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BLOQUEIO DA MEIOSE COM BUTIROLACTONA I EM OVÓCITOS BOVINOS: EFEITOS SOBRE A MATURAÇÃO NUCLEAR E CITOPLASMÁTICA
PAULO ROBERTO ADONA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ MARÇO – 2006
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BLOQUEIO DA MEIOSE COM BUTIROLACTONA I EM OVÓCITOS BOVINOS: EFEITOS SOBRE A MATURAÇÃO NUCLEAR E CITOPLASMÁTICA
PAULO ROBERTO ADONA
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal.
Orientadora: Profª. Drª. Cláudia Lima Verde Leal CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
MARÇO – 2006
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca do CCTA / UENF 028/2006
Adona, Paulo Roberto
Bloqueio da meiose com butirolactona I em ovócitos bovinos : efeitos sobre a maturação nuclear e citoplasmática / Paulo Roberto Adona. – 2006. 78 f. il.
Orientador: Cláudia Lima Verde Leal Tese (Doutorado em Produção Animal) – Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. Campos dos Goytacazes, RJ, 2006. Bibliografia: f. 55-67.
1. Butirolactona I 2. Embrião 3. Maturação 4. Meiose 5. Ovócito bovino I. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. II. Título.
CDD 636.2082
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BLOQUEIO DA MEIOSE COM BUTIROLACTONA I EM OVÓCITOS BOVINOS: EFEITOS SOBRE A MATURAÇÃO NUCLEAR E CITOPLASMÁTICA
PAULO ROBERTO ADONA
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal.
Aprovado em 10 de março de 2006. Comissão Examinadora: ___________________________________________________________________
Profª. Drª. Gisele Zoccal Mingoti (Doutorado em Fisiologia) UNESP ___________________________________________________________________
Profª. Drª. Maria Clara Caldas Bussiere (Doutorado em Fisiologia) UENF ___________________________________________________________________
Profº Dr. Reginaldo da Silva Fontes (Doutorado em Fisiologia) UENF ___________________________________________________________________ Profª. Drª. Cláudia Lima Verde Leal (Doutorado Reprodução Animal) USP/FZEA
(Orientador)
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AGRADECIMENTOS
Em especial à minha mãe, meu irmão e às minhas irmãs.
Gostaria de expressar minha profunda gratidão e carinho, em especial:
À Rosângela A. Queiroz;
À Cláudia L. V. Leal;
À Margot A. N. Dode;
À Maineide Z. Velasques.
À todos meus amigos pelo carinho e companheirismo. Sem cada um de vocês
nada disso seria possível e a vida não teria sentido.
Alexandre Barreto; Aline S. M. César; Amanda de A. Rocha; Aparecida Mandella; Bethania Lopes; Bruno Fagundes; Camila Cortez; Fabiana Bressan; Felipe C. Braga; Fernando Biaze; Flávio P. Júnior; Giovana K. F. Merighe; Gustavo (Sancho); Hebinho (Baby Sauro) Isabele P. Emanuelli; Kátia L. Schwartz; Kelen S. Viana; Lígia Garcia Mesquita; Marcos R. Chiaratti; Mariene (Bitoca); Moysés S. Miranda; Nilton P. dos Santos; Norma Clea Rodovalho; Patrícia M. Porciúncula; Paula Ripamonte; Pedro Ratto; Roberto Carneiro; Rosemary Bastos; Sílvia G. Matta; Sylvia S. Cortezzi; Tiago H. C. De Bem; Vanessa G. Ueno;
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Aos Professores: Maria Clara C. Bussiere, Flávio Vieira Meirelles, Reginaldo
Fontes, Gisele Zoccal Mingoti.
Àqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desse
trabalho.
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy R. (UENF/CCTA/LMGA);
À Universidade de São Paulo (USP/FZEA/ZAB);
À FAPESP, pelo financiamento do projeto de pesquisa;
À CAPES, pela concessão da bolsa de estudo.
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iv
BIOGRAFIA
PAULO ROBERTO ADONA, filho de Ivo Adona e Maria Boniatti Adona,
nasceu em 26 de agosto de 1966, na cidade de Campinas do Sul – RS.
Em março de 1995, ingressou no curso de Biologia da Universidade Católica
Dom Bosco (UCDB), em Campo Grande – MS. Submeteu-se à apresentação de
monografia para conclusão do curso em dezembro de 1998.
Foi selecionado em março de 1997 como estagiário do setor de Reprodução
Animal da Embrapa – CNPGC, sob orientação da Pesquisadora Drª. Margot A. N.
Dode.
Foi aprovado em agosto de 2000 no curso de Pós-graduação em Produção
Animal, a nível de mestrado, da Universidade Estadual do Norte Fluminense
(UENF), Campos dos Goytacazes – RJ, submetendo-se à defesa de tese para a
conclusão do curso em abril de 2002.
Foi aprovado em março de 2002 no curso de Pós-graduação em Produção
Animal, a nível de doutorado, da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro (UENF), Campos dos Goytacazes – RJ, submetendo-se à defesa de tese
para a conclusão do curso em março de 2006.
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v
CONTEÚDO LISTA DE ABREVIATURAS------------------------------------------------------------------- viii RESUMO ------------------------------------------------------------------------------------------- x ABSTRACT ---------------------------------------------------------------------------------------- xii
1. INTRODUÇÃO ----------------------------------------------------------------------------- 01 2. REVISÃO DE LITERATURA ----------------------------------------------------------- 03
2.1. Ovogênese e foliculogênese ----------------------------------------------------- 03
2.2. Maturação ovocitária --------------------------------------------------------------- 04
2.2.1. Maturação nuclear ----------------------------------------------------------- 05
2.2.2. Maturação citoplasmática ------------------------------------------------- 06
2.2.3. Organização estrutural na maturação ---------------------------------- 07
2.2.3.1. Citoesqueleto --------------------------------------------------------- 07
2.2.3.2. Organelas -------------------------------------------------------------- 08
2.2.3.2.1. Mitocôndrias ----------------------------------------------------- 08
2.2.3.2.2. Grânulos corticais --------------------------------------------- 09
2.2.4. Mudanças moleculares e bioquímicas --------------------------------- 10
2.2.4.1. Cinases dependentes de ciclinas (CDKs) --------------------- 11
2.2.4.2. Fator promotor da maturação (MPF) --------------------------- 12
2.2.4.3. Proteína cinase ativada por mitógenos (MAPK) ------------- 13
2.3. Competência ovocitária ------------------------------------------------------------ 15
2.4. Bloqueio meiótico-------------------------------------------------------------------- 17
3. OBJETIVOS -------------------------------------------------------------------------------- 20
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vi
4. MATERIAL E MÉTODOS --------------------------------------------------------------- 21 4.1. Coleta de ovários e ovócitos ----------------------------------------------------- 21
4.2. Solução estoque do inibidor ------------------------------------------------------ 22
4.3. Bloqueio da meiose com butirolactona I --------------------------------------- 22
4.4. Determinação do estádio da meiose ------------------------------------------- 22
4.5. Maturação in vitro ------------------------------------------------------------------- 23
4.6. Microtúbulos -------------------------------------------------------------------------- 24
4.7. Microfilamentos ---------------------------------------------------------------------- 24
4.8. Grânulos corticais ------------------------------------------------------------------- 25
4.9. Mitocôndrias -------------------------------------------------------------------------- 25
4.10. Fecundação e cultivo in vitro --------------------------------------------------- 25
4.11. Delineamento experimental ----------------------------------------------------- 27
4.11.1. Experimento 1. Avaliação de concentrações decrescentes de
BL I em meio suplementado com BSA -----------------------------------------------------
27
4.11.2. Experimento 2. Avaliação de concentrações crescentes de BL
I em meio sem suplementação de BSA ----------------------------------------------------
27
4.11.3. Experimento 3. Efeito do bloqueio da meiose na maturação
nuclear ----------------------------------------------------------------------------------------------
28
4.11.4. Experimento 4. Cinética da maturação nuclear pós-bloqueio
da meiose ------------------------------------------------------------------------------------------
29
4.11.5. Experimento 5. Efeito do bloqueio da meiose na organização
dos microtúbulos e dos microfilamentos ---------------------------------------------------
29
4.11.6. Experimento 6. Efeito do bloqueio da meiose na distribuição
dos grânulos corticais e das mitocôndrias -------------------------------------------------
30
4.11.7. Experimento 7. Efeito da BL I no desenvolvimento
embrionário in vitro -------------------------------------------------------------------------------
31
4.12. Análise estatística ----------------------------------------------------------------- 32
5. RESULTADOS ----------------------------------------------------------------------------- 33 5.1. Experimento 1. ----------------------------------------------------------------------- 33
5.2. Experimento 2. ----------------------------------------------------------------------- 34
5.3. Experimento 3. ----------------------------------------------------------------------- 35
5.4. Experimento 4. ----------------------------------------------------------------------- 36
5.5. Experimento 5. ----------------------------------------------------------------------- 38
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vii
5.7. Experimento 6. ----------------------------------------------------------------------- 40
5.9. Experimento 7. ----------------------------------------------------------------------- 43
6. DISCUSSÃO ------------------------------------------------------------------------------- 45 7. CONCLUSÕES ---------------------------------------------------------------------------- 54 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ------------------------------------------------- 55
APÊNDICE ----------------------------------------------------------------------------------------- 68
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viii
LISTA DE ABREVIATURAS μg – micrograma;
μL – microlitro;
μM – micromolar;
AI – anáfase I;
AMPc – monofosfato de adenosina cíclica;
ATP – trifosfato de adenosina;
B199 – TCM-199, sais de Earle e 20 mM de bicarbonato de sódio;
BL I – butirolactona I;
BSA – albumina sérica bovina;
CDK – cinase dependente de ciclina;
CIV – cultivo in vitro;
CO2 – dióxido de carbono;
CSF – fator citostático;
DMSO – dimetilsulfóxido;
DNA – ácido desoxirribonucléico;
ERK – cinase regulada por sinal extracelular (MAPK);
FITC – isotiocianato de fluoresceína;
FIV – fecundação in vitro;
FSH – hormônio folículo estimulante;
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ix
GDP – guanosina difosfato;
GTP – guanosina trifosfato;
H199 – TCM -199, sais de Earle, 20 mM de bicarbonato de sódio e 25 mM de Hepes;
LH – hormônio luteinizante;
MAPK – proteína cinase ativada por mitógenos;
MAP2K, MAP3K, MAP4K – cinases ativadoras de cinases ativadas por mitógenos
MAT – metáfase I, anáfase I e telófase I;
MBP – proteína básica de mielina;
MEK – cinase regulada por sinal extracelular (MAP2K);
MI – metáfase I;
MII – metáfase II;
Miss – MAPK de interação e estabilização do fuso meiótico;
MIV – maturação in vitro;
mL – mililitro;
mos – oncogene c-mos;
MPF – fator promotor da maturação;
Myt1, Wee1 e CDC25 – proteínas cinases envolvidas na atividade do MPF;
P90RSK – proteína cinase ribossomo S6;
PBS – tampão fosfato salina;
PIV – produção in vitro;
PKA – proteína cinase A;
PKC – proteína cinase C;
PVA – álcool polivinílico;
Raf-1 – MAP3K;
Ras – MAP4K;
RNAm – ácido ribonucléico mensageiro;
SFB – soro fetal bovino;
SOF – fluido de oviduto sintético;
TALP – meio tyrode’s com albumina, lactato e piruvato;
TCM-199 – meio de cultura de tecidos 199;
TI – telófase I;
VG – vesícula germinativa.
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x
RESUMO
ADONA, Paulo Roberto, Dr. S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro: março de 2006; Bloqueio da meiose com butirolactona I em ovócitos
bovinos: efeitos sobre a maturação nuclear e citoplasmática; Orientador: Profª. Drª.
Cláudia Lima Verde Leal. Conselheiro: Profª. Drª. Maria Clara Caldas Bussiere.
O presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito do uso da butirolactona I
(BL I) na pré-maturação sobre a progressão da meiose, estruturas celulares e
desenvolvimento de ovócitos bovinos cultivados in vitro. Ovários bovinos foram
coletados em frigoríficos e os folículos de 2-6 mm de diâmetro foram aspirados para
a obtenção dos ovócitos. Inicialmente, foram avaliadas diferentes concentrações de
BL I em meio suplementado ou não com BSA. Houve diferença (P < 0,05) nas taxas
de vesícula germinativa (VG) entre os grupos C/24 (0,0%), 25 (65,1%), 50 (84,4%) e
100 μM (97,4%) de BL I suplementados com BSA, mas não houve diferença (P >
0,05) entre os tratados com 10 (94,7%), 15 (97,2%), 20 (98,7%) e 25 μM (98,7%) de
BL I em meio sem BSA. As taxas de maturação (MII) não diferiram (P > 0,05) entre o
controle (91,1%) e os tratados com 10 (B10 = 91,5%) e 100 μM (B100 = 92,4%) de
BL I. Em relação à cinética de MIV pós-bloqueio, observou-se que às 6h de MIV os
grupos B10 (71,4%) e B100 (74,3%) apresentaram taxas de VG inferiores (P < 0,05)
ao controle (97,3%). Com 12h de MIV a maior parte dos ovócitos estava em estádios
intermediários da meiose (MAT) (77,9; 83,1 e 86,4% para controle, B10 e B100,
respectivamente, P > 0,05). Com 18h de MIV as taxas de MII não diferiram (P >
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xi
0,05) entre controle (72,0%), B10 (73,7%) e B100 (78,9%). Com relação aos
microtúbulos não foram observadas alterações no fuso meiótico quanto à
organização e formação da placa metafásica nos diferentes grupos de ovócitos
(controle, B10 e B100) e horários (0, 6, 12, 18 e 24h) avaliados. Também não foi
observada nenhuma alteração no arranjo dos microfilamentos no citoplasma dos
ovócitos avaliados nas mesmas condições. Em 100% dos ovócitos não maturados
independente do grupo (C/0h, B10 e B100), os grânulos corticais apresentavam-se
dispersos pelo citoplasma (P > 0,05) dos ovócitos. Após 24h de MIV, 98% dos
ovócitos apresentavam migração dos grânulos corticais para a região periférica do
citoplasma em todos os grupos (P > 0,05). As mitocôndrias nos ovócitos não
maturados dos grupos tratados encontravam-se em sua maioria na periferia dos
ovócitos (81,5 e 86,9%, P > 0,05), mas foi inferior (P < 0,05) ao controle (100%).
Após 24h de MIV, as mitocôndrias migraram por todo o ovócito, sendo o grupo C/24
(81,5%) inferior (P < 0,05) aos grupos B10M (95,2) e B100M (98,2%) que não
diferiram entre si (P > 0,05). As taxas de clivagem (81-87%) não diferiram (P > 0,05)
para os ovócitos submetidos à FIV nos grupos controle, B10 e B100. Com relação à
percentagem de blastocisto no D7, os grupos controle (38,3%) e B10 (41,6%) não
diferiram entre si (P > 0,05), mas ambos foram superiores (P < 0,05) ao grupo B100
(33,0%). A taxa de blastocisto eclodido foi similar (P > 0,05) entre os grupos controle
(19,2%), B10 (17,7%) e B100 (11,0%) no D8. Também não foi observada variação
(P > 0,05) no número médio de células dos blastocistos no D8, entre o controle
(138), B10 (136) e B100 (150). A pré-maturação com BL I não aumentou os índices
de desenvolvimento, porém também não induziu alterações estruturais e não
comprometeu (B10) o desenvolvimento embrionário, sugerindo a possibilidade de
sua aplicação em biotécnicas de PIV de embriões e de clonagem.
Palavras-chave: butirolactona I, embrião, maturação, meiose e ovócito bovino.
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xii
ABSTRACT
ADONA, Paulo Roberto, Dr. S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro: março de 2006; Meiosis block using butyrolactone I in bovine oocytes:
Effects on nuclear and cytoplasmic maturation; Supervisor: Prof. Dr. Cláudia Lima
Verde Leal. Counselor: Prof. Dr. Maria Clara Caldas Bussiere.
The present study aimed to assess the effects of butyrolactone I (BL I) in pre-
maturation on meiosis progression, cellular structures and development of bovine
oocytes cultured in vitro. Bovine ovaries were collected in abattoirs and 2-6mm
follicles were aspirated to obtain oocytes. Initially, different BL I concentrations were
evaluated in B199 medium supplemented or not with BSA. Germinal vesicle (GV)
rates were different (P < 0.05) among the groups C/24 (0.0%) 25 (65.1%), 50
(84.4%) and 100 μM (97.4%) BL I in medium supplemented with BSA. However, no
difference (P>0.05) was observed when oocytes were cultured with 10, 15, 20 and 25
μM BL I (94.7, 97.2, 98.7 and 98.7%, respectively) in medium without BSA.
Maturation rates (MII) were similar (P > 0.05) between controls (91.1%) and treated
oocytes (91.5 and 92.4% for B10 and B100, respectively). Regarding maturation
kinetics, VG rates at 6h IVM in controls (97.3%) were superior (P < 0.05) to treated
oocytes (71.4 and 74.3% for B10 and B100, respectively). At 12h most of the oocytes
were at intermediate stages of meiosis (77.9, 83.1 and 86.4%, for control, B10 and
B100, respectively, P>0.05). After 18 h IVM, MII rates were similar (P > 0.05) among
groups (72.0, 73.7 and 78,9% for control, B10 and B100, respectively). Regarding
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microtubules no alterations in meiotic spindle were observed for organization and
formation of metaphase plate in different groups (control, B10 and B100) and IVM
periods (0, 6, 12, 18 and 24h). No alterations in microfilament arrangement were
observed either under the same conditions. All immature oocytes (100%) presented
cortical granules (CG) dispersed throughout the cytoplasm, irrespective of oocyte
group (C/0h, B10 and B100, P > 0.05). After 24 h IVM, also irrespective of oocyte
group, 98% of the oocytes had the CG migrated to the periphery of the cytoplasm (P
> 0.05). Immature oocytes in treated groups presented mitochondria mostly in the
periphery of the oocytes (81.5 and 86.9%, P > 0,05), although at a lower rate than in
control oocytes (100%, P < 0.05). After 24 h IVM, mitochondria migrated throughout
the cytoplasm, but in both treated groups the migration rates were superior (95.2 and
98.2% for B10 and B100, P > 0.05) to controls (81.5%, P < 0.05). Cleavage rates
were not affected (81-87%, P > 0.05) in oocytes fertilized in vitro. However,
blastocyst rates in day 7 were reduced in the B100 group (33.0%, P < 0.05). Controls
and B10 had similar rates (38.3 and 41.6%, respectively, P >0.05). Day 8 hatching
rates (19.2, 17.7 and 11.0% for control, B10 and B100, P > 0.05) and blastocyst cell
numbers (138, 136 and 150 B100 for control, B10 and B100, P > 0.05) were
unaffected. Pre-maturation using BL I did not increase blastocyst rates, but also did
not affect cell structures and development (B10), suggesting the possibility of its use
for in vitro embryo production and cloning.
Palavras-chave: butyrolactone I, embryo, maturation, meiosis and oocyte bovine.
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1. INTRODUÇÃO
Os mecanismos pelos quais os ovócitos adquirem a competência para
desenvolverem-se até o estádio de blastocisto ainda não estão totalmente
compreendidos. Há evidências de que a aquisição da competência está
correlacionada com moléculas de RNAs e de proteínas estocadas e processadas
durante as fases de crescimento, “capacitação” (pré-maturação) e maturação do
ovócito. Essas moléculas são usadas para sustentar as fases iniciais da
embriogênese até que a transcrição do DNA do embrião se torne ativa (DE LA
FUENTE e EPPIG, 2001).
Apesar dos muitos esforços para melhorar a produção in vitro (PIV) de
embriões para fins científicos e/ou comerciais, a sua eficiência ainda é relativamente
baixa. Apenas 35-40% dos ovócitos bovinos maturados in vitro (MIV) desenvolvem-
se até o estádio de blastocisto (MAYES e SIRARD, 2001; SIRARD et al., 2006), e
ainda desses, somente 30% chegam a termo após a transferência (WARD et al.,
2002; PARK et al., 2005). Essas baixas taxas são determinadas por vários fatores
decorrentes das etapas que constituem o sistema de PIV de embriões. As condições
de cultura para maturação nuclear e citoplasmática do ovócito certamente têm um
papel fundamental, e uma maturação completa é essencial para o desenvolvimento
embrionário. Portanto, para a obtenção de um sistema que possibilite a produção de
um maior número de embriões é necessária a compreensão dos mecanismos
envolvidos na maturação.
Observou-se que in vivo, os ovócitos, ao final de seu período de crescimento,
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mas antes do período de maturação propriamente dito, passam por um período
chamado de “capacitação”, o qual parece ser importante para o desenvolvimento
pleno de sua competência. Nesse período ocorrem modificações estruturais e
moleculares que são importantes para o desenvolvimento embrionário (HYTTEL et
al., 1997, DIELEMAN et al., 2002).
Os ovócitos utilizados no sistema de PIV de embriões normalmente já
concluíram sua fase de crescimento e entraram no período de “capacitação”
ovocitária (HYTTEL et al., 1997). Porém, ao serem removidos do ambiente folicular
reiniciam a meiose (KUBELKA et al., 2000) e uma parte dessa população ainda não
concluiu a “capacitação” ovocitária.
Uma das alternativas que vários pesquisadores vêm analisando para estudar
a competência de desenvolvimento dos ovócitos in vitro é o bloqueio da retomada da
meiose antes da maturação. No entanto, pouco se sabe do que ocorre nesse
período. De toda forma, o bloqueio da meiose serviria como ferramenta para estudar
os possíveis fatores envolvidos na indução da “capacitação” após a remoção dos
ovócitos do ambiente folicular, e que poderiam ter efeitos positivos sobre o
desenvolvimento embrionário subseqüente. A obtenção de conhecimento nesse
sentido, por sua vez, poderá contribuir para um melhor embasamento no
desenvolvimento de procedimentos mais eficientes para a PIV de embriões bovinos.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Ovogênese e foliculogênese
A ovogênese refere-se à seqüência de eventos em que as células
germinativas primordiais diferenciam-se em ovogônias, ovócitos primários e
secundários, findando com a fecundação do ovócito maturo (GONSALVES et al.,
2002; VAN DEN HURK e ZHAO, 2005). Já a foliculogênese inicia-se com a
formação dos folículos
primordiais,
progredindo para
folículos primários,
secundários e
terciários, finalizando
com a ovulação de um
ovócito maturo
(GONSALVES et al.,
2002; VAN DEN
HURK e ZHAO, 2005)
(Figura 1). A
diferenciação das
células da linhagem
germinativa feminina ocorre totalmente ou quase totalmente na fase
embrionária/fetal dependendo da espécie (MOORE e PERSAUD, 2000;
GONSALVES et al., 2002) (Tabela 1). Estudos recentes, porém, sugerem que possa
Figura 1. Diagrama simplificado da ovogênese e foliculogênese. Fonte: adaptado de Gonsalves et al., (2002) e Van den Hurk e Zhao (2005).
C. germinativas primordiais
Endoderma
Ovogônia
Ovócito 1°
Folículo primordial Folículo 1º
Folículo 2º
Folículo ovulatório
Meiose IIOvulação
Fecundação
Zigoto
Mitose
FO L I C U L O G Ê N E S E
Blastocisto
O V O G Ê N E S
Dictióteno
Início da meiose I
Prófase I
Prófase I
Folículo 3º Folículos pré-antrais
Folículos antrais
E
Ovócito 2°
Término da meiose I
Término da meiose II
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haver diferenciação dessas células também em adultos, embora a maior parte das
evidências ainda indique que folículos primários sejam formados apenas na vida
fetal (BUKOVSKY et al., 2005).
Ao nascer, os bovinos dispõem de um número determinado de ovócitos
primários, cada um dos quais com o material genético duplicado (GONSALVES et
al., 2002). O processo de
diferenciação dos ovócitos
primários (imaturo) para
secundários (maturo) é iniciado
na maturidade sexual quando, a
intervalos médios de 21 dias
(bovinos), um ovócito (2n)
conclui a primeira meiose
iniciada na fase fetal. Agora, o ovócito secundário ou maturado (n) encontra-se apto
para a fecundação. Com a fusão do espermatozóide, o ovócito finaliza sua segunda
divisão meiótica (extrusão do segundo corpúsculo polar). Desse modo o material
genético do ovócito é reduzido à metade por meio de duas divisões meióticas
sucessivas. A ploidia retorna à sua conformação original (2n) com a interação
(singamia) do material genético do espermatozóide com o do ovócito, formando
assim o zigoto, que originará o embrião (MOORE e PERSAUD, 2000; GONSALVES
et al., 2002; HAFEZ, 2002).
Tabela 1. Cronologia da ovogênese e foliculogênese em bovinos e ovinos.
Eventos Dias de gestação Bovinos Ovinos Células germinativas primordiais 35 23 Ovogônias 60 48 Ovócitos primários 75-80 55 Folículo primordial 90-130 90 Folículos primários 140 95 Folículos secundários 210 103 Folículos terciários 230-250 150 Nascimento 280 150
Fonte: McNatty et al., 2000; Gonsalves et al., 2002; Fair, 2003
2.2 . Maturação ovocitária
Durante todo o período do desenvolvimento, desde a formação e crescimento
dos ovócitos e dos folículos, até após o período da dominância folicular, os ovócitos
bovinos permanecem em estádio de prófase da primeira meiose. In vivo, o reinício
da meiose ocorre com o surgimento do pico pré-ovulatório de LH (hormônio
luteinizante) e se dá somente nos ovócitos inteiramente crescidos e meioticamente
competentes dos folículos pré-ovulatórios (FAIR, 2003; RODRIGUEZ e FARIN,
2004). A competência dos ovócitos tem uma estreita relação com as multicamadas
de células do cumulus que os cercam, mantendo uma importante via de
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5
comunicação através das junções comunicantes (gap), antes e durante o pico pré-
ovulatório de LH (RODRIGUEZ e FARIN, 2004; GILCHRIST et al., 2004). Logo após
o pico de LH, começa a ocorrer o desaparecimento dessas vias de comunicação
entre o ovócito e as células do cumulus (HYTTEL et al., 1997).
A progressão do ciclo celular do ovócito até o estádio de metáfase da
segunda meiose (metáfase II), tanto in vivo quanto in vitro, é marcada por uma série
de transformações bioquímicas e estruturais no núcleo e no citoplasma do ovócito,
eventos esses que caracterizam a maturação ovocitária (MACHATKOVA et al.,
2004; DE SOUSA et al., 2004). Na transição da prófase I à metáfase II, estabelece-
se uma complexa cascata de fosforilações e desfosforilações de uma série de
proteínas envolvidas no reinício e na regulação da meiose (DEKEL, 2005; DUMONT
et al., 2005). Entre as proteínas que mais se destacam no período da maturação
estão as proteínas do complexo MPF (fator promotor da maturação) e da família
MAPK (proteína cinase ativada por mitógenos). Para efeito de estudo, a maturação
será dividida em maturação nuclear e citoplasmática, apesar desses eventos
ocorrerem concomitantemente.
2.2.1. Maturação nuclear
A diferenciação do ovócito imaturo em maturo envolve uma série de
alterações que são estimuladas principalmente por hormônios gonadotróficos
(MERTON et al., 2003). Sob a influência dos hormônios, o ovócito recomeça seu
ciclo celular progredindo da fase de diplóteno da prófase da primeira meiose
(prófase I), passando pelos estádios de metáfase I, anáfase I, telófase I (término da
primeira divisão meiótica) e progredindo até o estádio de metáfase da segunda
divisão meiótica (MEINECKE et al., 2001). No intervalo que compreende os estádios
de prófase I a metáfase II, os cromossomos condensam e o envelope nuclear é
desfeito marcando o início da maturação nuclear (MEINECKE et al., 2001; JONES,
2004). Dando seqüência, os cromossomos homólogos são divididos em dois grupos,
com a metade do número original de cromossomos. Ao término da primeira divisão
meiótica o citoplasma é dividido assimetricamente (CAN et al., 2003), gerando duas
células de tamanhos diferentes: uma pequena chamada de corpúsculo polar e outra
-
6
grande, o ovócito secundário. Ao término da maturação nuclear o ovócito permanece
nesse estádio do ciclo celular (metáfase II) até a fecundação (MAYES e SIRARD,
2001) ou ativação partenogenética (YI e PARK, 2005).
Os fatores da ativação (natural ou artificial) dos ovócitos maturos vão
promover o término da segunda divisão meiótica, que se caracteriza pela progressão
da metáfase II até a telófase II com a liberação do segundo corpúsculo polar. Após a
ativação, o futuro embrião prossegue seu ciclo celular por divisão mitótica. In vitro, a
maturação nuclear de ovócitos bovinos de folículos > 2 mm de diâmetro em
condições apropriadas requer de 18 a 24 horas de cultivo (KHATIR et al., 1998;
DODE e ADONA, 2001; ADONA e LEAL, 2004).
2.2.2. Maturação citoplasmática
A competência de desenvolvimento do ovócito em embrião em estádio
adiantado de desenvolvimento é basicamente dependente das modificações
bioquímicas, moleculares e estruturais do citoplasma. Essas alterações na
maturação do ovócito são processos altamente complexos que envolvem vários
eventos simultâneos como síntese de proteínas (KHATIR et al., 1997; SIRARD et al.,
1998), modificações moleculares (KUBELKA et al., 2000) e migração e
reorganização de organelas no citoplasma (STOJKOVIC et al., 2001). Se
compararmos as taxas de
maturação (Tabela 2),
observaremos que a maturação
citoplasmática (taxa de
blastocistos) in vitro está aquém
da maturação nuclear (taxa de
metáfase II) (HASHIMOTO et al., 2002; OYAMADA et al., 2004; ADONA e LEAL
2004). Por outro lado, in vivo, as taxas de blastocistos são de aproximadamente 80%
(RIZOS et al., 2002).
Tabela 2. Comparação entre maturação nuclear e citoplasmática.
Nuclear1 Citoplasmática2
81,0% 33,5% 81,4% 22,2% 90,9% 34,8%
1 Taxa de ovócitos em estádio de metáfase II; 2 Taxa de embriões em estádio de blastocisto, após sete dias de cultivo in vitro. Fonte: Hashimoto et al., 2002; Oyamada et al., 2004; Adona e Leal, 2004
-
7
2.2.3. Organização estrutural na maturação
2.2.3.1. Citoesqueleto
Microtúbulos, um dos componentes do citoesqueleto, são filamentos
altamente dinâmicos e sua dinâmica se dá pela adição (polimerização) ou remoção
(despolimerização) constante de novas unidades de tubulina α e β. Na transição do
ciclo celular durante a maturação de ovócitos de mamíferos ocorre uma intensa
reorganização dos microtúbulos (KIM et al., 2000).
Durante a maturação meiótica, duas populações de centrossomos regulam
coordenadamente o conjunto de microtúbulos nos eventos nucleares e
citoplasmáticos, tais como formação do eixo meiótico orientado assimetricamente,
segregação dos cromossomos durante a meiose, a extrusão do primeiro corpúsculo
polar e a formação da segunda placa metafásica (ALBERTS et al., 1997; KIM et al.,
2000; CAN et al., 2003; SUN et al., 2004).
Os erros de segregação dos cromossomos durante uma ou outra divisão
meiótica podem resultar em embrião aneuplóide após a fecundação, o que por sua
vez pode ter grave conseqüência para o desenvolvimento (BRUNET et al., 2003;
SUN et al., 2004). Especificamente nos mamíferos, a perda ou ganho de um
cromossomo autossômico resulta em distúrbios fisiológicos e de desenvolvimento
(ABRUZZO e HASSOLD, 1995).
Para o sucesso da fecundação, o fuso meiótico no ovócito deve permanecer
estável e corretamente organizado durante o
bloqueio do ovócito em metáfase II (TERRET et
al., 2003). Há evidências de que as proteínas da
família MAPK (proteína cinase ativada por
mitógenos) e a PKC (proteína cinase C) são
responsáveis pela estabilidade dos microtúbulos
mantendo o fuso meiótico estável em ovócitos de
ratos (HORNE et al., 2003; TONG et al., 2003).
Os substratos da MAPK (Figura 2), tais como a
p90rsk (proteína cinase ribossomo S6) e a MISS
(MAPK de interação e estabilização do fuso)
Figura 2. Proteínas envolvidas na estabilidade do fuso meiótico e na atividade do CSF em camundongos. Fonte: Lefebvre et al., (2002).
mos
MAPKK
MAPK
Miss P90RSK
Estabilidade do fuso MII CSF bloqueio ?
-
8
parecem participar dessa estabilidade via proteínas mos/.../MAPK (LEFEBVRE et al.,
2002; TERRET et al., 2003).
A rede de microtúbulos é usada por proteínas motoras (famílias das cinesinas
e dineínas) para gerar movimentos periódicos das organelas no interior da célula. As
proteínas motoras dependentes de microtúbulos desempenham uma função
importante no posicionamento das organelas (ALBERTS et al., 1997).
Os microfilamentos são os maiores componentes do citoesqueleto em
ovócitos de mamíferos e fornecem a estrutura para divisão celular (KIM et al., 2000).
Ficam situados principalmente no córtex celular (camada situada logo abaixo da
membrana plasmática rica em actina e uma variedade de proteínas) de ovócitos em
estádio VG (vesícula germinativa) e no eixo meiótico da célula depois do rompimento
da VG (desestruturação da membrana nuclear) (ALBERTS et al., 1997; KIM et al.,
2000). Estão envolvidos na incorporação do espermatozóide, na extrusão do
corpúsculo polar e na migração dos grânulos corticais para o córtex celular durante a
maturação ovocitária em diferentes espécies de mamíferos (CONNORS et al., 1998;
KIM et al., 2000; SUN et al., 2001a).
2.2.3.2. Organelas
2.2.3.2.1. Mitocôndrias
As mitocôndrias são a central bioenergética da célula com função claramente
essencial que define a competência funcional dos ovócitos. São organelas
especializadas que ocupam uma porção substancial do volume citoplasmático das
células de origem materna. São responsáveis pela produção da maior parte da
energia celular em forma de ATP (trifosfato de adenosina), por fosforilação oxidativa
através do metabolismo dos carboidratos e dos ácidos graxos contidos no
citoplasma provenientes do meio interno e externo (WILDING et al., 2001;
CUMMINS, 2004). Nos ovócitos em geral, há uma grande concentração de
mitocôndrias para suportar uma taxa mais elevada de síntese de moléculas dos
processos fisiológicos envolvidos no desenvolvimento. A eficiência da matriz
mitocondrial na conversão do piruvato em ATP é requerida para o processo de
maturação e divisão celular (WILDING et al., 2001). A inabilidade das mitocôndrias
-
9
de aumentarem e/ou acumularem ATP tem sido ligada ao desenvolvimento anormal
ou ao bloqueio do desenvolvimento embrionário (STEUERWALD et al., 2000).
Durante a mitose, as mitocôndrias são distribuídas aleatoriamente entre as
células filhas e no decorrer da ovogênese há um aumento substancial no número de
mitocôndrias (6000 para 193.000 mitocôndrias no ovócito em humanos) com uma
variação expressiva entre ovócitos do mesmo estádio de desenvolvimento
(REYNIER et al., 2001; CUMMINS, 2004). Porém, se os blastômeros embrionários
não receberem uma população suficiente de mitocôndrias para produção de ATP
podem tornare-se disfuncionais e fragmentados (CUMMINS, 2004). Há uma
correlação similar entre o potencial para o desenvolvimento, índice de ATP e função
mitocondrial tanto nos ovócitos quanto nos embriões bovinos (STOJKOVIC et al.,
2001).
Durante a maturação ovocitária as mitocôndrias modificam sua disposição
dentro do citoplasma celular. Elas são localizadas próximas às gotas de lipídios que
por sua vez aumentam de tamanho com a progressão da maturação (HYTTEL et al.,
1997). Em ovócitos de mamíferos em estádio de VG, as mitocôndrias são
encontradas em maior quantidade na periferia do citoplasma, e com pequenos
grupos dispersos mais ao centro do ovócito (HYTTEL et al., 1997; SUN et al.,
2001b). Já nos ovócitos em estádio metáfase II, as mitocôndrias estão mais
centralizadas no citoplasma (HYTTEL et al., 1997; SUN et al., 2001b).
2.2.3.2.2. Grânulos Corticais
Os grânulos corticais (GC) são organelas produzidas a partir do complexo de
Golgi e estão presentes apenas nos gametas femininos de todos os mamíferos, na
maioria dos vertebrados e em muitos invertebrados (WESSEL et al., 2001; MAYES,
2002). São possuidores de uma população de moléculas que incluem proteases,
glicosidases, enzimas e proteínas estruturais que contribuem para a barreira física e
bioquímica que bloqueia a polispermia (WESSEL et al., 2001).
Os GC são vesículas secretoras não renováveis e com advento da
fecundação o seu conteúdo não é mais sintetizado. Os RNAs que codificam as
diversas moléculas do conteúdo dos GC são degradados seletivamente no período
-
10
da maturação do ovócito e só voltam a ser transcritos e codificados nos novos
ovócitos do ciclo reprodutivo (WESSEL et al., 2001).
A principal função do conteúdo presente nos GC é de construir
(equinodermos – Ex.: ouriço-do-mar) ou de modificar (mamíferos – Ex.: bovinos) a
matriz extracelular (zona pelúcida) existente nos ovócitos para oferecer uma barreira
bioquímica e mecânica que impede a entrada de mais de um espermatozóide no
ovócito (WESSEL et al., 2001). Os GC são formados nos ovócitos em crescimento,
mas sua redistribuição ocorre no período da maturação (DUCIBELLA et al., 1994; HYTTEL et al., 1997). Primeiramente, os GC podem ser identificados em pequenos
grupos pelo citoplasma dos ovócitos em estádio de VG. Sua migração para a
periferia do ovócito vai ocorrendo com o avanço da maturação. Em estádio de
metáfase II, os GC estão distribuídos no córtex próximo à membrana plasmática
(CONNORS et al., 1998; WESSEL et al., 2001; VELILLA et al., 2004).
2.2.4. Mudanças moleculares e bioquímicas
Durante o crescimento, a “capacitação” e a maturação do ovócito, diversas
moléculas são sintetizadas e armazenadas. Essas moléculas vão dar suporte à
maturação e ao desenvolvimento após a fecundação, até que o genoma do embrião
se torne transcricionalmente ativo e as mensagens derivadas do embrião comecem
a regular a embriogênese (CHA e CHIAN, 1998; MERMILLOD et al., 2000;
MEIRELLES et al., 2004). A maioria dos RNAm (ácido ribonucléico mensageiro) no
ovócito é sintetizada e acumulada durante o período de crescimento do ovócito (DE
SOUSA et al., 1998). Esse metabolismo no ovócito é caracterizado pela transcrição
e pela tradução ativa durante o período pré-ovulatório. Entretanto, a transcrição
gênica bovina cessa antes da ovulação, assim, o ovócito, o zigoto e o embrião com
menos de 16 blastômeros são dependentes do “pool” dos RNAs e das proteínas
acumuladas durante o período de crescimento e de maturação do ovócito
(GANDOLFI e GANDOLFI, 2001; MEMILI e FIRST 2000; LONERGAN et al., 2003).
Ovócitos de muitas espécies dependem da síntese e da ativação de uma
variedade de proteínas para que possam ingressar e prosseguir no processo de
maturação ovocitária. Entre as proteínas mais importantes que regulam o
-
11
mecanismo da maturação ovocitária estão as proteínas do complexo MPF e as
proteínas da família MAPK (SHENG et al., 2002; TIAN et al., 2002; JONES, 2004).
2.2.4.1. Cinases dependentes de ciclinas (CDKs)
As CDKs são uma família de serina/treonina cinases envolvidas na regulação
do ciclo celular (CDK1, 2, 3, 4, 6 e 7), na transcrição (CDK7, 8 e 9) ou na função
neuronal (CDK5) (SCHANG, 2004; MAPELLI et al., 2005). A atividade da CDK é
dependente da interação com uma ciclina, cujos níveis são regulados
seqüencialmente para assegurar que as fases do ciclo celular prossigam na ordem
correta (ARRIS et al., 2000). Por exemplo, as ciclinas D interagem com as CDKs 4 e
6 durante a fase G1, a ciclina E com a CDK2 no final da fase G1, a ciclina A com a
CDK2 na fase S/G2 e a ciclina B com a CDK1 na fase G2/M (Figuras 3 e 4)
(KNOCKAERT et al., 2002; ARRIS et al., 2000). A falha no controle das CDKs e a
conseqüente perda da função do ponto de verificação do ciclo celular têm sido
relacionadas diretamente à patologia
molecular do câncer (ARRIS et
al.,2000).
Figura 3. Diagrama simplificado da atividade das CDKs/ciclinas na regulação do ciclo celular. Fonte: Knockaert et al., (2002) e Arris et al., (2000)
CDK 2 Ciclina E
CDK 1 Ciclina B
CDK 4/6 Ciclina D
CDK 2 Ciclina A
Mitose
Meiose
ovócito
Figura 4. CDKs envolvidas na regulação do ciclo celular, na transcrição e na função neuronal. Fonte: Knockaert et al., (2002)
CDK1 Ciclina B
Ringo Transição de prófase I para metáfase II Regulação da topoisomerase II
Transição das fases G1/S e S/G2 Duplicação do centrossomo.
Transição das fases G1/S
Fase G1
Apoptose Migração dos neurônios Envolvida em outros eventos celular
Sinal de tradução e transcrição
Fase G1, morte de células neurais.
Ativação da CDK1 e CDK2
Regulação da DK7/ciclina H
Processamento de RNA ou transcrição Apoptose
CDK2
CDK3 Ciclina E?
Ciclina E
Ciclina A
Ciclina D
P35, P25
P39, P29
Ciclina D
Ciclina H
Ciclina C
Ciclina K
Ciclina T
Ciclina L
CDK4
CDK5
CDK6
CDK7
CDK8
CDK9
CDK11
Fase G1
F a s e S
Fase G2
F a s e M
-
12
2.2.4.2. Fator promotor da maturação (MPF)
O MPF é um heterodímero composto por uma cinase catalítica (p34cdc2 ou
CDK1) e uma subunidade de ciclina B regulatória (ABRIEU et al., 2001; JONES,
2004). Há ao menos três tipos de ciclinas B (B1, B2 e B3), e nos mamíferos parece
que a ciclina B1 é a principal responsável pela atividade do complexo MPF. Embora
a ligação da CDK1 com a ciclina B1 seja necessária, não é o suficiente para
desencadear a atividade do complexo MPF (CASTRO et al., 2001; JONES, 2004),
que é dependente dos mecanismos subseqüentes: fosforilação da CDK1 nos
resíduos de tirosina 15 (Y15),
treonina 14 (T14), treonina 161
(T161) e a posterior
desfosforilação dos resíduos
Y15 e T14 (KIKUCHI et al.,
2000; VAILLANT et al., 2001;
JOSEFSBERG e DEKEL,
2002). Em termos gerais a
CDK1 é fosforilada em Y15 e
T14 pelas proteínas cinases
Myt1 e Wee1, que causam uma
fosforilação inibitória da CDK1.
Nesse estádio o complexo MPF
está formado (pré-MPF), mas
ainda está inativo (Figura 5). A
ativação do MPF depende da
desfosforilação em Y15 e T14
pela proteína fosfatase CDC25
(MPF – ativo) (KIKUCHI et al., 2000; JONES, 2004). O aumento da atividade da
proteína CDC25 e a baixa atividade das proteínas cinases Myt1 e Wee1 são
necessários para a ativação completa do complexo MPF (JONES, 2004).
Figura 5. Diagrama simplificado do mecanismo de ativação do MPF. Fonte: Dekel (2005).
Wee1
Myt1
AMPc
PKC
Síntese
Ovócito em VG
Condensação dos cromossomos Rompimento da VG
Mos -RMAm poliadenilação
Mos síntese, MEK MAPK ativação.
Formação do fuso
Extrusão do 1ª corpúsculo polar
CSF estável Metáfase II bloqueada
Fecundação ou ativação artif. CSF instável
M E I O S E
A T I V A D A
n
Ciclina B
A variação da atividade do MPF pode ser detectada nos ovócitos bovinos
durante a maturação. Sua atividade é baixa em VG passando a ser observada no
início do rompimento da VG. Alcança um pico no estádio de metáfase I e declina sua
MPF
MPF Ativo
MPF Ativo
MPF Ativo
CDK1
M CDK1 E I O S E
B L O Q U E A D A
Ativação
CDC25
-
13
atividade durante a transição entre os estádios de metáfase I e metáfase II
(KUBELKA et al., 2000), reativando para entrada do ovócito em metáfase II. Sua
inativação nos ovócitos em estádio de metáfase II é induzida pela fecundação ou
pela ativação paternogenética (NEBREDA e FERBY, 2000; KUBELKA et al., 2000;
KIKUCHI et al., 2000; ABRIEU et al., 2001; LEDAN et al., 2001). A inativação
abrupta do MPF é considerada como um disparador necessário para o escape da
meiose bloqueada em metáfase II (TAIEB et al., 1997).
O processo de desorganização do heterodimero do complexo MPF independe
da sua ativação catalítica, que é causada geralmente pela proteólise da ciclina B.
Em ovócitos fecundados de camundongos e de suínos, a degradação da ciclina B foi
claramente relacionada com a inativação do complexo MPF (WINSTON, 1997;
KIKUCHI et al., 1999).
O MPF é um dos principais reguladores das alterações morfológicas durante
a maturação ovocitária, regulando a condensação dos cromossomos, o rompimento
do envelope nuclear, a reorganização dos microtúbulos e outras organelas
citoplasmáticas com a participação de outras proteínas (KIM et al., 2000; KANO et
al., 2000; KRISCHEK e MEINECKE, 2002; KUBELKA et al., 2002; LEFEBVRE et al.,
2002).
2.2.4.3. Proteína cinase ativada por mitógenos (MAPK)
Um segundo grupo importante de proteínas que estão envolvidas na
progressão da meiose pertencem à família das serina/treonina cinases, as proteínas
cinases ativadas por mitógenos (MAPK) (KUBELKA et al., 2000). Essas proteínas
são ativadas dentro de vias específicas de transdução de sinais (Figura 6), por sinais
extracelulares (NEBREDA e FERBY, 2000). Por esta razão, a MAPK também é
chamada de ERK (cinase regulada por sinal extracelular – suas variantes, ERK1/2 –
p44/p42 kDa) (KRISCHEK e MEINECKE, 2002). A via intracelular de transdução de
sinal consiste na proteína mos (do oncogene c-mos) que ativa a MEK (MAPKK) que
fosforila a ERK (MAPK) (CHA e CHIAN, 1998; KRISCHEK e MEINECKE, 2002; SUN
et al., 2002).
-
14
A ampla faixa de atuação das MAPKs é mediada pela fosforilação de diversos
substratos, incluindo fosfolipases, fatores de transcrição e proteínas do
citoesqueleto. As MAPKs também catalisam fosforilação e a ativação de diversas
proteínas cinases, denominadas de proteínas cinases ativadas pelas MAPKs, que
representam um adicional enzimático de vários espectros em diferentes células
(ROUX e BLENIS, 2004).
As MAPKs são amplamente ativadas por fatores de crescimento e por soro,
com uma ativação menor pelo
estresse, efeito osmótico e pela
desorganização dos microtúbulos.
Uma variedade de estímulos
diferentes pode ativá-las, mas no
geral a ERK1 e ERK2 são ativadas
preferencialmente em resposta aos
fatores de crescimento, enquanto
as cinases JNK (c-jun amino
terminal cinase) e p38 cinase são
mais responsivas aos estímulos de estresse e efeitos osmóticos (CHEN et al., 2001;
ROUX e BLENIS, 2004).
MAP4K GDP GTP
A via MAPK é ativada universalmente durante a maturação meiótica em
ovócitos de vertebrados. Entretanto, o tempo requerido para sua ativação é díspar
nas diferentes espécies (NEBREDA e FERBY, 2000). A ativação da MAPK em
ovócitos bovinos ocorre após 8 horas de cultivo in vitro e apresenta um aumento
gradual até 12–14 horas e se mantém estável até o final da maturação (KUBELKA et
al., 2000).
As duas principais isoformas (ERK1/2) da MAPK são ativadas com a
proximidade do rompimento da VG em ovócito bovinos (KUBELKA et al., 2000). Isso
sugere que a MAPK não é requerida para o reinício da meiose, mas é essencial em
eventos pós-rompimento da VG (KANO et al., 2000; LEFEBVRE et al., 2002).
Porém, a injeção de MAPK ativa em ovócitos de suíno ou de bovino induz o
rompimento da VG, indicando que essa proteína promove o reinício da meiose em
condições especiais (FISSORE et al., 1996; INOUE et al., 1998).
MAP3K MAPKK MAPK Figura 6. Diagrama simplificado das vias de ativação das MAPKs. Fonte: Cha e Chian 1998; Nebreda e Ferby, 2000; Kubelka et al., 2000; Krischek e Meinecke, 2002; Sun et al., 2002.
GTP
Raf-1
MEK
ERK
CSF
GDP
mos
AMPc ⇓
PKA ⇓
Ras
-
15
2.3. Competência ovocitária
A competência para a progressão da maturação meiótica em ovócitos de
mamíferos é adquirida durante o crescimento folicular (PAVLOK et al., 2000;
MIYANO, 2003). Nesse contexto, para que o ovócito tenha competência para a
maturação tanto nuclear como citoplasmática esse deve completar sua fase de
crescimento. Em bovinos foi demonstrado que folículos de diâmetro acima de 3 mm
de diâmetro contêm ovócitos (110-120 μm de diâmetro) com potencial de
desenvolvimento mais elevado que os de folículos menores (GANDOLFI e
GANDOLFI, 2001). Ovócitos obtidos de folículos maiores de 3 mm de diâmetro
resultam em blastocistos com maior número de células nucleadas, comparados com
os ovócitos obtidos de folículos menores que 3 mm (AVELINO et al., 1998).
Ainda não está totalmente compreendido como os ovócitos adquirem a
competência meiótica durante sua fase de crescimento e se tornam competentes
para reiniciar e terminar a meiose. Há evidências de que a aquisição da competência
meiótica nos ovócitos está correlacionada com as moléculas de RNAs e de proteínas
estocadas durante a fase de crescimento e maturação do ovócito e com o aumento
da funcionalidade das mitocôndrias (DE LA FUENTE e EPPIG, 2001; STOJKOVIC et
al., 2001; TOMEK et al., 2002; CHIAN et al., 2003).
Essas moléculas são usadas para sustentar as fases iniciais do
desenvolvimento embrionário antes que a transcrição do DNA do embrião se torne
ativa (DE LA FUENTE e EPPIG, 2001). Os padrões de síntese protéica aumentam
antes do rompimento da vesícula germinativa em ovócitos durante o cultivo de
maturação, sugerindo que essa síntese de proteínas possa ser importante para o
subseqüente desenvolvimento embrionário (TOMEK et al., 2002; CHIAN et al.,
2003). Isso faz do ovócito uma célula muito especial, completamente diferente das
células somáticas, onde os RNAs e as proteínas se submetem geralmente a uma
rápida rotação de estoque. Para permitir o estoque e o uso oportuno de tais
moléculas armazenadas, vários mecanismos necessitam ser eficaz nesse controle
no ovócito (GANDOLFI e GANDOLFI, 2001; TOMEK et al., 2002).
Em bovinos, os RNAs e as proteínas do ovócito conduzem o desenvolvimento
embrionário inicial após a fecundação até o 4º ciclo celular quando o controle
genômico (estádio de 8 a 16 células) do embrião torna-se evidente. Muitos dos
-
16
produtos derivados dos transcritos maternos são necessários para preparar o
maquinário biológico do embrião (SIRARD, 2001; DIELEMAN et al., 2002; KAÑKA,
2003).
A competência meiótica em ovócitos de Xenopus sp está correlacionada com
as mudanças no acúmulo e na ativação de moléculas do ciclo celular (JESSUS e
OZON, 2004). Esses mesmos
mecanismos foram observados em
ovócitos em crescimento de suínos
que começam a acumular
moléculas CDK1. Já a ciclina B foi
observada em ovócitos de folículos
antrais pequenos quando cultivados
em meio de maturação (Figura 8),
mas a CDK1 foi negativamente
fosforilada e assim inativada, talvez
pela proteína Myt1 (KANAYAMA et al., 2002; MIYANO, 2003). Nos folículos de 1,0-
1,5 mm de diâmetro, os ovócitos iniciam a meiose, mas param em metáfase I. Eles
são capazes de ativar o MPF, mas não estabelecem a cascata de proteínas da via
MAPK (KANAYAMA et al., 2002; MIYANO, 2003). Os ovócitos em crescimento
desenvolvem primeiramente a habilidade de ativar CDK1 e posteriormente de ativar
a via MAPK. Somente os ovócitos com o crescimento completo possuem
competência para ativar efetivamente as duas vias do ciclo celular.
Folículos 0,5-0,7mm 1,0-1,5 mm 4,0-6,0 mm Ovócitos 104 μm 109 μm 122μm
0 27 42 0 27 42 0 27 42h
histona H1 MBP Cultivo (h)
Figura 8. Mudanças nas atividades da CDK1 e da MAPK durante a maturação de ovócitos de suínos em vários estádios do crescimento folicular. As atividades da CDK1 e da MAPK foram detectadas pela fosforilação de histona H1 e da proteína básica de mielina (MBP), respectivamente. Adaptado a partir de Miyano, 2003.
Na produção de embriões in vitro, a maioria dos ovócitos bovinos são
provenientes de folículos de 2 a 6 mm de diâmetro (ADONA e LEAL, 2004; DALVIT
et al., 2005). A remoção dos ovócitos dos folículos antes de eles finalizarem a
foliculogênese é, provavelmente, um dos fatores envolvidos na baixa produção de
embriões in vitro. Assim sendo, a interrupção da foliculogênese seria um fator
responsável pela redução da competência ovocitária. Para contornar a
foliculogênese interrompida a que os ovócitos são submetidos, uma alternativa seria
mantê-los por um determinado período com a mesma configuração nuclear daquela
encontrada nos folículos. Para tal, os ovócitos seriam submetidos ao bloqueio
meiótico, evitando a retomada da meiose logo após a sua remoção dos folículos,
para que tenham o tempo necessário para sofrerem as mudanças necessárias antes
de serem submetidos à maturação in vitro.
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17
2.4. Bloqueio meiótico
A maturação espontânea em ovócitos de bovinos ocorre in vitro após sua
retirada do ambiente folicular, o que se deve, provavelmente, à remoção do sinal
inibidor proveniente do folículo. Estudos sugerem que o fator inibidor que controla a
retomada da meiose seja produzido pelas células da teca e/ou granulosa (células
foliculares) (FOOTE e THIBAULT, 1969; SIRARD et al., 1998). KOTSUJI et al.
(1994) demonstraram que o fator inibidor da meiose em ovócitos bovinos seria
sintetizado pelas células da granulosa, mas que as células da teca contribuiriam na
amplificação desse sinal. O mecanismo que envolve o reinício da meiose também
está associado a redução nas concentrações de AMPc (monofosfato de adenosina
cíclica) (CONTI et al., 1998).
O AMPc é uma molécula sinalizadora intracelular que exerce um importante
controle na meiose em mamíferos, anfíbios e em alguns invertebrados (BILODEAU-
GOESEELS, 2003). A redução do AMPc no interior do ovócito parece estar
envolvida com a ruptura da vesícula germinativa, ao menos in vitro. Assim, os níveis
elevados da AMPc dentro do ovócito mantêm o bloqueio meiótico, visto que a
redução do AMPc é um sinal necessário para a maturação ovocitária (CONTI et al.,
1998; EYERS et al., 2005).
A regulação nas atividades enzimáticas de uma série de proteínas cinases e
fosfatases controla a meiose em ovócitos de mamíferos. Dessa forma, a meiose
pode ser bloqueada por inibidores que mantenham altas concentrações de AMPc no
interior do ovócito (BILODEAU-GOESEELS, 2003), por inibidores não específicos da
síntese protéica (MEINECKE et al., 2001), de proteínas cinases (ANDERIESZ et al.,
2000; DODE e ADONA, 2001) e por inibidores específicos da fosforilação de
proteínas CDKs (ADONA e LEAL, 2004).
In vitro, o reinício da meiose ocorre porque o ovócito é liberado da influência
dos inibidores provenientes do folículo (KOTSUJI et al., 1994). No entanto, a
maturação in vitro resulta em uma redução na produção de embriões, sugerindo que
nem todos os ovócitos conseguem maturar adequadamente (maturação
citoplasmática). Portanto, diferentes protocolos estão sendo usados in vitro para
permitir que todos (ou a maioria) os ovócitos coletados terminem a maturação
nuclear sem afetar a qualidade dos mesmos, a fim de maximizar a produção de
-
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embriões (ADONA e LEAL, 2004; SCHOEVERS et al., 2005). O uso de inibidores
fisiológicos ou farmacológicos pode ser uma alternativa in vitro para um cultivo de
pré-maturação antes de submeter os ovócitos à maturação, fecundação e ao
desenvolvimento embrionário.
A ativação das cinases dependentes de ciclinas (CDKs - MPF) é um ponto
chave no reinício da meiose em ovócitos. Na tentativa de sincronizar o
desenvolvimento nuclear nos ovócitos in vitro, alguns estudos demonstraram a
inibição da ativação do MPF pelo aumento de níveis intracelulares de AMPc com
dbcAMP ou hipoxantina (SUN et al., 1999; MA et al., 2003), pela inibição não
específica da síntese protéica com cicloheximida (MEINECKE et al., 2001) ou pela
inibição não específica de proteínas cinases com 6-dimetilaminopurina
(ANDERIESZ et al., 2000; DODE e ADONA, 2001). Embora a inibição da ativação do MPF seja bem sucedida com o uso dessas drogas, os efeitos não específicos
desses inibidores são prejudiciais para o desenvolvimento subseqüente do ovócito.
As CDKs desempenham um papel central na regulação do ciclo da divisão
celular, o que lhes faz um alvo promissor para o desenvolvimento de agentes
terapêuticos do câncer. Um grande esforço foi feito nos últimos anos na busca de
inibidores específicos de CDKs de baixo peso molecular (BRAÑA et al., 2004). A
butirolactona I é um inibidor natural isolado do fungo Aspergillus terreus, que exibe
atividade antiproliferativa, inibindo seletivamente em mamíferos as cinases CDK2 e
CDK1, que executam um importante papel na progressão do ciclo celular nas fases
G1/S e G2/M, respectivamente (SCHIMMEL et al., 1998; SCHANG, 2004).
Entretanto, tem pouco efeito nas proteínas cinases ativadas por mitógenos, proteína
cinase C, cinases dependentes de AMPc, caseína cinase I e II e no receptor tirosina
cinase do fator de crescimento epidermal (SCHIMMEL et al., 1998; SAX et al., 2002;
BRAÑA et al., 2004). A butirolactona I comporta-se como um inibidor competitivo
pelo local de ligação do ATP na CDK1 (SAX et al., 2002; BRAÑA et al., 2004).
É possível manter os ovócitos bovinos em estádio de vesícula germinativa in
vitro por um determinado período de tempo com o uso de inibidores específicos ou
não de CDKs (butirolactona I, roscovitina, cicloheximida e 6-dimetilaminopurina).
Essas informações são importantes, pois tornam possível fazer um cultivo de pré-
maturação para, posteriormente, induzir a maturação final. Assim, permite ao ovócito
um tempo maior para sofrer as mudanças necessárias à aquisição da competência
meiótica, visto que estes são submetidos a uma foliculogênese interrompida, sendo
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removidos precocemente dos folículos e ocorrendo a retomada espontânea da
meiose. Entretanto, convém ressaltar que nesse tipo de estudo é importante verificar
não só a efetividade das substâncias em inibir o reinício da meiose, mas também
sua eficiência na reversibilidade e ausência de efeitos negativos sobre o
desenvolvimento embrionário.
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3. OBJETIVOS
O presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito da butirolactona I no
cultivo de pré-maturação sobre a meiose, estruturas celulares e desenvolvimento
dos ovócitos bovinos cultivados in vitro.
Mais especificamente foram avaliados:
1) as condições de redução da concentração de BL I para indução de bloqueio
meiótico e sua reversão (maturação in vitro);
2) a cinética de maturação pós-bloqueio;
3) a organização do citoesqueleto (microtúbulos e microfilamentos) após o
bloqueio meiótico e sua reversão;
4) a distribuição de organelas (grânulos corticais e mitocôndrias) após o bloqueio
meiótico e sua reversão;
5) o efeito do bloqueio meiótico sobre o desenvolvimento embrionário.
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4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Coleta de ovários e ovócitos
Ovários de fêmeas bovinas foram coletados em frigoríficos logo após o abate
e transportados em solução fisiológica estéril (NaCl 0,9% – Sigma, S9625) acrescida
de antibióticos (100 UI/mL de penicilina – Sigma, P7794 e 100 ug/mL de
estreptomicina – Sigma, S9137) a uma temperatura de 30º C. No laboratório, os
ovários foram lavados em NaCl 0,9% e os folículos com diâmetro de 2 – 6 mm
foram aspirados com auxílio de uma agulha de 18 “G” (1,20 X 40 mm) conectada a
uma seringa descartável de 10 mL. O líquido folicular contendo os ovócitos foi
depositado em tubos cônicos de 50 mL (Cellstar, 227261) e mantido em repouso
para decantação por 5 minutos. A porção superior do líquido foi retirada e na porção
restante foram adicionados 3-5 mL de meio H199 (TCM199 com 25 mM de Hepes –
Gibco, 12340030) acrescido de 100 UI/mL de penicilina e 100 ug/mL de
estreptomicina; suplementado com 1% de soro fetal bovino – Gibco, 26140-079).
Posteriormente, o material do tubo foi transferido para uma placa de Petri (60 x 15
mm – Falcon, 353002), onde foi feita a busca dos ovócitos sob estereomicroscópio
para avaliação e classificação dos mesmos. Somente ovócitos classificados como
graus I e II (DE LOOS et al., 1991), contendo três ou mais camadas de células do
cumulus oophorus e citoplasma uniforme, foram utilizados para os experimentos.
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4.2. Solução estoque do inibidor
O inibidor de cinases dependentes de ciclinas (CDKs) butirolactona I (Biomol,
87414-49-1) foi preparado em solução estoque de 50 mM em dimetilsulfóxido
(DMSO – Sigma, D5879) e rediluído para 5 mM com B199 [TCM199 com sais de
Earle e com 20 mM de bicarbonato de sódio (Gibco-11150-067) suplementado com
10 μg/mL de gentamicina (Sigma, G1272)], aliquotado em tubos para
microcentrífuga e conservado no freezer a -20º C.
4.3. Bloqueio da meiose com butirolactona I
Para o bloqueio da meiose os ovócitos bovinos foram cultivados in vitro com
butirolactona I (BL I) diluída em meio B199 (suplementado com 0,2 mM de piruvato –
Sigma, P5280) na concentração apropriada do experimento (descrita
posteriormente). O cultivo foi feito em gotas de 100 µl de meio de bloqueio (±20
ovócitos por gota), sob óleo mineral (Sigma, M8410) a 38,5º C em atmosfera de 5%
de CO2 em ar.
4.4. Determinação do estádio da meiose
Para determinação do estádio da meiose, os ovócitos foram desnudados
(remoção das células do cumulus oophorus) em tubo de 5 mL com 0,3 mL de PBS
acrescida de 1% de SFB (soro fetal bovino) e agitados no “vortex” por 4 minutos
(Figura 9). Os ovócitos desnudos foram fixados entre lâmina e lamínula por 24 horas
em etanol (Synth, A1084.01.BJ) e ácido acético (Synth, A1019.01.BJ) 3:1. Após a
fixação, foram corados com lacmóide 0,004% (Aldrich, 274720) e observados em
microscópio de contraste de fase para determinação dos estádios da meiose. Os
ovócitos foram classificados de acordo com a configuração nuclear em vesícula
germinativa (VG), metáfase I (M I), anáfase I (A I), telófase I (T I) e metáfase II (M II)
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(Figura 10). A taxa de bloqueio foi avaliada como a percentagem de ovócitos em VG
e a de reversão como a percentagem de ovócitos em M II.
Figura 9. Procedimentos para fixação e coloração de ovócitos.
3) Pressionar a lamínula sobre a lâmina suavemente até fazer uma pressão nos ovócitos – pouca pressão os ovócitos ficam soltos entre a lâmina/lamínula; o inverso os ovócitos rompem. 4) Colocar a lâmina no fixador 3:1 (álcool etílico e ácido acético). 5) Deixar fixando por no mínimo 24 h.
6) coloração com lacmóide ou orceina acética
a) Colocar a lâmina em um ângulo de 45°, adicionar o corante na parte superior da lâmina; b) Corar por ±5 minutos; c) se for necessário remover o excesso de corante com o próprio fixador; d) Não deixar secar a lâmina – vedar com esmalte. (corante: 40 mL ácido acético, 60 mL água + 0,004% do corante – aquecer para dissolver melhor e filtrar)
2) Preparação das lâminas para fixação dos ovócitos
Lâmina: Fazer uma gota de ±4μL
com ± 25 ovócitos.
Lamínula: Colocar pequenas gotas
de cola (silicone) nas bordas.
1) Procedimento para desnudar os ovócitos
Em um tubo de 5 mL adicionar 0,3 mL de PBS e os ovócitos. Agitar no vortex (velocidade 6-7) por 4 minutos; lavar a parede do tubo com 2 mL de meio; transferir o conteúdo para uma placa de Petri para seleção dos ovócitos.
P B S
A B C D
400X 400X 200X 200X
Figura 10. Classificação da meiose de ovócitos bovinos. A) vesícula germinativa; B) metáfase I; C) anáfase I/telófase I; D) metáfase II. Seta vermelha: placa metafásica e seta azul: 1° corpúsculo polar.
4.5. Maturação in vitro
Após o período de bloqueio, os ovócitos foram lavados três vezes em meio
livre de inibidor e transferidos para o meio de maturação [B199 suplementado com
10% de SFB (soro fetal bovino), 5,0 µg/mL de LH (hormônio luteinizante, Bioniche –
Lutropin-v), 0,5 µg/mL de FSH (hormônio folículo estimulante, Bioniche – Folltropin-
v), 0,2 mM de piruvato e 10 μg/mL de gentamicina]. Como controle, um grupo de
ovócitos foi submetido à maturação sem sofrer cultivo prévio de bloqueio. O cultivo
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de maturação in vitro (MIV) foi feito em gotas de 100 µl de meio de maturação (±20
ovócitos por gota), sob óleo mineral a 38,5 º C e atmosfera de 5% de CO2 em ar.
4.6. Microtúbulos
Para avaliação dos microtúbulos os ovócitos foram desnudados e fixados em
3,7% de paraformaldeído (Sigma, P6148) acrescido de 0,6% Triton X-100 (USB,
9002-93-1) em PBS (livre de cálcio e magnésio) com 0,1% de PVA (álcool polivinílico
- Sigma, P8136) por 30 minutos; lavados três vezes em PBS com 0,1% de PVA
(PP); bloqueados com 3% de soro de cabra (Invitrogen, 16210-064) em PP por 45
minutos; corados com anticorpo anti-alfa tubulina conjugada com FITC (Sigma,
F23168) (1:100) em PP por uma hora; lavados por três vezes em PP; corados com
10 μg/mL de iodeto de propídio (Sigma, P4170) em PP por 15 minutos; lavados três
vezes em PP e montados entre lâmina e lamínula com glicerol (USB, 56-81-5) para a
avaliação sob microscópio de epifluorescência.
4.7. Microfilamentos Para avaliação dos microfilamentos os ovócitos foram desnudados e fixados
em 3,7% de paraformaldeído mais 0,6% Triton X-100 em PP por 30 minutos; lavados
três vezes em PP; colorados com 1 μg/mL de faloidina conjugada com FITC (P5282)
mais 10 μg/mL de iodeto de propídio em PP por 30 minutos; lavados três vezes em
PP e montados entre lâmina e lamínula com glicerol para a avaliação sob
microscópio de epifluorescência.
-
25
4.8. Grânulos corticais
Para avaliação dos grânulos corticais os ovócitos foram desnudados e a zona
pelúcida foi removida com 0,5% protease (Sigma, P8811) em PBS (livre de cálcio e
magnésio) por ±6 minutos a 38,5 °C; fixados em 3,7% de paraformaldeído em PP
por 30 minutos; incubados em solução de bloqueio [SB: PBS suplementado com
0,1% de BSA, 0,751% de glicina (Sigma, G8790) e 0,2% de azida sódica (Research
Organics, 0939S)] por duas horas; permeabilizados com 0,1% Triton X-100 em SB
por 5 minutos; lavados três vezes em SB; corados com 1 μg/mL de lectina – Lens
culinaris (Sigma, L9262) e 10 μg/mL de iodeto de propídio em SB por 15 minutos;
lavados três vezes em SB e montados entre lâmina e lamínula com glicerol para a
avaliação sob microscópio de epifluorescência.
4.9. Mitocôndrias
Para avaliação das mitocôndrias os ovócitos foram desnudados; corados com
0,5 µM de Mitotracker red (Molecular probes) e 10 µg/mL Hoechst 33342 (Sigma,
B2261) em PP por 20 minutos; lavados três vezes em PP e montados entre lâmina e
lamínula para a avaliação sob microscópio de epifluorescência.
4.10. Fecundação e cultivo in vitro
Para a fecundação in vitro (FIV) foi utilizado sêmen congelado de um mesmo
touro e da mesma partida, o qual foi preparado segundo a técnica de gradiente
Percoll (Amersham Biosciences, 17-0891-01). Em um tubo cônico de 15 mL (Tedia
Brazil, 1475-1611.50), foi adicionado 1 mL de Percoll 90% e, em seguida, 1 mL de
Percoll 45% (Apêndice). O gradiente foi mantido na estufa de CO2 por uma hora
antes de sua utilização. O sêmen foi descongelado a uma temperatura de 37° C por
30 segundos e, em seguida, adicionado na porção superior do gradiente de Percoll e
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26
centrifugado por 10-12 minutos a 650 “g”. Após a retirada do sobrenadante foram
adicionados 4 mL de meio TALP-sp (Apêndice), e uma nova centrifugação de 2
minutos a 200 “g” foi realizada para remover o excedente do Percoll.
Os espermatozóides foram adicionados na gota de fecundação a uma
concentração final de 2 x 106 espermatozóides/mL. A fecundação foi feita em TALP–
FIV (Apêndice) suplementado com 2 µM penicilamina (Sigma, P4875), 1 µM
hipotaurina (Sigma, H1384), 250 µM epinefrina (Sigma, E1635) e 20 µg/mL heparina
(181 UI/mg, USB, 9041-08-1). Os espermatozóides e os ovócitos foram co-
incubados em gotas de 100 µL de meio sob óleo mineral em placa de Petri (35 x 10
mm. Corning, 430165) por um período de 18 horas.
Após as 18 horas de FIV, os ovócitos foram parcialmente desnudados com
auxílio de um micro-pipetador de 50 µL. Após o desnudamento parcial, os ovócitos
foram transferidos para o meio de cultivo in vitro SOF (fluido de oviduto sintético -
Apêndice) em gotas de 100 µL e com 48 horas de cultivo in vitro (D2), foi avaliada a
taxa de clivagem. Os ovócitos clivados permaneceram no meio de cultivo in vitro e
os demais foram removidos e descartados. No quinto dia (D5) de cultivo in vitro foi
feita a troca (feeding) parcial (40%) do meio de cultivo e a partir do sétimo (D7) e do
oitavo dia (D8) foi feita a avaliação das taxas de formação de blastocisto (D7), de
eclosão (D8) e a contagem do número de células dos embriões eclodidos (D8). O
cultivo in vitro dos embriões foi feito em estufa de CO2 a 38,5ºC em atmosfera de 5%
de CO2 em ar.
Para a contagem do número de células dos embriões em estádio de
blastocisto eclodido, eles foram corados com 10 µg/mL de Hoechst 33342 em PP
por 15 minutos; lavados três vezes em PP e montados entre lâmina e lamínula para
a avaliação sob microscópio de epifluorescência.
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4.11. Delineamento experimental
4.11.1. Experimento 1: Avaliação de concentrações decrescentes de BL I em meio suplementado com BSA.
Nesse experimento foram avaliadas concentrações decrescentes de BL I
(100, 50 e 25 μM) em meio de cultivo (B-199) suplementado com albumina sérica
bovina (BSA, Sigma, A9647) (Figura 11), para avaliar a capacidade da BL I em
promover o bloqueio meiótico em diferentes concentrações. Os ovócitos foram
cultivados na presença ou ausência (controle) de BL I por um período de 24 h. Após
o período de cultivo in vitro, os ovócitos foram desnudados, fixados, corados e
avaliados sob microscópio de contraste de fase para determinação das taxas de
bloqueio da meiose (VG). Um grupo de ovócitos foi fixado logo após a aspiração
(controle zero hora).
Figura 11. Esquema representativo do delineamento do experimento 1.
25 μM de BL I
50 μM de BL I
100 μM de BL I
fixados
Controle C/0
24 h de cultivo com BSA
desnudados
corados
avaliados
Controle C/24
Avaliado logo após a aspiração
4.11.2. Experimento 2: Avaliação de concentrações crescentes de BL I em meio sem suplementação de BSA
Nessa avaliação, não foi usada suplementação protéica (BSA) no meio de
bloqueio (Figura 12). O bloqueio da meiose foi feito em meio B199 com diferentes
concentrações de BL I (10, 15, 20 e 25 μM) com o intuito de investigar a capacidade
do inibidor em bloquear a meiose em concentrações ainda mais baixas, porque
segundo KUBELKA et al., (2000) o inibidor (BL I) poderia interagir com o BSA,
reduzindo sua disponibilidade no meio. Com base nesse estudo os ovócitos bovinos
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foram cultivados na presença ou ausência (controle) do inibidor sem suplementação
de BSA por um período de 24 horas. Após o cultivo, os ovócitos foram desnudados,
fixados, corados e avaliados sob microscópio de contraste de fase para
determinação das taxas de bloqueio da meiose (percentagem de VG).
Figura 12. Esquema representativo do delineamento do experimento 2.
10 μM de BL I
15 μM de BL I
20 μM de BL I
25 μM de BL I
Avaliados
Controle C/24
24 h de cultivo sem adição de BSA
4.11.3. Experimento 3: Efeito do bloqueio da meiose na maturação nuclear
Para a avaliação da maturação pós-bloqueio da meiose, ovócitos bovinos
foram cultivados na presença (10 μM em meio sem BSA e 100μM em meio com
BSA) de BL I por 24 h, conforme definido nos experimentos 1 e 2. Como controle,
um grupo submetido apenas à maturação in vitro. Após o período de bloqueio,
ambos os grupos foram maturados in vitro por mais 24 h (Figura 13). A seguir, foram
desnudados, fixados, corados e avaliados sob microscópio de contraste de fase para
determinação das taxas de maturação (percentagem de metáfase II).
Figura 13. Esquema representativo do delineamento do experimento 3.
10 μM de BL I
100 μM de BL I
Avaliados
24 h de bloqueio
24 h de MIV
24 h de MIV
24 h de MIV
Controle
-
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4.11.4. Experimento 4: Cinética da maturação nuclear pós-bloqueio da meiose
Nesse experimento, os ovócitos foram bloqueados por um período de 12
horas na presença (100 μM de BL I) ou na ausência (10 μM de BL I) de BSA e
avaliados ao longo da MIV, nos horários de 6, 12 e 18 horas de maturação (Figura
14). Os períodos de bloqueio da meiose e da maturação (reversão) foram baseados
no estudo feito por ADONA e LEAL (2006). Após cada período de maturação (6, 12
e 18 horas), os ovócitos foram desnudados, fixados, corados e avaliados sob
microscópio de contraste de fase para determinação do estádio de maturação
nuclear. Um grupo de ovócitos submetido somente à MIV também foi avaliado nos
mesmos períodos dos tratados com BL I.
Horários das avaliações Figura 14. Esquema representativo do delineamento do experimento 4.
12 horas de bloqueio
10 μM de BL I
100 μM de BL I
12 h de MIV
18 h de MIV
MIV
Controle
Avaliações
CCiinnééttiiccaa ddaa mmaattuurraaççããoo ppóóss--bbllooqquueeiioo ddaa mmeeiioossee
6 h de MIV
4.11.5. Experimento 5: Efeito do bloqueio da meiose na organização dos microtúbulos e dos microfilamentos
Nesse experimento foram avaliados os efeitos do bloqueio meiótico em
condições de baixa e alta concentração de BL I (definidos nos experimentos 1 e 2)
na organização dos microtúbulos e dos microfilamentos. Os ovócitos foram
bloqueados por 24 horas e posteriormente cultivados em meio de maturação.
Ovócitos foram coletados às 0, 6, 12, 18 e 24 horas de pós-bloqueio para a
avaliação da organização dos microtúbulos, microfilamentos. A progressão meiótica
foi avaliada concomitantemente (Figura 15). O controle foi avaliado nos mesmos
-
30
horários ao longo da MIV sem ter sofrido inibição prévia. Um grupo de ovócitos foi
avaliado logo após a aspiração (controle 0h) e um outro no final das 24 horas de
bloqueio (antes do início da MIV – controle 24h).
Figura 15. Esquema representativo do delineamento do experimento 5.
24 horas de bloqueio
10 μM de BL I
100 μM de BL I
6 h de MIV
12 h de MIV
18 h de MIV
MIV
Controle
Avaliações
Horários das avaliações
0 h de MIV
24 h de MIV
Avaliação dos microtúbulos e dos microfilamentos
4.11.6. Experimentos 6: Efeito do bloqueio da meiose na distribuição dos grânulos corticais e das mitocôndrias.
Nesse experimento foi avaliado o efeito da BL I na distribuição dos grânulos
corticais e das mitocôndrias nos ovócitos tratados com duas concentrações de BL I,
uma na ausência (10 μM) e outra na presença (100 μM) de BSA. Os ovócitos foram
bloqueados por 24 horas e após esse período de bloqueio foram divididos em dois
grupos, uns para avaliação imediata (24 horas de bloqueio) e os demais cultivados
em meio de maturação e coletados somente depois de 24 horas de MIV (Figura 16),
para a avaliação do efeito na distribuição dos grânulos corticais e das mitocôndrias
nos ovócitos tratados com o inibidor do ciclo celular. No grupo controle, a avaliação
foi feita em dois momentos, um logo após a aspiração (zero hora) e uma outra no
final da maturação (24 horas de MIV).
-
31
Figura 16. Esquema representativo do delineamento do experimento 6.
24 horas de bloqueio
Controle
10 μM de BL I
100 μM de BL I
Avaliados
Bloqueados
Imaturos
Maturados
Avaliados
Maturados
Avaliação dos grânulos corticais e das mitocôndrias
4.11.7. Experimento 7: Efeito da BL I no desenvolvimento embrionário in vitro
Nesse experimento foi avaliado o efeito de BL I sobre os ovócitos que foram
expostos (tratados) ou não (controle) a duas concentrações do inibidor, uma na
ausência (10 μM de BL I) e outra na presença de BSA (100 μM de BL I). Após o
período de bloqueio (24 horas) e de maturação in vitro (MIV, 21 horas), os ovócitos
foram submetidos à fecundação in vitro (FIV, 18 horas) seguida pelo cultivo in vitro
(CIV, 8 dia) (Figura 17). Com 48 horas de CIV (D2), foram avaliados quanto às taxas
de clivagem. As taxas de desenvolvimento dos embriões em estádio de blastocistos
foram determinadas no dia 7 (D7) da CIV. No dia 8 (D8) da CIV foram determinadas
as taxas de eclosão e o número total de células dos blastocistos eclodidos.
Figura 17. Esquema representativo do delineamento do experimento 7.
Eclosão
Nº de células
Clivagem Blastocistos
Controle/MIV FIV CIV
24 horas 21 horas 18 horas D2 D7 D8
MIV CIVFIV10 μM de BLI
MIV FIV CIV100 μM de BLI
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4.12. Análise estatística
Os dados foram avaliados utilizando metodologia de quadrados mínimos, por
meio do procedimento PROC GLM do programa Statistical Analysis System, versão
9.1.3 (SAS, 1995). As variáveis foram transformadas, de acordo a função arco seno
(raiz - percentagens), de acordo com as recomendações de Banzatto e Kronca
(1989). Os dados dos números de células dos blastocistos não foram transformados,
sendo analisados em escala original. Para os resultados significativos nas análises
de variância foi utilizado o teste t de Student como procedimento de comparações
múltiplas entre os grupos. O nível de significância foi de 5% para evidenciar
diferenças entre os tratamentos.
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5. RESULTADOS
5.1. Experimento 1
Nesse experimento foram avaliadas diferentes concentrações de butirolactona
I (BL I) em meio de cultivo B199 suplementado com albumina sérica bovina (BSA),
visando determinar a concentração mais adequada em estudos de bloqueio meiótico
em ovócitos bovinos.
A maioria dos ovócitos tratados nas concentrações de 100 (B100), 50 (B50) e
25 µM (B25) de BL I permaneceram bloqueados na meiose em estádio de vesícula
germinativa (VG), nas proporções de 97,4; 84,4 e 65,1%; respectivamente. No grupo
controle após 24 h de cultivo (C/24) não foram observados ovócitos em estádio de
VG (0%). Dos ovócitos avaliados logo após a aspiração folicular (controle zero hora
– C/0), 100% dos mesmos encontravam-se em estádio VG (Tabela 3). Os grupos
C/24 (0%), B100 (97,4%), B50 (84,4%) e B25 (65,1%) diferiram entre si (P < 0,05)
para o percentual de ovócitos em VG, com as taxas de bloqueio meiótico diminuindo
com a redução da concentração do inibidor. O grupo B100 (97,4%) e o C/0 (100%)
por outro lado, foram similares entre si (P > 0,05).
Foram observados ovócitos nas fases intermediárias da meiose (MAT,
metáfase I, anáfase I e telófase I), somente no grupo C/24, no demais tratamentos
os ovócitos estavam em VG ou MII (metáfase II). A taxa de ovócitos em MAT do
grupo C/24 (10,4%) diferiu (P < 0,05) dos demais tratamentos (0%).
Com relação aos percentuais de ovócitos que atingiram o estádio de MII, ou
seja, que concluíram a maturação in vitro (MIV), houve diferença (P < 0,05) nas
taxas de MII entre os ovócitos dos grupos C/24 (89,6%), B100 (2,6%), B50 (15,6%) e
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B25 (34,9%) após 24 horas de cultivo, com a redução da taxa de MII com o aumento
da concentração de BL I. Não houve diferença (P > 0,05) entre os grupos C/0 (0%) e
B100 (2,6%) para o percentual de ovócitos em estádio de MII.
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