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pH e Tampões

Fernanda Malagutti Tomé � A [H+] nas células e líquidos biológicos influencia a velocidade das reações químicas, a forma e função das enzimas assim como de outras proteínas celulares e a integridade das células

Íon hidrogênioÍon hidrogênio

� O íon hidrogênio (H+) é o íon mais importante nos sistemas biológicos

ÁcidosÁcidos

Conceito de Arrhenius: Ácido é toda substância que

em solução aquosa libera como cátion o íon hidrogênio (H+).

Ex.: HCl + H2O ↔ H3O+ + Cl-

Conceito de Brönsted e Lowry: Ácido é um doador de

prótons, um substância que pode transferir um próton para outra.

Conceito de Arrhenius: Base é toda substância que

em solução aquosa se dissocia liberando ânion oxidrila (OH-).

Ex.: NaOH + H2O ↔ Na+ + OH-

Conceito de Brönsted e Lowry: Base é um receptor de

prótons. Um ácido pode transferir um próton para

uma base. Ex.: NH3 + H2O ↔ NH4

+ + OH-

BasesBases

Ácidos e BasesÁcidos e Bases

CH3-COOH + H2O ↔ CH3-COO - + H3O+

(ácido) (base)

� O íon acetato é a base conjugada do ácido acético

� O ácido acético é o ácido conjugado do íon acetato

� O íon hidrônio é o ácido conjugado da água

� A água é a base conjugada do íon hidrônio

Ácidos aumentam a [H+] de uma solução aquosa e bases a diminuem

Dissociação da água e Dissociação da água e seus produtos iônicosseus produtos iônicos

H2O + H2O ↔ OH - + H3O+

A água funciona tanto como ácido quanto como base

Na água pura a [H+] é igual a [OH-]

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Potencial Potencial hidrogeniônicohidrogeniônico (pH)(pH)

� O pH é definido como o logarítmo negativo da [H+]

� pH = -log [H+]

� A escala de pH varia de 1 até 14, uma vez que qualquer [H+] está compreendida na faixa de 100 a 10-14.

� A [H+] de uma solução é quantificada em unidades de pH ���� equilíbrio entre a entrada ou produção de íons hidrogênio e a livre remoção desses íons do organismo.

���� o organismo dispõe de mecanismos para manter a [H+] e, conseqüentemente o pH sangüineo, dentro da normalidade, ou seja manter a homeostasia .

pH do Sangue Arterial

7,47,0 7,8Faixa de sobrevida

Acidose AlcalosepH normal

pH x homeostasia

Homeostasia é a constância do meio interno

Aumento da [H+]

7,4

Acidose

Alcalose

Queda do pH

Acúmulo de ácidos

Acúmulo de basesPerda de ácidos

Perda de bases

Diminuição da [H+]

Escala de pH

Aumento do pH

Alterações no pHAlterações no pH

Metabolismoaeróbico da glicose

Metabolismoanaeróbico da glicose

Ácido Carbônico Ácido Lático

Ácido Sulfúrico

Ácido Fosfórico

Corpos Cetônicos Ácidos

H+

Oxidação de AminoácidosSulfurados

Oxidação incompleta de ácidos graxos

Hidrólise das fosfoproteínas e nucleoproteínas

Fontes de HFontes de H++ decorrentes decorrentes dos processos metabólicosdos processos metabólicos

Os Sistemas Tampões

Tampão » qualquer substância que pode,reversivelmente, se ligar aos íons hidrogênio.

» Soluções formadas por um ácido fraco e sua baseconjugada ou por um hidróxido fraco e seu ácidoconjugado

Tampão + H+ H+Tampão

TampãoH+ + OH- H2O + Tampão

COMPOSIÇÃO E AÇÃO DAS SOLUÇÕES-TAMPÃO

� Um tampão resiste ás variações no pH porque ele contém tanto espécies ácidas para neutralizar os íons OH- quanto espécies básicas para neutralizar os íons H+.

� As espécies ácidas e básicas que constituem o tampão não devem consumir umas às outras pela reação de neutralização.

Exigência preenchida por um par ÁCIDO-BASE CONJUGADO

CH3COOH / CH3COO- NH4+ / NH3ou

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CAPACIDADE DE TAMPÃO

� É a quantidade de ácido ou base que um tampão pode neutralizar antes que o pH comece a variar a um grau apreciável.

� Depende da quantidade de ácido e base da qual o tampão é feito.

Os Sistemas Tampões do

Organismo

Os principais sistemas tampões presentes noorganismo, que permitem a manutenção da homeostasia,são:

� sistema bicarbonato

� sistema fosfato

� proteínas

� sistema da amônia

Efeito Bohr

Aminoácidos e Proteínas

Estrutura geral de um aminoácido (aa): Isômeros D e L:

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Exceções: 20 aa geram proteínas biológicas:

20 aa geram proteínas biológicas: Classificação quanto a estrutura:

� Alifáticos:

Classificação quanto a estrutura:

� Aromáticos:

Classificação quanto a estrutura:

� Contendo Enxofre (sulfurados):

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Classificação quanto a estrutura:

� Iminoácido:

Classificação quanto a estrutura:

� Polares sem carga:

Classificação quanto a estrutura:

� Aminoácidos com carga negativa (acídicos):

Classificação quanto a estrutura:

� Aminoácidos com carga positiva (básicos):

Nomenclatura – abreviações:

� Glicina – Gly� Alanina – Ala� Valina – Val� Leucina – Leu� Isoleucina – Ile� Cisteína – Cys� Metionina – Met� Fenilalanina – Phe� Lisina – Lys� Arginina - Arg

Nomenclatura – abreviações:

� Tirosina – Tyr� Prolina – Pro� Serina –Ser� Treonina – Thr� Asparagina – Asn� Glutamina – Gln� Ácido aspártico – Asp� Ácido glutâmico – Glu� Histidina - His

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Ligação Peptídica: Níveis estruturais das proteínas

Estrutura primária de uma proteína: Estrutura secundária:

Estrutura terciária: Estrutura quaternária:

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Enzimaholozima

Apoenzimaparte proteica

Grupo prostético

metal

coenzima

cofator

Algumas proteínas, enzimas em especial, contêm em sua molécula uma porção não proteica, que é essencial para atividade biológica.

Distinção entre cofator e coenzima depende da força de ligação com a apoproteína. Ex: o NAD+ pode ser cofator de uma enzima (ligação fraca) e ser coenzima de outra (ligação forte). O mesmo ocorre com as metais.

ativa

inativaGrupo Prostético

Coenzima Reação com Vitamina

Biocitina CO2 Biotina

Coenzima A Grupos acil Ác. Pantotênico

Coenzima B12 H e grupos alquil Vitamina B12

FAD, FMN óxido-redução Riboflavina

NAD, NADP óxido-redução Niacina

Fosfato de piridoxal Grupos aminos Piridoxina

Pirofosfato Tiamina Grupos aldeídos Tiamina

Tetrahidrofolato unidades C Ácido fólico

Grupo prostético:

� Grupo não protéico que dá função a proteína.

� Exemplo: grupo heme da hemoglobina

Purificação e caracterização de proteínas:

� Essencial para compreensão� Procedimento: carga, tamanhos,

propriedades de ligação e solubilidade.� Caracterização dos aminoácidos e da

estrutura.

Proteínas podem ser separadas e

purificadas� Sabendo que a célula possui

milhares de proteínas, como purificar uma única delas?� Basta selecionar por propriedade

� Tamanho, carga e propriedades de ligação

� Obter o extrato bruto� “correr” em cromatografia de coluna

� Fase estável (matriz)� Fase móvel (solução com tampão)

� Coluna maior permite maior resolução na separação

Cromatografia por troca iônica

� Polímero carregado negativamente� Proteínas positivas ligam

ao polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna

� Afinidade da proteína é definido também pelo pH

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Cromatografia por exclusão de

tamanho

� Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores

� Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro

Cromatografia de afinidade

� Adiciona-se à matriz da coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse

� Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz

� Elui-se com solução de ATP

Eletroforese, etapas

1. Preparação do gel

2. Aplicação das amostras

3. Eletroforese

4. Coloração

5. Análise dos resultados

Enzimas

Atividade enzimática e inibidores enzimáticos.

Definicao

Enzimas são proteínas especializadas (com a exceção de um pequeno grupo de RNAs) que têm como função acelerar reações químicas, sem alterar a constante de equilíbrio da reação

aumentam a velocidade da reação atuando como um catalisador

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Sitio Ativo

Atividade Enzimática: EncaixeEmil Fisher, na década de 1950, propôs o modelo chave-fechadura para expli-car o reconhecimento (especificidade) do substrato pela enzima. Nesse modelo, o sítio ativo da enzima é pre-formado e tem a forma complementar à molécula do Substrato, de modo que outras moléculas não teriam acesso a ela.

No entanto, o modelo chave-fechadura não explica a interação das enzimas com inibidores e análogos dos substratos.

Na década de 1970, Daniel Kosland propôs o modelo de encaixe induzido, no qual o contacto com a molécula do substrato induz mudanças conformacio-nais na enzima, que otimizam as intera-ções com os resíduos do sítio ativo. Esse é o modelo aceito hoje em dia.

Modelo Chave-Fechadura

Esquema:

� Formação do complexo enzima substrato:

� E + S <==> [ES] ==> E + P

Propriedades:

� As enzimas diferem dos catalisadores químicos em diferentes aspectos:

� – Velocidades de reacção mais elevadas.

� – Condições de reacção mais suaves.

� – Especificidade reaccional elevada.

� – Regulação da reacção.

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Nomenclatura:

� As enzimas são classificadas com base nas reações que catalisam.

� – Nome do substrato + Sufixo ase:

� Ex: Urease ≡ hidrólise da ureia

ReaçõesOxidoredutase

Transferase

Hidrolase

Liase

Isomerase

Ligase

Atividade enzimatica

ro activo:

� – contém os resíduos de aminoácidos diretamente envolvidos na reação;

� – ocupa uma parte relativamente pequena do volume total da enzima;

� – trata-se de uma entidade tridimensional;

� – corresponde, geralmente, a uma cavidade na molécula de enzima, com um ambiente químico muito próprio.

� – o substrato entra no sítio ativo e liga-se à enzima através de interações fracas, não covalentes;

Algumas enzimas utilizadas para

diagnóstico clínico

� ALT (alanina aminotransferase) (TGP) -hepatócitos

� AST (aspartato aminotrasnferase) (TGO)–miocárdio.

� CK (creatina fosfoquinase) – CK-MB – em IM atinge seu pico em 12 a 24 horas.

Marcadores bioquímicos:

� Marcadores citoplasmáticos enzimáticos.(Ex. CK-MB)

� Marcadores citoplasmáticos não enzimáticos. (Ex. mioglobina)

� Marcadores não citoplasmáticos e não enzimáticos. (Ex. miosina)

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Exemplo: IAMExemplo: IAM

Liberação Liberação de estruturas intracelularesde estruturas intracelulares

isquemia

Segundos Minutos Horas

l CK totall CK - MBl Isoformas de CK-MBl Troponina T and Il Mioglobina

l LDHl TGOl Cadeia pesada de

miosinal Cadeia leve I de

miosinal Fosforilase do

glicogênio BB

Marcadores séricos de isquemia

Marcadores séricos de lesão miocárdica

CK-MB Troponina Mioglobina

Característica enzimaproteína proteína

estrutural heme citoplas

Liberação após

dano celular irreversível reversível(?) irreversível

– início 4 h 4 - 6 h 30 min. - 1 h

– pico 9 - 30 h 12 - 24 h 6 - 10 h– normal 48 - 72 h 5 - 7 dias 16 - 24 h

Fatores que regulam a atividade

enzimática

Coenzima Cofator

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Inibidores Enzimáticos

� Inibidor não competitivo:

Inibidores competitivos

Inibidores nao competitivos Irreversiveis

� Algumas substâncias se ligam covalentementeàs enzimas deixando-as inativas.

� Inibidores irreversíveis podem serextremamente seletivos pois são semelhantesao substrato.

Inibidor alostérico

Enzimas alostéricas possuem uma região diferente do sítio ativo ao seliga um efetor ou modulador alostérico. A mudança conformacionaldecorrente da ligação do efetor alostérico se propaga pela molécula eafeta o sítio ativo, ativando-o ou inibindo-o. Observe nas figuras.

Ativador alostérico

Feedback - negativo

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Feedback - positivo Ativação de zimogênios é um caso específico de modulação covalente exclusivo de alguns tipos de enzimas proteolíticas.

• zimogênios: as proteases são sintetizadas numa forma inativa por estar em uma conformação desfavorável, com bloqueio ou desalinhamento dos resíduos do sítio catalítico.

• conformação desfavorável resulta de porções adicionais da cadeia poli-peptídica, que devem ser retirados para que a proteína assuma a forma ativa.

• podem acontecer duas situações, combinadas ou não:- zimogênio tem uma extensão N-terminal (pro-segmento) que precisa

ser retirada. Pro-segmentos podem ter de 2 a 150 resíduos a.a.- zimogênio tem cadeia polipeptídica única, que precisa ser clivada

(proteólise limitada) para formar duas ou mais subunidades.

• conversão do zimogênio à protease ativa pode resultar da ação proteolítica de outra protease, ou de alteração do pH ou temperatura do meio, ou ainda, da adsorção do zimogênio à uma superfície negativa. Esses eventos determinam mudança conformacional e/ou auto-hidrólise pela própria protease.

• ativação é irreversível, e por isso, energeticamente cara para o organismo.

Fatores que alteram a atividade

enzimática

Saturação dos sítios-ativos

Equação de Michaelis-Menten

V0 = Vmax [S]Km + [S]

Concentração enzimática...

Concentração de substratoQuando a quantidade de substrato é aumentada etodos os outros parâmetros são mantidosconstantes, a velocidade da reação aumenta atéatingir um ponto de velocidade máxima (Vmax)(Figura 19). Este é o ponto onde o acréscimo desubstrato não provoca um aumento da velocidadeda reação em decorrência da saturação dos sítiosativos.A quantidade de substrato presente numa dadareação, quando esta atinge metade da Vmax échamada de Km, ou constante de Michaelis.

Quantidade de substrato: Concentracao enzimas, substratos e

produtos:

tempo

con

cen

traç

ão

O gráfico abaixo ilustra como as concentrações de E, S e P variam ao longo do tempo da reação.

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Temperatura:

100-

50-

0-

% a

tivi

dad

e en

zim

átic

a m

áxim

a

Temperatura ótima

Desnaturação térmica da proteína

Pouca energia para a reação acontecer Ao contrário da curva em

forma de sino no caso da atividade enzimática versus

pH, a enzima só está desnaturada em temperaturas acima da temperatura ótima.

pH

% a

tivi

dad

e en

zim

átic

a m

áxim

a

Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas

O pH ótimo de uma enzima reflete variações no estado de ionização de resíduos de aminoácidos do sítio ativo. A enzima está pelo menos parcialmente desnaturada em pHs afastados do pH ótimo. Quando o substrato é uma molécula ionizável, o pH ótimo da enzima também reflete o seu estado de ionização .

pH ótimo=1,5 pH ótimo=6,8 pH ótimo=9,9

Referencias:

� DEVELIN, T.M. Manual de Bioquímica comcorrelações clínicas, 4º edição – EdgardBlücher, São Paulo, 1998.

� STRYER, L. Bioquímica, 4º edição,Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1996.

� CAMPBELL, M.K. Bioquímica, 3º edição,Artmed, Porto Alegre, 2003.

Boas Provas!!!