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Procedimentos Analíticos Gerais em Toxicologia

Profa. Verônica Rodrigues• FARMACÊUTICA INDUSTRIAL - UFRJ• MESTRE EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS - UFRJ

• EX-DOCENTE - UNIPLI• EX-PERITA LEGISTA - TOXICOLOGISTA - PCERJ• PESQUISADORA EM PROPRIEDADE INDUSTRIAL - INPI

Procedimentos Analíticos em Toxicologia

CONSIDERAÇÕES SOBRE A AMOSTRA NA ANÁLISE TOXICOLÓGICA

Análises Toxicológicas Forenses:

• Cadeia de custódia :

• Quem manuseou a amostra ou aliquota?• Quando tal manuseio ocorreu?• Onde a amostra ou a aliquota foi obtida?

• Considerações sobre a amostra:� Aspecto da amostra (odor, cor, aparência)

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� O que coletar? - Seleção da matriz biológica adequada:� conhecimentos da toxicocinética do analito� concentração média do analito no materialamostradoEx.: Intoxicação por paraquat → pulmãoIdentificação de heroína / 6-MAM → urina

CONSIDERAÇÕES SOBRE A AMOSTRA NA ANÁLISE TOXICOLÓGICA

Metabolismo de alguns Fármacos


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� Quanto coletar?

- representatividade da amostra → técnica analítica

- quantidades de alíquotas: prova e contra-prova

(toxicologia forense, exames de doping)

� Onde coletar?

- uso de recipientes adequados que não contaminem asamostras

Coleta e Preparo da Amostra

Fonte: Society of Forensic Toxicology, AAFS, 2002

(Fonte: Toxicologia Analítica. Moreaau & Siqueira. 2008. )

Coleta e Preparo da Amostra

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� Ao abrigo:

- luz (fotodegradação)

- calor (degradação térmica)

• refrigeração (~ 4 ºC)

• congelamento

- umidade (degradação microbiana)

Estocagem e Conservação da Amostra

� Adição de conservantes - antimicrobianos (fluoreto de sódio)- anticoagulantes (heparina)- antioxidantes (ácido ascórbico)� Inviolabilidade da amostra- Autenticidade da amostra (laudo pericial)- Adulteração intencional ou acidental

Estocagem e Conservação da Amostra

Seleção de Amostras Biológicas

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Cuidados Gerais1. Autenticidade� Garantia de que uma amostra de material biológicopertence a uma dado indivíduo depende de fatorescomo:- processo de coleta- identificação da amostra- adoção de critérios de inviolabilidade- transporte e armazenamento adequados� Algumas amostras precisam de cuidados especiaispara que a autenticidade da mesma possa sergarantida, como no caso da urina. Garantia de cadeia de custódia segura


Cuidados Gerais2. Amostra de Tempo Anterior ao Uso� Importante garantir que o indivíduo não trará consigouma amostra autêntica (por exemplo, de urina)previamente coletada, mas em momento anterior ao usoda droga.3. Adulteração� Representada pela adição de produtos químicos àamostra coletada.� Qualquer produto adicionado à amostra pode interferirna análise enzimática e/ou cromatográfica.� Produtos de limpeza em geral degradam as drogas.


Cuidados Gerais4. Seleção Adequada da Amostra� Importante selecionar a amostra em função do localonde o analito poderá ser encontrado� Amostras como sangue, urina, e tecidos são bastanteusadas em análises toxicológicas.� Atualmente, amostras alternativas estão sendoutilizadas em análises toxicológicas.� Exemplos incluem a saliva, para análise de drogas nolocal de trabalho e em casos de suspeita de delitosao volante; o cabelo, que pode ser usado para avaliaro histórico de uso de drogas.


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Cuidados Gerais5. Critérios de Conformidade da Amostra� Todos os critérios de conformidade da amostra para examedevem ser satisfeitos de modo a garantir a autenticidade daamostra e dar maior probabilidade de detecção ao teste.� Amostras coletadas sem supervisão, com indícios de adiçãode produtos químicos e que não foram aprovadas pelostestes de conformidade (pH, aspecto, densidade, creatinina,uréia, etc para urina, por exemplo) devem receber o laudode “NÃO CONFORMIDADE”, independente da análise tersido ou não realizada, ou de resultado positivo ou negativo.� Informar no laudo o limite de detecção do método.Seleção de Amostras Biológicas

Amostras Biológicas Convencionais

�� UrinaUrina� A coleta da urina requer cuidados em função doconstrangimento que a coleta pode causar ao periciado.� A privacidade requerida para a coleta da urina →risco para garantia da autenticidade da amostra.


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Coleta de UrinaColeta de UrinaColeta de UrinaColeta de Urina� Critérios de Segurança� Atenção no momento da coleta� Avaliação da temperatura da amostra imediatamente após a coletaObs.: esse critério pode ser falho.� Análise de uréia e creatinina (SAMSHA – Substance Abuse andMental Health Administration)- Creatinina ≥ 5mg/mL- Densidade da urina entre 1001 ≤ d ≤ 1020Importante: a adição de cloreto de sódio aumenta a densidade daamostra e pode interferir na triagem por ensaio enzimático.


Coleta de UrinaAmostras Biológicas Convencionais

Cuidados Gerais� Diluição da Amostra� Adição intencional x ingestão de grandesquantidades de água� O excesso de água provoca uma queda naconcentração da urina e pode afetar a detecção nafase de triagem.� Como contornar o problema da diluição? Avaliação dacreatinina urinária e densidade.Valores médios: - creatinina: 20-40 mg/dL- densidade: 1003 - 1010(varia entre

os autores)(Fonte: Vigilância Toxicológica. Eliani Spinelli. 2004. )


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Cuidados GeraisDiluição da Amostra - continuação� SAMSHA – amostras diluídas- creatinina: < 20 mg/dL- densidade: < 1003� Em casos de não conformidade com os parâmetrosestabelecidos, recomenda-se a coleta de umasegunda amostra para exame (se possível)

(Fonte: Vigilância Toxicológica. Eliani Spinelli. 2004. )


Table 1

Common Adulterants

ADULTERANTS ASSAYS AFFECTED DETECTION MEANS

Water (DILUTION) All Creatinine, Specific Gravity

Ammonia All Odor, pH

Bleach All, esp. THC Odor

Glutaraldehyde (URINEAID) All, esp. THC Bizarre data

Soap/Detergent All, esp. THC Bizarre data, foams, odor

Nitrite (KLEAR) THC Specific Test

Chromate (URINE LUCK) THC Specific Test

Peroxidase (STEALTH) THC Test under consideration

Comment: There are dipsticks available which allow for adulterant testing at the collection site.

This has advantage of early detection of unstable adulterants like bleach and STEALTH which

can degrade and are harder to detect in the lab.

(Fonte: http://www.wardelab.com/12-1.html)

Adulterantes e Ensaios para Detecção dos Mesmos em UrinaAmostras Biológicas Convencionais

�� SangueSangue� Sangue e seus derivados são amostras de especialimportância nas análises toxicológicas� Dentre os derivados do sangue, o soro possui comovantagem o fato de que nenhum aditivo (anticoagulante) foiadicionado à amostra, mantendo sua composição inalterada.� Em indivíduos vivos, os efeitos fisiológicos da maioria dosfármacos possuem correlação direta com suasconcentrações sanguíneas.� Atenção em sangue coletados post-mortem



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�� Sangue Sangue PostPost--MortemMortem� A desigual distribuição de drogas nos tecidos leva aalterações na concentração sérica de drogas. após a morte.Isso é chamado de redistribuição post-mortem� Ocorre principalmente por difusão da droga do sangue parasítios vizinhos, (tecidos e órgãos), como de conteúdo doestômago.� Este processo é particularmente importante para fármacoscom alta em liposolubilidade.� O sangue coletado do fundo do coração e outros sítiostorácica e abdominal deve ser evitado sempre que possível.


� Sangue post-mortem - observações:- punção das veias subclávia (braço) e/ou femoral(perna)- cuidados com a viscosidade do sangue- cuidado com a descontaminação do local- atenção no transporte e manuseio – lise dashemácias- uso de conservantes para preservar a amostraAmostras Biológicas Convencionais

� A desigual distribuição de drogas nos tecidos leva aalterações na concentração sérica de drogas. após amorte. Isso é chamado de redistribuição post-mortem� Exemplos de fármacos particularmente sujeitos àredistribuição post-mortem: • fenotiazinas• dextropropoxifeno• propranolol• metadona• antidepressivos tricíclicos.• amfetamines• barbitúricos• cocaína• cloroquina• digoxina


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� Coleta de sangue post-mortemAmostras Biológicas Convencionais

Amostras Biológicas Não-Convencionais

�� CabeloCabelo� Um Breve Histórico� Os primeiros trabalhos sobre a utilização de cabelocomo amostra para exame toxicológico surgiram apartir de 1857 – indivíduo morto há 11 anos, vítima deintoxicação por arsênico.� Cerca de 100 mais tarde ocorreu a detecção dofenobarbital em pêlos de cobaia após exposição oral aomedicamento.� Na década de 1960 e 1970, a análise do cabelo foiimpulsionada pelo desenvolvimento da espectroscopiade absorção atômica (análise de metais pesados).



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� Um Breve Histórico� 1979 – Primeiro trabalho publicado sobre detecção dedrogas em cabelo humano� Na década de 1980 – o desenvolvimento da CG/EMpermitiu um crescimento nas pesquisas de substânciasorgânicas em cabelos.Técnica de radioimunoensaio para detecção de opiáceos em amostras de usuários de heroínaPesquisa envolvendo cocaína, canabinóides e anfetaminas



� Vantagens da Técnica� Maior janela de detecção (semanas ou meses), contra2-4 dias para a maioria das drogas na urina e sangue.� Para fins práticos, os dois testes se complementam.� Urina e sangue: fornecem informações a curto prazosobre o uso de drogas por parte de um indivíduo,enquanto histórias de longo prazo são acessíveisatravés da análise do cabelo.� A análise do cabelo pode fazer a distinção entre o usocrônico ou única exposição à drogas.


� Biologia do Cabelo� Cabelo é um produto de órgãos diferenciados na pele dosmamíferos. Ela difere em indivíduos apenas em quantidade,cor e textura.� O cabelo é basicamente proteínas (65-95%, basicamentede queratina), juntamente com a água (15-35%) e lipídios (1-9%). O conteúdo mineral do cabelo varia de 0,25% a 0,95%.� O número total de folículos pilosos em adultos é estimadaem cerca de 5 milhões, com um milhão encontrado nacabeça. Os folículos pilosos são implantados no epitélio daepiderme da pele, aproximadamente 3-4 mm abaixo dasuperfície da pele.

(Fonte: Jickells, Clarke’s Analytical Forensic Toxicology. 2008. )


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Secção longitudinal do folículo piloso


� Crescimento capilar� Cabelo não cresce continuamente, mas em ciclos,alternando períodos de crescimento e de quiescência.� 1 - Fase anágena: o cabelo é produzido durante 4 a 8 anos(cabelos da cabeça) e 12 meses (cabelo não-cabeça) comuma taxa de aproximadamente 0.22–0.52 mm / dia ou 0.6–1.42 cem / mês para cabelos da cabeça (taxa de crescimentodepende do tipo de cabelo e localização anatômica).� 2 - Fase catágena: o folículo entra em um período detransição de cerca de duas semanas, durante o qual deixa dedivisão celular e do folículo começa a degenerar.


� Crescimento capilar� 3 - Fase telógena: período de descanso ou repouso,de cerca de 10 semanas, durante o qual o eixo docabelo pára de crescer completamente e crescimentodo cabelo começa a desligar.� No couro cabeludo de um adulto, aproximadamente85% dos cabelos está na fase de crescimento e osrestantes 15% estão em uma fase de descansando.



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Fases do Crescimento CapilarAmostras Biológicas Não-Convencionais

� Mecanismos de Incorporação de Drogas em Cabelo� Cabelo não cresce continuamente, mas em ciclos,alternando períodos de crescimento e de quiescência.� As drogas podem ser incorporadas no cabelo através de3 mecanismos:

• a partir do sangue, durante a formação do cabelo• a partir de suor e sebo• a partir do ambiente externo

� O cabelo é muito poroso e pode aumentar sua massa ematé 18% a partir da absorção de líquidos. Assim,medicamentos podem ser transferidas facilmente para ocabelo através do suor.Amostras Biológicas Não-Convencionais

Mecanismos de Incorporação de Drogas em Cabelo(Fonte: Jickells, Clarke’s Analytical Forensic Toxicology. 2008. )


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� Estabilidade de Drogas em Cabelo� O mecanismo exato pelo qual os produtos químicos estãoligados no cabelo não é totalmente conhecido.1 - Ligação à melanina2 - Ligação de drogas com os grupos sulfidrilas dosaminoácidos presentes no cabelo.� Estudos in vitro demonstraram que fármacos podempermanecer quimicamente estáveis por vários meses.� A meia vida da cocaína no cabelo foi determinda emexperimento e foi achado ser igual a 6 meses.Amostras Biológicas Não-Convencionais

� Procedimentos para Coleta de Amostras� Procedimentos de coleta para a análise do cabelo paraas drogas não foram padronizados.� Na maioria dos estudos publicados, as amostras sãoobtidas a partir de locais aleatórios no couro cabeludo.� O cabelo é melhor coletadas de área na parte de trásda cabeça, chamado de vértice posterior.vértice posterior da cabeçaAmostras Biológicas Não-Convencionais

� Procedimentos para Coleta de Amostras� Fios de cabelo são cortados o mais próximo possíveldo couro cabeludo, e sua localização no couro cabeludoé anotado.� Depois de coletados, amostras de cabelo podem serarmazenadas à temperatura ambiente em papel dealumínio, um envelope ou um tubo de plástico.� O tamanho da amostra varia consideravelmente entreos laboratórios e depende da droga para ser analisado eda metodologia de teste a ser aplicada.Exemplo: 100 mg de cabelo são recomendados para análise do fentanil ou buprenorfina.Amostras Biológicas Não-Convencionais

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� Análise Toxicológica1 - Processo inicial de descontaminação (lavagem) paraa maioria dos métodos2 – Pulverização da amostra e digestãoSoluções ácidas diluídas, soluções alcoólicas, detergentes ou mesmos solventes orgânicosCondições variáveis de tempo e temperaturaquímica ácidaquímica alcalinaenzimática



� Análise Toxicológica3 – Extração com solvente orgânico (ex: metanol)4 – Análise por CG/EM� Imunoensaios podem ser utilizados� Considerações importantes: - método deve ser sensível- detecção da formainalterada(na urina, são osmetabólitos)

1- Análise dos resíduos de extração2- Suspensão do resíduo com solução tampãoAmostras Biológicas Não-Convencionais


Análise Toxicológica de Drogas em CabeloAmostras Biológicas Não-Convencionais

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�� SalivaSaliva� Definições� A saliva é o produto da secreção das glândulassalivares presentes na boca.� No entanto, os fluidos encontrados na cavidade oralsão uma mistura de saliva, predominantemente, compequenas quantidades de fluido gengival, restoscelulares e de sangue.



�� SalivaSaliva� Definições� Em 1993, o encontro do New York Academy ofSciences definiu:- saliva: palavra por secreções glandulares coletadosdiretamente as glândulas salivares (geralmente asparótidas);- fluido oral: o fluido recolhido na cavidade bucal oupela expectoração.



� Um Breve Histórico� A passagem de fármacos da corrente sanguínea para asaliva já havia sido sugerida desde a segunda metadeda década de 1960.� A utilização da matriz biológica só veio a aumentarsignificativamente na última década:- estudos farmacocinéticos- monitorização terapêutica- verificação do uso de substâncias ilícitas


Importante na vigilância de motoristas sobre o uso de psicoativosAmostras Biológicas Não-Convencionais

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� Anatomia e Fisiologia da Saliva� As glândulas salivares humanas produzem entre 0,5 e1,5 L de saliva por dia.� Durante o repouso, mais saliva misturada é fornecidopelas glândulas submandibular (70%), com uma menorquantidade das glândulas parótidas (25%) e o restantedas glândulas sublinguais (5%)� A saliva é composta por 99% de água, 0,3% deproteína (principalmente amilase) e 0,3% mucinas.


Anatomia das Glândulas SalivaresAmostras Biológicas Não-Convencionais

� Vantagens e Desvantagens� Vantagens:- facilidade de obtenção- coleta assistida (dificulta adulterações)- coleta sem constrangimentos- coleta não-invasiva- É possível traçar paralelos com a concentraçãosanguínea! Útil em estudos farmacocinéticos e análises forenses


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� Vantagens e Desvantagens� Desvantagens:- detecção do fármaco livre no plasma- amostras em pequenas quantidades- estados patológicos e emocionais podem inibir asecreção salivar, diminuindo ainda mais adisponibilidade do material- solubilidade adequada e forma não-ionizada noplasma.

curta janela de detecção!Amostras Biológicas Não-Convencionais

� Aspectos Farmacocinéticos� A maioria dos xenobióticos chega à saliva por difusãosimples através das membranas celulares que compõemos túbulos salivares.� Para que os xenobióticos cheguem à saliva énecessário:- que estejam na forma livre- que estejam na forma não-ionizada- que possuam solubilidade adequada



� Aspectos Farmacocinéticos� pH da saliva mais ácido que pH do sangueAcúmulo na saliva de bases fracasCompostos ionizados não retornam ao plasma


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� Coleta de Amostra� A maior vantagem da saliva é a possibilidade de que aamostra pode ser coletada do doador em observação.� A amostra pode ser coletada logo após o momento doincidente.� Coleta não invasiva e pode ser feito pelos própriosdoadores na maioria das situações.� Uma série de dispositivos estão disponíveis para acoleta de saliva e de fluido oral.


Coleta de AmostraO coletor emprega um rolo dealgodão dental (poliéster), queé mastigado pelo doador por30-45 segundos, com ou semestimulação do ácido cítrico.Após ser embebido com fluidooral, o rolo de algodão écolocado em um recipiente quese encaixa em um tubo decentrífuga. O algodão absorve1-1,5 mL de fluido oral.Amostras Biológicas Não-Convencionais

Coleta de AmostraDispositivos de coleta maismodernos geralmente usam ummaterial absorvente em umahaste semelhante ao utilizadopara testes de álcool na saliva.O dispositivo ao lado consisteem um bloco de papel de filtroimpregnado com sais detampão em uma haste deplástico. O bloco é colocado naboca por 2-5 minutos. Após acoleta, o papel é colocado emum tubo com líquidoconservante e enviadas aolaboratório para análise.Absorção de cerca de 0,4 mLde fluido oral.Amostras Biológicas Não-Convencionais

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Coleta de AmostraO coletor Cozart Rapiscan usa uma almofada de algodãoabsorvente destacável em um indicador de punho. Depois que oindicador passou de branco para azul, que indica que 1 mL desaliva foram coletadas, a almofada pode ser destacada e mantidaem um tubo de ensaio que contém conservante tampão até aanálise.


Coleta de AmostraO coletor Finger (utiliza umapropriedade odontológicoabsorvente (espumaAccuSorb), que absorve asaliva, quando colocado naboca por alguns minutos. Asaliva é extraída a partir dapressão do dedo sobre omaterial absorvente.Amostras Biológicas Não-Convencionais

Coleta de AmostraO teste de salivaDrugWipe tenta limpar alíngua com um pino delimpeza e transferir osfluidos orais recolhidospor lavá-lo em uma tira deteste.O DrugWipe testasubstâncias comomaconha, cocaína e crack,opiáceos como a heroína,morfina e metadona Todosos medicamentos daclasse das anfetaminas eecstasy, bem como osbenzodiazepínicos.


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DrugWipeDrugWipeAmostras Biológicas Não-Convencionais

� Testes de Confirmação� Quando os imunoensaios são utilizados como testes detriagem para drogas na saliva, testes cromatográficosdeve ser utilizada para confirmação.� Eles devem ser capazes para detectar os níveis dedrogas que aparecem na saliva.� Métodos CG/EM foram relatadas para a confirmaçãode opiáceos, cocaína, canabinóides e benzodiazepínicos.


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