paula gameiro resistência bacteriana (na busca de novos antibióticos – um trabalho de...

Paula Gameiro

Resistência Bacteriana(na busca de novos antibióticos – um trabalho de cooperação

entre Biofísica, Microbiologia e Síntese Inorgânica )

uso generalizado e maciço de antibióticos e acontece quer estes sejam usados para tratar infecções, quer como profilaxia ou como promotores do crescimento animal

A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina

Antibióticos entram no corpo humano

matam quase todas as bactérias, mas algumas resistem e ficam activas....

Bactérias resistentes transferem os seus genes resistentes a outro tipo de bactérias....

Propagação de bactérias resistentes


O problema da resistência

Alguns antibióticos e desenvolvimento de resistência

Antibiotico Descoberta Uso Clinico Resistência

Penicilina 1929 1943 1940

Streptomicina 1944 1947 1947

Tetraciclina 1948 1952 1956

Eritromicina 1952 1955 1956

Vancomicina 1956 1972 1987

Gentamicina 1963 1967 1970


O problema da resistênciaBactérias mais comuns com resistência múltipla

Hospital Comunidade

Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae

Enterococcus faecium Mycobacterium tuberculosis

Enterococcus faecalis Neisseria gonorrhoeae

Klebsiella sp. Streptococcus pyrogenes

Enterobacter sp. Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Acinetobacter baumanii


O problema da resistênciaMédico....

Uso profilático antes de uma cirurgia Uso empírico (no known etiologic agent) Aumento do uso de agentes com largo

espectro Antibióticos nas rações animais Uso pediátrico para infecções víricas Adesão incompleta à terapêutica


O problema da resistência

ANTIBIÓTICOS

Substâncias produzidas por microorganismos que matam ou inibem outros microorganismos

Substâncias naturais modificadas no laboratório Substâncias sintetizados no laboratório

Penicilina


Cefalosporinas

penicilinas

macrolidos

quinolonas

aminoglicosideos

tetraciclinas

outros

37%

Várias famílias de antibióticos

17%11%

14%

17%3%

3%


Penicilinas Cefalosporinas


FluoroquinolonasMacrólidos


Causas de ineficácia

Famílias de antibióticos mais usadas:

Penicilinas Cefalosporinas Macrólidos Fluoroquinolonas

Destruição da droga Alteração no receptor Diminuição entrada Mecanismo metabólico

alternativo


Mecanismo de Acção


Mecanismos de Resistência


Inactivação da droga


S

NO

NRCH3

CH3

COOH

Penicillin

S

NO

NR

C-R

COOH

Cephalosporin

b-lactamase

b-lactamase


Diminuição captura/aumento excrecção


Bombas efluxo fluoroquinolonas, b-lactâmicos, macrolidos

Redução permeabilidade membrana

P. aeruginosa, E. coli O157:H7

quinolonas Mutação das porinas

Gram (-) b-lactâmicos,quinolonas


Mecanismos de ResistênciaInactivação da droga

Diminuição captura /

Modificação do alvo

b-lactâmicos

Macrólidos

Fluoroquinolonas

Diminuição captura/

Modificação do alvo

Diminuição captura/aumento excrecção

Aumento excrecção

aumento excrecção


Diminuição capturaAumento excrecção


Problema GraveApós introdução do DNA — seja via conjugação, transducção, ou transformação — está incorporado na célula e dá origem a um novo genótipo resistentes


Como controlar o problema? Novas drogas

Existem cerca de 100 antibioticos Três mecanismos de acção Farmacêuticas tentam descobrir novas

drogas (SAR) Investigação em genética e microbiologia

fisiologica, para descobrir novos alvos de acção

Ligação a universidades


Novos Antibióticos Inibidores da parede celular – baseados

no esqueleto dos beta-lactâmicos Novas quinolonas Drogas que inibam os mecanismos de

resistência Melhores inibidores das beta-lactamases Bloqueadores das bombas de efluxo

Drogas interfiram com as membranas Conhecimento sobre as estrutura/funções

membranares aumenta….


O que estamos a desenvolver….

Sistemas miméticos que permitam entender as interacções a nível molecular Captura/Uptake antibiótiocs

Síntese de possiveis metaloantibióticos: Cu/fluoroquinolona/fenantrolina


FLUOROQUINOLONAS

N

N

piperazine

NH2

R7 R5

GRAM(-)

CH3

GRAM (+)

X8 R5

N O-CH3

Activas contra anaerobicos

X8 X8

N


Proteínas da membrana externa Diminuição da captura

Proteínas que formam poros

OmpF a mais estudada

Trimero muito estável

Responsáveis pela captura de fluoroquinolonas

Porinas

Dados clínicos comprovam que diminuição do

influxo/captura causa de resistência


O que se verifica a nível clínico….


Preparação dos sistemas miméticosLipossomas

T>Tm

lípido

MLV

LUV

DMPC


Proteoliposomes: reconstitution

fitração por gelDiluiçãoBiobeads:Detergent beads

Reconstitutionmixture adsortion Proteoliposomes

Reconstitutionmixture

Detergent

Mixedmicelles

proteoliposomes

Remoção surfactante

0 50 100 150 200 250 300 350 4000

2

4

6

8

10

12

Mea

n In

tens

ity %

Size (d.nm)

0 40 80 120 160 200 240 2800

5

10

15

20

Mea

n In

tens

ity %

Size (d.nm)


Estudos anisotropia

DPH

5 10 15 20 25 30 35 40 450.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Ani

sotr

opy

Temperature ºC

LiposomesProteoliposomes biobedsProteoliposomes columnProteoliposomes sonication

Tm = 24.40.3 ºC.

Tm = 23.60.1 ºC.

)1(

212 '

101

mT

TB

ssss

rrrr

DPH

TMA-DPH

x

x

AFM

Bicamada achatada e homogénea, mostra inserção da porina

(i.e. globular features of 1.8 ± 0.7nm in height),

Proteolipossomasverificão da insertção


Espectro de actividade antibacteriana

Como escolher o sistema….


N

N N

F

O O

OH

Estirpes bacterianas

Testes susceptibilidade (cmc)NN

COOH

CH3

O

C2H5

N

O

COOHF

N

HN

BL21(DE3) mae (OmpF:Tn5) 2 (∆ lambB ∆ OmpC) 6 (∆ lambB OmpF:Tn5 ∆ OmpC) 7 BL21(DE3), no porin 8

http://129.128.185.122/drugbank2/drugs/DB01059/structure_image


24 Å

23 Å DMPC

OMPF: proteína mais importante


Interacção de fluoroquinolonas:

0.0 1.0x10-5 2.0x10-5 3.0x10-5 4.0x10-5

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25

F0

/F

|CIP|

290 300 310 320 330 340 350 360 370

250

300

350

400

450

500

550

IF

(nm)

Modelos)|exp(||)|1(0

AFQ VNQQKF

F

|)|exp(0 QKF

FFQ

Ciprofloxacin

E.Coli

NN

COOH

CH3

O

C2H5

N

O

COOHF

N

HNN

N N

F

O O

OH


Resultados Interação Quinolonas/OmpF : Constantes Associação (OmpF/QN)

Importancia da OmpF na captura das quinolonas em bacterias Gram (-)

Conatantes de associação indicam a afinidade do ligando para a proteína

Espectroscopia de UV-vis e de Fluorescencia

Desvio espectral indica interacção

310 320 330 340 350 360 3700

200

400

600

800

1000

Aumento [QN]

1

10

10

1

IF (

u.a

)

/ nm

Log K

Nalixic Ac Ciprofl Enrofl Moxiflo

DMPC 3.98 ± 0.04 4.22 ± 0.074.40 ± 0.07

4.45 ± 0.10

Há aumento da afinidade para a proteína das fluoroquinolonas mais recentes

Interaction between quinolones antibiotics and bacterial outer membrane porin OmpF, Patrícia Neves, Emir Berkane, Paula Gameiro, Mathias Winterhalter, Baltazar de Castro. Biophys. Chem. 2005, 113, 123-128.


LOCALIZAÇÃO


Localização das drogas no proteolipossoma

DMPC Nalidixic Ciproflo Enroflo Moxiflo

Ka fa Ka fa Ka fa Ka fa Ka fa

I-

2.8 0.4 1.5 0.5 2.2 0.4 0.4 0.7 3.1 0.4

(±0.2

)

(±0.1

)(±0.3)

(±0.1

)

(±0.1

)

(±0.1) (±0.1

)

(±0.

1)

(±0.2

)(±0.1)

Acryl

3.8 0.6 3.5 0.6 3.1 0.6 1.9 0.7 5.1 0.6

(±0.1) (±0.1) (±0.2) (±0.1) (±0.1)(±0.1)

(±0.3)(±0.1

)(±0.1) (±0.1)

MX ⇨ aumento de Ka possivel alteração na conformação

MX comportamento diferente ⇨ possivel interacção perto do Trp61

I-

ACR

AN decresce Ka Interação na interface lipido/OmpFCP interactua muito pouco com Trp214

Enr diminui Ka Interação na interface lipido/OmpF

AN, CP não provocam qualquer alteraçãoEnr diminui Ka interacção perto do Trp61

Fluorescence Quenching as a Tool to Investigate Quinolone Antibiotic Interactions with Bacterial Protein OmpF P. Neves,I Sousa, Ma. Winterhalter, P. Gameiro. J. Memb.Biol. 2009, 227, 133–140


Localização da droga

5 mM acido nalidixico

Antes adição antibiótico

5 mM moxifloxacina

Corrobora as conclusões para o ácido nalidixico

Estudos de conductância


Estudos de dinâmica molecular

Verifica-se a chegada da moxifloxacina ao local de ligação e um alargamento do poro.

Este indica um rearranjo da conformação da proteína para acomo dar a moxifloxacina.

Moxifloxacin interactua mais perto do Trp61Facilitated permeation of antibiotics across membrane channels – interaction of the quinolone moxifloxacin with the OmpF channel”, T. Mach, P. Neves, E. Spiga, H. Weingart, M.s Winterhalter, P. Ruggerone, M.Ceccarelli, P.Gameiro J. Am. Chem. Soc. 2008, 130 (40), 13301–13309.



Enrofloxacina

“Molecular Basis of Enrofloxacin Translocation through a Bacterial Porin – When Binding does not Imply Translocation “. Hajjar, E.; Mach, Ti.; Lovelle, M.; Sousa, I.; Kumar, A.t; Weingart, H.; Gameiro, P.; Winterhalter, M.; Ceccarelli, M.; Spiga, E.; Kozhinjampara, M.. J. Phys. Chem. B 2010, 114, 5170–5179


Estudos de condutância e dinâmica molecular corroboram os resultados de fluorescência: droga perto dos dois Trp


Mutantes testados

OmpF R132A

OmpF D113N

A substituição de um resíduo R132A (+) não parece afectar a velocidade de translocação

Mas a substituição de D113N (-) resulta num aumento da velocidade de translocação

Estudos com mutantes na zona de constrição


Sem antibiotico Com ENRO

OmpF padrão Ka (M-1) fa Ka (M-1) fa

acrilamida 3.8 (±0.2) 0.6 (±0.2) 1.9 (±0.3) 0.7 (±0.1)I - 2.8 (±0.4) 0.4 (±0.2) 0.4 (±0.1) 0.7 (±0.1)

D113N Ka (M-1) fa Ka (M-1) fa

acrilamida 2.4 (±0.1) 0.8 (±0.2) 1.7 (±0.3) 0.7 (±0.1)I - 2.7 (±0.5) 0.2 (±0.2) 11.7 (±1.9) 0.2 (±0.1)

R132A Ka (M-1) fa Ka (M-1) fa

acrilamida 2.6 (±0.1) 0.6 (±0.2) 1.8 (±0.3) 0.6 (±0.2)I - 12.9 (±0.5) 0.5 (±0.2) 11.5 (±1.9) 0.5 (±0.2)

MUTAÇÃO DE RESIDUO NEGATIVO MUDA A AFINIDADE DROGA/PORINA E A VELOCIDADE DE

TRANSLOCAÇÃO.

Enro na estirpe padrão localizada em ambos oe Trp. No D113N a Enr está localizada dentro do canal e tranlocação muito mias rapida que na estirpe padrão


O que tentamos conseguir:

Métodos permitem a identificação de resíduos

específicos de aa que estão localizados no canal e têm

um papel muito importante na captura das

fluoroquinolonas

Entender a passagem através das porinas e permitir o

“desenho” racional de novos antibióticos mais eficazes e

que consigam contornar os mecanismos de resistência

Sintese de derivados destes antibióticos ????


X8

N

R6

R7 R5

O

R1 CO

O

X8

N

R6

R7

R5

O

R1

C

O

O

Cu

RESISTENCE TO FLUOROQUINOLONES

Tentar minimizar resistência

Fluoroquinolonas hidrofóbicas

Complexos de metais de transiçãoComplexos bináriosComplexos ternários

Acido nalidixico/Cu/fenantrolinaNuclease química

X8

N

R6

R7 R5

O

R1 CO

O

N

N

Cu

Síntese de derivados destes antibióticos


log 110 log 120

Cu(II)/OFLO 6.240.04 11.200.04

Cu(II)/NORFLO 6.950.03 12.700.04

Complexos binários

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2 3 4 5 6 7 8 9

CuL2

CuL

H2L

Cu

HL CuOH

Cu2+ + HL [CuHL]2+

Cu2+ + 2HL [Cu(HL)2]2+

Cu2+ + HL [CuL]+ + H+

Cu2+ + 2HL [CuL2]2+ + 2H+


Complexos ternários

Cu2+ + HL + A CuHLACu2+ + L + A CuLA

CuHLA CuLA

CIP 17.96 17.37

ENR 16.54 16.93

MOX 15.97 17.37

Complexos muito estáveis


Complexo com estrutura raio X

[CuLA]+ Solução a pH 7.4

[CuHLA]2+ [CuLA]+



Enro CuENRA Mox CuMOXA

POPE/POPG 270±23 551.3 316±42 299±62

POPE/POPG/CL 167±32 843.2 243±41 435±12

E. coli total 159±17 1282.9 258±23 1013±12

MIC (M) 4.00x10-3 4.20x10-3 3.80x10-3 2.30x10-3

MIC (M)/no OMPF 8.80x10-3 14.0x10-3 2.74x10-3 1.48x10-3

300 350 400 450 5000

100

200

300

400

500

600

700

FI/u

.a.

/nm

0.0 4.0x10-4 8.0x10-4 1.2x10-3 1.6x10-3

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0,0 4,0x10-4 8,0x10-4 1,2x10-3 1,6x10-3

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

IFN

orm

aliz

ada

|POPE:POPG:CL|/M

IFNormalized

|E.coli|/M

||/

||/

waterC

lipidCK

w

mp

derivatives


BL21(DE3) untreated BL21(DE3) treated with ternary

complex

BL21(DE3)omp8 treated with ternary

complex

.AFM.. Usado para complementar o estudos do complexo ternário em diferentes estirpes de E.Coli e permite verificar variações morfologicas



Estudos em bactérias resistentes promissor em Gram (+)…


Conclusões

Entender o mecanismo de acção a nível molecular

Modelos miméticos com boa inserção da proteína.

Usar mais do que uma técnica . Modelação molecular, conductância, AFM

e fluorescência complementam-se Complexos ternários parecem

promissores .


Agradecimentos

Jacobs University BremenMathias WinterhalterHelge WeingartMahendran Kozhinjampa

Università di CagliariPaolo RuggeroneMateo CeccarelliEric Hajjar

IST, LisboaManuel Prieto

Fabio Luis Loura

Requimte, FCUPMª José FeioPeter EatonSílvia LopesIsabel SousaPatrícia NevesMarcos LovelleTivadar MachRaúl SaraivaMariana FerreiraCarla Ribeiro

€€€€ Fundação para a Ciência e Tecnologia PTDC/SAL-FAR/111414/2009

€€€€ EU- MRTN-CT-2005–019335 (Translocation)€€€€ REQUIMTE

IHMT/UNL Sofia Santos Costa

Isabel CoutoMiguel Viveiros

http://www.fct.mctes.pt/projectos/pub/2006/Painel_Result/vglobal_projecto.asp?idProjecto=67915&idElemConcurso=854


Obrigada


http://www.rivm.nl/earss/ (The European Antimicrobial Resistance Surveillance System )

http://www.infarmed.pt/portal/page/portal/INFARMED

http://www.rivm.nl/earss/



paula gameiro resistência bacteriana (na busca de novos antibióticos – um trabalho de...

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