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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM VIGILÂNCIA SANITÁRIA

INSTITUTO NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE

FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ

Rodrigo Rollin Pinheiro

APLICAÇÃO DE DIFERENTES MÉTODOS NO CONTROLE DE QUALIDADE

DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE SANEANTES DOMISSANITÁRIOS

Rio de Janeiro

2012




Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Vigilância Sanitária

Orientadoras: Maria Helena Simões Villas Bôas

Marta de Campos Neves

Rio de Janeiro

2012

Catalogação na fonte

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde

Biblioteca

Pinheiro, Rodrigo Rollin

Aplicação de Diferentes Métodos no Controle de Qualidade da Atividade Antimicrobiana de Saneantes Domissanitários./Rodrigo Rollin Pinheiro.- Rio de Janeiro: INCQS/FIOCRUZ, 2012.

118 f.: il., tab.

Dissertação (Mestrado em Vigilância Sanitária) – Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária; Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, 2012.

Orientadoras: Maria Helena Simões Villas Boas e Marta dos Campos Neves

1. Atividade Antimicrobiana. 2. Diluição de Uso. 3. Comitê Europeu de

Normalização. 4. Desinfetantes. 5. Vigilância Sanitária.




Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Vigilância Sanitária

Aprovado em ___ /___ /___

BANCA EXAMINADORA

Célia Maria Carvalho Pereira Romão (Doutor) Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde

Sergio Eduardo Longo Fracalanzza (Doutor) Universidade Federal do Rio de Janeiro

Vera Carolina Bordallo Bittencourt (Doutor) Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro

Maria Helena Simões Villas Bôas (Doutor) - Orientadora Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde

Marta de Campos Neves (Doutor) - Orientadora Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde

A meus pais e meus irmãos, por todo

o suporte e apoio que sempre me dão.

AGRADECIMENTOS

Um trabalho científico nunca é realizado sozinho. Por isso, agradeço a

todas as pessoas que de alguma forma participaram dessa realização:

À minha orientadora Dra. Maria Helena Simões Villas Bôas, por quem

tenho muita admiração, por todo o incentivo, ajuda, ensinamentos e

compreensão. Muito obrigado pela amizade e confiança durante a

realização desse trabalho.

À Dra. Neide Miyazaki (in memorian), que apesar de não tido a

oportunidade de participar da realização do trabalho, foi de grande

importância para a idealização inicial do projeto, além de ter aceitado a

orientação no projeto de mestrado.

Aos amigos que fiz no Setor Saneantes por toda a amizade, ajuda, ótima

companhia e excelente ambiente de trabalho. Obrigado Marta de

Campos Neves, Daniella Cristina Rodrigues, Aline da Silva Soares

Souto, Cristina e Priscila por estarem sempre dispostas a ajudar, e em

especial Bruna Peres Sabagh pela grande ajuda e companhia nos

ensaios.

À Célia Maria Carvalho Pereira Romão pela colaboração como

pesquisadora e revisora deste trabalho.

À Verônica Viana Vieira, João, Livia e Paulo pela fundamental ajuda na

identificação dos microrganismos.

Aos funcionários da Central de Esterilização e do Setor de Meios de

Cultura, pela disponibilidade e presteza sempre que solicitados, e em

especial à amiga Cátia Cristina S. do Nascimento por todas as soluções

e meios TSA, ajuda essencial para a realização do trabalho.

Aos funcionários da Coordenação de Pós-Graduação.

Ao Setor Saneantes do Departamento de Química pelas análises

químicas dos produtos utilizados nesse trabalho.

Ao meus pais Walter e Sonia e meus irmãos Eduardo e Renata que

sempre me apoiaram em minhas decisões e me dão todo o suporte para

o meu desenvolvimento profissional e pessoal.

À minha namorada Luna, por todo o amor, carinho, dedicação e

paciência, sempre me incentivando e dividindo todos os momentos.

A CAPES pelo apoio financeiro.

A todos do INCQS que de alguma forma contribuíram para a realização

do trabalho.

RESUMO

Microrganismos estão presentes em grande escala no ambiente domiciliar e público. Diversos relatos na literatura já demonstraram a existência de bactérias em várias superfícies em domicílios, como pias, geladeiras, toalhas e outros objetos, e em locais de livre circulação, como aeroportos, academias de ginástica, ônibus e banheiros públicos. Com a crescente atenção voltada para a contaminação e risco de infecções causadas por alimentos e produtos manufaturados contaminados, houve um aumento do uso de desinfetantes pelo público em geral, levando a maior comercialização e circulação desses produtos. No Brasil, com a criação do Mercosul, a presença de desinfetantes provenientes de outros países se acentuou, havendo a necessidade de harmonização das normas técnicas. Por essa razão, a legislação brasileira foi alterada em 2007, com a publicação da RDC nº 14, de 28 de fevereiro de 2007, que estabeleceu que para avaliação da qualidade dos produtos desinfetantes poderiam ser aceitas as metodologias preconizadas pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC) ou pelo Comitê Europeu de Normalização (CEN). Dessa forma, surgiu a necessidade do Brasil se preparar para essa mudança na legislação, implantando as metodologias preconizadas pelo CEN. Assim, visando a preparação do único laboratório federal oficial do Brasil, o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, esse trabalho teve como objetivo principal implantar as metodologias baseadas nas normas do CEN para a avaliação da atividade antibacteriana de desinfetantes de uso institucional. Foi avaliado também o comportamento de bactérias isoladas do ambiente domiciliar através da aplicação em paralelo dos métodos da AOAC e do CEN. Os resultados obtidos permitiram a padronização da fase 1 e da fase 2, etapa 1 da metodologia preconizada pelo CEN, assim como os passos iniciais da fase 2, etapa 2. Como resultados observamos que o álcool etílico 70% e o produto A, à base de compostos quaternários de amônio, foram considerados satisfatórios frente a todos os microrganismos testados (de referência e os isolados domiciliares) nas duas metodologias, enquanto o produto B não foi capaz de eliminar S. aureus pelo método da Diluição de Uso. Durante a realização do estudo foram encontrados produtos desinfetantes dispostos à venda apresentando contaminação microbiana. Essas bactérias contaminantes foram identificadas e evidenciaram a presença no mercado brasileiro de produtos com graves desvios de qualidade. Esses dados são inclusive corroborados por relatos presentes na literatura. Estudos complementares são necessários para que seja realizada a total padronização da fase 2, etapa 2 da metodologia preconizada pelo CEN e para a avaliação de desinfetantes à base de outros princípios ativos. Palavras-chave: Atividade Antimicrobiana; Diluição de Uso; Comitê Europeu de Normalização; Desinfetantes; Vigilância Sanitária.

ABSTRACT

Microorganisms are widely distributed in households and public environments. Several reports in the literature have just demonstrated the existence of bacteria in many households surfaces, as sinks, refrigerators, towels and other objects, and in free circulation places, as airports, gyms, buses and public bathrooms. Greater attention on contamination and infection risk caused by contaminated food and manufactured products led to increasing use of disinfectants by general population and, consequently, more commercialization and circulation of these products. In Brazil, with the foundation of “Mercosul”, the presence of disinfectants from other countries increased, leading to the necessity of technical standards harmonization. For this reason, Brazilian legislation changed in 2007 with the publication of RDC nº 14, from February 28, 2007, which established that the methodologies recommended by Association of Official Analytical Chemists (AOAC) or European Committee of Normalization (CEN) could be accepted for the quality evaluation of disinfectants. Therefore, Brazil needs to be prepared for this law change, implementing CEN methodologies. So, in order to prepare the only official federal laboratory in Brazil, “Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde”, this study aimed to implement the CEN methods for antimicrobial activity evaluation of institutional use disinfectants. It was also evaluated the behavior of environment bacteria isolated from households, through application of both AOAC and CEN methods in parallel. The results obtained allowed the standardization of phase 1 and phase 2 step 1, as well as the first steps of phase 2 step 2. It was also observed that ethyl alcohol 70% and product A, based on ammonium quaternary compounds, were considered satisfactory against all microorganisms tested (reference ones and households isolates) in both methods, while product B was not able to eliminate S. aureus by Use-Dilution method. During the study, it was found disinfectant products ready for sale presenting microbial contamination. These bacteria were identified and evidenced the presence of products with serious quality deviations in Brazilian market. These data are corroborated with reports in literature. Complementary studies are required for the complete standardization of phase 2, step 2 from CEN methodology, and for the evaluation of disinfectants based on others actives. Key-words: Antimicrobial Activity; Use-Dilution; European Committee Standardization; Disinfectants; Sanitary Surveillance.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Ordem decrescente de resistência dos microrganismos aos

métodos e soluções germicidas.....................................................20

FIGURA 2 Etapa inicial da preparação do inóculo realizado a partir das

culturas estocadas para o Método da Diluição de Uso (INSTITUTO

NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE,

2009...............................................................................................40

FIGURA 3 Esquema dos procedimentos empregados no preparo do inóculo

utilizado no Método da Diluição de Uso, a partir do 4° repique após

incubação a 36 ± 1ºC por 48h (INSTITUTO NACIONAL DE

CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE, 2009)........................41

FIGURA 4 Etapa de contaminação e transferência dos cilindros segundo o

Método da Diluição (INSTITUTO NACIONAL DE CONTROLE DE

QUALIDADE EM SAÚDE, 2009)...................................................42

FIGURA 5 Esquema da transferência dos cilindros entre tubos utilizados no

método da Diluição de Uso (INSTITUTO NACIONAL DE

CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE, 2009)........................43

FIGURA 6 Padronização do inóculo inicial através da utilização conjunta de

técnica espectrofotométrica (leitura da DO) e contagem de

unidades formadoras de colônias (UFC).......................................49

FIGURA 7 Preparação e ajuste da suspensão teste (N) e da suspensão de

validação (Nv)................................................................................50

FIGURA 8 Esquema do teste de avaliação da atividade antimicrobiana de

desinfetantes EN 1040 (EUROPEAN STANDARD 1040, 2005)....52

FIGURA 9

Esquema do controle A do teste (EUROPEAN STANDARD 1040,

2005)..............................................................................................53

FIGURA 10 Esquema do controle B do teste (EUROPENA STANDARD 1040,

2005)..............................................................................................54

FIGURA 11 Esquema do controle C do teste (EUROPEAN STANDARD 1040,

2005)..............................................................................................55

FIGURA 12a Esquema de realização do teste EN 1040 demonstrando passo a

passo a realização dos controles...................................................56

FIGURA 12b Esquema de realização do teste EN 1040....................................57

FIGURA 13 Esquema representativo do teste da fase 2 passo 2.....................63

FIGURA 14 Esquema representativo do controle de água da fase 2 passo

2.....................................................................................................64

FIGURA 15 Esquema representativo do controle do neutralizante da fase 2

passo 2..........................................................................................65

FIGURA 16 Esquema representativo do teste de neutralização da fase 2 passo

2.....................................................................................................66

FIGURA 17 Padronização do inóculo de S. aureus através da correlação da

densidade ótica e da contagem das unidades formadoras de

colônia............................................................................................74

FIGURA 18 Padronização do inóculo de P. aeruginosa através da correlação

da densidade ótica e da contagem das unidades formadoras de

colônia............................................................................................74

FIGURA 19

Padronização do inóculo de E. coli através da correlação da


colônia............................................................................................75

FIGURA 20 Padronização do inóculo de E. hirae através da correlação da


colônia............................................................................................75

FIGURA 21 Padronização do inóculo de E. cloacae (cozinha) através da

correlação da densidade ótica e da contagem das unidades

formadoras de colônia...................................................................76

FIGURA 22 Padronização do inóculo de E. cloacae (banheiro) através da

correlação da densidade ótica e da contagem das unidades

formadoras de colônia...................................................................76

FIGURA 23 Formulário de registro dos resultados dos teste preconizados pelo

CEN...............................................................................................78

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Exemplos de princípios ativos de produtos desinfetantes.............19

TABELA 2 Produtos escolhidos para a realização das metodologias de

avaliação da atividade antimicrobiana...........................................35

TABELA 3 Microrganismos utilizados nos testes para avaliação da atividade

antimicrobiana preconizados pela Association of Official Analytical

Chemists (AOAC) e pelo Comitê Europeu de Normalização

(CEN)..............................................................................................38

TABELA 4 Etapas da metodologia preconizada pelo CEN..............................46

TABELA 5 Características observadas durante o isolamento e a cultura dos

microrganismos oriundos da cozinha, do banheiro e dos produtos

contaminados.................................................................................68

TABELA 6 Microrganismos identificados pelo VITEK 2...................................69

TABELA 7 Avaliação do teor de princípio ativo dos produtos A, B, C, D e E.

Todos os produtos eram à base de quaternários de

amônio............................................................................................70

TABELA 8 Avaliação da atividade antimicrobiana do álcool 70% pelo método

da Diluição de Uso.........................................................................71

TABELA 9 Avaliação da atividade antimicrobiana do produto A pelo método da

Diluição de Uso..............................................................................72

TABELA 10 Avaliação da atividade antimicrobiana do produto B pelo método da

Diluição de Uso..............................................................................73

TABELA 11 Soluções neutralizantes testadas e seus respectivos resultados

para a fase 1 da metodologia preconizada pelo CEN....................77

TABELA 12

Avaliação da atividade antimicrobiana do álcool etílico 70% pelo

método EN 1040 do CEN (Fase 1)................................................79

TABELA 13 Atividade antimicrobiana do álcool etílico avaliada pela Fase 1 da

metodologia do CEN, especificando todas as concentrações

utilizadas.........................................................................................79

TABELA 14 Avaliação da atividade antimicrobiana do produto A pelo método

EN 1040 do CEN (Fase1)..............................................................80

TABELA 15 Avaliação da atividade antimicrobiana do produto B pelo método

EN 1040 do CEN (Fase1)..............................................................81

TABELA 16 Avaliação da atividade antimicrobiana do álcool etílico 70% pelo

método EN 1276 do CEN (Fase 2, Etapa 1)..................................83

TABELA 17 Atividade antimicrobiana do álcool etílico avaliada pela Fase 2,

Etapa 1 da metodologia do CEN, especificando todas as

concentrações utilizadas................................................................83

TABELA 18 Avaliação da atividade antimicrobiana do produto A pelo método

EN 1276 do CEN (Fase 2, Etapa1)................................................84

TABELA 19 Atividade antimicrobiana do produto A avaliada pela Fase 2, Etapa

1 da metodologia do CEN, especificando todas as concentrações

utilizadas.........................................................................................85

TABELA 20 Avaliação da atividade antimicrobiana do produto B pelo método

EN 1276 do CEN (Fase 2, Etapa1)................................................86

TABELA 21 Teste preliminar da fase 2, etapa 2 usando-se E. coli, nas

condições estabelecidas pela norma EN 13697............................87

TABELA 22 Teste preliminar da fase 2, etapa 2 usando-se E. coli, com adição

da etapa de sonicação ao procedimento.......................................88

TABELA 23 Teste preliminar da fase 2, etapa 2, com adição de solução

neutralizante 20% mais concentrada e caldo Letheen como

alternativas ao desprendimento das bactérias dos discos.............89

LISTA DE SIGLAS, ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS

ºC Graus Celsius

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AOAC Association of Official Analytical Chemists

ATCC American Type Culture Collection

BSA Bovine serum albumin

CEN Comitê Europeu de Normalização

CL Caldo Letheen

CN Caldo Nutriente

DNA Ácido desoxiribonucleico

DO Densidade ótica

DU Diluição de Uso

EN Norma Europeia

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz

g Medida de força centrífuga

INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde

KOH Hidróxido de Potássio

MERCOSUL Mercado Comum do Sul

N Suspensão teste

Nc Controle com água purificada da Fase 2, etapa 2 (CEN)

NC Controle da neutralização da Fase 2, etapa 2 (CEN)

Nd Teste da Fase 2, etapa 2 (CEN)

nm Nanômetros

NT Teste da neutralização da Fase 2, etapa 2 (CEN)

NTS Controle do desprendimento das células dos discos

Nv Suspensão de validação

POP Procedimento Operacional Padrão

RDC Resolução da Diretoria Colegiada

TSA Agar Soja Tríptica

TSB Caldo Soja Tríptica

UFC/mL Unidades formadoras de colônia por mililitro

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................18

1.1 CARACTERÍSTICAS DOS DESINFETANTES............................................18

1.2 LEGISLAÇÃO DOS SANEANTES COM ATIVIDADE ANTIMICROBIANA.22

1.3 MÉTODOS DA DILUIÇÃO DE USO E DO COMITÊ EUROPEU DE

NORMALIZAÇÃO..............................................................................................26

1.4 MICRORGANISMOS NO AMBIENTE DOMICILIAR E PÚBLICO...............28

1.5 JUSTIFICATIVA...........................................................................................31

2 OBJETIVOS...................................................................................................33

2.1 OBJETIVO GERAL......................................................................................33

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................33

3 METODOLOGIA.............................................................................................34

3.1 PRODUTOS UTILIZADOS..........................................................................34

3.2 ISOLAMENTO DAS BACTÉRIAS DO AMBIENTE DOMICILIAR................35

3.3 ISOLAMENTO DAS BACTÉRIAS CONTAMINANTES DOS

DESINFETANTES.............................................................................................36

3.4 IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS ISOLADAS........................................36

3.5 CEPAS BACTERIANAS..............................................................................37

3.6 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE DESINFETANTES DE USO GERAL

PELO MÉTODO DA DILUIÇÃO DE USO..........................................................37

3.6.1 Manutenção dos microrganismos de referência.......................................37

3.6.2 Cilindros carreadores................................................................................39

3.6.3 Metodologia..............................................................................................39

3.6.4 Leitura e avaliação dos resultados...........................................................44

3.6.5 Controles...................................................................................................44

3.7 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE PRODUTOS DESINFETANTES

DESTINADOS A DESINFECÇÃO DE SUPERFÍCIES EM AMBIENTES

DOMÉSTICO, INSTITUCIONAL E INDUSTRIAL SEGUNDO O COMITÊ

EUROPEU DE NORMALIZAÇÃO.....................................................................46

3.7.1 Manutenção dos microrganismos de referência.......................................47

3.7.2 Teste em Suspensão Quantitativo para Avaliação da Atividade

Bactericida Básica de Desinfetantes Químicos e Antissépticos – Fase 1

(EUROPEAN STANDARD 1040, 2005).............................................................48

3.7.2.1 Repiques................................................................................................48

3.7.2.2 Padronização do inóculo inicial..............................................................48

3.7.2.3 Realização do teste...............................................................................49

3.7.2.4 Controles................................................................................................52

3.7.2.5 Leitura e avaliação dos resultados........................................................58


Bactericida Básica de Desinfetantes Químicos e Antissépticos usados em

Áreas Alimentícia, Industrial, Doméstica e Institucional – Fase 2, Etapa 1

(EUROPEAN STANDARD 1276, 2009).............................................................60

3.7.4 Teste Quantitativo em Superfície Não Porosa para Avaliação da Atividade

Bactericida e/ou Fungicida de Desinfetantes Químicos usados em Áreas

Alimentícia, Industrial, Doméstica e Institucional – Fase 2, Etapa 2

(EUROPEAN STANDARD 13697, 2001)...........................................................61

3.7.4.1 Tratamento inicial dos carreadores de microrganismos........................61

3.7.4.2 Preparação do inoculo inicial.................................................................61

3.7.4.3 Contaminação dos discos......................................................................62

3.7.4.4 Teste propriamente dito.........................................................................62

3.7.4.5 Controle com água purificada................................................................63

3.7.4.6 Controle do neutralizante.......................................................................64

3.7.4.7 Teste de neutralização...........................................................................65

3.7.4.8 Controle do desprendimento das células dos discos.............................66

3.7.4.9 Cálculos e avaliação dos resultados......................................................67

4 RESULTADOS...............................................................................................68

4.1 IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS.............................................68

4.2 ANÁLISE QUÍMICA DOS PRODUTOS DESINFETANTES........................69

4.3 TESTES REALIZADOS PARA A AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTIMICROBIANA............................................................................................69

4.4 AVALIAÇÃO DOS DESINFETANTES PELO MÉTODO DA DILUIÇÃO DE

USO...................................................................................................................70

4.4.1 Álcool etílico 70%......................................................................................71

4.4.2 Produto A..................................................................................................71

4.4.3 Produto B..................................................................................................72

4.5 METODOLOGIAS DO COMITÊ EUROPEU DE NORMALIZAÇÃO............73

4.5.1 Padronização inicial do inóculo ................................................................73


Bactericida Básica de Desinfetantes Químicos e Antissépticos – Fase 1 (EN

1040)..................................................................................................................77

4.5.2.1 Álcool etílico 70%...................................................................................78

4.5.2.2 Produto A...............................................................................................80

4.5.2.3 Produto B...............................................................................................81


Bactericida Básica de Desinfetantes Químicos e Antissépticos usados em

Áreas Alimentícia, Industrial, Doméstica e Institucional – Fase 2, Etapa 1 (EN

1276)..................................................................................................................82

4.5.3.1 Álcool etílico 70%...................................................................................82

4.5.3.2 Produto A...............................................................................................84

4.5.3.3 Produto B...............................................................................................85


Bactericida e/ou Fungicida de Desinfetantes Químicos usados em Áreas

Alimentícia, Industrial, Doméstica e Institucional – Fase 2, Etapa 2 (EN

13697)................................................................................................................86

5 DISCUSSÃO...................................................................................................90

6 CONCLUSÕES...............................................................................................97

PERSPECTIVAS...............................................................................................98

REFERÊNCIAS.................................................................................................99

APÊNDICE A - FORMULÁRIOS DOS ENSAIOS DE DILUIÇÃO DE USO....110

APÊNDICE B - FORMULÁRIOS DOS TESTES DO COMITÊ EUROPEU DE

NORMALIZAÇÃO – FASE 1...........................................................................112

APÊNDICE C - FORMULÁRIOS DOS TESTES DO COMITÊ EUROPEU DE

NORMALIZAÇÃO – FASE 2 ETAPA 1...........................................................115

APÊNDICE D – RESULTADOS DOS TESTES DE AVALIAÇÃO DA

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA PELOS MÉTODOS DA DILUIÇÃO DE USO E

DO COMITÊ EUROPEU DE NORMALIZAÇÃO.............................................118

18

1 INTRODUÇÃO

Saneantes domissanitários são substâncias ou preparações destinadas à

higienização, desinfecção ou desinfestação domiciliar, em ambientes coletivos e/ou

públicos, em lugares de uso comum e no tratamento de água. Essas substâncias

compreendem inseticidas, raticidas, detergentes e desinfetantes (BRASIL, 1976).

Dentre os saneantes, destacam-se os produtos desinfetantes que são

amplamente utilizados nos mais diversos ambientes, como domiciliar, industrial,

institucional e de assistência à saúde. Os desinfetantes são definidos como produtos

que matam todos os microrganismos patogênicos, mas não necessariamente todas

as formas microbianas esporuladas em objetos e superfícies inanimadas (BRASIL,

2007).

1.1 CARACTERÍSTICAS DOS DESINFETANTES

Algumas características são consideradas extremamente relevantes para o

uso e aplicação de um desinfetante. Como exemplos, esses produtos devem possuir

um amplo espectro de ação; serem ativos na presença de matéria orgânica; serem

compatíveis com sabões, detergentes e outros produtos químicos; possuírem baixa

toxicidade (não devem ser irritantes para o usuário); serem compatíveis com

diversos tipos de materiais (não serem corrosivos em superfícies metálicas e não

devem causar deterioração de borrachas, plásticos e outros materiais); serem

inodoros ou de odor agradável; estáveis à temperatura ambiente; econômicos; não

poluentes; estáveis em concentração original ou quando diluídos (BLOCK, 2001).

No mercado, existe uma grande diversidade e oferta de produtos com

diferentes princípios ativos (Tabela 1).

19

Tabela 1

Exemplos de princípios ativos de produtos desinfetantes.

Grupo Químico Exemplos

Álcoois Etanol

Isopropanol

Aldeídos Glutaraldeído

Formaldeído*

Agentes liberadores de

halogênios

Compostos de cloro

Compostos de iodo

Peroxigênios Peróxido de hidrogênio

Ácido peracético

Compostos fenólicos Fenol

Cresol

Compostos à base de

quaternário de amônio

Cetrimida

Cloreto de benzalcônio

* proibido para uso

Fonte: (Adaptado de MCDONNELL; RUSSELL, 1999).

Os mecanismos de ação através dos quais esses ativos afetam a viabilidade

celular de microrganismos são objetos de diversos estudos na literatura. Estudos

apontam que o álcool etílico atua principalmente causando danos na membrana

plasmática e desnaturação de proteínas; o glutaraldeído causa danos na parede

celular e na função de diversas enzimas celulares; os compostos de cloro afetam o

DNA e a respiração celular; os compostos de iodo afetam enzimas, nucleotídeos e

ácidos graxos; o peróxido de hidrogênio age como um oxidante, liberando radicais

livres que afetam componentes celulares, incluindo lipídeos, proteínas e DNA; já os

compostos quaternários de amônio agem na parede celular e membrana plasmática

(MCDONNELL; RUSSELL, 1999).

Um aspecto essencial para a obtenção de uma desinfecção eficaz é a

utilização de produtos desinfetantes de forma adequada, ou seja, obedecendo às

instruções do fabricante e implantando um planejamento de aplicação dos produtos.

Contudo, é comum os desinfetantes serem utilizados na concentração incorreta (não

recomendada), ou haver a mistura de mais de um produto desinfetante, levando a

formas de manipulação incorretas que podem afetar a atividade antimicrobiana do

20

produto. A escolha do princípio ativo mais adequado para cada área é um passo

muito importante para a desinfecção (RUTALA, 1996).

Entretanto, o sucesso da desinfecção não depende somente das

características do produto e da forma como é utilizado, mas também das

características dos microrganismos presentes no local. A Figura 1 mostra os

diferentes níveis de resistência dos microrganismos às substâncias microbicidas.

Figura 1 - Ordem decrescente de resistência dos microrganismos aos

métodos e soluções germicidas

Fonte: ( FAVERO, BOND. In: BLOCK, 1991).

Assim, para um processo de desinfecção eficaz, é necessário levar em

consideração uma série de fatores relacionados ao produto a ser utilizado

(concentração, tempo de exposição), ao local onde será aplicado (presença de

matéria orgânica, acesso do produto) e aos microrganismos presentes (carga

microbiana, tipo de microrganismo). Em 2007, Ioannou, Hanlon e Denyer

demonstraram através de estudos em laboratório que diversos fatores, como a

concentração do produto, tempo de exposição e carga microbiana, podem alterar o

sucesso da desinfecção frente a Staphylococcus aureus ao usar produtos à base de

quaternário de amônio (IOANNOU; HANLON; DENYER, 2007).

21

Os desinfetantes são amplamente utilizados nos hospitais e em outras áreas

de atendimento à saúde, sendo uma importante ferramenta nas práticas de controle

e prevenção de infecções. No ambiente hospitalar, o uso correto de agentes

antimicrobianos para a prevenção de infecções é um tema frequente. Estudos na

literatura relatam que uma das causas de infecções hospitalares está relacionada à

inadequada desinfecção dos artigos utilizados nos procedimentos hospitalares e

anti-sepsia de pacientes e funcionários do hospital. Lanini e colaboradores (2011),

por exemplo, investigaram a origem de uma infecção hospitalar causada por

Pseudomonas aeruginosa. Nesse trabalho, foi demonstrado que uma das possíveis

vias de contaminação era o dispensador de sabonete localizado no acesso à

unidade de tratamento intensivo, contaminado pela bactéria, evidenciando a

importância de manter as superfícies, objetos e materiais adequadamente limpos e

desinfetados, visando evitar o carreamento de microrganismos potencialmente

patogênicos para pacientes com a saúde mais debilitada. Nesse estudo, também foi

possível observar a importância da anti-sepsia de visitantes, enfermeiros e médicos,

a fim de prevenir a transmissão de possíveis patógenos aos pacientes (LANINI et al.,

2011). Shimono e colaboradores (2008) encontraram contaminação de

broncoscópios por P. aeruginosa após um surto dessa bactéria. Quando os

broncoscópios foram devidamente desinfetados, os casos de infecção por P.

aeruginosa começaram a diminuir. Takahashi e colaboradores (2004) analisaram um

surto de Serratia marcescens num hospital do Japão e associaram as infecções à

presença da bactéria em dispensadores de sabonete líquido e nebulizadores.

Os ambientes destinados a tratamentos dentários também merecem atenção.

Os objetos utilizados pelos dentistas nas consultas odontológicas, assim como os

implantes e placas inseridas na arcada dentária dos pacientes são superfícies

capazes de carrear microrganismos e por isso necessitam de uma desinfecção

correta antes do contato com o paciente. Hoje em dia, com o aumento do uso de

implantes para substituir a perda de dentes, é crescente a ocorrência de infecções

da mucosa oral (RENVERT; ROOS-JANSAKER; CLAFFEY, 2008). Estudos

demonstraram que o uso de soluções antimicrobianas, como hipoclorito de sódio,

peróxido de hidrogênio, clorexidina, ácido cítrico e solução à base de álcool etílico

são capazes de reduzir significativamente o número de bactérias vivas aderidas em

22

implantes de titânio, sendo viável a utilização devido ao baixo custo e fácil manuseio

dessas substâncias (GOSAU et al., 2010).

Nesse contexto, um grande desafio de um processo de desinfecção é a

eliminação de biofilmes bacterianos. Os biofilmes são uma forma de organização

das células bacterianas capaz de conferir maior resistência aos fatores adversos do

ambiente. Já foi demonstrada a presença dessa estrutura em diversos locais, como

encanamentos, equipamentos em indústrias, instrumentos médicos, sistemas de

ventilação e aparelhos de ar-condicionado (COSTERTON; STEWART, 2001).

Atualmente, os biofilmes são responsáveis por 100 mil mortes anuais nos Estados

Unidos e 80% das infecções microbianas (DAVIES, 2003, KLEVENS, 2007).

Diversos estudos já demonstraram que os microrganismos, quando estruturados em

biofilmes, são consideravelmente mais resistentes aos produtos desinfetantes.

Quando expostos a produtos à base de cloro, por exemplo, apresentam células

vivas após 60 minutos de contato (DAVIES, 2003). Em tubos, conseguem

recolonizar o local mesmo após fluxo contínuo com múltiplos biocidas durante 7 dias

(ANDERSON et al., 1990a). Além disso, microrganismos presentes em biofilmes já

demonstraram ser capazes de sobreviver em recipiente com solução de iodo por até

15 meses (PANLILIO et al., 1992). Epstein e colaboradores (2011) estudaram

biofilme de Bacillus subtilis e a sua resistência a desinfetantes, e observaram que a

eficácia do etanol em eliminar o biofilme depende da concentração utilizada.

1.2 LEGISLAÇÃO DOS SANEANTES COM ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

Devido à importância do uso de produtos desinfetantes e à grande variedade

de produtos existente, é essencial haver um arcabouço legal, que possa garantir a

qualidade desses produtos através da avaliação de parâmetros relacionados à

eficácia, à segurança da aplicação e à garantia da qualidade desses produtos

(ANDRADE et al., 2007). No Brasil, os desinfetantes estão submetidos às ações de

Vigilância Sanitária através da Lei nº 6.360, de 23 de setembro de 1976 (BRASIL,

1976), regulamentada pelo o Decreto nº 79.094, de 05 de janeiro de 1977 (BRASIL,

1977a), que dispõe sobre normas de vigilância sanitária, onde os saneantes

23

domissanitários são enquadrados como produtos a serem fiscalizados pela

Vigilância Sanitária.

Em relação às infrações sanitárias, há a Lei Federal nº 6.437, de 20 de agosto

de 1977, evidenciando as penas aplicadas nos casos em que as normas

estabelecidas para esses produtos não são cumpridas (BRASIL, 1977b).

Já a Lei nº 9.782, de 23 de fevereiro de 1999, que criou o Sistema Nacional

de Vigilância Sanitária, estabeleceu em seu artigo 6º que a Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (Anvisa) tem por finalidade institucional “promover a saúde da

população, por intermédio do controle sanitário da produção e da comercialização de

produtos e serviços submetidos à vigilância sanitária”, entre outros (BRASIL, 1999).

Assim, estas leis funcionam como ferramentas para que a Vigilância Sanitária

possa fiscalizar esses produtos produzidos no Brasil ou no exterior, assim como

tomar providências quando algum produto não se adeque a essa legislação.

Além dessas leis gerais, existem legislações específicas, cujas exigências

devem ser cumpridas. A RDC n° 59, de 17 de dezembro de 2010 (BRASIL, 2010b)

estabelece os procedimentos referentes ao registro de produtos saneantes

domissanitários levando-se em conta a avaliação e o gerenciamento de risco,

considerando parâmetros como a toxicidade e a finalidade de uso do produto, a

ocorrência de problemas anteriores, entre outros. Dessa forma, através do artigo 5º,

classifica os produtos como de Risco I e de Risco II sendo que o último refere-se

àqueles que oferecem maior risco à população e devem ser registrados junto à

Anvisa antes de serem comercializados. De acordo com parágrafo 2º da referida

Resolução, os produtos com atividade antimicrobiana, como os desinfetantes,

pertencem à classe de Risco II, os quais devem atender a alguns requisitos como:

não apresentarem efeitos comprovadamente mutagênicos, teratogênicos ou

carcinogênicos; produtos com DL50 oral para ratos, superiores a 200 mg/kg de peso

corpóreo para produtos líquidos e 500 mg/kg de peso corpóreo para produtos

sólidos, na diluição final de uso.

A RDC nº 14, de 28 de fevereiro de 2007 (BRASIL, 2007) classifica os

desinfetantes por âmbito de aplicação, compreendendo uso geral, uso em indústria

alimentícia e afins, uso hospitalar e uso específico (BRASIL, 2007).

Os produtos com ação antimicrobiana de uso geral abrangem os produtos de

uso doméstico, institucional ou industrial, destinados a serem aplicados sobre

24

objetos, superfícies inanimadas e ambientes. Estes são classificados em

desodorizantes (produtos que têm em sua composição substância com atividade

antimicrobiana capaz de controlar odores desagradáveis), sanitizantes

(agentes/produtos que reduzem o número de bactérias a níveis seguros de acordo

com as normas de saúde) e desinfetantes (BRASIL, 2007).

Os produtos com ação antimicrobiana para indústria alimentícia e afins

abrangem aqueles para uso em objetos, equipamentos e superfícies inanimadas e

ambientes onde se dá o preparo, consumo e estocagem dos gêneros alimentícios,

utilizados em cozinhas, indústrias alimentícias, laticínios, frigoríficos, restaurantes e

demais locais produtores ou manipuladores de alimentos. Estes são classificados

em sanitizantes e desinfetantes (BRASIL, 2007).

Os produtos com ação antimicrobiana de uso hospitalar abrangem os

produtos para uso em ambientes, pisos, paredes, mobiliários e artigos (objetos,

equipamentos e acessórios) utilizados exclusivamente em hospitais e

estabelecimentos relacionados com o atendimento à saúde. Estes são classificados

de acordo com a RDC n° 14, de 28 de fevereiro de 2007, como desinfetantes

hospitalares para superfícies fixas e artigos não críticos (objetos e equipamentos

odontológicos, médicos e hospitalares, que entram em contato superficial com a pele

intacta do organismo) (BRASIL, 2007).

Os produtos com ação antimicrobiana de uso específico abrangem os

produtos que, em função de seu uso específico, não se enquadram nas

classificações anteriores. Estes são desinfetantes para lactários, para piscinas, para

água de consumo humano, para tecidos e roupas, para roupas hospitalares e outros

(BRASIL, 2007).

Já a RDC n° 35, de 16 de agosto de 2010, harmonizada pelo Mercosul

(Mercado Comum do Sul), introduziu uma nova classificação para os desinfetantes

de uso hospitalar utilizados em artigos semi-críticos (aqueles que entram em contato

com a pele não íntegra ou com a mucosa do paciente) e críticos (aqueles utilizados

em procedimentos de alto risco, que penetram tecidos ou órgãos). Nela os

desinfetantes são classificados como de nível intermediário (produtos que destroem

bactérias vegetativas, micobactérias, a maioria dos vírus e fungos em um período de

tempo comprovado) e desinfetantes de alto nível (produtos que destroem todos os

25

microrganismos em um período de tempo comprovado, exceto um número elevado

de esporos bacterianos) (BRASIL, 2010a).

Em relação à comprovação da eficácia, as RDCs nº 14 e 35 preconizam que

os produtos saneantes domissanitários com ação antimicrobiana somente serão

registrados e autorizados para uso mediante a comprovação de sua eficácia aos fins

propostos, através de análise prévia realizada com o produto acabado e nas

diluições de uso indicadas pelo fabricante. Essas análises podem ser realizadas no

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação

Oswaldo Cruz (Fiocruz), Ministério da Saúde, ou em laboratórios oficiais

credenciados especificamente para este fim, obedecidos os métodos da Association

of Official Analytical Chemists (AOAC) ou métodos adotados pelo Comitê Europeu

de Normalização (CEN).

Oficialmente, até a elaboração da RDC nº 14, a legislação em vigor (Portaria

n° 15, de 23 de agosto de 1988) preconizava que os métodos e procedimentos para

a avaliação da atividade antimicrobiana dos desinfetantes fossem aquelas

preconizadas pelo INCQS, onde eram utilizadas apenas as metodologias da AOAC

(BRASIL, 1988). No caso dos desinfetantes de uso geral, na análise de eficácia se

utilizava o Método da Diluição de Uso (DU). Por outro lado, existem países que não

utilizam os métodos preconizados pela AOAC, fazendo uso de outras normalizações

e metodologias. Como exemplo, há os países da União Europeia, que seguem as

normas do CEN, além de países do continente asiático que também possuem suas

próprias normas. Com a circulação cada vez mais frequente de produtos entre os

diferentes países, torna-se cada vez mais necessário que esses órgãos,

responsáveis por essas avaliações estejam preparados para receber produtos que

utilizem diferentes métodos para a avaliação da atividade antimicrobiana. No Brasil,

esses problemas se tornam mais complicados entre os países do Mercosul, uma vez

que os produtos circulam com mais facilidade entre esses países e estes não são

avaliados apenas pelas metodologias preconizadas pela AOAC. Dessa forma, com o

objetivo de adequar um regulamento técnico para produtos saneantes com ação

antimicrobiana harmonizado no âmbito do Mercosul, a principal mudança da extinta

Portaria n° 15 para a RDC nº 14 foi a abertura para a utilização de outros métodos

objetivando a avaliação da eficácia, incluindo não somente os da AOAC como

também aqueles adotados pelo CEN, entre outros.

26

1.3 MÉTODOS DA DILUIÇÃO DE USO E DO COMITÊ EUROPEU DE

NORMALIZAÇÃO

O Método da DU da AOAC baseia-se na utilização de cilindros de aço inox

impregnados com microrganismos de referência. Esses cilindros são expostos ao

desinfetante a ser testado, de acordo com a diluição e o tempo de contato

recomendados pelo próprio fabricante, respeitada a legislação vigente e a

classificação do produto. Em seguida, os cilindros são transferidos para meios de

cultura para verificação de possíveis microrganismos sobreviventes. Após a

incubação, é avaliado o crescimento microbiano nas subculturas através da turvação

desses meios. Para ser aprovado, o produto deve eliminar os microrganismos em 59

dos 60 cilindros utilizados em cada teste (TOMASINO, 2007, INSTITUTO

NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE, 2009).

Entretanto, apesar de ser o método oficialmente adotado pela AOAC e pelos

órgãos brasileiros responsáveis, o Método da DU apresenta algumas falhas.

Estudos já demonstraram problemas na reprodutibilidade dos testes, onde a

variação dos resultados para um mesmo produto é considerada alta (ARLEA et al.,

2008). Um exemplo desses estudos foi a análise de 6 desinfetantes (3 fenólicos e 3

quaternários) pelo Método da DU, onde os resultados mostraram uma inabilidade de

reprodução do efeito bactericida desses desinfetantes, assim como a extrema

variabilidade dos resultados entre os laboratórios que participaram dos testes

(RUTALA; COLE, 1987). Outro problema encontrado nesse método é a falta de

padronização do inóculo do microrganismo que irá impregnar os cilindros. Estes são

mergulhados numa suspensão com o microrganismo teste durante um tempo

determinado e, posteriormente são colocados em estufa para secar, mas uma

estimativa do número de células por cilindro não é realizada (COLE; RUTALA;

ALFANO, 1988, TOMASINO; PINES; HAMILTON, 2009). Alguns estudos já

demonstraram que essa falta de padronização do inóculo inicial nos cilindros pode

ser uma das causas do problema da reprodutibilidade (TOMASINO; FIUMARA;

COTTRILL, 2006). Além disso, a padronização do número de células por cilindro no

início do método e a avaliação do número de células ao final da análise poderia dar

um caráter quantitativo ao Método da DU (TOMASINO; PINES; HAMILTON, 2009).

27

Outros estudos também já demonstraram que esses problemas apresentados pelo

método podem ser determinados pela manipulação inadequada do operador,

principalmente no que diz respeito aos cilindros (ARLEA et al., 2008).

Em relação ao método adotado pelo CEN para a avaliação da atividade

antimicrobiana de saneantes usados em ambientes domiciliares ou institucionais,

este é composto por algumas etapas e fases, pelas quais os produtos precisam

passar para serem analisados. Ao longo desses testes, os produtos são avaliados

quanto à capacidade de eliminar os microrganismos em suspensão, na presença de

substâncias interferentes e em superfície (com a utilização de discos de aço inox). A

fase 1 (teste em suspensão) tem como objetivo a obtenção de um resultado

preliminar sobre o produto teste, etapa utilizada principalmente pelas próprias

indústrias produtoras para ajuste da concentração do princípio ativo e maior

conhecimento da eficácia e características do produto que está sendo desenvolvido.

A fase 2 etapa 1 (teste em suspensão) difere da fase 1 pela adição de substância

interferente, utilizada para mimetizar a matéria orgânica encontrada nas superfícies

do ambiente, com o objetivo de se aproximar da realidade do processo de

desinfecção. A fase 2, etapa 2 é um teste em superfície, com a utilização dos discos

de aço inox, com o objetivo de avaliar o comportamento e eficácia do produto em

uma superfície semelhante aquela onde poderá ser utilizado. Segundo a norma do

CEN, para uma análise oficial de avaliação da atividade antimicrobiana são

necessárias apenas a fase 2, etapa 1 e 2 (EUROPEAN STANDARD 14885, 2006).

Dessa forma, os desinfetantes podem ser analisados em diferentes situações

e em condições simuladas que se aproximam um pouco mais da realidade, o que

pode tornar a avaliação mais precisa em relação à situação real de uso dos

produtos. Além disso, todas as etapas do método são realizadas a partir de um

inóculo inicial padronizado e o número final de células viáveis será observado,

possibilitando uma análise quantitativa da ação antimicrobiana dos produtos

(BLOCK, 2001).

28

1.4 MICRORGANISMOS NO AMBIENTE DOMICILIAR E PÚBLICO

Com a crescente atenção voltada para a contaminação e risco de infecções

causadas por alimentos e produtos manufaturados, houve um aumento do uso de

desinfetantes pelo público em geral (MCDONNELL; RUSSELL, 1999).

Microrganismos estão presentes em grande escala no ambiente domiciliar e público.

Diversos trabalhos já demonstraram a existência de bactérias em superfícies em

residências e locais de livre circulação da população. Acredita-se que os fômites

(superfícies capazes de transmitir patógenos e doenças) desempenhem um

importante papel na transmissão de infecções entéricas e respiratórias (BOONE;

GERBA, 2007). No ambiente domiciliar, uma série de objetos apresenta

contaminação por microrganismos. Ojima e colaboradores (2002b) estudaram 5

residências no Japão, pesquisando a presença de microrganismos em diferentes

superfícies. A cozinha foi o local com maior contaminação por bactérias aeróbias,

seguida pelo banheiro. Coliformes foram encontrados na geladeira, mais

precisamente no compartimento onde são estocados os vegetais. Escherichia coli,

S. aureus e P. aeruginosa foram detectados em diversas superfícies, como

torneiras, pias, esponjas, toalhas de prato e mão, maçanetas, brinquedos, dentre

outros (OJIMA et al., 2002b). Os mesmos autores, num outro estudo, avaliaram 86

residências japonesas, rastreando todos os cômodos em relação à presença de

bactérias e fungos, mostrando que a cozinha é o local com maior contaminação de

bactérias aeróbias, incluindo coliformes, E. coli, S. aureus e P. aeruginosa (OJIMA et

al., 2002a).

Também já foi demonstrada a presença de contaminação em locais de livre

circulação, como shoppings, aeroportos, corrimão de escadas, banheiros públicos,

pontos de ônibus, telefones públicos e locais de recreação infantil (REYNOLDS et

al., 2005). Nesse estudo, além do cultivo das amostras em meio de cultura, também

foi realizada a avaliação da presença de marcadores bioquímicos, como

hemoglobina, ureia, amilase e proteínas, evidenciando o potencial das superfícies

em apresentar contaminação microbiana e em transmitir doenças. A hemoglobina,

por exemplo, é capaz de carrear vários patógenos presentes no sangue do

hospedeiro; a ureia e a amilase estão presentes na mucosa e pele das pessoas,

29

indicando possível contaminação por microrganismos de mucosa e pele; já as

proteínas estão amplamente distribuídas pelo corpo e indicam possível

contaminação por microrganismos presentes no hospedeiro (REYNOLDS et al.,

2005).

O nível de contaminação microbiana em residências e locais públicos pode

ser influenciado por uma série de fatores. Um estudo comparou a presença de

contaminação microbiana em 2 países distintos, um menos desenvolvido (Camboja)

e outro desenvolvido (Estados Unidos). Foi evidenciada a presença de 100 vezes

mais coliformes termotolerantes no local menos desenvolvido, provavelmente devido

a diferenças no clima, estrutura das residências e práticas de higiene. Além disso,

superfícies que apresentam maior umidade apresentam maior contaminação

microbiana, devido à maior disponibilidade de água (SINCLAIR; GERBA, 2010).

Aproximadamente 1,8 milhões de mortes de crianças são associadas às

doenças de origem alimentar, principalmente em países em desenvolvimento

(ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 2008). Entretanto, os países desenvolvidos

também sofrem com doenças diarreicas (SCALLAN et al., 2005). Nos Estados

Unidos, os patógenos alimentares causam aproximadamente 76 milhões de casos,

325 mil hospitalizações e 5 mil mortes por ano (SCOTT, 1996, MEAD et al., 1999), o

que resulta em um custo estimado em 6,9 bilhões de dólares por ano, devido ao

absenteísmo, custo com medicação e hospitalização (ALLOS et al., 2004, IMHOFF

et al., 2004).

Microrganismos patogênicos associados à diarreia já foram isolados do

ambiente residencial (ALLOS et al., 2004; SCOTT, 1996), dentre eles

Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, E. coli O157:H7, Listeria

monocytogenes, Salmonella não tifóide e S. aureus, sendo responsáveis por 3-7

milhões de casos e 2-6 mil mortes anuais nos Estados Unidos (BUZBY et al., 1996).

De acordo com Kagan, Aiello e Larson (2002), entre 6-60% da transmissão de

doenças infecciosas ocorrem dentro do ambiente domiciliar onde um dos membros

da família está doente (KAGAN; AIELLO; LARSON, 2002).

A eficácia da limpeza e desinfecção é importante para reduzir a disseminação

microbiana devido à contaminação cruzada entre pessoas, animais, cozinha,

brinquedos e superfícies de contato (COGAN; BLOOMFIELD; HUMPHREY, 1999,

COGAN et al., 2002, FREDRIKSSON-AHOMAA; KORTE; KORKEALA, 2001,

30

OTOKUNEFOR et al., 2003, IWANICKA-GRZEGOREK et al., 2005,

SEEPERSADSINGH; ADESIYUN; SEEBARANSINGH, 2005, VAN ASSELT et al.,

2008, RUTLAND et al., 2009). Além disso, máquinas e utensílios de lavagem podem

funcionar como reservatórios de microrganismos (KAGAN; AIELLO; LARSON,

2002), como exemplo, alguns vírus entéricos que são capazes de sobreviver aos

processos de lavagem (GERBA; KENNEDY 2007). A manipulação adequada de

alimentos e procedimentos de higiene também são ferramentas eficazes para evitar

a disseminação microbiana (KITAMOTO et al., 2009), pois bactérias são capazes de

sobreviver, se multiplicar e dispersar pela cozinha e outras áreas domiciliares

durante o preparo dos alimentos (COGAN; BLOOMFIELD; HUMPHREY, 1999,

RUSIN; MAXWELL; GERBA, 2002, CASTRO-DEL CAMPO et al., 2004).

Dessa forma, a maneira mais importante para manter um controle microbiano

eficiente inclui minimizar a carga microbiana de fontes externas, o controle

microbiano eficaz de sítios vulneráveis das residências e a limpeza e desinfecção

adequada do domicílio (WIRTANEN; SALO, 2003). Medrano-Félix e colaboradores

analisaram um grupo de 30 residências e observaram a presença de patógenos

como E. coli, Salmonella spp e S. aureus em vários locais no interior dos domicílios

(MEDRANO-FÉLIX et al., 2010). Nesse estudo, foram avaliados e utilizados

procedimentos de limpeza e desinfecção por compostos de cloro e de quaternários

de amônio, evidenciando a importância da desinfecção e das práticas de higiene

para o sucesso da redução da carga microbiana e, consequentemente, da

transmissão de infecções. Diversos outros trabalhos evidenciaram a importância dos

procedimentos de limpeza e desinfecção para a prevenção de transmissão de

doenças. Já foi demonstrado que quando superfícies de ônibus escolares e

brinquedos são regularmente limpos e desinfetados, ocorre uma redução nos casos

de doenças gastrointestinais e respiratórias entre as crianças do local (BARKER;

STEVENS; BLOOMFIELD, 2001). Além disso, este trabalho cita uma série de

estudos que indicam uma redução da contaminação e infecção viral quando são

adotadas práticas de higiene, evidenciando que essas práticas são capazes de

interromper, ou ao menos minimizar, a transmissão de doenças microbianas.

Entretanto, bactérias Gram-negativas têm sido encontradas como

contaminantes dos próprios produtos desinfetantes. A menor suscetibilidade das

bactérias Gram-negativas a esses compostos, em comparação às Gram-positivas,

31

está relacionada à presença da membrana externa, de natureza lipoprotéica, que

age como uma barreira, limitando a entrada de muitos tipos de agentes

antibacterianos quimicamente não relacionados (MIYAGI; TIMENETSKY;

ALTERTHUM, 2000). Algumas bactérias Gram-negativas, como P. aeruginosa,

Burkholderia cepacia, e Proteus spp já mostraram alto nível de resistência a

desinfetantes (MCDONELL; RUSSELL, 1999), havendo relatos de sobrevivência de

S. marcescens em clorexidina (MARRIE; COSTERTON, 1981), P. aeruginosa e

Pseudomonas cepacia em soluções à base de iodo (BERKELMAN et al., 1984;

ANDERSON et al., 1990b). Produtos à base de quaternários de amônio também já

apresentaram contaminação. No Brasil, já houve relatos de isolamento de

Enterobacter spp de desinfetante de uso domiciliar (TIMENETSKY, 1990). A maior

resistência dessas bactérias parece estar relacionada a uma adaptação fisiológica

em resposta à mudança no ambiente, principalmente com alterações na membrana

externa das células. Em P. aeruginosa, observou-se que há uma diferença na

composição do lipopolissacarídeo (LPS) e aumento no conteúdo do íon Mg+, que

fortalece as ligações entre os LPS. Além disso, a presença de porinas de baixa

eficiência impede a difusão de moléculas para o interior da célula. Em B. cepacia, o

alto conteúdo de arabinose ligado ao fosfato no seu LPS parece diminuir a afinidade

da membrana externa às moléculas catiônicas (MCDONNELL; RUSSELL, 1999).

1.5 JUSTIFICATIVA

O monitoramento da qualidade dos produtos saneantes deve ser realizado

rotineiramente pelas autoridades sanitárias. E especial atenção deve ser dada aos

produtos com atividade antimicrobiana devido ao papel essencial desses produtos

no contexto da saúde pública, na prevenção e transmissão de doenças infecciosas.

No mundo globalizado de hoje, onde ocorre a livre circulação de mercadorias e o

lançamento de produtos com alta tecnologia, a dinâmica da avaliação da eficácia

desses produtos deve ser sempre aprimorada. Por isso, é de suma importância,

capacitar o único laboratório federal de controle de qualidade de produtos

submetidos à Vigilância Sanitária, o INCQS, na execução de metodologias que

32

permitam a avaliação e o controle da qualidade desses produtos e suas

formulações, evitando assim a comercialização de produtos que possam gerar risco

direto ou indireto à população.

Dessa forma, após a publicação da RDC nº 14 pela Anvisa, onde é permitida

a utilização de novas metodologias para a avaliação da atividade antimicrobiana de

produtos desinfetantes, é extremamente necessária a implantação de métodos que

representem alternativas a DU nos laboratórios oficiais para adequá-los à nova

legislação.

Além disso, é de grande interesse a avaliação desses métodos utilizando-se

cepas bacterianas provenientes do ambiente, de forma a se obter mais proximidade

com a realidade de aplicação dos produtos.

33

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Este trabalho teve como objetivo estudar, implantar e aplicar métodos

baseados nas normas do Comitê Europeu de Normalização para a avaliação da

atividade antibacteriana de desinfetantes de uso institucional (produtos de venda

livre, utilizados em domicílios, locais públicos, indústrias), avaliando em paralelo a

metodologia da Diluição de Uso.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Implantar os métodos preconizados pelo CEN para avaliar a eficácia de

desinfetantes de uso institucional;

Aplicar os métodos implantados frente a produtos desinfetantes

comercializados no mercado brasileiro;

Utilizar o método de Diluição de Uso para uma avaliação em paralelo com os

métodos implantados;

Isolar e identificar bactérias do ambiente domiciliar para serem utilizadas

como microrganismos teste nos métodos em estudo;

Identificar os microrganismos encontrados como contaminantes em

desinfetantes utilizados ao longo da realização do presente trabalho.

34

3 METODOLOGIA

3.1 PRODUTOS UTILIZADOS

Foram utilizados três produtos desinfetantes para a realização dos testes de

avaliação da atividade antimicrobiana. O álcool etílico a 70%, preparado no próprio

laboratório a partir de etanol absoluto e dois produtos (A e B) à base de compostos

quaternários de amônio classificados como desinfetantes de uso geral

comercializados no mercado brasileiro. O produto A possui como ativos Cloreto de

Cocobenzil Alquil Dimetil Amônio (0,45%) e Cloreto de Cetil Trimetil Amônio (0,35%),

coloração laranja, pouca opacidade e recomendação de uso como produto puro. O

produto B possui como ativo Cloreto de Alquil Dimetil Benzil Amônio (2%), coloração

verde, pouca opacidade e recomendação de uso na diluição de 5%.

Logo no início do trabalho, foram também adquiridos três produtos à base de

quaternários de amônio que seriam utilizados nos testes em paralelo com as

metodologias da AOAC e do CEN, porém foi verificada nesses produtos a presença

de contaminação microbiana conforme descrito no item 3.3 (produtos C, D e E). O

produto C possui como ativo Cloreto de Alquil Dimetil Benzil Amônio (0,4%),

coloração roxa, pouca opacidade e recomendação de uso como produto puro. O

produto D possui como ativo Cloreto de Alquil Dimetil Benzil Amônio (0,4%),

coloração verde, pouca opacidade e recomendação de uso como produto puro. O

produto E possui como ativo Cloreto de Alquil Dimetil Benzil Amônio (0,3%),

coloração rosa, pouca opacidade e recomendação de uso como produto puro.

Assim, esses três produtos não foram utilizados nos testes para avaliação da

atividade antimicrobiana, sendo realizada a identificação dos contaminantes

(segundo item 3.2, 3.3 e 3.4) (Tabela 2).

A avaliação do teor de princípio ativo dos produtos foi realizada pelo Setor de

Saneantes e Cosméticos do Departamento de Química do INCQS, de acordo com o

POP INCQS nº 65.3110.014 (INSTITUTO NACIONAL DE CONTROLE DE

QUALIDADE EM SAÚDE, 2011).

35

Todos os produtos foram utilizados conforme recomendado pelos fabricantes,

tanto no método da DU como nas metodologias do CEN, utilizando-se água

purificada para diluição dos mesmos quando foi o caso.

Tabela 2

Produtos escolhidos para a realização das metodologias de avaliação da atividade antimicrobiana.

Produto Princípio Ativo Observação

Álcool etílico 70% Álcool etílico Utilizado nos testes

Produtos A e B Quaternário de amônio Utilizados nos testes

Produtos C, D e E Quaternário de amônio Identificação da contaminação

3.2 ISOLAMENTO DAS BACTÉRIAS DO AMBIENTE DOMICILIAR

Duas áreas (cozinha e banheiro) de uma mesma residência foram escolhidas

para a coleta das amostras. Na cozinha, foi escolhida uma região no chão, ao lado

da caixa de areia do animal doméstico; no banheiro, foi escolhida uma região no

chão ao lado do vaso sanitário. Numa área delimitada de 100 cm², foi passado um

swab umedecido em solução de cloreto de sódio 0,85%. O material coletado no

swab foi inoculado em um tubo contendo caldo soja tríptica (TSB) e incubado por

24h a 36 ± 1ºC. A partir do crescimento no meio TSB, alçadas foram transferidas,

através da técnica de esgotamento, para placas de Petri contendo os meios ágar

soja tríptica (TSA), ágar cetrimida, ágar MacConkey e ágar manitol salgado. Após

incubação por 24 h a 36 ± 1ºC, as colônias isoladas foram submetidas à

bacterioscopia pelo método de Gram e transferidas para uma nova placa de TSA,

semeada através da técnica de esgotamento. Após incubação por 24 h a 36 ± 1ºC,

foi verificada a pureza da cultura e, a partir desse crescimento, foi realizada a

identificação.

36

3.3 ISOLAMENTO DAS BACTÉRIAS CONTAMINANTES DOS DESINFETANTES

Os três produtos desinfetantes foram inicialmente utilizados nos ensaios de

avaliação da atividade antimicrobiana. Ao realizar o método da DU, foi observado o

crescimento de todos os tubos de meio de cultura usados nos ensaios, indicando

uma possível contaminação presente nesses produtos. Assim, uma alíquota de 1 mL

de cada desinfetante foi transferida para um tubo contendo caldo Letheen e este foi

incubado a 37ºC por até 7 dias. Após esse período foi observada a turvação do meio

de cultura, confirmando a presença de contaminantes nesses produtos. A partir

dessa observação, foi realizado o isolamento das bactérias contaminantes.

Alíquotas de 1 mL foram retiradas diretamente da embalagem de cada

desinfetante que apresentou contaminação nos testes iniciais, e adicionadas em

tubos contendo 10 mL de caldo Letheen. Os tubos foram incubados a 36 ± 1ºC por 1

a 5 dias. Após crescimento em caldo Letheen, alçadas foram transferidas para os

meios de cultura utilizados para observação do crescimento bacteriano: meio

Lowenstein-Jensen, TSA e ágar cetrimida. A partir do crescimento em TSA, foi

realizado o estoque das bactérias em criotubos, contendo TSB com 20% de glicerol,

e mantidos a – 70ºC.

3.4 IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS ISOLADAS

As bactérias a serem identificadas foram cultivadas em placas contendo meio

TSA, através da técnica de esgotamento, e incubadas por 24 h a 36 ± 1ºC. A partir

do crescimento em placa, foi realizada a bacterioscopia pelo método de Gram. Para

confirmação das características morfo-tintoriais, foi realizada a técnica do hidróxido

de potássio. Uma colônia isolada na placa de TSA foi retirada com a ajuda de uma

alça e esfregada em solução de KOH 3% (hidróxido de potássio) por 1 minuto. No

caso de formação de um filete após a alça ser levantada do esfregaço, a bactéria

deve ser considerada Gram-negativa. Caso não seja formado o filete, a bactéria

deve ser considerada Gram-positiva (POWERS, 1995).

37

Além da técnica do KOH, o crescimento em placa de TSA foi utilizado para a

identificação das bactérias no equipamento VITEK 2 (bioMérieux). Alçadas do

microrganismo foram retiradas para a realização de uma suspensão com turvação

equivalente a 0,5 da escala MacFarland em solução de cloreto de sódio 0,45-0,5%.

A suspensão foi, então, colocada no aparelho em cartão de identificação (Cartão

VITEK 2 GN, nº lote: 241188540) relativo às características morfo-tintoriais

confirmadas pela técnica do KOH. O ciclo do equipamento para a realização das

provas bioquímicas foi de 24h.

3.5 CEPAS BACTERIANAS

Neste trabalho, foram utilizadas para o método da DU as cepas de referência

de S. aureus INCQS nº 00039 (ATCC 6538) e S. choleraesuis INCQS nº 00028

(ATCC 10708) segundo o preconizado pela AOAC (TOMASINO, 2007). Para as

metodologias do CEN, foram utilizadas as cepas de referência de S. aureus INCQS

nº 00039 (ATCC 6538), P. aeruginosa INCQS nº 00025 (ATCC 15442), E. coli

INCQS nº 00031 (ATCC 10536) e Enterococcus hirae INCQS nº 00019 (ATCC

10541) (EUROPEAN STANDARD 14885, 2006). Além dessas, foram utilizadas nas

duas metodologias aquelas bactérias isoladas de domicílio (Tabela 3).

3.6 AVALIAÇÃO DA QUALIDADAE DE DESINFETANTES DE USO GERAL PELO

MÉTODO DA DILUIÇÃO DE USO

3.6.1 Manutenção dos microrganismos de referência

Ampolas contendo os microrganismos liofilizados foram reconstituídas com

0,5 mL de caldo nutriente Difco (para S. choleraesuis) ou TSB (para S. aureus).

Alíquotas de 0,2 mL foram transferidas para um tubo contendo o mesmo caldo e

38

este foi incubado por 18-24 h a 36 ± 1ºC. Foram semeados também, por estrias, três

tubos com ágar nutriente inclinado, incubados por 48 ± 2 h a 36 ± 1ºC. A partir do

crescimento em caldo, foi realizada a bacterioscopia para a observação da

morfologia das células. Para a verificação da pureza da cultura, foi semeada uma

placa de Petri com ágar nutriente Difco e incubada por 18-24 h a 36 ± 1ºC. Caso a

cultura estivesse pura, os três tubos de ágar nutriente inclinado eram estocados a 2-

5 ºC por 30 ± 2 dias (cultura estoque) (TOMASINO, 2007, INSTITUTO NACIONAL

DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE, 2009).

Tabela 3

Microrganismos utilizados nos testes para avaliação da atividade antimicrobiana preconizados pela

Association of Official Analytical Chemists (AOAC) e pelo Comitê Europeu de Normalização (CEN).

Métodos

Microrganismos

Diluição de Uso

Staphylococcus aureus

Salmonella choleraesuis

Isolado domiciliar (cozinha) – Enterobacter cloacae

Isolado domiciliar (banheiro) - Enterobacter cloacae

Metodologia CEN

Fase 1

Fase 2, Etapa1

Fase 2, Etapa 2

Staphylococcus aureus

Pseudomonas aeruginosa

Escherichia coli

Enterococcus hirae

Isolado domiciliar (cozinha) - Enterobacter cloacae

Isolado domiciliar (banheiro) - Enterobacter cloacae

39

3.6.2 Cilindros carreadores

Foram utilizados cilindros de aço inoxidável tipo 304, SS 18-8, polidos, com 8

± 1 mm de diâmetro externo, 6 ± 1 mm de diâmetro interno e 10 ± 1 mm de

comprimento.

Antes da realização dos ensaios, os cilindros sofreram uma preparação

específica. Inicialmente foram observados possíveis danos visíveis, como arranhões,

lascas e orifícios. Os cilindros foram então fervidos em água destilada por 10

minutos e, posteriormente, tratados com solução de hidróxido de sódio 1M por uma

noite. Após esse tratamento, os cilindros foram lavados abundantemente com água

corrente até a água de lavagem apresentar pH neutro. Após esse procedimento, os

cilindros foram colocados em tubos de ensaio 25 mm x 200 mm com tampa de rosca

na quantidade de 12 cilindros por tubo e cobertos com água purificada. Os tubos

foram, então, esterilizados por autoclavação a 121ºC por 20 minutos e guardados à

temperatura ambiente até a realização dos ensaios (INSTITUTO NACIONAL DE

CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE, 2009).

3.6.3 Metodologia

A partir das culturas estocadas foram realizados 3 repiques consecutivos.

Estes foram incubados a 36 1ºC por 24 horas em 10 mL de caldo nutriente. O 4º

repique consecutivo, a ser utilizado no teste, foi preparado através da inoculação de

no mínimo 7 tubos contendo 10 mL de caldo nutriente incubados a 36 1ºC por 48

horas (Figura 2). Após o tempo de incubação, as culturas testes foram agitadas e

reunidas em um frasco estéril, e distribuídas em alíquotas de 20 mL em 3 tubos de

25 X 150 mm estéreis (Figura 3). Foram então transferidos 22 cilindros de aço inox

estéreis (20 foram utilizados no ensaio e 2 foram usados no controle de fertilidade

descrito posteriormente), com auxílio do gancho de transferência para cada um dos

três tubos da cultura teste de 48 h, onde permaneceram submersos por 15 minutos

à temperatura ambiente (Figura 3). Após esse tempo de contato, utilizando-se o

40

gancho flambado, os 22 cilindros foram cuidadosamente dispostos verticalmente em

duas placas de Petri forradas com duas folhas de papel de filtro Whatman nº 2, e as

placas foram incubadas a 36 1ºC por 40 minutos (Figura 4).

Figura 2 - Etapa inicial da preparação do inóculo realizado a partir das culturas estocadas para o

Método da Diluição de Uso (INSTITUTO NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE,

2009)

41

Figura 3 - Esquema dos procedimentos empregados no preparo do inóculo utilizado no Método da

Diluição de Uso, a partir do 4° repique após incubação a 36 ± 1ºC por 48h (INSTITUTO NACIONAL

DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE, 2009)

4º Repique – 7 tubos contendo o microrganismo teste em 10 mL de Caldo Nutriente.

Inóculo de 20 mL

42

Figura 4 - Etapa de contaminação e transferência dos cilindros segundo o Método da Diluição

(INSTITUTO NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE, 2009)

Cada um dos cilindros foi transferido assepticamente e cronometradamente,

com intervalo de 30 segundos, para cada um dos 20 tubos contendo 10 mL do

produto à temperatura de 20ºC. Após o tempo de contato de 10 minutos, os cilindros

foram transferidos para 20 tubos contendo 10 mL de meio de cultura (caldo Letheen

para os produtos à base de compostos quaternários de amônio e caldo nutriente

para a solução de álcool etílico a 70%). Após 30 minutos, a contar da transferência

do último cilindro para o tubo com o meio de cultura, estes foram novamente

transferidos para tubos contendo 10 mL do mesmo meio (subcultura) e o total de 40

tubos de meio de cultura foi incubado a 36 1ºC por 48 horas. Esse procedimento

foi realizado em três baterias de 20 cilindros cada, perfazendo um total de 60

cilindros de aço inoxidável e 120 tubos contendo o meio de subcultura (Figura 5).

Inóculo Inóculo + 22 cilindros 11 cilindros / placa

(20 mL/tubo) (15 minutos de contato) (36 1ºC / 40 min.)

43

Figura 5 - Esquema da transferência dos cilindros entre tubos utilizados no método da Diluição de Uso (INSTITUTO NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE, 2009). T indica o tempo de transferência, T1 corresponde ao momento que o cronômetro marca o tempo 1 minuto, quando o 1

o cilindro é transferido para o 1º tubo contendo o produto em estudo (P1); após 30 segundos (T2)

outro cilindro é transferido para o 2º tubo contendo o produto e assim sucessivamente. O último cilindro é transferido no tempo T20 ao tubo P20 e após 30 segundos o 1º cilindro, que se encontra no tubo P1 que terá totalizado 10 minutos de contato com o produto, é transferido no tempo T21 para o 1º tubo contendo o meio de cultura (CL 1). No tempo T22 o 2

o cilindro é transferido do tubo T12 para

o tubo CL2 e assim sucessivamente. A nomenclatura dos meios de cultura exemplifica o uso de caldo Letheen (CL) para produtos à base de compostos quaternários de amônio

44

3.6.4 Leitura e avaliação dos resultados

Para leitura do teste foi observada a ausência ou a presença de crescimento,

após incubação, através da turvação do meio de cultura. O produto, para ser

considerado satisfatório, deveria ser capaz de matar o microrganismo teste em 59

dos 60 cilindros utilizados, o que confere um nível de confiança de 95%. O teste foi

repetido de acordo com os critérios preconizados no POP INCQS nº 65.3210.007, ou

seja, no caso do resultado do teste ser satisfatório, não foi realizada nenhuma

repetição. Entretanto, quando o resultado do teste foi insatisfatório, houve a nova

realização do mesmo teste. No caso de haver crescimento microbiano, foi

confirmada a presença do microrganismo teste utilizado no teste através de

bacterioscopia pelo método de Gram e prova da coagulase (para S. aureus) e

sorologia com soro polivalente (para Salmonella choleraesuis) (INSTITUTO


3.6.5 Controles

Todo o material envolvido no teste foi verificado quanto à esterilidade,

evitando a ocorrência de resultado falso-positivo. Os controles realizados testes

estão descritos abaixo:

o Esterilidade do meio de subcultura

A esterilidade dos meios de subcultura foi verificada através da incubação, a

36 1ºC por 48 horas, de um tubo do mesmo lote do meio de subcultura utilizado no

teste, não devendo ser observado crescimento microbiano (INSTITUTO NACIONAL

DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE, 2009).

45

o Esterilidade da água purificada

Neste procedimento, foi adicionado 0,2 mL da água purificada estéril, usada

para diluir o produto, a um tubo contendo o meio de subcultura utilizado no teste e

incubado a 36 1ºC por 48 horas, não devendo ser observado crescimento

microbiano (INSTITUTO NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE,

2009).

o Esterilidade dos lotes de pipetas

Foi separada uma pipeta de cada lote utilizado no teste e com o auxílio de um

pipetador automático, foi realizada a aspiração do meio de subcultura até acima da

marcação da graduação, permitindo logo em seguida, a saída do líquido para o

mesmo tubo. Este procedimento foi repetido 3 vezes. O tubo foi incubado a 36 1ºC

por 48 horas, não devendo ser observado crescimento microbiano (INSTITUTO


o Esterilidade dos carreadores

Um cilindro estéril, do lote empregado no teste, foi transferido para um tubo

contendo o meio de subcultura utilizado no teste e incubado a 36 1ºC por 48 horas,

não devendo ser observado crescimento microbiano (INSTITUTO NACIONAL DE


o Fertilidade do meio de cultura

Um cilindro contaminado e seco foi transferido para um tubo contendo o

mesmo lote do meio de subcultura utilizado no teste. Este foi incubado a 36 1ºC

por 48 horas. Após esse tempo de incubação a evidência de crescimento foi

observada através da turvação do meio de subcultura (INSTITUTO NACIONAL DE


46

3.7 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE PRODUTOS DESINFETANTES

DESTINADOS A DESINFECÇÃO DE SUPERFÍCIES EM AMBIENTES

DOMÉSTICO, INSTITUCIONAL E INDUSTRIAL SEGUNDO O COMITÊ EUROPEU

DE NORMALIZAÇÃO

Essa avaliação é baseada em um conjunto de normas que preconizam desde

a abertura de ampolas, preservação das cepas bacterianas e os testes de avaliação

da atividade antimicrobiana propriamente ditos, incluindo até 3 fases de avaliação

(Tabela 4).

Tabela 4

Etapas da metodologia preconizada pelo CEN.

Etapa

Observação Objetivo

Fase 1 Etapa em suspensão

Triagem inicial para encontrar a

concentração ideal de uso (não é

obrigatória para a avaliação da eficácia)

Fase 2, Etapa 1

(Fase 2.1)

Etapa em suspensão, com

adição de substância

interferente

Avaliação do desinfetante na presença

de substância interferente para

mimetizar a presença de matéria

orgânica

Fase 2, Etapa 2

(Fase 2.2)

Etapa em superfície, com

utilização de discos de aço inox

Teste em superfície, mimetizando o uso

do produto em superfícies

contaminadas no ambiente

47

3.7.1 Manutenção dos microrganismos de referência

Ampolas contendo microrganismos liofilizados foram reconstituídas com 1,0

mL de TSB. Essa suspensão foi diluída em 5,0 mL do mesmo caldo e agitada para

obter uma suspensão homogênea. Duas placas de Petri contendo TSA foram

inoculadas com a suspensão bacteriana, uma com 0,1 mL da suspensão, gerando

um crescimento confluente na placa, e a outra com uma alçada para crescimento em

isolamento. As duas placas foram incubadas por 24 h a 36 ± 1ºC. Esta última foi

utilizada para a verificação da pureza da cultura e a realização da bacterioscopia

pelo método de Gram para observação da morfologia.

À placa com crescimento confluente, foram adicionados 10 mL de solução

crioprotetora (extrato de carne, digesto pancreático de caseína e glicerol),

realizando-se uma raspagem da superfície para a obtenção de uma suspensão de

células. Essa suspensão foi aliquotada em criotubos, em porções de 0,5 mL da

suspensão bacteriana. Os criotubos foram mantidos à temperatura de -70ºC por

14 meses (cultura estoque).

A partir da suspensão criopreservada, foi obtida a cultura de trabalho. Uma

alçada da suspensão criopreservada foi transferida para dois tubos contendo TSA

inclinado, incubados por 24 h a 36 ± 1ºC. Após o tempo de incubação, os tubos

foram mantidos a 2-5ºC por no máximo 9 semanas (excessão para P. aeruginosa, a

qual foi mantida por no máximo 6 semanas) (EUROPEAN STANDARD 12353,

2006).

48

3.7.2 Teste em Suspensão Quantitativo para Avaliação da Atividade Bactericida

Básica de Desinfetantes Químicos e Antissépticos – Fase 1 (EUROPEAN

STANDARD 1040, 2005)

3.7.2.1 Repiques

Para a obtenção da cultura teste, a partir da cultura de trabalho, foram

realizados dois repiques consecutivos em meio TSA inclinado, com incubação por

24 h a 36 ± 1ºC. Um terceiro repique opcional é permitido.

3.7.2.2 Padronização do inóculo inicial

Conforme preconizado pela norma EN 1040, o inóculo inicial utilizado nos

testes deve estar entre 1,5 x 108 e 5,0 x 108 UFC/mL. Para padronizar essa faixa na

prática, foi adotada, para cada microrganismo, uma relação entre densidade ótica

(leitura em espectrofotômetro) e contagem de colônias em placas (unidades

formadoras de colônia – UFC).

Para isso, a partir do segundo repique, alçadas foram transferidas para um

tubo contendo solução diluente (digesto pancreático de caseína e cloreto de sódio) e

5 g de pérolas de vidro. O tubo foi, então, agitado a 1.000 g por 3 minutos. A partir

dessa suspensão, foi realizada uma diluição seriada de 10-1 a 10-8. Cada diluição foi

plaqueada (1 mL) em meio TSA através da técnica de pour plate e incubada por 24

h a 36 ± 1ºC. Após o tempo de incubação, as unidades formadoras de colônia (UFC)

foram contadas nas placas onde foi possível encontrar contagem entre 14 e 330

UFC (Figura 6).

A média ponderada da contagem das duas placas de cada diluição foi obtida

e multiplicada pela diluição para a obtenção do número de células por mL. Foram

realizadas três repetições desse procedimento para a obtenção de pelo menos três

correlações entre densidade ótica (DO) e número de células/mL, para ser possível

49

obter uma faixa de DO a qual correspondesse à faixa de 1,5 x 108 e 5,0 x 108

UFC/mL.

A DO desta suspensão foi medida em espectrofotômetro, no comprimento de

onda de 630 nm.

Figura 6 - Padronização do inóculo inicial através da utilização conjunta de técnica

espectrofotométrica (leitura da DO) e contagem de unidades formadoras de colônias (UFC).

3.7.2.3 Realização do teste

Na realização do teste propriamente dito, a partir do 2º repique, alçadas com

o microrganismo teste foram transferidas para um tubo contendo 15 mL de solução

diluente e 5 g de pérolas de vidro. Essa suspensão foi agitada a 1.000 g por 3

minutos (5 minutos para P. aeruginosa). Para ajustar a suspensão inicial (N),

alíquotas de 3 mL foram retiradas e realizada a leitura em espectrofotômetro para

medir a DO. Com a suspensão inicial ajustada, de acordo com a padronização

50

inicial, foi realizada uma diluição seriada de 10-1 a 10-7. As diluições 10-6 e 10-7 foram

plaqueadas em meio TSA para a contagem da suspensão inicial (Figura 7).

Para os controles, foi preparada uma suspensão de validação (Nv),

padronizada entre 3,0 x 10² e 1,6 x 10³ UFC/mL, transferindo 2 mL da diluição 10 -5

para um tubo contendo até 6 mL de solução diluente (proporção 1:3). Para a

contagem em placa da suspensão de validação, foi realizada uma diluição 10 -1

(Figura 7).

Figura 7 - Preparação e ajuste da suspensão teste (N) e da suspensão de validação (Nv). DO =

densidade ótica

Com a suspensão teste (N) e a suspensão de validação (Nv) preparadas, o

teste propriamente dito pôde ser realizado.

Um mL da suspensão teste foi transferido para um tubo contendo 1 mL de

água purificada estéril. Após 2 minutos, 8 mL do produto teste foram adicionados ao

tubo. Após 10 minutos de contato e ação do produto, 1 mL da mistura foi transferida

para um tubo contendo 1 mL de água e 8 mL de solução neutralizante. Após 5

minutos de neutralização, 1 mL da mistura foi plaqueada em duplicata em meio TSA

51

adicionado do mesmo neutralizante. As placas foram incubadas por 24 h a 36 ± 1ºC

(Figura 8). Todo o procedimento foi realizado em banho de água a 20ºC.

Esse procedimento foi realizado para cada diluição do produto teste e

segundo o preconizado pelo método do CEN, cada produto teste deve ser testado

utilizando-se 3 concentrações diferentes: uma concentração acima da recomendada

pelo fabricante, a concentração recomendada pelo fabricante e uma concentração

abaixo da recomendada pelo fabricante. Esta última deve ser ineficaz em eliminar os

microrganismos nos testes. As duas concentrações extras são utilizadas apenas

como um controle do comportamento do produto nos testes, entretanto para fins de

cálculos do resultado é utilizada apenas a concentração recomendada pelo

fabricante. Para a avaliação do produto à base de álcool etílico, este foi utilizado

sem diluição (produto puro), a 70% (concentração de uso) e a 25% (concentração

abaixo da recomendada). Para o produto A, por ter recomendação de uso sem

diluição (produto puro), foram utilizadas somente 2 concentrações, o produto puro

(recomendação do fabricante) e diluído a 50%. Já para o produto B, foram utilizadas

as concentrações de 10% (concentração acima da recomendada), 5%

(concentração recomendada pelo fabricante) e 1% (concentração abaixo da

recomendada).

Em relação à solução neutralizante utilizada, foram testadas 4 soluções

neutralizantes, sendo elas compostas por polissorbato 80 (30 g/L) + lecitina (3 g/L);

polissorbato 80 (30 g/L) + lecitina (3 g/L) + dodecil sultado de sódio (4 g/L);

polissorbato 80 (30 g/L) + lecitina (3 g/L) + saponina (30 g/L); polissorbato 80 (30

g/L), lecitina (3 g/L), tiossulfato de sódio (5 g/L) e L-histidina (1 g/L). No caso do

produto álcool etílico 70%, a solução neutralizante foi substituída por água

purificada, uma vez que este princípio ativo não necessita de neutralização por não

possuir efeito residual.

52

Figura 8 - Esquema do teste de avaliação da atividade antimicrobiana de desinfetantes EN 1040

(EUROPEAN STANDARD 1040, 2005). N: suspensão teste

3.7.2.4 Controles

A metodologia preconiza a realização de 3 controles do teste: controle do

microrganismo (A), controle do microrganismo frente ao neutralizante (B) e controle

da neutralização (C).

Controle A:

Um mL da suspensão de validação foi transferida para um tubo contendo 1

mL de água. Após 2 minutos, 8 mL de água foram adicionados ao tubo. Após 10

53

minutos de contato, 1 mL da mistura foi plaqueada em duplicata em meio TSA. As

placas foram incubadas por 24 h a 36 ± 1ºC (Figura 9).

Figura 9 - Esquema do controle A do teste (EUROPEAN STANDARD 1040, 2005). Nv: suspensão de

validação

Controle B:

Um mL da suspensão de validação foi transferida para um tubo contendo 8

mL de solução neutralizante e 1 mL de água. Após 5 minutos de neutralização, 1 mL

da mistura foi plaqueada em duplicata em meio TSA. As placas foram incubadas por

24 h a 36 ± 1ºC (Figura 10).

54

Figura 10. Esquema do controle B do teste (EUROPENA STANDARD 1040, 2005). Nv: suspensão

de validação

Controle C:

Oito mL da concentração mais alta do produto teste utilizado no teste foram

transferidos para um tubo contendo 1 mL de água e 1 mL de solução diluente. Após

10 minutos de contato e ação do produto, 1 mL da mistura foi transferido para um

novo tubo contendo 8 mL de solução neutralizante. Após 5 minutos de neutralização,

foi adicionado 1 mL da suspensão de validação. Após 30 minutos, 1 mL da mistura

foi plaqueada em duplicata em meio TSA. As placas foram incubadas por 24 h a 36

± 1ºC (Figura 11).

55

Figura 11 - Esquema do controle C do teste (EUROPEAN STANDARD 1040, 2005). Nv: suspensão

de validação

Na prática, para a realização simultânea do procedimento de 3 concentrações

de produto teste e três controles, foi montado um esquema de encaixe dos tempos

de cada passo, demonstrado na Figura 12 (a e b).

56

Figura 12a - Esquema de realização do teste EN 1040 demonstrando passo a passo a realização dos

controles. Nv: suspensão de validação; A: controle A; B: controle B; C: controle C. Os números em

caixa vermelha indicam os tempos em minutos de cada etapa do teste

57

Figura 12b - Esquema de realização do teste EN 1040. N: suspensão teste; 1: concentração mais

alta do produto teste; 2: concentração do produto teste recomendada pelo fabricante; 3: concentração

mais baixa do produto teste. Os números em caixa vermelha indicam os tempos em minutos de cada

etapa do teste.

58

3.7.2.5 Leitura e avaliação dos resultados

A partir do crescimento nas placas com meio TSA, foi realizada a contagem

das UFC e cálculo em logaritmo da suspensão teste inicial (contagem das placas

referente às diluições 10-6 e 10-7) e da mistura final (contagem das placas referente

ao teste). Para o produto ser considerado satisfatório, deve ser capaz de reduzir a

população inicial em pelo menos 5 log.

Para o cálculo da suspensão inicial, foi utilizada a seguinte fórmula:

Onde,

C = é a soma das UFC contadas no plaqueamento da suspensão inicial

n1 = é o número de placas semeadas da diluição 10-6

n2 = é o número de placas semeadas da diluição 10-7

10-6 = é o fator de diluição correspondente a menor diluição

A faixa padronizada da suspensão inicial deve estar entre 1,5 x 108 e 5 x 108.

Para o cálculo da suspensão final (Na), após o contato com o produto

desinfetante, foi realizada a média aritmética da contagem de UFC das placas

semeadas. Esse valor encontrado foi multiplicado por 10, devido à adição de

neutralizante, o que dilui em 10 vezes a suspensão:

Onde,

c = é a soma das UFC contadas no plaqueamento da suspensão final

n = é o número de replicatas utilizadas

59

Para o cálculo da suspensão de validação (Nv), foi realizada a média

aritmética da contagem de UFC das placas semeadas. Esse valor encontrado foi

multiplicado por 10, devido à diluição 10-1 feita para a contagem em placa:

Onde,

c = é a soma das UFC contadas no plaqueamento da suspensão final

n = é o número de replicatas utilizadas

A faixa padronizada da suspensão de validação deve estar entre 3,0 x 102 e

1,6 x 103, equivalendo a uma contagem de 30-160 UFCs nas respectivas placas.

Para o cálculo dos controles A, B e C, foi realizada a média aritmética da

contagem de UFC das placas semeadas. Esses valores deveriam ficar maiores ou

iguais à metade do valor encontrado na suspensão de validação.

Para o cálculo do logaritmo da redução (logR), foi utilizado o log de N0, devido

a diluição de 10-1 da suspensão inicial (N):

Onde,

N0 = é o valor em logaritmo da suspensão inicial dividido por 10

Na = é o valor em logaritmo da suspensão final

60

3.7.3 Teste em Suspensão Quantitativo para Avaliação da Atividade Bactericida de

Desinfetantes Químicos e Antissépticos usados em Áreas Alimentícia, Industrial,

Doméstica e Institucional – Fase 2, Etapa 1 (EUROPEAN STANDARD 1276, 2009)

A partir do 2º repique, alçadas do microrganismo teste foram transferidas para

um tubo contendo 15 mL de solução diluente e 5 g de pérolas de vidro. Essa

suspensão foi agitada a 1.000 g por 3 minutos (5 minutos para P. aeruginosa). Para

ajustar a suspensão inicial (N), alíquotas de 3 mL foram retiradas e realizada a

leitura em espectrofotômetro para medir a DO, com comprimento de onda de 630

nm. Com a suspensão inicial ajustada, foi realizada uma diluição seriada de 10-1 a

10-7. As diluições 10-6 e 10-7 foram plaqueadas em meio TSA para a contagem da

suspensão inicial (Figura 7).

Para os controles, foi preparada uma suspensão de validação (Nv),

transferindo 2 mL da diluição 10-5 para um tubo contendo 6 mL de solução diluente

(proporção 1:3). Para a contagem em placa da suspensão de validação, foi realizada

uma diluição 10-1 (Figura 7).

Com a suspensão teste (N) e a suspensão de validação (Nv) preparadas, o

teste propriamente dito pôde ser realizado.

O procedimento da fase 2, etapa 1 é muito semelhante com a fase 1, a

diferença está na substituição de 1 mL de água por 1 mL de soroalbumina bovina

(BSA) 3% nos seguintes tubos: primeiro tubo do teste, tubo do controle A e primeiro

tubo do controle C. O BSA foi utilizado como substância interferente, simulando a

presença de matéria orgânica na ação do produto desinfetante. Com exceção dessa

substituição, todo o processo foi igual à fase 1, como já demonstrado nas Figuras 7,

8, 9, 10, 11 e 12. Os cálculos utilizados para a avaliação dos resultados são os

mesmos demonstrados para a fase 1.

Além disso, na fase 2, etapa 1, para os produtos A e B foi testada uma 5ª

solução neutralizante, composta por polissorbato 80 (36 g/L), lecitina (3,6 g/L),

tiossulfato de sódio (6 g/L) e L-histidina (1,2 g/L), representando um aumento de

20% na concentração desses componentes em relação a mesma solução utilizada

na fase 1.

61


Bactericida e/ou Fungicida de Desinfetantes Químicos usados em Áreas Alimentícia,

Industrial, Doméstica e Institucional – Fase 2, Etapa 2 (EUROPEAN STANDARD

13697, 2001)

3.7.4.1 Tratamento inicial dos carreadores de microrganismos

Como carreadores, foram utilizados discos de aço inox 304 com no mínimo

10,5% de cromo e máximo de 1,2% de carbono, com 2 cm de diâmetro, 1,5 mm de

espessura externa (borda) e 1 mm de espessura interna (EUROPEAN STANDARDS

10088, 2005).

Os discos de aço inox foram previamente tratados com 5% de Triton X-100

por 60 minutos, para a retirada de sujidades. Após esse período, os discos foram

lavados abundantemente em água corrente para a retirada do Triton.

Posteriormente, os discos foram tratados com isopropanol 70% (v/v) durante a noite.

No dia seguinte, os discos foram retirados da solução e secados assepticamente, e

estocados em tubos estéreis.

3.7.4.2 Preparação do inóculo inicial

A partir do 2º repique, alçadas do microrganismo teste foram transferidas para

um tubo contendo 15 mL de solução diluente e 5 g de pérolas de vidro. Essa

suspensão foi agitada a 1.000 g por 3 minutos (5 minutos para P. aeruginosa). Para

ajustar a suspensão inicial (N), alíquotas de 3 mL foram retiradas e realizada a

leitura em espectrofotômetro para medir a DO, com comprimento de onda de 630

nm. Com a suspensão inicial ajustada, foi realizada uma diluição seriada de 10-1 a

10-7. As diluições 10-6 e 10-7 foram plaqueadas em meio TSA para a contagem da

suspensão inicial (Figura 7).

62

3.7.4.3 Contaminação dos discos

Um mL da suspensão inicial foi adicionada a 1 mL de BSA 3% por 2 minutos.

Após esse tempo, 50 µL da mistura foram adicionados em cada disco, de forma a

cobrir toda a superfície. Os discos foram, então, incubados a 36 ± 1ºC por 40

minutos e, posteriormente, à temperatura ambiente por mais 20 minutos para

equilibrar a temperatura.

3.7.4.4 Teste propriamente dito

Aos discos contaminados e secos, foram adicionados 100 µL do produto teste

em três concentrações: a concentração recomendada pelo fabricante, uma

concentração acima da recomendada e uma concentração abaixo da recomendada.

Após 5 minutos de contato do produto com a superfície contaminada dos discos,

estes foram mergulhados em tubos de 4-5 cm de diâmetro, contendo 10 mL de

solução neutralizante e 5 g de pérolas de vidro. Após 5 minutos de neutralização, os

tubos foram agitados por 1 minuto a 150 g. Após esse processo, uma alíquota de 1

mL foi retirada, realizando diluições 10-1 e 10-2. Todos os tubos das diluições foram

plaqueados em duplicata em meio TSA, incubados a 36 ± 1ºC por 24 horas (Figura

13). O valor da contagem das placas do tratamento com o produto teste foi chamado

de Nd.

63

Figura 13 - Esquema representativo do teste da fase 2, etapa 2

3.7.4.5 Controle com água purificada

Este controle foi realizado de forma semelhante ao teste propriamente dito,

substituindo-se o produto teste por água. Ao final do processo, foram feitas diluições

até 10-6. As diluições de 10-3 a 10-6 foram plaqueadas em duplicata em meio TSA,

incubadas a 36 ± 1ºC por 24 horas (Figura 14). O valor da contagem das placas do

tratamento com o produto teste foi chamado de Nc.

64

Figura 14 - Esquema representativo do controle de água da fase 2, etapa 2

3.7.4.6 Controle do neutralizante

A um tubo contendo 10 mL de solução neutralizante e 5 g de pérolas de vidro,

foi adicionado 0,1 mL de água purificada estéril. Após 5 minutos, um disco

previamente contaminado foi adicionado ao tubo, e este foi agitado por 1 minuto a

150 g. Posteriormente, foram feitas diluições seriadas até 10-5, sendo as diluições

10-3 a 10-5 plaqueadas em duplicata em meio TSA (Figura 15). O valor da contagem

das placas do controle da neutralização foi chamado de NC.

65

Figura 15 - Esquema representativo do controle do neutralizante da fase 2, etapa 2

3.7.4.7 Teste de neutralização

A um tubo contendo 10 mL de solução neutralizante e 5 g de pérolas de vidro,

foi adicionado 0,1 mL do produto teste (foi utilizada a maior concentração do produto

usada no teste). Após 5 minutos, um disco previamente contaminado foi adicionado

ao tubo, e este foi agitado por 1 minuto a 150 g. Posteriormente, foram feitas

diluições seriadas até 10-5, sendo as diluições 10-3 a 10-5 plaqueadas em duplicata

em meio TSA (Figura 16). O valor da contagem das placas do controle da

neutralização foi chamado de NT.

66

Figura 16 - Esquema representativo do teste de neutralização da fase 2, etapa 2

3.7.4.8 Controle do desprendimento das células dos discos

Para confirmar que as células foram adequadamente desprendidas dos

discos durante a realização do teste e dos controles, os discos foram retirados dos

tubos contendo neutralizante e pérolas de vidro e lavados com 10 mL de água

purificada estéril. Após esse procedimento, os discos foram colocados, com a

superfície contaminada para cima, em placas contendo 10 mL de TSA solidificado. A

superfície contaminada foi, então, raspada com auxílio de ponteiras estéreis por 1

minuto, sendo posteriormente colocados mais 10 mL de TSA fundido. O valor da

contagem desse controle foi chamado de NTS.

67

3.7.4.9 Cálculos e avaliação dos resultados

Para o cálculo do valor da suspensão inicial (N), foi utilizada a seguinte

fórmula:

Onde,

x e x` = contagem de cada placa com TSA

d = maior diluição utilizada

Para o cálculo do resultado do teste (Nd), controle de água (Nc), controle da

neutralização (NC) e teste da neutralização (NT), foi utilizada a seguinte fórmula:

Onde,

a e a´ = contagem de cada placa com TSA

d = maior diluição utilizada

Para que o teste fosse considerado válido, as seguintes condições devem

ocorrer:

N – Nc não deve ser maior que 2 log10

N – NC não deve ser maior que 2 log10

NC – NT não deve ser maior que ± 0,3

NTS não deve apresentar contagem maior que 100 UFC/mL

Para que o produto teste seja considerado satisfatório, o valor de Nc – Nd

deve ser igual ou maior que 4 log.

68

4 RESULTADOS

4.1 IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS

Antes de serem analisados pelo VITEK 2, algumas características morfo-

tintoriais dos microrganismos foram observadas, como crescimento em meios de

cultura e morfologia (Tabela 5). Após o isolamento, os microrganismos foram

identificados pelo VITEK 2, com 99% de probabilidade de identidade, conforme

Tabela 6.

Tabela 5

Características observadas durante o isolamento e a cultura dos microrganismos oriundos da

cozinha, do banheiro e dos produtos contaminados.

Origem dos

Microrganismos Testes Resultados e Características

Isolado de domicílio

(cozinha)

Meio de cultura para isolamento Ágar cetrimide

Morfologia (Gram) Bacilos Grem-negativos

Técnica KOH Gram-negativo

Isolado de domicílio

(banheiro)

Meio de cultura para isolamento Ágar Mcconkey

Morfologia (Gram) Bacilos Gram-negativos


Produto C

Ágar Lowenstein-Jensen Colônias esbranquiçadas

Ágar cetrimide Crescimento em 48h

Ágar soja tríptica Colônias brilhantes, grandes e amareladas

Morfologia (Gram) Bastonetes, formam paliçada, arranjos

diversos


Produto D

Ágar Lowenstein-Jensen Colônias amarelo-esverdeadas

Ágar cetrimide Crescimento em 48h

Ágar soja tríptica Colônias brilhantes, pequenas e amareladas

Morfologia (Gram) Bastonetes, Gram lábil


Produto E

Ágar Lowenstein-Jensen Colônias esverdiadas

Ágar cetrimide Crescimento com mais de 48h (em torno de

5 dias)

Ágar soja tríptica Colônias transparentes e grandes

Morfologia (Gram) Bastonetes e coco-bacilos, Gram lábil


69

Tabela 6

Microrganismos identificados pelo VITEK 2.

Origem

Microrganismo

Isolado de domicílio (cozinha) Enterobacter cloacae

Isolado de domicílio (banheiro) Enterobacter cloacae

Produto C Serratia marcescens

Produto D Achromobacter xylosoxidans

Produto E Aeromonas salmonicida

4.2 ANÁLISE QUÍMICA DOS PRODUTOS DESINFETANTES

A avaliação do teor de princípio ativo presente nos produtos à base de

quaternários de amônio utilizados nesse estudo foi realizada de acordo com o POP

INCQS nº 65.3110.014 (INSTITUTO NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE

EM SAÚDE, 2011) e está mostrada na Tabela 7. Com exceção do produto A, todos

apresentaram teor do princípio ativo acima do declarado pelo fabricante, sendo

considerados insatisfatórios.

4.3 TESTES REALIZADOS PARA A AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTIMICROBIANA

Para cada um dos três produtos (álcool etílico 70%, produto A e produto B)

utilizados no trabalho, foram realizadas metodologias da AOAC e do CEN, de acordo

com os microrganismos preconizados, conforme mostrado na Tabela 3.

70

Para o método da DU, os testes só foram repetidos no caso de resultado

insatisfatório. Para a metodologia do CEN, cada teste foi realizado pelo menos duas

vezes, quando os resultados foram coincidentes.

Tabela 7

Avaliação do teor de princípio ativo dos produtos A, B, C, D e E. Todos os produtos eram à base de

quaternários de amônio.

4.4 AVALIAÇÃO DOS DESINFETANTES PELO MÉTODO DA DILUIÇÃO DE USO

Para exemplificar os resultados obtidos em cada teste descrito abaixo, um

formulário de registro da avaliação da atividade antimicrobiana de um teste

encontra-se no Apêndice A.

Produtos

Teor

(% do declarado)

Faixa de

Aprovação

(% do declarado)

Resultado

Produto A

102%

± 15%

Satisfatório

Produto B

210%

± 15%

Insatisfatório

Produto C

124%

± 15%

Insatisfatório

Produto D

120%

± 15%

Insatisfatório

Produto E

168%

± 15%

Insatisfatório

71

4.4.1 Álcool etílico 70%

Pelo método da DU, o produto álcool etílico 70% foi considerado satisfatório

frente a todos os microrganismos utilizados (Tabela 8). Todos os controles utilizados

apresentaram-se dentro dos padrões desejados.

Tabela 8

Avaliação da atividade antimicrobiana do álcool etílico 70% pelo método da Diluição de Uso.

Microrganismos

Total de

Carreadores

Positivos

Controles

Resultado

Teste Esterilidade Fertilidade

S. aureus 1 C C S

S. choleraesuis 0 C C S

Enterobacter cloacae

(Isolado da cozinha) 0 C C S


(Isolado do banheiro) 0 C C S

C = conforme; S = satisfatório

4.4.2 Produto A

Pelo método da DU, o produto A foi considerado satisfatório frente a todos os

microrganismos utilizados (Tabela 9). Todos os controles utilizados apresentaram-se

dentro dos padrões desejados.

72

Tabela 9

Avaliação da atividade antimicrobiana do produto A pelo método da Diluição de Uso.

Microrganismos

Total de

Carreadores

Positivos

Controles Resultado

Teste Esterilidade Fertilidade

S. aureus 0 C C S

S. choleraesius 0 C C S






4.4.3 Produto B

Pelo método da DU, o produto B foi considerado satisfatório frente a S.

choleraesius, Enterobacter cloacae (isolados da cozinha e do banheiro). Entretanto,

frente a S. aureus, o produto foi considerado insatisfatório, devido ao crescimento

em mais de 1 carreador em 2 dos 3 testes realizados (Tabela 10). Todos os

controles utilizados apresentaram-se dentro dos padrões desejados.

73

Tabela 10

Avaliação da atividade antimicrobiana do produto B pelo método da Diluição de Uso.

Microrganismos

Total de

Carreadores

Positivos

Controles Resultado

Testes Esterilidade Fertilidade

S. aureus

13 C C I

0 C C S

2 C C I

S. choleraesius 0 C C S





C = conforme; S = satisfatório; I = insatisfatório

4.5 METODOLOGIAS DO COMITÊ EUROPEU DE NORMALIZAÇÃO

4.5.1 Padronização inicial do inóculo

A faixa para as contagens do inóculo foi alcançada com as suspensões

apresentando leitura de DO entre 0,150 a 0,200 para todos os microrganismos

utilizados nos testes, com exceção de S. aureus que foi de 0,200 a 0,300. Esses

valores foram determinados pela observação da contagem obtida em cada valor de

DO analisado. A faixa de leitura foi determinada pela observação dos valores de DO

obtidos pela contagem de UFC/mL obtidos na etapa de padronização inicial do

inóculo (Figuras 17 a 22), em associação com os dados obtidos posteriormente em

cada teste realizado (Apêndice B e C). Todas as leituras de DO foram feitas no

comprimento de onda de 630 nm.

74

Figura 17 - Padronização do inóculo de S. aureus através da correlação da densidade ótica e da

contagem das unidades formadoras de colônia.

Figura 18 - Padronização do inóculo de P. aeruginosa através da correlação da densidade ótica e da


75

Figura 19 - Padronização do inóculo de E. coli através da correlação da densidade ótica e da


Figura 20 - Padronização do inóculo de E. hirae através da correlação da densidade ótica e da


76

Figura 21 - Padronização do inóculo de E. cloacae (cozinha) através da correlação da densidade

ótica e da contagem das unidades formadoras de colônia

Figura 22 - Padronização do inóculo de E. cloacae (banheiro) através da correlação da densidade

ótica e da contagem das unidades formadoras de colônia.

77


Básica de Desinfetantes Químicos e Antissépticos – Fase 1 (EN 1040)

Para registrar os resultados dos testes, foi elaborado um formulário para

organizar os dados, conforme mostrado na Figura 23. Um exemplo do

preenchimento deste formulário encontra-se no Apêndice B.

Para a realização da etapa de neutralização dos produtos à base de

quaternários de amônio, foram testadas primeiramente 3 soluções neutralizantes

(polissorbato 80 (30 g/L) + lecitina (3 g/L); polissorbato 80 (30 g/L) + lecitina (3 g/L) +

SDS (4 g/L); e polissorbato 80 (30 g/L) + lecitina (3 g/L) + saponina (30 g/L)), as

quais não apresentaram resultado satisfatório na neutralização desses produtos,

uma vez que o controle de neutralização (controle C) não se apresentou dentro do

padrão necessário. Assim, um quarto neutralizante, composto por polissorbato 80

(30 g/L), lecitina (3 g/L), tiossulfato de sódio (5 g/L) e L-histidina (1 g/L) foi testado,

sendo observada a neutralização adequada desses produtos (Tabela 11).

Tabela 11

Soluções neutralizantes testadas e seus respectivos resultados para a fase 1 da metodologia

preconizada pelo CEN.

Soluções Neutralizantes

Resultado

Controle C

Limites Conclusão

Polissorbato 80 (30 g/L) + Lecitina

(3 g/L)

< 0,5 x Nv

≥ 0,5 x Nv

NC


(3 g/L) + SDS (4 g/L) < 0,5 x Nv ≥ 0,5 x Nv NC


(3 g/L) + Saponina (30 g/L) < 0,5 x Nv ≥ 0,5 x Nv NC

Polissorbato 80 (30 g/L), Lecitina

(3 g/L), Tiossulfato de sódio (5

g/L) e L-histidina (1 g/L)

≥ 0,5 x Nv ≥ 0,5 x Nv C

Nv = Suspensão microbiana inicial de validação; C = conforme; NC = não conforme

78

Figura 23 - Formulário de registro dos resultados dos testes preconizados pelo CEN. Vc: contagem

de UFC das placas; Na: número de UFC após realização do teste; logR: redução de log (log No – log

Na).

4.5.2.1 Álcool etílico 70%

Pelo método EN 1040 do CEN, o álcool etílico 70% foi considerado

satisfatório frente a todos os microrganismos utilizados (Tabela 12). A concentração

acima do recomendado (produto puro, a 100%) também foi capaz de reduzir 5 logs

da suspensão microbiana inicial. Já a concentração abaixo da recomendada (álcool

etílico a 25%) não foi capaz de reduzir 5 logs da suspensão microbiana inicial, sendo

com isso a concentração ideal para observar a ausência de atividade antimicrobiana

(Tabela 13)

79

Tabela 12

Avaliação da atividade antimicrobiana do álcool etílico 70% pelo método EN 1040 do CEN (Fase 1).

Microrganismos

Controles

Redução do n°

de log Resultado

A

B C

S. aureus

C

C

C

> 5,34 log

S

P. aeruginosa C C C > 5,36 log S

E. coli C C C > 5,32 log S

E. hirae C C C > 5,2 log S


(Isolado da cozinha) C C C > 5,27 log S


(Isolado do banheiro) C C C > 5,36 log S


Tabela 13

Atividade antimicrobiana do álcool etílico avaliada pela Fase 1 da metodologia do CEN, especificando

todas as concentrações utilizadas. Os valores mostrados representam a redução de log em relação à

suspensão microbiana inicial.

Microrganismos

Concentrações do produto

Produto Puro

70% 25%

S. aureus

> 5,34 log

> 5,34 log

< 3,97 log

P. aeruginosa > 5,36 log > 5,36 log < 3,78 log

E. coli > 5,32 log > 5,32 log < 3,95 log

E. hirae > 5,2 log > 5,2 log < 3,83 log


(Isolado da cozinha) > 5,27 log > 5,27 log < 3,9 log


(Isolado do banheiro) > 5,36 log > 5,36 log < 3,99 log

80

4.5.2.2 Produto A

Pelo método EN 1040 do CEN, o produto A foi considerado satisfatório frente

a todos os microrganismos utilizados (Tabela 14). Tanto a concentração

recomendada pelo fabricante (produto puro) como a concentração mais baixa (50%)

apresentaram atividade antimicrobiana, sendo capazes de reduzir em 5 log o

crescimento da suspensão microbiana inicial (Tabela 14). Assim, não foi possível

observar a concentração onde não há atividade antimicrobiana.

Tabela 14

Avaliação da atividade antimicrobiana do produto A pelo método EN 1040 do CEN (Fase1). Os resultados

apresentados representam as 2 concentrações do produto utilizadas nos testes.

Microrganismo

Controles

Redução do n°

de log Resultado

A

B

C

S. aureus

C

C

C

> 5,23 log

S









81

4.5.2.3 Produto B

Pelo método EN 1040 do CEN, o produto B foi considerado satisfatório frente

a todos os microrganismos utilizados (Tabela 15). As três concentrações do produto

utilizadas nos testes (10%, 5%, 1%) apresentaram atividade antimicrobiana, com

redução de 5 log do crescimento da suspensão microbiana inicial, não sendo

possível observar a concentração onde não é mais observada atividade

antimicrobiana (Tabela 15).

Tabela 15

Avaliação da atividade antimicrobiana do produto B pelo método EN 1040 do CEN (Fase1). Os

resultados apresentados representam as 3 concentrações do produto utilizadas nos testes.

Microrganismos

Controles

Redução do n°

de log Resultado

A

B C

S. aureus

C

C

C

> 5,23 log

S









82


Básica de Desinfetantes Químicos e Antissépticos usados em Áreas Alimentícia,

Industrial, Doméstica e Institucional – Fase 2, Etapa 1 (EN 1276)

Para registrar os resultados dos testes, foi utilizado o mesmo formulário para

organizar os dados, conforme mostrado na Figura 23. Um exemplo de formulário

preenchido encontra-se no Apêndice C.

Com a adição de BSA 3% como substância interferente no teste, a solução

neutralizante utilizada na fase 1 da metodologia deixou de apresentar eficácia na

neutralização dos produtos à base de quaternários de amônio frente somente a S.

aureus. Assim, frente a esse microrganismo, foi utilizada uma solução neutralizante

de igual composição, porém 20% mais concentrada (polissorbato 80 (36 g/L), lecitina

(3,6 g/L), tiossulfato de sódio (6 g/L) e L-histidina (1,2 g/L)).

4.5.3.1 Álcool etílico 70%

Pelo método EN 1276 do CEN, o álcool etílico 70% foi considerado

satisfatório frente a todos os microrganismos utilizados (Tabela 16). A concentração

acima do recomendado (produto puro, a 100%) também foi capaz de reduzir 5 logs

da suspensão microbiana inicial. Já a concentração abaixo da recomendada (álcool

etílico a 25%) não foi capaz de reduzir 5 logs da suspensão microbiana inicial, sendo

com isso a concentração ideal para observar a ausência de atividade antimicrobiana

(Tabela 17)

83

Tabela 16

Avaliação da atividade antimicrobiana do álcool etílico 70% pelo método EN 1276 do CEN (Fase 2,

Etapa 1).

Microrganismo

Controles

Redução do n°

de log Resultado

A

B C

S. aureus

C

C

C

> 5,22 log

S







(Isolado do banheiro) C C C > 5,426log S


Tabela 17

Atividade antimicrobiana do álcool etílico avaliada pela fase 2, etapa 1 do método EN 1276 do CEN,

especificando todas as concentrações utilizadas. Os valores mostrados representam a redução de log

em relação à suspensão microbiana inicial.

Microrganismos


Produto Puro

70% 25%

S. aureus

> 5,22 log

> 5,22 log

< 3,85 log

P. aeruginosa > 5,24 log > 5,24 log < 3,87 log

E. coli > 5,3 log > 5,3 log < 3,93 log

E. hirae > 5,19 log > 5,19 log < 3,82 log


(Isolado da cozinha) > 5,28 log > 5,28 log < 3,91 log


(Isolado do banheiro) > 5,26 log > 5,26 log < 3,89 log

84

4.5.3.2 Produto A

Pelo método EN 1276 do CEN, o produto A foi considerado satisfatório frente

a todos os microrganismos utilizados, com exceção de S. aureus cujo teste não

apresentou um bom resultado para o controle da neutralização (controle C) (Tabela

18). Para os demais microrganismos, tanto a concentração recomendada pelo

fabricante (produto puro) como a concentração mais baixa (50%) apresentaram

atividade antimicrobiana, sendo capazes de reduzir em 5 log o crescimento da

suspensão microbiana inicial (Tabela 19). Assim, não foi possível observar a

concentração onde não é observada atividade antimicrobiana.

Com a utilização da solução neutralizante 20% mais concentrada, o produto A

continuou não sendo adequadamente neutralizado (Tabela 22), serão necessários

estudos adicionais com outras soluções neutralizantes para que o controle de

neutralização (controle C) fique dentro do padrão exigido pela norma e o teste possa

ser considerado válido.

Tabela 18

Avaliação da atividade antimicrobiana do produto A pelo método EN 1276 do CEN (Fase 2, Etapa1).

Microrganismos

Controles

Redução do n°

de log Resultado

A

B C

S. aureus C C NC Indeterminado Controle C não

conforme









85

Tabela 19

Atividade antimicrobiana do produto A avaliada pela fase 2, etapa 1 pelo método EN 1276 do CEN,

especificando todas as concentrações utilizadas. Os valores mostrados representam a redução de log

em relação à suspensão microbiana inicial.

Microrganismos


Produto Puro

50%

S. aureus Não foi possível neutralizar o produto frente a S. aureus com as

soluções utilizadas nesse trabalho

P. aeruginosa > 5,39 log > 5,39 log

E. coli > 5,41 log > 5,41 log

E. hirae > 5,36 log > 5,36 log


(Isolado da cozinha) > 5,41 log > 5,41 log


(Isolado do banheiro) > 5,4 log > 5,4 log

4.5.3.3 Produto B

Pelo método EN 1276 do CEN, o produto B foi considerado satisfatório frente

a P. aeruginosa, E. coli, E. hirae e E. cloacae (Tabela 20). As três concentrações do

produto utilizadas nos testes (10%, 5%, 1%) apresentaram atividade antimicrobiana,

com redução de 5 log do crescimento da suspensão microbiana inicial, não sendo

possível observar a concentração onde não é mais observada atividade

antimicrobiana (Tabela 20).

Nos testes iniciais ocorreram problemas de neutralização frente a S. aureus.

Com o objetivo de obter um bom resultado da neutralização, foi utilizada uma

solução neutralizante 20% mais concentrada em relação a todos os componentes

para a realização dos testes com o produto B nessa fase. Com essa nova solução

neutralizante, foi possível observar a adequada neutralização do produto B frente a

S. aureus (Tabela 20).

86

Tabela 20

Avaliação da atividade antimicrobiana do produto B pelo método EN 1276 do CEN (Fase 2, Etapa 1).

Os resultados apresentados representam as 3 concentrações do produto utilizada nos testes.

Microrganismos

Controles

Redução do n°

de log Resultado

A

B C

S. aureus

C

C

C

> 5,33 log

S





(Isolado Cozinha) C C C > 5,41 log S


(Isolado Banheiro) C C C > 5,4 log S



Bactericida e/ou Fungicida de Desinfetantes Químicos usados em Áreas Alimentícia,

Industrial, Doméstica e Institucional – Fase 2, Etapa 2 (EN 13697)

A fase 2, etapa 2 da metodologia preconizada pelo CEN, é realizada em

superfície através da utilização de discos de aço inox. Esses carreadores de acordo

com as especificações exigidas pelo teste não estão disponíveis para venda no

Brasil. Assim, foram realizados diversos contatos com um fornecedor europeu, sem

sucesso de comunicação para a obtenção do material. Dessa forma, após uma

busca intensa pelo mercado brasileiro, foi encontrada uma empresa metalúrgica que

se propôs a confeccionar os discos. Todavia, o material somente pôde ser adquirido

em fevereiro de 2012, não restando tempo viável para a realização integral do teste

em superfície.

87

Portanto, foram realizados somente os passos iniciais da fase 2, etapa 2,

envolvendo apenas o controle de água dessa metodologia, frente a bactéria E. coli,

visando a padronização do tempo de secagem dos discos após a contaminação com

a suspensão bacteriana inicial, e do método de desprendimento das bactérias

aderidas aos discos.

Em relação ao tempo de secagem das bactérias nos discos, é preconizado na

norma (EN 13697) que este não deve ultrapassar 60 minutos, uma vez que períodos

superiores a este podem alterar a viabilidade da bactéria. Entretanto, foi observado

que os 0,05 mL da suspensão inicial que foram adicionados à superfície dos discos

não secaram até o tempo limite de 60 minutos, quando incubados a 36 ± 1ºC. Por

isso, foram testados outros tempos e condições para a padronização dessa etapa.

Assim, foi estabelecida a condição de secagem utilizando-se 40 minutos de

incubação dos discos a 36 ± 1ºC, seguido de 20 minutos a temperatura ambiente (os

discos foram deixados esse tempo no interior do fluxo laminar, com a tampa da

placa de Petri aberta), permitindo a secagem dos mesmos.

Em relação ao desprendimento das bactérias presentes nos discos, a norma

(EN 13697) estabelece agitação por 1 minuto a 150 g do tubo contendo o disco, em

solução neutralizante e pérolas de vidro. Entretanto, foi observado que nessas

condições não há o desprendimento adequado das bactérias, uma vez que o

controle do desprendimento (NTS) apresentou resultados insatisfatórios, assim

como o controle de água se apresentou abaixo do valor satisfatório (Tabela 21).

Tabela 21

Teste preliminar da fase 2, etapa 2 usando-se E. coli, nas condições estabelecidas pela norma EN

13697 do CEN.

Parâmetros e Controles

Teste

Limites Resultado

Suspensão inicial (N)

3,49 x 108

1,5 x 108 a 5 x 10

8

C

Controle de água (Nc) 8,5 x 106 ≥ 10

6 C

N – Nc (em escala logarítmica) 8,54 – 6,93 = 1,61 ≤ 2 log C

NTS > 100 UFC ≤ 100 UFC/mL NC

C = conforme; NC = não conforme; N = suspensão microbiana inicial; Nc = controle de água; NTS = controle do

desprendimento das células dos discos.

88

Devido ao resultado insatisfatório do desprendimento das bactérias presentes

nos discos e nas condições estabelecidas pela norma (EN 13697), foi adicionada

uma etapa adicional de sonicação ao teste. A sonicação foi realizada por 1, 5 e 10

minutos, seguida de agitação por 1 minuto a 1.000 g. Entretanto, novamente não

houve o desprendimento adequado das bactérias, uma vez que o controle do

desprendimento (NTS) apresentou resultados insatisfatórios, assim como o controle

de água se apresentou abaixo do valor satisfatório (Tabela 22).

Tabela 22

Teste preliminar da fase 2, etapa 2 usando-se E. coli, com adição da etapa de sonicação ao

procedimento estabelecido pela norma EN 13697 do CEN.



Parâmetros e

Controles

Tempos de sonicação

Limites Resultado

1 min

5 min 10 min

Suspensão

inicial (N)

3,36 x 108 3,36 x 10

8 3,36 x 10

8

1,5 x 108 a

5 x 108

C

Controle de

água (Nc)

6,8 x 105 6,75 x 10

5 3,4 x 10

5 ≥ 10

6 NC

N – Nc

8,53 – 5,83 =

2,7

8,53 – 5,83 =

2,7

8,53 – 5,53 =

3,0 ≤ 2 log NC

NTS

> 100 UFC

> 100 UFC

> 100 UFC

≤ 100

UFC/mL

NC

89

Devido ao resultado insatisfatório do desprendimento das bactérias presentes

nos discos também pela adição da etapa de sonicação, foram utilizadas 2 soluções

neutralizantes alternativas, a solução neutralizante 20% mais concentrada (utilizada

também no item 4.5.3.1) e o caldo Letheen. Da mesma forma que nos testes das

condições anteriores, não houve o desprendimento adequado das bactérias, uma

vez que o controle do desprendimento (NTS) apresentou resultados insatisfatórios,

assim como o controle de água se apresentou abaixo do valor satisfatório (Tabela

23).

Tabela 23

Teste preliminar da fase 2, etapa 2, com adição de solução neutralizante 20% mais concentrada e

caldo Letheen como alternativas ao desprendimento das bactérias dos discos.



Parâmetros e

Controles

Neutralizantes

Limites Resultado

Solução 20%

concentrada

Caldo

Letheen

Suspensão inicial

(N)

3,54 x 108

3,54 x 108

1,5 x 108 a 5 x 10

8

C

Controle de água

(Nc)

2,95 x 105

9,35 x 105

≥ 106 NC

N – Nc

8,55 – 5,47 = 3,08

8,55 – 5,97 =

2,58

≤ 2 log NC

NTS

> 100 UFC

> 100 UFC ≤ 100 UFC/mL NC

90

5 DISCUSSÃO

Os microrganismos são encontrados em diversas superfícies inanimadas,

tanto no ambiente domiciliar, em pias, toalhas, maçanetas (OJIMA et al., 2002a),

como no ambiente público, em ônibus, corrimão de escadas e telefones públicos

(REYNOLDS et al., 2005). Esses fômites possuem um grande potencial de

transmissão de patógenos, podendo causar uma série de doenças que podem ser

adquiridas no ambiente (BOONE; GERBA, 2007). Assim, a utilização de produtos

desinfetantes com o objetivo de eliminar os microrganismos de superfícies e

minimizar a incidência de doenças transmissíveis é de grande relevância para a

saúde pública. Entretanto, relatos da literatura demonstram que esses produtos

podem apresentar contaminação por bactérias que possuam maior tolerância aos

componentes do produto (MIYAGI; TIMENETSKY; ALTERTHUM, 2000).

No início desse trabalho, foram adquiridos três desinfetantes de uso geral à

base de quaternários de amônio que apresentaram contaminação bacteriana

(produtos C, D e E), evidenciando que a contaminação desses produtos, relatados

na literatura desde a década de 1970, continua a ocorrer nos dias de hoje (FRANK;

SCHAFFNER, 1976, OIE; KAMIYA, 1996, MIYAGI; TIMENETSKY; ALTERTHUM,

2000).

A identificação das bactérias contaminantes pelo equipamento VITEK 2

revelou a presença de Serratia marcescens, Achromobacter xylosoxidans e

Aeromonas salmonicida, respectivamente nos produtos C, D e E. A presença dessas

bactérias como contaminantes de produtos desinfetantes já foi descrita na literatura

anteriormente. Nakashima, Highsmith e Martone (1987) relataram a presença de

Serratia marcescens em algodão embebido numa solução de quaternários de

amônio, enquanto Ehrenkranz e colaboradores (1980) relataram a contaminação por

Serratia marcescens em borrifadores utilizados em hospitais, onde são colocados

desinfetantes à base de quaternários de amônio, levando à ocorrência de infecções

hospitalares por essa espécie.

Em relação a Aeromonas salmonicida, não há relatos na literatura associando

a contaminação de desinfetantes a essa bactéria. Porém, outras espécies do gênero

Aeromonas já foram isoladas de amostras de pacientes com quadro diarreico

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ehrenkranz%20NJ%22%5BAuthor%5D

91

(PABLOS et al, 2011), de alimentos e de água potável (OTTAVIANI et al., 2011).

Nesse mesmo trabalho, a espécie Aeromonas salmonicida foi encontrada em

amostras de água e em alimentos como peixes e salmão, o que indica que a

contaminação do produto desinfetante pode ter origem na fonte de água utilizada na

fabricação do produto.

A espécie Achromobacter xylosoxidans já foi encontrada como contaminante

de soluções de clorexidina em um hospital na Espanha, causando várias infecções

em pacientes de todas as faixas etárias (MOLINA-CABRILLANA et al., 2007). Como

a fonte natural dessa bactéria também foi a água, é possível que a contaminação

por Achromobacter xylosoxidans também tenha origem na água utilizada no

processo de fabricação do desinfetante.

A análise química desses produtos indicou que todos estão insatisfatórios em

relação ao teor de princípio ativo, apresentando valores acima do declarado pelos

fabricantes. Mesmo nessas condições, os microrganismos encontrados foram

capazes de se estabelecerem nessas formulações, evidenciando o caráter tolerante

dessas bactérias. Apesar de não se conhecer o mecanismo exato de tolerância

dessas bactérias aos compostos de quaternários de amônio, supõe-se que ocorra

uma regulação metabólica induzida pela presença do biocida, principalmente na

membrana externa das células (MIYAGI; TIMENETSKY; ALTERTHUM, 2000). Em S.

marcescens resistente à clorexidina, por exemplo, foi constatada a presença de

material polissacarídico formando uma matriz fibrosa que protegeria a célula

bacteriana (MARRIE; COSTERTON, 1981).

Com esses dados, é possível perceber a importância das indústrias

possuírem processos de fabricação adequados e um rigoroso controle da qualidade

de seus produtos, minimizando ao máximo possíveis erros, pois do contrário o

produto final pode conter uma formulação com desvio de qualidade, gerando risco a

saúde do consumidor. Dessa forma, a avaliação da atividade antimicrobiana dos

produtos desinfetantes é essencial para que os produtos comercializados tenham a

sua qualidade garantida.

Para avaliação em paralelo das metodologias da AOAC e do CEN frente a

microrganismos de referência preconizados pelas normas, mas principalmente

daqueles oriundos de ambiente domiciliar, foram escolhidos três produtos, o álcool

etílico 70 % e 2 produtos à base de compostos quaternários de amônio. O álcool

92

etílico 70% foi escolhido devido à sua eficácia amplamente conhecida como

desinfetante e antisséptico (RUTALA, 1996). De fato, em todos os testes realizados,

tanto pela metodologia preconizada pela AOAC como pelo método do CEN, este

produto apresentou resultados satisfatórios para todos os microrganismos testados,

comprovando sua eficácia como desinfetante em metodologias quantitativas e

qualitativas, em suspensão ou em superfície (Apêndice D).

Já os produtos à base de quaternários de amônio foram escolhidos, pois

atualmente no mercado brasileiro existem diversos desinfetantes de uso geral

formulados com esse princípio ativo. Observando os resultados encontrados para

avaliação da atividade antimicrobiana e para o teor de princípio ativo, percebeu-se

um comportamento diferente entre os produtos A e B. Enquanto o produto A

apresentou uma formulação adequada quimicamente e se mostrou eficaz em todos

os testes realizados, o produto B apresentou uma formulação insatisfatória

quimicamente, pois o produto estava com teor do princípio ativo duas vezes maior

do que o declarado, mesmo assim se mostrou ineficaz contra S. aureus pelo método

da DU. Esses resultados sugerem a influência que uma formulação inadequada do

produto pode exercer sobre a atividade antimicrobiana, mesmo que o teor do

princípio ativo esteja duas vezes acima do declarado. A formulação

inadequadamente de um produto pode levar a resultados insatisfatórios nos testes

de avaliação da atividade antimicrobiana, e consequentemente não ser capaz de

promover a desinfecção corretamente de uma superfície, gerando risco à saúde da

população.

O método da DU se mostrou um método muito adequado para a avaliação da

atividade antimicrobiana do álcool etílico 70% e do produto A. Entretanto, em relação

ao produto B, os testes não apresentaram repetibilidade adequada quando foi

utilizado o microrganismo de referência S. aureus (Apêndice D). Esses resultados

mostram a dificuldade dessa metodologia em relação a repetitividade (ARLEA et al.,

2008), uma vez que a comprovação da atividade antimicrobiana do produto só foi

observada em um dos três testes. Essa variabilidade nos resultados pode ser

causada pela falta de padronização do número de células microbianas nos cilindros.

Por isso, na última revisão das normas da AOAC e consequentemente no POP da

DU do INCQS, foi adicionada uma etapa de contagem das bactérias viáveis nos

cilindros, como um controle adicional do teste de acordo com as recomendações da

93

AOAC. Nessa etapa, um cilindro contaminado e seco e escolhido aleatoriamente e

adicionado a um tubo contendo caldo Letheen. Esse tubo com o cilindro é colocado

em ultrassom para sonicação e, após agitação, alíquotas são retiradas, diluídas e

plaqueadas para a contagem das células viáveis (TOMASINO, 2010; INSTITUTO

NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE, 2011). Essa etapa

confere maior segurança em relação à quantidade do microrganismo envolvido em

cada teste, estabelecendo limites para o inóculo inicial. Dessa forma, é possível

minimizar o problema da falta de reprodutibilidade como observado nos resultados

desse trabalho.

A metodologia preconizada pelo CEN sugere leituras de DO entre 0,150 e

0,460 para o inóculo inicial utilizado nos testes. Entretanto, os resultados

encontrados nesse trabalho para a padronização do inóculo inicial não corroboram

com a norma europeia, uma vez que a faixa sugerida foi de 0,150 a 0,200 para todos

os microrganismos utilizados, menos para S. aureus cuja faixa de DO foi sugerida

entre 0,200 e 0,300. Na prática, valores acima de 0,200 (0,300 para S. aureus)

muitas vezes ficavam acima da faixa de UFC/mL estabelecida na norma. Foi

observado também que a associação entre DO e UFC/mL apresenta variação de um

teste para outro, devido à manipulação durante a realização de cada teste. Alguns

testes apresentaram o inóculo inicial fora do padrão, mesmo com a DO dentro da

faixa padronizada. Isso se deve a erros na manipulação no decorrer do preparo do

inóculo, como o ajuste da DO, pipetagem e tempo que o tubo fica em repouso

durante esses procedimentos. Porém nesses casos, foi possível considerar os testes

válidos, uma vez que os produtos foram capazes de comprovar sua atividade

antimicrobiana mesmo com a suspensão inicial do microrganismo acima da faixa

estabelecida. Da mesma forma, a alteração das condições de cada laboratório pode

variar esses valores, sendo fundamental que cada laboratório realize a padronização

da suspensão inicial de cada microrganismo utilizado.

A neutralização é uma etapa de grande importância em qualquer método para

avaliação de eficácia (RUSSEL, 1981). Uma neutralização inadequada permite que

o produto possa agir por um tempo maior que o recomendado, podendo gerar

resultados falso-positivos. Por isso, diferentes soluções neutralizantes foram

testadas até que fosse encontrado um neutralizante capaz de neutralizar

corretamente os produtos utilizados. Os resultados mostraram que a solução

94

neutralizante pode ser afetada pela adição do BSA 3% no teste, uma vez que o

neutralizante utilizado na fase 1 do método não foi eficaz para todos os

microrganismos nos testes da fase 2, etapa 1, sendo necessária a utilização de uma

solução neutralizante 20% mais concentrada que foi eficaz apenas para o produto B.

Para o produto A, é necessário testar outros neutralizantes. Esses resultados

indicam que a escolha de uma solução neutralizante adequada para cada produto é

uma etapa essencial para que os testes sejam satisfatórios, uma vez que a falha no

controle da neutralização inviabiliza todo o teste. A falha na neutralização observada

na fase 2, etapa 1 ocorreu apenas para S. aureus, indicando que a neutralização

dos produtos não ocorreu completamente, restando algum resíduo do produto que

pode estar afetando o crescimento dessa bactéria. Esses resultados não corroboram

alguns estudos encontrados na literatura, que mostram a presença de genes em S.

aureus que conferem tolerância dessa bactéria a várias drogas, inclusive aos

quaternários de amônio (NAKAMINAMI et al., 2007). Esses resultados sugerem que

a escolha da solução neutralizante mais adequada precisa levar em consideração

não apenas o produto a ser testado, mas também o microrganismo envolvido, de

forma a não deixar nenhum resíduo que possa interferir no crescimento microbiano e

inviabilizar o teste.

Enquanto o álcool etílico se mostrou sem atividade antimicrobiana na

concentração mais baixa utilizada (25%), o mesmo não foi observado para os

produtos A e B, para os quais todas as concentrações utilizadas foram capazes de

reduzir 5 log do crescimento da suspensão microbiana inicial. Para se alcançar a

concentração onde não é observada atividade antimicrobiana, será necessário

realizar outros testes posteriormente. Dessa forma, a escolha da menor

concentração, com a qual o microrganismo não é eliminado, depende de cada

produto, sendo necessária uma avaliação preliminar para a definição dessa

concentração (JAYAPRAKASH; SHARMA; MOSES, 2010).

Nos testes preliminares da fase 2, etapa 2 foram realizados dois passos

essenciais para a metodologia. Primeiramente, a contaminação dos discos com as

bactérias preconizadas, etapa de grande importância, onde, segundo a norma (EN

13697) a padronização da etapa visa impedir a perda da viabilidade das células

bacterianas, a qual pode ser afetada com a incubação dos discos contaminados por

mais de 60 minutos, isso pode interferir diretamente nos problemas de falta de

95

reprodutibilidade dos testes. Outro ponto crucial da metodologia é o desprendimento

das células aderidas aos discos após o contato com o produto ou com água

(controle de água). Os resultados encontrados não permitiram a padronização dessa

etapa, uma vez que os procedimentos estabelecidos pela norma, e mesmo alguns

procedimentos alternativos, não foram capazes de desprender as células dos discos.

Assim, é possível perceber a dificuldade e a importância da adequada padronização

desse ponto da metodologia, de forma a avaliar corretamente a contagem de UFC

em placas e avaliar a presença de células viáveis após o contato com o produto

desinfetante.

Portanto, a metodologia do CEN apresentou etapas em suspensão de fácil

realização. O estoque e preparação dos microrganismos para os testes também

foram etapas que se mostraram bastantes práticas na rotina do laboratório. A etapa

em superfície se mostrou mais trabalhosa, principalmente em relação a manipulação

dos discos carreadores. Entretanto, como são requeridas pela norma a utilização de

4 microrganismos de referência, 3 concentrações do produto teste e pelo menos 6

repetições de cada ensaio, a utilização dessa metodologia em avaliações oficiais de

atividade antimicrobiana se torna muito pouco prática na rotina laboratorial, uma vez

que para a avaliação de um único produto são necessários 48 testes com cada uma

das três concentrações do produto.

Nesse trabalho foram utilizadas duas bactérias isoladas do ambiente

domiciliar, a fim de avaliar o comportamento das metodologias e dos produtos frente

a esses microrganismos. As amostras foram coletadas de uma mesma residência e,

de acordo com a identificação das amostras pelo equipamento VITEK 2, os dois

isolados pertenciam a mesma espécie bacteriana, Enterobacter cloacae. Esse fato

pode ser explicado pela livre circulação do animal de estimação por toda a casa,

além da circulação dos 5 membros da família, fatos que permitem o carreamento da

bactéria para todos os ambientes da casa. Mesmo sendo identificados como a

mesma espécie, os dois isolados foram mantidos separadamente para fins de

realização dos testes de atividade antimicrobiana. Nos testes de avaliação da

atividade antimicrobiana, as bactérias isoladas foram eliminadas pelos três produtos,

evidenciando a capacidade destes em eliminar não apenas microrganismos de

referência, mas também amostras coletadas do ambiente. Esses resultados parciais

sugerem que ambas as metodologias para a avaliação da atividade antimicrobiana

96

são capazes de aferir a qualidade dos produtos desinfetantes e a eficácia destes

para o uso prático no ambiente domiciliar e público. Entretanto, ainda é necessária a

avaliação da fase 2, etapa 2 para uma observação mais completa dessas

características.

Portanto, a implantação de novas metodologias que possam contribuir para a

avaliação da qualidade dos produtos com atividade antimicrobiana é de extrema

importância para que o mercado nacional tenha produtos adequados e em

conformidade com a legislação brasileira, não gerando risco à saúde da população.

97

6 CONCLUSÕES

Com esse trabalho foi realizada a padronização da fase 1 e da fase 2, etapa 1

da metodologia preconizada pelo CEN, assim como os passos iniciais da fase

2, etapa 2.

O álcool etílico a 70% e o produto A se mostraram eficazes frente a todos os

microrganismos preconizados nas duas metodologias, enquanto o produto B se

apresentou satisfatório apenas na metodologia do CEN, não sendo eficaz

frente a S. aureus no método preconizado pela AOAC.

Dois isolados bacterianos foram coletados de domicilio e identificados como

Enterobacter cloacae. Esses foram utilizados nas duas metodologias de

avaliação da atividade antimicrobiana, onde todos os produtos foram eficazes

em eliminá-los nas concentrações recomendadas pelos fabricantes,

evidenciando a eficácia dos produtos frente não só as bactérias de referência

preconizada pelas metodologias, mas também frente às bactérias encontradas

no ambiente.

A utilização das bactérias isoladas do ambiente permitiu observar que ambas

as metodologias da AOAC e do CEN foram capazes de avaliar o

comportamento dos produtos comercializados no mercado brasileiro frente às

bactérias presentes em ambientes onde esses produtos são utilizados.

As bactérias contaminantes dos três desinfetantes obtidos no início do trabalho

foram identificadas, revelando a presença de Serratia marcescens,

Achromobacter xylosoxidans e Aeromonas salmonicida. A observação

evidenciou a presença de produtos contaminados nos dias de hoje,

corroborando com dados mais antigos da literatura, os quais relatam

contaminação desde a década de 1970.

98

PERSPECTIVAS

Este estudo permitiu observar a complexidade para a implantação de

métodos para avaliação da eficácia de desinfetantes. Estudos adicionais utilizando

produtos à base de outros princípios ativos são de grande interesse e necessidade

para a implantação das metodologias e maior conhecimento do comportamento das

mesmas frente aos produtos comercializados no mercado brasileiro.

99

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110

APÊNDICE A

EXEMPLO DO FORMULÁRIO DE REGISTRO DOS TESTES DE DILUIÇÃO DE

USO

112

APÊNDICE B

EXEMPLO DOS FORMULÁRIOS DE REGISTRO DOS TESTES DO COMITÊ

EUROPEU DE NORMALIZAÇÃO – FASE 1

115

APÊNDICE C

EXEMPLO DOS FORMULÁRIOS DE REGISTRO DOS TESTES DO COMITÊ

EUROPEU DE NORMALIZAÇÃO – FASE 2, ETAPA 1

Enterobacter cloacae (isolado da cozinha)

116


117


118

APÊNDICE D

RESULTADOS DOS TESTES DE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTIMICROBIANA PELOS MÉTODOS DE DILUIÇÃO DE USO E DO COMITÊ

EUROPEU DE NORMALIZAÇÃO

Microrganismos Método da

Diluição de Uso CEN – Fase 1

CEN – Fase 2,

Etapa 1

Álcool etílico 70%

S. aureus Satisfatório Satisfatório Satisfatório

S. choleraesuis Satisfatório ---------------- ----------------

P. aeruginosa ---------------- Satisfatório Satisfatório

E. coli ---------------- Satisfatório Satisfatório

E. hirae ---------------- Satisfatório Satisfatório

E. cloacae (isolado

cozinha) Satisfatório Satisfatório Satisfatório

E. cloacae (isolado

banheiro) Satisfatório Satisfatório Satisfatório

Produto A

S. aureus Satisfatório Satisfatório Produto não foi

neutralizado





E. cloacae (isolado


E. cloacae (isolado


Produto B

S. aureus Insatisfatório Satisfatório Satisfatório





E. cloacae (isolado


E. cloacae (isolado


programa de pÓs-graduaÇÃo em vigilÂncia … · studies are required for the complete...

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