LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de PPrograma de Póóss--GraduaGraduaçção em Genão em Genéética tica e Melhoramento de Plantase Melhoramento de Plantas

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

QUORUM SENSING NA INTERAQUORUM SENSING NA INTERAÇÇÃO ÃO BACTBACTÉÉRIA PLANTARIA PLANTA

Aluna: Viviane Colombari Pedrazzini dos SantosAluna: Viviane Colombari Pedrazzini dos SantosOrientador: Prof. Dr. João Lúcio de Azevedo

Co-orientador: Prof. Dr. Welington Luiz de Araújo

SumSumááriorio

� Introdução e Histórico

� Quorum sensing na interação bactéria-bactéria. � Gram positivas� Gram negativas

� Quorum sensing nas interações bactéria-planta.� Mutualísticas � Patogênicas

� Quorum quenching

� Considerações finais

IntroduIntroduççãoão

� Quorum sensing... ou auto-indução... ou sensoriamento populacional...

� processo de comunicação célula-célula no qual

genes bacterianos são expressos de acordo com a

densidade populacional, após uma concentração

crítica de moléculas auto-indutoras ter sido

atingida (Fuqua et al,1994).

Alguns processos regulados por QSAlguns processos regulados por QS

QuorumQuorum

sensingsensing

Formação de biofilmes

Conjugação

Metabólitossecundários

Nodulação

VirulênciaMotilidade

HistHistóóricorico

� Identificado pela 1a vez em Vibrio fischeri e Vibrio harveyi.

� Simbiontes de peixes e lulas.

� Produzem bioluminescência.

V. fischeriV. fischeri e e Euprymna scolopesEuprymna scolopes

� Simbiose

� Nutrição

�� BioluminescênciaBioluminescência

• Camuflagem

• Atrair presas

Fonte: Ruby, E. G. (1999)

Sistema QS Sistema QS -- LuxRLuxR/I em /I em V. fischeriV. fischeri

Genes estruturais de luminescência

Alta densidade Celular (↑↑↑↑ autoindutores)

LuxR se liga a AI

Adaptado de Reading & Sperandio, 2006

Sistema QS Sistema QS -- LuxRLuxR/I em /I em Vibrio fischeriVibrio fischeri

Adaptado de Williams et al, 2000

Homólogo LuxR

Homólogo LuxI

inativo

ativo

Sinal AHL

Sinal gerador

Feedback positivo (auto-indução)

Gene alvo

Gene alvo

Gene alvo

Sem quorum Com quorum

Nível basal de expressão

gênica

Acúmulo de sinal

Ativação do sensor

Ativação de genes alvo

AutoAuto--indutoresindutores

� feromônios ou auto-reguladores.

�� Gram negativas Gram negativas (Filo Proteobacteria)(Filo Proteobacteria)

�� N N –– acil homoserinas lactonasacil homoserinas lactonas• N-(3-oxohexanoil)-HSL

• N-butanoil-HSL

• N-hexanoil-HSL

• N-octanoil-HSL

• N-decanoyl-HSL

• ...(4 a 14 Carbonos)Estrutura:

anel de homoserina conectado a uma cadeia

acil variável.

Especificidade:tamanho

e composiçãoda sua cadeia acil lateral

Mais de 70 espécies bacterianas

são produtoras de moléculas AHL e

apresentam sistema QS homólogo ao

V. fischeri

AutoAuto--indutoresindutores

�� Gram negativasGram negativas

� Bradioxetina• Bradyrhizobium japonicum

� Quinolonas • Pseudomonas

� ácido metil ester 3-hidroxil-palmítico (3–OH PAME)• Ralstonia solanacearum

� ácido 2-metil dodecanóico (DSF)• Xanthomonas campestris pv. campestris,

X. oryzae pv. oryzae e Xylella fastidiosa

� ácido 3-indol acético • Azospirilum (PGPR)

AutoAuto--indutoresindutores

�� Gram positivasGram positivas

� peptídeos modificados pós tradução

� Peptídeos não modificados• 5 a 34 aa e normalmente apresentam estruturas químicas incomuns.

� γ - butirolactonas (semelhantes a AHLs)

• Actinomicetos (Streptomyces)

• Produção de antibióticos e metabólitos secundários

Sistema QS em Gram positivasSistema QS em Gram positivas

PeptPeptíídeosdeosprocessadosprocessadosppóós tradus traduççãoão

TransportadorTransportadorABCABC

Processa e exporta o peptídeo

auto-indutor

ReconhecimentoReconhecimentopor protepor proteíínas kinasesnas kinases

sensoras de dois sensoras de dois componentescomponentes

Adaptado de Bassler, 1999

Locus do precursordo ferormônio

Gene alvo

AutoAuto--indutores na comunicaindutores na comunicaçção interão inter--especespecííficafica

�� AutoAuto--indutor AIindutor AI--22

� descoberto em 1997 no simbionte V. harveyi.

� moléculas furanosil borato difuranosil borato diééster. ster.

� Presente em mais de 60 espécies (Gram positivas e negativas).• Sinal universal? Comunicação inter-específica?

� Sistema QS diferente do observado em V. fischeri.

� A inibição desse sistema em alguns patógenosinterfere na virulência.

Sistema QS Sistema QS –– LuxSLuxS/AI/AI--2 em 2 em V. harveyiV. harveyi

AI-2Furanosil borato

diésterAI-1

4-OH-C4-HSL

Adaptado de Bassler, 1999

síntesesíntese

PeriplasmaPeriplasma

CitoplasmaCitoplasma

Quorum sensingQuorum sensing nas interanas interaçções bactões bactéériaria--plantaplanta

�� MutualMutualíísticassticas

� Simbiose

• Fixadores de N2

• PGPR

� Neutra

• endofíticos

�� PatogênicasPatogênicas

raiz

Rizosfera/rizoplano

Filosfera/filoplano

Sistema vascular

caule

folha

nervura

raiz

Quorum sensing nas interações bactéria-planta

Simbiontes vs. Patógenos

Condições ambientais

Densidade Celular

bacteriana

Não AHL

Fator Nod

Expressão de genes

QSEnzimas

hidrolíticas

Adesão

motilidade

Efetores T4

Efetores T3

EPS

Adaptado de Soto et al, 2006

Armas comuns de colonização

Quorum sensing nas interações mutualísticas

� Sistema QS em rizóbios:� Complexo

� Produção de diversas AHLs

� Funções reguladas por QS:� Divisão celular

� Transferência de plasmídeos

� Expressão gênica na rizosfera

� Desenvolvimento do simbiossoma

� Fixação de nitrogênio

� Número de nódulos

HHHH2222OOOO

HHHH2222OOOO

COCOCOCO2222

OOOO2222

OOOO2222

NNNN2222

NNNN2222NHNHNHNH4 4 4 4

++++

rizosferarizosferarizosferarizosfera

nnnnóóóódulodulodulodulorizrizrizrizóóóóbiosbiosbiosbios

Sugere-se que a regulação via QS otimize as interações com o hospedeiro em diferentes etapas.

Walker, Crossman, 2007

Rizóbios e o ciclo do N2

Alguns exemplos de QS em rizóbios

Nodulação, transferência de

plasmídeo

CinR/CinI, RhiR/RhiI, RaiR/RaiI

7-cis-C14-HSL

C6-HSL/C7-HSL

C8-HSL

3-oxo-C8-HSL,

3-hydroxy-C8-HSL

R. leguminosarum bv viciae

Diferenciação do bacteróide, migração em

superfícies semi-sólidas

CinR/CinI

RaiR/RaiI

3OH-(slc)-HSL

Outras de estrutura não definida

Rhizobium etli

Adesão a raiz, nodulação

-AHL não identificadaM. tianshanense

Desenvolvimento de biofilme,

nodulação, taxa de crescimento

.AHL não identificadaMesorhizobium huakuii

Nodulação,

quimiotaxia, motilidade

SinR/SinI, ExpR, TraR

C8-HSL, C12-HSL,

3-oxo-C14-HSL,

3-oxo-C16:1-HSL,

C16:1-HSL, C18-HSL

Sinorhizobium meliloti

FenótipoLuxR/LuxIAHLEspécie

Quorum sensing em R. leguminosarum bv. viciae

Fatores da plantaFatores da plantaFatores ambientaisFatores ambientais

Genes alvoGenes alvo

NodulaNodulaççãoão

Transferência de plasmTransferência de plasmíídeo simbideo simbióóticotico

Adaptado de Wisniewski-Dyé, Downie, 2002

InibiInibiçção deão decrescimentocrescimento

Quorum sensing em R. etli

� Sistema raiI/raiR (Rosemeyer et al, 1998)

� ∆raiI → aumentou em duas vezes o nº de nódulos sem alterar a fixação de N2.

� ∆raiR → não alterou → supressão da nodulação?

� Sistema cinI/cinR (Daniels et al, 2002)

� ∆cinI e ∆cinR → diminuição na fixação de N2

� ∆cinR → afeta a migração sobre superfícies� ∆cinI → bacteróides não completamente diferenciados� cinI é produzido no interior dos bacteróides (sugere

função QS no nódulo maduro)

� Funções distintas das encontradas em R. leguminosarum bv. viciae

� Sistema traI/traR → semelhante a R. leguminosarum

Quorum sensing em Sinorhizobium meliloti

� Sistema sinI/sinR (Gal et al, 2005)

� ∆sinI• Deficiência na adesão, motilidade

• Diminui a eficiência no início da nodulação

� ∆sinR• Diminui ligeiramente a nodulação

• Altera a expressão de genes dependentes de sinI

� Gene expR (Gal et al, 2005)

� Regulador tipo luxR

� Interrompido por uma sequência de inserção

� Envolvido na síntese de EPS

• Permite a infecção na planta

� ∆sinI• Deficiência na motilidade

Alguns exemplos de QS em fitopatógenos

EPS, biofilme, adesão,

colonização do hospedeiro

EsaI/EsaR3-oxo-C6-HSL

3-oxo-C8-HSLPantoea stewartii subsp. stewartii

EPS, motilidade, enzimas

extracelulares, biofilme

-3-OH-PAMERalstonia solanacearum

Motilidade, EPS, virulência,

resistência a ROS

AhlR/AhlI3-oxo-C6-HSLPseudomonas syringae pv. syringae

VirulênciaAvsR/AvsI3-oxo-C16:1-HSLAgrobacterium vitiae

Antibiótico, exoenzimas, virulência

ExpR/CarRCarI/ExpI

3-oxo-C6-HSLPectobacterium carotovora pv. carotovora

ConjugaçãoTraR/TraI3-oxo-C8-HSLAgrobacterium tumefaciens

FenótipoLuxR/LuxISinal QSEspécie

Quorum sensing nas interações patogênicas

Produção de opinas

Inserção doplasmídeo Ti

por Agrobacteriumtumefaciens

A. tumefaciens

� Biofilmes descontínuos (a)

� Agregados bacterianos cobrem os vasos do xilema com material fibroso (b)

Chatocnema pulicaria

Doença de Stewartii em milhoVon Bodman et al, 2003

� Sistema QS EsaI/EsaR� Síntese de EPS (adesão e formação de biofilme).

� Disseminação no xilema (padrão distinto de colonização).

Colonização do xilema por P. stewartii-GFP

Microscopia eletrônica de vasos de xilema infectados

selvagem

∆∆∆∆EsIR

Selvagem(A) E (B)

∆∆∆∆EsIR

Deficiente em AHL

Deficiente em AHL(sem EPS)

Células colapsadas

� ∆∆∆∆ EsaR� Deficientes na adesão.

Colonização do xilema por P. stewartii-GFP

Microscopia eletrônica de vasos de xilema infectados

selvagem

∆∆∆∆EsIR

Selvagem(A) E (B)

∆∆∆∆EsIR

Deficiente em AHL

Deficiente em AHL

Células colapsadas

� Existe um sistema QS que dirige a interação de X. fastidiosa com o inseto vetor e com a planta hospedeira?

� X. campestris pv. campestris : � Molécula QS: DSF – gene: rpfF� Fenótipo: produção de EPS e exoenzimas

� Proteínas RpfF de Xcc e X. fastidiosaapresentam 66% de similaridade de seqüências, sugerindo funções conservadas.

Doença de Pierce

Cigarrinha azulGraphocephala atropunctata

� 1) Transmissibilidade pela cigarrinha� Mutantes rpfF são deficientes

� 2) Colonização do inseto� Mutantes rpfF não são transmitidos eficientemente porque não são retidos no inseto.

� 3) Formação de biofilme no inseto� requer rpfF.

� 4) Virulência das cepas mutantes� Mutantes: sintomas mais severos e precoces.

Colonização da cigarrinha por cepas selvagens e mutantes rpfF.

mutante selvagem

� 5) Formação de biofilme na planta� Formação nas mutantes e selvagens.

� Mutante rpfF de Xylella ainda produz exopolissacarídeos ao contrário do mutante rpfF de Xcc.

� Interessantemente, em um terceiro relato de fitopatógeno, X. oryzae pv. oryzae, há redução da virulência sem afetar a produção de exopolissacarídeo.

Selvagem

Mutante

� Discussão

� falta de transmissibilidade está relacionada a incapacidade do mutante formar biofilme no inseto.

� resultados revelam a importante conexão entre a sinalização QS e a transmissão.

� Hipótese para o aumento da virulência na cepa mutante:

• X. fastidiosa expressa exoenzimas, reguladas por DSF, que degradam as membranas no xilema e permitem maior espalhamento bacteriano.

• Na cepa mutante ocorre maior oclusão dos vasos, portanto sintomas mais intensos da doença.

Modelo para o movimento de X. fastidiosa no xilema

DSF

mutante

selvagem

Sintomas mais severos de doença

� Interferência positiva ou negativa no mecanismo

quorum sensing

Quorum quenching

Diversas enzimas e inibidores têm sido identificados

em diferentes fontes, incluindo organismos eucariotos

e procariotos.

� Produção de enzimas:

� AHL lactonases (gene aiiA)• Conservadas em Bacillus spp, A. tumefaciens,

Burkholderia spp, Arthrobacter e Rhodococcusspp.

• Bactérias de solo

� AHL acilases (gene aiiD)• Ralstonia sp, Variovorax e Pseudomonas spp

• Aplicação: expressão heteróloga em plantas para estudar a regulação de processos via QS

Quorum quenching

Quorum quenching

Expressão de AHL-lactonase (aiiA) em P. carotovora inoculada em tabaco

Dong & Zhang, 2005

Expressando Expressando aiiAaiiAControleControle SelvagemSelvagem

Função das lactonases na bactéria

� A produção de lactonase e AHL é dependente da fase de crescimento.

� Fase exponencial: attM éreprimido pelo fator transcricional AttJ.

� Fase estacionária: o esgotamento de nutrientes dispara a produção de um hormônio que se liga a AttJ, e permite a expressão de AttM e degradação do sinal AHL.

AHL AHL

Dong & Zhang, 2005

A. tumefaciens

Faseexponencial

Faseestacionária

� A concentração de GABA aumenta rapidamente nos tecidos feridos da planta, mas o seu papel na interação planta-bactéria não é conhecido.

� Os autores demonstraram que o GABA, estimula a inativação da molécula QS pela AttM lactonase de A. tumefaciens.

GABA induz a expressão do operon attKLM.

Spot de attK

� A evidência de que o GABA atua como sinal entre eucariotos e bactérias oferece a oportunidade de

desenvolver estratégias para defesa contra

bactérias patogênicas.

Célula vegetal em tecidos feridos

mitocôndriacitosol

citosol

� B. glumae - principal fator de virulência: pigmento amarelo tóxico denominado toxiflavina.

� Estudos recentes indicam que a produção de toxiflavina seja regulada por QS.

� isolaram uma Burkholderia sp. endofítica de arroz (divide o mesmo nicho ecológico com a espécie patogênica) e inseriram o gene proveniente de Bacillus thuringiensis que codifica uma AHL-lactonase.

Inibição do sinal QS e supressão de doença causada porP. carotovora pela Burkholderia sp. transgênica (pKPE-aiiA).

P. carotovora

P. carotovora+

Burkholderia sp

Burkholderia sppKPE-aiiA

Atenuação da podridão em arroz causada por B. glumaepela Burkholderia sp. transgênica (pKPE-aiiA)

AA

AA

BB

BB

CC

CC

A: A: B. glumaeB. glumaeB: B: B. glumaeB. glumae + + pKPEpKPEC: C: B. glumaeB. glumae + + pKPEpKPE--aiiAaiiA

In vitro

In planta

Quorum quenching

� produção de moléculas que:

� mimetizam,

� degradam ou

� bloqueiam os auto-indutores,

� podendo assim estimular ou inibir as respostas dependentes de QS.

� O legume Medicago truncatula - sistema modelo para análises moleculares das interações bactéria – planta.

� Além do simbionte fixador de nitrogênio Sinorhizobium meliloti, micorrrizas simbiontes e várias bactérias patogênicas.

� avaliaram substâncias ativas frente às moléculas QS em M. truncatula:

� 15 a 20 substâncias foram capazes de estimular ou inibir respostas em QS.

� a atividade das substâncias que mimetizam QS éalterada acentuadamente com o desenvolvimento da planta.

� Análise proteômica:� M. truncatula detecta e responde positivamente ou

negativamente a concentrações nano a micromolaresde AHLs produzidos por uma bactéria simbionte Sinorhizobium meliloti e por uma patogênica (Pseudomonas aeruginosa).

� Mudanças específicas também foram detectadas dependendo da concentração e estrutura da AHL, sugerindo que as plantas podem discriminar entre AHLsprovenientes de bactérias diferentes.

Considerações finais

� Bactérias simbiontes não parecem ser tão dependentes do QS quanto as patogênicas para obter sucesso na interação com a planta.

� Embora diferentes espécies bacterianas possam utilizar moléculas sinalizadoras similares, a sua percepção e função são específicas para diferentes hospedeiros.

� Necessidade de maiores investigações sobre compostos que mimetizam auto-indutores.

� Maior compreensão a respeito de como as plantas respondem não somente aos auto-indutores mas também a outros sinais envolvidos no sistema QS.

OBRIGADA PELA ATENÇÃO!

Walker, Crossman, 2007