo............................................................................................ 41
Figura 8 Comparação de médias semanais de índice glicêmico entre sexos.. 46
Figura 9 Linha do tempo ilustrando a data de ocorrência da alta glicêmica..... 46
Figura 10 Comparação de médias semanais de peso vivo entre sexos............ 48
Figura 11 Coeficiente de correlação de Pearson entre índice glicêmico e peso
vivo de camundongos NOD machos e fêmeas de 10 a 29 semanas
de vida, criados no ICTB/Fiocruz. Em azul Machos: r(20) = 0,79, p
< 0,0001; Em vermelho Fêmeas: r(20) =0,72, p = 0,0003. IC = 95%,
alfa = 5%............................................................................................. 50
Figura 12 Graus de infiltração mononuclear de ilhotas de Langerhans em
camundongos NOD (a, b, c), versus o controle C57Bl/6 e NOD não
diabético (d)........................................................................................ 52
Figura 13 Grau de vacuolização das células hepáticas de fígado de
camundongos NOD com diferentes índices glicêmicos. As vacuolas
intracitoplasmáticas correspondem a acúmulos de glicogênio no
hepatócito, em resposta à hiperglicemia............................................ 53
Figura 14 Comparação das curvas glicêmicas de machos e fêmeas de
camundongos NOD criados no Lab. Taconic e no ICTB.................... 57
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Estatística descritiva do índice glicêmico em camundongos NOD
de 10 a 30 criados no ICTB/Fiocruz.................................................. 44
Tabela 2 – Resultados dos testes de normalidade para a variável índice
glicêmico semanal em camundongos NOD de 10 a 29 semanas
criados no ICTB/Fiocruz.................................................................... 45
Tabela 3 – Estatística descritiva do peso vivo em camundongos NOD de 10 a
30 semanas criados no ICTB/Fiocruz............................................... 47
Tabela 4 – Resultados dos testes de normalidade para a variável peso vivo
semanal em camundongos NOD de 10 a 29 semanas criados no
ICTB/Fiocruz...................................................................................... 49
Tabela 5 – Níveis de índice glicêmico em camundongos NOD de 10 a 29
semanas de vida, criados no ICTB/Fiocruz..................................... 50
Tabela 6 – Adaptado KIRSTEN, 2006. Comparativo entre biotérios da
incidência de diabetes com 30 semanas de vida dos
camundongos da linhagem NOD...................................................... 56
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E TERMOS ESTRANGEIROS
3Rs
Redução, Substituição, Refinamento, do inglês Reduction, Replacemen ,
Refinement.
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
BRA Brasil
CD4 Grupamento de diferenciação 4, do inglês cluster of differentation 4
CD8 Grupamento de diferenciação 8, do inglês cluster of differentation 8
CEUA Comitê de ética de uso animal
CONASS Conselho Nacional de Secretários de Saúde
CONCEA Conselho Nacional de controle de experimentação animal
CTS Catarata Shionogi,do inglês Cataract Shionogi
dL Decilitro
DM Diabetes Melittus
DM1 Diabetes Melittus tipo 1
DM2 Diabetes Melittus tipo 2
DNA Ácido desoxirribonucleico, do inglês deoxyribonucleic acid
FELASA
Federação para associações científicas de animais de laboratório, do
inglês Federation for Laboratory Animal Science Associations
Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz
g Grama
HLA Antígeno Leucocitário Humano, do inglês Human Leucocitary Antigen
ICTB Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos
IDD Diabetes Dependente de Insulina, do inglês Insulin Dependent Diabetes
IDD1
Diabetes Dependente de Insulina tipo 1, do inglês Insulin Dependent
Diabetes type 1
.ITA Itália
LAB. Laboratorio
LADA
Diabetes autoinmune latente em adultos, do inglês Latent Autoimmune
Diabetes in Adults
mg Miligrama
MHC
Complexo de Histocompatibilidade Maior, do inglês Major
Histocompatibility Complex
NAFLD
Doença do fígado gorduroso não alcoólica, do inglês Nonalcoholic fatty
liver disease
NCT Ausência de catarata, do inglês Non-cataract
NOD Diabético Não Obeso do inglês,Non Obese Diabetic
PNH Primata não humano
RNA Ácido ribonucleico, do inglês ribonucleic acid
SBEM Sociedade Brasileira de Endocrinologia e Metabologia
SPF Livres de patógenos específicos, do inglês Specific Pathogen Free
STZ Estreptozotocina, do inglês streptozotocin
ZDF Diabético obeso de Zucker, do inglêsZucker Diabetic Fatty
ZDSD Diabético Spraguey Dawley de Zucker do inglês Zucker Diabetic
Spraguey Dawley
LISTA DE SÍMBOLOS
β Beta
® Marca Registrada
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 17
1.1 DIABETES................................................................................................... 17
1.1.1 Diabetes Mellitus Tipo 1 (DM1) ................................................................ 19
1.1.2 Fatores ambientais indutores de diabetes ............................................. 21
1.1.3 Diagnóstico................................................................................................ 21
1.2 MODELOS ANIMAIS PARA ESTUDO E EXPERIMENTAÇÃO EM
DIABETES................................................................................................... 22
1.2.1 Primatas não humanos............................................................................. 23
1.2.2 Cães............................................................................................................ 24
1.2.3 Roedores ................................................................................................... 24
1.3 O CAMUNDONGO COMO MODELO EXPERIMENTAL............................. 25
1.4 CAMUNDONGO NOD................................................................................. 26
1.4.1 Histórico..................................................................................................... 26
1.4.2 Características da linhagem..................................................................... 27
1.4.3 Manejo......................................................................................................... 28
1.5 FATORES QUE AFETAM A PRODUÇÃO, MANUTENÇÃO E
EXPERIMENTAÇÃO EM MODELOS ANIMAIS.......................................... 29
1.5.1 Status genético.................................... ..................................................... 29
1.5.2 Status sanitário.......................................................................................... 29
1.5.3 Fatores Ambientais e Nutricionais........................................................... 31
1.5.4 Boas práticas de manejo e manutenção de linhagens em biotérios.... 32
2 JUSTIFICATIVA.......................................................................................... 33
3 OBJETIVOS................................................................................................ 34
3.1 GERAL......................................................................................................... 34
3.2 ESPECÍFICOS............................................................................................. 34
4 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 35
4.1 ASPECTOS ÉTICOS................................................................................... 35
4.2 CÁLCULO AMOSTRAL E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL.................. 35
4.3 ANÁLISES ESTATÍSTICAS......................................................................... 35
4.4 MANEJO DOS ANIMAIS............................................................................. 36
4.5 MARCAÇÃO E MONITORAMENTO DOS ANIMAIS................................... 37
4.6 MEDIÇÃO DO ÍNDICE GLICÊMICO........................................................... 38
4.7 MEDIÇÃO DO PESO VIVO......................................................................... 39
4.8 EUTANÁSIA................................................................................................. 41
4.9 NECROPSIA E COLETA DE AMOSTRAS.................................................. 42
4.10 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA.................................................................. 42
5 RESULTADO............................................................................................... 43
5.1 ÍNDICE GLICÊMICO.................................................................................... 43
5.2 PESO VIVO................................................................................................ 46
5.3 CORRELAÇÃO ENTRE ÍNDICE GLICÊMICO E PESO VIVO.................... 49
5.4 PROPORÇÃO DE CAMUNDONGOS DIABÉTICOS................................... 50
5.5 HISTOPATOLOGIA DO PÂNCREAS.......................................................... 51
6 DISCUSSÃO................................................................................................ 54
7 CONCLUSÕES............................................................................................ 58
8 PERSPECTIVAS......................................................................................... 59
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 60
ANEXO A – PROTOCOLO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS... 68
ANEXO B – CAIXA DE CONTENÇÃO PARA CAMUNDONGOS......................... 69
ANEXO C – FICHA DE MONITORAMENTO INDIVIDUAL DE CAMUNDONGO.. 70
ANEXO D – ESQUEMA DE MARCAÇÃO INDIVIDUAL COM SOLUÇÃO DE
ÁCIDO PÍCRICO..................................................................................................... 71
ANEXO E – PORTFOLIO DO CAMUNDONGO DA LINHAGEM NOD CRIADA
NO ICTB................................................................................................................. 72
17
1 INTRODUÇÃO
1.1 DIABETES
Diabetes é uma doença metabólica crônica caracterizada por níveis
elevados de glicose no sangue (ou açúcar no sangue), que leva ao longo do tempo a
sérios danos ao coração, vasos sanguíneos, olhos, rins e nervos (World Health
Organization, 2018). Ocorre quando o pâncreas não produz, ou produz de forma
insuficiente, a insulina, ou quando o organismo não pode utilizar efetivamente a
insulina produzida (LOPES et al., 2012; AUGUSTA, 2015). O hormônio insulina é
produzido pelas células beta (β) do pâncreas, e sua principal função é promover a
entrada de glicose para as células do organismo, podendo assim ser usada em
diversas atividades celulares (LINS et al., 2007; LOPES et al., 2012), como, por
exemplo, em células do sistema nervoso ou eritrócitos, as quais possuem alta
dependência da glicose como fonte de energia (VOET et al., 2013). Problemas no
carreamento da glicose pela insulina levam ao seu acúmulo no sangue
(hiperglicemia) (SBEM, 2017; LINS et al., 2007; SAMPAIO, 2006)
Atualmente, a doença Diabetes Mellitus (DM) é considerada uma epidemia
mundial. Características como o envelhecimento da população, a urbanização
crescente e a adoção de estilos de vida pouco saudáveis como o sedentarismo,
dieta inadequada e obesidade associadas as fatores hereditários (genéticos) são os
grandes responsáveis pelo grande aumento da incidência do diabetes em todo o
mundo (CNSS, 2016; SAMPAIO, 2006). Durante o curso da Diabetes Mellitus tipo 1
ocorre uma destruição específica das células β, responsáveis pela produção de
insulina, como consequência de uma ação imunológica mediada por células
linfocitárias, macrófagos e células “natural killer”, e esse processo inflamatório é
denominado insulite (LA CAVA et al., 2015; BALDA & PACHECO-SILVA, 1999)
Segundo o Ogurtsova (2017),atualmente estima-se que haja 425 milhões de
adultos com diabetes (1 a cada 11 adultos), sendo 50% ainda não diagnosticados,
além de 1 a cada 6 crianças nascidas que são afetadas pela hiperglicemia materna
durante a gestação. Em 2017, o Brasil possui cerca de 12,5 milhões de pessoas
com diabetes, tendo como perspectiva ultrapassar os 23 milhões em 2040.
18
Há diversos tipos de diabetes descritos na literatura, e, dentre eles os que
apresentam maior frequência na população humana são:
1. Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2): A forma mais comum da doença,
causada principalmente pela insuficiência das células β do pâncreas em
responder à grande concentração de glicose no sangue e também é
caracterizada pela resistência do organismo à insulina e obesidade dos
indivíduos (PANDEY et al., 2015); Os relatos na população acima dos 40
anos são mais comuns, porém, com a mudança dos hábitos alimentares
e o aumento do sedentarismo na população mais jovem, o número de
crianças obesas e diabéticas vem aumentando (FERREIRA & CAMPOS,
2014).
2. Diabetes gestacional: ainda não muito bem caracterizada, pode ter
origem semelhante às outras formas de diabetes e, em alguns casos, é
determinada como diabetes 1 ou 2 preexistente (CARREIRO, et al.,
2018); ocorre devido ao aumento da glicose no sangue durante a
gravidez, normalmente voltando à normalidade no período pós-parto,
porém, em alguns casos, há retorno das manifestações clínicas nas
mesmas mulheres após alguns anos(SAMPAIO, 2006; SBD 2015).
3. Diabetes tipo LADA (Latent Autoimmune Diabetes in Adults):
conhecida também como “Diabetes 1 1/2”, DM1 latente, DM1 lentamente
progressivo, entre outros, é caracterizada pela expressão tardia da
Diabetes tipo 1, onde normalmente acomete pessoas acima de 35 anos
(FERREIRA & CAMPOS, 2014; CALSOLARI et al., 2008).
4. Diabetes tipo MODY (Maturity-Onset Diabetes of the Young):
caracterizada pela mutação de um ou uma série de genes, como por
exemplo HNF1A Ser3Cys, PDX1, Glu224Lys, e His94Gln
(DODDABELAVANGALA et al., 2017) podendo ser hereditária e
normalmente é diagnosticada antes dos 25 anos de idade; dentro do
grupo diagnosticado, 95% das pessoas nascidas com essas
19
características genéticas serão diabéticas ou apresentarão alguma
alteração em seu metabolismo da glicose antes dos 55 anos (OLIVEIRA
et al., 2002).
5. Diabetes tipo 1 ou Diabetes Mellitus: é geralmente diagnosticada em
crianças e jovens adultos, sendo caracterizada pelo processo
autoimune, com destruição das células β do pâncreas (AUGUSTA, 2015;
LOPES et al., 2012; LINS et al., 2007; SAMPAIO, 2006; BRASIL, 2006;
BALDA& PACHECO-SILVA, 1999); dentre todos os tipos, é a que
apresenta manifestações clínicas mais agressivas, e também é expressa
em outras espécies de mamíferos, como primatas não humanos, cães,
ratos e camundongos. As características gerais da doença serão
descritas a seguir.
1.1.1 Diabetes Mellitus Tipo 1 (DM1)
É uma doença autoimune resultante da destruição parcial ou total das
células β das ilhotas de Langerhans pancreáticas (insulite), responsáveis pela
produção de insulina (SBD, 2018; FERNANDES et al., 2005).Os sinais
histopatológicos característicos aparecem em torno de 80% das ilhotas
comprometidas, o que agrava ainda mais a sintomatologia, devido ao diagnostico
tardio. A ativação desse processo imunológico é influenciado por fatores genéticos e
ambientais (SBD, 2018).
Pacientes no período clínico da doença apresentam poliúria, polifagia,
polidipsia, astenia e perda de peso, além de alterações hepáticas como
hepatomegalia e esteatose não alcoólica (PORTUGAL et al., 2011) durante a
evolução da doença. Em outras espécies onde a DM1 é apresentada, os sintomas
permanecem semelhantes, facilitando o estudo da patologia em outros modelos
(JACKSON LAB., 2018; FORNARI et al., 2008;).
A DM1 tem origem principalmente na expressão ou mutação de
determinados genes, que, por sua vez, induzem a expressão dos eventos de
autoimunidade que caracterizam a fisiopatologia da doença.
Trabalhos anteriores desenvolvidos no camundongo Non Obese Diabetic
(NOD) identificaram mais de 20 idd (insulin dependent diabetes) loci gênicos
20
correlacionados com a autoimunidade na doença (RIDGWAY, 2006). Tanto em
humanos quanto em camundongos, o fator genético mais importante que contribui
com a susceptibilidade do organismo à DM1 está no idd1 (ou IDD1 do HLA-Human
Leucocitary Antigen, em humanos), que corresponde ao MHC em camundongos
(Major Histocompatibility Complex), além de outros idds, como I-Ag7 e I-E (genes
ortólogos aos HLAs em humanos), e MHC-I H-2KdDb (Pearson et al., 2016).
Mutações nos genes HNF1A Ser3Cys, PDX1 Glu224Lys, His94Gln, NEUROD1
Glu59Gln, Phe318Ser, INS Gly44Arg, GCK, ABCC8 Arg620Cys e BLK Val418Met
foram descritos como indutoras de DM1 em humanos (DODDABELAVANGALA et
al., 2017)
Dentre os aspectos imunológicos, a DM1 tem como característica um
processo inflamatório auto reativo de células do sistema imune inato, como células
dendríticas, macrófagos, neutrófilos e, posteriormente linfócitos, que infiltram o
pâncreas dos camundongos NOD após três semanas de idade. O processo é
semelhante em humanos (WILCOX et al., 2009) e ratos (VOORBIJ et al., 1989). A
infiltração destas células sinaliza a migração de células T CD4 e CD8 adaptativas
entre quatro e seis semanas de idade no camundongo (MIYAZAKI et al., 1985),
onde se inicia o processo de destruição das ilhotas pancreáticas e suas células β.
A frequência de células T auto reativas é baixa no sistema durante a DM1,
porém, são estas células que reconhecem auto antígenos relacionados à diabetes,
como a insulina, entre outros. Estas células se desenvolvem no timo, mas, por
defeitos na seleção negativa, não são eliminadas e migram para o sistema
(PEARSON et al., 2016). Além das células T, as células B são produtoras dos auto
anticorpos ou apresentadoras de auto antígenos para outras células do sistema
imune, e estão localizadas nas ilhotas pancreáticas (DE AIZPURUA et al., 1994).
Cabe ressaltar que quanto maior a expressão de pró-insulina no timo, mais as
células auto reativas são eliminadas na seleção negativa (CHENTOUFI et al., 2002).
Além das alterações pancreáticas no curso da DM1, alguns autores
descrevem alterações hepáticas em indivíduos acometidos da doença. Dentre as
alterações, há hepatomegalia resultante da deposição excessiva de glicogênio intra-
hepático (glicogenose) e esteato-hepatite não alcoólica (PORTUGAL et al., 2011),
além da produção de corpos cetônicos (EL-MOHANDES & HUECKER, 2017). A
doença do fígado gorduroso não alcoólica (Nonalcoholic fatty liver disease – NAFLD)
21
frequentemente coexiste em indivíduos com DM1 e se caracteriza por inflamação
hepática com danos teciduais (MILLS et al., 2018; TARGHER et al., 2018)
Além dos fatores intrínsecos ao organismo, a DM1 pode ser induzida por
fatores ambientais, conforme descrito a seguir.
1.1.2 Fatores ambientais indutores de diabetes
Fatores ambientais são tão importantes indutores de diabetes quanto os
fatores genéticos. Há muita dificuldade atualmente no estudo destes fatores, pois
existem milhares de estímulos ambientais, associados aos fatores genéticos, que
podem induzir o surgimento da DM1 em humanos (PEARSON et al., 2016). Neste
caso, a utilização do camundongo NOD, em ambiente controlado, se tornou
importante na compreensão da doença.
Em camundongos NOD, diversos fatores ambientais foram descritos como
indutores de susceptibilidade à diabetes, tais como, uso de trigo e glúten na
alimentação (MAURANO et al., 2005; MARIETTA et al., 2013), exposição a agentes
infecciosos (ZACCONE et al., 2004; DRESCHER et al., 2004) e alterações na
microbiota (WEN et al., 2008; TORMO-BADIA et al., 2014).
1.1.3 Diagnóstico
O diagnostico da DM1 em humanos se inicia de forma bem simples, com a
coleta de uma gota de sangue e teste em aparelho medidor de glicose. Valores de
referência (níveis iguais ou superiores a 126mg/dL em jejum ou superiores a
200mg/dL a qualquer hora do dia) determinam o diagnóstico inicial (OLIVEIRA e
VENCIO, 2015; MEYRER, 2014). Outros exames podem ser indicados para
confirmar o diagnóstico como a Curva Glicêmica, onde os níveis de glicose no
sangue são avaliados seguindo uma cinética temporal (SBD, 2018). Também, como
complemento, é possível mensurar a glicose urinária, quando a concentração da
glicose sanguínea for maior que o limiar renal o excedente é eliminado pela urina
(MEYRER, 2014).
22
1.2 MODELOS ANIMAIS PARA ESTUDO E EXPERIMENTAÇÃO EM DIABETES
Modelo é algo que permite imitação ou reprodução de algum evento, e deve
possuir características semelhantes e capacidade de ser manipulado, sem
apresentar total ou parcialmente, as dificuldades técnicas, logísticas ou biológicas do
objeto imitado (SANTOS, 2002a, FAGUNDES &TAHA, 2004).
O prefixo Bio tem sua origem na palavra grega “Bios” (vida) (FIGUEIREDO,
1913). O conceito biomodelação é considerado o termo genérico usado para
descrever a capacidade de reproduzir, em 3D, a morfologia de uma estrutura
biológica, sendo seu produto nomeado Biomodelo (D’URSO et. Al., 1998)
Sendo assim entende-se que biomodelos são os animais que melhor
respondem a um experimento, possibilitando a reprodução total ou parcial dos
aspectos que caracterizam um evento biológico, e de forma que possam ter seus
resultados reprodutíveis por outros grupos de pesquisa (SANTOS, 2002a).
Com o advento e evolução da experimentação em modelos animais ao longo
das últimas décadas, a necessidade de padronização dos mesmos, tanto sobre suas
características requeridas genotípica e fenotipicamente, dentre outras, deu-se a
necessidade da criação de biotérios, atualmente denominados instalações de
criação animal, onde parâmetros ambientais podem ser monitorados e mantidos
para que se mantenham as características das espécies e suas linhagens, incluindo
status genético e sanitário, além do seu bem-estar. Muitas espécies podem ser
usadas como biomodelos, sendo cada uma especificada para cada tipo de estudo,
e, dentre todas as espécies, o camundongo, por suas características de tamanho
reduzido, prole numerosa, ciclo reprodutivo curto, fácil adaptação ao cativeiro,
docilidade, e alta semelhança genética com humanos, é hoje, o biomodelo mais
utilizado em pesquisa (SANTOS, 2002a)
Através de sistemas de acasalamentos consanguíneos, tipo inbred, foi
possível fixar características biológicas desejáveis aos biomodelos murinos,
principalmente, tornando-os ainda mais específicos, criando, assim, animais
direcionados para o estudo de doenças como, por exemplo, a diabetes
(camundongo mutante non obese diabetic, ou nod),entre outras (SANTOS, 2002b).
Além das características originadas e mantidas por acasalamentos consanguíneos,
a biotecnologia também possibilitou gerar modelos geneticamente modificados,
dentre eles, os transgênicos (animais com alterações no código genético pela
23
introdução de uma ou mais sequências de genes provenientes de outra espécie,
mediante o emprego de técnicas de engenharia genética. o genoma dos organismos
transgênicos contém fragmentos do genoma de bactérias, vírus ou outros
organismos em seu DNA) e os nocautes (animal que possui uma ou algumas
sequências de seu genoma bloqueados, principalmente por RNA de interferência,
para produção de determinada molécula ou via metabólica específica, substituindo o
gene original em seu locus por uma versão modificada do mesmo (ANDRADE,
2002).
Além destes modelos geneticamente modificados, também foi possível,
através de seleção artificial, produzir linhagens mutantes (animais que de forma
natural ou induzidas sofreram algum tipo de modificação no genoma, gerando
eventos fisiológicos característicos) (FERREIRA et al., 2005; SANTOS, 2002b).
Há modelos animais com característica de apresentar a DM de forma
espontânea, porém há possibilidade também de induzir a doença no animal com o
uso de substâncias como a estreptozotocina (STZ) (IONUT et al., 2016) e Alloxan
(OLIVARES et al., 2017) ou até por processo cirúrgico com a retirada do pâncreas
no procedimento chamado pancreatectomia total. Os modelos animais que
apresentam alguma forma de diabetes serão descritos a seguir.
Em modelos animais como primatas não humanos, cães e roedores, pode-
se fazer a medição da glicose sanguínea com o auxílio dos mesmos aparelhos de
medição de diagnóstico humano, seguindo os valores de referência para cada
espécie.
1.2.1 Primatas não humanos
Os Primatas Não Humanos (PNH) são considerados o modelo animal
“padrão-ouro” (ANDRADE, 2017), pois são os mais semelhantes geneticamente aos
humanos, mimetizando a maioria dos aspectos característicos da DM1 acima
descritos (LUPPI et al., 2007).
Os PNH insulino-dependentes são importantes no xenotransplante de
ilhotas, porém a pancreatectomia total é de difícil execução e com níveis altos de
complicações. Já a indução pela administração de STZ pode causar efeitos tóxicos
(JIN et al., 2010).Também são os modelos utilizados nas fases finais de testes
clínicos com drogas para controle da DM1, como por exemplo, o tratamento com
24
Glucagon ancorado a microesferas sintéticas que aumentariam seu tempo de ação
no organismo sobre a diabetes (KELLI et al., 2017).
1.2.2 Cães
Podem ser utilizados como método primário para o estudo inicial de muitas
terapias sobre diabetes, incluindo transplante de ilhotas pancreáticas. Devido ao seu
tamanho, o modelo foi também utilizado para estudos e desenvolvimento de técnicas
de transplante de pâncreas (ADIN; GILOR, 2017; MACLEOD, 1922a; MACLEOD,
1922b). Cães podem ter a diabetes induzida através da aplicação de fármacos como
AlloxanDM1 (OLIVARES et al., 2017), ou estreptozotocinaDM2 (IONUT et al., 2016).
1.2.3 Roedores
Roedores, conforme descrito anteriormente, são os biomodelos mais eleitos
para uso em pesquisa. O rato (Rattus norvegicus albinus) tem sido amplamente
usado em estudos na fisiologia da diabetes (LERCO et al., 2003;), pois, como são
criados em sistemas não consanguíneos, mimetizam o fluxo gênico e a variabilidade
da população humana. Atualmente, há sub linhagens de ratos selecionadas para
uso específico em estudos de DM1, tais como os descritos abaixo:
ZDF (Zucker Diabetic Fatty) – Utilizado em estudos de diabetes 2,
desenvolve obesidade e resistência à insulina quando jovem e
hiperglicemia com a idade avançada. Esses processos são originados
de alterações nas células β do pâncreas e baixa resposta do tecido
hepático à insulina e glicose (SHIOTA & PRINTZ, 2012). Além disso,
diabetes tipos I e II podem induzir alterações cardiovasculares nesses
modelos (STABLEY et al., 2015).
ZDSD (Zucker Diabetic Spraguey Dawley) – Rato utilizado em
estudos da fase pré-diabética, expressa diabetes 2 originada da via
da leptina, exibindo obesidade, hiperlipidemia, hipertensão e
resistência à insulina (PETERSON et al., 2017).
BB (BioBreeding) – Rato utilizado em estudos sobre a patogênese de
diabetes 1, além de ensaios clínicos. O modelo BBDP (Diabetes-
Prone BB) desenvolve espontaneamente diabetes 1, enquanto o
25
BBDR (Diabetes-Resistant BB ), mesmo compartilhando os mesmos
genes do modelo anterior, não desenvolve a doença em abientes
livres de vírus (BORTELL & YANG, 2012).
LEW 1AR1/-IDDM (Lewis-insulin dependent diabetes mellitus) – Rato
utilizado em estudos sobre as complicações da diabetes, expressa
diabetes 1 muito similar à humana, com rápida progressão de insulite
e destruição de células β. A doença é expressa igualmente em
machos e fêmeas e consegue viver em boas condições mesmo após
os sintomas da doença (AL-AWAR et al., 2016).
GK (Goto-Kakizaki) – Rato utilizado em estudos de diabetes II,
expressa intolerância à glicose, além de hiperglicemia quando jovens
e fibrose pancreática após insulite. O fenótipo e funcionalidade das
células β nesse modelo pode levar à glucolipotoxicidade (AL-AWAR
et al., 2016).
Outros roedores, como o camundongo, devido às características biológicas e
de manejo já descritas, tem sido o modelo mais eleito neste tipo de estudo.
1.3 O CAMUNDONGO COMO MODELO EXPERIMENTAL
O camundongo, dentre os roedores utilizados, tem sido o modelo mais bem
caracterizado e modificado geneticamente para estudos em DM1. Assim como o rato
albino, o camundongo Swiss Webster não consanguíneo é amplamente utilizado em
pesquisa e testes de drogas na DM1. Dentre os modelos transgênicos, por exemplo,
há animais que super expressam o polipetídeo hiAPP presente no pâncreas de
pacientes diabéticos (ALCARRAZ-VIZÁN et al., 2017; HÖPPENER et al., 2008).
Dentre os camundongos mutantes selecionados artificialmente com
características próprias para estudos em DM1, a linhagem congênica mutante NOD
é a mais utilizada atualmente (FERREIRA et al., 2005).
26
1.4 CAMUNDONGO NOD
1.4.1 Histórico
A linhagem NOD foi desenvolvida pelo Dr. Susumo Makino nos Laboratórios
de Pesquisa de Shionogi em Aburahi - Japão a partir do cruzamento de duas
linhagens consanguíneas, sendo uma delas propensa à catarata (Cataract Shionogi-
CTS) e a outra resistente à catarata (Non-cataract- NCT) (LEITER, 1993). Na
geração 6 deste cruzamento, foram identificados animais livres de catarata com
níveis glicêmicos em jejum anormalmente altos, os quais foram selecionados pelos
criadores para geração de matrizes diabéticas (KIKUTANI; MAKINO, 1992). Na
geração 13 deste cruzamento, os animais com níveis glicêmicos em jejum normais
(100mg/dL) começaram a ser separados pelos criadores daqueles com níveis
glicêmicos mais elevados (acima de 150mg/dL), visando criar um grupo controle. Por
fim, na geração 20, uma fêmea proveniente da linhagem controle apresentou
manifestações clínicas de diabetes autoimune (LEITER, 1993), dando origem,
assim, à linhagem NOD/Shi gerada a partir dos sucessivos cruzamentos
consanguíneos entre animais diabéticos provenientes da linhagem controle. A
incidência da doença nesta linhagem é de 70 a 80% nas fêmeas e 20% nos machos
(KIKUTANI & MAKINO, 1992), sendo este dimorfismo provavelmente devido à ação
dos hormônios sexuais (LEITER, 1993).
O camundongo diabético não obeso (Non Obese Diabetic NOD) é conhecido
por desenvolver uma forma de DM1 com origem autoimune clínica e geneticamente
similar à DM1 em humanos, motivo pelo qual é considerado um dos principais
modelos de estudos para doença (DELOVITCH & SIGH, 1997). Durante o curso da
doença o pâncreas perde células β responsáveis pela produção da insulina, como
consequência de uma resposta autoimune sob o controle poligênico, cuja
penetrância é fortemente influenciada por fatores ambientais e estocásticos (LA
CAVA et al., 2001), sendo que os animais em estado autoimune apresentam índices
glicêmicos acima de 250mg/dL, valor determinado para o início da DM1 nesta
linhagem (FORNARI, 2008). Dados observados previamente na colônia de
camundongo NOD do ICTB/Fiocruz demonstraram que alguns indivíduos podem
alcançar valores acima de 500mg/dL. Além do fator genético, outros fatores podem
influenciar na manifestação da DM-1 sendo estes, o estresse de manejo, nutrição,
27
temperatura ambiental, status sanitário, entre outros (LA CAVA et al., 2001; MAKINO
et al., 1980; POZZILLI et al., 1993; MCDEVITT, 1996).
1.4.2 Características da linhagem
O camundongo da linhagem NOD é considerado um importante modelo para
estudo das doenças do sistema imune, principalmente a DM1 (ANDERSON &
BLUESTONE, 2005). Além de estudos em bioquímica (aproximadamente 1160
trabalhos publicados), fisiologia (aproximadamente 700 trabalhos publicados)
(PUBMED, acesso em 4 março de 2018). Como características fenotípicas, é um
camundongo albino, não obeso, com prole em torno de 6 animais por parto, tendo
peso médio, quando adulto de 25 g (fêmeas) e 30g (machos), A hiperglicemia se
inicia em fêmeas com aproximadamente 12 semanas de vida e mais tardio em
machos (The Jackson Lab). É considerado o início do processo diabético quando a
glicemia plasmática, sem jejum, é superior a 250 mg/dL (FORNARI, 2008) e
apresentam hiperglicemia, poliúria e polidipsia decorrentes do processo diabético,
assim como humanos.
Podemos encontrar sub-linhagens em biotérios diferentes, tendo
características próprias e que as diferem entre si, como por exemplo:
NOD/ShiLtJ – Utilizado em estudos gerais sobre diabetes I, expressa
insulite, consequentemente a resistência à insulina, de maneira mais
tardia em machos. Pode ser usado como background na construção
de modelos geneticamente modificados com aplicações em
farmacologia e imunologia devido às alterações em fenótipos
celulares durante o curso da doença (The Jackson Lab, 2018).
NOD/MrkTac - Utilizado em estudos gerais sobre diabetes I, expressa
insulite autoimmune a partir de quatro semanas e sintomas da
diabetes tipo I em 50% das fêmeas a partir de três meses, e em 15%
dos machos, a partir de seis meses (LABORATÓRIOS TACONICS,
2018).
No Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos (ICTB), a linhagem
NOD (Figura 1) foi recebida em 2007, sendo suas matrizes de fundação e produção
mantidas em ambiente controlado. As matrizes que vieram para o ICTB, segundo
registros da unidade, são oriundas da colônia original mantida nos Laboratórios
28
Taconic. Atualmente, são produzidos em torno de100 animais/mês para
fornecimento aos usuários.
Figura 1 Camundongo da linhagem NOD criado no ICTB
Fonte: Arquivo pessoal, 2017
1.4.3 Manejo
Por ser uma linhagem inbred os acasalamentos devem ser realizados entre
irmãos a fim de se manter o fundo genético (SANTOS, 2002b). A troca de gaiola,
ração e água é realizada semanalmente e são acondicionados, no máximo, 7
indivíduos por gaiola (Figura 2) até que completem a idade requerida pelos usuários
para fornecimento.
Figura 2 Gaiola microisoladora de criação de camundongo
Fonte: Arquivo pessoal, 2017
29
a) Gaiola montada, maravalha, enriquecimento ambiental, ração e água
(todos previamente autoclavados) acomodação de até 7 animais; b) Gaiolas no rack
já com a identificação individual, sendo o fundo azul para gaiolas com machos e
fundo rosa para gaiolas com fêmeas.
Esta linhagem, assim como as outras produzidas no instituto, tem seu status
genético e sanitário monitorados, a fim de garantir a qualidade do modelo.
1.5 FATORES QUE AFETAM A PRODUÇÃO, MANUTENÇÃO E
EXPERIMENTAÇÃO EM MODELOS ANIMAIS
1.5.1 Status genético
Os biomodelos podem ser classificados em outbred, ou seja, não
consanguíneos, heterogênicos ou inbred que são consanguíneos ou isogênicos.
Animais outbred, devido ao sistema de acasalamento, método Poiley,
mantém alta taxa de heteregozigose (99%), assim, possibilitando a reprodução /
mimetização de populações naturais. Já os biomodelos inbred, são produtos de pelo
menos 20 gerações de acasalamentos entre irmãos ou pais e filhos, garantindo,
assim, um índice de homozigose de 99%, tornando esses modelos mais idênticos
geneticamente, mantendo determinada característica (SANTOS, 2002b).
Caso haja quaisquer erros na manutenção dos tipos específicos de
acasalamento (troca de matrizes, desconhecimento da origem das matrizes, não
realização frequente de monitoramento genético), o status genético é quebrado e a
linhagem deve ter sua produção bloqueada, a fim de se realizarem técnicas de
retrocruzamento, ou inseminação de novas matrizes com material proveniente do
banco de sêmen ou óvulos, para uma nova linhagem (SANTOS, 2002b).
1.5.2 Status sanitário
Os animais de experimentação podem ser classificados conforme o seu
status sanitário, e com isso, as instalações do biotério ou laboratório deverão
oferecer barreiras para que esse status se mantenha (FERREIRA et al., 2005;
COUTO, 2002a). O status sanitário está correlacionado com os organismos
associados externos, como ectoparasitas, ou internos, como bactérias, protozoários,
30
vírus, entre outros. Toda avaliação de patógenos no status sanitário das colônias, é
baseada nas recomendações da FELASA (Federation for Laboratory Animal
Science Association)
Os animais, de acordo com status sanitário, podem ser classificados em:
Gnotobióticos (gnoto = conhecida, conhecer; biota = vida):
animais gnotobióticos são animais onde se tem o conhecimento da
microbiota presente por estarem em um sistema sanitário com
barreiras rigorosas, podendo ainda, serem germfree, ou seja, livres de
germes associados (FERREIRA et al., 2005).
Livres de Patógenos Específicos (Specific PathogenFree – SPF)
ou heteroxênicos: são biomodelos livres organismos associados
(microorganismos e parasitos) conhecidos, porém, pode estar ou não
livre de outros microrganismos internos ou externos (FERREIRA et
al., 2005; COUTO, 2002a). Da mesma forma que os animais
germfree, os animais SPF devem ser mantidos em ambientes dotados
de rigorosas barreiras sanitárias, para que possa assegurar o status
sanitário. estes animais têm sido muito utilizados pois proporcionam
experimentação mais segura, pontual e reprodutível (COUTO, 2002a).
Convencionais: animais com biota indefinida, onde não há
necessidade de barreiras sanitárias rigorosas nas suas instalações
(FERREIRA et al., 2005; COUTO, 2002a).A escolha pelo uso de
animais convencionais depende dos objetivos da pesquisa a ser
realizada e é um status presente na maioria das instalações
nacionais.
O status sanitário está diretamente ligado aos desafios experimentais que o
animal irá passar, sendo assim um ponto importante na escolha do modelo
(ANDERSON; BLUESTONE, 2005).
A quebra de barreiras físicas ou químicas, além de erros de manejo nas
instalações pode promover alterações nesse status, promovendo infecções
indesejadas nas colônias, levando a um plano de contingência com tratamentos
medicamentosos específicos, além de alterações estruturais na instalação, que
prejudicam a produção da linhagem e afetam a experimentação com os biomodelos.
31
Os camundongos da linhagem NOD criados no ICTB, segundo o
monitoramento sanitário realizado no período da coleta de dados constatou que a
sala de criação possuía a presença de Pasteurella pneumotropica.
Segundo a folha técnica do Laboratório Charles River (2018), animais
portadores da P. pneumotropica podem ser utilizados na pesquisa, exceto se
estiverem clinicamente doentes.
1.5.3 Fatores Ambientais e Nutricionais
Diversos fatores ambientais influenciam diretamente na fisiologia dos
animais, dentre eles, luminosidade, temperatura, umidade, ruídos, gases tóxicos,
entre outros (PEARSON et al., 2016). Esses fatores podem, inclusive, influenciar na
susceptibilidade do modelo a determinada infecção, alterar seus ciclos reprodutivos,
e comportamento, dentre outras diversas características (PEARSON et al., 2016,
ANDRADE, 2002). Algumas linhagens são mais susceptíveis que outras quando
desafiadas por estresse ambiental. Segundo Mullen (2017), os camundongos NOD
criados por Makino, quando não eram mantidos em status sanitário SPF ou criados
em grande escala já em condições não SPF demonstravam uma alteração
significativa na incidência de diabetes entre os grupos, enquanto que animais
mantidos em ambiente não SPF tiveram a expressão genica tardia ou abaixo do
esperado.
A nutrição tem grande influência na fisiologia do animal, favorecendo ou
prevenindo doenças, auxiliando no seu desenvolvimento, e modulando suas funções
biológicas (PAULA et al., 2009). Cada linhagem tem requisitos nutricionais
específicos, porém, em instalações com grandes produções, como ICTB, os animais
são mantidos com rações de uso geral, porém, com parâmetros previamente
estabelecidos.
Em relação aos biomodelos utilizados para estudo de DM1, como o
camundongo NOD, os fatores ambientais e nutricionais acima descritos podem agir
como indutores da patogênese da doença e grau de comprometimento do indivíduo
(SESTERHEIM et al., 2007).
32
1.5.4 Boas práticas de manejo e manutenção de linhagens em biotérios
Atualmente, além da qualidade e especificidade dos modelos fornecidos
para pesquisa, deve-se levar em conta o bem estar animal nas instalações de
criação. De acordo com a Lei 11.794 de 2008 (BRASIL, 2008), há normas a serem
seguidas para a correta utilização de animais em pesquisa e ensino. Esta lei
determinou a criação do CONCEA (Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal) e CEUAs (Comitês de Ética de Uso Animal). Todas essas
normas determinam padrões de criação, manejo e experimentação.
Além das normativas da Lei Arouca, outros pontos devem ser levados em
conta ao se utilizar animais em pesquisa. O princípio dos 3Rs, proposto por
RUSSEL & BURCH (1959), aconselha parâmetros que possam substituir
(replacement), reduzir (reducement) ou refinar (refinement) o usos animal em
pesquisa. A depender do propósito de cada instalação ou laboratório de
experimentação, um ou mais desses princípios podem ser aplicados.
Nas colônias de produção do ICTB, dois destes princípios são aplicados
diretamente. A produção de animais geneticamente modificados leva à redução no
uso de modelos convencionais e o refinamento no manejo das colônias reduz o
estresse ambiental, levando à homeostasia dos modelos. Projetos de
enriquecimento ambiental em andamento, além de procedimentos operacionais
padrão sobre diversos aspectos da colônia, têm influenciado na melhoria da
produção de biomodelos no ICTB.
Dentro deste contexto, a avaliação da DM1 da linhagem NOD objetiva
determinar uma curva padrão de glicemia específica dos animais produzidos no
ambiente SPF do ICTB, refinando seu manejo, e, levando ao usuário maior
conhecimento acerca do modelo produzido pelo instituto.
33
2 JUSTIFICATIVA
O camundongo NOD é hoje o principal biomodelo no estudo da DM1, devido
apresentar semelhança com a doença em humanos. Além do uso para estudos da
DM1, o camundongo NOD pode ser utilizado no estudo de alterações bioquímicas e
fisiológicas em mamíferos, o que o torna um grande aliado na pesquisa biomédica.
Embora os procedimentos de manejo das colônias de camundongos NOD do ICTB
estejam conforme as normas recomendadas pelo Canadian Council on Animal Care
(CCAC) de 2003, diversos fatores externos podem influenciar na expressão dos
genes correlacionados a diabetes bem como influenciar no sistema imune do animal.
A caracterização do camundongo NOD e a expressão genética da Diabetes estão
correlacionadas com fatores ambientais (luminosidade, ruído, temperatura e
pressão), nutricionais (alimentação desbalanceada e suplementação com alimentos
calóricos), sanitários contaminações por microorganismos), entre outros, e, com
isso, cada biotério pode possuir animais com características próprias, mesmo
mantendo ainda a autenticidade genética. Com a caracterização da linhagem na
colônia de NOD criada no ICTB, é possível o refinamento das técnicas de criação,
atualização do portfólio do ICTB com informações próprias dos animais que serão
fornecidos, gerando uma possível redução do número necessário de animais nas
pesquisas, atendendo assim dois pontos da proposta dos 3R’s (Refinamento e
Redução).
34
3 OBJETIVOS
3.1 GERAL
Caracterizar a colônia de camundongos inbred da linhagem NOD criada no
ICTB/Fiocruz através da análise dos dados coletados semanalmente do índice
glicêmico e peso vivo
3.2 ESPECÍFICOS
Caracterizar a curva glicêmica de camundongos NOD criados no
ICTB.
Correlacionar a curva glicêmica com a curva de peso vivo dos
camundongos NOD do ICTB para fornecimento..
Determinar a idade de manifestação da diabetes na colônia de
camundongos NOD do ICTB.
Caracterizar a Histopatologia.
Refinar a produção de camundongos NOD do ICTB fornecendo
animais mais adequados para pesquisa
Elaborar um portfólio da linhagem como informativo aos
pesquisadores.
35
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 ASPECTOS ÉTICOS
Todos os procedimentos realizados nos animais vivos foram autorizados
pela Comissão de Ética no Uso de Animais CEUA-Fiocruz a través da licença LW-
35/17 e constam no Protocolo CEUA Nº33/17-3 (ANEXO nº1).
4.2 CÁLCULO AMOSTRAL E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
O tamanho amostral foi calculado segundo a fórmula n={[(Zα/2)*σ]/E}2 onde
n é o tamanho amostral, Zα/2 é o valor crítico correspondente ao grau de confiança
desejado, σ é o desvio padrão da variável analisada e E corresponde ao erro
máximo de estimativa aceito. Foi determinado um grau de confiança de 95%, ao
qual corresponde um valor crítico Zα/2 de 1,96; o σ da porcentagem de
camundongos NOD fêmeas criadas no ICTB manifestando diabetes tipo 1 ao cabo
de 30 semanas foi estimado em aproximadamente 25%, e foi determinado um E do
10%. De acordo com esta fórmula, o tamanho amostral de fêmeas para o presente
estudo foi de: n=[(1,96 x 25%)/10]2= 24 animais. Para atingir o objetivo de
caracterizar a colônia inteira, um grupo de semelhante de machos foi constituído.
4.3 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
As variáveis, índice glicêmico e peso vivo em ambos os sexos foram
inicialmente submetidas a análises exploratórias nas quais foram calculadas a média
(M), o desvio padrão (DP) e o intervalo de confiança (IC) bilateral a um nível de 95%.
Seguidamente foi verificada a normalidade da sua distribuição a través dos testes t
de D'Agostino e Pearson e de Shapiro Wilk, a intervalos de confiança bilaterais de
95% e níveis de significância de 5%. Posteriormente, as variáveis foram comparadas
entre sexos através do teste t bilateral não pareado corrigido por Welch para
igualdade de médias e o teste F para igualdade de variâncias, os dois com intervalos
de confiança bilaterais de 95% e níveis de significância superiores ao 5%.
Finalmente, foram calculadas as correlações entre as duas variáveis por sexo
aplicando o teste de correlação de Pearson bilateral com intervalo de confiança de
36
95% e nível de significância de 5%. Todas as análises foram feitas no programa
Prism 7 para Windows ® versão 7.00 (GraphPad ®, La Jolla California USA,
www.graphpad.com).
4.4 MANEJO DOS ANIMAIS
Selecionaram-se para o monitoramento 23 fêmeas e 24 machos da linhagem
NOD criados no ICTB com três semanas de vida, os quais foram separados por
sexo, distribuídos em grupos aleatórios de quatro a sete indivíduos tendo-se nas
fêmeas um grupo de quatro animais, um grupo de cinco animais e dois grupos de
sete animais, e nos machos três grupos de quatro animais e dois grupos de seis
animais. Os grupos foram alocados em gaiolas do tipo micro isolador modelo
Ventilife® (ALESCO - BRA) com dimensões de 460 cm² de piso por 21 cm de altura.
Em geral os grupos foram conformados por animais da mesma ninhada, sendo o
seu tamanho afetado pela proporção de sexos. Nos casos eventuais nos quais o
número de animais de um sexo foi inferior a quatro, os grupos foram constituídos
misturando animais de distintas ninhadas.
As gaiolas foram mantidas em uma sala de manejo com fotoperíodo
programado para 12 horas de luz e 12 horas de escuridão, controle de temperatura
com margem entre 20 e 22 ºC e umidade ambiental com margem entre 40 e 60%. A
rotina de manejo foi feita semanalmente e consistiu na troca do substrato (maravalha
de Pinus sp.), da água e da ração comercial peletizada assim como dos elementos
de enriquecimento ambiental: iglus, algodão hidrófobo e/ou tubos de papelão (Figura
3). Todos os itens oferecidos durante o manejo foram previamente esterilizados por
autoclavagem.
37
Figura 3 Itens utilizados para enriquecimento ambiental do NOD no ICTB
a) iglus, b) algodão hidrófobo, c) tubos de papelão. Estes objetos foram fornecidos para mi-nimizar o estresse do confinamento, buscando estimular nos animais a manifestação de condutas naturais.
Fonte: Arquivo pessoal, 2017
4.5 MARCAÇÃO E MONITORAMENTO DOS ANIMAIS
Os animais foram monitorados entre a 10ª e 30ª semana de vida e, para as
análises estatísticas definiu-se como unidade amostral a média semanal de cada
parâmetro por sexo, devido à diferença no número de medidas como consequência
da eliminação dos animais submetidos a eutanásia ao longo do monitoramento.
Sendo assim, o tamanho amostral foi de 20 unidades por parâmetro analisado.
Visando reduzir o estresse produzido pela manipulação, as medições do
índice glicêmico e do peso vivo foram efetuadas durante as rotinas de manejo. De
igual forma e para garantir o correto acompanhamento semanal de cada animal
foram feitas marcações individuais usando tintura a base de solução de ácido pícrico
ao início do primeiro monitoramento, às dez semanas de vida (Figura 4).
38
Figura 4 Identificação dos animais
Camundongo NOD exibindo marcação com tintura a base de ácido pícrico. Fonte: Arquivo pessoal, 2017
Dentro da cabine de fluxo laminar da sala, cada animal foi retirado
cuidadosamente da gaiola e segurado por um técnico o qual expôs sua área dorsal
enquanto outro técnico efetuou a marcação com um pincel de ponta fina, conforme
os padrões de marcação apresentados no Anexo 1 - Figura 2.
4.6 MEDIÇÃO DO ÍNDICE GLICÊMICO
O índice glicêmico foi medido conforme descrito no POP-SCRL-267 e o
sangue foi coletado a partir da ponta da cauda conforme o procedimento descrito no
POP-SCRL-268. Cada animal foi retirado da gaiola e colocado em uma caixa de
contenção confeccionada em polímero plástico de 10 cm de comprimento, 5 cm de
largura e 5 cm de altura especialmente desenhada e projetada para facilitar a
exposição e manuseio da cauda provocando o mínimo de estresse (Figura 5a). Com
o auxílio de uma tesoura cirúrgica devidamente esterilizada por autoclavagem e
submersa em álcool etílico 70%, foi feito um corte a menos de 1 mm da ponta da
cauda obtendo-se o extravasamento de uma gota de sangue (Figura 5c) a qual foi
coletada na fita (Figura 5a.iv) previamente inserida no aparelho de medição de
glicicemia da marca GTech® modelo Free 1 (Accumed-Glicomed® – BRA, Figura
5a.v).
39
Figura 5 Coleta de sangue da ponta da cauda de camundongo.
a) Material para coleta de sangue e medição do índice glicêmico: i) gaiola tipo microisolador, ii) tesoura cirúrgica em álcool 70%; iii) Caixa de contenção para camundongo; iv) Fita de medição de glicose; v) Aparelho de medição de glicose. b) Camundongo na caixa de con-tenção. Note-se a facilidade de manipulação da cauda com apenas uma mão. c) Obtenção do sangue periférico após o corte da ponta da cauda. d) Medição da glicose com auxílio do aparelho.
Fonte: Arquivo pessoal, 2017
O sangramento da ponta da cauda foi contido utilizando pó hemostático para
uso em animais a base de cloreto férrico, cloreto de alumínio e sulfato de cobre
(Granado®). Nas semanas seguintes, o animal foi contido da mesma forma e o
sangue foi obtido apenas retirando o tampão cicatricial da ponta da cauda, fazendo a
devida hemostasia conforme descrito anteriormente. Os valores registrados pelo
aparelho de medição foram anotados manualmente em uma ficha de controle
individual (Anexo III) e posteriormente tabulados em uma planilha eletrônica para a
posterior análise dos dados.
4.7 MEDIÇÃO DO PESO VIVO
Logo após a medição da glicemia, a caixa de contenção foi virada com o
animal no seu interior e pesada em uma balança eletrônica da marca BEL® (ITA)
com precisão de 0,01g, previamente tarada e zerada descontando o peso da caixa
40
(Figura 6). O peso vivo foi igualmente registrado na ficha de controle individual
(Anexo III) e posteriormente tabulado na planilha eletrônica para análise.
A utilização da caixa de contenção durante a medição do peso vivo do
animal proporciona um maior conforto pois evita o estresse durante a pesagem e o
estresse térmico pelo contato com o prato metálico da balança que devido a
temperatura do macro ambiente se encontra gelado.
Figura 6 Medição do peso vivo.
Fonte: Arquivo pessoal, 2017
Ao final de cada manejo, os animais foram colocados de volta nas suas
respectivas gaiolas, as quais tiveram durante o monitoramento a troca da maravalha,
água, ração e itens de enriquecimento ambiental.
41
Figura 7 Linha do tempo das medições glicêmicas e peso vivo dos animais no
estudo
Linha do tempo indicando as avaliações de índices glicêmicos e peso vivo realizados desde a 10ª semana de vida até até o End Point (30ª semana de vida). Marcação com ácido pícrico apenas na primeira semana (10 semanas de vida), a pesagem e verificação do índice glicêmico foram semanais.
4.8 EUTANÁSIA
Todos os animais que apresentaram, a qualquer momento, perda de peso
superior a 25% do peso da marcação da semana anterior ou glicemia acima de 250
mg/dL foram encaminhados para eutanásia para evitar sofrimento desnecessário
(ponto final humanitário). De igual forma os animais que atingiram 30 semanas de
vida e não apresentaram perda de peso ou glicemia acima do limite foram
submetidos a eutanásia conforme o descarte zootécnico da colônia de criação.
Para o procedimento de eutanásia foi utilizado um sistema de anestesia
inalatória especialmente desenvolvido para uso em animais de pequeno e médio
porte, da marca Bonther(R) modelo Kent Cientific. Este conta com um sistema de
cálculo automático de anestésico de 0,5 à 19,9% com resolução de 0,1 % e
monitoramento digital da saída do mesmo, vaporizador universal com escala de 0 à
105 cm³ e uma caixa de indução selada feita em acrílico cinza de 10 mm de
espessura e de dimensões de 150 mm de altura por 150 mm de largura por 300 mm
de profundidade. Os camundongos destinados à eutanásia receberam previamente
uma dose pré-anestésica de 100 mg/kg de cetamina acrescida de 10 mg/kg de
xilazina pela via intraperitonial utilizando agulha de 0,45 x 13 mm (26G ½), sendo
verificada a sedação pela ausência dos reflexos corneal, plantar e das vibrissas.
Imediatamente foram colocados na caixa de indução e expostos à inalação de
isofluorano ao 5% até se observar a cessação total dos movimentos respiratórios. O
42
óbito foi confirmado pela verificação da ausência de batimentos cardíacos, cianose
das mucosas e ausência dos reflexos corneal, plantar e das vibrissas.
4.9 NECROPSIA E COLETA DE AMOSTRAS
As carcaças dos animais que apresentaram índices glicêmicos iguais ou
superiores a 250 mg/dL foram submetidas a necropsia para coleta do pâncreas e
fígado. Para fazer o controle da morfologia normal do órgão foram coletados
adicionalmente os pâncreas das carcaças de um macho e uma fêmea da linhagem
NOD com níveis glicêmicos normais e três camundongos da linhagem C57Bl/6 do
descarte zootécnico.
4.10 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
As amostras de tecido coletadas foram fixadas em formol 10% tamponado,
embebidas em parafina plástica e submetidas a cortes histológicos de 30 a 40
micras de espessura e fixadas em lâminas histológicas convencionais, as quais
foram coradas com hematoxilina e eosina – floxina e analisadas em microscópio
óptico Carl Zeiss® modelo Axiostar® a aumentos de 100X, 200X e 400X. As
fotomicrografias foram capturadas usando um digitalizador de imagem marca Carl
Zeiss® modelo Axiocam ERc 5s® a aumento de 400X utilizando o programa
AxiovisionVs40x64V4.9.1.0®.
Foram analisadas no total de 18 amostras de tecido pancreático e hepático,
nove de fêmeas e nove de machos, sendo quinze de camundongos da linhagem
NOD e duas da linhagem C57Bl/6 como controle não diabético. Todas as amostras
foram provenientes do biotério de criação do ICTB/Fiocruz. Foram definidos então
três graus de infiltração mononuclear de acordo com a porcentagem de ilhota
afetada: grau I (quando o infiltrado afetou até 25% da ilhota), grau II (quando o
infiltrado afetou mais do 25% e até 50% da ilhota) e grau III (quando o infiltrado
afetou mais do 50% da ilhota). De igual forma o índice glicêmico foi classificado em
quatro níveis sendo o nível um inferior a 250 mg/dL, o nível dois entre 250 e 350
mg/dL, o nível três entre 350 e 450 mg/dL e o nível quatro superior a 450 mg/dL. No
fígado, foi determinado o grau de vacuolização em hepatócitos, caracterizando lesão
hepática.
43
5 RESULTADOS
5.1 ÍNDICE GLICÊMICO
O índice glicêmico mínimo registrado nas fêmeas foi de 69 mg/dL
(identificado em um animal com 15 semanas de vida e peso vivo de 22,00 g) e nos
machos foi de 90mg/dL em um animal com 11 semanas de vida com peso vivo de
25,15g, já o valor máximo registrado nas fêmeas foi superior a 600 mg/dL (registrado
no aparelho glicêmico como Hi) identificado em um animal com 22 semanas de vida
e peso 20,13g caracterizando já a perda de peso devido ao processo diabético e
nos machos foi de 450 mg/dL em um animal com 23 semanas de vida e peso
equivalente a 31,30g.
Ao analisar os grupos amostrais, as fêmeas registraram uma média semanal
de 150 mg/dL ± 4,9 com um IC 95% entre 140 e 160 mg/dL, enquanto os machos
registraram uma média semanal de 158 mg/dL ± 4,2 com um IC 95% entre 149 e
167 mg/dL. Os dados da estatística descritiva estão resumidos na Tabela 1
44
Tabela 1 – Estatística descritiva do índice glicêmico em camundongos NOD de 10 a
30 criados no ICTB/Fiocruz
Parâmetro estatístico Fêmeas Machos
Tamanho amostral (n) 20 20
Valor médio mínimo 121 140
Percentil 25% 128 143
Mediana 147 151
Percentil 75% 172 170
Valor médio máximo 191 199
Média 150 158
Desvio Padrão 22 19
Erro Padrão da Média 4,9 4,2
Limite inferior do IC da Média 95% 140 149
Limite superior do IC da Média 95% 160 167
Valores expressados em mg/dL
Fonte: Elaborada pelo próprio autor
Ao analisar os resultados do teste t de D'Agostino e Pearson os dois grupos
amostrais apresentaram uma distribuição normal a um nível de significância de 5%.
Já no teste t de Shapiro - Wilk, só as fêmeas mostraram uma distribuição normal a
um nível de significância do 5%. Os dados das análises são apresentados na Tabela
2.
45
Tabela 2 – Resultados dos testes de normalidade para a variável índice glicêmico
semanal em camundongos NOD de 10 a 29 semanas criados no ICTB/Fiocruz
Teste t de D'Agostino e Pearson para o índice glicêmico
Parâmetro estatístico Fêmeas Machos
Valor K² 3,100 3,600
Valor P 0,215 0,168
P≤0,05
Teste t de Shapiro-Wilk para o índice glicêmico
Parâmetro estatístico Fêmeas Machos
Valor W 0,920 0,850
Valor P 0,090 0,006
P≤0,05
Fonte: Elaborada pelo próprio autor
Os resultados do teste t não pareado (corrigido por Welch) e do teste F para
diferença de variâncias foram não significativos, os dois a níveis de significância do
5%, indicando que as médias e variâncias semanais dos índices glicêmicos foram
similares em ambos os sexos. Os resultados estão resumidos na Figura 7.
Os resultados dos testes de comparação de medias e de variâncias foram os
seguintes:
a) Teste t não pareado (com correção de Welch). t(37) = 0,2073, p < 0.05.
b) Teste F de comparação de variâncias. F(19) = 0,4995, p < 0.05.
c) M ± EPM: fêmeas = 150 ± 4,9 (n=20); machos = 158 ± 4,2 (n=20);
diferença entre as médias = 8,2 ± 6,4; IC (95%) = -4,8 a 21; R² = 0,043.
46
Figura 8 Comparação de médias semanais de índice glicêmico entre sexos
Análise das médias semanais dos índices glicêmicos dos camundongos NOD criados no ICTB (machos em azul e fêmeas em vermelho) comparado com a idade do animal medida em semanas, apresentando tendência de aumento do valor médio do índice glicêmico no decorrer das semanas. P=0,2073
Figura 9 Linha do tempo ilustrando a data de ocorrência da alta glicêmica
Linha do tempo indicando o manejo realizado semanal e os acontecimentos mais relevantes e sua marcação temporal, indicando as características da linhagem NOD criada no ICTB.
5.2 PESO VIVO
O valor médio semanal do peso vivo dos grupos amostrais de fêmeas foi de
24 g ± 0,32 com um IC 95% entre 23 e 24 g; já o valor médio semanal da massa
47
corporal nos machos foi de 31 g ± 0,6 com um IC 95% entre 30 e 32 g. Os dados da
estatística descritiva estão resumidos na Tabela 3.
Tabela 3 – Estatística descritiva do peso vivo em camundongos NOD de 10 a 30
semanas criados no ICTB/Fiocruz
Parâmetro estatístico Fêmeas Machos
Tamanho amostral (n) 20 20
Valor mínimo 20 26
Percentil 25% 23 29
Mediana 24 31
Percentil 75% 25 33
Valor máximo 25 34
Média 24 31
Desvio Padrão 1,4 2,7
Erro Padrão da Média 0,32 0,6
Limite inferior do IC da Média 95% 23 30
Limite superior do IC da Média 95% 24 32
Valores expressados em g.
Fonte: Elaborada pelo próprio autor
Sendo os valores no inicio da coleta de dados (10 semanas de vida) em
fêmeas mínimo de 16,00g, máximo 22,75g e média 20,48g ± 0,97 já em machos
mínimo 22,37g, máximo 29,29g e média 25,52g ± 1,52.
Os resultados dos testes de comparação de medias e de variâncias foram os
seguintes:
a) Teste t não pareado (com correção de Welch): t(29) <0,0001, p < 0.05.
b) Teste F de comparação de variâncias. F(19) = 0,0076, p < 0.05
c) M ± EPM: fêmeas = 24 ± 0,32 (n=20); machos = 31 ± 0,6, (n=20);
diferença entre as médias = 7,3 ± 0,68; IC (95%) = 5,9 a 8,7; R² = 0,8.
48
Figura 10 Comparação de médias semanais de peso vivo entre sexos
Curva de ganho médio de peso vivo dos camundongos da linhagem NOD, sendo azul para macho e vermelho para fêmea. Variações intragrupos demonstradas em Erro Padrão Médio (EPM).
Os resultados dos testes t de normalidade de D’Agostino e Pearson e de
Shapiro-Wilk, apresentaram resultados não significativos nos dois casos, indicando
que os valores médios semanais de peso vivo em ambos os sexos apresentaram
distribuições normais a um nível de significância de 5%. Os resultados são
apresentados na Tabela 4.
49
Tabela 4 – Resultados dos testes de normalidade para a variável peso vivo semanal
em camundongos NOD de 10 a 29 semanas criados no ICTB/Fiocruz.
Teste t de normalidade de D'Agostino e Pearson para o peso vivo
Parâmetro estatístico Fêmeas Machos
Valor K² 2,6 2,5
Valor P 0,2749 0,2826
P≤0,05
Teste t de normalidade de Shapiro-Wilk para o peso vivo
Parâmetro estatístico Fêmeas Machos
iValor W 0,92 0,94
Valor P 0,1115 0,273
P≤0,05
Fonte: Elaborada pelo próprio autor
Ao fazer as comparações do peso vivo semanal, ambos os resultados do
teste t não pareado (corrigido por Welch) e do teste F para diferença de variâncias
foram significativos a níveis de significância de 5%, corroborando a diferença no
comportamento deste parâmetro entre sexos (Figura 10).
5.3 CORRELAÇÃO ENTRE ÍNDICE GLICÊMICO E PESO VIVO
O coeficiente de correlação de Pearson foi significativo nas análises de
machos e fêmeas, a intervalos de confiança bilaterais de 95% e graus de
significância de 5%, mostrando uma correlação positiva entre o índice glicêmico e o
peso vivo em ambos os sexos. Os resultados são ilustrados na Figura 9.
50
Figura 11 Coeficiente de correlação de Pearson entre índice glicêmico e peso vivo
de camundongos NOD machos e fêmeas de 10 a 29 semanas de vida, criados no
ICTB/Fiocruz. Em azul Machos: r(20) = 0,79, p < 0,0001; Em vermelho Fêmeas:
r(20) =0,72, p = 0,0003. IC = 95%, alfa = 5%.
5.4 PROPORÇÃO DE CAMUNDONGOS DIABÉTICOS
O percentual de fêmeas que atingiram índice glicêmico acima de 250mg/dL
ao final da semana 29 foi de aproximadamente 30% já em machos
aproximadamente 33%.
Tabela 5 – Níveis de índice glicêmico em camundongos NOD de 10 a 29 semanas
de vida, criados no ICTB/Fiocruz.
Índice glicêmico (mg/dL) Fêmeas Machos
< 250 16 (70%) 16 (67%)
250 - 350 5 (22%) 6 (25%)
350 - 450 1 (4%) 2 (8%)
> 450 1 (4%) 0 (0%)
Número de animais analisados 23 24
Fonte: Elaborada pelo próprio autor
51
5.5 HISTOPATOLOGIA DO PÂNCREAS
Para efeitos da análise tentou-se avaliar a existência de correlação entre o
grau de infiltração mononuclear e o nível do índice glicêmico, porém não foi possível
estabelecer este parâmetro com exatidão devido a que todos os graus de infiltração
foram vistos indistintamente em todos os níveis glicêmicos menos no nível 1
Foi observado que 14 das 15 amostras de NOD apresentaram níveis
glicêmicos iguais ou superiores a 250 mg/dL e apresentaram algum grau de insulite
mononuclear, manifestada pela presença de infiltrado mononuclear
predominantemente linfocitário ao redor ou dentro das ilhotas de Langerhans.
Infiltrados de grau I e II foram mais frequentemente encontrados no nível glicêmico 2
e infiltrados de grau III foram mais frequentes nos níveis glicêmicos 3 e 4. É
importante ressaltar que em um indivíduo com nível glicêmico 4 (superior a 600
mg/dL) apresentou escassas ilhotas com infiltrado predominantemente de nível III e
frequentes estruturas cicatriciais de pequeno tamanho com infiltrado mononuclear
sugestivos de vestígios de destruição total de ilhotas. A Figura 12 ilustra diferentes
graus de infiltrado mononuclear nas ilhotas de Langerhans a diferentes níveis
glicêmicos e a Tabela 5 apresenta as proporções de animais por sexo dentro das
categorias de índice glicêmico.
Na Figura 13 é possível observar na fotomicrografia a presença de
vacuolização do citoplasma do hepatócito por acúmulo de glicogênio em
camundongos NOD que apresentaram glicemia maior que 250mg/dL.
52
Figura 12 Graus de infiltração mononuclear de ilhotas de Langerhans em
camundongos NOD (a, b, c), versus o controle C57Bl/6 e NOD não diabético (d).
a) Ilhota de Langerhans com infiltrado mononuclear de grau I, b) ilhota de Langerhans com infiltrado mononuclear de grau II, c) Ilhota de Langerhans com infiltrado mononuclear de grau III, d) ilhota de Langerhans normal.
Fonte: Arquivo CPEA-ICTB/Fiocruz
53
Figura 13 Grau de vacuolização das células hepáticas de fígado de camundongos
NOD com diferentes índices glicêmicos. As vacuolas intracitoplasmáticas
correspondem a acúmulos de glicogênio no hepatócito, em resposta à hiperglicemia.
a) Corte histológico de fígado de camundongo NOD com ídice glicêmico abaixo de 250mg/dL, apresentando vacuolização escasa do citoplasma do hepatócito; b) cort e histológico de fígado de camundongo NOD com índice glicêmico acima de 250 mg/dL (diabético), apresentando extensa vacuolização citoplásimica dos hepatócitos pelo acúmulo de glicogênio.
Fonte: Arquivo CPEA-ICTB/Fiocruz
Com os dados obtidos no estudo foi possível elaborar um portfólio da
linhagem (Anexo 5) que tem como funcionalidade informar aos pesquisadores as
características da linhagem que podem ser utilizadas com o objetivo de reduzir e
refinar os experimentos que a utilizam, fazendo assim uma experimentação mais
ética.
54
6 DISCUSSÃO
Com os resultados obtidos nesse trabalho foi possível demonstrar que a
linhagem NOD criada no ICTB apresenta características próprias, mantendo ainda o
status genético esperado para a linhagem.
Os valores médios de glicemia, tanto para fêmeas como para machos, bem
como o percentual da amostra que ultrapassou o limiar glicêmico de 250 mg/dL
podem sofrer influencia de diversos fatores como a condição sanitária (KIRSTEN,
2006), segundo Anderson; Bluestone (2005), quanto mais o ambiente for livre de
contaminações (germfree) maior será a incidência da doença, e quanto mais
contaminado o ambiente convencional, menor será a incidência. O status sanitário
dos setores do ICTB é monitorado a cada trimestre e o ambiente não é considerado
livre de contaminações, ainda sim obtivemos um valor médio máximo na 30ª semana
de vida dos camundongos de 191mg/dL e 199mg/dL em fêmeas e machos,
respectivamente.
Acredita-se que devido a fatores ambientais, os camundongos criados no
ICTB estão atingindo a diabetes de forma tardia a encontrada na literatura, sendo o
inicio nas fêmeas a partir de 15 semanas de vida e o macho, 17 semanas de vida, o
maior desvio padrão é observado na 23ª semana de vida para ambos os sexos. No
portfolio do Jackson Laboratories, o inicio da diabetes seria para fêmeas as 12
semanas de vida e algumas semanas depois em machos (JACKSON LAB, 2017).
O peso vivo comportou-se como esperado para a linhagem segundo a
literatura, com uma tendência de aumento conforme o avanço da idade e com uma
diferença significativa entre machos e fêmeas a um nível de significância de 5%,
(LABORATÓRIOS JACKSON, 2018; LABORATÓRIOS TACONIC, 2018). Ao
comparar com os valores médios do peso vivo às 10 semanas de vida registrados
no site do portfólio do laboratório Taconic (https://www.taconic.com/mouse-
model/nod), é possível ver que os animais do ICTB apresentam valores ligeiramente
inferiores, apresentando os animais do Lab. Taconic 22g (19,8g a 24g) nas fêmeas
e 28,6 nos machos (26 g a 31,3g) frente a 20,48 g (16,00 g a 22,75 g)nas fêmeas e
25,52 g (22,37 g a 29,29 g) nos machos da colônia do ICTB.
Quando correlacionamos à glicemia e a massa corporal é observada uma
correlação positiva, o que demonstra uma tendência de aumento da glicemia e do
55
peso vivo com o passar das semanas, estando de acordo com o observado no
Jackson Laboratory (2018).
A análise histopatológica do pâncreas confirmou o quadro diabético de todos
os animais com índice glicêmico acima de 250 mg/dL, e mostrou uma tendência de
aumento no grau e intensidade do processo de infiltração linfocítica nas ilhotas de
Langerhans, o qual explicaria satisfatoriamente os altos índices registrados pela
redução da sua funcionalidade conforme encontrado na literatura. Outros órgãos,
como o fígado podem ser afetados pela infiltração linfocitária em humanos e
camundongos (MILLS et al., 2018; TARGER et al., 2018) Nos camundongos NOD
criados no ICTB foram observados vacuolização intracitoplasmáticas
correspondentes a acúmulos de glicogênio no hepatócito em resposta à
hiperglicemia. Acredita-se que, conforme a literatura, se a colônia dos animais
criados no ICTB for mantida por períodos superiores a 30 semanas de vida, a
porcentagem de animais hiperglicêmicos e a mortalidade espontânea devida a esta
causa aumentarão até valores próximos de 100%.
Apesar do ambiente da criação ser controlado, houve durante a coleta de
dados oscilação na temperatura devido a problemas no sistema de refrigeração.
Segundo Person, Wong & Wen (2017) tal fator pode também influenciar a
patogênese da diabetes no camundongo NOD. Além da temperatura, fatores como
vibração e limitação de espaço podem diminuir a incidência do diabetes (KIRSTEN,
2006). A incidência maior em machos pode ser explicada pelo fator genético
(afastamento das colônias originais) tendo em vista que todos os outros fatores eram
iguais para ambos os sexos.
A incidência da alta taxa glicêmica, varia entre os biotérios no mundo inteiro,
devido às condições sanitárias em que são mantidas as colônias, bem como o fator
genético, pois mesmo mantendo a característica isogênica, com o tempo as
linhagens vão se afastando das colônias originais. A Tabela 6 compara a incidência
do diabetes em diferentes colônias no mundo inteiro.
56
Tabela 6 – Adaptado KIRSTEN, 2006. Comparativo entre biotérios da incidência de
diabetes com 30 semanas de vida dos camundongos da linhagem NOD.
COLÔNIAS INCIDÊNCIA DE DIABETE
NOD/Lt (Leiter) 90% fêmeas
83% machos
NOD/Shi (Shionogi) 70-80% fêmeas
< 20% machos
NOD/Wehi (Walter and Eliza Hall Institute < 10% fêmeas
< 1% machos
NOD/MrkTac (Lab. Taconic) 50% fêmeas
15% machos
Fonte: Elaborada pelo próprio autor
O laboratório Taconic, em seu portfólio da linhagem, demonstra na última
mensuração (2017) que animais dessa linhagem atingiram índice glicêmico acima de
250mg/dL, o que se observa, reduzido se comparado com anos anteriores, o que
sugere que tais índices variam com o passar dos anos, corroborando com as
perspectivas onde diversos fatores podem influenciar esse fenótipo.
Ao compararmos os índices do percentual glicêmico na colônia da
linhagem NOD criados no ICTB e os criados no Lab. Taconic é possível verificarmos
que nas fêmeas, apesar dos animais do ICTB terem iniciado de forma precoce, o
índice de animais que atingem medição ≤ 250mg/dL foi menor que o apresentado na
colônia do laboratório Taconic, em relação aos machos, é observado que o inicio de
valores ≤ 250mg/dL na colônia do ICTB se deu de forma tardia, porém, a partir da
22ª semana houve um aumento na taxa de animais com alta glicêmica, se
distanciando dos valores observados na colônia do laboratório Taconic.
57
Figura 14 – Comparação das curvas glicêmicas de machos e fêmeas de
camundongos NOD criados no Lab. Taconic e no ICTB.
Gráfico demonstrativo indicando o % de camundongos hiperglicêmicos na colônia do Lab. Taconic e do ICTB, sendo em azul os machos e vermelho as fêmeas, e o traçado tracejado os dados do Lab. Taconic e linha contínua os animais criados no ICTB.
Nas fêmeas, apesar da diferença entre os laboratórios no percentual e na
idade que são observados animais com alta glicêmica, é possível verificar que a
evolução se mantém semelhante em ambos os biotérios, nos machos, as diferenças
são maiores, o que corrobora com o encontrado na literatura, tendo em vista que os
animais criados no Lab. Taconic possuem o status sanitário SPF e os criados no
ICTB é sabido que há contaminações, como a linhagem criada no ICTB é oriunda da
colônia criada no Lab. Taconic, essa diferença também sugere o distanciamento
genético, e uma possível sublinhagem.
Os valores obtidos neste estudo estão de acordo com o esperado devido à
condição sanitária a qual os animais estão sendo mantidos, conforme colocado por
Mullen (2017) os camundongos da linhagem NOD que são criados em ambientes
mais limpos apresentam taxas de diabetes maiores que animais criados em
ambientes com desafios ambientais e sanitários.
58
7 CONCLUSÕES
A linhagem inbred de camundongo NOD criado no ICTB apresenta a
alta glicêmica seguida de um quadro diabético de forma tardia tendo
uma tendência que todos os animais venham a atingir essa
característica.
A proporção, às 30 semanas de vida, de animais diabéticos foi 30% e
33% em fêmeas e machos, respectivamente.
É evidente a presença de infiltrado inflamatório nos animais da
linhagem NOD que atingiram níveis glicêmicos superiores a 250mg/dL
bem como a não presença do infiltrado na linhagem controle e nos
animais da linhagem NOD que não atingiram níveis glicêmicos
superiores a 250mg/dL.
A linhagem de camundongo NOD criado no ICTB apresenta um
padrão único de hiperglicemia ao ser semelhante em ambos os
sexos, e o aumento da curva glicêmica tende a ser tardio, quando
comparado ao da linhagem criada no Lab. Taconic, da qual é
originária. Isto parece indicar o início de uma diferenciação genética
desta linhagem.
Nossos dados em conjunto permitiram a elaboração de um portfólio
específico da linhagem NOD, que será oferecido no site do ICTB aos
usuários.
59
8 PERSPECTIVAS
Elaborar um estudo longitudinal, com cinética temporal, correlacionando
separadamente alterações na temperatura e umidade que pontualmente
ocorram no ICTB e as alterações glicêmicas na linhagem NOD, seguindo até
90 semanas de vida;
Redigir o artigo com os dados apresentados neste trabalho.
60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADIN, C. A.; GILOR, C. The diabetic dog as a translational model for human islettransplantation. The Yale journal of biology and medicine, New Haven, v. 90, p. 509-515, set. 2017. Disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5612193/>. Acesso em: 18 abr. 2018. AIZPURUA, H. J. et al. Natural history of humoral immunity to glutamic acid decarboxylase in non-obese_diabetic (nod) mice. Journal of Autoimmunity, Estados Unidos, v. 7, n. 5, p. 643-653, 1994. Disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7840856>. Acesso em: 18 abr. 2018. AL-AWAR A. et al. Experimental Diabetes Mellitus in Different Animal Models. J. Diabetes Res., Londres, v. 2016, ago. 2016. Disponível em: <https://www.hindawi.com/journals/jdr/2016/9051426/>. Acesso em: 18 abr. 2018. ALCARRAZ-VIZÁN, G. et al. Bace 2 suppression promotes β-cell survival and function in a model of type 2 diabetes induced by human islet amyloid polypeptide overexpression. Cellular and Molecular Life, Basileia, v. 74, n. 15, p. 2827-2838, ago., 2017. Disponível em: <https://doi.org/10.1007/s00018-017-2505-1>. Acesso em: 17 abr. 2018. ANDERSON, M. S.; BLUESTONE, J. A. The NOD mouse: a model of immune dysregulation. Annual Review of Immunology, Estados Unidos, v. 23, p. 447-485, 2005. Disponível em: <https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.immunol.23.021704.115643>. Acesso em: 18 abr. 2018. ANDRADE, A. Fatores que Influenciam no Resultado do Experimento Animal. In: ______. .Animais de Laboratório criação e experimentação. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz, 2002. Disponível em: <http://books.scielo.org/id/sfwtj/pdf/andrade-9788575413869.pdf>. Acesso em: 18 abr. 2018. p. 289-294. ANDRADE, A. et al. Biologia, manejo e medicina de primatas não humanos na pesquisa biomédica. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz, 2010. AUGUSTA, R. Diabetes: O que é? Disponível em: <https://portal.fiocruz.br/pt-br/content/diabetes-o-que-e>. Acesso em: 20/12/2017. BALDA, C. A.; PACHECO-SILVA, A. Aspectos imunológicos do diabetes melito tipo 1. Revista da Associação Médica Brasileira, São Paulo, v. 2, n. 45, p. 175-180, abr./jun, 1999. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0104-42301999000200015>. Acesso em: 18 abr. 2018.
61
BORTELL R., YANG C. The bb rat as a model of human type 1 diabetes. Methods Mol Biol., Estados Unidos, v. 933, p. 31-44, 2012. Disponível em: <https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-62703-068-7_3>. Acesso em: 18 abr. 2018. BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE. Diabetes Mellitus. Caderno de Atenção Básica, Brasília, 2006. BRASIL, Lei n.º 11.794, de 8 de outubro de 2008. Estabelece procedimentos para o uso científico de animais. Diário Oficial União, Brasília, DF, 9 out. 2008. Disponível em: <http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2007-2010/2008/lei/l11794.htm>. Acesso em: 18 abr. 2018. CALSOLARI, M. R. et al. Diabetes auto-imune latente do adulto ou diabetes melito tipo 2 magro? Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia, São Paulo, v. 52, n. 2, p. 315-321, 2008. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0004-27302008000200019>. Acesso em: 18 abr. 2018. CARREIRO, M; NOGUEIRA, A; OLIVEIRA, A. R. Controversies and advances in gestational diabetes: an update in the era of continuous glucose monitoring. Journal of Clinical Medicine, Basileia, v. 7, n. 2, p. 11, 2018. Disponível em: <http://www.mdpi.com/2077-0383/7/2/11>. Acesso em: 18 abr. 2018. CHARLES RIVER LAB, Technical sheet,<
https://www.criver.com/sites/default/files/resources/PasteurellapneumotropicaTechnicalSheet.pdf> acesso em 24 junho 2018 CHENTOUFI, A. A.; POLYCHRONAKOS, C. Insulin expression levels in the thymus modulate insulin-specific autoreactive t-cell tolerance: the mechanism by which the iddm2 locus may predispose to diabetes. Diabetes, Estados Unidos, v. 51, n. 5, p. 1383-1390, 2002. Disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK470282/>. Acesso em: 18 abr. 2018. CNSS - CONSELHO NACIONAL DE SECRETÁRIOS DE SAÚDE. OMS classifica o diabetes como epidemia mundial. 2016. Disponível em: <http://www.conass.org.br/oms-classifica-o-diabetes-como-epidemia-mundial/>. Acesso em: 10 dez. 2017. COUTO, S. E. R. Classificação dos animais de laboratório quanto ao status sanitário. In: ANDRADE, A. Animais de laboratório: criação e experimentação. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz, 2002a. Disponível em: < http://books.scielo.org/id/sfwtj/pdf/andrade-9788575413869.pdf>. Acesso em: 18 abr. 2018. p. 59-64. COUTO, S. E. R. Equipamentos, materiais e insumos. In: ANDRADE, A. Animais de laboratório: criação e experimentação. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz, 2002b. Disponível em: <http://books.scielo.org/id/sfwtj/pdf/andrade-9788575413869.pdf>. Acesso em: 18 abr. 2018. p. 45-54.
62
COUTO, S. E. R. Instalações e barreiras sanitárias. In: ANDRADE, A. Animais de laboratório: criação e experimentação. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz, 2002c. Disponível em: <http://books.scielo.org/id/sfwtj/pdf/andrade-9788575413869.pdf>. Acesso em: 18 abr. 2018. p. 33-44. DELOVITCH, T. L.; SINGH, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity, v. 7, p. 727-738, dez. 1997. Disponível em: <>. Acesso em: 18 abr. 2018. D’URSO, P.S.; ATKINSIN, R.L.; WEIDMANN, M.J.; REDMOND, M.J.; HALL, B.I.; EARWAKER, W.J.S., THOMPDON, R.G.; EFFENEY, D.J. Biomodelling of skull base tumors. Journal of Clinical Neuroscience, 6(1), p.31-35, 1998 DODDABELAVANGALA MRUTHYUNJAYA, M. et al. Comprehensive Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) Gene Screening in Pregnant Women with Diabetes in India. PloS One, [s.l.], v. 12, n o 1, p. e0168656, 2017. ISSN: 1932-6203, DOI: 10.1371/journal.pone.0168656 EL-MOHANDES N.; HUECKER M. R. Diabetic Ketoacidosis, Pediatric. StatPearls Publishing, 2017. Disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK470282/>. Acesso em: 18 abr. 2018. FAGUNDES, D. J.; TAHA, M. O. Modelo animal de doença: critérios de escolha e espéciesde animais de uso corrente. Acta Cirurgica Brasileira, São Paulo, v. 19, n. 1, p. 59-65, 01 2004. Disponível em: <http://www.scielo.br/scieloOrg/php/articleXML.php%3Flang% 3Den%26pid%3DS0102-86502004000100010>. FERNANDES, A. P. M. et al. Fatores imunogenéticos associados ao diabetes mellitus do tipo 1. Revista Latino-Americana de Enfermagem, v. 13, n. 5, p. 743 – 749, set./out. 2005. FERREIRA, L. M.; HOCHMAN, B.; BARBOSA, M. V. J. Modelos experimentais em pesquisa. Acta Cirurgica Brasileira, São Paulo, v. 20, n. 2, p. 28-34, 2005. Disponível em: <http://www.scielo.br/scieloOrg/php/articleXML.php%3Flang%3Des% 26pid%3DS0102-86502005000800008>. Acesso em: 18 abr. 2018. FERREIRA, V. A.; CAMPOS, S. M. B. de. Avanços farmacológicos no Tratamento do diabetes tipo 2. Brazilian Journal of Surgery and Clinical Research, Paraná, v. 8, n. 3, p. 72 – 78, set./nov. 2014. Disponível em: <https://www.mastereditora.com.br/periodico/20141101_221529.pdf>. Acesso em: 18 abr. 2018. FORNARI, T. A. et al. Análise da expressão gênica promíscua no timo de camundongos NOD (non obese diabetic) durante a emergência do Diabetes melitus tipo 1. 2008. 154 f. Dissertação (Mestrado em Genética)- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2008. Disponível em: <http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-13042009-150027/>. Acesso em: 18 abr. 2018.
63
HÖPPENER, J. W. M. et al. Human islet amyloid polypeptide transgenic mice: in vivo and ex vivo models for the role of hiapp in type 2 diabetes mellitus. Experimental Diabetes Rresearch, Londres, v. 2008, fev. 2008. Disponível em: <https://doi.org/10.1155/2008/697035>. Acesso em: 18 abr. 2018. IONUT, V. et al. Exenatide Treatment Alone Improves β-Cell Function in a Canine Model of Pre-Diabetes. PLOS ONE, Estados Unidos, v. 11, n. 7, jul. 2016. Disponível em: <http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0158703>. Acesso em: 18 abr. 2018. JACKSON LABORATORY. Also known as: NOD, non-obese diabetic. Disponível em: <https://www.jax.org/strain/001976>. Acesso em: 10 set. 2017. JIN, X. et al. Son of single high-dose streptozotocin with partial pancreatectomy combinedwith low-dose streptozotocin for diabetes induction in rhesus monkeys. SAGE Jounals, Estados Unidos, v. 235, n. 7, 2010. Disponível em: http://journals.sagepub.com/doi/10.1258/ebm.2010.009361>. Acesso em: 18 abr. 2018. KIKUTANI, H.; MAKINO, S. The murine autoimmune diabetes model: NOD and related strains, Adv. Immunol., Estados Unidos, v. 52, p. 285-322, 1992 Disponível em: <https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0065277608604903>. Acesso em: 18 abr. 2018. KIRSTEN, V. R. Caracterização do modelo experimental NOD (nonobese diabetic) em ambiente convencional. 2006. 97 f. Dissertação (Mestrado em Nefrologia)- Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2006. Disponível em: <http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/1541#preview-link0>. Acesso em: 18 abr. 2018. LA CAVA, A. et al. A SNP in the immunoregulatory molecule CTLA-4 controls mRNA splicing in vivo but does not alter diabetes susceptibility in the NOD mouse. Diabetes, Estados Unidos, v. 65, n. 1 p. 120-128, out. 2015. Disponível em: <http://diabetes.diabetesjournals.org/content/65/1/120>. Acesso em: 18 abr. 2018. LERCO, M. M. et al. Caracterização de um modelo experimental de Diabetes Mellitus, induzido pela aloxana em ratos: estudo clínico e laboratorial. Acta Cir. Bras., São Paulo, v. 18, n. 2, p. 132-142, mar./abr. 2003. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0102-86502003000200010>. Acesso em: 17 abr. 2018. LEITER, E. H. The NOD mouse: a model for analyzing the interplaybetween heredity and environment in development of autoimmune disease. ILAR Journal, Oxford, v. 35, n. 1, p. 4-14, jan. 1993. Disponível em: <https://academic.oup.com/ilarjournal/article/35/1/4/728423>. Acesso em: 18 abr. 2018.
64
LINS, T. V. G.; BARBOSA, G. N.; OLIVEIRA, M. R. Produção do hormônio insulina àbase de técnicas da moderna engenharia genética. In: ENCONTRO DE INICIAÇÃO À DOCÊNCIA, 11., 2007, João Pessoa. Anais eletrônicos... João Pessoa: Universidade Federal da Paraíba, 2007. Disponível em: <http://www.prac.ufpb.br/anais/xenex_xienid/xi_enid/monitoriapet/RESUMOS/Area6/6CCENDBMMT04-P.pdf>. Acesso em: 18 abr. 2018. LOPES, D. S. A. et al. A produção de insulina artificial através da tecnologia do DNA recombinante para o tratamento de diabetes mellitus. Revista da Universidade Vale do Rio Verde, Betim, MG, v. 10, n. 1, p. 234-245, 2012. Disponível em: <http://periodicos.unincor.br/index.php/revistaunincor/article/view/248>. Acesso em: 18 abr. 2018. LUPPI, M. M. et al. Estudo comparativo entre métodos de determinação da glicemia emmacacos-prego (Cebus apella) mantidos em cativeiro. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, Lisboa, n. 102, p. 75-79, 2007. Disponível em: <http://docplayer.com.br/12729242-Estudo-comparativo-entre-metodos-de-determinacao-da-glicemia-em-macacos-prego-cebus-apella-mantidos-em-cativeiro.html>. Acesso em: 18 abr. 2018. MACLEOD, J. J. R. Insulin and diabetes: a general statement of the physiological and therapeutic effects of insulin. British Medical Journal, Reino Unido, v. 2, n. 3227, p. 833-835, 1922a. Disponível em: <https://www.jstor.org/stable/20421529?seq=1#page_scan_tab_contents>. Acesso em: 18 abr. 2018. MACLEOD, J. J. R. Insulin and steps taken to secure an effective preparation. Canadian Medical Association Journal, Canadá, v. 12, n. 12, p. 899-900, 1922b. Disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1706858/>. Acesso em: 18 abr. 2018. MAKINO, S. et. al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Experimental Animals, Japão, v. 29, n. 1, p. 1-13, jan. 1980. Disponível em: <https://www.researchgate.net/publication/16204180_Breeding_of_a_Non-Obese_Diabetic_Strain_of_Mice>. Acesso em: 18 abr. 2018. MAZO, V. K. et al. Streptozotocin induced diabetes rat models. Voprosy Pitaniia, Rússia, v. 85, n. 4, p. 14-21, jan. 2018. Disponível em: <https://www.researchgate.net/publication/311437666_Streptozotocin_induced_diabetes_rat_models>. Acesso em: 18 abr. 2018. MEYRER, B. Diabetes Mellitus: monitorando o tratamento. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2014. 11p. Disponível em: <https://www.ufrgs.br/lacvet/site/wp-content/uploads/2014/11/diabetes-mel.pdf>. Acesso em: 20 dez. 2017 MILLS, E. P. et al. Treating nonalcoholic fatty liver disease in patients with type 2 diabetes mellitus: a review of efficacy and safety. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism, Estados Unidos, v. 9, n. 1, p. 15–28, 2018. Disponível em: <http://journals.sagepub.com/doi/10.1177/2042018817741852>. Acesso em:18 abr. 2018.
65
MIYAZAKI A. et al. Predominance of t lymphocytes in pancreatic islets and spleen of pre-diabetic non-obese diabetic (nod) mice: a longitudinal study. Clinical and Experimental Immunology, Reino Unido, v. 60, n. 3, p. 622-630, 1985. Disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1577215/>. Acesso em: 18 abr. 2018. MRUTHYUNJAYA, M. D. et al. Comprehensive maturity onset diabetes of the young (MODY) gene screening in pregnant women with diabetes in India. PLOS ONE, Estados Unidos, v. 12, n. 1, jan. 2017. Disponível em: <http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0168656>. Acesso em: 18 abr. 2018. MULLEN, Y. Development of the nonobese diabetic mouse and contribution of animalmodels for understanding type 1 diabetes. Pancreas Journal, Filadélfia, v. 46, n. 4, p. 455-466, abr. 2017. OGURTSOVA, K. et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040. Diabetes Research and Clinical Practice, Londres, v. 128, p. 40–50, 2017. Disponivel em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28437734>. Acesso em: 18 abr. 2018. OLIVARES, A. M. et al. Animal Models of Diabetic Retinopathy. Current Diabetes Reports, Estados Unidos, v. 17, n. 190, p. 93, ago. 2017. Disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5569142/>. Acesso em: 18 abr. 2018. OLIVEIRA, C. S.; FURUZAWA, G. K.; REIS, A. F. Diabetes mellitus do tipo mody. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia, São Paulo, v. 46, n. 2, p. 186-192, 2002 Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0004-27302002000200012&lng=en&nrm=iso&tlng=pt>. Acesso em: 18 abr. 2018. OLIVEIRA, J. E. P. de; VENCIO, S. Classificação etiológica do diabetes mellitus. In: . Diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes. [S.l.]: GEN, 2014–2015. cap. 2. OLIVEIRA, J. E. P. de; VENCIO, S. Uso da insulina no tratamento do diabetes mellitus tipo 1.In: . Diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes. [S.l.]: GEN, 2014–2015. cap. 11. PANDEY, A.; CHAWLA, S.; GUCHHAIT, P. Type-2 diabetes: Current understanding and future perspectives: type-2 Diabetes. IUBMB Life, Estados Unidos, v. 67, no 7, p. 506–513, 2015. Disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26177573>. Acesso em: 18 abr. 2018. PAULA, L. D. de; MARQUES, C. F.; CHAULD, S. G. Efeitos produzidos pela ingestão de fibras alimentares: solúveis e insolúveis em camundongos. Ciência et Praxis, Minas Gerais, v. 2, n. 3, p. 55 –60, 2009. Disponível em: <http://revista.uemg.br/index.php/praxys/article/viewFile/2087/1081>. Acesso em: 18 abr. 2018.
66
PAULA, R. S. de et al. Animais trangênicos: conceito, metodologias e Aplicações. Revista Electrónica de Veterinaria, Espanha, v. 18, n. 9, 2017. Disponível em: <http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n090917/091711.pdf>. Acesso em: 18 abr. 2018. PEARSON, J. A.; WONG, F. S.; WEN, L. The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of autoimmunity, Estados Unidos, v. 66, p. 76-88, jan. 2016. Disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4765310/>. Acesso em: 18 abr. 2018. PETERSON, R. G.; JACKSON, C. V.; ZIMMERMAN, K. M. The ZDSD rat: a novel model of diabetic nephropathy. Am. J. Transl. Res., Estados Unidos, v. 9, n. 9, p. 4236-4249, set. 2017. Disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5622266/>. Acesso em: 18 abr. 2018. PORTUGAL, Vanessa et al. Alterações hepáticas em contexto de diabetes mellitus tipo I descompensada. Nascer e Crescer, Porto, v. 20, n. 3, p. 132-134, 2011. Disponível em: <http://www.scielo.mec.pt/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0872-07542011000300005&lng=pt&nrm=iso>. Acesso em: 07 fev. 2018. POZZILLI, P. et al. NOD mouse colonies around the world- recent facts and figures. Immunology Today, Londres, v. 14, n. 5, p. 193-196, 1993. Disponível em: <https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/016756999390160M?via%3Dihu>. Acesso em: 18 abr. 2018. RIDGWAY, J. et al. Inhibition of Dll4 signalling inhibits tumour growth by deregulating angiogenesis. Nature, Reino Unido, v. 444, n. 7122, p. 1083–1087, dez. 2006. Disponível em: <10.1038/nature05313>. Acesso em: 18 abr. 2018. RUSSELL, W. M.; BURCH, R. L. Chapter 5: replacement. In: ______. The principle of humane experimental technique. Londres: Methuem, 1959. SAMPAIO, L. F.R. Saúde bucal. Brasília: Ministério da Saúde, 2006. SANTOS, B. F. dos. Classificação dos Animais de Laboratório quanto ao Status Genético. In: ______. Animais de laboratório: criação e experimentação. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz, 2002. SANTOS, B. F. dos. Modelo animal. In: ______. Animais de laboratório: criação e experimentação. Rio de Janeiro: Editotra Fiocruz, 2002. STABLEY, J.N. et al. Type 2 diabetes alters bone and marrow blood flow and vascular control mechanisms in the ZDF rat. J. Endocrinol., Reino Unido, v. 225, n. 1, p. 47-58, abr. 2015. Disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4379453/>. Acesso em: 18 abr. 2018.
67
SESTERHEIM, P.; SAITOVITCH, D.; STAUB, H. L. Diabtes mellitus tipo1: multifatores queconferem suscetibilidade à patogenia auto-imune. Scientia Medica, Porto Alegre, v. 17, n. 4, p. 212-217, out./dez. 2007. Disponível em: <https://core.ac.uk/download/pdf/26755878.pdf>. Acesso em: 18 abr. 2018. SHIOTA M.; PRINTZ R. L. Diabetes in Zucker diabetic fatty rat. Methods Mol Biol., Estados Unidos, v. 933, 103-123, 2012. Disponível em: <https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-62703-068-7_8>. Acesso em: 18 abr. 2018. SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES. Diabetes mellitus gestacional: diagnóstico, tratamento e acompanhamento pós-gestacional. In: ______. Diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes: 2014-2015. São Paulo, 2015. p. 192-197. Disponível em: <http://www.diabetes.org.br/profissionais/images/pdf/diabetes-gestacional/001-Diretrizes-SBD-Diabetes-Gestacional-pg192.pdf>. Acesso em: 18 abr. 2018. SOCIEDADE BRASILEIRA DE ENDOCRINOLOGIA E METABOLOGIA. O que é Diabetes? Disponível em: <https://www.endocrino.org.br/o-que-e-diabetes/>. Acesso em: 28 dez. 2017. TACONIC MODELS FOR LIFE. Nod inbred. 2018. Disponível em: <https://www.taconic.com/mouse-model/nod>. Acesso em: 10 dez. 2017. TISCH, R.; MCDEVITT, H. Insulin-dependent diabetes mellitus. Cell, Estados Unidos, v. 85, n. 3, p. 291–297, mai. 1996. Disponível em: <http://www.cell.com/fulltext/S0092-8674(00)81106-X>. Acesso em: 18 abr. 2018. VOET, D.; VOET, J. G.; PRATT, C. W. Fundamentos de bioquímica. a vida em nível molecular. 4. ed. [S.l.]: Artmed, 2014, VOORBIJ, H. A. M. et al. Dendritic Cells and Scavenger Macrophages in Pancreatic Islets of Prediabetic BB Rats. Laboratory for Clinical Immunology, Diabetes, Estados Unidos, v. 38, n. 12, p. 1623-1629, 1989. Disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2684715>. Acesso em: 18 abr. 2018. WILLCOX A. et al. Analysis of islet inflammation in human type 1 diabetes. Clin Exp Immunol., Reino Unido, v. 155, n. 2, p. 173-181, fev. 2009. Disponível em: <https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/j.1365-2249.2008.03860.x>. Acesso em: 17 abr. 2018.
68
ANEXO A – PROTOCOLO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS
69
ANEXO B – CAIXA DE CONTENÇÃO PARA CAMUNDONGOS
70
ANEXO C – FICHA DE MONITORAMENTO INDIVIDUAL DE CAMUNDONGOS
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ANEXO D – ESQUEMA DE MARCAÇÃO INDIVIDUAL COM SOLUÇÃO DE ÁCIDO
PÍCRICO
1 = Sem marcação; 2 = Linha occipital; 3 = Orelha direita; 4 = Orelha esquerda; 5 = Região escapular direita; 6 = Região escapular esquerda e 7= Região ilíaca direita.
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ANEXO E – PORTFOLIO DO CAMUNDONGO DA LINHAGEM NOD CRIADA NO
ICTB