pr rácticas - umhocw.umh.es/ciencias/genetica_molecular/materiales-de... · 2013-02-11 · la m...
TRANSCRIPT
[G
Pr
[GENÉTI
[María R
GRADO E
ráctic
ICA MOLE
Rosa Ponc
N BIOTEC
cas
ECULAR]
ce Molet]
CNOLOGÍA
A]
Área de GUniversid
NOMBRE
Genética dad Migue
:
Problema:
Genotipo
Tipo de opeOperador: Gen estruct
Problema:
Genoti
Tipo de opeOperador: Gen estruct
el Hernán
os C
efe
erón:
tural (enzim
pos ef
erón:
tural (enzim
dez Gr
PRÁCTIC
Enzima 1
on ector
Sefe
a 2):
Enzima 1
Con fector
Sefe
a 2):
rado en B
CA 1: OP
Activid
Sin ector
Coefec
Gen Gen Gen
Activi
Sin ector
Coefec
Gen Gen Gen
Departamiotecnolog
Grupo:
PERONES
ad enzimátic
Enzima 2
on ctor
Sin efect
regulador:estructural estructura (
idad enzimát
Enzima 2
on ctor
Sin efect
regulador:estructural estructura (
G
mento de gía
Fec
ca
En
or Con
efector
(enzima 1): enzima 3):
tica
En
or Con
efector
(enzima 1): enzima 3):
GENÉTICA M
Biología Curso
cha:
nzima 3
r Sin
efector
nzima 3
r Sin
efector
MOLECULAR
Aplicada2012-13
R
Problema:
Genoti
Tipo de opeOperador: Gen estruct
Problema:
Genoti
Tipo de opeOperador: Gen estruct
pos ef
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Enzima 1
Con fector
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a 2):
Enzima 1
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GE
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ENÉTICA MO
nzima 3
r Sin
efector
nzima 3
r Sin
efector
OLECULAR
página 3
GENÉTICA
página
4
Área de GUniversid
NOMBRE
1.- Ensayo 1.1.- Siem 1.2.- Anál2.- Mecanirradiación 2.1.- Siem 2.2.- Anál3.- Mutaci 3.1.- Siem 3.2.- Anál
Primera paEn
genética prlo largo de la disponibsumamente
El eel profesormétodo sentyphimuriumeste aminoáreversión dde coloniasdel ensayo,incluye al gimplicado ebacteriana,
Un con varias metabolismmutagénicoutilizando lque reviertfungicida, concentraci
MOLECULA
Genética dad Migue
:
PRÁ
o de deteccmbra de las isis de los rismos de n con luz u
mbra de las isis de los ones espo
mbra de las isis de los
rte: Ensayo el ambienteroduciendo mla vida de ubilidad de ue importanteensayo más ur estadounidncillo, rápidom, portadoraácido (mutae la mutaciós de la estirp las estirpesgen uvrB, deen la biosínt incrementaelevado porversiones,
mo humano)o de dos coas estirpes aen por distiherbicida yiones es tóx
AR
el Hernán
CTICA 2:
ción de muestirpes
resultados reparación
ultravioletaestirpes resultados ntáneas. Eestirpes resultados
de deteccióe existen numutaciones un individuo un ensayo e. utilizado pardense Bruceo y barato quas de mutacciones his‐). ón his‐, analipe auxótrofas utilizadas (el sistema dtesis de biot la permeabcentaje de mentre ellas
), son tambompuestos qauxótrofas dntos mecaniy como prica.
dez G
MUTAC
CR
utágenos a
n de los da
Experiment
n de mutágemerosos age(mutágenoses una de lade detecció
ra la detecció Ames y seue utiliza estciones de péLa mutagenzando la capa de SalmonBA13 y TA98e reparacióntina. Ademáilidad de la mutágenos ss la que inbién carcinóquímicos, la e Salmonellsmos. La azopelente (g
Grado en B
CIÓN Y RE
RONOGRAM
mbientales
daños prod
to de Luria
enos ambienentes químics ambientaleas principaleón de com
ón de mutág conoce, potirpes auxótrdida de funicidad de unpacidad del pnella en med8, entre otran por escisióás, la presenestirpe TA98según los rescluye enzimógenos. En azida sódica typhimuriuida sódica sgenera N2) e
DepartamBiotecnolo
Grupo:
EPARACI
MA
s
ducidos en
y Delbrück
ntales cos y físicoses). La acumes causas depuestos po
genos fue deor ello, comrofas para lanción en genn compuestopresunto mudio sin histidas) son tambón de nuclencia de la m8 a ciertos cosultados de mas de hígaesta prime
ca (NaN3) y um BA13 y Te emplea con la fabric
mento de ogía
Fec
ÓN DEL
n el DNA p
k
s capaces demulación de ml desarrollo tencialment
esarrollado ho “test de a histidina denes esencialeo se determinutágeno de idina. Para pién portadoótidos (NER
mutación rfa,ompuestos veste ensayo ado de mamera parte, eel peróxido
TA98, portadomo conservcación de
Biología Curso
cha:
ADN
1
por
e alterar la mutaciones de tumores
te mutagéni
hace cuatro Ames”. Se e la bacteriaes para la bina analizandncrementar potenciar la ras de una d) y a un gen, que afectavoluminososbacteriano mífero paraevaluaremoo de hidrógdoras de mutvante de meairbags, pe
Aplicadao 2012-13
2 3
informaciónsomáticas as, por lo queicos resulta
décadas portrata de una Salmonellaosíntesis dedo la tasa dela apariciónsensibilidaddeleción quen adyacentea a la pared. (que cuenta simular els el efectogeno (H2O2),taciones his‐
dicamentos,ero a altas
e
r
a e e
e e
o , ‐ s
La mleucina (CTreacción denucleótido deshidroge
Cada gru
de histidisembraránsea homo
Sembrar t
Sembrar
A contin
retiraremo
Cada ca
contiene:
Utilizand
Petri .
Por últim
filtro (aña
10
10
10
Las cajas
¿Qué sig
En el testmínimo suple
mutación hiC) por otro e la ruta deque producenasa de hist
upo recibirá
na. Se empn en cajas dgénea. tres cajas co
otras tres c
uación, espe
os las bolita
ja de Petri s
do pinzas est
mo, dispensa
adiendo cada
0 l de H2O e
0 l de azida
0 l de de ag
s de Petri se
nifica que la
t de Ames, cementado con
isG46 de la de prolina (e biosíntesise un cambioidina que ca
seis cajas de
plearán culte Petri con
on 100 μl de
ajas con 100
eraremos ha
s de vidrio s
se rotulará i
Caja
1
2
3
4
5
6
tériles, se co
aremos con
a sustancia a
estéril (contr
sódica (2,5
ua oxigenad
incubarán d
as estirpes B
uando proban trazas de his
estirpe BA1CCC) en la A de histidin (desfase) etaliza las do
e Petri con m
ivos bacterila ayuda de
l cultivo de l
0 μl del cultiv
sta que la su
iguiendo las
ndicando el
Estirp
olocará un d
una micropi
a una caja se
rol) .............
mg/ml) .......
da 50% (H2O2
durante 66 h
A13 y TA98
mos la capacstidina?
13 es una trATP fosforriba. La mutacn la pauta dos últimas et
medio de cul
ianos que s bolitas de v
la estirpe BA
vo de TA98 .
uperficie de
s instruccion
número de
pe
disco de pap
peta las sigu
embrada con
...................
...................
2) ................
oras a 37°C
son auxótro
cidad mutagé
ransición TAbosiltransferción hisD305e lectura deapas de la ru
ltivo mínimo
se encuentravidrio, para
A13 .............
...................
las cajas de
nes del profe
l grupo, la f
Sustancia adis
pel de filtro
uientes sust
n BA13 y a ot
...................
...................
...................
en la estufa
fas para la h
nica de una
GE
A→CG que sasa, enzima 52 en TA98 l ARNm del uta biosintét
o suplementa
an en la faque la distri
...................
...................
Petri se seq
esor .............
echa y el no
añadida al co
estéril en el
ancias sobre
tra caja sem
...................
...................
...................
..................
histidina?
sustancia, ¿p
ENÉTICA MO
sus tuye un que catalizaes una delegen hisD qutica.
ado con biot
se estacionibución de l
..................
..................
que, momen
..................
ombre de la
centro de c
e los discos
brada con TA
..................
..................
..................
..................
por qué usam
OLECULAR
página
residuo dea la primeraeción de une codifica la
tina y trazas
aria que seas bacterias
..........
..........
to en el que
..........
estirpe que
cada caja de
de papel de
A98):
..........
..........
..........
..........
mos un medio
5
e
s
e s
e
e
e
e
o
GENÉTICA
página
6
¿Por qué a
¿Por qué v
De los com
¿Qué tipo
Explica br
Segunda paultravioleta
La c
DNA por loredundantesistemas dede la célula
La lmaterial gehélice y puprovocadosfundamenta
Mucen la esperadiación Uxeroderma padecen so
El objestirpe muta
Cada gru
SV3 y a ucorrespon
Cada gru
estériles l
MOLECULA
aparece un ha
vemos colonia
mpuestos eva
o de mutacion
evemente qu
arte: Mecana
células poseos diversos es. La integre reparación o el organisluz ultraviolenético (prinuede provocs por la luz almente. chos de los cie humanaV. Las mutapigmentosan extremadaetivo de esta ante de Salmo
upo recibirá
una estirpe nde, aproximupo realizar
os volúmene
AR
alo de muerte
as en las cajas
luados, ¿cuál
es producen?
é es un desfas
ismos de re
en múltipleagentes muridad del ma y la deficiesmo correspleta (UV) esncipalmentecar la muerUV se repa
mecanismosa constituyeciones en va, que produamente proppráctica es co
onella typhimu
dos cultivo
mutante, a madamente, ará tres dilu
es que se ind
e en las cajas q
s en las que he
o cuáles han
?
se.
eparación de
s mecanismoutagénicos aaterial genétncia en alguondiente a ds un potente, la formacirte celular pran por los
s de reparace la vía prinarios de los gce hipersenspensos a desomparar la seurium tras la ir
os de Salmon
una densida 109 célulasciones suce
dican en la t
que llevan el d
emos añadido
resultado ten
e los daños
os de reparaa los que estico dependuno de ellos determinadoe mutágenoión de dímepor colapsosistemas d
ción están cncipal de egenes de estsibilidad a lasarrollar cánensibilidad y crradiación con
nella typhim
ad óptica ds por mililitresivas de ca
abla:
disco impregn
o agua como c
ner capacidad
producidos
ación para están expueste del funciose traduce eos agentes m que produceros de pirim de la reple reparación
onservados liminación dta ruta provoa radiación Uceres de pieapacidad repan una dosis de
murium, corr
e 1 (medidao de cultivoada cultivo,
nado en H2O2?
control?
mutagénica?
en el ADN
eliminar los tas, algunosonamiento cen un incremmutagénicos.ce lesiones midinas) queicación. En n por fotorr
en la evolude las lesioocan enfermUV, por lo ql cuando se aradora de la e luz ultraviole
respondiente
a a 550 nm.................., transfirien
?
por irradiac
daños produs de ellos pcorrecto de mento en la de diversa íe distorsionprocariotas
reactivación
ción, como ones provocmedades gravue los indiviexponen a lestirpe silveseta de 4000 μ
es a la estir
). Esta dens..................ndo a tubos
ción con luz
ucidos en elarcialmentetodos estossensibilidad
índole en elan la dobles, los dañosy por NER,
el NER, queadas por laves, como laiduos que laa luz solar.stre SV3 y unaμJ/cm2.
rpe silvestre
sidad óptica.......... s eppendorf
z
e s
e s
e
a
e
f
Las célul
de las bac
Sembrar
Sembrar
A contin
retiraremo
Cada caj
contiene y
¿Cuántas
cuales se hic
Paso
Factor d
Númeroml
Volumedel paso
Volume(μl)
Volume
as se sembr
cterias sea h
r tres cajas d
r tres cajas d
uación, espe
os las bolita
a de Petri s
y el tratamie
Caja
1
2
3
4
5
6
colonias espe
ieron las diluc
de dilución
o de célula
n de cultivoo anterior
n de med
n total (μl)
arán en las c
omogénea.
de Petri (sin
de Petri (con
eraremos ha
s de vidrio s
se rotulará i
ento recibido
Estir
SV
SV
SV
Muta
Muta
Muta
erarías observ
ciones) conten
s por 1
o (μl)
io LB
cajas de Petr
ampicilina)
n ampicilina)
sta que la su
iguiendo las
ndicando el
o:
rpe
3
3
3
ante
ante
ante
var en las caja
nían 109 célula
0
1
109
1
ri con la ayu
con 100 μl d
) con 100 μl
uperficie de
s instruccion
número de
Nin
Luz uSe cubre
Luz uSe expon
Nin
Luz uSe cubre
Luz uSe expon
as control (nú
as por mililitro
1
102
107
10
990
1000
da de bolita
de la dilución
de la dilució
las cajas de
nes del profe
el grupo, la f
Tratami
guno (se inc
ltravioleta (inmediatam
aluminy se incuba
ltravioleta (ne a luz visiby se incuba
nguno (se inc
ltravioleta (inmediatam
aluminy se incuba
ltravioleta (ne a luz visiby se incuba
úmeros 1 y 4)
o?
GE
2
104
105
10
990
1000
s de vidrio,
n 3 de la est
ón 3 de la est
Petri se seq
esor .............
fecha, el no
ento
uba a 37°C).
4000 μJ/cm2
ente con panio a 37°C.
4000 μJ/cm2
le durante 1 a 37°C.
cuba a 37°C)
4000 μJ/cm2
ente con panio a 37°C.
4000 μJ/cm2
le durante 1 a 37°C.
) si los cultivo
ENÉTICA MO
3
105
104
100
900
1000
para que la
irpe silvestr
tirpe mutant
que, momen
..................
ombre de la
.
2). pel de
2). 1 hora
2). pel de
2). 1 hora
os iniciales ( a
OLECULAR
página
distribución
e SV3 .
te ......
to en el que
..........
estirpe que
a partir de los
7
e
e
s
GENÉTICA
página
8
¿Se aprec
¿Qué mecan
¿Se obser
Propón u
mutante?
Glosario es
agua oxigen
ATP fosforr
auxótrofo (
auxótrofo (
azida sódica
biotina
cambio en l
carcinógeno
deshidroge
dímero de p
ensayo de A
fotoliasa
fotorreactiv
hígado
hipersensib
histidina
leucina
mamífero
medio míni
mutación so
mutación
mutación p
mutagénico
mutágeno
prolina
reparación
reversión
ruta biosint
MOLECULA
cia alguna dife
ismo de repa
rva alguna dife
n hipótesis q
pañol‐inglés
nada
ibosiltransfe
adjetivo)
sustantivo)
a
la pauta de l
o
nasa
pirimidinas
Ames
vación
bilidad
mo
omática
untual
o
por escisión
tética
AR
erencia entre
ración podría
erencia entre
que explique
s
erasa
lectura, desf
n de nucleóti
e los cultivos
ser el respon
las cajas de la
los resultado
A
fase f
A
ido
expuestos a
sable de la dif
a estirpe silves
os observado
hydrogen pe
ATP phospho
auxotrophic
auxotroph
sodium azid
biotin
frameshift
carcinogen
dehydrogen
pyrimidine d
Ames test
photolyase
photoreactiv
liver
hypersensiti
histidine
leucine
mammalian
minimal me
somatic mut
mutation
point mutat
mutagenic
mutagen
proline
nucleotide e
reversion
biosynthetic
luz visible y l
ferencia obse
stre SV3 y las
os. ¿Qué enzi
eroxide
oribosyltran
c
de
ase
dimer
vation
ivity
dium
tation
ion
excision repa
c pathway
os irradiados
rvada? Razon
de la estirpe
ma podría es
sferase
air
s sólo con luz
na tu respuest
mutante?
star dañada
ultravioleta?
ta.
en la estirpe
?
e
Área de GUniversid
NOMBRE
Tercera La e
incapacita degradaciónprovoca su (AraS). Sin observan almutantes qy originar c
Bajoforma aleatEl cultivo elugar a colopuesta a lextensión atransmitien
Luriinterpretacevidencia emanifiesto fundamenta
PROTOCOTres
Salmonella continuacióml, nuevamcon ellos 10suspensión (“cultivo gr
Cada gru
eppendorfsembrará:
4 ca
4 ca
Las cajas deglucosa. La incubarán a
Genética dad Migue
:
PRÁCTIC
parte: Mestirpe SV3 para catalizn de la aramuerte celuembargo, clgunas colonue han perdolonias. o un punto toria y esponen presencialonias. Los a anterior, ha cualquier ondo a sus desia y Delbrüión neodarwexperimentaal otorgarlealmente por
OLO s días antetyphimurium
ón, se prepamente con ta00 ml de me(50 ml) se ande”). Los
upo de alum
f con 0,4 m: ajas de Petri
ajas de Petri
e Petri contisuspensión a 37°C duran
el Hernán
CA 2: MU
utacionede Salmonezar la convabinosa. La ular, por lo qcuando se inias resistentdido la sensi
de vista neontánea, indea de arabinopartidarios hubiesen sosotro compuescendientes ck publicarwinista y ql posterior e a los dos este trabajo
s del comiem SV3 de ura una serieampón Tris‐sdio mínimo divide en 1617 recipient
mnos recibirá
ml de cada u
(cada una co
(cada una co
enen medio de células d
nte tres días.
dez Gra
UTACIÓN
es espontlla typhimurersión de Lacumulaciónque SV3 es snocula un etes (AraR). Ebilidad a ara
odarwinista,ependientemosa sólo evidde la adaptstenido que sto, como cola resistencon en 1943ue constituque refute investigadoo.
enzo de la una caja de e de dilucionales; despué(tampón Tri6 tubos (“cues se incuba
á un tubo ep
uno de los
on 100 μl de
on 100 μl de
mínimo sólidebe extende.
ado en Bio
N Y REPA
táneas. Exrium es portL‐ribulosa‐5‐n de la L‐risensible a laelevado núml fenómeno abinosa y, e
las mutaciomente de la pdencia la extación herelas bacteriaonsecuenciaia. 3 un sencilye el motivdicha interpores el Prem
práctica se Petri y se
nes: 50 μl deés se tomans‐sales, glucultivos pequean con agitac
ppendorf co
cultivos peq
el cultivo gra
e un cultivo p
ido suplemeerse uniform
Departamotecnologí
Grupo:
RACIÓN
xperimentadora de u‐fosfato a Dibulosa‐5‐fosa presencia dmero de cése debe a lan consecuen
ones que copresencia o xistencia de ditaria postas adquieren de la prese
lo experimevo de la ppretación, y mio Nobel d
toma con resuspende
e esta suspe 0,2 ml de ecosa y requeeños”), y la ción, durant
on 1,2 ml de
queños. Usa
ande) ..........
pequeño dis
ntado con amemente sob
GE
mento de ía
Fec
DEL ADN
nto de Luna mutaciónD‐xilulosa‐5‐sfato es tóxde arabinosalulas en mea aparición, encia, pueden
nfieren resiausencia delos mutanteulada por L la resistencncia de ésta
ento que prresente prásu gran tra
de Fisiología
un asa de en 5 ml dnsión de céesta segundarimientos) yotra mitad e 3 días, a 3
el cultivo gr
ando bolitas
...................
tinto) .........
rabinosa y cbre la superf
ENÉTICA MO
Biología Curso
cha:
N (cont.)
uria y Deln en el gen fosfato, en xica para laa en el mediedio con aren la muestrn crecer en s
stencia se pe arabinosa ees resistentLamarck, intcia a la araba en el medio
rueba la vaáctica. No hascendencia a o Medicin
cultivo unade tampón Tlulas se dilua suspensióny se agita. Lase coloca en7°C.
rande (50 m
s de vidrio,
..................
..................
con glicerinaficie de las c
OLECULAR
página
Aplicadao 2012-13
)
brück. araD que lala ruta de
a bacteria yo de cultivorabinosa, sera inicial, desu presencia
producen deen el medio.es, que danterpretacióninosa, y poro de cultivo,
alidez de lahay ningunase puso de
na en 1969,
colonia deTris‐sales. Auyen hasta 5n, se inocula mitad de lan un matraz
l) y 4 tubos
cada grupo
..........
..........
en lugar decajas, que se
9
e y o e e
e r ,
e ,
e A 5 z
s
o
e e
GENÉTICA
página
10
Notcaja de PetPara ello se
Cada gru
de coloniacultivo gra
A contin
cultivos p ........
MOLECULA
0
ta: Como cori con medioe siembra po
upo de alum
as resistenteande. Los re
uación se ca
equeños y d
Tabla
Cultivo grande
16 cajas
Media
Varianza
AR
ntrol de la so mínimo coor estría una
nos realizará
es que han asultados se
alculará por
del grande, c
1.‐ Número
Grupo
A
B
C
D
a
sensibilidad n arabinosacolonia en c
á el recuento
parecido enanotarán en
separado la
combinando
de colonias
Número de colonias
a la arabino y glicerina cada una de
o de las colo
las cajas sen la Tabla 1 ..
a media y la
los resultad
resistentes
Cpe
osa de la esty en otra colas dos caja
onias de las
mbradas a p...................
a varianza d
dos obtenido
presentes e
Cultivos equeños
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Media
Varianza
irpe SV3, seon medio míns de Petri.
cajas de Pet
partir de los ...................
e los recuen
os por cuatro
n las cajas d
Grupo
A
B
C
D
e puede semnimo con só
tri, indicand
cultivos peq..................
ntos procede
o grupos dis
e Petri
Número de colonias
brar en unaólo glicerina.
o el número
queños y del..........
entes de los
stintos (A‐D)
o
s
Área de GUniversid
NOMBRE
Mutagénes1.‐ Síntesis 2.‐ Prepara3.‐ Digestio4.‐ Transfor5.‐ Siembra6.‐ Análisis
DÍA 1 Primera pa
Dur
punto de desarrolladgen, alteranmutagénespermiten erelativamen
En eun kit comeemplea la tla mutagéncebadores Las molécu(mutantes) organismo dparentales,
Cada un plásmidcontienen emedio de ccolorimétricprimer expeinactivar el fragmento producir la
Genética dad Migue
:
sis dirigida dde las cadención de un gon de las mormación de la en placas dde los result
rte: Mutagé
rante buena partida la io procedimindo de formis dirigida stablecer el nte sencilla yesta prácticaercial (QuikCécnica de la esis se utiliz(oligonucleólas que sirveporque las
del que se o utilizando lgrupo realizo distinto, el fragmentocultivo. El gca, convirtieerimento, se fragmento lacZα del pcomplemen
el Hernán
PRÁCT
del fragmentnas mutantegel de agarosléculas parela estirpe DHde Petri de latados obten
nesis dirigid
parte del siinducción yientos, basa
ma específicase lleva a cnúmero y lay versátil esta, realizaremChange Site‐DPCR para inza una polimótidos sintéten de moldes primeras btuvo el pláa restrictasazará dos expel pBluescrio lacZ del gen lacZ codendo el galae introducirálacZα. En el plásmido pWtación con
dez G
TICA 3: M
Cr
to lacZα del es sa y electrofntales con DH5α as células soidos
da del fragm
glo XX la disel aislamie
dos en la Ina su secuenccabo in vitra posición dte tipo de mmos un expeDirected Mutroducir mumerasa termticos) comple (parentalesestán metismido. Esta a DpnI que aperimentos dpt II SK(‐) y
gen lacZ, cuydifica la enzactósido X‐Gá una mutacsegundo ex
Whitescript‐4n el producto
Grado en B
MUTAGÉN
ronogram
gen de la β‐
foresis de losDpn I
metidas a tr
mento lacZα
sección genéento de mungeniería gecia y estudiaro, sobre mde los nucleóutagénesis. rimento de utagenesis), dtaciones en oestable coementarios s) pueden diiladas con característicctúa específde mutagéney el pWhiteya expresiónima ‐galacGal, que es ción en el plperimento s4.5 kb. Se eo del fragme
DepartamBiotecnolo
Grupo:
NESIS DIR
ma
‐galactosida
s productos
ransformació
del gen de la
ética de la fuutantes. En nética, que ando el fenooléculas deótidos que s mutagénesisde la emprela secuencian actividad entre sí, quistinguirse del patrón ca se empleaficamente soesis dirigida,escript‐4.5 kpuede indu
ctosidasa, quincoloro, enásmido pBluse intentará mpleará la ento lacZ d
GE
mento de ogía
Fec
RIGIDA
sa
de la reacció
ón
a β‐galactos
unción de lolas últimaspermiten as
otipo asociad ADN clonaerán modific
s dirigida basa estadouna de un plásmexonucleasaue contienene las sinteticaracterística para la elimobre el ADN empleandob, que derivcirse medianue catalizarán un producuescript II SKrevertir la mestirpe DH5el plásmido.
ENÉTICA MO
Biología Curso
cha:
1
ón
sidasa
s genes ha ts tres décasignar una fdo a la pertuadas, por mcados. La PC
sado en el pidense Stratmido. Para la 3’→5’ y unn la mutaciózadas por laco de Escheminación demetilado. o cada alumnva del primnte la adicióá in vitro ucto de colorK(‐) con el pmutación qu5α de E. co.
OLECULAR
página
Aplicadao 2012-13
2 3 4
tenido comodas se hanunción a unurbación. La
métodos queCR ha hecho
protocolo detagene, quelevar a cabona pareja deón deseada.a polimerasaerichia coli, las cadenas
no del grupoero. Ambosn de IPTG alna reacciónr azul. En elpropósito dee inactiva elli, capaz de
11
o
e o
e e o e s
o s
e
e
GENÉTICA
página
12
Teniendo(véase el m¿qué color en presenci
¿De qué
Dado qutendrán laspresencia d
¿De qué
plásmido pW
Para inactivSK(‐), utiliza pBS‐1: 5´‐C
pBS‐2: 5´‐G
Indica s
complemen
Indica s
complemen
¿Qué rel
Completdebe correcebadores p
MOLECULA
2
o en cuenta apa del Apétendrán las ia de IPTG y
color serán
e el plásmids colonias dde IPTG y X‐G
é color será
Whitescript‐
var el fragmaremos los s
CCATGATTAC
GTGAGGGTT
i la secuen
ntaria. ¿Exist
i la secuen
ntaria. ¿Exist
ación existe
a la Figura 1sponder al pBS‐1 y pBS‐
AR
que el plásmndice 1), uticolonias deX‐Gal?
las colonias
do pWhitescde la estirpGal?
án las colon
‐4.5 kb medi
mento lacZα siguientes ce
CGCCAAGCG
TAATTACGCG
cia del ceb
te alguna dif
cia del ceb
te alguna dif
entre la sec
1 con ayudaproducto d‐2?
mido pBluescilizado tradic la estirpe D
si inactivam
cript‐4.5 kb pe DH5α tra
nias si rever
ante mutagé
del gen de ebadores:
CGTAATTAA
GCTTGGCGTA
bador pBS‐1
ferencia entr
bador pBS‐2
ferencia entr
cuencia del c
a de la tablael fragment
cript II SK(‐)cionalmenteDH5α transfo
mos el fragm
porta una cansformadas
rtimos la m
énesis dirigid
la β‐galacto
ACCCTCAC‐3´
AATCATGG‐3
hibrida co
re la secuen
hibrida co
re la secuen
cebador pBS
a del códigoto lacZα? ¿Q
porta una ce en la seleccormadas con
ento lacZα m
copia inactivs con pWhi
mutación de
da?
osidasa, pres
3´
on la repres
cia del cebad
on la repres
cia del cebad
‐1 y la del ce
genético (AQué tipo de
copia funcionción blanco‐n pBluescrip
mediante mu
va del fragmtescript‐4.5
l fragmento
sente en el
sentada en
dor pBS‐1 y
sentada en
dor pBS‐2 y
ebador pBS‐
Apéndice 2).e mutación
nal del fragm‐azul de tranpt II SK(‐) si
utagénesis d
mento lacZα,kb si se s
o lacZα pres
plásmido p
la Figura
la del plásm
la Figura
la del plásm
2?
¿Qué pautaintroducirem
mento lacZαsformantes,se siembran
irigida?
, ¿qué coloriembran en
sente en el
Bluescript II
1 o con su
ido?
1 o con su
ido?
a de lecturamos con los
α ,
r
s
Fig
5'‐ C A G
5'‐ G C G
5'‐ T G G
Para revertcebadores: pWS‐1: 5´‐pWS‐2: 5´‐
Indica si complemen
Indica si complemen
¿Qué rel
ura 1.‐ Secu
G G A A
G C A A
G A G C
tir la mutac
‐CCATGATTA‐GTGAGGGTTla secuencia
ntaria. ¿Exist
la secuenciantaria. ¿Exist
ación existe
uencia parcia
A C A G
T T A A
T C C A
ción presen
ACGCCAAGCGTAATTGCGCa del cebadote alguna dif
a del cebadote alguna dif
entre la sec
al del plásmque codifi
C T A T G
C C C T C
C C G C G
nte en el p
GCGCAATTAAGCTTGGCGTor pWS‐1 hibferencia entr
or pWS‐2 hibferencia entr
cuencia del c
ido pBluescrica el fragme
G A C C
C A C T
G G T G
lásmido pW
ACCCTCAC‐3TAATCATGG‐brida con la re la secuen
brida con la re la secuen
cebador pWS
ript II SK(‐), cento lacZα
A T G A
A A A G
G C G G
Whitescript‐4
3´ 3´ secuencia recia del cebad
secuencia recia del cebad
S‐1 y la del c
GE
correspondie
T T A C
G G A A
C C ‐3'
4.5 kb, utiliz
epresentadador pWS‐1 y
epresentadador pWS‐2 y
cebador pWS
ENÉTICA MO
ente a la reg
G C C A
C A A A
zaremos los
a en la Figury la del plásm
a en la Figury la del plásm
S‐2?
OLECULAR
página
gión
A G C ‐3
A G C ‐3
s siguientes
a 2 o con sumido?
a 2 o con sumido?
13
'
'
s
GENÉTICA
página
14
Completcontiene lacebadores p
Figu
5'‐ C A G
5'‐ G C G
5'‐ T G G
1.‐ Síntesis
Cada plásmido pWreacciones polimerasa PfuTurbo delos cebador
Cada indicadas enprofesor.
Mezcla e
MOLECULA
4
a la Figura 2a secuencia pWS‐1 y pW
ura 2.‐ Secu
G G A A
G T A A
G A G C
de las cadeestudiante
Whitescript‐se llevarán PfuTurbo, q
ebe diluirse res y del moestudiante can la tabla sigu
en un tubo e
Compon
Tampón
Mezcla
Mezcla
Plásmid
Polimer
H2O (ha
AR
2 con ayudadel plásmi
S‐2?
encia parciaque co
A C A G
T T A A
T C C A
nas mutante preparará ‐4.5 kb o dea cabo en uque se sum10 veces, dalde se exprealculará, en pruiente. No se
ppendorf de
nente
n 10x (sin Mgde dNTP 10xde cebadoreo (molde) 5 asa PfuTurbosta 20 l) Total
de la tablaido pWhites
al del plásmidntiene una m
C T A T G
C C C T C
C C G C G
es una reacció
el plásmido n volumen dinistra a unado que se esan en esta rimer lugar, loe iniciará el e
e 1,5 ml:
gCl2) x es 25 ng/l ng/l o 1 U/l
del código script‐4.5 k
do pWhitescmutación en
G A C C
C A C T
G G T G
ón de síntepBluescript de 20 l, en na concentraencuentra a práctica en os volúmenesexperimento h
Volumen (
2 l
20
genético (Ab? ¿Qué am
cript‐4.5 kb, el fragment
A T G A
A A A G
G C G G
sis, eligiendII SK(‐)] y loun tubo de ación de 1 una concentng/l. s necesarios phasta que los
l) Concen
2,
0,
péndice 2). minoácido i
correspondito lacZα
T T A C
G G A A
C C ‐3'
do uno de os cebadorespared fina dU/l. El tamtración 10x.
para obtener ls cálculos hay
ntración fina
1x1x
5 ng/l
05 U/l
¿Qué tipo dntroducirem
iente a la re
G C C A
C A A A
los moldes s corresponde 200 l. Sempón de la Las concent
las concentrayan sido corr
al
de mutaciónmos con los
gión
A G C ‐3
A G C ‐3
[10 ng deldientes. Lase utilizará lapolimerasa
traciones de
ciones finalesegidos por el
s
'
'
s
e
s l
Transfier
Coloca e 95° 12 c 4°C Las reacciosiguiente se
¿Por qué e
¿Qué cade¿Qué cadena
¿Qué cade¿Qué cadena
¿En qué
¿Existe aPfuTurbo?
¿A qué rit
DÍA 2
2.‐ Prepara
Pesar 0,5
Añadir 5disolució
Disolver calentam
Comprobburbujas
Dejar en
Sellar los
re la mezcla
l tubo en el C, 30 s ciclos: 95°C, , ∞
ones serán resión de labo
es necesario e
ena se sintetia se usará com
ena se sintetia se usará com
conformació
alguna difere
tmo se increm
ción de un g
5 g de agaro50 ml de tón madre 50la agarosa p
miento cada bar que la as en la disolufriar la disols portageles
de reacción
termociclad
30 s; 55°C,
recogidas pooratorio.
emplear una p
izará a partir mo molde?
izará a partir mo molde?
ón debe enco
encia entre
mentará el núm
gel de agaro
sa y deposittampón de 0x) ..............por calentamvez que la dagarosa se hución ..........ución de agas con cinta ad
a un tubo d
or, con el sig
1 min; 72°C,
or el profes
polimerasa co
del cebador p
del cebador p
ontrarse el p
las molécul
mero de molé
sa y electrof
arlos en un electrofore..................miento en undisolución enha disuelto ..................arosa durantdhesiva ......
de PCR de pa
guiente prog
, 5 min (1 mi
sor y se co
on actividad ex
pBS‐1 (o pWS
pBS‐2 (o pWS
plásmido uti
as parentale
culas durante
foresis de lo
matraz de 2esis (TAE 1x...................n horno micntre en ebullcompletame...................te 5 minutos...................
ared fina de 0
grama:
in/kb)
nservarán e
xonucleasa 3’
‐1), la mostra
‐2), la mostra
lizado como
es (molde) y
e la reacción?
os productos
50 ml .........x, preparad...................croondas. Delición ..........ente y que ...................s a temperat...................
GE
0,2 ml .........
n un conge
→5’?
da en las figu
da en las figu
molde? Raz
y las sintetiz
Razona tu res
s de la reacc
...................o a partir ...................ebe interrum...................no se han f...................tura ambient...................
ENÉTICA MO
..................
elador a ‐20
uras o su com
uras o su com
zona tu resp
zadas por la
spuesta.
ción
..................de una ..................mpirse el ..................formado ..................te ................................
OLECULAR
página
..........
0°C hasta la
mplementaria?
mplementaria?
uesta
polimerasa
..........
..........
..........
..........
..........
..........
15
?
?
GENÉTICA
página
16
Colocar e
Añadir 1
Agitar suenfriarse
Una vez cinta ad
Introduc
Tra
mezclarán,
10
2
El
Cargar topocillos las muessiguiente
Conectar+) en el
Poner enV ..........
Tras 30 m(312 nm
MOLECULA
6
el peine sob,25 l de Safuavemente le ................que se hayahesiva ........ir el portage
s la solidificen un tubo
0 l de la mel de tampó
resto de la m
odas las mudel gel, anostras (véase e) ...............
r los electroextremo opu
n marcha la ..................
min, se proc) de un docu
Calle
1
2
3
4
5
6
7
8
9
AR
re el portagfeView a 50 a disolución..................a formado un..................eles en la cu
cación del geeppendorf d
ezcla de reacn de carga 6
mezcla de re
uestras y el tando cuidael patrón d..................
dos a la fuenuesto a aqué
fuente de a..................
cederá a visuumentador d
Marcado
Reacción
Reacción
Reacción
Reacción
Reacción
Reacción
Reacción
Reacción
eles ............ml de la dison y verterla ..................n gel consist..................beta, cubrie
el, se prepare 1,5 ml:
ción, ..........6x ................
eacción (10
marcador ddosamente ee bandas de..................
nte de alimeél en el que s
limentación,..................
ualizar el ADde geles, obt
or de peso m
n con pBlues
n con pWhit
n con pBlues
n con pWhit
n con pBlues
n con pWhit
n con pBlues
n con pWhit
...................olución de aen el portag...................tente, se ret...................ndo el gel co
rarán muest
...................
...................
l) se mante
de peso molel número del marcador ...................
entación, colse cargaron
, regulándol...................
DN medianteteniendo una
Muestra
molecular
script II SK(‐
escript‐4.5 k
script II SK(‐
escript‐4.5 k
script II SK(‐
escript‐4.5 k
script II SK(‐
escript‐4.5 k
...................garosa ........geles, en do...................tirarán con c...................on tampón d
ras de 12 l
...................
...................
endrá en hie
ecular en sue cada pocilde peso mo...................
locando el dlas muestra
a a un volta...................
e el transiluma fotografía
) (grupo 1)
kb (grupo 1)
) (grupo 2)
kb (grupo 2)
) (grupo 3)
kb (grupo 3)
) (grupo 4)
kb (grupo 4)
...................
...................onde polime...................cuidado el pe...................de electrofor
por pocillo
...................
...................
lo ...............
us corresponlo y el conte
olecular en la...................
e color rojo s .................
je constante...................
minador ultrdel gel ........
..................
..................rizará al ..................eine y la ..................resis ...........
. Para cada
..................
..................
..................
ndientes enido de a página ..................
(ánodo; ..................
e de 100 ..................
ravioleta ..................
..........
..........
..........
..........
..........
muestra, se
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
e
Finalmenexplicará
¿Coincide
3.‐ Digestió
Para eliminmoldes en restricción
Estarestricción)
Empvolumen finrealización
Ta
En
AD
H2
TO
cerrar el
me
y s
nte, se pegaá el profesor
en los tamaños
ón de las mo
nar selectivalas reaccioDpnl.
a enzima re), en la que l
pleando la nal de 15 l,de cada uno
mpón 10x pnzima (DpnI; DN (del pasoO
OTAL ..........
tubo y mezcediante su asu centrifuga
ará en estar .................
s observados
oléculas pare
amente los nes anterio
econoce unaos residuos
micropipeta, los siguieno de los paso
ara DpnI 10 U/l) anterior)
..................
clar adecuadgitación en ación breve
guía la fot..................
con los esper
entales con D
plásmidos pres, realizar
a secuencia de A están m
5’‐3’‐
de 20 l, tes componos:
1,51 10
......
damente los un agitador (durante 1 m
tografía del ...................
rados?
DpnI
pWhitescriptremos una
específica dmetilados:
‐G meA↓
T C‐C T
↑meA G
se mezclaráentes de la
l ..............l .................l ..............l .................
l
component(vórtex), ....min) en una
gel, interp...................
‐4.5 kb y pdigestión en
de 4 pares
C‐3’ G‐5’
án en un tumezcla de d
...................
...................
...................
...................
es de la dige...................microfuga ...
GE
retándola ta...................
Bluescript IInzimática co
de bases en
ubo eppendodigestión, ind
...................
...................
...................
...................
estión, ...............................................
ENÉTICA MO
al como ..................
I SK(‐), utilion la endon
n el ADN (s
orf de 1,5 mdicando en c
.......
.......
.......
.......
.......
.......
.......
OLECULAR
página
..........
zados comonucleasa de
su diana de
ml, para uncada caso la
17
o e
e
GENÉTICA
página
18
La digestióconservarán
La incuba
La incuba
¿Por qué
DÍA 3 4.- Trans Tras
hospedado
Cada sido somet
Cada estudrealizada en
Añadir 1
compete
Incubar l
50 l deusarán c
Someter
baño a 4
Incubar l
Utilizand
antibióti
Incubar l
¿Por qué s
¿Por qué
5.‐ SiembraTras
contienen mX‐Gal, que placa de Pe
MOLECULA
8
n se incuban en un congación de la m
ación de la d
no se digieren
sformaciós la digestió
r bacteriano
grupo recibidas a un tr
iante transfon el paso ant
1 l de la r
entes DH5 .los dos tubo
e células comcomo contro todos los t
42°C ............los tubos en
do una mic
ico) a cada ulos tubos a 3
sometemos la
incubamos lo
a en placas ds la incubacimedio LB sóse utilizarántri suplemen
AR
ará durante gelador a ‐20mezcla de di
digestión fin
n las molécula
ón de la eón de las c
o adecuado,
birá 1 tubo eratamiento
ormará una terior, tal co
reacción de
..................os en hielo d
mpetentes Dl .................tubos a un
.................. hielo duran
ropipeta de
uno de los tr37°C con agit
as células a ca
s tubos a 37°C
de Petri de laión de los cuólido. El men para la sentada con am
una hora, 0°C hasta la gestión con
alizó a las
as sintetizadas
estirpe DHcadenas del
tal como la e
eppendorf coquímico par
alícuota de omo se descr
digestión a
..................urante 20 m
DH5 a las q..................choque térm
..................te 5 min .....
e 1000 l, es tubos .....tación (225
ambios brusco
C durante 30 m
as células soultivos del adio de las pelección de mpicilina y o
a 37°C, en siguiente seDpnI se inic
horas y
s por la polim
H5α molde, la
estirpe DH5on 150 l dera incremen
células DH5ribe a contin
a un tubo e
...................min, junto co
que no se ha...................mico, mante
...................
...................
añadir 800
...................rpm) durant
os de tempera
min en medio
ometidas a tpartado antplacas de Pecolonias blaotra que no c
una estufaesión de práció a las
y min
erasa PfuTurb
cadenas sin
de Escherie células DHtar su capa
5 con los pnuación:
ppendorf co
...................on un tercer
a añadido AD...................eniéndolos d
...................
...................
l de me
...................e 30 min .....
atura?
o LB sin antibió
transformacerior, cada getri está supancas/azulescontiene est
a. Los tuboscticas. horas y
nutos.
bo?
ntetizadas d
ichia coli.
H5 competecidad de inc
roductos de
on 50 l de
...................tubo eppend
DN exógeno...................durante 90
...................
...................
dio líquido
...................
...................
ótico?
ión grupo recibiplementado . Se utilizare antibiótico
s de las dig
minut
eben transf
entes. Estascorporar AD
la digestión
e células
..................dorf con
o, que se ..................s en un
..................
..................
LB (sin
..................
..................
rá 2 placas dcon ampici
rán como coo.
gestiones se
os.
ferirse a un
células hanDN exógeno.
n enzimática
..........
..........
..........
..........
..........
..........
de Petri quelina, IPTG yontroles una
e
e y
Cada mu
Muestra
500 l del500 l del300 l del300 l del
Utilizand
inóculoesparcello bo
Tras su
entrea
Cierra la
DÍA 4
6.‐ Anális
Exa
¿Aparece
¿Qué pu
¿Aparece
¿Qué pu
Para el r
divide ccirculare
estra se ino
l cultivo de c
l cultivo de c
l cultivo de c
l cultivo de c
do una micr
o indicado eirlo uniformolitas de vidrinoculación
biertas paras cajas de Pe
is de los re
mina los cul
en colonias d
ede concluir
en colonias d
ede concluir
recuento de
ada una dees y cuenta e
culará en un
células some
células some
control (célu
control (célu
opipeta de
en la tabla memente sobrio estériles ., coloca las
permitir quetri 15 min d
esultados
tivos inocula
de DH5α en
rse de la obs
de DH5α en
rse de la obs
e colonias o
las placas el número de
na de las plac
etidas a tran
etidas a tran
ulas no some
ulas no some
1000 l, añanterior, y
bre la super..................s placas de
ue se evapordespués e in
obtenidos
ados el día a
la placa de c
servación de
la placa de c
servación de
obtenidas tr
de Petri que colonias bl
cas de Petri
sformación
sformación
etidas a tran
etidas a tran
ñade a cada
sigue las ificie del me...................e Petri en u
e el agua cocúbalas boc
s
anterior y re
control que
la placa de
control que
la placa de
ras las trans
e contienenlancas y azu
cuya compo
con la reacc
con la reacc
sformación)
sformación)
a placa de P
nstruccionesedio de culti...................una estufa
ndensada ena abajo a 37
sponde las s
no contiene
control que
contiene am
control que
sformacione
n ampicilinales presente
GE
osición se ind
Ampic
ión 1 SÍ
ión 2 SÍ
SÍ
NO
Petri el volu
s del profesivo emplean...................a 37°C, dej
n la tapa .....°C. ..............
siguientes pr
ampicilina?
no contiene
mpicilina? ....
contiene am
s con las d
, IPTG y X‐Ges en cada un
ENÉTICA MO
dica en la Ta
cilina IPTG
Í SÍ
Í SÍ
Í NO
O NO
umen de
sor para ndo para ..................jándolas
..................
..................
reguntas:
? ................
e ampicilina?
..................
mpicilina?
digestiones e
Gal, en cuatno:
OLECULAR
página
abla:
X‐Gal
SÍ
SÍ
NO
NO
..........
..........
..........
.............
?
.............
enzimáticas,
tro sectores
19
,
s
GENÉTICA
página
20
Apéndic
(Reproducid
Apéndice 2
Glosario es mutagénesimetilado exonucleasa
MOLECULA
0
e 1: Map
do de: http:/
: El código g
Primera posición
pañol‐inglés
is dirigida
a
AR
pa del vec
//www.geno
genético est
U
U
Phe Phe Leu Leu
C
Leu Leu Leu Leu
A
Ile Ile Ile
Met
G
Val Val Val Val
s (palabras n
ctor pBlu
omics.agilent
ándar
Se
C
(F) (F) (L) (L)
SerSerSerSer
(L) (L) (L) (L)
ProProProPro
(I) (I) (I) (M)
ThrThrThrThr
(V) (V) (V) (V)
Ala Ala Ala Ala
nuevas)
site‐diremethylaexonucle
escript II
t.com/files/M
gunda posic
C
(S) (S) (S) (S)
TyTyStSt
(P) (P) (P) (P)
HisHisGlnGln
r (T)r (T) r (T) r (T)
AsnAsnLysLys
(A)(A) (A) (A)
AspAspGluGlu
ected mutagated ease
SK(‐)
Manual/212
ión
A
r (Y)r (Y) top top
CyCyS
Trp
s (H)s (H) n (Q) n (Q)
ArArArAr
n (N)n (N) s (K) s (K)
SeSeArAr
p (D)p (D) u (E) u (E)
GlGlGlGl
enesis
205_A01.pd
G
ys (C)ys (C) Stop p (W)
U
C
A
G
rg (R)rg (R) rg (R) rg (R)
U
C
A
G
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C
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y (G)y (G) y (G) y (G)
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C
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f)
Terce
ra posició
n
Área de GUniversid
NOMBRE
Se dfragmento d
Con
que corresmutación, y
Genética dad Migue
:
desea introddel gen araD
araara
n ayuda de lponde a lay (c) el efect
el Hernán
ducir una mD de Salmone
aD‐1: ATAATaD‐2: CGTAC
a tabla del proteína Ao de la muta
dez G
PRÁCTIC
utación en ella typhimu
CGACGCCGGTGGTGATTT
código genéAraD, (b) laación sobre l
Grado en B
CA 3: SU
la secuenciaurium. Dispo
GACGGCTAAAAGCCGTCCG
ético estánd posición dla secuencia
DepartamBiotecnolo
Grupo:
PUESTO
a mostrada enemos para
ATCACCAGTAGGCGTCGATT
ar, debe dede la proteí de la proteí
GE
mento de ogía
Fec
en la figura,ello de los s
ACG TAT
terminarse: ína donde dína.
ENÉTICA MO
Biología Curso
cha:
, que corressiguientes ce
(a) la pautadeseamos in
OLECULAR
página
Aplicadao 2012-13
sponde a unebadores:
a de lecturantroducir la
21
GENÉTICA
página
22
5'‐ T A A
5'‐ T G T
5'‐ C T A
5'‐ C C C
5'‐ G C G
5'‐ G C G
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5'‐ C A A
MOLECULA
2
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3'
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3'
GEENÉTICA MOOLECULAR
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