passado, presente e futuro da imunohematologia...
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Lilian Castilho, PhD
Passado, presente e futuro da Imunohematologia
Futuro
PassadoPresente
Declaração de Conflito de Interesse
Declaro que não possuo Conflito de Interesse para esta
apresentação
Imunohematologia
História dos Grupos Sanguíneos
1900, Viena: Karl Landsteiner
ABO e aglutinação
Passado
História dos Grupos Sanguíneos
1900, Viena: Landsteiner
História dos Grupos Sanguíneos
1901, Viena: Landsteiner
1961, USA, TransfusionOn the Agglutination of Normal Human Blood
Nomenclatura ABO
1901-1910 :
Landsteiner and colleagues
A= alpha, B= beta, O=Ohne (without)
1910: Sistema ABO
Reatividade dos antígenos e anticorpos
1923: Karl Landsteiner e Philip Levine hemácias humanas em coelhos: antígenos M, N (immune) antígeno P (alfabeto)
História dos Grupos Sanguíneos
1922, Rockfeller University, NYC, Landsteriner
1930: Karl Landsteiner Prêmio Nobel em Medicina
1939-1940: Karl Landsteiner, Alexander Wiener e Philip Levine Hemácias de macacos Rhesus em coelhos Anticorpo humano (DHRN e RTH) Sistemas Rh e LW
Teste da Antiglobulina Humana soro humano em coelhos> anti-gamaglobulina humana novo teste para detecção de anticorpos incompletos
História dos Grupos Sanguíneos
1945, Robin Coombs, Bob Race e Arthur Mourant
Descoberta dos Sistemas de Grupos Sanguíneos
1945-2000: 24 novos sistemas de GS
1954: Sistema Diego 1956: Indios da região de Mato Grosso e
Paraná: 43%-46% Dia (Junqueira et al, Nature, 1956)
1951: Sistema Kidd 1960: Indíos da região de Mato Grosso: 5,4%
Jk(a-b-) ( Silver et al, Nature, 1960) 1970: Famílias Bombay no Brasil
The aim by the mid-1970‘s was to find all types of
regardless of their importance.
Ferramentas
EnzimasReagentes químicosPotencializadoresEluição
TesteMolecular
Acs monoclonaisSoros raros
Hemácias raras
Descoberta dos Sistemas de Grupos Sanguíneos
1900-1950: 5 sistemas 1950-1980: 17 sistemas 1980-2000: 7 sistemas
1900 1929 1940 1950 196
0
ABO MNS e P RH, LW LU, KEL, LE, H, FY, JK
GLOB, DI, YT, I, GE, XG, SC
DO, CH/RG, CO, KN
1970
1980
1990
IN, XK, CROM, JMH, OK, GIL,
RAPH
Karl Landsteiner, 1900
Limitações Disponibilidade de reagentes Baixa capacidade Baixa resolução $$$$
Ag presente
Tipagem sorológica
✏ Imunohematologia Molecular
Recentes desenvolvimentos
1980s e 1990s: Clonagem dos genes de grupos sanguíneos e seus alelos 2016: Localização dos genes codificando os genes dos 36 sistemas de grupos
sanguíneos em seus cromossomos específicos (14 cromossomos autossomose um cromossomo X)
Presente
1990s: Bases moleculares da maioria dos genes de grupos sanguíneos codificandoantígenos clinicamente significantes
2016: Bases moleculares de 314 antígenos classificados em 36 sistemas de grupossanguíneos
1990 1995 2000 2005 2010 2015
GYPA/GYPB, ABO,RHD/RHCE,
FUT1, FUT3, CROM, YT, KN, CH/RG,
GCNT2, OK, CO, IN, LW, XG, DI, GIL
RAPH, FY, GE, KEL, LU,
JK, JMH DO, SC, XK, B3GALNT1 RHAG
GBGT1, A4GALT, JR, LAN, VEL,
CD59
AUG
Human Genome ProjectHapMap Project 1000 Genomes Project
Recentes desenvolvimentos✏ Imunohematologia Molecular
Descoberta dos Sistemas de Grupos Sanguíneos
1900-1950: 5 sistemas 1950-1980: 17 sistemas 1980-2000: 7 sistemas 2010-2016: 7 sistemas
1900 1929 1940 1950 196
0
ABO MNS e P RH, LW LU, KEL, LE, H, FY, JK
GLOB, DI, YT, I, GE, XG, SC
DO, CH/RG, CO, KN
1970
1980
1990
2010-2016
IN, XK, CROM, JMH, OK, GIL,
RAPH
RHAG, FORS, JR, LAN, VEL,
CD59,AUG
Vantagens dos métodos moleculares
Não necessita de hemácias
Transfusões recentes de hemácias não interferem
Benefícios da genotipagem em pacientes com transfusões recentes Castilho et al, 2002: Discrepâncias entre fenótipos e genótipos em 6/40
pacientes falciformes e em 9/10 pacientes talassêmicos
Todos os pacientes se beneficiaram após receber transfusões de concentrado de hemácias
fenotipadas de acordo com os genótipos, e apresentaram melhor sobrevida das hemácias
transfundidas
TDA positivo não interfere El Kenz et al, 2014: 4 of 7 transfused patients with WAIHA received antigen-matched
blood based on RBC genotyping and showed a satisfactory recovery
Detecção de antígenos fracos
Detection of weak antigens may be important
2000-2016
D Fraco, DEL, Fybweak, U+var
Vantagens dos métodos moleculares
Discriminação de D fraco e D parcial
D fraco
D parcial
Identificação de variantes RhCE
Ags fracos
Ags parciais
http://www.uni-ulm.de/~fwagner/RH/RB/
http://www.isbtweb.org/working-parties/red-cell-immunogenetics-and-blood-group-terminology/blood-group-terminology/
2016
490 alelos RHD 150 alelos RHCE
Vantagens dos métodos moleculares
Não necessita de soros raros
Antígenos Dombrock Fenótipos raros: hrB-, hrS-, Js(a-), Lu(b-), Yt(a-), Sc1-, LW-, Co(a-),
Vel-, Lan-, Jr(a-), At(a-)
Determina zigozidade
Controle de qualidade de reagentes de hemácias Homozigose para RHD, FY, DO
Zigosidade RHD paterna
Vantagens dos métodos moleculares
Aplicações dos testes moleculares
Receptores de sangue• Pacientes aloimunizados e/ou cronicamente
transfundidos• Pacientes com autoacs quentes ou TDA positivo
Deduzir o fenótipo dos pacientes
Distinguir aloacs de autoacs
Resolver resultados sorológicos inconclusivos
Realizar compatibilidade molecular
2010-2016
Aumentar o estoque de hemácias com múltiplos antígenos e fenótipos raros
Produção de painéis de hemácias
Classificar corretamente doadores D-negativo e D fraco
2016
Aplicações dos testes moleculares
Doadores de sangue
✏DNA fetal no plasma materno
Recentes desenvolvimentos e suas aplicações
Lancet 1997; 350:485-87
2000-2016
DNA fetal livre no plasma materno (3-6%)
Tipagem RHD fetal nãoinvasiva
Prever o risco da DHFRN
Aplicações dos testes moleculares
Medicina materno-fetal
Identificação do gene RHD fetal no plasma materno
Zigozidade RHD paterna
Genotipagem RHD em gestantes resultados na tipagem RhD fracos, discrepantes ou inconclusivos
2015
Outras aplicações
Laboratórios de Referências
Resolução de problemas complexos
Determinação da expressão de novos alelos
Usar sequências de peptídeos como imunógenos para produção de anticorpos monoclonais
Expressar antígenos em sistemas heterólogos para detectar e identificar acs
Produzir formas recombinantes de antígenos para auxiliar na identficação de acs
2014
Proteínas recombinantes
Blood Group System AntigenChido/Rodgers Cha
Rga
Kell K Kpb
k Kpb
Lutheran Lua
Lub
Duffy Fya
Fyb
Dombrock Doa
Dob
Cromer Cra Dra
Knops Kna
John Milton Hagen JMHLandsteiner-Wiener LWa
Cartwright Yta
Scianna SC1XG Xga
Indian Inb
Seltsam et al, Transfusion, 2014
2016
Publicações na revista Transfusion
0
10
20
30
40
50
60
70
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
2014
2015
Publ
icat
ions
Year
ImmunohematologyGenomics
Evolução dos métodos moleculares
1990 2000 2010
Is serology finished?
High-throughputplatforms using
various techniques
Sistemas de grupos sanguíneos
314 ags em 36 sistemas
352 antígenos
36 sistemas
FORSJR LAN
VELCD59AUG
DOYADOMR
DOLCDODE
LURCLUIT
LUGA
STEMFPTT
LORCCENR CEST
CELOCEAGPARG
SARA
KIPP
GUTISERF
CEVF
GEATGETI
KELP KETIKASH
DAKKANT
KUCI
JMHMJMHQ
RHAG4
KCAM
OKGV
JENU
LUACLUBI
KEALINRA 20
16
Classificação ISBT dos antígenos de GSE
2012-2015
Seis novos sistemasde GS
Qual é o próximo?
ABO >380 alelosRHD > 491 alelos
45 genes> 1914 alelos
Hemaglutinação
Simples e rápida, e atende a maioria do cenário transfusional.Necessita de hemácias e soro
Pacientes com transfusão recente, AHAI, anticorpos complexos, variantes Rh
Tecnologias atuais
2016
Testes de DNA
Mais complexos, fáceis de implementar mas difíceis de interpretar. Mais demorados e utilizados em casos com problemas sorológicos.Não necessitam hemácias e soros
Pacientes com transfusão recente, AHAI, anticorpos complexos, variantes Rh
Is serology finished?
ICII Meeting - Junho 2015
Genotipagem ABO Um genótipo não é um fenótipo Treinamento teórico e prático em Imunohematologia molecular Sómente as variantes mais comuns são incluídas nas plataformas
platforms Muitos alelos nulos não são detectados Polimorfismos adicionais podem levar a resultados falso-negativos
"allele drop-out“ Alelos híbridos podem levar a resultados falsos Mutações em regiões não codificantes não são detectadas Detecção de todos os alelos RH conhecidos não é possível com as
atuais ferramentas moleculares
Limitações dos testes moleculares
2016
Sequenciamento
Evolução dos métodos moleculares
1990 2000 2010-2015 2016 e …
Several SNP arraysNGS
NGS
Futuro
Potencial de novas técnicas para GSE
Ensaios moleculares são ferramentas criadas para facilitar novas descobertase melhorar a prática da Imunohematologia e a prática transfusional
Qual é o poder do sequenciamento de nova geração??
Futuro
Exoma e SNG Sequenciamento em larga escala: bilhões de basesem uma única corrida
Vantagens Melhor avaliação de inserções e deleções Resolução de ambiguidade cis/trans.
Sequenciamento em paralelo de múltiplos fragmentos de DNA.
Sequenciamento de nova geração
Futuro
''Todos nós temos nossas máquinas do tempo. Algumas nos levam para trás, são chamadas de memórias. Outras nos levam para frente, são chamadas sonhos.''
Referências
''Todos nós temos nossas máquinas do tempo. Algumas nos levam para trás, são chamadas de memórias. Outras nos levam para frente, são chamadas sonhos.''
“Só é útil o conhecimento que nos torna melhores“
