precipitacao

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS

DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045

REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO

Trabalho realizado pelo Mestrando em Ciências Animais nos Trópicos Dan Loureiro Nascimento sob orientação do Prof. Dr. Ricardo Wagner Dias Portela do Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular (LABIMUNO). Atualizado em Fevereiro de 2010.

TEIXEIRA, A.C.O.; Ferreira, M.A.S.V. e Marques, A.S.A.. Detecção de Erwinia psidii via enriquecimento em extrato de folhas de goiabeira e imunodifusão radial dupla. Tropical Plant Patology, vol. 33, nº 3. Brasilia, Junho de 2008.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

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• Teste utilizado para detectar a presença de anticorpo (ac)

específicos em fluidos corporais

• Possui boa especificidade, porém apresenta falhas de sensibilidade

• A formação do complexo ag/ac e sua precipitação permite a

visualização do teste

• Facilidade de confecção do teste

• Antígeno e anticorpo são colocados em meio sólido ou líquido,

interagem e precipitam formando uma linha de precipitação, que

indica a presença do anticorpo no soro.


• Utiliza-se, em geral, uma placa de Petri, lâmina de microscopia ou

placa de poliestireno onde se adiciona o gel contendo ou não

antígeno,

• O gel geralmente é composto de agarose ou ágar nobre (a depender

do teste e o tipo de malha e afinidade eletrônica que o mesmo

exige). Depois de preparado e colocado na placa o gel é perfurado e

nestes poços anticorpo e/ou antígeno são colocados, de onde se

difundirão.

• Na região onde o antígeno e o anticorpo se encontrarem (zona de

precipitação) formar-se-á uma linha de precipitação que indica a

positividade da amostra e/ou controle,

• É um método qualitativo (na medida em que indica um resultado

através da presença ou não das zonas de precipitação).

CARACTERÍSTICAS BÁSICASo Elementos necessários para a realização:

• Gel de Agarose ou Ágar (o gel pode ser impregnado com Ac ou não a

depender do tipo de imunodifusão),

• Antígeno purificado (imunodifusão dupla),

• Anticorpo purificado (controle positivo),

• Amostras a serem testadas,

• Placa de poliestireno, Petri, ou lâmina de microscopia,

• Cuba de eletroforese horizontal.


CARACTERÍSTICAS BÁSICASo Elementos necessários para a realização:

Placas Imunodifusão

Cuba de eletroforese horizontalPlaca de PetriAcervo pessoal.

http://www.biomol.com.br/Imagens/Fotos/%7B1isqt6495xo2bv02u0i43dlgfdrxh4%7D_Cubas%20de%20Eletroforese%20Horizontal%2014%20x%2014.JPG

http://eximlab.com.br/images/fotos/fotop_DGH12_3.jpg


o Vantagens• É um método de fácil execução,

• Não necessita de aparato sofisticado,

• Teste com boa especificidade (característica que indica que o

teste em questão identificará somente o ag ou ac desejado) –

menor risco de falsos-positivos,

• Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo,

• Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo em

comparação com outras técnicas.


oDesvantagens• Falhas em sensibilidade, o que indica um alto risco de falsos

negativos,

• É um teste que apresenta alguns problemas com a

reprodutibilidade,

• Apesar de ser um texte de rápida execução, o tempo de

incubação é muito grande, de 24 até 72 horas em alguns casos.

• Difícil peservação do gel

• Não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas.

PRINCIPAIS TIPOS

PRINCIPAIS TIPOS

EM MEIO SEMI-SÓLIDO

• IMUNODIFUSÃO RADIAL: dosagem de ac ou ag

• IMUNODIFUSÃO DUPLA: detecção de ac

• IMUNOELETROFORESE: avaliação de imunoglobulinas

CURVA DE PRECIPITAÇÃO

Zona de excesso de anticorpo

Zona de equivalência

Zona de excesso de antígeno

+ - -+- -

Anticorpo livre

Antígeno livre Precipitação de anticorpo

Quantidade de antígeno adicionado

IMUNODIFUSÃO RADIAL (Mancini e Fahey, 1965)1) A placa se encontra cheia de gel impregnado com um anticorpo específico,

2) Coloca-se os controles positivos e as amostras a serem testadas nos poços perfurados no gel,

3) Incuba-se a placa por 48 horas,

4) Os halos (zona de equivalência) formados em tono dos poços são medidos,

Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go.


o Interpretação dos resultados:• Durante a incubação ocorre a difusão do antígeno na agarose e a formação de

complexos ag-ac.,

IMUNODIFUSÃO RADIAL

• Os complexos precipitam e formam um

halo ao redor do orifício,

• Existe uma relação linear entre o

quadrado do diâmetro do halo (d2) e a

concentração do antígeno,

• Utilizando antígeno de concentrações

conhecidas pode-se fazer uma curva

padrão, permitindo determinar a

concentração em amostras

desconhecidas.

http://www.anflalab.com.br/images/Hoja%20Diffuplate%20051.jpg



o Aplicações na medicina humana e veterinária:• Diagnóstico de doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de imunoglobulinas

e proteinas séricas seja significativa

• Exemplos: dosagem de imunoglobulinas e proteina séricas (tanto em

humanos como em animais).

IMUNODIFUÃO RADIAL

Acervo Pessoal.

IMUNODIFUSÃO DUPLA (Ouchterlony, 1947) 1) O gel de agarose ou agar é preparado e colocado na placa,

2) Após a solidificação do gel, poços são perfurados com um molde (perfurador ou roseta),3) adiciona-se antígeno , controle positivo e a amostra a ser testada nos poços perfurados,4) Incuba-se a placa por 48 horas.

5) Os complexos ac-ag se formam e precipitam formando linhas de precipitação que indicam o resultado.


Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go

o Interpretação dos resultados:• A formação e localização da banda de

precipitação indicam a presença de ac

bem como sua concentração em relação

ao ag,

• Quanto mais perto do ag maior a

concentração de ac na amostra .

IMUNODIFUSÃO DUPLA

Acervo pessoal.

o Aplicações na medicina humana e veterinária:• Muito usado no diagnóstico de doenças infecto-contagiosas,

• Exemplos na Medicina Humana: Candidísase, Histoplasmose e

Aspergilose

• Exemplos na Medicina Veterinária: Doença de Maedi-visna, Brucella

ovis.

IMUNODIFUSÃO DUPLA

IMUNOELETROFORESE1) O gel é preparado e perfurado após sua solidificaçação,

3) É colocado o ac e/ou ag (a depender do tipo de imunoeletroforese) nos poços ou canaleta perfurados,4) O gel numa cuba de eletroforese horizontal,5) É aplicada carga no gel, esta carga é a responsável pela migração de ag,

7) Ac e ag formam arcos de precipitação no gel

2) O pH do gel éescolhido de forma que partículas negativas migrem para o eletrodo positivo,

6) É cortada uma canaleta entre os poços, a qual será preenchida com ac,

BURMESTER, G.R.; Pezzutto, A.. Color Atlas of Immunology. Thieme, Germany, 2003.

o Interpretação dos resultados:• Proteínas podem ser identificadas baseado na intensidade, forma e posição

das linhas de precipitação,

• Cada arco de precipitação representa um antígeno.

IMUNOELETROFORESE

Imunoeletroforese

Rocket Eletroforese

o Aplicações na Medicina Humana e Veterinária:• Utilizada em pacientes com suspeitas de gamopatias monoclonais e

policlonais. Imunoglobulinas policlonais são distribuídas uniformemente

através da fração de gama-globulina depois da separação eletroforética.

• Diagnóstico sorológico de algumas doenças

• Exemplo na Medicina Humana: detecção de ac e ag bacterianos

(Meningite e Septicemia), Cisticercose.

• Exemplo na Medicina Veterinária: cisticercose, alérgenos.

IMUNOELETROFORESE

REFERÊNCIAS

• BURMESTER, G.R.; Pezzutto, A.. Color Atlas of Immunology. Thieme, Germany, 2003.• ROITT,I.M.; Rabson, A.; Delves, P.J.. Really Essential Medical Immunology. Ed – 2.

Blackwell Publishing. Massachusetts – USA, 2005. • TEIXEIRA, A.C.O.; Ferreira, M.A.S.V. e Marques, A.S.A.. Detecção de Erwinia psidii via

enriquecimento em extrato de folhas de goiabeira e imunodifusão radial dupla. Tropical Plant Patology, vol. 33, nº 3. Brasilia, Junho de 2008.

• http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg• http://pathmicro.med.sc.edu/Portuguese/13.GIF• http://eximlab.com.br/images/fotos/fotop_DGH12_3.jpg• http://www.biomol.com.br/Imagens/Fotos/%7B1isqt6495xo2bv02u0i43dlgfdrxh4%7

D_Cubas%20de%20Eletroforese%20Horizontal%2014%20x%2014.JPG• http://www.anflalab.com.br/images/Hoja%20Diffuplate%20051.jpg• http://www.fcf.usp.br/Ensino/Graduacao/Disciplinas/LinkAula/imunoprecipitacao.p

df• http://www.unirio.br/DMP/Graduacao/Medicina/Imunologia/Ag-Ab%20Reactions.p

df• http://www.scielosp.org/img/revistas/rsp/v12n1/11f1.gif


http://pathmicro.med.sc.edu/Portuguese/13.GIF

http://eximlab.com.br/images/fotos/fotop_DGH12_3.jpg



http://www.anflalab.com.br/images/Hoja%20Diffuplate%20051.jpg

http://www.fcf.usp.br/Ensino/Graduacao/Disciplinas/LinkAula/imunoprecipitacao.pdf

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http://www.scielosp.org/img/revistas/rsp/v12n1/11f1.gif

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