UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica

Preparo e caracterização de micelas poliméricas de Pluronic F127

contendo miltefosina

Vinicius Cordeiro de Almeida

Trabalho de Conclusão do Curso de

Farmácia-Bioquímica da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da

Universidade de São Paulo.

Orientador(a):

Prof.(a). Dr(a) Carlota O. Rangel Yagui

São Paulo

2020

1

SUMÁRIO

Pág.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS

RESUMO

1. INTRODUÇÃO

2. OBJETIVOS

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. MICELAS POLIMÉRICAS COMO SISTEMA CARREADOR DE FÁRMACOS

3.2. FORMAÇÃO DE MICELAS POLIMÉRICAS

3.3. ENSAIOS DE HEMÓLISE

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. MICELAS POLIMÉRICAS COMO SISTEMA CARREADOR DE

FÁRMACOS: ESTADO DA ARTE

4.2. FORMULAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE MICELAS POLIMÉRICAS

4.3. REDUÇÃO DO POTENCIAL HEMOLÍTICO DA MILTEFOSINA APÓS

INCORPORAÇÃO EM MICELAS DE PLURONIC® F127

5. CONCLUSÃO

7. REFERÊNCIAS

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Estrutura química da MTF

Figura 2 – Mecanismos de ação da MTF

Figura 3 – Formação de micela a partir de copolímero tribloco PEO-PPO-PEO

Figura 4 – Estrutura Geral de Pluronics®

Figura 5 – Mecanismo de formação de micelas poliméricas

Figura 6 – Técnicas de formulação de micelas poliméricas

Figura 7 – Caracterização de micelas poliméricas de Pluronic® F127 preparadas por

diferentes métodos

Figura 8 – Curva de hemólise de sangue de carneiro desfibrilado com concentrações

crescentes de MTF

Figura 9 – Curva de hemólise de sangue de carneiro desfibrilado com 60 µg/mL de MTF

com concentrações crescentes de Pluronic® F127

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Caracterização de micelas poliméricas de Pluronic® F127 preparadas pelos

métodos de hidratação de filme e dissolução direta, com suas respectivas variações nos

métodos

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LISTA DE ABREVIATURAS

DLS Dynamic Light Scattering - Espalhamento Dinâmico de Luz

MTF Miltefosina

MAPK Mitogen Activated Protein Kinases

PLA poli(ácido lático)

PCL poli(caprolactona)

PEG poli(etilenoglicol)

PEO poli(óxido de etileno)

PPO poli(óxido de propileno)

CMC concentração micelar crítica

Dh Diâmetro Hidrodinâmico

PDI Polydispersity index - índice de polidispersão

HC50 concentração de fármaco responsável pela lise de 50% de hemácias

FDA Food and Drug Administration

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RESUMO ALMEIDA, V. C. Preparo e caracterização de micelas poliméricas de Pluronic F127 contendo miltefosina. 2020. no. 28p. Trabalho de Conclusão de Curso de

Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de

São Paulo, São Paulo, 2020.

Palavras-chave: miltefosina, câncer, nanoestruturas, micelas poliméricas

INTRODUÇÃO: A miltefosina é um fármaco alquilfosfolipídico utilizado para o tratamento da leishmaniose. Estudos também demonstram sua eficácia como agente antitumoral, sendo um composto anfifílico que a membrana plasmática da célula tumoral. A administração desse fármaco por via intravenosa é inviabilizada por conta de sua atividade altamente hemolítica, restringindo o seu uso como antitumoral aos casos de metástases cutâneas de câncer de mama (uso tópico). No entanto, nanotransportadores como micelas poliméricas podem ser uma alternativa para o uso intravenoso do fármaco. OBJETIVOS: Busca na literatura do estado atual do desenvolvimento de micelas poliméricas de Pluronics® como nanotransportadores de fármacos; preparo e a avaliação das características físico-químicas de micelas poliméricas de Pluronic F127 + miltefosina e o impacto da formação dessas micelas na atividade hemolítica do fármaco. MATERIAIS E MÉTODOS: Busca de artigos científicos, de publicação dos últimos 15 anos em bases de dados como Pubmed, Web of Knowledge e LILACs, utilizando como palavras-chave: “polymeric”, “micelles”, “intravenous”, “drug delivery”, “Pluronics” e “polaxamers”, de modo isolado ou combinado; formulação e otimização de micelas poliméricas de Pluronic F127 contendo miltefosina a fim de investigar o efeito da encapsulação de miltefosina em seu potencial hemolítico. RESULTADOS E CONCLUSÃO: As micelas poliméricas de Pluronic F127 possuem potencial importante como carreadores de fármacos, com potencial de aumentar a solubilidade, biodisponibilidade, tempo de meia-vida de fármacos menos hidrossolúveis aumentando a sua especificidade em relação ao alvo terapêutico, com ganhos em termos de eficácia e redução de eventos adversos, principalmente em tratamentos de câncer. A encapsulação de miltefosina em concentração de 0,2% em micelas de Pluronic F127, com o polímero em concentração de até 1% resultou em micelas com diâmetro de 31 nm (±10 nm) que demonstraram 100% de redução do potencial hemolítico da miltefosina, ressaltando a importância do estudo dessa forma de carreamento de fármacos para o desenvolvimento de novas terapias ou aprimoramento de terapias já existentes.

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1. INTRODUÇÃO

Em decorrência do envelhecimento populacional, a incidência do câncer e a

mortalidade associada ao conjunto de doenças classificadas como câncer

encontram-se em ascensão. Atualmente, o câncer é classificado em primeiro ou

em segundo lugar como principal causa de morte prematura (em idades de 30 a

69 anos) em 134 de 183 países. Estima-se que após 2040, ocorrerão mais de 27

milhões novos casos de câncer por ano mundialmente, um aumento de 50%

comparado com a incidência de 18,1 milhões de casos estimada em 2018, o que

evidencia a necessidade do desenvolvimento terapêutico nessa área (Wild et al,

2020).

Na atualidade, os tratamentos disponíveis para o câncer são cirúrgicos,

quimioterápicos, radioterápicos e mais recentemente imunoterápicos. Na

quimioterapia, uma combinação de diferentes moléculas é utilizada para destruir

células tumorais ou reduzir sua atividade proliferativa, atuando em diversos

mecanismos celulares de sobrevivência e proliferação. Porém, devido a atividade

não seletiva dos fármacos antitumorais, uma série de eventos adversos é

observada nos pacientes com câncer, em geral com baixa eficácia do tratamento

(Shewach et al, 2009). A imunoterapia também apresenta-se como uma

alternativa mais recente para o tratamento do câncer, sendo alvo-direcionada e,

portanto, com menor incidência de eventos adversos quando comparada à

quimioterapia (Arruebo et al, 2011). No entanto, apesar da eficácia dessa nova

modalidade terapêutica, há preocupação em relação aos custos associados ao

tratamento com imunoterapia, com potencial de ameaçar a sustentabilidade dos

sistemas de saúde (Ventola, 2017). Adicionalmente, a eficácia desse tipo de

terapia pode ser limitada dependendo do paciente, visto que dependente da

presença ou ausência de determinados biomarcadores, dependendo do tipo de

câncer e da resposta imunológica do organismo do paciente (Ventola, 2017).

Dentro desse panorama, destaca-se a importância da exploração de novos alvos

terapêuticos para prevenção e tratamento do câncer, considerando a maior

eficácia atingida em estratégias terapêuticas de combinação (Mokhtari et al, 2017),

7

o desenvolvimento de terapias mais seletivas, seja por imunoterapia ou com a

aplicação de terapia baseada em nanoestruturas (Arruebo et al, 2011) e o

reposicionamento de agentes terapêuticos já aprovados para outras doenças

(Mokhtari et al, 2017).

A hexadecilfosfocolina (miltefosina: Figura 1) é molécula estruturalmente

derivada da estrutura de fosfatidilcolinas e pertencente à classe de

alquilfosfolipídios, sendo um composto anfifílico, ou seja, possui uma região

hidrofílica e uma região hidrofóbica (Agresta et al, 2003; Mollinedo, 2014).

Atualmente, é utilizada para tratamento de leishmaniose (Jha et al. 1999), mas

também há estudos que comprovam sua eficácia como antitumoral agindo em vias

de sinalização envolvendo proteínas na membrana plasmática da célula tumoral,

induzindo a mesma a apoptose, por exemplo através da inibição da via MAPK

(Mitogen Activated Protein Kinases) por anular a atividade de proteínas Ras,

localizadas na membrana (Mollinedo, 2014). Testes in vitro comprovam

pronunciada atividade antitumoral (Chakrabandhu et al, 2008), porém a

administração in vivo deste fármaco é inviabilizada devido a alta atividade

hemolítica (Agresta et al, 2003), restringindo seu uso no câncer, então, à

administração cutânea (Terwogt et al, 1999). Alta toxicidade gastrointestinal

também é observada durante a administração de miltefosina (MTF) a pacientes

nas doses necessárias para o efeito antineoplásico, ficando essa via restrita ao

tratamento de leishmanioses (Jha et al, 1999).

Figura 1: Estrutura química da miltefosina (MTF).

A atividade hemolítica da MTF se deve à capacidade deste composto de

formar micelas mesmo em baixas concentrações. Essas micelas tem a

capacidade de interagir com a membrana plasmática de eritrócitos, que é

altamente proteica (~52%), e interagir com porções hidrofóbicas das proteínas

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presentes na membrana ou lipídios, resultando na solubilização e ruptura da

membrana, ou seja, sua lise (Moreira et al, 2013).

Figura 2: Mecanismos de ação da miltefosina (MTF). Elaborado pelo autor, adaptado de Pachioni

et al, 2013.

Para alcançar a redução dos efeitos adversos de hemólise e toxicidade

gastrointestinal, uma alternativa é a incorporação da MTF em nanoestruturas.

Sistemas nanoestruturados vêm sendo amplamente estudados pois oferecem

diversas vantagens como aplicação alvo-direcionada de fármacos em um

organismo, aprimoramento da solubilidade de moléculas, diminuição de

toxicidade, aumento de eficácia e ação prolongada do efeito farmacológico (Wang

et al, 2012).

Dentre os nanotransportadores estudados na literatura, as micelas poliméricas se

destacam devido a possibilidade de copolímeros anfifílico se auto-agregarem em

soluções aquosas, resultado de sua baixa concentração micelar crítica (CMC)

(Torchilin, 2007). Polímeros como poli(óxido de etileno)-poli(ácido lático) (PEO-

PLA), poli(óxido de etileno)-poli(caprolactona) (PEO-PCL) e poloxâmeros

(Pluronics®) são biocompatíveis e não geram resíduos nocivos ao meio ambiente

(Mora-Huertas et al, 2010). Esses copolímeros, quando a fração do segmento

hidrofílico é superior a 40%, se agregam formando micelas com núcleo hidrofóbico

e uma coroa hidrofílica (Rijn P et al, 2013). Dependendo das características

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moleculares e da massa molecular dos polímeros, as micelas poliméricas têm um

tamanho entre 10 a 100 nm. O núcleo hidrofóbico dessa formação micelar pode

acomodar fármacos menos hidrossolúveis aumentando a sua solubilidade

significativamente e a biodisponibilidade dos mesmos em um organismo (Sant et

al, 2005).

No caso de Pluronics®, copolímeros tribloco formados por poli(óxido de

etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno) (PEO-PPO-PEO),

nanoestruturas podem se formar a partir do arranjo em micelas, onde a porção

hidrofílica (PEO) se volta para a água, enquanto a porção hidrofóbica (PPO)

compõe a parte interna da estrutura, tendo o contato com a água minimizado

(Figura 3). Essa formação micelar por Pluronics® é vantajosa, já que ocorre

mesmo com o polímero em baixa concentração, por conta de sua baixa CMC, de

~0,15% (Mora-Huertas et al., 2010; Valenzuela-Oses et al, 2017). A formação de

micelas com um interior hidrofóbico favorece a incorporação de compostos

lipossolúveis ou anfifílicos em sua matriz, como representado na Figura 3,

possibilitando o carreamento ao alvo molecular pretendido, otimizando a

biodisponibilidade do fármaco no organismo, e, consequentemente, diminuindo

sua dosagem e efeitos adversos e aumentando a eficácia (Movassaghian et al.,

2015).

Figura 3: Formação de micela a partir de copolímero tribloco PEO-PPO-PEO. Adaptado de Feitosa

et al, 2019.

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2. OBJETIVO(S)

Esse estudo teve como principais objetivos a busca na literatura do estado

atual do desenvolvimento de micelas poliméricas de Pluronics® como

transportador para o carreamento de fármacos, bem como o desenvolvimento e

avaliação das características físico-químicas de micelas poliméricas de Pluronic®

F127 + MTF e o impacto da formação dessas micelas na atividade hemolítica da

MTF.

3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. REVISÃO DA LITERATURA

Os termos “polymeric micelles”, “micelas poliméricas”, “intravenous”,

“intravenoso”, “intravenosa”, “drug delivery”, “carrea*”, “fármacos”, “drogas”,

“Pluronic”. “polaxamers” e “polaxâmeros” foram usados como palavras chaves

para busca nas bases de dados US National Library of Medicine – National

Institutes of Health (PubMed), Web of Knowledge, Biblioteca Virtual em Saúde

(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciências da Saúde – LILACS) e no

Google Scholar.

Duas etapas de exclusão de artigos foram realizadas conforme os critérios

descritos a seguir: (a) foram selecionados estudos publicados entre os anos de

2005 e 2020, em língua portuguesa ou inglesa, que tenham como objeto o estudo

in vivo e/ou in vitro de encapsulação de substâncias em micelas poliméricas com

Pluronics® e sua influência em características como biodisponibilidade, tempo de

meia-vida, efetividade e impacto em eventos adversos; (b) foi levado em

consideração o conteúdo do estudo a partir da análise do título, do abstract e da

conclusão. Os estudos que se adequaram à proposta desse trabalho foram lidos

na íntegra, para sua estruturação. Os estudos que não possuíam o texto na

íntegra disponível para leitura foram excluídos desse trabalho.

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3.2. PREPARO DAS MICELAS POLIMÉRICAS

A miltefosina, com grau de pureza >99%, foi adquirida via Avant Polar

Lipids (USA). O sangue de carneiro desfibrilado foi comprado da NewProv (Brasil).

O copolímero Pluronic® F127 grau farmacêutico, o qual denominamos daqui para

frente Pluronic F127, foi gentilmente cedido pela BASF (Brasil). Todos os materiais

foram utilizados sem purificação adicional. A estrutura do Pluronic® utilizado pode

ser visualizada na Figura 4 e na Tabela 1.

Figura 4: Estrutura Geral dos copolímeros tribloco do tipo Pluronics®. O Pluronic F127 possui

massa molecular de 12.500 Da, sendo que a porção a possui 101 repetições e a porção b possui

56 repetições. Adaptado de Cagel et al, 2017.

As micelas do Pluronic F127 foram obtidas a partir dos métodos de

dissolução direta e hidratação de filme polimérico. No caso de formulação por

dissolução direta, o copolímero foi solubilizado em solução aquosa de cloreto de

sódio (0,9% m/v) para atingir concentração de 9% e a solução foi submetida a

agitação magnética. Na formulação por hidratação de filme polimérico, o

copolímero foi solubilizado em solvente (clorofórmio ou etanol), seguido de

formação de filme polimérico em frasco após remoção do solvente sob pressão

reduzida. Esse filme polimérico foi hidratado com solução aquosa de cloreto de

sódio (0,9% m/v), também resultando em sistema com concentração de 9% de

Pluronic F127. Algumas variações nas etapas de preparo foram realizadas:

variação na forma de remoção de solvente, temperatura de agitação, e emprego

de ultrassom para homogeneização da amostra, no intuito de encontrar

formulação mais adequada.

Após preparo, as amostras foram analisadas e caracterizadas por meio da

técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) por equipamento Zetasizer ZS

Nano (Malvern) com ângulo de dispersão de 90º com a amostra em temperatura

12

ambiente (25 ºC), sendo que os parâmetros de diâmetro hidrodinâmico (Dh) e

índice de polidispersão (PDI) foram determinados.

Por fim, após definição do método ótimo para formação de micelas, a

mesma formulação foi realizada com a adição de MTF (0,2 µg/mL) para verificar

interferência da adição do fármaco na formação de micelas, seguida de

caracterização por DLS para obtenção do Dh e PDI médio. Todas as amostras

foram analisadas em triplicata e a média entre as medidas foi calculada.

3.3. ENSAIOS DE HEMÓLISE

O perfil hemolítico da MTF pura foi investigado através do preparo de

soluções com concentrações crescentes de MTF e sangue de carneiro desfibrilado

(5%), que foram levadas a agitação a 37 ºC por 1 hora e centrifugadas a 3.000

rpm por 5 minutos. A solução sobrenadante foi analisada por espectrofotometria

no comprimento de onda de 540 nm (absamostra), para determinação do HC50

(concentração de fármaco responsável pela lise de 50% das hemácias). A

absorbância das amostras foi comparada a solução salina (abssalina) como controle

negativo (0% de hemólise) e a água destilada (abságua) como controle positivo

(100% de hemólise). Os resultados de hemólise foram demonstrados em % do

total de hemólise atingida, conforme equação abaixo:

% ℎ𝑒𝑚ó𝑙𝑖𝑠𝑒 = 100𝑎𝑏𝑠!"#$%&! − 𝑎𝑏𝑠!"#$%"𝑎𝑏𝑠á!"# − 𝑎𝑏𝑠!"#$%"

Em seguida o efeito da incorporação da MTF nas micelas poliméricas de

Pluronic® e seu impacto no potencial hemolítico foram estudados. A análise

estatística foi feita a partir do software Prism 7 (Graphpad).

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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. MICELAS POLIMÉRICAS COMO SISTEMA CARREADOR DE FÁRMACOS: ESTADO DA ARTE

Nos últimos anos, um dos sistemas de carreamento de fármacos para

farmacoterapia de diversos tipos de doenças estudados foi o de micelas

poliméricas. Micelas poliméricas são nanoestruturas coloidais constituídas de

copolímeros anfifílicos em bloco que, devido à sua baixa CMC, se auto agregam

em soluções aquosas (Croy et al, 2006; Rangel-Yagui et al, 2005). Esse sistema

traz otimizações no carreamento de fármacos, aumentando a solubilidade e a

estabilidade de fármacos hidrofóbicos (Chiappetta et al, 2007). Seu tamanho no

intervalo da escala nanométrica de 10 a 80 nm aumenta o tempo de residência no

organismo por previnir a filtração glomerular e excreção renal e diminuir a

fagocitose por macrófagos observada com nanoestruturas maiores (Movassaghian

et al, 2015). O efeito de permeabilidade e retenção melhorada, característica

favorecida pela encapsulação em micelas poliméricas, permite o direcionamento e

acúmulo do fármaco em tecidos cancerosos versus a ação generalizada do

fármaco livre em outros tecidos, diminuindo a ocorrência de eventos adversos

(Shin et al, 2016).

Quando uma solução aquosa constituída por esses copolímeros anfifílicos

encontra-se em concentração superior à CMC, ocorre uma associação das

cadeias poliméricas que minimiza o contato das porções hidrofóbicas da estrutura

com o meio aquoso externo, levando à formação da estrutura micelar (Figura 5),

composta por um núcleo hidrofóbico, onde fármacos de baixa solubilidade em

água podem se alojar, e um envoltório hidrofílico, que determina a solubilidade da

estrutura e também pode sofrer modificações para promover especificidade ao

alvo terapêutico, além de proteger o fármaco encapsulado do meio externo

(Yokoyama et al, 2010). Uma série de parâmetros devem ser considerados na

utilização de micelas poliméricas como carreadores de fármacos, como

estabilidade da micela, a distribuição de tamanho dessas micelas e sua

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capacidade de encapsular fármacos (Yokoyama et al, 2010). A estabilidade de

micelas é desejada, visto que essas podem passar por diversas mudanças de

ambiente com variação de fatores como pH, força iônica, interação com proteínas

e células e diluição. Um dos principais fatores que influenciam na estabilidade da

micela é a CMC, sendo que valores mais baixos indicam maior estabilidade. A

CMC de micelas poliméricas é geralmente mais baixa quando comparada à CMC

de micelas de tensoativos clássicos, por exemplo, já que essa é influenciada pelo

tamanho da cadeia hidrofóbica do polímero, sendo que uma cadeia maior indica

maior estabilidade, promovida por uma maior coesão do núcleo hidrofóbico.

Partindo desse princípio, também é possível que a encapsulação de um fármaco

pode estabilizar ainda mais a micela, aumentando a quantidade de interações

hidrofóbicas no núcleo das micelas. A porção hidrofílica das micelas poliméricas

também influencia na estabilidade da micela, já que essa porção tem interações

hidrofílicas com o meio aquoso externo. O aumento da cadeia hidrofílica pode

tornar a micela mais rígida, enquanto uma cadeia menor e menos densa promove

a exposição do núcleo hidrofóbico da micela com o meio aquoso, levando a sua

desestabilização (Shawn et al, 2012).

Figura 5: Mecanismo de formação de micelas poliméricas, adaptado de Movassaghian et al, 2015.

Um polímero ideal para o carreamento de fármacos formaria uma micela

com as seguintes características: biodegradável, biocompatível, direcionável, com

baixa toxicidade, com protetor estérico eficiente (para furtividade), que provoca a

estabilização do sistema, que previne agregação promovendo estabilidade

coloidal, que previne adesão de proteínas plasmáticas e permite solubilidade em

15

água (Movassaghian et al, 2015). Considerando essas características, Pluronics®

se mostram como uma família de polímeros promissora para o carreamento de

fármacos. Os diferentes tipos de Pluronics® disponíveis possuem variação no

comprimento das cadeias PEO e PPO, resultando em compostos de diferentes

massas moleculares, e, consequentemente, perfis de solubilidade e CMC. Esses

polímeros são biocompatíveis e aprovados para uso pelo FDA (Food and Drug

Administration), com aplicação em diversos medicamentos e cosméticos (Talelli et

al, 2011), e por já existir extensa literatura utilizando esse polímero para

encapsulação de fármacos em micelas (Cagel at al, 2017), foram escolhidos como

objeto deste estudo.

As técnicas de formulação dessas micelas e encapsulamento de fármacos

podem ser divididas em duas categorias (Figura 6): (a) de polímeros solúveis em

solução aquosa, com adição do fármaco em solvente ou não e (b) de polímeros

que não são imediatamente solúveis em solução aquosa e emprega-se solventes

orgânicos para solubilizar esses polímeros juntamente com o fármaco. As técnicas

da categoria (a) (Figura 6, A-C) são: método auto agregação de micelas com o

fármaco, sob agitação e aquecimento ou não; método de evaporação de solvente,

com incorporação gota-a-gota de fármaco dissolvido em solvente em um sistema

micelar, seguido de evaporação da fase orgânica, e método de emulsão do tipo

óleo em água. As vantagens dos métodos da categoria (a) consistem de sua

simplicidade de formulação e por evitar o uso de solventes orgânicos (ou

minimizar), tornando o processo escalonável e em geral com boa eficiência de

encapsulação. Em contrapartida, essa categoria não é viável para fármacos ou

polímeros altamente hidrofóbicos, resultando em formulações com baixas taxas de

encapsulação. No caso dos métodos da categoria (b) (Figura 6, D e E), as

técnicas são: método de diálise, com remoção do solvente miscível em água

através de diálise e subsequente formação de micelas; e o método de hidratação

de filme, em que a fase orgânica não miscível em água é evaporada, formando um

filme composto por polímero e fármaco, que é hidratado com fase aquosa,

favorecendo a formação de micelas. As vantagens desses métodos são a alta taxa

de encapsulação de fármacos, otimização da interação fármaco e polímero, já que

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ambos os constituintes são solubilizados na mesma fase. No entanto, esses

métodos são mais complexos e menos escalonáveis e há uso proeminente de

solventes orgânicos, que devem ser totalmente removidos para se obter o produto

final (Cagel et al, 2017).

Figura 6: Técnicas de formulação de micelas poliméricas, adaptado de Cagel et al, 2017.

O uso de micelas poliméricas para carreamento de fármacos vem

ganhando relevância em diversas áreas terapêuticas, já que possui uma série de

vantagens como aumento de biodisponibilidade e solubilidade do fármaco

utilizado. Um estudo que utilizou micelas mistas de Pluronic® P123 e lecitina

contendo trans-resveratrol demonstrou, após administração intravenosa em ratos,

um aumento de 40% na biodisponibilidade do fármaco, tornando o seu uso

terapêutico viável, já que a sua biodisponibilidade sem carreador é limitada (Li et

al, 2017). Outro estudo, utilizando micelas de Pluronic® L121, P123 e F127

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contendo vinpocetina demonstrou maiores tempos de meia-vida e de residência in

vivo em coelhos, comparado ao fármaco sem carreador (El-Dahmy et al, 2014).

Essas características são vantajosas para otimizar o tratamento

quimioterápico de câncer, já que a maioria dos agentes quimioterápicos utilizados

atualmente possui baixa solubilidade em água, além de serem inespecíficos,

causando uma série de eventos adversos e toxicidade por conta de sua ação

sistêmica (Narvekar et al, 2014). A doxorubicina é um dos agentes quimioterápicos

estudados para encapsulação em micelas poliméricas de Pluronics®, sendo um

agente com eficácia significativa contra diferentes tipos de câncer. Apresenta,

entretanto, uma série de eventos adversos como náusea e vômito, alopécia,

mielosupressão e cardiotoxicidade (Barenholz, 2012). Os estudos que incluem a

doxorubicina demonstram maior acúmulo do fármaco no tecido tumoral in vitro e in

vivo, com eficácia antitumoral mais alta, além de apresentarem uma redução de

toxicidade (Cagel et al, 2017; Chen et al, 2016; Hong et al, 2017; Huang et al,

2016; Liu et al, 2017), sendo que um estudo chegou a apresentar menor acúmulo

de doxorubicina no tecido cardíaco de ratos, diminuindo o efeito de

cardiotoxicidade (Liu et al, 2017). A formulação de micelas poliméricas de

Pluronics® contendo doxorubicina foi a primeira a ser avaliada em estudos clínicos

para o tratamento de câncer (Alakhova et al, 2013; Armstrong et al, 2006; Valle et

al, 2011; Pito-Barry et al, 2014).

Uma formulação de micelas poliméricas contendo trans-resveratrol, um

fármaco com baixa biodisponibilidade e distribuição cerebral, conseguiu

demonstrar acúmulo do fármaco atravessando a barreira hematoencefálica em um

estudo in vivo via intravenosa em ratos, indicando biocompatibilidade e segurança

considerando baixa atividade hemolítica da formulação (Katekar et al, 2019). Outro

estudo, de micelas poliméricas de Pluronic® P105 contendo docetaxel com adição

de transportador de glicose e ácido fólico demonstrou a capacidade da formulação

atravessar a barreira hematoencefálica, em um modelo in vitro, no intuito de tratar

tumores cerebrais (Niu et al, 2014), o que mostra que é possível aprimorar ainda

mais a seletividade de micelas poliméricas com a adição de agentes seletivos que

se alojam na coroa de PEO das micelas. Esse aprimoramento na seletividade

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também foi demonstrado com micelas poliméricas de Pluronics® contendo

lamotrigina, um antiepilético, também utilizando o transportador de glicose

acoplado as micelas, com penetração in vivo da barreira hematoencefálica (Liu et

al, 2014).

O paclitaxel é outro agente quimioterápico estudado para encapsulação em

micelas poliméricas de Pluronics®; é um fármaco importante no tratamento de

vários tipos de câncer, também com baixa solubilidade em água e eventos

adversos consideráveis como neutropenia, neuropatias periféricas, vômito, náusea

e mialgia. Os estudos com esse fármaco demonstraram um maior tempo de

circulação sistêmica das micelas poliméricas e tempo de meia-vida, com maior

biodisponibilidade, maior atividade antitumoral, maior acúmulo do fármaco no

tecido tumoral e redução de eventos adversos (Chen et al, 2016; Han et al, 2006;

Huang et al, 2016; Wang et al, 2008; Yoncheva et al, 2012; Zhang et al, 2011). Um

estudo clínico de fase 3 de não-inferioridade de paclitaxel encapsulado em micelas

poliméricas versus paclitaxel no tratamento de pacientes com câncer de mama

recorrente ou metastático foi publicado, e, apesar do objetivo primário do estudo

não ter sido atingido, uma menor incidência de neuropatia periférica sensorial, um

dos eventos adversos do paclitaxel, foi observada (Fujiwara et al, 2019). Outro

estudo de fase 3, com formulação de micela polimérica contendo paclitaxel em

combinação com carboplatina demonstrou não inferioridade versus paclitaxel livre

no tratamento de pacientes com câncer de ovário, demonstrando também uma

menor incidência de neuropatia periférica sensorial, sendo que essa formulação

está comercialmente disponível na europa, aprovada com o nome de Apealea®

(Heldring et al, 2018).

As micelas poliméricas de Pluronics® também podem ser utilizadas para

transportar agentes de detecção de tumores, como corantes. Dois estudos

demonstram sucesso ao utilizar indocianina verde encapsulada em micelas de

Pluronics® para a detecção de tumores em ratos (Kim et al, 2010; Kim et al,

2012), tornando o emprego de micelas poliméricas importantes não apenas para

tratamento, mas também para diagnóstico de diferentes tipos de câncer. Nesse

panorama, temos também os chamados “teranósticos”, que consistem em

19

formulações que contêm o agente terapêutico e também o agente diagnóstico.

Portanto, permite a visualização em forma de imagem de um tumor, por exemplo,

antes, durante e após o tratamento, proporcionando maior personalização da

terapia com base nos resultados de imagem (Xie et al, 2010). Um estudo

demonstrou que é possível acompanhar a evolução do tratamento de tumores in

vivo em um sistema de micelas poliméricas contendo paclitaxel e nanopartículas

de óxido de ferro, sendo possível a visualização da diminuição do tumor com

scanner de imagem de ressonância magnética, através da vibração das partículas

de ferro presentes no tumor, provocada pelo scanner (Upponi et al, 2018).

4.2. FORMULAÇÃO DAS MICELAS POLIMÉRICAS

A Tabela 2 apresenta as formulações de Pluronic F127 desenvolvidas neste

trabalho e, como pode ser observado, todas resultaram na formação de micelas,

com variação do Dh de 31 (± 10 nm) a 36 nm (± 16 nm). Embora não tenhamos

realizado análise de microscopia, as micelas de Pluronic F127 foram previamente

visualizadas e apresentam tamanho compatível com o apresentado neste trabalho

(Valenzuela-Oses et al., 2017)

20

Tabela 1: Caracterização de micelas poliméricas de Pluronic F127 preparadas

pelos métodos de hidratação de filme e dissolução direta, com as respectivas

variações nos métodos.

Amostra Método Variação do Método Dh (± Desvio Padrão) (nm)

PDI

A Hidratação de filme

Solvente: etanol remoção de solvente residual por pressão

reduzida

34 (10) 0,481

B Hidratação de filme

Solvente: clorofórmio; remoção de solvente residual por pressão

reduzida

33 (13) 0,480

C Hidratação de filme

Solvente: clorofórmio; remoção de solvente residual por agitação

magnética

35 (17) 0,501

D Dissolução direta

Aquecimento à 25 oC por 5 min

36 (16) 0,473

E Dissolução direta

Aquecimento à 50 oC por 5 min

35 (18) 0,487

F Dissolução direta

Sonicação por 5 min 36 (14) 0,646

Observando a Figura 7, a qual traz as curvas de DLS para os sistemas,

quando a preparação foi realizada por método de hidratação de filme (A-C), não

há diferença significativa entre o preparo de micelas utilizando etanol ou

clorofórmio como solvente, entretanto é visível a formação de picos não micelares

proeminentes (6 e 2631 nm) quando a remoção do solvente residual é realizada

utilizando bomba de vácuo. No caso da remoção de solvente residual por

evaporação sob agitação magnética (D-F), uma redução significativa do pico não

micelar de maior diâmetro foi observada. A formação desse pico se deve a

possível precipitação de polímero ou à formação de agregados durante a remoção

do solvente residual utilizando bomba de vácuo. No preparo das amostras por

dissolução direta, foram aplicados três protocolos de transferência de energia para

as amostras: através de aquecimento a 25 e 50 ºC ou sonicação. Essa variação

não apresentou diferença significativa na formação de micelas, no entanto, a

amostra sonicada apresentou um aumento de estruturas intermediárias entre os

21

picos micelares (de 35 a 36 nm) e os picos monoméricos (6 nm), resultado de um

possível rompimento das micelas em agregados menores, causado pela

sonicação. Observando as amostras que passaram por aquecimento, nota-se que

a amostra que foi aquecida a 50 ºC apresentou resultado semelhante a amostra

sonicada, o que indica a organização de estruturas intermediárias entre os picos

micelares e os picos monoméricos nessa formulação.

Comparando os resultados obtidos para otimização dos métodos de

hidratação de filme (Dh = 33±13 nm e PDI = 0,480) e dissolução direta (Dh =

36±16 nm e PDI = 0,473), é visível que não há diferença significativa na formação

de micelas de Pluronic F127, já que as amostras possuem um Dh e PDI

semelhantes, entretanto a concentração de Pluronic em todas as amostras foi

considerada inadequada devido a formação proeminente de picos não micelares.

Considerando a equivalência entre as amostras seguindo esses métodos de

preparo, foi tomada a decisão de realizar a encapsulação de MTF (20 µg/mL) em

micelas de Pluronic F127 utilizando o método de hidratação de filme com remoção

de solvente por agitação magnética overnight. No intuito de minimizar a formação

de estruturas não micelares/polímero precipitado, essa amostra foi preparada em

concentração de 5% de Pluronic F127 (Figura 7 – G).

22

A

B

C

D

E

F

G

Figura 7: Curvas de espalhamento de luz (DLS) para os sistemas de micelas poliméricas de

Pluronic F127 preparadas por diferentes métodos (distribuição de diâmetro, em nanômetros, por

intensidade, em %). A: hidratação de filme de F127 a 9% (m/v), preparado com etanol, distribuição

de tamanho por intensidade; B: hidratação de filme de F127 a 9% (m/v), preparado com

clorofórmio, com remoção de solvente residual por bomba de vácuo; C: hidratação de filme de

F127 a 9% (m/v), com remoção de solvente residual por agitação magnética overnight; D:

dissolução direta de F127 a 9% (m/v), aquecimento a 25 ºC por 5 minutos; E: dissolução direta de

F127 a 9% (m/v), aquecimento a 50 ºC por 5 minutos; F: dissolução direta de F127 a 9% (m/v),

sonicação por 5 minutos; G: hidratação de filme F127 a 5% (m/v) com adição de MTF (20 µg/mL).

Remoção de solvente residual por agitação magnética overnight. Linhas coloridas representam

medidas individuais e as linhas pretas representam a média entre as medidas.

23

Na Figura 7, é observado em G que ao encapsular MTF em micelas de

Pluronic F127 há formação de um pico único em 31 nm (Dh = 31 ± 10 nm, PDI =

0,145), que corresponde a um pico micelar. A diminuição na concentração do

Pluronic eliminou a formação de estruturas não micelares na amostra, quando

comparada a amostras preparadas com maior concentração. Também é possível

que a MTF tenha ação na estabilização na formação de micelas, por ser um

composto anfifílico, aumentando o número de interações hidrofóbicas com a

cadeia hidrofóbica do Pluronic, conforme descrito Feitosa et al (2019). A formação

desse pico único sugere que ocorreu uma coagregação do fármaco com as

estruturas coloidais de Pluronic F127, formando micelas mistas. Esse resultado se

deve à baixa CMC do Pluronic F127 e também do próprio fármaco, que são de

~0,15% e ~0,20%, respectivamente (Barioni, 2015; Valenzuela-Oses et al., 2017).

4.3. REDUÇÃO DO POTENCIAL HEMOLÍTICO DA MILTEFOSINA APÓS INCORPORAÇÃO EM MICELAS DE PLURONIC F127

Hemólise é a ruptura de células vermelhas do sangue e a dispersão do seu

conteúdo no fluído em que essas células se encontram, e pode acontecer in vivo e

in vitro. Quando as células vermelhas do sangue entram em contato com

compostos anfifílicos, a hemólise pode acontecer por diferentes caminhos, como

desestabilização da estrutura dessas células, ocasionando a dispersão de seu

conteúdo ou a partir da solubilização dos lipídios presentes na membrana

plasmática, também resultando em sua ruptura (Schreier et al, 2000). Na Figura 8

é observada a curva de hemólise causada pela MTF, com um HC50 de 40 µg/mL.

No tratamento da leishmaniose t com MTF, a dose estabelecida para adultos é de

2,5 mg/kg/dia, com uma dosagem máxima de 150 mg/dia por via oral, durante 28

dias (Machado et al, 2010), sendo que sua dosagem máxima é limitada por estar

associada a toxicidade gastrointestinal cumulativa (Sindermann et al, 2006). Os

monômeros de MTF se auto-agregam em micelas quando solubilizados em

solução aquosa, tendo uma CMC de 20,35 µg/mL ou 0,20% (Barioni et al, 2015).

Na Figura 8 é observado que o efeito hemolítico da MTF começa a partir de cerca

24

de 20 µg/mL, o que sugere que esse efeito hemolítico está associado à presença

de micelas de MTF, que interagem com a membrana plasmática causando sua

ruptura, mecanismo já descrito por Blitterswijk et al, 2008. No entanto, deve-se

notar que o efeito hemolítico da MTF também é dependente da concentração de

células vermelhas do sangue, que afeta a taxa de acúmulo da MTF na membrana

plasmática dos eritrócitos (Alonso e Alonso, 2016).

Figura 8: Curva de hemólise de sangue de carneiro desfibrilado em presença de concentrações

crescentes de miltefosina (MTF).

Para reduzir o efeito hemolítico da MTF, foi estudada a incorporação desse

fármaco em micelas de Pluronic F127, a partir de sua formulação utilizando o

método de hidratação de filme com remoção de solvente por agitação magnética

overnight. Para determinar a redução do potencial hemolítico da MTF, foi realizado

ensaio com MTF em concentração de 60 µg/mL, que tem efeito de 100% de

hemólise, com concentrações crescentes de Pluronic F127. O resultado

observado na Figura 9 mostra que com o polímero em concentração de 0,5% já é

obtida redução quase completa do efeito hemolítico da MTF. O aumento da

concentração de Pluronic a partir desse ponto continuou demonstrando redução

de ~100% do efeito hemolítico, portanto o ensaio foi realizado até uma

concentração máxima de 1% de Pluronic. Esse efeito protetor se deve à interação

entre a MTF e as micelas de Pluronic F127, sendo que a formação de micelas por

esse copolímero é resultado da cadeia PPO (hidrofóbica) mais longa do F127,

quando comparado a outros Pluronics (Li et al, 2011), permitindo maior interação

0 50 100 1500

50

100

MTF (µg/mL)

Hem

ólis

e (%

)Hemólise MTF

0.0 0.5 1.0 1.50

50

100

F127 (%)

Hem

ólis

e (%

)

Hemólise com F127

25

da MTF com essa porção e facilitando a auto-agregação do fármaco e do

polímero, que resulta na formação de micelas mistas de MTF e Pluronic F127,

discutidas anteriormente. Desse modo, os eritrócitos ficam protegidos da

hemólise, já que o fármaco interage menos com a membrana plasmática dessas

células. No estudo de Feitosa et al (2019) foi demonstrado que é possível reduzir

o efeito de hemólise da MTF em maiores concentrações, sendo esse feito protetor

mantido ao aumentar também a concentração de Pluronic F127. Essa proteção

não foi observada com outros Pluronics (F108, F68, L44 e L64), que possuem

cadeias PPO de menor tamanho, visto que essas não permitem uma interação

hidrofóbica tão pronunciada e podem formar agregados que ocasionam a

disrupção das micelas de MTF, tornando esta mais disponível para interação com

os eritrócitos e resultando em sua hemólise (Feitosa et al., 2019 e Li et al., 2011).

Figura 9: Curva de hemólise de sangue de carneiro desfibrilado com 60 µg/mL de MTF com

concentrações crescentes de Pluronic F127.

0 50 100 1500

50

100

MTF (µg/mL)

Hem

ólis

e (%

)

Hemólise MTF

0.0 0.5 1.0 1.50

50

100

F127 (%)

Hem

ólis

e (%

)

Hemólise com F127

26

5. CONCLUSÃO

Formulações de micelas poliméricas de Pluronics® vêm ganhando bastante

atenção, principalmente como carreadores de fármacos com ação antitumoral.

Sua capacidade de aprimorar as características de solubilidade, biodisponibilidade

e tempo de meia-vida de fármacos menos hidrossolúveis são interessantes para

aplicação em agentes quimioterápicos e fármacos que precisem atravessar a

barreira hematoencefálica. Essa forma de carreamento também possibilita a

detecção de tumores a partir de marcação com pigmentos, sendo importante

também para desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico. A MTF é um

exemplo de fármaco hidrofóbico que possui atividade antitumoral, mas com um

alto potencial hemolítico, inviabilizando sua administração intravenosa. Esse

trabalho demonstrou que o emprego de micelas poliméricas de Pluronic F127 para

encapsulação de miltefosina permite redução do efeito hemolítico do fármaco,

viabilizando seu uso via parenteral para o tratamento antitumoral. Conclui-se que a

utilização dessa forma de carreamento de fármacos tem grande potencial no

desenvolvimento de novas terapias e otimização de terapias já existentes, em

especial para o emprego de fármacos anfifílicos.

27

6. REFERÊNCIAS

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26/06/2020