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MARÍLIA DE HOLANDA CAVALCANTI MACIEL

Produção e caracterização parcial de pectinases de Aspergillus niger por fermentação em estado sólido da

palma forrageira e da casca do maracujá

Recife 11/2009

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE PECTINASES DE

ASPERGILLUS NIGER POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO DA

PALMA FORRAGEIRA E DA CASCA DO MARACUJÁ

Marília de Holanda Cavalcanti Maciel.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos do Departamento de Micologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia de Fungos. Área de Concentração: Micologia Aplicada Orientadora: Profa. Dra. Cristina Maria de Souza Motta. Co-orientadora: Profa. Dra. Keila Aparecida Moreira.

Recife 11/2009

Maciel, Marília de Holanda Cavalcanti Produção e caracterização parcial de pectinases de Aspergillus Niger por fermentação em Estado sólido da palma forrageira e da casca do maracujá / Marília de Holanda Cavalcanti Maciel. – Recife: O Autor, 2009. 101 folhas : il., fig., tab.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Pós-Graduação em Biologia de Fungos, 2009.

Inclui bibliografia.

1. Enzimas 2. Fungos – Enzimas 3. Enzimas – Aplicações industriais

4. Hidrólise 5. Taxonomia (Biologia) I. Título.

572.7 CDD (22.ed.) UFPE/ CCB – 2010- 067

Dedico esta dissertação aos meus pais, que em todos os momentos estiveram do meu lado.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, a Deus pela vida, saúde e sabedoria para vencer todas as etapas

desse trabalho.

Ao meu pai e à minha mãe, Helcias Maciel e Lúcia Maciel, que viveram esse sonho

comigo e partilharam de cada momento ao longo de todos os anos da minha vida.

Agradeço a minha tia Fátima e a minha vovó Maria pelo apoio, torcida, amor e

carinho que me foi dado durante toda a vida.

Ao meu namorado, Thyago Revorêdo, pelo incentivo na realização deste trabalho,

pelos momentos de alegria, tristeza e acima de tudo a amizade, paciência e amor.

À minha professora e primeira orientadora de pesquisa, Dra. Cristina Maria de

Souza Motta, pela orientação, amizade, incentivo, disponibilidade, conselhos profissionais

e científicos que me levaram a conclusão desse trabalho.

À minha professora e co-orientadora, Dra. Keila Aparecida Moreira, por ter me

aceitado como sua aluna, pela amizade que foi construída e pela sua presença

incentivadora.

À Profa. Maria José Fernandes pela contribuição na identificação das culturas de

fungos.

Um agradecimento em particular a Profa. Dra. Ana Lúcia Figueiredo Porto por ter

disponibilizado a infra-estrutura do Laboratório de Tecnologia de Bioativos da

Universidade Federal Rural de Pernambuco (Labtecbio/UFRPE) para a realização dos

experimentos.

À Dra. Tatiana Souza Porto por sua ajuda na análise estatística dos dados e por toda

a orientação dada no decorrer dos experimentos. Obrigada pelo carinho e amizade.

Às minhas amigas da Micoteca, Liana, Stheffania, Tatiana, Minelle, Roberta,

Odacy, agradeço pelos bons momentos no ambiente de trabalho. Agradeço em especial a

Eliane e Bruninho pela amizade e pelo apoio dado nas horas que mais precisei.

À Polyanna que sempre me ajudou na realização dos experimentos. Obrigada por

estar comigo durante os fins de semana de horas e horas de trabalho.

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Pernambuco (FACEPE) pela bolsa

concedida durante o meu mestrado.

Agradeço a todos vocês por tudo.

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE PECTINASES DE

ASPERGILLUS NIGER POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO DA

PALMA FORRAGEIRA E DA CASCA DO MARACUJÁ

RESUMO

Microrganismos isolados e identificados, quando preservados por processos adequados

podem ser armazenados por longos períodos. Existem métodos de preservação que

asseguram a viabilidade, morfologia, fisiologia e genética, com o objetivo de manter a

cultura por períodos, conservando as características genéticas e propriedades industriais.

Aspergillus niger é a espécie mais comumente utilizada para a produção industrial de

enzimas pectinolíticas. As enzimas pectinolíticas são um grupo heterogêneo de enzimas

que hidrolisam as substâncias pécticas presentes nos vegetais. Este trabalho teve como

objetivo avaliar a viabilidade, autenticar taxonomicamente 25 culturas de A. niger

estocadas sob óleo mineral na Micoteca URM e produzir pectinases por fermentação em

estado sólido (FES) da palma forrageira e da casca do maracujá utilizando a cultura

selecionada. Todas as culturas reativadas foram viáveis e autenticadas taxonomicamente,

apesar do longo período de estocagem, que variou de 1 a 41 anos. Quanto à capacidade

pectinolítica, 23 culturas apresentaram halo de degradação ao redor da colônia,

evidenciando a capacidade de degradar pectina. A cultura que apresentou maior halo de

degradação foi URM4645 (18 mm), sendo selecionada para as FES, onde foram avaliadas

as atividades de endopoligalacturonase (endo-PG), exopoligalacturonase (exo-PG), pectina

liase (PL) e pectinesterase (PE). A atividade máxima obtida foi de 66,19 U/g de endo-PG,

3,59 U/g de exo-PG e 40.615,62 U/g de PL, nos tempos de 96, 24 e 72 horas de FES da

palma forrageira, respectivamente. A melhor condição para a produção das enzimas foi

obtida com 10,0 g do substrato, 107 esporos/g a 28ºC com 96 horas. A atividade ótima de

endo-PG e PL foi em pH 5,0 a 50ºC e exo-PG em pH 7,0 a 40ºC. Endo-PG e exo-PG

foram estáveis em uma faixa de pH 3,5-11,0 e a 50ºC e a 80ºC, respectivamente, e PL em

pH 5,0 e a 50ºC. Utilizando a casca do maracujá a atividade máxima obtida foi de 31,35

U/g de endo-PG, 7,98 U/g de exo-PG, 551.299,39 U/g de PL e 447,93 U/g de PE, nos

tempos de 96 horas de FES para a endo-PG e PL e 72 horas para a exo-PG e PE. A melhor

condição para a produção das quatro enzimas foi obtida com 5,0 g do substrato, 30% de

umidade a 34ºC com 96 horas. Endo-PG apresentou atividade ótima em pH 7,5 a 40ºC,

exo-PG e PL em pH 7,0 a 80°C e PE em pH 3,5 a 30°C. Endo-PG foi estável na faixa de

pH 7,0-8,0 e a 40ºC, enquanto exo-PG e PL foram estáveis na faixa de pH 6,0-8,0 e 6,0-7,5

e a 60-70ºC, respectivamente. PE foi estável na faixa de pH 3,5-5,0 e a 30-60ºC.

Palavras-chave: Aspergillus niger, enzimas pectinolíticas, fermentação em estado sólido.

PRODUCTION AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF PECTINASES BY

ASPERGILLUS NIGER FROM SOLID STATE FERMENTATION IN FORAGE

PALM AND PASSSION PEEL

ABSTRACT

Microorganisms isolated and identified, when preserved by appropriate procedures can be

stored for long periods. There are preservation methods that ensure the viability,

morphology, physiology and genetics, in order to maintain the culture over time,

preserving the genetic and industrial properties. Aspergillus niger is the species most

commonly used for industrial production of pectinolytic enzymes. Pectinolytic enzymes

are a heterogeneous group of enzymes that hydrolyze the pectic substances present in

vegetables. This study aimed to evaluate the feasibility, authenticate taxonomically 25

cultures of A. niger stored under mineral oil at the Micoteca URM and produce pectinases

by solid state fermentation (SSF) of forage palm and passion fruit peel using the selected

culture. All cultures were reactivated viable and authenticated taxonomically, despite the

long storage period, which ranged from 1 to 41 years. The pectinolytic capacity, 23

cultures showed degradation halo around the colony, showing the ability to degrade pectin.

The culture that presented higher degradation halo was URM4645 (18 mm), being selected

for the SSF, evaluating the activities of endopolygalacturonase (endo-PG),

exopolygalacturonase (exo-PG), pectin lyase (PL) and pectinesterase (PE). The maximum

activity obtained was 66.19 U/g of endo-PG, 3.59 U/g of exo-PG and 40,615.62 U/g of PL,

in times of 96, 24 and 72 hours of FES forage palm, respectively. The optimum condition

for the enzymes production was obtained with 10.0 g of substrate, 107 spores/g at 28ºC

with 96 hours of SSF. The optimum activity of endo-PG and PL was at pH 5.0 at 50°C and

exo-PG at pH 7.0 at 40°C. Endo-PG and exo-PG were stable in a pH range 3,5-11,0 and

50°C and 80°C, respectively, and PL at pH 5.0 and 50°C. Using the passion fruit peel the

maximum activity obtained was 31.35 U/g of endo-PG, 7.98 U/g of exo-PG, 551,299.39

U/g of PL and 447.93 U/g of PE in times of 96 hours of SSF for the endo-PG and PL and

72 hours for the exo-PG and PE. The optimum conditions for the production of four

enzymes was obtained with 5.0 g substrate, 30% humidity at 34ºC with 96 hours of SSF.

Endo-PG presented optimum activity at pH 7.5 at 40°C, exo-PG and PL at pH 7.0 at 80°C

and PE at pH 3.5 at 30°C. Endo-PG was stable at pH 7.0-8.0 and 40°C, while exo-PG and

PL were stable at pH 6.0-8.0 and 6,0-7,5 and 60-70ºC respectively. PE was stable at pH

3.5-5.0 and 30-60ºC

Keywords: Aspergillus niger, pectinolytic enzymes, solid state fermentation.

LISTA DE FIGURAS

REVISÃO DE LITERATURA Pág.

Figura 1 - Representação esquemática da parede celular de vegetais........................... 26

CAPÍTULO 1

Figura 1 - Aspergillus niger URM4645: A) Colônias em Ágar Extrato de Malte

com sete dias de crescimento; B) Célula pé (seta 1), conidióforo (seta 2) e cabeça

conidial (seta 3) (17,7x); C) métulas (seta 4) maiores que as fiálides (seta 5) (47,7x);

D) conídio globoso e rugoso (110x)..............................................................................

47

Figura 2 - Cultura de Aspergillus niger URM4645 evidenciando halo de degradação

ao redor da colônia mostrando atividade pectinolítica após 7 dias em meio seletivo

contendo pectina cítrica .................................................................................................

50

CAPÍTULO 2

Figura 1 - Atividade de endopoligalacturonase (□ - endo-PG), exopoligalacturonase

(∆ - exo-PG) e pectina liase (○ - PL) na melhor condição de produção das três

enzimas (10,0 g do substrato, 107 esporos/g a 28°C com 96 horas de fermentação em

estado sólido (FES) - Ensaio 04)....................................................................................

62

Figura 2 - Efeito do pH na atividade de endopoligalacturonase (□ - endo-PG),

exopoligalacturonase (∆ - exo-PG) e pectina liase (○ - PL) de Aspergillus niger

URM4645.......................................................................................................................

Figura 3 - Efeito da temperatura na atividade de endopoligalacturonase (□ - endo-

PG), exopoligalacturonase (∆ - exo-PG) e pectina liase (○ - PL) de Aspergillus niger

URM4645.......................................................................................................................

64

65

CAPÍTULO 3

Figura 1 - Atividade de endopoligalacturonase (□- endo-PG), exopoligalacturonase

(∆ - exo-PG), pectina liase (○ - PL) e pectinesterase (◊ - PE) na melhor condição de

produção das quatro enzimas (5,0 g do substrato, 30% de umidade a 24°C com 96

horas de fermentação em estado sólido (FES) - Ensaio 05)...........................................


exopoligalacturonase (∆ - exo-PG), pectina liase (○ - PL) e pectinesterase (◊ - PE)

de Aspergillus niger URM4645......................................................................................

Figura 3 - Efeito da temperatura na atividade de endopoligalacturonase (□ - endo-

PG), exopoligalacturonase (∆ - exo-PG), pectina liase (○ - PL) e pectinesterase (◊ -

PE) de Aspergillus niger URM4645...............................................................................

Pág.

78

81

82

LISTA DE TABELAS

REVISÃO DE LITERATURA Pág.

Tabela 1 - Classificação das enzimas pécticas...............................................................

29

CAPÍTULO 1

Tabela 1 - Viabilidade e autenticação taxonômica de culturas de Aspergillus niger

preservados sob óleo mineral na Micoteca URM...........................................................

46

Tabela 2 - Culturas de Aspergillus niger testadas quanto à atividade pectinolítica e

correspondentes diâmetros de halos..............................................................................

49

CAPÍTULO 2

Tabela 1 - Níveis das variáveis utilizadas no planejamento 23 para produção de

pectinases por fermentação em estado sólido da palma forrageira utilizando

Aspergillus niger URM4645...........................................................................................

56

Tabela 2 - Resultados do planejamento experimental (23) para a produção de

endopoligalacturonase (endo-PG), exopoligalacturonase (exo-PG) e pectina liase

(PL) por fermentação em estado sólido (FES) da palma forrageira com Aspergillus

niger URM4645..............................................................................................................

Table 3 - Efeitos calculados a partir das respostas do planejamento fatorial completo

do tipo 23 para produção de endopoligalacturonase (endo-PG), exopoligalacturonase

(exo-PG) e pectina liase (PL) com 96 horas de fermentação em estado sólido (FES)

por Aspergillus niger URM4645....................................................................................

60

63

CAPÍTULO 3

Tabela 1 - Níveis das variáveis utilizadas no planejamento 23 para extração de

pectinases por fermentação no estado sólido da casca do maracujá..............................

Tabela 2 - Resultados do planejamento experimental (23) para produção de

endopoligalacturonase (Endo-PG), exopoligalacturonase (Exo-PG), pectina liase

(PL) e pectinesterase (PE) por fermentação em estado sólido (FES) com Aspergillus

niger URM4645..............................................................................................................

Tabela 3 - Efeitos calculados a partir das respostas do planejamento fatorial

completo do tipo 23 para produção de endopoligalacturonase (endo-PG),

exopoligalacturonase (exo-PG), pectina liase (PL) e pectinesterase (PE) com 96

horas de fermentação em estado sólido (FES) por Aspergillus niger URM4645...........

Pág.

73

77

79

SUMÁRIO

Pág.

1. INTRODUÇÃO........................................................................................................ 16

2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 19

2.1. Coleção de Culturas................................................................................................ 19

2.2. Métodos para preservação de culturas de fungos................................................... 20

2.3. Taxonomia do Grupo Aspergillus niger.................................................................

2.4. Substâncias pécticas................................................................................................

2.5. Enzimas pectinolíticas............................................................................................

2.5.1. Protopectinases.............................................................................................

2.5.2. Enzimas desmetoxilantes ou desesterificantes.............................................

2.5.3. Enzimas despolimerizantes...........................................................................

2.5.3.1. Hidrolases.........................................................................................

2.5.3.2. Liases................................................................................................

2.6. Aplicações das pectinases.......................................................................................

2.6.1. Indústrias de sucos de frutas.........................................................................

2.6.2. Indústria têxtil...............................................................................................

2.6.3. Indústria de vinho.........................................................................................

2.6.4. Indústria de papel e celulose.........................................................................

2.6.5. Alimentação animal......................................................................................

2.7. Fermentação em Estado Sólido (FES)....................................................................

2.8. Utilização de Aspergillus niger na produção de pectinases....................................

2.9. Substratos utilizados na Fermentação em Estado Sólido (FES).............................

2.9.1. Palma forrageira............................................................................................

2.9.2. Maracujá.......................................................................................................

23

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29

29

30

30

30

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32

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38

3. VIABILIDADE, AUTENTICAÇÃO TAXONÔMICA E CARACTERIZAÇÃO

DE CULTURAS PECTINOLÍTICAS DE ASPERGILLUS NIGER PRESERVADAS

SOB ÓLEO MINERAL NA MICOTECA URM..........................................................

40

Resumo.......................................................................................................................... 41

Introdução...................................................................................................................... 42

Material e métodos........................................................................................................ 44

Resultados e discussão................................................................................................... 45

Pág.

Conclusões.....................................................................................................................

Agradecimentos.............................................................................................................

51

51

4. PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE PECTINASES DE

ASPERGILLUS NIGER URM4645 UTILIZANDO A PALMA FORRAGEIRA

COMO SUBSTRATO...................................................................................................

52

Resumo.......................................................................................................................... 53

Introdução...................................................................................................................... 54



Conclusões.....................................................................................................................

Agradecimentos.............................................................................................................

5. PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE PECTINASES DE

ASPERGILLUS NIGER URM4645 POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO

(FES) DA CASCA DO MARACUJÁ...........................................................................

67

67

68

Resumo.......................................................................................................................... 69

Introdução...................................................................................................................... 70



Conclusões..................................................................................................................... 84

Agradecimentos............................................................................................................. 84

6. CONSIDERAÇÕES GERAIS................................................................................... 85

7. REFERÊNCIAS........................................................................................................ 87

MACIEL, M. H. C. Produção e caracterização parcial de pectinases de Aspergillus...

1

1. INTRODUÇÃO

Microrganismos isolados e identificados, quando preservados por processos

adequados podem ser armazenados por longos períodos, conservando as características

genéticas e propriedades industriais. A maneira mais eficaz de preservação de

microrganismos de importância econômica é a preservação ex-situ, ou seja, em coleções

de culturas (CANHOS, 2009). Dentre estes métodos de preservação podem ser citados o

método de óleo mineral, água destilada esterilizada, liofilização, criopreservação,

ultracongelamento a -80°C, sílica gel, solo e repiques seriados (LACAZ et al., 2002;

NAKASONE et al., 2004).

As espécies pertencentes ao Grupo Aspergillus niger têm sido bem estudadas

com base em critérios morfológicos e moleculares (ABARCA et al., 2004). A

identificação e caracterização destas espécies, até a década de 90, eram feitas levando

em consideração apenas caracteres morfológicos, tais como: diâmetro, cor e textura das

colônias, tamanho e textura do conídio e estrutura do conidióforo (KLICH, 2002). A

diversidade genética desse grupo é muito grande, de forma que a taxonomia clássica se

apresenta altamente complexa (DENDIS et al., 2003; SAMSON et al., 2006).

A economia brasileira é essencialmente baseada na agricultura, produzindo e

exportando café, açúcar de cana, soja, mandioca, frutas, entre outros. Entretanto, a

grande produção desses produtos agroindustriais é responsável por uma elevada geração

de resíduos. Nos últimos anos houve um aumento na procura de processos capazes de

reciclar esses resíduos agroindustriais, cuja disposição no ambiente causa sérios

problemas ambientais (SOCCOL; VANDENBERGHE, 2003).

Umas das aplicações em potencial desses resíduos agroindustriais é a utilização

em bioprocessos, como fontes de carbono, para obtenção de produtos de maior valor

agregado. Nesse sentido, a fermentação em estado sólido (FES) se apresenta como um

processo biotecnológico capaz de propor caminhos alternativos para a utilização dos

resíduos gerados, que são facilmente disponíveis e de baixo custo, diminuindo possíveis

problemas ambientais, bem como, de agregar valor a essas matérias-primas, por meio da

produção de substâncias de interesse econômico, como enzimas, álcool, proteínas,

ácidos orgânicos, aminoácidos e compostos de aroma (PANDEY et al., 2001;

UENOJO; PASTORE, 2007).


2

Os resíduos agroindustriais têm apresentado bons resultados na produção de

enzimas incluindo inulinases (MAZUTTI et al., 2009), celulases e xilanases (KANG et

al., 2004; CARMONA et al., 2005) e pectinases (MARTINS et al., 2002).

Mundialmente, a palma forrageira (Opuntia ficus indica Mill) é utilizada na

alimentação humana, arraçoamento animal, como fonte de energia, na medicina, na

indústria de cosméticos, na proteção e conservação do solo, na fabricação de adesivos,

colas, fibras para artesanato, papel, corantes, mucilagem, antitranspirante e

ornamentação (BARBERA, 2001). A grande diversidade de usos e aplicações da palma

forrageira revela a versatilidade dessa espécie vegetal, porém não possui sua

potencialidade explorada plenamente (CHIACCHIO et al., 2006). É uma excelente

fonte de carboidratos não fibrosos com aproximadamente 62% (WANDERLEY et al.,

2002) e 62% de nutrientes digestíveis totais (MELO et al., 2003), além de apresentar

altos teores de pectina (SILVA et al., 1997).

No Brasil, a cultura do maracujá vem crescendo a cada ano, sendo o primeiro

produtor mundial, com uma área plantada de 35.600 hectares, gerando

aproximadamente 615.196 toneladas de frutos em 2006. A cadeia produtiva do

maracujá estende-se por diversas regiões do Brasil, principalmente na região Nordeste

(IBGE, 2009). As cascas são constituídas basicamente por carboidratos, proteínas e

pectinas, o que possibilita o aproveitamento das mesmas para a obtenção de produtos de

alto valor agregado como as enzimas do complexo pectinolítico, aumentando assim seu

valor comercial (OLIVEIRA et al., 2002).

O complexo pectinolítico é constituído por enzimas desesterificantes e

despolimerizantes, devido à função de degradar a pectina localizada na lamela média da

parede celular primária das células vegetais e são classificadas em poligalacturonase

(PG), pectina liase (PL) e pectinesterase (PE) de acordo com a forma de ação

(DARTORA et al., 2002). Podem ser produzidas por plantas e microrganismos como

fungos e bactérias (SILVA et al., 2005). Dentre os fungos, o gênero Aspergillus se

destaca como bom produtor destes biocatalizadores, especialmente certas linhagens de

A. niger (DINU et al., 2007). O interesse pelo uso de espécies pertencentes ao Grupo

Aspergillus niger em processos industriais vem aumentando nos últimos anos,

proporcionando vantagens econômicas na produção de enzimas, ácidos orgânicos e

preparação de aliemtos orientais (CAMPBELL et al., 1989).

As pectinases apresentam grande importância comercial na indústria de sucos de

frutas, na recuperação de óleos essenciais, na extração de óleos vegetais, na fabricação


3

de ração para animais, na indústria de vinhos, na indústria têxtil e na indústria de papel e

celulose (UENOJO; PASTORE, 2007).

As pesquisas que envolvem o estudo e a produção de enzimas com potencial

industrial são importantes devido à constante busca por novos produtos diversificados e

facilmente acessíveis para um mercado exigente (MOLINA et al., 2001). Dessa forma, o

trabalho teve como objetivos avaliar a viabilidade, autenticar taxonomicamente e

produzir pectinases por Aspergillus niger, da Micoteca URM, através da FES da palma

forrageira e da casca do maracujá, além de caracterizar parcialmente as pectinases

produzidas.


4

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. COLEÇÃO DE CULTURAS

Coleções de culturas são centros de excelência, funcionando como unidades de

conservação ex-situ, mantendo e estudando um "pool" genético para gerações futuras, e

oferecendo serviços fundamentais para a comunidade científica e tecnológica

(CANHOS, 2009). Essas coleções podem ser classificadas como coleções de serviço,

coleções de trabalho ou coleções institucionais. Estas duas últimas categorias, embora

valiosas, não contam com o respaldo necessário para assegurar a sua perenidade, sendo

normalmente mantidas pelo esforço individual de pesquisadores. Já as coleções de

serviço, fundamentadas na conservação e distribuição de recursos genéticos e com a

finalidade de pesquisa e desenvolvimento, contam com financiamento em longo prazo

em países industrializados (CANHOS, 2003).

As coleções de culturas de fungos representam uma importante fonte de recursos

biológicos permitindo o conhecimento da biodiversidade fúngica e a condução de

inúmeros trabalhos científicos, possibilitando um maior conhecimento da sua

importância para as áreas da saúde e do meio ambiente, assegurando o sucesso de sua

utilização em processos, principalmente, biotecnológicos (FIGUEIREDO, 2001).

A primeira coleção de serviço que se tem registro é a Coleção Kral, estabelecida

em Praga, República Tcheca, em 1890, com a finalidade de fornecer culturas puras para

estudos comparativos e identificação de bactérias patogênicas. No início do século XX,

outras coleções de serviço mundialmente importantes foram estabelecidas, tais como: o

IMI (International Mycological Institue) na Inglaterra; a ATCC (American Type Culture

Collection) nos EUA; o CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures) na Holanda;

MUCL (Mycotheque de L'Universite Catholique de Luvaim) na Bélgica, IFO (Institue

For Fermentation) e JCM (Japan Collection of Microorganisms) no Japão e outras.

Estas coleções passaram por um contínuo processo de evolução, visando atender

demandas especializadas decorrentes dos avanços na microbiologia industrial, na

biotecnologia e na engenharia genética e genômica (CANHOS, 2003).

Atualmente, existem 556 coleções de culturas distribuídas em 68 países. O Brasil

possui 53 coleções de culturas preservando em torno de 37.737 culturas de diversos

microrganismos como algas, protozoários, bactérias e fungos (WORLD DATA

CENTER FOR MICROORGANISMS, 2009).


5

A Coleção de Culturas, Micoteca URM, do Departamento de Micologia, Centro

de Ciência Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, foi fundada em 1954

pelo Prof. Augusto Chaves Batista e apresenta um acervo diversificado de fungos

pertencentes aos filos Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota e “Deuteromycota”

(fungos anamorfos). A Micoteca URM está registrada no Commonwealth Mycological

Institute (CMI) sob a sigla URM (University Recife Mycologia) e é filiada ao Word

Federation for Culture Collections (WFCC) sob o número 604 (MICOTECA, 2009;

WORLD DATA CENTER FOR MICROORGANISMS, 2009).

Inicialmente o método de preservação utilizado na Micoteca URM era apenas o

de óleo mineral (SHERF, 1943), porém, em 1988, houve a implantação de mais dois

métodos: liofilização (RAPER; ALEXANDER, 1945) e água destilada esterilizada

(CASTELLANI, 1967). Os métodos de preservação em óleo mineral e liofilização estão

sendo utilizados para todas as amostras de fungos filamentosos e leveduras, enquanto

que a água destilada esterilizada, apenas para os Zygomycota e para as espécies

patógenas ao homem e animais (MICOTECA, 2009).

2.2. MÉTODO PARA PRESERVAÇÃO DE CULTURAS DE FUNGOS

As coleções de culturas mundiais eram, inicialmente, mantidas por repicagens

periódicas e constantes, o que, sem dúvida, representa um trabalho exaustivo. Além

disso, problemas como perda da viabilidade, mudanças fisiológicas, de aspecto e

coloração, decréscimo e perda da capacidade esporulação e declínio da patogenicidade

aparecem constantemente em culturas após repicagens sucessivas. Assim, para

preservação desse patrimônio biológico por longos períodos de tempo, tornou-se

necessário desenvolver outros métodos que fossem menos dependentes do trabalho

humano e que mantivessem as culturas viáveis e menos sujeitas a variações

morfológicas e fisiológicas (SMITH; WALLER, 1992; FIGUEIREDO, 2001).

O método de preservação de fungos em óleo mineral foi empregado pela

primeira vez por Sherf (1943) e sua eficácia tem sido relatada em vários estudos para

diferentes grupos de fungos (BUELL; WESTON; 1947; BORBA et al 1992; BORBA et

al., 2002).

O método de preservação sob óleo mineral consiste em recobrir culturas jovens,

crescidas em tubos de ensaio com meios de cultura específicos, com uma camada de


6

óleo mineral esterilizado, prevenindo assim a desidratação do meio de cultura,

reduzindo a atividade metabólica e o crescimento dos organismos preservados através

da redução da tensão de oxigênio (SMITH; ONIONS, 1994; FIGUEIREDO, 2001;

NAKASONE et al., 2004).

A redução da freqüência das repicagens é uma das principais vantagens do

método de preservação em óleo mineral, assim como a eficiência do controle dos

ácaros; não exigência de equipamentos e operadores especializados; possibilidade de

utilização da mesma cultura para várias repicagens; a longa viabilidade de algumas

espécies; e armazenamento de espécies que não sobreviveriam em outros métodos de

preservação. As desvantagens do método seriam uma rotina de repicagem trabalhosa e

complicada, além de todos os inconvenientes do trabalho com substâncias oleosas;

necessidades dos tubos de cultura ser mantidos permanentemente na posição vertical

para que o óleo não toque os tampões de algodão, levando assim a contaminação; riscos

de contaminação durante a preparação, repicagens e preservação das culturas por

esporos do ar; contaminações por bactérias que não são facilmente percebidas nas

culturas imersas em óleo; e o retardo no crescimento de algumas culturas quando

reativadas (SMITH; ONIONS, 1994; FIGUEIREDO, 2001).

A reativação das culturas de fungos estocadas em óleo mineral se faz através da

remoção de uma pequena amostra da cultura para um meio líquido ou sólido (SMITH;

ONIONS, 1994; NAKASONE et al., 2004). Neufeld (1996), em estudos realizados com

306 cepas de dermatófitos dos gêneros Mycrosporum, Nannizia e Trichophyton,

preservadas sob óleo mineral por um período de até 71 anos, conseguiu recuperar 47

espécies (15,3%), observando que o tempo máximo de estocagem variou de 9 a 44 anos.

Pela avaliação da sobrevivência e alteração morfológica de 70 culturas de

Paracoccidioides brasiliensis mantidas na Coleção de Culturas Fúngicas do Instituto

Oswaldo Cruz e preservadas pelo método de óleo mineral à temperatura ambiente, no

período de 1923 a 1992, apenas 18 culturas (26%) continuaram viáveis (SILVA et al.,

1994).

Lastra et al. (2002) testaram a viabilidade de nove espécies de fungos

entomopatogênicos armazenados em água deionizada, óleo mineral, sílica gel e

ultracongelamento a -20 e -80ºC. Paecilomyces fumosoroseus apresentou os melhores

resultados, estando viável após 18 meses de preservação em água deionizada, óleo

mineral e em ultracongelamento a -80ºC.


7

Bezerra et al. (2006) avaliaram 20 culturas de Coccidioides immitis preservadas

sob óleo mineral na Coleção de Culturas do Instituto Oswaldo Cruz e apenas cinco

foram viáveis, mostrando que o método de preservação não foi adequado.

Estudos realizados por Braz et al. (2009) avaliaram a viabilidade de 31 culturas

de Acremonium preservadas sob óleo mineral na Micoteca URM, 26 (83,9%)

mantiveram-se viáveis e 24 (92,3%) foram autenticadas taxonomicamente.

Os métodos de preservação em água destilada esterilizada e óleo mineral podem

manter os fungos vivos por longos períodos de tempo, mas alguns pesquisadores têm

observado que as alterações morfológicas e fisiológicas têm acorrido de acordo com o

tempo de preservação (KITAMOTO et al., 2002).

A criopreservação tem sido considerada como a melhor técnica de preservação e

amplamente aplicável para os fungos filamentosos (SILVA et al. 2004a; HOMOLKA et

al. 2006, 2007a, b). As principais vantagens deste método são que as características

genotípicas e fenotípicas são preservadas e a difícil contaminação. No entanto, é um

método muito caro e o armazenamento das culturas deve ser feito em sala bem

ventilada, devido à constante evaporação do gás nitrogênio, fato que pode sufocar os

trabalhadores (VOYRON et al., 2009).

A preservação por liofilização foi muito utilizada com culturas de fungos por

Raper e Alexander (1945). O longo período de preservação é a principal vantagem deste

método, além de que as culturas podem ser armazenadas em lugar pequeno, não

necessitam de manutenção e podem ser enviadas sem requisitos especiais. A liofilização

é um método comumente usado para preservar culturas de fungos (VOYRON et al.,

2009).

O método de preservação de fungos em solo esterilizado, descrito por

Bakerspigel (1953, 1954) tem sido útil na preservação de espécies de Fusarium, porém

Windels et al. (1993) descreveram que o armazenamento no solo acarreta um risco de

mutação, podendo resultar em perda de caracteres morfológicos e, por vezes,

patogenicidade.

Com o desenvolvimento biotecnológico, várias técnicas de preservação foram

criadas (NAKASONE et al., 2004), porém o método a ser utilizado deve ser adequado

para as espécies de fungos e o acompanhamento periódico deve ser feito verificando sua

autenticação taxonômica (WINDELS et al., 1993; BEZERRA et al., 2006). Porém,

devem-se considerar fatores adicionais como simplicidade, viabilidade e custo do

método (SMITH; ONIONS, 1994; NAKASONE et al., 2004).


8

2.3. TAXONOMIA DO GRUPO Aspergillus niger

A taxonomia clássica do gênero Aspergillus baseia-se nas características

morfológicas, fisiológicas e reprodutoras observadas nos cultivos em meio seletivos

conforme literatura especializada (RAPER; FENNELL, 1965; KLICH, 2002).

A identificação de fungos pertencentes ao Grupo Aspergillus niger constitui-se

em uma das mais complexas do gênero Aspergillus, tendo como principais

características, conídios de coloração marrom-escuro a negros, conidióforo hialino ou

levemente pigmentado próximo ao ápice, esterigma uniseriado (apresentam apenas

fiálides) ou biseriado (apresentam fiálides e métulas) e vesículas globosa. Essas

características são comparadas com chave de identificação recomendadas por Raper e

Fennell (1965) e Klich (2002).

Em 1965, Raper e Fennell publicaram um manual de classificação formado por

12 espécies e duas variedades dentro do que denominaram de Grupo Aspergillus niger

(A. aculeatus, A. awamori, A. carbonarius, A. ellipticus, A. ficuum, A. heteromorphus,

A. japonicus, A. niger, A. phoenicis, A. pulverulentus, A. tubingensis, A. foetidus, A.

foetidus var. acidus e A. foetidus var. pallidus).

Al-Musallam (1980) revisou a taxonomia deste grupo de fungos usando análise

de agrupamento envolvendo parâmetros morfológicos e culturais e considerou apenas

cinco espécies para os “Aspergillus negros” (A. carbonarius, A. ellipticus, A.

helicothrix, A. heteromorphus e A. japonicus) e um “agregado Aspergillus niger”,

constituído de duas espécies, A. foetidus e A. niger, este último composto por seis

variedades e duas formas. No manual de Klich e Pitt (1988) foram aceitas as mudanças

propostas por Al-Musallam (1980).

Kozakiewicz (1989) baseado na ornamentação dos conídios, mediante técnica de

microscopia eletrônica de varredura (SEM), propôs uma nova classificação para as

espécies pertencentes aos “Aspergillus negros”, definindo dois tipos de ornamentação

dos esporos: i) verrucoso, a que pertenciam os esporos do “agregado A. niger” (A.

acidus, A. citricus e A. niger) e A. fonsecaeus; ii) equinulado, a que pertenciam os

esporos de A. carbonarius, A. ellipticus, A. helicotrix, A. hetermorphus e A. japonicus.

Nessa classificação, Kozakiewicz (1989) distinguiu cinco variedades de A. niger e uma

de A. citricus.

Em um recente manual de taxonomia de Aspergillus, Klich (2002), descreve

cinco espécies pertencentes aos “Aspergillus negros” (A. awamori, A. carbonarius, A.


9

foetidus, A. japonicus e A. niger) e menciona que o “status” taxonômico de A. aculeatus

está em discussão.

Em todas as classificações propostas para este grupo, a delimitação de alguns

taxa é problemática, pelo fato de serem distinguidos por diferenças relativamente

pequenas em caracteres variáveis, que tornam difícil a classificação levando-se em

consideração apenas caracteres morfológicos. Além disso, a variabilidade

intraespecífica dificulta o discernimento da variabilidade interespecífica, de maneira que

variedades e espécies são às vezes confundidas. Os taxa inclusos no chamado “agregado

niger” também são extremamente difíceis de serem distinguidos através de caracteres

morfológicos. As diferenças entre as espécies e variedades descritas nas classificações

propostas são extremamente sutis e o número de taxa proposto pelos diferentes autores

para o “agregado niger” é variável (ABARCA et al., 2004).

A taxonomia molecular tem importância fundamental como auxiliar na

taxonomia clássica, de forma que o uso combinado de diferentes ferramentas de

identificação fornece uma classificação mais precisa e confiável (HSIEH et al. 2005;

TRIEBEL et al. 2005 ; VARGA et al. 2007). Foi a partir da década de 90 que deu início

aos estudos moleculares baseados em PCR (Reação em Cadeia da DNA Polimerase),

estudos esse que estão cada vez mais contribuindo para tornar mais clara a complexa

taxonomia desses fungos (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998; FUNGARO, 2000).

A. carbonarius é a espécie mais distinta dos membros do Grupo Aspergillus

niger, sendo facilmente reconhecida através do tamanho dos conídios que é maior em

relação às demais espécies deste grupo. Os conídios possuem de 7-9 µm de diâmetro

(KLICK; PITT, 1988) e são multinucleados, apresentando de 5 a 12 núcleos (KEVEI et

al., 1996). A análise de RFLP (Polimorfismo de Tamanho de Fragmentos de Restrição)

do rDNA distingue claramente A. carbonarius das outras espécies da secção

(PARENICOVÁ et al., 2000; VARGA et al., 2000; PARENICOVÁ et al., 2001).

Segundo Parenicová et al. (2000) esta espécie pode ser distinguida facilmente de outras

espécies do grupo através de seqüências de nucleotídeos do rDNA, uma vez que mais de

18 diferenças no conteúdo de bases separa A. carbonarius das outras espécies do Grupo

Aspergillus niger.

Analisando fungos do “agregado niger” através de perfis de RFLP, Varga et al.

(1994) confirmaram os perfis encontrados pelos dois autores mencionados acima e

descreveram um terceiro perfil. Este último perfil foi encontrado para seis linhagens

isoladas de solos brasileiros e poderia ser uma variedade de A. niger ou uma nova


10

espécie do “agregado niger”. Provisoriamente, estas linhagens foram denominadas A.

brasiliensis.

Parenicová et al. (1997) ao estudarem 27 linhagens do “agregado niger”,

descreveram um novo perfil de RFLP da região ITS (Espaçador Interno Transcrito) do

rDNA obtido com PstI-SalI que está representando a linhagem tipo de A. foetidus.

Consequentemente propuseram uma nova subdivisão para o “agregado niger” em 3 taxa

morfologicamente idênticos: A. foetidus, A. niger e A. tubingensis. Em trabalho

posterior, Parenicová et al. (2001) propuseram a divisão do “agregado niger” em quatro

espécies morfologicamente idênticas, denominadas A. brasiliensis, A. foetidus, A. niger

e A. tubingensis.

De acordo com Abarca et al. (2004) a análise de seqüências de nucleotídeos do

rDNA das espécies propostas para o “agregado niger”, mostra um número muito

pequeno de variações pontuais. Apenas três nucleotídeos diferenciam A. niger de A.

tubingensis. Dois nucleotídeos diferenciam A. tubingensis de A. foetidus, enquanto A.

foetidus e A. niger são diferenciados por cinco nucleotídeos nas regiões ITS.

A. ellipticus, A. helicothrix e A. heteromorphus são espécies biseriadas e

incomuns aceitas por Al-Mussallam (1980). Em um estudo realizado por Someren et al.

(1991) A. helicothrix foi considerado um mutante de A. ellipticus. Através da análise da

sequência de nucleotídeos das regiões ITS demonstrou-se que A. ellipticus e A.

heteromorphus são altamente relacionados geneticamente, uma vez que somente seis

nucleotídeos separam estas duas espécies.

Através de análises filogenéticas utilizando-se de dados moleculares e apoiando-

se em dados morfológicos, Varga et al. (2003) sugeriram que ao Grupo Aspergillus

niger pertencem as seguintes espécies: A. heteromorphus, A. ellipticus, A. carbonarius,

A. japonicus, A. aculeatus, A. niger, A. tubingensis, A. foetidus e A. brasiliensis. As

quatro últimas são morfologicamente indistinguíveis e, portanto, pertencem ao

denominado “agregado niger”. As espécies A. awamori, A. usamii, A. phoenicis e A.

ficuum foram reduzidas a sinônimos, das espécies A. niger, A. tubingensis, A.

brasiliensis e A. foetidus, respectivamente. A. helicothrix foi desconsiderado como

espécie após demonstração que se tratava de um mutante de A. ellipticus.

Frente ao exposto, conclui-se que embora um número significativo de trabalhos

relacionados ao Grupo Aspergillus niger tenham sido realizados, a taxonomia deste

grupo está longe de ser totalmente esclarecida.


11

2.4. SUBSTÂNCIAS PÉCTICAS

As substâncias pécticas são macromoléculas glicosídicas de alto peso molecular

que formam o maior componente da parede celular e da lamela média de vegetais

(Figura 1). São um grupo bastante heterogêneo de polissacarídeos com diferentes

massas moleculares e graus de esterificação (ALKORTA et al., 1998). Quimicamente,

as substâncias pécticas são complexos coloidais de polissacarídeos ácidos, compostos

de resíduos de ácido galacturônico unidos por ligações α-1,4. As cadeias laterais da

molécula de pectina são compostas de L-ramnose, arabinose, galactose e xilose. Os

grupos carboxílicos dos ácidos galacturônicos são parcialmente esterificados por grupos

metil éster e parcial ou completamente neutralizados pelo sódio, potássio ou íons de

amônio (UENOJO; PASTORE, 2007).

(Fonte: LODISH et al., 2000).

Figura 1: Representação esquemática da parede celular de vegetais.

Segundo a Sociedade Americana de Química (American Chemical Society) as

substâncias pécticas são classificadas em quatro tipos:

(I) Protopectinas são insolúveis em água e estão presentes nos tecidos vegetais

intactos. Compostas por unidades de ácido galacturônico ligadas ao cálcio por ligações


12

iônicas de caráter acentuadamente forte e em condições de hidrólise restrita produzem

ácidos pectínicos ou pectina (JAYANI et al., 2005).

(II) Ácido péctico é um polímero solúvel composto de ácido poligalacturônico onde os

grupos carboxilas estão em pequenas quantidades metoxilados por grupos metil éster

(KASHYAP et al., 2001).

(III) Ácido pectínico é um grupo de compostos contendo ácido poligalacturônico com

um número mais que pequeno de grupos carboxilas metoxilados em sua estrutura e em

condições adequadas são capazes de formar géis com açúcares e ácidos (KASHYAP et

al., 2001).

(IV) Pectina designa ácidos pectínicos solúveis em água no qual, pelo menos, 75% dos

grupos carboxílicos das unidades de ácido poligalacturônico são esterificados com

metanol. Apresentam grau de neutralização capaz de formar gel com açúcares e ácidos

em condições adequadas (UENOJO; PASTORE, 2007; JAYANI et al., 2005). Consiste

em uma estrutura de ligações axiais de unidades de ácido α-1,4-D-galacturônico e

contêm moléculas de L-ramnose, arabinose, galactose e xilose como correntes laterais

(LANG; DÖRNENBURG, 2000).

Em frutos não maduros, a protopectina complexa-se com a celulose, conferindo

rigidez à célula. Com o amadurecimento do fruto, sua estrutura é alterada, pela

solubilização gradativa do vegetal resultando no amolecimento do tecido vegetal. Essa

alteração se dá pela ação de enzimas ativas presentes no próprio vegetal (KASHYAP et

al., 2001). A pectina é parte importante da biomassa dos frutos, constituindo de 4-30%

da casca de frutas cítricas (KAUR et al., 2004).

Durante a extração de suco, as substâncias pécticas são responsáveis pela

consistência e turbidez dos sucos de fruta. Sua presença causa um aumento considerável

na viscosidade do suco dificultando a sua filtração (FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et al.,

2004). Porém nas indústrias de sucos e de vinhos, isso torna-se um problema,

dificultando as etapas de clarificação em vinhos e extração de sucos de frutas, pois a

turvação dificilmente pode ser removida apenas por filtração devido à grande

quantidade de partículas em suspensão, diminuindo assim, o rendimento da extração de

sucos. Quando tratados previamente por enzimas pectinolíticas, resulta na degradação

da pectina e outros componentes de alto peso molecular, diminuindo a viscosidade e

aumentando o rendimento dos sucos ocasionando uma aparência cristalina no produto

final e reduzindo em até 50% o tempo de filtração (JAYANI et al., 2005).


13

2.5. ENZIMAS PECTINOLÍTICAS

As enzimas pectinolíticas, ou pectinases são enzimas capazes de reconhecer

ligações glicosídicas do tipo α-1,4 entre monômeros do ácido galacturônico ou seu

derivado metoxilado. Essas enzimas são produzidas em diferentes combinações pelas

plantas e por microrganismos como fungos e bactérias (DA SILVA et al., 2005). Em

escala industrial os fungos filamentos são preferidos, pois cerca de 90% das enzimas

produzidas são extracelulares (BLANDINO et al., 2001).

Entre as enzimas produzidas por fungos, as pectinases estão associadas com a

degradação das substâncias pécticas presentes na parede celular vegetal. Este processo

degradativo possui papel importante nas indústrias de alimentos, como sucos de frutas,

vinhos, no enriquecimento protéico de sucos naturais e na produção de alimentos

infantis (DARTORA et al., 2002), na fermentação de café e chá (JAYANI et al., 2005),

na extração de óleos vegetais (KASHYAP et al., 2001); na indústria têxtil, essas para a

maceração do linho e tratamento de fibras têxteis brutas (HOONDAL et al., 2000;

BLANDINO et al., 2001) e na indústria de papel e celulose (JAYANI et al., 2005).

Outras aplicações de pectinases incluem redução de amargor excessivo em cascas de

frutas cítricas, restauração do aroma perdido durante secagem, melhora na firmeza de

pêssego e picles processados, além de outras aplicações (BHAT, 2000; UENOJO;

PASTORE, 2007).

A síntese dessas enzimas sofre influência dos componentes do meio de cultura,

particularmente da fonte de carbono, presença de indutores como a pectina e derivados

(GUMMADI; PANDA, 2003); e das condições de cultivo, pH, temperatura, aeração,

agitação e tempo de incubação (SOUZA et al., 2003).

De acordo com o mecanismo de ação as pectinases são classificadas em três

tipos (JAYANI et al., 2005):

(I) Protopectinases: degradam a protopectina insolúvel dando origem a pectina solúvel;

(II) Pectina esterases - desesterificante ou desmetoxilante: catalisam a desesterificação

da pectina pela remoção dos grupos metil éster das substâncias pécticas, dando origem

ao ácido péctico;

(III) Despolimerases - incluem as enzimas hidrolíticas e as liases: catalisam a clivagem

das ligações glicosídicas α-1,4 entre os monômeros do ácido D-galacturônico das

substâncias pécticas.


14

Estas enzimas foram classificadas e nomeadas de acordo com a Enzyme Comission

(EC), segundo as recomendações da IUPAC-IUB (IUPAC - Union of Pure and Applied

Chemistry; IUB - International Union of Biochemistry) (Tabela 1).

Tabela 1: Classificação das enzimas pécticas.

(Fonte: UENOJO; PASTORE, 2007).

2.5.1. PROTOPECTINASES

Estas enzimas solubilizam a protopectina em pectina solúvel altamente

polimerizada (KASHYAP et al., 2001). São classificadas em dois tipos, levando em

consideração o mecanismo de reação, onde o tipo A (PPase-A) reage com o sítio

interno, isto é, com a região do ácido poligalacturônico da protopectina e, o tipo B

(PPase-B) que reage com o sítio externo, ou seja, com as cadeias de polissacarídeos que

podem estar conectadas às cadeias de ácido poligalacturônico, constituintes da parede

celular (JAYANI et al., 2005).

2.5.2. ENZIMAS DESMETOXILANTES OU DESESTERIFICANTES

Pectina esterase (PE), também conhecida como pectinametil hidrolase, catalisa a

desesterificação do grupo metil da pectina, liberando metanol e convertendo a pectina

em pectato (polímero não esterificado). Age preferencialmente no grupo metil éster da

unidade de galacturonato próxima a uma unidade não esterificada (KASHYAP et al.,

2001), apresenta valores de pH ótimo variando de 4 a 8 e temperatura ótima de 40ºC a

50°C (JAYANI et al., 2005). A PE está presente em praticamente todas as preparações


15

enzimáticas comercializadas, podendo ser utilizada para proteger e melhorar a textura e

firmeza de várias frutas processadas, bem como na extração e clarificação de sucos de

frutas (UENOJO; PASTORE, 2007).

2.5.3. ENZIMAS DESPOLIMERIZANTES

As enzimas despolimerizantes são classificadas de acordo com a clivagem

hidrolítica (hidrolases) ou transeliminativa (liases) das ligações glicosídicas;

mecanismos endo- de forma randômica ou exo- a partir do final da molécula de ação e

preferência por ácido péctico ou pectina como substrato. Envolvem as hidrolases que

catalisam a hidrólise de ligações α-1,4, e as liases que catalisam a β-eliminação

(ALKORTA et al., 1998; UENOJO; PASTORE, 2007).

2.5.3.1. HIDROLASES

As hidrolases incluem as polimetilgalacturonases e as poligalacturonases. As

polimetilgalacturonases (PMG) hidrolisam as ligações glicosídicas α-1,4 de

polimetilgalacturonatos (RIZZATTO, 1999). Apesar da PMG ser citada na literatura,

sua existência é questionada por alguns autores (SAKAI et al., 1993; RIZZATTO,

1999).

As poligalacturonases (PG) catalisam a clivagem hidrolítica das ligações

glicosídicas α-1,4 entre dois resíduos de ácido galacturônico (MUTLU et al., 1999).

Elas são as enzimas mais bem estudadas dentro do complexo pectinolítico (JAYANI et

al., 2005). As poligalacturonases fúngicas são úteis pela alta atividade enzimática e

possuem pH ótimo de atividade na região levemente ácida e temperatura ótima entre 30

e 50°C (ZHENG; SHETTY, 2000; UENOJO; PASTORE, 2007).

2.5.3.2. LIASES

As liases ou transeliminases rompem ligações glicosídicas resultando em

galacturonídeos com uma ligação insaturada entre os carbonos 4 e 5 do final não redutor

do ácido galacturônico formado (JAYANI et al., 2005) e incluem as pectina liases e as

pectato liases (UENOJO; PASTORE, 2007).


16

A pectina liase (polimetilgalacturonato liase, PMGL) quebra as ligações por

transeliminação do hidrogênio dos carbonos das posições 4 e 5 do substrato (pectina)

(KARAM; BELARBI, 1995) de modo endo- ou exo- (KASHYAP et al., 2001;

UENOJO; PASTORE, 2007). O pH ótimo é em torno de 5,5 (MAYANS et al., 1997) e

temperatura ótima entre 40 e 50°C (JAYANI et al., 2005).

A pectato liase (poligalacturonato liase, PGL) catalisa a clivagem de ligações α-

1,4 de ácido péctico de modo endo- ou exo- por transeliminação (KASHYAP et al.,

2001) e requer Ca2+ para atividade (MAYANS et al., 1997). Possui pH ótimo na região

alcalina, entre 7,5 e 10 e temperatura ótima entre 40 e 50°C (MAYANS et al., 1997;

JAYANI et al., 2005).

2.6. APLICAÇÃO DAS PECTINASES

Há muitos anos, as pectinases têm sido utilizadas em vários processos

industriais, como na indústria têxtil, no processamento de fibras vegetais; na indústria

de alimentos, na fermentação do chá e café; na extração de petróleo, tratamento de

águas residuais, entre outros (JAYANI et al., 2005).

2.6.1. INDÚSTRIAS DE SUCOS DE FRUTAS

As substâncias pécticas são responsáveis pela consistência e turbidez dos sucos

de frutas, e sua presença causa aumento considerável na viscosidade e turbidez do suco,

dificultando o processo de filtração (FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et al., 2004) .

A maior aplicação industrial das pectinases está na extração do suco de frutas e

clarificação. A adição de enzimas pectinolíticas nos purês de frutas e vegetais resulta na

degradação da pectina e outros componentes de alto peso molecular (SARIOGLU et al.,

2001; DE GREGORIO et al., 2002) diminuindo a viscosidade e aumentando o

rendimento dos sucos ocasionando aparência cristalina do produto final e reduzindo em

até 50% o tempo de filtração (SOUZA et al., 2003; JAYANI et al., 2005). O tratamento

de polpas de frutas com enzimas pectinolíticas mostrou aumento no rendimento de

extração de sucos de banana, uvas e maçãs (KAUR et al., 2004).

A combinação de pectinases, celulases e hemicelulases, chamadas coletivamente

de enzimas de maceração, são usadas na extração e clarificação de sucos de frutas e

vegetais. As enzimas de maceração aumentam o rendimento da extração e melhoram o


17

processamento, sem aumento de custos. Essas enzimas são utilizadas após o corte da

matéria-prima, para macerar a polpa até a liquefação parcial ou total da fruta,

diminuindo o tempo de processamento e melhorando a extração dos componentes da

fruta (KAUR et al., 2004; DA SILVA et al., 2005).

2.6.2. INDÚSTRIA TÊXTIL

Nas indústrias têxteis as pectinases são utilizadas para degradar a camada de

pectina que recobre as fibras de celulose, liberando-as para o processamento

(KAYSHAP et al., 2001; PICCOLI-VALLE et al., 2001), no tratamento do resíduo

líquido e na degomagem das fibras naturais (KAUR et al., 2004). Pectinases alcalinas

são utilizadas para maceração das fibras vegetais, como linho, cânhamo e juta, e na

biopreparação de algodão (JAYANI et al., 2005).

Em algodão cru, a remoção da pectina, cera e agentes de goma com a utilização

de pectinases em conjunto com amilases, lipases e hemicelulases, em condições

adequadas, substitui o uso da soda cáustica e gera produtos de alta qualidade.

Posteriormente um menor consumo de energia é requerido no tingimento e processo de

tecelagem (SAWADA; UEDA, 2001).

2.6.3. INDÚSTRIA DE VINHO

Pectinases, em conjunto com β-glucanases e hemicelulases, têm sido utilizadas

na produção de vinhos. As vantagens do uso dessas três enzimas são: melhor maceração

da casca e aumento da extração de pigmentos, facilitando a clarificação e filtração do

mosto, aumenta a qualidade e estabilidade do vinho (FÉRNANDEZ et al., 2000;

TAKAYANAGI et al., 2001).

A adição de pectinases durante o esmagamento das uvas melhora a extração do

suco, reduzido o tempo de clarificação e aumentando o conteúdo de terpenos no vinho.

As preparações comerciais de pectinases com alta atividade de pectina liase e baixa

atividade de pectina esterase são preferidas por minimizarem a liberação de metanol dos

ácidos poligalacturônicos metilados durante a produção do vinho (BHAT, 2000).

Enzimas pectinolíticas adicionadas durante a maceração das uvas para produção de

vinho tinto resultam no melhoramento dos atributos sensoriais, tais como cor e turbidez,

quando comparadas com vinhos não tratados (JAYANI et al., 2005).


18

2.6.4. INDÚSTRIA DE PAPEL E CELULOSE

Durante a fabricação de papel, as pectinases despolimerizam as substâncias

pécticas e, posteriormente, reduzem a demanda catiônica das soluções de pectina e do

filtrado resultante do branqueamento com peróxido de hidrogênio (JAYANI et al.,

2005; UENOJO; PASTORE, 2007)

2.6.5. ALIMENTAÇÃO ANIMAL

As pectinases são usadas em conjunto com outras enzimas para reduzir a

viscosidade da ração animal, na tentativa de aumentar a absorção e biodisponibilizar

nutrientes através da hidrólise das fibras não biodegradáveis e dos nutrientes bloqueados

pelas fibras (HOONDAL et al., 2000; JAYANI et al., 2005).

2.7. FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO (FES)

Os setores agroindustriais e de alimentos produzem grandes quantidades de

resíduos, tanto líquidos como sólidos. Esses resíduos podem apresentar elevados

problemas de disposição final e potencial poluente. Ao contrário do que acontecia no

passado, quando resíduos eram dispostos em aterros sanitários ou empregados sem

tratamento para ração animal ou adubo, atualmente, conceitos de minimização,

recuperação, aproveitamento de subprodutos e bioconversão de resíduos são cada vez

mais difundidos e necessários para as cadeias agroindustriais (LAUFENBERG et al.,

2003). Desta forma a FES vem desempenhando papel de destaque no aproveitamento de

resíduos sólidos, pois, em virtude do crescimento microbiano, ocorre síntese de diversos

compostos, dos quais muitos apresentam grande interesse para a indústria, além de

elevado valor comercial (GONZÁLEZ et al., 2003).

O termo fermentação em estado sólido, ou fermentação semi-sólida, ou em meio

semi-sólido aplica-se ao processo de crescimento de microrganismos sobre substratos

sólidos sem a presença de água livre. A água presente nesses sistemas encontra-se

ligada à fase sólida, formando uma fina camada na superfície das partículas

(RAIMBAULT, 1998), apresentando nível de atividade de água que possa garantir o


19

crescimento e metabolismo dos microrganismos, mas não exceda à máxima capacidade

de absorção de água pela matriz sólida (PINTO et al., 2006).

Pandey (2002) definiu a FES como sendo um processo fermentativo que ocorre

na ausência ou próximo da ausência de água livre, usando um sólido natural como

substrato ou suporte inerte. A água livre, indispensável ao crescimento dos

microrganismos, é adsorvida num suporte sólido ou complexada no interior de uma

matriz sólida (SOCCOL, 1992).

Os principais microrganismos cultivados nos processos no estado sólido são

fungos filamentosos. Os meios sólidos utilizados na FES se assemelham aos meios

naturais (solos) de desenvolvimento desses fungos (ORIOL, 1987). Além disso, os

fungos filamentosos podem desenvolver-se em umidades muito baixas. O teor de

umidade deve variar entre 12% e 85%, considerando que abaixo do limite mínimo os

microrganismos não se desenvolvem. O limite superior é fixado em função da

capacidade da adsorção de água pelo material utilizado (LONSANE et al., 1985).

Segundo Pandey (1992) a seleção adequada do microrganismo é um dos mais

importantes critérios para FES, pelo fato de que uma cultura de A. niger pode produzir

cerca de vinte tipos diferentes de enzimas, dentre as quais destacam-se as do complexo

pectinolítico.

O material sólido, utilizado em FES, é geralmente fragmentado e de natureza

granular ou fibrosa que permite a retenção de água por higroscopia ou capilaridade, e

que possuem um determinado teor de umidade. A quantidade de água presente varia

consideravelmente de acordo com o material utilizado (SOCCOL, 1992).

O uso da FES ou da fermentação submersa (FSm) deve ser estudado de acordo

com o microrganismo a ser utilizado e o produto que se deseja obter (LONSANE et al.,

1985). Gervais e Molin (2003) relataram que a principal diferença entre a FSm e FES

está na capacidade de mistura dos sistemas. A FSm é uma reação de mistura perfeita

onde, em teoria, cada parte do reator contém, ao mesmo tempo, a mesma quantidade de

microrganismos e nutrientes. No entanto, na FES encontra-se um sistema de alta

viscosidade, sendo que, para se chegar à homogeneidade, seria necessária excessiva

agitação, o que levaria a ruptura celular. Dessa forma, o sistema de cultivo em estado

sólido caracteriza-se por serem meios heterogêneos, em termos e concentração do soluto

(PALMA, 2003).

Muitas vantagens são obtidas pelo uso da FES devido à simplicidade de meio de

cultura; possibilidade de emprego de resíduos abundantes e de substratos baratos como


20

matérias-primas, especialmente em países como o Brasil; crescimento celular ocorre em

condições mais próximas aos dos habitats naturais; redução das contaminações

resultantes da baixa umidade do meio fermentativo; fácil aeração devido à porosidade

do material; utilização direta dos sólidos fermentados; maiores rendimentos e

concentração mais alta do produto desejado e baixa demanda de energia e de água.

Desvantagens também são apresentadas por esse processo como a dificuldade de

remoção do calor gerado pelo metabolismo microbiano; difícil regulação dos

parâmetros de cultura (pH e umidade); pré-tratamento dos suportes (umidificação,

homogeneização, dispersão, tratamento térmico e enzimático) e alta taxa de inoculação

(quando não se utiliza a microflora natural) (SPIER 2005; SANTOS, 2007).

No entanto, existe o consenso da necessidade de investigação contínua dos

fatores relacionados à FES para permitir que o pleno potencial desta tecnologia seja

utilizado. Os substratos sólidos são ricos em fontes de carbono, nitrogênio e sais

minerais, podendo ser utilizados em processos de FES para a obtenção de biopesticidas,

enzimas, ácidos orgânicos, fungos comestíveis e metabólitos secundários (SOCCOL,

1992, VANDENBERGHE et al., 2000).

Em escala comercial, uma das aplicações da FES é a produção de ácido cítrico a

partir de farelo de trigo. Esse processo, conhecido por “Koji”, representa um quinto de

todo o citrato produzido anualmente no Japão (PANDEY et al., 2001).

2.8. UTILIZAÇÃO DE Aspergillus niger NA PRODUÇÃO DE PECTINASES

Aspergillus é o gênero mais comum entre os fungos filamentos utilizados na

FES. Muitas espécies de Aspergillus são utilizadas para obtenção de produtos com

maior valor agregado, destacando-se as enzimas (ROSA et al., 2002). Dentre as espécies

mais conhecidas encontram-se o A. clavatus, A. flavus, A. fumigatus, A. glaucus, A.

nidulans, A. niger, A. oryzae, A. ustus e A. versicolor (UENOJO; PASTORE, 2007).

Vários gêneros de fungos são conhecidos como produtores de pectinases. Entre

as espécies de Aspergillus, A. niger é classificada como GRAS (Generally Recognized

as Safe) pelo FDA (Food and Drug Administration), órgão do governo dos Estados

Unidos responsável pelo controle dos alimentos e medicamentos, permitindo assim sua

aceitabilidade na indústria de alimentos (GUMMADI; PANDA, 2003). A. niger é

utilizado em aplicações industriais, pois, além de ser seguro quanto à toxicidade,

apresentam características de ótimos fermentadores, altos níveis de secreção de


21

proteínas, produção de diversas enzimas, em particular pectinases, de grande valor para

a indústria de alimentos (VRIES; VISSER, 2001). Um fator que pode justificar o uso de

pectinases de origem fúngica na indústria de sucos é o fato desses fungos possuírem o

pH de atuação próximo ao pH da maioria dos sucos de frutas, que varia de 3,5 a 5,5

(MOYO et al., 2003).

As pectinases produzidas por fungos apresentam características importantes para

aplicação em bioprocessos, como estabilidade ao pH e à temperatura (MARTIN et al.,

2004).

A. niger apresenta algumas vantagens como a facilidade de manipulação, sua

habilidade de fermentar uma grande variedade de matérias-primas complexas de baixo

custo e produzir rendimentos elevados de bioprodutos. Apesar de existir uma grande

variedade de fungos produtores de pectinases, Torres e colaboradores (2005), afirmam

que as preparações comerciais dessas enzimas, utilizadas na indústria de alimentos, são

produzidas principalmente por A. niger.

Maior produção de pectinases por Aspergillus foi observada na FES quando

comparada com FS (SOLIS-PEREIRA et al., 1993; MALDONADO; SAAD, 1998;).

Acunã-Arguelles e colaboradores (1995) relataram que A. niger produz diferentes

respostas fisiológicas, dependendo da técnica de fermentação utilizada, e que há

vantagens para a produção pectinases utilizando a FES quando comparado com a FS.

As pectinases de origem microbiana são responsáveis por 25% do mercado

mundial de enzimas, sendo grande parte utilizada pela indústria de alimentos (JAYANI

et al., 2005).

2.9. SUBSTRATOS UTILIZADOS NA FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO

(FES)

Os substratos utilizados na FES são, em geral, resíduos ou subprodutos da

agroindústria (PANDEY, 2003). Farelos, cascas, bagaços e outros componentes

vegetais são materiais considerados viáveis para a biotransformação, como por

exemplo, bagaço de laranja, farelo de trigo e de arroz, farelo de soja, polpa de maçã e

café, quirela de milho, bagaço de cana e de abacaxi, casca de maracujá, pedúnculo de

caju, entre outros. Esses resíduos são recursos naturais renováveis e produzidos em

grandes quantidades, o que, algumas vezes, faz com que se tornem um problema

ambiental (NITURE; PANT, 2004).


22

A estrutura desses materiais tem como seus principais componentes celulose,

hemicelulose, lignina, amido, pectina e proteínas, o que os caracteriza como materiais

extremamente heterogêneos, e que servem tanto como fonte de carbono e energia

quanto de suporte para o crescimento microbiano (PANDEY, 2003).

O substrato deve ter algumas características que possibilitem o maior

rendimento do processo, entre elas podemos citar a porosidade, o tamanho e o formato

das partículas possibilitando o alto grau de acessibilidade do microrganismo a todo o

meio (DEL BIANCHI et al., 2001). As partículas de tamanho reduzido oferecem maior

área superficial ao ataque dos microrganismos, mas ao mesmo tempo, tendem a

compactar facilmente, causando dificuldade de respiração e aeração no sistema.

Partículas maiores, por sua vez, promovem maior espaço interpartículas, embora

possuam área superficial menor (PANDEY et al., 2001). Quanto à porosidade, a

principal qualidade desta característica é a capacidade de absorção de água, que facilita

o transporte de enzimas e metabólitos por entre o meio e os microrganismos (SANTOS

2007).

2.9.1. PALMA FORRAGEIRA

Opuntia é um gênero botânico da família Cactaceae, que cresce em diferentes

regiões do mundo devido a sua forte capacidade de adaptação. A espécie mais comum e

estudada deste gênero é Opuntia ficus indica (L.) Miller, provavelmente nativa do

México (CASTROVIEJO et al., 1990; TEIXEIRA et al., 2000) e conhecida como palma

forrageira (LIRA et al., 1998).

No Brasil, a palma forrageira foi introduzida no final do século XIX e sua área

de cultivo no Nordeste brasileiro é de mais de 400 mil hectares, sendo a maior parte em

Pernambuco e Alagoas, onde a principal espécie cultivada é a O. ficus indica (LIRA et

al., 1998).

Em países como Itália, Espanha, México, Chile, Brasil e Argentina a palma

forrageira é cultivada para fins comerciais, principalmente para alimentação e forragem

(SEPÚLVEDA; SÁENZ, 1990). Mundialmente, a palma forrageira é utilizada na

alimentação humana (fonte de vitaminas), fabricação de vinagre, óleos de cozinha,

arraçoamento animal, como fonte de energia, na medicina, na indústria de cosméticos,

na proteção e conservação do solo, na fabricação de adesivos, colas, fibras para

artesanato, papel, corantes, mucilagem, antitranspirante e ornamentação (SÁENZ, 1985;


23

SEPÚLVEDA; SÁENZ, 1990; TEIXEIRA et al., 2000; BARBERA, 2001). A palma é

uma fonte de renda para os pequenos agricultores e uma alternativa para a indústria na

elaboração de produtos processados (GUEDES, 2002).

A palma é uma excelente fonte de carboidratos não fibrosos, (WANDERLEY et

al., 2002) e nutrientes digestíveis totais (MELO et al., 2003), além de apresentar altos

teores de pectina (SILVA et al., 1997).

Diversos estudos estão sendo realizados em centros de pesquisa para

aproveitamento da palma na elaboração de diversos produtos para alimentação de

humanos, como também acabar com o preconceito entre potenciais consumidores de

palma, que podem ajudar na difusão de uma culinária delicada e nutritiva, que estão

presentes nos mais finos restaurantes de países como México, Itália e Espanha. O Chile

exporta suco concentrado da fruta da palma e o México exporta o broto em conserva

doce e salgada (GUEDES et al., 2004).

Portanto, o desenvolvimento de tecnologias de processamento da palma que

atendam as exigências dos consumidores é de fundamental importância para a difusão

dos produtos e desencadeando uma potencialidade para o consumo da população dos

grandes centros urbanos (GUEDES, 2002). A grande diversidade de usos e aplicações

da palma forrageira revela a versatilidade dessa espécie vegetal, porém não possui sua

potencialidade explorada plenamente (CHIACCHIO et al., 2006).

Nas regiões semi-áridas do Nordeste brasileiro, a palma forrageira destaca-se

pela capacidade de adaptação e alta produção de matéria seca por unidade de área

(SANTOS et al., 1997). Dessa forma, a palma forrageira pode ser uma fonte alternativa,

disponível em grandes quantidades na região e de menor custo, para a obtenção de

bioprodutos pela FES.

2.9.2. MARACUJÁ

O maracujazeiro é uma planta nativa do Brasil e encontrada em todo o mundo.

Cerca de 530 espécies foram identificadas na família Passifloraceae (CHASSAGNE et

al., 1999). As duas principais espécies comestíveis cultivadas para fins comerciais

efeitos são o maracujá-roxo (Passiflora edulis Sims), tipicamente consumidos frescos,

devido ao seu sabor doce, e o maracujá-amarelo ou "maracujá" (P. edulis f. flavicarpa

Degener), comumente usado para a produção de suco devido ao seu sabor ligeiramente

ácido (YAPO; KOFFI, 2006).


24

Os maiores produtores de maracujá estão localizados na América do Sul, onde o

Brasil, a Colômbia, o Peru e o Equador são os maiores exportadores. No Brasil, a cultura

do maracujá vem crescendo a cada ano, sendo o primeiro produtor mundial, com uma

área plantada de 35.600 hectares, gerando aproximadamente 615 mil toneladas de frutos

em 2006 (IBGE, 2009).

A cadeia produtiva do maracujá estende-se por diversas regiões do Brasil,

principalmente na região Nordeste, com os estados da Bahia, Pernambuco e Alagoas

(IBGE, 2009).

A casca do maracujá é rica em aminoácidos, proteínas e carboidratos, contendo

ainda 10 a 20% de pectina. A pectina do maracujá é constituída de 76 a 78% de ácidos

galacturônicos, 9% do grupo metoxila, galactose e arabinose (MANICA, 1981). O alto

teor de pectina da casca possibilita o aproveitamento da mesma para a obtenção de

produtos de alto valor agregado como as enzimas do complexo pectinolítico,

aumentando assim seu valor comercial (OLIVEIRA et al., 2002).

O maracujá é utilizado na elaboração de vários produtos existentes no mercado,

resultando na produção de grande quantidade de sementes e cascas, as quais

representam mais da metade do peso total do fruto. A produção do suco gera uma

grande quantidade de cascas, acarretando em uma carga substancial ao meio ambiente.

Dessa forma, é necessário encontrar maneiras de aproveitamento deste resíduo

(FERRARI et al., 2004; LIU et al., 2006).

A importância econômica do maracujá está na produção de suco concentrado,

porém outros alimentos são elaborados a partir do fruto, como a polpa para servir de

matéria-prima para elaboração de doces e outras formulações, néctares, refrescos,

concentrados para refrigerantes, xaropes, sorvetes, geléias dentre outros produtos

(MODESTA, 1990).


25

CAPÍTULO I

Viabilidade, autenticação taxonômica e caracterização

de culturas pectinolíticas de Aspergillus niger

preservadas sob óleo mineral na Micoteca URM

M. H. C. Maciel1*; P. N. Herculano1, M. J. S. Fernandes1, M. F. S. Teixeira2, K. A.

Moreira3, C. M. Souza-Motta1

1Departamento de Micologia - Universidade Federal de Pernambuco, Cidade

Universitária - CEP: 50670-420 - Recife- PE- Brasil - Email: [email protected], 2Departamento de Parasitologia - Universidade Federal do Amazonas, 3Unidade

Acadêmica de Garanhuns - Universidade Federal Rural de Pernambuco


26

RESUMO

Microrganismos isolados e identificados, quando preservados por processos adequados

podem ser armazenados por longos períodos, conservando as características genéticas e

propriedades industriais. Existem métodos de preservação que asseguram a viabilidade,

morfologia, fisiologia e genética, com o objetivo de manter a cultura por longo tempo.

Dentre os métodos de preservação de fungos podem ser citados óleo mineral, água

destilada, liofilização, nitrogênio líquido, ultracongelamento a -80°C, sílica gel, solo e

repiques seriados. Aspergillus niger é a espécie mais comumente utilizados fungos para

a produção industrial de enzimas pectinolíticas que hidrolisam substâncias pécticas

presentes nas plantas. Na indústria, as pectinases são utilizadas na clarificação de suco

de fruta, na produção de vinho, na extração de petróleo, degomagem de fibras e

fermentação de chá, café e cacau. Este trabalho teve como objetivo verificar a

viabilidade, autenticar taxonomicamente e caracterizar quanto à capacidade

pectinolítica culturas de A. niger estocadas sob óleo mineral na Micoteca URM. Das 25

culturas reativadas, todas foram viáveis e autenticadas taxonomicamente, apesar do

longo período de estocagem, que variou de 1 a 41 anos, evidenciando a eficiência do

método de preservação utilizado. Entre as 25 culturas testadas quanto à capacidade

pectinolítica, 23 apresentaram halo de degradação ao redor da colônia, evidenciando a

capacidade de degradar pectina. A cultura que apresentou maior halo de degradação foi

URM4645 (18 mm). Com base nos resultados, concluímos que as culturas de A. niger

armazenados em coleções de culturas podem ser uma interessante fonte para produção

de pectinases.

PALAVRAS-CHAVES: Viabilidade, autenticação taxonômica, Aspergillus niger,

pectina cítrica, caracterização pectinolítica.


27

INTRODUÇÃO A taxonomia do Grupo Aspergillus niger tem sido estudada por muitos

pesquisadores e foi recentemente revista com base em critérios morfológicos e

moleculares (ABARCA et al., 2004). A identificação e a caracterização destas espécies,

até a década de noventa, eram feitas levando em consideração apenas as características

morfológicas, tais como: diâmetro, cor e textura das colônias, tamanho e textura dos

conídios e a estrutura do conidióforo (KLICH, 2002).

A manutenção de microrganismos em micotecas é de fundamental importância

para estudos retrospectivos e prospectivos, que enfoquem sua biologia, etiologia e

aspectos epidemiológicos. Entretanto, para uma satisfatória análise fenotípica e

genotípica, a longo prazo, é necessária a escolha adequada do método de preservação

(LIMA; BORBA, 2001). A seleção de métodos apropriados para estocagem de fungos

baseia-se nas características fenotípicas inerentes a cada microrganismo, bem como, no

comportamento de cada espécie frente aos métodos de preservação. Diversas técnicas de

estocagem têm sido relatadas na literatura especializada, porém, nenhuma tem se

mostrado plenamente eficaz, requerendo-se a conjunção de dois ou mais métodos, para

garantir melhor recuperação das culturas (BORBA; RODRIGUES, 2000; CRESPO et

al., 2000; LIMA; BORBA, 2001).

A preservação de fungos é de grande importância para a biotecnologia, para o

estudo da sistemática e da biodiversidade. O método de preservação a ser utilizado deve

ser adequado para as espécies de fungos e o acompanhamento periódico deve ser feito

verificando sua autenticação taxonômica (WINDELS et al., 1993; BEZERRA et al.,

2006). Porém, devem-se considerar fatores adicionais como simplicidade, viabilidade e

custo do método (SMITH; ONIONS, 1994; NAKASONE et al., 2004). O método de

preservação de fungos em óleo mineral foi empregado pela primeira vez por Sherf

(1943) e sua eficácia tem sido relatada em vários estudos para diferentes grupos de

fungos (BUELL et al., 1947; BORBA et al 1992; BORBA; RODRIGUES, 2000).

Estudos realizados por Braz et al. (2009) avaliaram a viabilidade de 31 culturas de

Acremonium preservadas sob óleo mineral na Micoteca URM, 26 mantiveram-se

viáveis e 24 foram autenticadas taxonomicamente.

As substâncias pécticas são macromoléculas glicosídicas de alto peso molecular,

formadoras do maior componente da lamela média das paredes primárias de células de

vegetais superiores (DE GREGORIO et al., 2002), compostas de resíduos de ácido


28

galacturônico unidos por ligações α-1,4, parcialmente esterificados por grupos metil

éster (LIMBERG et al., 2000; KAYSHAP, 2001). Essas substâncias pécticas podem ser

degradadas por enzimas pectinolíticas produzidas naturalmente por plantas, fungos e

bactérias (TSUYUMU et al., 1989; GAINVORS et al., 1994), muito utilizadas nas

indústrias de alimentos para extração e clarificação de sucos de frutas e vegetais, para

aumentar o rendimento e melhorar o processamento sem o aumento de custos (BHAT,

2000). Diversas espécies de microrganismos dos gêneros Bacillus, Erwinia,

Kluyveromyces, Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Pseudomonas, Penicillium e

Fusarium são conhecidos como bons produtores de pectinases (KAYSHAP et al., 2001;

DE GREGORIO et al., 2002). A. niger é a espécie que tem sido utilizada para vários

fins biotecnológicos, incluindo a produção de enzimas, com destaque para as pectinases

(ROSA et al., 2002; GUMMADI; PANDA, 2003).

O objetivo deste trabalho foi verificar a viabilidade, autenticar taxonomicamente

e caracterizar quanto à capacidade pectinolítica culturas de A. niger preservadas sob

óleo mineral na Micoteca URM, do Departamento de Micologia, Universidade Federal

de Pernambuco (UFPE), Recife-PE, Brasil.


29

MATERIAL E MÉTODOS Culturas de fungos

Para a verificação da viabilidade e autenticação taxonômica foram utilizadas 25

culturas de A. niger preservadas sob óleo mineral (SHERF, 1943) estocadas de 1968 a

2008 na Micoteca URM do Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Pernambuco (Tabela 1).

Reativação das culturas

Fragmentos das culturas preservadas foram transferidos para o meio caldo

glicosado contido em tubos de ensaio e mantidos a 28ºC ± 2ºC. Após crescimento, as

culturas foram transferidas para o meio Ágar Extrato de Malte (KLICH, 2002) para

verificar viabilidade, pureza e autenticação taxonômica.

Autenticação taxonômica Para autenticação taxonômica das culturas, foram observadas características

macroscópicas e microscópicas de acordo com Raper e Fenell (1965) e Klich (2002).

Atividade pectinolítica Após sete dias de crescimento das culturas de A. niger em Ágar Extrato de Malte

contido em placas de Petri, discos de 5 mm de diâmetro foram retirados e inoculados

centralmente no meio seletivo, constituído de 1,25 % de solução de pectina cítrica

(Sigma) pH 5,5 em água destilada (autoclavado separadamente), 6,7 g/L de extrato de

levedura, 0,2% de glicose e 1,5% de ágar, autoclavado por 15 minutos a 120°C a 1 atm.

Em seguida as placas foram incubadas em BOD (Biochemical Oxygen Demand) por

quatro dias a 28ºC e, após este período foi adicionada uma solução 0,1% de vermelho

congo por 45 minutos e lavadas com água destilada para visualização do halo de

degradação (UENOJO; PASTORE, 2006). As culturas que apresentaram zonas claras ao

redor das colônias foram consideradas capazes de produzir pectinases e tiveram os halos

medidos com o auxílio de um paquímetro. O experimento foi realizado em triplicata.


30

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Viabilidade e autenticação taxonômica

Todas as culturas utilizadas no trabalho estavam viáveis e foram autenticadas

taxonomicamente por apresentarem estruturas características da espécie, evidenciando a

eficiência do método de preservação sob óleo mineral após longos períodos de

estocagem (Tabela 1). As culturas de A. niger apresentaram colônia marrom escuro a

negra, variando de 3 a 7 cm de diâmetro em meio Ágar Extrato de Malte a 28°C±1°C,

com textura granular para flocosa; cabeça conidial radiada, com conidióforos variando

de 300-3000 µm x 7-20 µm, de parede lisa, hialina para amarelada ou ligeiramente

marrom, especial perto do ápice; vesícula de 20-85 µm de largura, quase esférica;

esterigma biseriado (muito raramente unisseriado), métula cobrindo a superfície inteira

da vesícula, medindo 12-40 µm x 3-6 µm, às vezes com um único septo e fiálides de 7-

10 µm x 3-4 µm; conídio globoso, de 3-5 µm de diâmetro e muito rugoso (Figura 1).

Todas essas características estão de acordo com Raper e Fennell (1965) e Klich (2002).

Corroborando com nossos resultados, Girão et al. (2004) verificaram que dos 48

isolados de Malassezia pachydermatis, 29 apresentaram-se viáveis quando preservados

sob óleo mineral entretanto, os autores utilizaram também solução salina, melhorando a

viabilidade dos isolados devido à capacidade em prevenir a desidratação do meio e

diminuir a atividade metabólica dos fungos estocados.

Lastra et al. (2002) verificaram a viabilidade de nove espécies de fungos

entomopatogênicos armazenados em água deionizada, óleo mineral, sílica gel e

ultracongelamento a -20 e -80ºC. Paecilomyces fumosoroseus apresentou melhor

viabilidade após 18 meses de preservação em água deionizada, óleo mineral e em

ultracongelamento a -80ºC.

Bezerra et al. (2006) obtiveram 20 culturas de Coccidioides immitis preservadas

sob óleo mineral na Coleção de Culturas do Instituto Oswaldo Cruz e apenas cinco

foram viáveis, mostrando que o método de preservação não foi adequado.

Estudos realizados por Braz et al. (2009) avaliaram a viabilidade de 31 culturas

de Acremonium preservadas sob óleo mineral na Micoteca URM, sendo que 26

linhagens mantiveram-se viáveis e 24 foram confirmadas taxonomicamente.

Nakasone et al. (2004) afirmam que culturas de fungos podem ser preservadas

sob óleo mineral por até 32 anos, porém, neste estudo obtivemos período superior com


31

o isolado URM2228 que permanece viável e taxonomicamente autenticado após 41

anos de preservação sob óleo mineral.

Tabela 1 - Viabilidade e autenticação taxonômica de culturas de Aspergillus niger

preservadas sob óleo mineral na Micoteca URM.

N° de Registro* Ano de Preservação

Substrato Viabilidade Autenticação

Taxonômica

URM2228 1968 Secreção de ouvido + + URM2604 1980 Pulmão de ave + + URM3701 1996 Folhedo + + URM3753 1997 Água + + URM3806 1997 Resíduo de cajú + + URM3811 1997 Resíduo de abacaxi + + URM3820 1997 Solo + + URM3856 1997 Resíduo de maracujá + + URM3885 1997 Solo + + URM4452 2002 Solo + + URM4645 2003 Solo + + URM5001 2005 Solo + + URM5117 2005 NC + + URM5149 2005 Água + + URM5162 2005 Argamassa + + URM5207 2007 NC + + URM5437 2007 Água + + URM5438 2007 Água + + URM5439 2007 Escamas ungueais + + URM5555 2007 Alimento + + URM5756 2008 Resíduo de Mamona + + URM5837 2008 Resíduo de Mamona + + URM5838 2008 Resíduo de Mamona + + URM5842 2008 Solo + + URM5853 2008 Solo + +

*Número de acesso na Micoteca URM (Recife, Pernambuco); NC: não consta; +: positivo.


32

Figura 1 - Aspergillus niger URM4645: A) Colônias em Ágar Extrato de Malte com

sete dias de crescimento; B) Célula pé (seta 1), conidióforo (seta 2) e cabeça conidial

(seta 3) (17,7x); C) métulas (seta 4) maiores que as fiálides (seta 5) (47,7x); D) conídio

globoso e rugoso (110x).

Caracterização das culturas de Aspergillus niger quanto à capacidade

de produzir pectinases

Das 25 culturas de A. niger testadas, 23 foram consideradas capazes de produzir

pectinases, sendo evidenciados halos de degradação ao redor das colônias (Figura 2). A

cultura URM3701 foi capaz de produzir pectinases após 13 anos de preservação sob

óleo mineral. As duas culturas mais antigas, URM2228 e URM2604, isoladas de

amostras clínicas e preservadas por 40 e 28 anos, respectivamente, cresceram no meio

seletivo, mas não apresentaram halo de degradação, podendo o substrato de isolamento

e o tempo de preservação terem influenciado na produção das enzimas pectinolíticas.

Entre as 23 culturas, sete apresentaram halo de degradação da pectina abaixo de 10 mm

e 16 apresentaram halos que variaram de 10 a 18 mm de diâmetro. Dentre estas 16, a


33

maioria (11 culturas) foi isolada de substratos derivados de vegetais (6 culturas) e do

solo (5 culturas) (Tabela 2).

Fungos isolados do solo são considerados de alta atividade nos processos de

biodeterioração e biodegradação através da produção de enzimas, contribuindo para

ciclagem de nutrientes e conseqüentemente, para a manutenção dos ecossistemas

(ALLSOPP; SEAL, 1986), o que poderia justificar a capacidade de produzir pectinases

por todas as culturas procedentes do solo, tendo o isolado URM4645 apresentado o

maior diâmetro de halo (18 mm).

Taşkin et al. (2008) avaliaram a capacidade pectinolítica de 262 espécies de

fungos isoladas de solo de campos produtores de uvas, através do diâmetro do halo e da

colônia e selecionaram quatro isolados pertencentes a duas espécies do Grupo

Aspergillus niger: A. aculeatus e A. foetidus var. pallidus. Uenojo e Pastore (2006)

testando 104 microrganismos quanto à atividade pectinolítica, 18 foram consideradas

positivas (ou seja, apresentaram halo de degradação), 81 apresentaram crescimento,

mas não apresentam halo de degradação e cinco microrganismos não apresentaram

crescimento no meio seletivo.

Alguns estudos têm demonstrado que o armazenamento de fungos in vitro por

longos períodos de tempo pode provocar alterações morfológicas (SILVA et al., 1994),

as alterações nos componentes da parede celular (SAN-BLAS et al., 1977), mutações

espontâneas (BRASS et al., 1982) e perda ou atenuação da virulência (BRUMMER et

al., 1990). No entanto, os resultados obtidos nesse trabalho mostraram que a

longevidade e autenticação taxonômica das culturas devem-se a garantia de boas

práticas de armazenamento e do meio de cultura utilizado, o que tende a reduzir a

possibilidade de alterações morfológicas e fisiológicas, tal como o risco de

contaminação.


34

Tabela 2 - Diâmetro de colônia, diâmetro total (colônia mais halo) e diâmetro de halo

(diâmetro total menos o da colônia) das 25 culturas de Aspergillus niger testadas quanto

à capacidade de produzir pectinases.

Nº de Registro* Colônia Colônia + Halo Halo (mm)

URM2228 34 - - URM2604 37 - -

URM3701 33 50 17 URM3753 52 62 10 URM3806 45 59 14 URM3811 62 76 14 URM3820 52 63 11 URM3856 67 73 06 URM3885 50 57 07 URM4452 40 50 10 URM4645 35 53 18 URM5001 57 63 06 URM5117 47 55 08 URM5149 55 63 08 URM5162 68 76 08 URM5207 64 74 10 URM5437 61 72 11 URM5438 60 70 10 URM5439 56 63 07 URM5555 64 75 11 URM5756 47 58 11 URM5837 54 65 11 URM5838 60 70 10 URM5842 48 60 12 URM5853 52 64 12

*Número de acesso na Coleção de Culturas - Micoteca URM (Recife, Pernambuco); -: negativo.


35

Figura 2 - Cultura de Aspergillus niger URM4645 evidenciando halo de degradação ao

redor da colônia mostrando atividade pectinolítica após 7 dias em meio seletivo

contendo pectina cítrica.


36

CONCLUSÕES O método de preservação sob óleo mineral é adequado para preservar culturas de

A. niger por longos períodos sem afetar a viabilidade e as características morfológicas

das culturas. De acordo com a capacidade de produção de pectinases, culturas de A. niger

preservadas por até 13 anos são capazes de degradar a pectina, formando halo ao redor

da colônia. As culturas URM3701, 3806, 3811, 3820, 4452, 4645, 5207, 5437, 5438,

5555, 5756, 5837, 5838, 5842 e 5853 apresentaram halo de degradação variando de 10 a

18 mm e estão sendo indicadas como promissoras para serem utilizadas em processos

para produção de pectinases, sendo A. niger URM4645 selecionada para posteriores

trabalhos com fermentação em estado sólido para produção destas enzimas.

AGRADECIMENTOS Os autores gostariam de agradecer o apoio financeiro da Fundação de Amparo à

Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco, Recife, Brasil (FACEPE IBPG-0086 -

2.03/08), pela Financiadora de Estudos e Projetos, Rio de Janeiro, Brasil (FINEP

2083/07) e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico,

Brasília, Brasil (CNPq 552410/2005-5).


37

CAPÍTULO II

Produção e caracterização parcial de pectinases de

Aspergillus niger URM4645 utilizando a palma

forrageira como substrato

M. H. C. Maciel1*; P. N. Herculano1, T. S. Porto2, M. F. S. Teixeira3, K. A.

Moreira4, C. M. Souza-Motta1


Universitária - CEP: 50670-420 - Recife- PE- Brazil - Email: [email protected], 2Departamento de Fisiologia e Morfologia Animal - Universidade Federal Rural

Pernambuco, 3Departamento de Parasitologia - Universidade Federal do Amazonas, 4Unidade Acadêmica de Garanhuns - Universidade Federal Rural de Pernambuco


38

RESUMO As atividades de endopoligalacturonase (endo-PG), exopoligalacturonase (exo-PG),

pectina liase (PL) e pectinesterase (PE), produzidas por Aspergillus niger URM4645

foram estudadas através da fermentação em estado sólido (FES) usando palma

forrageira como substrato. O efeito das variáveis quantidade do substrato, concentração

do inóculo e da temperatura de fermentação para a produção das pectinases foram

estudadas usando um planejamento fatorial completo (2³). A atividade máxima obtida

foi de 66,19 U/g de endo-PG, 3,59 U/g de exo-PG e 40.615,62 U/g para a PL, nos

tempos de 96, 24 e 72 horas de fermentação, respectivamente. PE não mostrou

atividade. A produção de endo-PG e exo-PG foi significativamente influenciada pelas

variáveis quantidade do substrato, concentração do inóculo e temperatura, porém não

tiveram influência significativa sobre a produção de PL. A melhor condição para a

produção das três enzimas foi obtida com 10,0 g do substrato, 107 esporos/g a 28ºC com

96 horas de FES. Endo-PG e PL apresentaram atividade ótima em pH 5,0 a 50°C e exo-

PG em pH 7,0 a 40°C. Endo-PG e exo-PG foram estáveis em uma faixa de pH 3,5-11,0

e a 50ºC e 80ºC, respectivamente. PL mostrou estabilidade apenas em pH 5,0 e a 50ºC.

PALAVRAS-CHAVES: Aspergillus niger, atividades pectinolíticas, palma forrageira,

fermentação em estado sólido.


39

INTRODUÇÃO Atualmente, os resíduos agrícolas estão sendo utilizados como matérias-primas

para degradação biológica, por microrganismos, para a produção de compostos de maior

valor como proteínas, polissacarídeos, oligossacarídeos, vitaminas, hormônios, enzimas

e outros (EL-SHEEKH et al., 2009).

As enzimas pectinolíticas são classificadas de acordo com o modo de clivagem

da cadeia de ácido galacturônico da molécula de pectina, podendo ser classificadas em

enzimas desmetoxilantes (pectinesterase - PE, EC 3.1.1.11) que atacam a ligação éster

desmetoxilando ácidos galacturônicos, resultando em pectinas com baixo teor de

metoxilação, e enzimas despolimerizantes, que atacam as ligações glicosídicas α-1,4

entre unidades de ácido galacturônico desmetoxilados. As poligalacturonases (PGs) e as

pectina liases (PL) quebram as ligações glicosídicas ao lado de outros grupos carboxila

por hidrólise e por β-eliminação, respectivamente. Ambos os tipos de endo PGs e PAL

(EC 3.2.1.15 e EC 4.2.2.2, respectivamente) são conhecidas por quebrar a molécula de

pectina ao acaso. As exopoligalacturonases (exo-PGs, E.C 3.2.1.67) liberaram

monômeros ou dímeros do final não reduzido da cadeia, enquanto que as exopectina

liases (exo-PALs, E.C 4.2.2.9) liberam dímeros insaturados a partir do final reduzido.

Pectinas altamente metoxiladas são degradadas pela endopectina liase (endo-PL, EC

4.2.2.10) e também por uma combinação de PE com PG (SARKANEN, 1991; PILNIK;

VORAGEN, 1993).

As pectinases são amplamente utilizadas para a desintegração dos tecidos

vegetais nas indústrias de processamento de frutas e vegetais, para aumentar a extração

de suco, para diminuir a viscosidade dos concentrados e na clarificação de sucos

(CROOK; CORREDIG, 2001; GUMMADI; PANDA, 2003) e vinhos (PÉREZ-

MAGANINO; GONZÁLEZ-SAN, 2001).

A capacidade de sintetizar enzimas pectinolíticas é muito comum entre os

microrganismos, porém os fungos são preferidos em uma escala industrial. Isso ocorre

porque cerca de 90% das enzimas produzidas podem ser secretadas no meio de cultura

(BLANDINO et al., 2001). Aspergillus niger é a espécie de fungo mais comumente

utilizada para a produção industrial de enzimas pectinolíticas (NAIDU; PANDA, 1998;

DINU et al., 2007), sendo as PGs as enzimas mais abundantes e amplamente estudadas,

podendo apresentar atividade de endo (PARENICOVÁ et al., 2000) e exo


40

(SAKAMOTO et al., 2002). PLs (VITALI et al., 1998) e PEs (KHANH et al., 1991)

também foram purificadas e caracterizadas em algumas espécies de Aspergillus.

A palma forrageira (Opuntia ficus indica Mill) é considerada uma excelente

fonte de energia, sendo rica em carboidratos não-fibrosos (61,79%) (WANDERLEY et

al., 2002), nutrientes digestíveis totais (62%) (MELO et al., 2003a) e pectina (23,3%)

(MELO et al., 2003b). Este alto teor de pectina da palma forrageira faz com que ela

possa ser explorada como substrato barato para a produção de pectinases microbiana.

O objetivo deste estudo foi avaliar a produção de poligalacturonases (endo-PG e

exo-PG), pectina liase (PL) e pectinesterase (PE) por Aspergillus niger URM4645 por

fermentação em estado sólido (FES) utilizando a palma forrageira como substrato e

caracterizar parcialmente a enzima.


41

MATERIAL E MÉTODOS

Microrganismo A. niger URM4645 foi utilizado neste estudo, sendo obtido da Micoteca URM

do Departamento de Micologia, da Universidade Federal de Pernambuco, Brasil. A

cultura foi mantida em Ágar Extrato de Malte (KLICH, 2002) a 28ºC ± 2ºC por 7 dias.

Fermentação em Estado Sólido Para fermentação foi utilizada a palma forrageira como substrato, com

granulometria variando de 3-8 mm. O substrato foi autoclavado a 120ºC por 15 minutos

em Erlenmeyer de 250 mL contendo o substrato. O teor de umidade inicial do meio de

fermentação foi de aproximadamente 85%.

Delineamento experimental A influência da quantidade do substrato (Sa), da concentração do inóculo (Ic) e

da temperatura (T), sobre as quatro atividades (endo-PG, exo-PG, PL e PE - respostas),

foram analisadas a partir dos resultados dos experimentos de acordo com o

planejamento fatorial completo (23) (BRUNS et al., 2006), com três repetições no ponto

central (Tabela 1). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software

Statistica 8.0 (STATSOFT INC, 2008).

Tabela 1 - Níveis das variáveis utilizadas no planejamento 23 para produção de

pectinases por fermentação em estado sólido da palma forrageira utilizando Aspergillus

niger URM4645.

Variáveis

Níveis

Inferior (-1) Central (0) Superior (+1)

Quantidade do resíduo (g) 5,0 7,5 10,0

Concentração do inóculo

(esporos/g) 105 106 107

Temperatura (ºC) 28 32 36


42

Extração das enzimas A produção de pectinases foi seguida por 120 horas com amostragem a cada 24

horas. A extração das enzimas foi feita pela adição de tampão acetato 0,2 M, pH 5,5

(1:2,5 - substrato fermentado: tampão - g/mL), em seguida incubadas em banho de

temperatura controlada a 32ºC por um período de 1 hora e filtrada com papel de filtro

(Whatman nº 1) sob vácuo. O sobrenadante foi utilizado como extrato bruto enzimático

e submetido às análises enzimáticas.

Atividade de endopoligalacturonase (ENDO-PG) A atividade de endopoligalacturonase foi determinada viscosimetricamente,

utilizando as seguintes condições: 250 µL do extrato enzimático foi adicionado em 5,5

mL da solução de pectina cítrica 1% (p/v) em tampão acetato de sódio 25mM pH 5,0

contendo 1,0 mM de EDTA (ácido etileno di-amino tetra acético), de acordo com a

metodologia de Tuttobello e Mill (1961).

Em seguida as misturas foram homogeneizadas em agitador de tubos e

incubadas a 50ºC por 10 minutos e em seguida resfriadas em banho de gelo. A leitura

foi realizada em viscosímetro de Ostwald, onde uma unidade viscosimétrica (U) foi

definida como a quantidade da enzima necessária para diminuir em 50% a viscosidade

inicial por minuto nas condições descritas. A atividade enzimática foi determinada em

U/g.

Atividade de exopoligalacturonase (EXO-PG)

A atividade de exopoligalacturonase foi determinada pela redução dos grupos

redutores usando-se o método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), proposto

inicialmente por Miller (1959).

A mistura de reação foi preparada da seguinte forma: para 500 µL de solução de

pectina cítrica 0,5 % (Sigma) em tampão acetato de sódio 25mM pH 5,0 com 1 mM de

EDTA e em seguida adicionado 500 µL de extrato enzimático. Após completa

homogeneização, os tubos foram incubados a 50°C por 10 minutos, em seguida

adicionados 500 µL de DNS a cada um deles e imediatamente agitados e incubados em

água fervente por cinco minutos. Após o resfriamento, foram adicionados 5 mL de água

destilada esterilizada e submetido novamente à agitação.


43

A leitura foi realizada em espectrofotômetro a 575 nm e os valores obtidos

foram comparados com a curva padrão de ácido monogalacturônico. Uma unidade

enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima que libera um mmol de ácido

monogalacturônico por minuto nas condições descritas. A atividade enzimática foi

expressa em U/g.

Atividade de pectina lise (PL) A atividade de pectina liase foi determinada a 235 nm. A mistura de reação foi

composta de 1,0 mL de solução de pectina cítrica 0,5 % (Sigma) em tampão citrato

fosfato 0,2 M pH 5,5 e 1,0 mL de extrato enzimático, e em seguida incubada a 40°C por

1 hora. Após esse período, a reação foi paralisada com a adição de 3,5 mL de HCl 0,5

M.

Uma unidade enzimática (U) foi definida como a quantidade da enzima que

libera 1 mmol de produtos urônicos insaturados por minuto, com base no coeficiente de

extinção molar (ε235 = 5550 M-1cm-1) (ALBERSHEIN, 1966; UENOJO; PASTORE,

2006). A atividade enzimática foi expressa em U/g.

Atividade de pectinesterase (PE) A atividade de pectinesterase foi avaliada por decréscimo do pH no meio e pela

titulação dos grupos carboxílicos utilizando uma metodologia modificada (SIÉSSERE

et al., 1992), onde a mistura de reação foi composta por 2,0 mL de solução de pectina

cítrica 1% (p/v) em tampão Tris-acetato 0,025 M pH 6,5 e 1,0 mL do extrato

enzimático.

A reação foi conduzida a 50ºC por duas horas e interrompida em banho de água

fervente por três minutos. Em seguida, as amostras foram resfriadas em banho de gelo e

tituladas com solução de NaOH 0,01 M.

Uma unidade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima que

libera um microequivalente de grupos carboxílicos em uma hora de reação, nas

condições descritas. A atividade enzimática foi expressa em U/g.

Caracterização enzimática As atividades de endo-PG, exo-PG e PL foram realizadas em diferentes valores

de pH e temperatura. PE não apresentou atividade e, portanto, não foi caracterizada.


44

pH e temperatura ótima para a atividade das enzimas pectinolíticas: o efeito do pH

sobre a atividade das enzimas foi observado usando diferentes tipos de tampões, como

segue: tampão acetato de sódio (pH 3.5-5.0), tampão citrato-fosfato (pH 5.0-7.0),

tampão Tris-HCl ( pH 7.0-8.5) e glicina-NaOH (pH 8,5-11,0). A temperatura ótima foi

determinada no intervalo de 30-80ºC pela incubação da mistura de reação no pH ótimo.

Estabilidade ao pH e a temperatura: o extrato enzimático bruto foi diluído (1:1) em

diferentes tampões (pH 3,5-11,0, 0,2M para endo-PG e PL, e 0,025M para exo-PG, nos

tampões citados acima) e mantidos a 25ºC por 24 horas. Após a incubação, as atividades

foram medidas em seus valores de pH e temperatura ótima. Para a determinação da

estabilidade térmica, o extrato bruto enzimático foi incubado à temperatura de 30-70ºC

por 1 hora e em seguida as atividades foram determinadas.


45

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Produção das enzimas pectinolíticas A. niger URM4645 quando cultivado na palma forrageira, sem qualquer adição

de solução nutritiva, produziu endo-PG, exo-PG e PL, não sendo capaz de produzir PE

nestas condições. As enzimas produzidas na FES foram analisadas durante 120 horas e

os experimentos realizados em 11 ensaios.

A atividade máxima de endo-PG foi 66,19 U/g em 96 horas de fermentação,

utilizando 10,0 g do substrato, 107 esporos/g a 28ºC. A atividade máxima de exo-PG e

PL foi de 3,590 e 40.615,62 U/g obtidos com 24 e 72 horas de fermentação,

respectivamente, utilizando 5,0 g do substrato, 107 esporos/g a 36ºC (Tabela 2).

Tabela 2 - Resultados do planejamento experimental (23) para a produção de

endopoligalacturonase (endo-PG), exopoligalacturonase (exo-PG) e pectina liase (PL)

por fermentação em estado sólido (FES) da palma forrageira com Aspergillus niger

URM4645.

Ensaios Sa IC T

Endo-

PG96 (U/g)Exo-

PG24 (U/g)Exo-

PG96 (U/g)PL72 (U/g)

PL96 (U/g)

01 5,0 105 28 14,08 2,161 2,579 14.814,81 7.682,68 02 10,0 105 28 17,23 1,900 2.649 0,00 0,00 03 5,0 107 28 29,84 1,778 2.179 9.934,93 10.535,5404 10,0 107 28 66,19 1,621 2,492 25.300,30 35.735,7405 5,0 105 36 17,88 2,632 2,057 27.177,18 16.666,6706 10,0 105 36 39,52 2,213 1,342 14539.54 9.359,36 07 5,0 107 36 19,53 3,590 1,621 40.615,62 19.119,1208 10,0 107 36 57,02 2,335 1,307 11.161,16 28.978,98

09(C) 7,5 106 32 25,65 2,144 1,969 19.569,57 13.788,7910(C) 7,5 106 32 35,40 1,882 2,248 12.887,89 18.793,7911(C) 7,5 106 32 36,20 2,283 2,196 10.685,69 12.237,24NOTAS: Para endo-PG, exo-PG e PL o tempo de cultivo é dado em horas. Os significados dos símbolos: Sa - Quantidade do substrato (g), Ic - Concentração do inóculo (esporos/g), T - Temperatura (ºC), (C) - Ponto central.

Freitas et al. (2006) trabalhando com Monascus sp. e Aspergillus sp. obtiveram

1,6 e 1,9 U/mL para a atividade de endo-PG em 20 e 72 horas de FES, respectivamente,

utilizando farelo de trigo com o substrato. O valor da atividade de endo-PG obtido por

Fontana et al. (2005) foi de 152 U/g em 72 horas de FES utilizando farelo de trigo e

pectina cítrica como substratos, sendo este valor superior ao obtido no presente

trabalho, porém na fermentação da palma forrageira não foi adicionada qualquer fonte


46

de carbono ou de pectina na tentativa de aumentar a produção das enzimas

pectinolíticas.

Os valores das atividades de exo-PG obtidos com a palma forrageira foram

considerados baixos em comparação com os resultados obtidos por Silva et al. (2007) e

Patil e Dayanand (2006) quando trabalharam com Penicillium viridicatum RFC3 (16,0

U/g) e A. niger (17,1 U/g), utilizando uma mistura de farelo de trigo e bagaço de laranja

(1:1) e cabeça de girassol como substrato em 14 dias e 96 horas de FES,

respectivamente.

A produção de PL foi observada pelos gêneros Moniliella sp. e Penicillium sp.

quando cultivados em meio contendo como substratos bagaço de laranja, bagaço de

cana e farelo de trigo (1:1:1). A atividade de PL foi detectada em 144 e 96 horas de FES

para Moniliella sp. (19,40 U/g) e Penicillium sp. (11,0 U/g), respectivamente (MARTIN

et al., 2004). Segundo Silva et al. (2002) os estudos de produção de PL por P.

viridicatum usando bagaço de laranja como substrato apresentou valor de 2,0 U/g,

quando o farelo de trigo foi adicionado ao bagaço de laranja pode-se observar a

influência da composição do meio na produção da enzima que passou para 3,54 U/g. A

quantidade de PL obtidas no presente trabalho foi elevada em comparação aos

observados para outras espécies pectinolíticas cultivadas em substratos sólidos. No

entanto, a comparação dos níveis de produção enzimática por microrganismos

diferentes não é fácil, pois as condições de cultivo e as determinações das atividades

enzimáticas utilizadas são diferentes. Esses resultados mostraram que a FES foi

adequada para produção de pectinases por A. niger URM4645 utilizando a palma

forrageira como substrato.

A máxima produção de endo-PG, exo-PG e PL foram obtidas em diferentes

condições e tempos de cultivo, assim, foi necessária a escolha de uma condição comum

para a produção das enzimas do complexo pectinolítico, uma vez que o complexo

enzimático é aplicado na indústria de alimentos para o processamento de sucos de

frutas. A condição de 10,0 g do substrato, 107 esporos/g a 28ºC com 96 horas de FES foi

escolhida através de análise estatística, sendo esta uma condição comum para a

produção de endo-PG, exo-PG e PL (Figura 1). Os resultados da análise estatística com

os efeitos de cada uma das variáveis estudadas no planejamento experimental na

atividade de endo-PG, exo-PG e PL com 96 horas de FES são apresentados na Tabela 2.


47

Figura 1 - Atividade de endopoligalacturonase (□ - endo-PG), exopoligalacturonase (∆

- exo-PG) e pectina liase (○ - PL) na melhor condição de produção das três enzimas

(10,0 g do substrato, 107 esporos/g a 28°C com 96 horas de fermentação em estado

sólido (FES) - Ensaio 04).

A temperatura não foi uma variável significativa na atividade de endo-PG. Já as

variáveis quantidade do substrato e concentração do inóculo tiveram um efeito positivo

sobre a atividade de endo-PG durante as 96 horas FES (Tabela 3). Assim, o uso de 10,0

g do substrato e 107 esporos/g mostraram a máxima atividade dessa enzima.

A variável temperatura apresentou efeito negativo significativo, indicando que

um aumento na atividade de exo-PG foi obtido através da redução da temperatura. A

quantidade do substrato e concentração do inóculo não influenciaram significativamente

na produção exo-PG. Nenhuma das variáveis apresentaram efeito significativo sobre a

produção de PL (Tabela 3).


48

Tabela 3 - Efeitos calculados a partir das respostas do planejamento fatorial completo


(exo-PG) e pectina liase (PL) com 96 horas de fermentação em estado sólido (FES) por

Aspergillus niger URM4645.

Variáveis/Interações Endo-PG96

Exo- PG96

PL96

(1) 4,72* -0,57 0,89 (2) 4,01* -0,92 2,69 (3) 0,32 -3,18* 0,89 1x2 2,35 0,57 2,22 1x3 0,94 -1,26 -0,66 2x3 -2,19 0,08 -0,73

1x2x3 -0,83 0,14 -0,70 NOTAS: *Valores estatisticamente significativos (intervalo de confiança de 95%). Os significados dos símbolos: (1) - Quantidade do substrato (g), (2) - Concentração do inóculo (esporos/g), (3) - Temperatura (ºC).

Caracterização enzimática Para caracterização de endo-PG, exo-PG e PL de A. niger URM4645 foi

utilizado o extrato enzimático bruto do ensaio 04 (10,0 g do substrato, 107 esporos/g a

28ºC com 96 horas de FES) escolhido como o melhor para a produção das três enzimas

do complexo pectinolítico (Tabela 2).

O efeito do pH na atividades de endo-PG, exo-PG e PL é apresentado na Figura

2. A atividade ótima para endo-PG e exo-PG ocorreu em pH 5,0 e pH 7,0,

respectivamente. Para endo-PG e exo-PG em valores de pH 8,0, 77% e 97% da

atividade máxima foram obtidas, respectivamente. O pH ótimo para a exo-PG foi maior

do que para a maioria das PGs fúngicas já descritas, que possuem melhor atividade em

valores de pH ácidos (FAVELA-TORRES et al., 2006). A máxima atividade de exo-PG

foi verificada para P. viridicatum RFC3 em pH 6,0 (SILVA et al., 2007), Moniliella sp.

SB9 em pH 4,5 e Penicillium sp. EGC5 em pH 4,5-5,0 (MARTIN et al., 2004). Freitas

et al. (2006) trabalhando com Monascus sp. e Aspergillus sp. obtiveram a máxima

atividade de exo-PG em pH 5,5.


49



URM4645.

A ótima atividade para PL foi em pH 5,0. Em pH 6,0 a atividade de PL diminuiu

em 93%, sendo desnaturada em valores de pH neutro e básico. Valores de pH ótimos

foram anteriormente relatados para PL, como pH ácido para P. canescens (5,5)

(SINITSYNA et al., 2007), neutro para P. expansum (SILVA et al., 1993) e básico para

A. flavus (8,0) (YADAV et al., 2008a) e A. terricola ( 8.0) (YADAV et al., 2008b). A

propriedade de tolerância ácida destas enzimas é uma grande vantagem em aplicações

de processamento de frutas e vegetais, já que a maioria dos sucos de frutas e dos tecidos

vegetais possuem pH ácido (FREITAS et al., 2006).

Endo-PG e exo-PG foram estáveis na faixa de pH 3,5-11,0. PL foi sensível à

variação de pH, mostrando-se estável apenas em pH 5,0. Após a incubação por 1 hora

na faixa de pH 3,5-11,0, mais de 40% da atividade foi mantida para endo-PG e PL, e

70% para exo-PG. Os resultados estão de acordo com os obtidos por Silva et al. (2002)

trabalhando com PG de P. viridicatum RFC3 mostrou estabilidade dessa enzima em

uma faixa de pH 5,0-8,0, mantendo 80% de sua atividade em pH 9,0 e PL sensível à

variação de pH, apresentando estabilidade máxima em pH 3,5-4,5, onde teve uma


50

redução de 80% de sua atividade em pH 5,0. PL produzidas por Moniliella sp. SB9 e

Penicillium sp. EGC5 foram estáveis em pH ácido a neutro (4,0-7,0) (MARTIN et al.,

2004). No entanto, os resultados obtidos por Yadav et al. (2008a,b) relataram a

estabilidade de PL em uma faixa de pH 4,0-10,0 e 4,0-9,0 com A. flavus e A. terricola,

respectivamente. Freitas et al. (2006) observaram que exo-PG de Monascus sp. foi

estável em pH 4,5-6,0, enquanto que a de Aspergillus sp. foi estável em pH 4,0. Silva et

al. (2007) também trabalhando com P. viridicatum RFC3 relataram a estabilidade de

exo-PG na faixa de pH 7,0-10,0.

A temperatura ótima foi a 50ºC para a atividade de endo-PG e PL, e a 40ºC para

exo-PG (Figura 3). Estes resultados estão de acordo com os obtidos por Phutela et al.

(2005) estudando pectinases de A. fumigatus TF3 e Yadav et al. (2008b) trabalhando

com PL de A. terricola MTCC 7588, estes autores obtiveram o máximo de atividade

enzimática a 50°C. Silva et al. (2002) também observaram que a máxima atividade de

PG e PL foi a 55ºC e a 50°C, respectivamente. Exo-PG de Monascus sp. e Aspergillus

sp. exibiram máxima atividade a 60°C e a 50°C, respectivamente (FREITAS et al.,

2006). Os resultados obtidos por Dinu et al. (2007) e Silva et al. (2007) mostraram uma

atividade ótima a 40°C para PG de A. niger MIUG 16 e a 60ºC para exo-PG de P.

viridicatum RFC3, respectivamente.


51

Figura 3 - Efeito da temperatura na atividade de endopoligalacturonase (□ - endo-PG),


URM4645.

Endo-PG e PL foram estáveis a 50°C após 1 hora, sendo inativadas em altas

temperaturas e exo-PG estável a 80°C mantendo 60% da atividade após1 hora nessa

temperatura. Silva et al. (2002) mostraram que a 40ºC por 1 hora, as atividades de PG e

PL foram mantidas em 100% e 80%, respectivamente, e a 50ºC, mantiveram 55% e

60% das atividades originais, respectivamente. Yadav et al. (2008a) revelou que 98%

da estabilidade foi mantida a 50°C para PL de A. flavus, diminuindo a estabilidade a

temperaturas acima de 50°C. Exo-PG de Monascus sp. e Aspergillus sp. manteve-se

estável até 50°C (FREITAS et al., 2006).

A clarificação enzimática de sucos de frutas pode ser realizada a 15ºC por 12

horas ou a 54ºC por 1-2 horas para evitar o crescimento de leveduras (DINU et al.,

2007). A estabilidade à temperatura mostrou que as enzimas (endo-PG, exo-PG e PL)

são promissoras para serem utilizadas na indústria de alimentos para o processamento

de frutas.


52

CONCLUSÕES A viabilidade da produção de endo-PG, exo-PG e PL, utilizando A. niger

URM4645 e a palma forrageira como substrato em fermentação em estado sólido, foi

demonstrada pelos resultados apresentados neste trabalho. Palma forrageira é um

material barato e facilmente encontrado. A condição de 10,0 g do substrato, 107

esporos/g a 28ºC com 96 horas de fermentação foi definida como a melhor condição

para a produção simultânea da endo-PG, exo-PG e PL. As variáveis quantidade do

substrato, concentração do inóculo e temperatura mostraram efeitos significativos sobre

produção da endo-PG, exo-PG e PL. Endo-PG e PL de A. niger URM4645 teve

atividade ótima em pH 5,0 e a 50ºC, enquanto a exo-PG teve atividade ótima em pH 7,0

e a 40°C. Endo-PG e exo-PG foram estáveis em uma faixa de pH 3,5-11,0 e nas

temperaturas de 50°C e 80°C, respectivamente. PL mostrou estabilidade em pH 5,0 e

apenas a 50°C. Estas propriedades são favoráveis para o uso destas enzimas na indústria

de alimentos para o processamento de sucos de frutas.

AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Ciência e

Tecnologia do Estado de Pernambuco, Recife, Brasil (FACEPE IBPG-0086-2.03/08), a

Financiadora de Estudos e Projetos, Rio de Janeiro, Brasil (FINEP 2083/07) e ao

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasília, Brasil

(CNPq 552410/2005-5).


53

CAPÍTULO III

Produção e caracterização parcial de pectinases de

Aspergillus niger URM4645 por fermentação em estado

sólido (FES) da casca do maracujá

M. H. C. Maciel1*; P. N. Herculano1, T. S. Porto2, M. F. S. Teixeira3, A. L. F. Porto2, K.

A. Moreira4, C. M. Souza-Motta1


Universitária - CEP: 50670-420 - Recife- PE- Brasil - Email: [email protected], 2Departamento de Fisiologia e Morfologia Animal - Universidade Federal Rural

Pernambuco, 3Departamento de Parasitologia - Universidade Federal do Amazonas, 4Unidade Acadêmica de Garanhuns - Universidade Federal Rural de Pernambuco


54

RESUMO

As atividades de endopoligalacturonase (endo-PG), exopoligalacturonase (exo-PG),

pectina liase (PL) e pectinesterase (PE), produzidas por Aspergillus niger URM4645

foram estudadas através da fermentação em estado sólido (FES) usando a casca do

maracujá como substrato. O efeito das variáveis, quantidade do substrato, umidade e

temperatura na produção das pectinases foram estudadas usando um planejamento

fatorial completo (2³). A atividade máxima obtida foi de 31,35 U/g de endo-PG, 7,98

U/g de exo-PG, 551.299,39 U/g para a PL e 447,93 U/g para PE nos tempos de 96 horas

de FES para a endo-PG e PL e 72 horas para a exo-PG e PE. A produção de endo-PG e

exo-PG foi significativamente influenciada pelas variáveis, quantidade do substrato,

umidade e temperatura. A melhor condição para a produção das enzimas foi obtida com

5,0 g do substrato, 30% de umidade a 34ºC com 96 horas de FES. Endo-PG apresentou

atividade ótima a pH 7,5 e a 40ºC, exo-PG e PL a pH 7,0 e a 80ºC e PE a pH 3,5 e a

30ºC. Endo-PG foi estável na faixa de pH 7,0-8,0 e a 40ºC, enquanto exo-PG e PL

foram estáveis na faixa de pH 6,0-8,0 e 6,0-7,5 e a 60-70ºC, respectivamente. PE foi

estável na faixa de pH 3,5-5,0 e a 30-60ºC. Os resultados apresentado neste trabalho

demonstraram a viabilidade da produção de endo-PG, exo-PG, PL e PE utilizando A.

niger URM4645 e a casca do maracujá como substrato em fermentação em estado

sólido.

PALAVRAS-CHAVES: Aspergillus niger, atividades pectinolíticas, casca do

maracujá, fermentação em estado sólido.


55

INTRODUÇÃO O desenvolvimento de pesquisas que utilizam resíduos na obtenção de enzimas,

produto de alto valor comercial, representa uma redução dos custos de produção

(SILVA et al., 2002). Os subprodutos da indústria cítrica, como polpa, casca, sementes

e bagaço, contêm apreciáveis quantidades de pectinas (AGUILAR; HUITRON, 1986;

YAPO; KOFFI, 2006), substrato indutor da síntese de pectinases por diversos

microrganismos (BAI et al., 2004). As enzimas pectinolíticas são classificadas com base

na ação sobre as substâncias pécticas, podendo ser enzimas desesterificantes ou

despolimerizantes. As principais enzimas pectinolíticas sintetizadas por fungos são as

poligalacturonases, pectina liase e pectinesterase (SILVA et al., 2002).

A capacidade de sintetizar enzimas pectinolíticas é muito comum entre os

grupos de microrganismos, mas os fungos são preferidos em uma escala industrial, pois

cerca de 90% das enzimas produzidas podem ser secretadas no meio de cultura

(BALNDINO et al., 2001; PAPAGIANNI, 2004). As enzimas pectinolíticas são

produzidas por diversas espécies de fungos, como Aspergillus flavus (Yadav et al.

(2008a), A. fumigatus (PHUTELA et al., 2005), A. japonicus (SEMENOVA et al.,

2003), A. niger (PICCOLI-VALLE et al., 2001; JOSHI et al. 2006; PATIL;

DAYANAND, 2006), A. sojae (USTOK et al., 2007) e A. terricola (YADAV et al.,

2008b). A. niger é a espécie mais utilizada para a produção industrial de enzimas

pectinolíticas (NAIDU; PANDA, 1998; DINU et al., 2007).

Enzimas pectinolíticas são amplamente utilizadas na indústria de alimentos com

aplicações na extração de sucos, aumentando a quantidade de suco livre; na quebra da

emulsão de óleo cítrico essencial; na diminuição da viscosidade e melhoramento de

propriedades organolépticas do vinho tinto e a eliminação de substâncias pécticas de

vegetais em alimentos processados (FRIEDRICH et al., 1990; GALIOTOU-

PANAYOTOU et al., 1997). Este processo de degradação da pectina tem importância

para a indústria de alimento, proporcionando redução do tempo de filtração e aumento

de volume de clarificação de sucos, além de conferir maior estabilidade ao produto

concentrado (TEIXEIRA et al., 2000).

As principais matérias-primas utilizadas na produção comercial das pectinases

são o bagaço de maçã e cascas de cítricos. Pouco se sabe sobre as substâncias pécticas

no maracujá. A casca do maracujá é rica em aminoácidos, proteínas e carboidratos,

contendo ainda 10 a 20% de pectina (MANICA, 1981; GALISTEO et al., 2008). A


56

casca do maracujá representa cerca da metade da massa do fruto e devido à grande

produção do suco, cerca de 90% das cascas e sementes são descartadas. Como a

quantidade de resíduos provenientes do processamento do suco de maracujá é bastante

expressiva, há necessidade de soluções viáveis para o seu reaproveitamento (LIU et al.,

2006). Assim, a casca do maracujá pode ser utilizada como substrato na fermentação em

estado sólido (FES) para a produção de pectinases. A FES consiste no crescimento de

microrganismos sobre um substrato sólido úmido na ausência de água livre

(RAIMBAULT, 1998).

O objetivo deste estudo foi avaliar a produção de poligalacturonases (endo-PG e

exo-PG), pectina liase (PL) e pectinesterase (PE) por Aspergillus niger URM4645 por

fermentação em estado sólido (FES) usando casca do maracujá como substrato e a

caracterização parcial das enzimas pectinolíticas.


57

MATERIAIS E MÉTODOS

Microrganismo A. niger URM4645 foi utilizado neste estudo, procedente da Micoteca URM do

Departamento de Micologia, da Universidade Federal de Pernambuco, Brasil. A cultura

foi mantida em meio Ágar Extrato de Malte (KLICH, 2002) a 28ºC ± 2ºC por 7 dias.

Fermentação em Estado Sólido Para fermentação, cascas do maracujá foram utilizadas como substrato, sendo

obtidas do Centro de Abastecimento Alimentar de Pernambuco (CEASA/PE) e

submetidas a sucessivas lavagens com água corrente para a retirada de impurezas e de

todo resíduo restante da polpa. Posteriormente, as cascas foram submersas por uma hora

em solução de hipoclorito de sódio 2% e depois lavadas em água corrente. As cascas

foram então trituradas, incubadas em estufa a 65ºC até completa desidratação e em

seguida armazenadas em potes plásticos higienizados. Para utilização, o material foi

novamente triturado, com um tamanho de aproximadamente 3-8 mm, para proporcionar

melhor porosidade e absorção para facilitar a oxigenação e transporte de nutrientes

durante a fermentação (SPIER et al., 2008). E em seguida colocados por 2 horas em luz

ultravioleta (UV). Uma suspensão de 107 esporos/g, preparado em solução de NaCl

(0,9% p/v) com Tween 80 (0,01% v/v), foi inoculada ao substrato.

Delineamento experimental A influência das variáveis quantidade do substrato (Sa), umidade (Um) e

temperatura (T) sobre as quatro atividades (Endo-PG, Exo-PG, Pl e PE - respostas)

foram avaliadas a partir dos resultados dos experimentos realizados de acordo com um

planejamento fatorial completo (23) (BRUNS et al., 2006), com quatro repetições no

ponto central (Tabela 1) . Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o

software Statistica 8.0 (STATSOFT INC, 2008).


58

Tabela 1. Níveis das variáveis utilizadas no planejamento 23 para extração de

pectinases por fermentação no estado sólido da casca do maracujá.

Variáveis

Níveis

Inferior (-1) Central (0) Superior (+1)

Quantidade do resíduo (g) 5,0 10,0 15,0

Umidade (%) 30 50 40

Temperatura (ºC) 26 34 30

Extração das enzimas A produção de pectinase foi seguida por 96 horas, com amostragens a cada 24

horas. Inicialmente foram retiradas 2,0 g de amostra, a qual permaneceu em estufa a

105ºC durante 24 horas para a determinação da umidade do fermentado. Para extração

das enzimas 5,0 g do fermentado foi misturado a 30 mL de solução tampão acetato

0,2M pH 5,5 (SPIER et al., 2008, modificado). Esta mistura foi macerada e em seguida

filtrada para a remoção dos sólidos obtendo-se um extrato bruto o qual foi centrifugado

a 5000 rpm durante 10 minutos a 4°C e o sobrenadante foi utilizado para determinar as

atividades pectinolíticas.

Atividade de endopoligalacturonase (ENDO-PG) A atividade de endopoligalacturonase foi determinada viscosimetricamente,

utilizando as seguintes condições: 250 µL do extrato enzimático foi adicionado em 5,5

mL da solução de pectina cítrica 1% (p/v) em tampão acetato de sódio 25mM pH 5,0

contendo 1,0 mM de EDTA (ácido etileno di-amino tetra acético), de acordo com a

metodologia de Tuttobello e Mill (1961).

Em seguida as misturas foram homogeneizadas em agitador de tubos e

incubadas a 50ºC por 10 minutos e em seguida resfriadas em banho de gelo. A leitura

foi realizada em viscosímetro de Ostwald, onde uma unidade viscosimétrica (U) foi

definida como a quantidade da enzima necessária para diminuir em 50% a viscosidade

inicial por minuto nas condições descritas. A atividade enzimática foi determinada em

U/g.


59

Atividade de exopoligalacturonase (EXO-PG)

A atividade de exopoligalacturonase foi determinada pela redução dos grupos

redutores usando-se o método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), proposto

inicialmente por Miller (1959).

A mistura de reação foi preparada da seguinte forma: para 500 µL de solução de

pectina cítrica 0,5 % (Sigma) em tampão acetato de sódio 0,025M pH 5,0 com 1 mM de

EDTA e em seguida adicionado 500 µL de extrato enzimático. Após completa

homogeneização, os tubos foram incubados a 50°C por 10 minutos, em seguida

adicionados 500 µL de DNS a cada um deles e imediatamente agitados e incubados em

água fervente por cinco minutos. Após o resfriamento, foram adicionados 5 mL de água

destilada esterilizada e submetido novamente à agitação.

A leitura foi realizada em espectrofotômetro a 575 nm e os valores obtidos

foram comparados com a curva padrão de ácido monogalacturônico. Uma unidade

enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima que libera um mmol de ácido

monogalacturônico por minuto nas condições descritas. A atividade enzimática foi

expressa em U/g.

Atividade de pectina lise (PL) A atividade de pectina liase foi determinada a 235 nm. A mistura de reação foi

composta de 1,0 mL de solução de pectina cítrica 0,5 % (Sigma) em tampão citrato

fosfato 0,2 M pH 5,5 e 1,0 mL de extrato enzimático, e em seguida incubada a 40°C por

1 hora. Após esse período, a reação foi paralisada com a adição de 3,5 mL de HCl 0,5

M.

Uma unidade enzimática (U) foi definida como a quantidade da enzima que

libera 1 mmol produtos urônicos insaturados por minuto, com base no coeficiente de

extinção molar (ε235 = 5550 M-1cm-1) (ALBERSHEIN, 1966; UENOJO; PASTORE,

2006). A atividade enzimática foi expressa em U/g.

Atividade de pectinesterase (PE) A atividade de pectinesterase foi avaliada por decréscimo do pH no meio e pela

titulação dos grupos carboxílicos utilizando uma metodologia modificada (SIÉSSERE

et al., 1992), onde a mistura de reação foi composta por 2,0 mL de solução de pectina


60

cítrica 1% (p/v) em tampão Tris-acetato 0,025 M pH 6,5 e 1,0 mL do extrato

enzimático.

A reação foi conduzida a 50ºC por duas horas e interrompida em banho de água

fervente por três minutos. Em seguida, as amostras foram resfriadas em banho de gelo e

tituladas com solução de NaOH 0,01 M.

Uma unidade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima que

libera um microequivalente de grupos carboxílicos em uma hora de reação, nas

condições descritas. A atividade enzimática foi expressa em U/g.

Caracterização enzimática As atividades de endo-PG, exo-PG e PL foram realizadas em diferentes valores

de pH e temperatura.

pH e temperatura ótima para a atividade das enzimas pectinolíticas: o efeito do pH

sobre a atividade das enzimas pectinolíticas foi observado usando diferentes tipos de

tampões, como segue: tampão acetato de sódio (pH 3.5-5.0), tampão citrato-fosfato (pH

5.0-7.0), tampão Tris-HCl ( pH 7.0-8.5) e glicina-NaOH (pH 8,5-11,0). A temperatura

ótima foi determinada no intervalo de 30-80ºC pela incubação da mistura de reação no

pH ótimo.

Estabilidade ao pH e a temperatura: o extrato enzimático bruto foi diluído (1:1) em

diferentes tampões (pH 3,5-11,0, 0,2M para endo-PG e PL, e 0,025M para exo-PG, nos

tampões citados acima) e mantidos a 25ºC por 24 horas. Após a incubação, as atividades

foram medidas em seus valores de pH e temperatura ótima. Para a determinação da

estabilidade térmica, o extrato bruto enzimático foi incubado à temperatura de 30-80ºC

por 1 hora e em seguida as atividades foram determinadas.


61

RESULTADOS E DISCUSSÃO A. niger URM4645 quando cultivado na casca do maracujá, sem qualquer adição

de solução nutritiva, foi capaz de produzir endo-PG, exo-PG, PL e PE. As enzimas

produzidas na FES foram analisadas durante 96 horas e os experimentos realizados em

12 ensaios.

A atividade máxima de endo-PG foi 31,35 U/g em 96 horas de fermentação,

utilizando 5,0 g do substrato, com 30% de umidade a 34ºC; de exo-PG foi 7,98 U/g em

72 horas de fermentação com 15,0 g do substrato, 30% de umidade e a 26ºC; de PL foi

de 551.299,39 U/g obtido com 96 horas de fermentação, utilizando 5,0 g do substrato,

com 30% de umidade a 26ºC e a PE apresentou máxima atividade de 447,93 U/g com

72 horas de fermentação, utilizando 15,0 g do substrato, 30% de umidade a uma

temperatura de 34ºC (Tabela 2).

Freitas et al. (2006) trabalhando com Monascus sp. e Aspergillus sp. obtiveram

1,6 e 1,9 U/mL para a atividade de endo-PG em 20 e 72 horas de FES, respectivamente,

utilizando farelo de trigo com substrato. O valor da atividade de endo-PG obtido por

Fontana et al. (2005) foi de 152 U/g em 72 horas de FES utilizando farelo de trigo e

pectina cítrica como substratos.

Silva et al. (2007) obtiveram uma produção para exo-PG de 16,0 U/g com

Penicillium viridicatum RFC3 quando utilizou como substrato uma mistura de farelo de

trigo e bagaço de laranja (1:1) em 14 dias de FES. Patil e Dayanand (2006) trabalhando

com A. niger obtiveram uma produção para exo-PG de 17,1 U/g utilizando cabeça de

girassol como substrato com 96 horas de FES. Ustok et al. (2007) utilizando A. sojae

ATCC 20235 e milho triturado para a produção de exo-PG por FES obtiveram máxima

atividade de 29,09 U/g.

A produção de PL foi observada pelos gêneros Moniliella sp. e Penicillium sp.

cultivados em meio contendo bagaço de laranja, bagaço de cana e farelo de trigo (1:1:1)

como substrato. A atividade de PL foi detectado em 144 e 96 horas de FES para

Moniliella sp. (19,40 U/g) e Penicillium sp. (11,0 U/g), respectivamente (MARTIN et

al., 2004). Segundo Silva et al. (2002) os estudos de produção de PL por P. viridicatum

usando bagaço de laranja como substrato apresentou valor de 2,0 U/g, quando o farelo

de trigo foi adicionado ao bagaço de laranja pode-se observar a influência da

composição do meio na produção da enzima que passou para 3,54 U/g. A quantidade de


62

PL obtidas em nosso estudo foi elevada em comparação aos observados para outras

espécies pectinolíticas cultivadas em substratos sólidos.

Joshi et al. (2006) observaram uma máxima produção de 5,5 U/g de PE de A.

niger por FES com polpa de maçã com 25 horas de fermentação. Maldonado e Saad

(1998) verificaram a produção de PE por A. niger em FES em meio contendo pectina

como única fonte de carbono e em meio suplementado com diferentes concentrações de

glicose, ambos tendo como suporte bagaço de cana de açúcar. A atividade de PE foi

quase a mesma no meio contendo pectina (500 U/L) ou na presença de 5 g/L de glicose

(520 U/L) no tempo de 24 horas de fermentação.

A comparação dos níveis de produção enzimática por microrganismos diferentes

não é fácil, pois as condições de cultivo e as determinações das atividades enzimáticas

utilizadas são diferentes. O principal objetivo do presente estudo foi à obtenção de um

processo de baixo custo para produção de pectinases, onde não houve a adição de

qualquer fonte de carbono ou de pectina cítrica na tentativa de aumentar a produção das

enzimas. Esses resultados mostraram que a FES é promissora para produção de

pectinases por A. niger URM4645 utilizando a casca do maracujá como substrato.

Tabela 2 - Resultados do planejamento experimental (23) para produção de

endopoligalacturonase (Endo-PG), exopoligalacturonase (Exo-PG), pectina liase (PL) e

pectinesterase (PE) por fermentação em estado sólido (FES) com Aspergillus niger

URM4645.

Ensaios Sa Um T Endo- PG96 (U/g)

Exo- PG72 (U/g)

PL96 (U/g)

PE72(U/g)

01 5,0 30 26 29,02 6,14 520.867,96 320,4802 15,0 30 26 15,02 7,98 373.563,73 348,4703 5,0 50 26 13,26 5,89 271.052,60 245,0704 15,0 50 26 17,37 3,67 213.617,93 245,8705 5,0 30 34 31,25 5,67 551.299,39 320,9006 15,0 30 34 5,39 7,93 304.155,37 447,9307 5,0 50 34 17,12 5,09 359.785,98 243,3608 15,0 50 34 18,64 5,08 262.886,63 275,66

09(C) 10,0 40 30 16,87 5,26 284.650,96 301,2910(C) 10,0 40 30 21,24 5,56 317.871,66 302,3911(C) 10,0 40 30 22,22 6,20 315.238,53 300,2212(C) 10,0 40 30 22,14 5,06 299.374,14 340,70

Para endo-PG, exo-PG e PL o tempo de cultivo é dado em horas. Os significados dos símbolos: Sa- Quantidade do substrato (g), Um- Umidade (%), T- Temperatura (ºC), (C)- Ponto central.


63

A máxima produção de endo-PG, exo-PG, PL e PE foram obtidas em diferentes

condições e tempos de cultivo, assim, foi necessária a escolha de uma condição comum

para a produção das enzimas do complexo pectinolítico, uma vez que o complexo

enzimático é aplicado na indústria de alimentos para o processamento de sucos de

frutas. A condição de 5,0 g do substrato, 30% de umidade a 34ºC com 96 horas de FES

foi a melhor para a produção das enzimas, endo-PG (31,25 U/g), exo-PG (6,67 U/g), PL

(551.299,39 U/g) e PE (351,15 U/g) (Figura 1). Os resultados da análise estatística dos

efeitos de cada uma das variáveis estudadas no planejamento experimental na atividade

de endo-PG, exo-PG, PL e PE com 96 horas de FES são apresentados na Tabela 3.

Figura 1 - Atividade de endopoligalacturonase (□ - endo-PG), exopoligalacturonase (∆

- exo-PG), pectina liase (○ - PL) e pectinesterase (◊ - PE) na melhor condição de

produção das quatro enzimas (5,0 g do substrato, 30% de umidade a 24°C com 96 horas

de fermentação em estado sólido (FES) - Ensaio 05).

As variáveis umidade (2) e temperatura (3) não foram significativas na atividade

de endo-PG, enquanto que a variável quantidade do substrato (1) teve um efeito

negativo sobre a atividade desta enzima durante as 96 horas FES (Tabela 3). As

variáveis, quantidade do substrato e a umidade (1x2) interagiram de forma positiva, de


64

forma que quanto menor a quantidade do substrato e a umidade inicial do meio de

fermentação, maior será a atividade de endo-PG.

A variável umidade (2) apresentou efeito negativo significativo, indicando que

um aumento na atividade de exo-PG foi obtido através da redução do nível de umidade.

As variáveis quantidade do substrato (1) e temperatura (3) não influenciaram

significativamente na produção exo-PG.

Para a atividade de PL as variáveis quantidade do substrato (1) e umidade (2)

apresentaram efeito negativo significativo sobre a produção desta enzima (Tabela 3). As

variáveis, quantidade do substrato e umidade (1x2) e a umidade e temperatura (2x3)

interagiram de forma positiva, onde quanto menor for a quantidade do substrato, a

umidade e a temperatura, maior será a atividade de PL.

Na atividade de PE apenas a variável umidade (2) apresentou efeito significativo

negativo, onde quanto menor for a umidade do meio de FES, maior será a atividade da

enzima (Tabela 3).

Tabela 3 - Efeitos calculados a partir das respostas do planejamento fatorial completo


(exo-PG), pectina liase (PL) e pectinesterase (PE) com 96 horas de fermentação em

estado sólido (FES) por Aspergillus niger URM4645.

Variáveis/Interações Endo-PG96

Exo- PG96

PL96 PE96

(1) -4,94* -0,46 -9,31* 1,03 (2) -2,00 -3,96* -14,72* -4,50* (3) -0,32 1,16 2,27 0,46 1x2 6,34* -1,36 5,50* -0,99 1x3 -2,02 0,89 -3,19 0,10 2x3 1,75 0,93 4,06* 0,64

1x2x3 1,29 0,28 1,38 0,27 *Valores estatisticamente significativos (intervalo de confiança de 95%). Os significados dos símbolos: (1) - Quantidade do substrato (g), (2) - Umidade (%) e (3) - Temperatura (ºC).

Caracterização enzimática Para caracterização de endo-PG, exo-PG, PL e PE de A. niger URM4645 foi

utilizado o extrato enzimático bruto obtido do experimento que apresentou melhor

condição para a produção das quatro enzimas do complexo pectinolítico.


65

A ótima atividade para endo-PG ocorreu em pH 7,5 e para exo-PG em pH 7,0

(Figura 2). A atividade de endo-PG em pH 7,0 e 8,0 é de 86% e 84% da atividade

máxima dessa enzima e para a exo-PG em pH 6,0 e 7,5 é de 98%. O pH ótimo para as

PGs foi maior do que para a maioria das PGs fúngicas já descritas, que possuem melhor

atividade em pH ácido (FAVELA-TORRES et al., 2006). A máxima atividade de exo-

PG para P. viridicatum RFC3 foi em pH 6,0 (SILVA et al., 2007), para Moniliella sp.

SB9 em pH 4,5 e Penicillium sp. EGC5 em pH 4,5-5,0 (MARTIN et al., 2004). Freitas

et al. (2006) trabalhando com Monascus sp. e Aspergillus sp. obtiveram a máxima

atividade de exo-PG em pH 5,5 e Phutela et al. (2005) obtiveram a máxima atividade

de PG em pH 5,0 com A. fumigatus.

A ótima atividade de PL foi obtida em pH 7,0 (Figura 2). A PL apresentou 93%

e 46% da máxima atividade em valores de pH 6,0 e 7,5, respectivamente. Valores de pH

ótimos foram anteriormente relatados para PL, como pH ácido (5,5) para P. canescens

(SINITSYNA et al., 2007), neutro (7,0) para P. expansum (SILVA et al., 1993) e básico

(8,0) para A. flavus (YADAV et al., 2008a) e A. terricola (YADAV et al., 2008b).

Piccoli-Valle et al. (2001) trabalhando com P. griseoroseum obtiveram máxima

atividade de PL com valores de pH próximos a neutro (pH 5,0-7,0). A ótima atividade para PE foi obtida em pH 3,5 (Figura 2), porém em pH 4,0 e

11,0 a atividade de PE foi de 97% e 61% da atividade máxima obtida. Dinu et al. (2007)

obtiveram a máxima atividade da enzima em pH 4,2-4,4 trabalhando com A. niger

MIUG 16. A ótima atividade de PE foi observada em pH 4,0 e pH 4,5-5,0 com A. niger

e P. griseoroseum, respectivamente (PICCOLI-VALLE et al., 2001; JOSHI et al.,

2006;).


66


exopoligalacturonase (∆ - exo-PG), pectina liase (○ - PL) e pectinesterase (◊ - PE) de


Endo-PG foi estável em uma faixa de pH de 7,0-8,0, a exo-PG em pH 6,0-8,0, a

PL em pH 6,0-7,5 e a PE em pH 3,5-5,0. Após a incubação por 24 hora na faixa de pH

3,5-11,0, mais de 40% da atividade foi mantida para as pectinases. Os resultados estão

de acordo com os obtidos por Silva et al. (2002) com PG de P. viridicatum RFC3 que

apresentou estabilidade em uma faixa de pH 5,0-8,0, mantendo 80% de sua atividade

em pH 9,0. Freitas et al. (2006) observaram que exo-PG de Monascus sp. foi estável na

faixa de pH 4,5-6,0, enquanto que a de Aspergillus sp. foi estável em pH 4,0. Silva et al.

(2007) também trabalhando com P. viridicatum RFC3 relataram a estabilidade de exo-

PG na faixa de pH 7,0-10,0.

As PL produzidas por Moniliella sp. SB9 e Penicillium sp. EGC5 foram

estáveis em pH ácido a neutro (4,0-7,0) (MARTIN et al., 2004), corroborando com os

resultados do presente trabalho. No entanto, os resultados obtidos por Yadav et al.

(2008a,b) relataram a estabilidade de PL em uma faixa de pH 4,0-10,0 e 4,0-9,0 com A.

flavus e A. terricola, respectivamente.


67

PE de A. japonicus mostrou estabilidade em uma faixa de pH 3,5-5,5

(SEMENOVA et al., 2003) e para Aureobasidium pullulans em faixa de pH 4,0-6,5

(MANACHINI et al., 1988).

A temperatura ótima foi de 40ºC para atividade de endo-PG, 80°C para a de exo-

PG e PL e 30°C para a de PE (Figura 3). Phutela et al. (2005) estudando pectinases de

A. fumigatus TF3 e Yadav et al. (2008b) trabalhando com PL de A. terricola MTCC

7588 obtiveram o máximo de atividade enzimática a 50°C. Silva et al. (2002) também

observaram que a máxima atividade de PG e PL foi a 55ºC e a 50°C, respectivamente.

Exo-PG de Monascus sp. e Aspergillus sp. exibiram máxima atividade a 60°C e a 50°C,

respectivamente (FREITAS et al., 2006). Os resultados obtidos por Dinu et al. (2007) e

Silva et al. (2007) mostraram uma atividade ótima a 40°C para PG de A. niger MIUG

16 e a 60ºC para exo-PG de P. viridicatum RFC3, respectivamente. A. aculeatus

apresentou máxima atividade de PE a 22ºC (DUVETTER et al., 2006).

Figura 3 - Efeito da temperatura na atividade de endopoligalacturonase (□ - endo-PG),

exopoligalacturonase (∆ - exo-PG), pectina liase (○ - PL) e pectinesterase (◊ - PE) de



68

Endo-PG foi estável a 40°C, apresentando a 50ºC 33% da atividade máxima.

Exo-PG e PL foram estáveis entre 60°C e 80°C. PE mostrou estabilidade entre 30°C e

60°C. Silva et al. (2002) mostraram que a 40ºC por 1 hora, as atividades de PG e PL

foram mantidas em 100% e 80%, e a 50ºC, 55% e 60% das atividades originais de PG e

PL foram mantidas, respectivamente. Yadav et al. (2008a) revelou que 98% da

estabilidade foi mantida a 50°C para PL de A. flavus, diminuindo a estabilidade a

temperatura acima de 50°C. Exo-PG de Monascus sp. e Aspergillus sp. mostrou-se

estável em temperaturas até 50°C (FREITAS et al., 2006). PL e PE de A. japonicus

mostraram estabilidade entre 40°C e 50ºC (SEMENOVA et al., 2003).

CONCLUSÕES A viabilidade da produção de endo-PG, exo-PG, PL e PE utilizando A. niger

URM4645 e a casca do maracujá como substrato em fermentação no estado sólido, foi

demonstrada pelos resultados apresentados neste trabalho. A casca do maracujá é um

subproduto da indústria de fabricação do suco, sendo descartada uma quantidade

expressiva no ambiente. A condição de 10,0 g do substrato, 30% de umidade a 34ºC

com 96 horas de fermentação foi definida como a melhor condição para a produção das

pectinases. As variáveis, quantidade do substrato, umidade e temperatura mostraram

efeitos significativos sobre produção da endo-PG, exo-PG, PL e PE. Endo-PG

apresentou atividade ótima em pH 7,5 a 40°C, exo-PG e PL em pH 7,0 a 80°C e PE em

pH 3,5 a 30°C. Endo-PG foi estável em uma faixa de pH 7,0-8,0 e a 40°C, exo-PG e PL

foram estáveis em uma faixa de pH 6,0-8,0 e pH 6,0-7,5 a 60-70ºC, respectivamente. PE

foi estável em uma faixa de pH 3,5-5,0 e a 30-60°C.

AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Ciência e

Tecnologia do Estado de Pernambuco, Recife, Brasil (FACEPE IBPG-0086-2.03/08), a

Financiadora de Estudos e Projetos, Rio de Janeiro, Brasil (FINEP 2083/07) e ao

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasília, Brasil

(CNPq 552410/2005-5).


69

6. CONSIDERAÇÕES GERAIS

• O método de preservação sob óleo mineral é adequado para preservar culturas de

Aspergillus niger por longos períodos sem afetar a viabilidade e as

características morfológicas e fisiológicas das culturas; • Culturas de A. niger preservadas por até 13 anos são capazes de degradar a

pectina, formando halo de degradação ao redor da colônia;

• A. niger URM4645 foi selecionada para a produção das pectinases através da

fermentação em estado sólido da palma forrageira e da casca do maracujá;

• A condição de 10,0 g do substrato, 107 esporos/g a 28ºC com 96 horas de FES da

palma forrageira foi definida como a melhor para a produção de endo-PG, exo-

PG e PL;

• Para FES da palma forrageira, as variáveis, quantidade do substrato,

concentração do inóculo e temperatura mostraram efeitos significativos sobre

produção da endo-PG, exo-PG e PL;

• A atividade ótima da endo-PG e da PL produzidas por FES da palma forrageira

por A. niger URM4645 foi em pH 5,0 e a 50ºC, enquanto da exo-PG foi em pH

7,0 e a 40°C. Endo-PG e exo-PG foram estáveis em uma faixa de pH 3,5-11,0 e

nas temperaturas de 50°C e 80°C, respectivamente. PL mostrou estabilidade em

pH 5,0 e a 50°C;

• A condição de 5,0 g do substrato, 30% de umidade a 26ºC com 96 horas de FES

da casca do maracujá foi definida como a melhor condição para a produção de

endo-PG, exo-PG, PL e PE;

• Para FES da casca do maracujá as variáveis, quantidade do substrato, umidade e

temperatura mostraram efeitos significativos sobre produção da endo-PG, exo-

PG, PL e PE;

• A atividade ótima da endo-PG produzidas por FES da casca do maracujá por A.

niger URM4645 foi em pH 7,5 a 40°C, enquanto da exo-PG e da PL foram em

pH 7,0 a 80°C e da PE em pH 3,5 a 30°C. Endo-PG foi estável em uma faixa de

pH 7,0-8,0 e a 40°C, exo-PG e PL foram estáveis em uma faixa de pH 6,0-8,0 e

pH 6,0-7,5 a 60-70ºC, respectivamente. PE foi estável em uma faixa de pH 3,5-

5,0 e a 30-60°C;


70

• A viabilidade para a produção das enzimas pectinolíticas utilizando A. niger

URM4645 na FES da palma forrageira e da casca do maracujá foi demonstrada

pelos resultados apresentados neste trabalho.


71

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