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MARCIA REGINA DIAS DE CARVALHO
PADRÃO DE IMUNORREATIVIDADE DE FATORES DE
CRESCIMENTO, METALOPROTEINASES DA
MATRIZ E SEUS
INIBIDORES NO AMELOBLASTOMA
Belém
2006
Livros Grátis
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2
Marcia Regina Dias de Carvalho
Padrão de imunorreatividade de fatores de
crescimento, metaloproteinases da matriz e seus
inibidores no ameloblastoma
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Pará, para obter o título de Mestre, pelo Programa de Pós–Graduação em Odontologia.
Orientador: Prof. Dr. João de Jesus Viana Pinheiro
Belém
2006
3
FOLHA DE APROVAÇÃO
Carvalho MRD. Padrão de imunorreatividade de fatores de crescimento, metaloproteinases da matriz e seus inibidores no ameloblastoma [Dissertação de Mestrado]. Belém: Faculdade de Odontologia da UFPa; 2006.
Belém, 16/05/2006
Banca Examinadora : 1)Prof(a).Dr(a).___________________________________________________ Titulação:________________________________________________________ Julgamento:___________________ Assinatura:_______________________
2) Prof(a).Dr(a).___________________________________________________ Titulação:________________________________________________________ Julgamento:___________________ Assinatura:_______________________
3) Prof(a).Dr(a).___________________________________________________ Titulação:________________________________________________________ Julgamento:___________________ Assinatura:_______________________
4
DEDICATÓRIA
Aos meus filhos, Lucas, Luiza e Mateus, minha razão de viver e lutar a cada dia por
um futuro melhor. Obrigada por compreenderem tantos momentos de ausência.
Ao meu marido, Luiz, meu amor e eterno companheiro, que me incentiva, apóia e
dá “suporte técnico” em todas as minhas empreitadas.
Ao meu amado pai, Leônidas, exemplo a ser seguido, não só profissionalmente, mas
na vida como um todo, humildade, perseverança, sabedoria e muita paciência. Pai,
onde você estiver, você estará sempre no meu coração.
À minha querida mãezinha Glycia, amiga de todas as horas, meu ombro pra chorar,
o ouvido que me escuta, a mão que me levanta, esta conquista também é sua.
Aos meus irmãos, Laura, Léo, Gilson e Hermínio, cunhados (as) e sobrinhos (as),
por tantas alegrias e tristezas compartilhadas.
Aos meus sogros, Lauro (in memorian) e June por todo o apoio que sempre me
deram.
5
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS A Deus, acima de todas as coisas, o nosso criador, aquele que nos guia no caminho
certo e nos ajuda a levantar.
Ao Prof. Dr. João de Jesus Viana Pinheiro, pela orientação brilhante e pela presença
constante em todos os momentos decisivos da realização deste trabalho. Além de
professor, orientador, colega de profissão, você é um amigo como poucos.
Ao meu irmão Prof. Dr. Leônidas Braga Dias Júnior, não só por ter aberto as portas
do Serviço de Patologia do Laboratório Dr. Paulo C. de Azevedo, para a realização
desta pesquisa, mas, principalmente, por todo o apoio que me deu desde o início.
6
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Suely Lamarão, coordenadora, e à Profa. Dra. Regina Feio, vice-
coordenadora do Programa de Pós-graduação em Odontologia da UFPa, por terem
acreditado e lutado por mais esta conquista.
Ao Dr. Antenor Madeira Neto, chefe do Departamento de Ensino e Pesquisa do
Hospital Ofir Loyola, por ter nos possibilitado acesso aos casos de ameloblastoma
deste hospital.
À Dra.Maria Vanda Catão Arnaud, chefe do Serviço de Patologia do Hospital Ofir
Loyola, por, tão gentilmente, ter cedido parte do material utilizado nesta pesquisa.
Às funcionárias do Serviço de Patologia do Hospital Ofir Loyola: Luciana, Lucinda e
Ivanilde, por sua relevante colaboração.
Ao técnico Michel, pela cooperação e disponibilidade na realização das reações
imunohistoquimicas.
À técnica Eliana, à biomédica Márcia e demais funcionários do Serviço de Patologia
do Laboratório Dr. Paulo C. de Azevedo, pelo auxílio prestado.
Às acadêmicas Adriane e Ana Celina, pela fundamental colaboração, dedicação e
amizade. Vocês terão um futuro brilhante.
Às amigas e companheiras de longas noites de estudo Cláudia, Helena e
Alessandra. Vocês, com certeza, foram um grande incentivo para que eu concluísse
mais esta etapa.
Aos meus colegas do Mestrado, novas e maravilhosas amizades que conquistei.
A todos os professores que, durante a minha vida, dedicaram seu tempo, boa
vontade e amor à minha formação.
7
“Não somos o que deveríamos ser. Não somos o que iremos ser. Mas, graças a Deus, não somos o que éramos.” Martin Luther King
8
Carvalho MRD. Padrão de imunoreatividade de fatores de crescimento, metaloproteinases da matriz e seus inibidores no ameloblastoma [Dissertação de Mestrado]. Belém: Faculdade de Odontologia da UFPa; 2006.
9
RESUMO
O ameloblastoma é um tumor odontogênico de origem ectodérmica que apresenta
crescimento lento, porém localmente invasivo, o que dificulta sua erradicação,
possibilitando a ocorrência de recidivas. Diversas pesquisas vêm sendo realizadas
no intuito elucidar suas propriedades invasivas. A interação entre as
metaloproteinases da matriz (MMPs), proteases que degradam a matriz extracelular,
e os fatores de crescimento, polipeptídios envolvidos em várias funções celulares,
pode ser um dos fatores responsáveis pela invasividade desta neoplasia. Existem
estudos que comprovam a expressão de certas MMPs no ameloblastoma, portanto o
objetivo desse trabalho foi verificar se as células desse tumor expressam o receptor
EGFR, e os fatores de crescimento EGF, TGF-α e TGF-ß1, bem como compará-los
com a imunoexpressão de MMPs e TIMPs. Utilizando a técnica de
imunohistoquímica, foi detectado que os tecidos do ameloblastoma expressam
MMPs 1,2 e 9, TIMPs 1 e 2, receptor e os fatores de crescimento acima citados, e
que houve diferença de expressão estatisticamente significante entre MMP-2 e
MMP-9,TIMP-1 e TIMP-2, em células neoplásicas e do estroma, entre EGF/EGFR,
EGF/TGF-ß1, e TGF-α/TGF-ß1, nas células neoplásicas, e entre EGF/TGF-ß1 no
estroma. Esses resultados demonstram que o comportamento biológico do
ameloblastoma pode ser influenciado pelas moléculas estudadas.
Descritores: Ameloblastoma, Fatores de Crescimento, Metaloproteinases da Matriz,
Inibidores Teciduais das Metaloproteinases da Matriz.
Carvalho MRD. Padrão de imunoreatividade de fatores de crescimento, metaloproteinases da matriz e seus inibidores no ameloblastoma [Dissertação de Mestrado]. Belém: Faculdadede Odontologia da UFPa; 2006.
10
ABSTRACT
Ameloblastoma is an epithelial odontogenic tumour that presents a slow growth, but,
because of it is locally invasive, its eradication is difficult, allowing the occurrence of
reincidence. A lot of researches were and are being realized as an attempt to
elucidate its invasive properties. The interaction between matrix metalloproteinases
(MMPs), proteases that degrade the extracellular matrix, and growth factors,
polypeptides involved in many cellular functions, may be one of the factors
responsible for the neoplasm´s invasiveness. Taking in account that there are studies
which prove the expression of certain MMPs in the ameloblastoma, the purpose of
this work was to verify if the tumour cells express the EGFR receptor, and the EGF,
TGF-α and TGF-ß1 growth factors, and also compare with MMPs and TIMPs
immunoexpression. Using immunohistochemistry techniques, it was detected that the
ameloblastoma tissues express MMP 1, 2 and 9, TIMP 1 and 2 and these receptor
and growth factors, and that was statistically significant expression diference
between MMP-2 and MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2, both in the neoplasic cells and
stroma, between EGF/EGFR, EGF/TGF-ß1 and TGF-α/TGF-ß1, in the neoplasic
cells, and between EGF/TGF-ß1 in the stroma. These results show that the
ameloblastoma’s biological behavior may be influenced by these molecules.
Descriptors: Ameloblastoma, Growth Factors, Matrix Metalloproteinases, Tissue
Inhibitors of Matrix Metalloproteinases.
11
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 2.1- Arranjo estrutural das
MMPs...............................................................................................................29
Figura 2.2- Hipótese para invasividade local do ameloblastoma.....................50
Figura 5.1- Cortes histológicos corados em hematoxilina e eosina (HE), exibindo os padrões de ameloblastoma utilizados no estudo...................... ....66 Figura 5.2- Controle positivo e controle negativo..............................................68 Figura 5.3- Padrões de expressão de MMP-1 no ameloblastoma....................70 Figura 5.4- Padrões de expressão de MMP-2 no ameloblastoma....................72 Figura 5.5- Padrões de expressão de MMP-9 no ameloblastoma....................74 Figura 5.6- Padrões de expressão do TIMP-1 no ameloblastoma....................76 Figura 5.7- Padrões de expressão do TIMP-2 no ameloblastoma....................78 Figura 5.8- Padrões de expressão de EGFR no ameloblastoma.....................80 Figura 5.9- Padrões de expressão de EGF no ameloblastoma.........................82 Figura 5.10- Padrões de expressão de TGF-α no ameloblastoma..................84 Figura 5.11- Padrões de expressão de TGF-β no ameloblastoma.................86 Figura 6.1- Hipótese para ação dos fatores de crescimento na invasividade local do
ameloblastoma.......................................................................102
Gráfico 5.1 - Distribuição dos valores de IPepit encontrados para MMP-1, MMP-2 e MMP-9............................................................................................................87 Gráfico 5.2 - Distribuição dos valores de IPest encontrados para MMP-1,MMP-2 e MMP-9............................................................................................................88 Gráfico 5.3 - Distribuição dos valores de IPepit encontrados para TIMP-1 e TIMP-2......................................................................................................................90 Gráfico 5.4 - Distribuição dos valores de IPest encontrados para TIMP-1 e TIMP-2.........................................................................................................................91 Gráfico 5.5 - Distribuição dos valores de IPepit encontrados para EGF, EGFR, TGF-α e TGF-β1................................................................................................93
12
Gráfico 5.6 - Distribuição dos valores de IPest encontrados para EGF, EGFR, TGF-α e TGF-β1................................................................................................94
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1- Metaloproteinases da matriz..........................................................28
Tabela 5.1 - Valores das medianas dos Índices de Positividade do Epitélio (IPepit) nas MMPs.............................................................................................87 Tabela 5.2 - Valores das medianas dos Índices de Positividade do Estroma (IPest)nas MMPs...………………...………..................….....................................89 Tabela 5.3 - Valores das medianas dos Índices de Positividade do Epitélio (IPepit) nas
TIMPs...............................................................................................90
Tabela 5.4 - Valores das medianas dos Índices de Positividade do Estroma (IPest)
nas TIMPs................................................................................................92
Tabela 5.5 - Valores das medianas dos Índices de Positividade do Epitélio (IPepit) nos
fatores de crescimento e receptor....................................................93
Tabela 5.6 - Valores das medianas dos Índices de Positividade do Estroma (IPest)
nos fatores de crescimento e receptor.....................................................95
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AgNORs do inglês “argirophilic nucleolar organiser regions”,traduzidocomo regiões organizadoras nucleolares argirofílicas.
BSA do inglês “bovin serum albumin”, traduzido como soro albumina bovina.
bFGF do inglês “basic fibroblastic growth factor”, traduzido como fator de crescimento básico de fibroblastos.
cAMP adenosina monofosfato cíclica.
DNA do inglês “deoxyribonucleic acid”, traduzido como ácido desoxirribonucléico.
EGF do inglês “epidermal growth factor”, traduzido como fator de crescimento epidermóide.
EGFR do inglês “epidermal growth factor receptor”, traduzido como receptor para o fator de crescimento epidermóide.
EMT FGF
do inglês “epithelial-to-mesenchymal transition”, traduzido como transição epitelial-mesenquimal. do inglês “fibroblast growth factor”, traduzido como fator de crescimento de fibroblastos.
IL interleucina. IP índice de positividade.
G0fase do ciclo celular em que as células permanecem metabolicamente ativas, mas não entram em proliferação até que seja necessário.
G1fase do ciclo celular que representa um intervalo entre a mitose e o início da replicação de DNA.
LAP do inglês “latency-associated protein”, traduzido como proteína associada de latência.
LSAB “Labelled Streptavidin-Biotin”
LTBP do inglês “latent TGFß-binding protein”, traduzido como proteína de ligação do TGF-ß latente.
Md mediana. MEC Matriz extracelular.
MMPs do inglês “matrix metalloproteinases”, traduzidas como metaloproteinases da matriz.
P.A. pró-análise.
PCNA do inglês “proliferative cell nuclear antigen”, traduzido como antígeno nuclear de proliferção celular.
RANKL do inglês “receptor activator of NFkB ligand”, traduzido para o português como ligante do receptor ativador do fator nuclear kappa.
TGF do inglês “transforming growth factor”, traduzido como fator de transformação do crescimento.
TIMPs do inglês “tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, traduzido como inibidores teciduais das metaloproteinases da matriz.
TNF do inglês “tumor necrosis factor”, traduzido como fator de necrose tumoral.
TRIS tri–hidroximetil-aminometano.
VEGF do inglês “vascular endothelial growth factor”, traduzido como fator de crescimento do endotélio vascular.
VPF do inglês “vascular permeability factor”, traduzido como fator de permeabilidade vascular.
14
LISTA DE SÍMBOLOS
α alfa
ß beta
γ gama
º graus
% por cento
µ mícron
µm micrômetro
15
SUMÁRIO
P. 1INTRODUÇÃO............................................................................................17
2 REVISÃO DA LITERATURA.................................................................19
2.1- AMELOBLASTOMA...................................................................................19
2.1.1. Invasividade Local do Ameloblastoma ..............................................24
2.2- METALOPROTEINASES DA MATRIZ E SEUS INIBIDORES TECIDUAIS
...........................................................................................................................26
2.3- FATORES DE CRESCIMENTO.................................................................35
2.3.1. Receptor para o Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR).............35
2.3.2. Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) e Fator Transformador de
Crescimento α (TGF- α)..................................................................................39
2.3.3. Fator Transformador de Crescimento β1 (TGF- β1)..........................44
3 PROPOSIÇÃO..........................................................................................51
4 MATERIAL E MÉTODOS. ...............................................................52
4.1.MATERIAL...................................................................................................52
4.1.1. Amostras de tecido................................................................................52
4.1.2. Materiais de Laboratório.......................................................................52
4.2. MÉTODOS..................................................................................................54
4.2.1. Tratamento das amostras.....................................................................54
4.2.2. Histopatologia........................................................................................54
4.2.3. Imunohistoquímica................................................................................55
4.2.4. Análise do Resultados..........................................................................57
16
5 RESULTADOS...........................................................................................58
5.1. HISTOPATOLÓGICO.................................................................................58
5.2. IMUNOHISTOQUÍMICA..............................................................................58
5.3. ÍNDICE DE POSITIVIDADE NAS MMPS...................................................87
5.3.1. Índice de Positividade (IP) nas células neoplásicas..........................87
5.3.2 Índice de Positividade (IP) nas células do estroma............................88
5.4. ÍNDICE DE POSITIVIDADE NAS TIMPs...................................................90
5.4.1. Índice de Positividade (IP) nas células neoplásicas..........................90
5.4.2 Índice de Positividade (IP) nas células do estroma............................91
5.5.ÍNDICE DE POSITIVIDADE NOS FATORES DE CRESCIMENTO E
RECEPTOR.......................................................................................................93
5.5.1. Ìndice de Positividade (IP) nas células neoplásicas..........................93
5.5.2 Índice de Positividade (IP) nas células do estroma.............................94
6 DISCUSSÃO...............................................................................................95
7 CONCLUSÕES. . . . . . . . . . . .......... ...........................................104
REFERÊNCIAS ........................ ........................ ..............105
APÊNDICE. . . . . . . . . . . . . . . ........................ ...................... .............112
APÊNDICE A - VALORES DOS ÍNDICES DE POSITIVIDADE DO EPITÉLIO
NEOPLÁSICO (IPepit) E DO ESTROMA (IPest)................................................112
ANEXOS…………………………………………………………………..113
ANEXO A - PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA....................113 ANEXO B – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO........114
17
1 INTRODUÇÃO
Segundo a Organização Mundial de Saúde, o ameloblastoma é um tumor de
origem ectodérmica formado por epitélio odontogênico com estroma fibroso e
maduro, porém sem a presença de ectomesênquima odontogênico (GARDNER et
al., 2005). Além de ser uma lesão de etiologia desconhecida, o ameloblastoma é
localmente invasivo, o que torna sua erradicação mais difícil e traumática, resultando
em recidivas freqüentes (PITREZ et al.,1995), com seqüelas estéticas, psicológicas
e, principalmente, funcionais.
Essa propriedade do ameloblastoma, em especial, vem intrigando
pesquisadores durante muitos anos. Vários estudos já foram conduzidos, e, a partir
deles, algumas teorias foram elaboradas para tentar explicar o comportamento
localmente agressivo dessa neoplasia. Uma hipótese que poderia explicar essa
característica seria o índice de proliferação celular, no entanto, verificou-se que
cerca de metade das células do tumor está em interfase (JORGE,1997; ROSA;
JAEGER; JAEGER, 1997).
Atualmente, as hipóteses baseadas na secreção de produtos capazes de
degradar a matriz extracelular pelas células tumorais, como as metaloproteinases da
matriz (MMPs), têm sido relatadas como justificativa para a invasividade do
ameloblastoma. Kumamoto et al.(2003), seguido por Pinheiro et al.(2004),
comprovaram esse fato verificando a expressão imunohistoquímica das MMPs -1, 2
e 9 nas células neoplásicas do ameloblastoma.
Por outro lado, sabe-se que o ameloblastoma, como qualquer tumor intra-
ósseo, cresce utilizando um mecanismo de reabsorção óssea local, e que, após a
18
reabsorção óssea, ocorre a liberação de diversos fatores de crescimento e citocinas
como EGF, FGF-1, FGF-2, TGFβ, TGFα e TNF (VAES, 1988). Nagase e Woessner
(1999), demonstraram que a expressão de MMPs é regulada por fatores de
crescimento e citocinas, polipeptídeos envolvidos basicamente na proliferação e
motilidade celular, promoção de angiogênese, entre outros, tanto em células normais
quanto em células neoplásicas.
Apesar dos esforços para a elucidação do problema, os estudos nessa área
ainda são escassos e não esclarecem por completo o comportamento biológico do
ameloblastoma. Portanto, a proposta deste trabalho é verificar a imunoexpressão
das metaoproteinases da matriz, seus inibidores e fatores de crescimento,
evidenciando a prevalência de cada um deles, contribuindo para o esclarecimento
dessa complexa patogenia.
19
2 REVISÃO DA LITERATURA
A revisão da literatura foi dividida em tópicos para facilitar a compreensão do
texto, a saber:
2.1- Ameloblastoma
2.2- Metaloproteinases da matriz e seus inibidores teciduais
2.3- Fatores de crescimento
2.1- AMELOBLASTOMA
Salama e Hilmy (1951) descreveram o que provavelmente, foi o primeiro caso
de ameloblastoma encontrado, cerca de 2800 a.C., no Egito.
Malassez(1884,1885a,1885b) trouxe uma grande contribuição ao conhecimento
da patogênese e patologia de neoplasias e cistos odontogênicos e propôs uma
classificação geral dos mesmos, baseado em uma teoria unificada sobre a sua
patogenia com origem no que hoje são conhecidos como “restos epiteliais de
Malassez”.
Ivy e Churchill (1934) nomearam a neoplasia de “ameloblastoma”, a partir da
observação de que as células periféricas do folículo neoplásico eram células
epiteliais altas, colunares e polarizadas, semelhantes aos ameloblastos, e os centros
dos folículos eram estruturalmente semelhantes ao retículo estreado do órgão do
esmalte.
Morfologicamente, o ameloblastoma assemelha-se ao aparato epitelial
odontogênico em alguns aspectos, principalmente pelo fato de proliferar-se através
do ectomesênquima e diferenciar-se no órgão epitelial do esmalte (JOSEPH;
20
SAVAGE, 1992). No entanto, o mecanismo detalhado da progressão tumoral, assim
como a oncogênese e a citodiferenciação dessa lesão ainda permanecem
desconhecidos (KUMAMOTO et al., 2003; REGEZI; SCIUBBA, 2000).
Diversas hipóteses acerca de sua origem já foram formuladas, atribuindo seu
surgimento a remanescentes da lâmina epitelial do órgão do esmalte, a células da
camada basal da mucosa oral (D`AGOSTINO et al., 2001; NEVILLE et al., 2004;
UENO et al., 1986), ao revestimento epitelial de um cisto odontogênico, como o cisto
dentígero, restos epiteliais de Malassez (KIM; JANG, 2001; REGEZI; SCIUBBA,
2000; UENO et al., 1986), órgão do esmalte de germes de dentes supranumerários
(D`AGOSTINO et al., 2001) e até à desregulação de certos genes no
desenvolvimento normal dos dentes (GARDNER et al., 2005).
Para Joseph e Savage (1992) a natureza agressiva do ameloblastoma pode
estar relacionada à semelhança entre suas características comportamentais e as da
lâmina dental. Ambos têm a habilidade de invadir tecido conjuntivo adjacente, e as
projeções digitiformes das células proliferativas da lâmina dental são bastante
semelhantes à expansão periférica invasiva observada em associação com o
crescimento do ameloblastoma.
Vários fatores já foram propostos como causas iniciais do mecanismo
patogênico do ameloblastoma, tais como irritações inespecíficas promovidas por
extrações, cáries, traumas, infecções, inflamações, erupção dentária (UENO et al.,
1986), desordens nutricionais ou patogêneses virais (KIM; JANG, 2001).
O ameloblastoma ocorre em três situações clínico-radiográficas distintas:
ameloblastoma sólido/multicístico, ameloblastoma unicístico e ameloblastoma
periférico (NEVILLE et al., 2004). Segundo Gardner (1999), a comunidade científica
21
já não considera apropriado que, estudos epidemiológicos a respeito dessa lesão
não especifiquem as variantes encontradas, porque, segundo sua concepção, esses
subtipos podem apresentar alguma diferença comportamental entre si. Autores como
Ferretti, Polakow e Coleman (2000) afirmam, por exemplo, que o ameloblastoma
sólido/multicístico é o tipo que apresenta a maior tendência à recidiva, em
comparação com as outras variantes do ameloblastoma.
O ameloblastoma do tipo sólido/multicístico corresponde a 88% dos casos e
apresenta uma alta taxa de recorrência se não for removido adequadamente, apesar
de efetivamente não ter tendência de sofrer metástase. (NEVILLE et al., 2004 )
Como o tumor origina-se na porção central do osso, sintomas iniciais estão
normalmente ausentes ou são mínimos. Uma massa indolor é um achado comum na
doença (JOSEPH; SAVAGE, 1992), e raramente ocorre parestesia (GARDNER et
al., 2005; NEVILLE et al., 2004).
Radiograficamente, o ameloblastoma sólido/multicístico é representado por
radiotransparências uni ou multiloculares semelhantes a cistos, podendo apresentar
bordas festonadas (GARDNER et al., 2005; NEVILLE et al., 2004). Por possuir
crescimento lento, os limites radiográficos da lesão são bem definidos, havendo a
formação de um halo de esclerose e expansão de cortical óssea (REGEZI;
SCIUBBA, 2000).
Vários subtipos histológicos do ameloblastoma sólido/multicístico são
reconhecidos, mas esse fato parece ter pouco significado no comportamento do
tumor (REICHART; PHILIPSEN; SONNER, 1995; SANDRA et al., 2005). Piattelli et
al. (1998) verificaram que os variados subtipos histológicos do ameloblastoma não
apresentam diferenças significativas na atividade do antígeno nuclear de
proliferação celular (PCNA), o qual está relacionado ao estado proliferativo da célula.
22
O padrão histológico folicular é o mais comum, correspondendo a 33% dos
casos de ameloblastoma sólido/multicístico, apresenta ilhas de epitélio, que lembram
o órgão do esmalte. O padrão plexiforme correspondente a 30,2% dos casos), são
observados longos cordões ou placas de epitélio odontogênico anastomosados
(REICHART; PHILIPSEN; SONNER, 1995). Tanto para o padrão histológico folicular,
quanto para o plexiforme, atividade mitótica e pleomorfismo celular são raramente
notados (GARDNER et al., 2005).
O padrão histológico acantomatoso é representado por extensa metaplasia
escamosa, envolvendo formação de ceratina nas porções centrais das ilhas de
epitélio de um ameloblastoma folicular. O padrão de células granulares é
caracterizado pela transformação de grupos de células epiteliais em células
granulares, as quais passam a apresentar citoplasma abundante e grânulos
eosinofílicos semelhantes a lisossomos. É considerado como amadurecimento ou
alteração de uma lesão de longa duração (NEVILLE et al., 2004). Ferretti, Polakow e
Coleman (2000) sugerem que o ameloblastoma de células granulares é mais
agressivo que os outros, mas nada ainda foi comprovado.
O padrão de células basais é o menos comum, e apresenta ninhos de células
basais uniformes, histopatologicamente semelhantes ao carcinoma de células basais
da pele. Não há presença de estrutura semelhante ao retículo estrelado e as células
da periferia tendem a ser cúbicas, e não colunares. (NEVILLE et al., 2004; REGEZI;
SCIUBBA, 2000).
O ameloblastoma unicístico é uma variante do tumor que se apresenta como
um cisto, e representa de 5 a 22% dos casos de ameloblastoma (PHILIPSEN;
REICHART,1998). Apesar de ser uma lesão expansiva capaz de destruir uma
porção significativa dos maxilares, o ameloblastoma unicístico não se comporta
23
como o multicístico, sendo, portanto, menos agressivo (KIM; JANG,2001).
Histopatologicamente, o ameloblastoma unicístico, segundo Neville et al. (2004),
subdivide-se em 3 tipos: luminal, intraluminal e mural.
O ameloblastoma periférico é o correspondente extra-ósseo do ameloblastoma
multicístico, e envolve apenas tecido mole. Corresponde a 1,3% – 10% de todos os
ameloblastomas e provavelmente origina-se de restos da lâmina dentária abaixo da
mucosa bucal ou de células epiteliais da camada basal do epitélio da mucosa
(GARDNER et al., 2005; REGEZI; SCIUBBA, 2000). A lesão costuma localizar-se na
região da gengiva ou de mucosa alveolar em áreas edêntulas (GARDNER et al.,
2005).
Histopatologicamente, o ameloblastoma periférico é representado por ilhas de
epitélio ameloblástico que ocupam a lâmina própria abaixo do epitélio da superfície.
Essa proliferação epitelial pode mostrar qualquer um dos padrões já descritos para o
ameloblastoma multicístico, sendo os tipos folicular e plexiforme os mais comuns
(NEVILLE et al., 2004). O ameloblastoma periférico não demonstra comportamento
invasivo, e a excisão conservadora é o tratamento de escolha (GARDNER et al.,
2005).
O ameloblastoma representa cerca de 1% de todos os tumores orais
(CHIDZONGA; PEREZ; ALVAREZ, 1996; D`AGOSTINO et al., 2001; EVERSOLE;
LEIDER;HANSEN, 1984; HOUSTON et al., 1993; NASTRI et al., 1995; OLAITAN;
AROLE; ADEKEYE, 1998) e corresponde a 1/5 de todas as neoplasias que se
originam do aparato odontogênico (JOSEPH; SAVAGE, 1992).
É um tumor de crescimento lento e localmente invasivo (CHIDZONGA; PEREZ;
ALVAREZ, 1996; D`AGOSTINO et al., 2001; EVERSOLE; LEIDER;HANSEN, 1984;
JOSEPH; SAVAGE, 1992; UENO et al., 1986), possuindo curso benigno na maioria
24
dos casos (NEWMAN et al., 1995). Mesmo assim, apresenta comportamento
localmente agressivo (REGEZI; SCIUBBA, 2000).
O ameloblastoma sólido/multicístico pode disseminar-se pelo espaço medular,
sendo que seu limite não é visível radiograficamente (UENO et al., 1986). Desse
modo, a ressecção marginal parece ser a técnica mais indicada para o tratamento
dessa variante. A margem da ressecção deve ser de pelo menos 1 cm além dos
limites radiográficos (FERRETTI; POLAKOW; COLEMAN, 2000). A taxa de
recorrência para essa modalidade de tratamento é de 15% (NEVILLE et al., 2004).
Outras técnicas terapêuticas, como curetagem, eletrocauterização e marsupialização
também são utilizadas (REICHART; PHILIPSEN;SONNER, 1995).
Olaitan, Arole e Adekeye (1998), em seu estudo, verificaram que 8,9% dos
ameloblastomas por eles analisados foram diagnosticados como lesões recorrentes.
Segundo esses autores, a recorrência reflete, em grande parte, a falha ou
inadequação do procedimento cirúrgico primário.
Após a remoção da lesão, um acompanhamento pós-cirúrgico por um extenso
período de tempo é essencial, desde que recorrências têm sido notadas em
períodos superiores a 10 anos depois do tratamento inicial (GARDNER et al., 2005).
2.1.1. Invasividade Local do Ameloblastoma
Uma das particularidades do ameloblastoma está relacionada à sua
invasividade local. De acordo com Pinheiro et al. (2004), os mecanismos que estão
relacionados à invasão tumoral do ameloblastoma ainda precisam ser melhor
esclarecidos.
Nas pesquisas realizadas por Rosa, Jaeger e Jaeger (1997) com base na
análise morfométrica das regiões organizadoras nucleolares argirofílicas (AgNORs),
25
verificou-se que apenas metade das células do ameloblastoma estão em estado
proliferativo. Pode-se especular, então, que o ameloblastoma apresenta outros
mecanismos além da proliferação celular que contribuem para seu padrão de
crescimento. Este mesmo estudo também verificou que a outra metade das células
do tumor está em interfase, e que, provavelmente, encontram-se em atividade de
síntese de proteínas. Essa atividade parece participar, pelo menos em parte, do
crescimento do ameloblastoma, já que pode envolver enzimas proteolíticas
relacionadas ao fenótipo invasivo, como as metaloproteinases da matriz (MMPs).
Pripatnanont et al. (1998) verificaram, através de estudos imunocitoquímicos,
que o ameloblastoma produz interleucina-1 (IL-1), um potente modulador da
remodelação óssea. Isso poderia explicar parte de sua capacidade osteolítica.
Piattelli et al. (1998), em sua pesquisa, demonstraram que as células com maior
expressão de PCNA foram encontradas nas áreas periféricas do tumor, o que pode
ser importante para explicar o crescimento infiltrativo do ameloblastoma.
Salo et al.. (1999) encontraram em seus estudos a expressão de laminina-5,
uma importante proteína da matriz extracelular (MEC) no ameloblastoma e em
germes dentários. Essa proteína pode contribuir para o potencial de crescimento
progressivo e invasivo do ameloblastoma. Desse modo, a expressão aumentada de
laminina-5 pode estar associada ao comportamento agressivo desse tumor.
Sandra et al. (2005) comprovaram, através de seus estudos, que o
ameloblastoma expressa e secreta o fator de necrose tumoral α (TNF-α) e o ligante
do receptor ativador do fator nuclear kappa (RANKL), dois fatores que
comprovadamente induzem a osteoclastogênese. A atuação dessas duas
substâncias poderia então gerar espaço para que a lesão se expandisse no tecido
ósseo, e poderia também explicar sua invasividade.
26
Até hoje, diversas pesquisas (LYONS et al., 1993; PINHEIRO et al., 2004;
VISSE; NAGASE, 2003; YU; STAMENKOVIC, 2002) já foram realizadas a respeito
das metaloproteinases da matriz (MMPs), enzimas cuja principal função é degradar
os componentes da matriz extracelular. Acredita-se que essas enzimas possam
estar envolvidas na invasividade local do ameloblastoma.
2.2- METALOPROTEINASES DA MATRIZ E SEUS INIBIDORES TECIDUAIS
A matriz extracelular (MEC) é uma rede tridimensional composta de uma
complexa mistura de macromoléculas insolúveis incluindo colágeno, laminina,
fibronectina, elastina, glicosaminoglicanas, entre outros. A MEC não somente
oferece suporte estrutural para as células, mas também atua como reservatório de
citocinas e fatores de crescimento. Através de receptores localizados em sua
superfície, as células recebem sinais e são capazes de perceber o microambiente
que as cerca e assim reagir a estímulos. Desta maneira, o estado das
macromoléculas dentro da MEC é de extrema importância, e a proteólise é a maior
responsável por mudanças ocorridas nessa matriz. A proteólise pode afetar a
aderência das células à MEC, bem como liberar fatores de crescimento e citocinas
(MOTT; WERB, 2004, SCHENK; QUARANTA 2003).
As metaloproteinases da matriz (MMPs) fazem parte de uma família de
endopeptidases zinco dependentes, que representam a maior classe de enzimas
responsáveis pela degradação de matriz extracelular (MEC) (KUMAMOTO et al.,
2003; LYONS et al., 1993; MOTT; WERB, 2004). Desse modo, participam da
remodelação da matriz extracelular, atividade inerente aos processos de cicatrização
e de crescimento epitelial invasivo, tanto durante a morfogênese e a organogênese
quanto durante o crescimento de carcinomas e cistos (LYONS et al., 1993). São
27
altamente controladas por fatores de crescimento, hormônios, oncogenes, ésteres de
forbol e citocinas (NAGASE; WOESSNER,1999; PARDO; SELMAN, 1996; WERB et
al., 1996).
As mais recentes pesquisas a respeito da MEC veiculam que fragmentos ou
epítopos de macromoléculas presentes na matriz também podem apresentar alguma
atividade biológica. A partir desses dados, surgiu o termo cryptic (do Latin crypticus)
para se referir a sítios funcionais que estão escondidos dentro da estrutura das
macromoléculas da MEC, e que, portanto, não estão expostos na superfície da
proteína (SCHENK; QUARANTA, 2003). Em muitos casos, os fragmentos das
moléculas da MEC apresentam uma bioatividade que as moléculas progenitoras não
possuem (MOTT; WERB, 2004). Alguns desses fragmentos bioativos, gerados
principalmente através da ação das MMPs, estão relacionados à ativação de
receptores e fatores de crescimento nas células.
Segundo Visse e Nagase (2003), cerca de vinte e três MMPs já foram
detectadas em humanos. Elas são dividas em grupos baseados na especificidade de
seu substrato, similaridades na seqüência e organização do domínio. Já foram
identificados tipos citoplasmáticos e membranosos, e todos são sintetizados como
enzimas latentes (pro- MMPs) (NUTT et al., 2003).
São classificadas em 4 subfamílias: colagenases, gelatinases, estromelisinas e
metaloproteinases de matriz tipo membrana (MT-MMPs) (THOMAS; LEWIS;
SPEIGHT, 1999; KAHARI; KERE,1999).
As colagenases são capazes de iniciar a degradação de colágenos intersticiais
Tipos I, II, III e V. As gelatinases degradam colágenos previamente desnaturados. As
estromelisinas podem degradar especificamente fibronectina, elastina, laminina e a
proteína central das proteoglicanas. As MT-MMPs formam um grupo de 4 membros
28
que possuem um domínio transmembrânico. Duas MMPs foram identificadas, a
MMP-19 e a enamelisina (MMP-20), e ainda não foram classificadas em nenhuma
subfamília (KAHARI; KERE, 1999).
Tabela 2.1- Metaloproteinases da matriz, adaptado de Visse e Nagase (2003).
GRUPO No. MMP lat/ativa
Colagenases
Colagenase 1 MMP-1 52/42
Colagenase 2 MMP-8 51/42
Colagenase 3 MMP-13 52/42
Gelatinases
Gelatinase A MMP-2 72/66
Gelatinase B MMP-9 92/84
Estromelisinas
Estromelisina-1 MMP-3 52/43
Estromelisina-2 MMP-10 52/44
Estromelisina-3 MMP-11 51/46
Tipo-membrana
MT1-MMP MMP-14 64/54
MT2-MMP MMP-15 72/61
MT3-MMP MMP-16 66/56
MT4-MMP MMP-17 62/51
Outros
Não denominada MMP-19 54/45
Matrilisina MMP-7 28/19
Metaloelastase MMP-12 52/20
Enamelisina MMP-20 54/22
As principais características estruturais das MMPs consistem de: 1) um domínio
pró-peptídeo responsável pela latência das pró-enzimas, que contém um resíduo
chave de cisteína formando uma ligação coordenada com o íon zinco presente no
domínio catalítico, mascarando o sítio ativo do zimogênio; 2) um domínio catalítico,
que possui sítios de ligação para íons zinco e cálcio, essencial para a atividade
enzimática; 3) uma seqüência rica em prolina, formando uma região de ligação e 4)
29
um carboxil-terminal adicional com repetições semelhantes à hemopexina (PARDO;
SELMAN, 1996; KAHARI; KERE,1999).
ZZnn22++
CC CC
PEPTÍDIO SINAL
PRÓ-PEPTÍDIO
REGIÃO DE LIGAÇÃO
DOMÍNIO CATALÍTICO
DOMÍNIO SEMELHANTE A HEMOPEXINA
DOMÍNIO TIPO II DE FIBRONECTINA
DOMÍNIO SEMELHANTE AO COLÁGENO
DOMÍNIO TRANSMEMBRÂNICO
10-14 AMINOÁCIDOS CONTENDO A SEQUÊNCIA RX [K/R] R
CAUDA CITOPLASMÁTICA
Figura 2.1 – Arranjo estrutural das MMPs dos vertebrados, adaptado de Woessner e Nagase (2000).
As MMPs podem ser ativadas por diferentes agentes: substâncias químicas
como acetato aminofenilmercúrio, ácido hipocloroso (HOCL) e dodecil sulfato de
sódio; proteinases como a tripsina e a plasmina e agentes caotrópicos
(WOESSNER,1991). Conforme Fowlkes e Winkler (2002), elas podem ser ativadas
MMAATTRRIILLIISSIINNAA ((MMMMPP--77))
ZZnn22++
CC CCOOLLAAGGEENNAASSEESS,, EESSTTRROOMMEELLIISSIINNAASS
ZZnn22++CC CC
GGEELLAATTIINNAASSEESS ((MMMMPP--22,, MMMMPP--99))
CC CC CC ZZnn22++MMMMPP--22
CC CC CC ZZnn22++MMMMPP--99
EESSTTRROOMMEELLIISSIINNAA 33 ((MMMMPP--1111))
ZZnn22++CC CC CC
MMMMPPss TTIIPPOO MMEEMMBBRRAANNAA
ZZnn22++ CC CC CC
30
através da remoção da seqüência pró-peptideo, via hidrólise química ou proteólise
realizada por outras MMPs.
O envolvimento das MMPs foi estudado em processos fisiológicos de
remodelação da matriz extracelular, como no desenvolvimento da glândula mamária
durante a gravidez e sua involução pós-desmame (WERB et al., 1996), na ovulação,
involução uterina, angiogênese, erupção dental, remodelação óssea e embriogênese
(PARDO; SELMAN, 1996).
No estudo da expressão de MMPs e TIMPs por células do ligamento periodontal
sob efeito de citocinas e de fatores solúveis produzidos pelos fibroblastos, na
diferenciação de células semelhantes a osteoclastos, as colagenases foram
produzidas em maior quantidade pelos fibroblastos do ligamento periodontal de
dentes decíduos que de dentes permanentes. Levando à conclusão de que MMPs e
TIMPs devem estar envolvidas na remodelação normal do ligamento periodontal
(WU;RICHARDS; ROWE, 1999).
Bolcato-Bellemin et al.(2000) observaram a diferença significativa na expressão
de MMP-1, MMP-2, TIMP-1 e TIMP-2 em fibroblastos do ligamento periodontal e da
gengiva submetidos à força de tensão contínua quando comparados a controles em
repouso. Associaram a presença destas MMPs e TIMPs com a remodelação da
MEC durante o movimento ortodôntico.
As MMPs são expressas em baixos níveis em tecidos normais de adultos, o
aumento desta expressão parece estar relacionado com o desenvolvimento de
vários processos patológicos incluindo artrite reumatóide, invasão tumoral, doença
periodontal e enfisema pulmonar (PARDO; SELMAN, 1996).
Para Lyons et al., (1993), muitas evidências sugerem que a invasividade tanto
de células normais quanto tumorais está associada com expressão elevada de
31
MMPs e/ou expressão diminuída de seus inibidores. Para este autor, a indução de
enzimas degradativas como as MMPs é capaz de conceder agressividade a tumores
em desenvolvimento, podendo estar diretamente ligadas à sua atividade de
promoção. Yu e Stamenkovic (2002) afirmam que muitos tumores produzem suas
próprias MMPs como parte de sua maquinaria de invasão, mas que o mecanismo
através do qual esse processo ocorre ainda é pouco conhecido.
Há diversos estudos sobre a importância do papel das MMPs na invasão
neoplásica e metástase. Acreditava-se que sua ação limitava-se a facilitar a
degradação da matriz extracelular, atualmente o papel destas enzimas inclui, além
deste, a proliferação celular e liberação de fatores de crescimento, promoção de
angiogênese, migração celular e a modificação da matriz extracelular, expondo sítios
ocultos, alterando o ambiente tecidual (CURRAN; MURRAY, 1999; DECLERCK,
2000; STETLER-STEVENSON; YU, 2001).
Nagase e Woessner (1999) relatam que as MMPs participam da disseminação
de células cancerígenas promovendo o colapso da matriz extracelular, e também
são importantes na criação de um ambiente que suporta a iniciação e manutenção
do crescimento de tumores primários e metastáticos. Além de participarem da
destruição da matriz extracelular associada com invasão tumoral e metástase
(KUMAMOTO et al., 2003; PINHEIRO et al., 2004), as MMPs também podem
promover angiogênese, criando um meio favorável para o desenvolvimento de
tumores (YU; STAMENKOVIC, 2002).
O carcinoma adenóide cístico é uma das neoplasias malignas que mais
acometem as glândulas salivares, apresentando um alto índice de recidiva local,
metástase e invasão perivascular e perineural. Loureiro (2000) estudou a expressão
das MMPs no carcinoma adenóide cístico, in vitro e in vivo, tendo detectado a
32
presença de MMP-1, MMP-2, MMP-3 e MMP-9 através da técnica de
imunofluorescência, e a presença de MMP-2 e MMP-9, nas suas formas ativa e
inativa, através de estudo zimográfico.
O adenoma pleomórfico é a neoplasia benigna mais freqüente nas glândulas
salivares, tanto maiores quanto menores. Em um estudo para verificar a expressão
de MMPs nesta neoplasia, verificou-se a presença de MMP-9 , latente e ativa, e
MMP-2, latente, através da zimografia; a imunofluorescência foi positiva para as
MMPs 1, 2 e 9; e na imunohistoquímica o tumor foi positivo para as MMPs 1, 2, 3 e
9, porém em expressões e padrões variáveis, não sendo conclusivas para relacionar
as MMPs com o padrão de invasão do mesmo (PEREIRA,2003).
Kumamoto et al. (2003) verificaram a expressão imunohistoquímica das MMP-
1, 2 e 9 em ameloblastomas para avaliar o papel dessas proteínas na progressão da
neoplasia. Os resultados mostraram que na maioria dos casos, a imunorreação das
MMPs foi especialmente proeminente no estroma ao redor das ilhas ou ninhos
celulares do ameloblastoma. Além do mais, verificou-se que a expressão de MMP-1,
apesar de detectada nas células do estroma, não foi detectada nas células do tumor,
denotando que as células do estroma têm uma grande participação na progressão
do ameloblastoma. MMP-2 e 9 também foram detectados nas células do estroma,
mas foram fracamente detectados nas células periféricas colunares ou cuboidais do
tumor. Um outro dado importante desse estudo é que o padrão de expressão das
MMPs não mostrou diferenças distintas entre os tipos folicular e plexiforme.
Pinheiro et al. (2004), através de estudo imunohistoquímico, zimográfico e
Western blotting, verificaram a presença de MMPs em ameloblastomas. Os
resultados desta pesquisa mostraram imunorreatividade para as MMPs 1, 2 e 9, e a
presença de suas formas lantente e ativa, sugerindo o envolvimento das MMPs na
33
proliferação celular do ameloblastoma e contribuindo para a invasividade local deste
tumor.
A MMP-1 faz parte do grupo das colagenases, e participa da clivagem do
colágeno intersticial I, II e III, além de outras moléculas da matriz extracelular. Ela
participa de processos como a migração de queratinócitos e reepitelização, aumento
da proliferação celular e ação pro e antinflamatória (VISSE; NAGASE 2003).
Já a MMP-2 e a MMP-9 fazem parte do grupo das gelatinases, sendo por isso
denominadas, respectivamente, de gelatinase A e gelatinase B. Sua principal função
é clivar colágeno desnaturado, sendo importantes na degradação da membrana
basal. A MMP-2, mas não a 9, possui a capacidade de clivar colágeno tipo I, II e III, e
é importante para a osteogênese, migração celular, aumento da afinidade pelo
colágeno e ação antiinflamatória. A MMP-9 é responsável pelo aumento da afinidade
pelo colágeno, ação pró e antiinflamatória e resistência das células tumorais (VISSE;
NAGASE, 2003). De acordo com Fowlkes e Winkler (2002) e Ogawa et al.. (2004),
essas duas MMPs digerem o colágeno tipos IV e V da membrana basal. Ogawa et
al. (2004), relatam ainda que a MMP-9 é capaz de clivar fibrina, e está envolvida em
processos como a oncogênese.
A atividade proteolítica de degradação da MEC pelas MMPs, resulta do balanço
entre a concentração destas enzimas e de suas inibidoras endógenas (STETLER-
STEVENSON; LIOTTA; KLEINER, 1993; BIRKEDAL-HANSEN et al., 1993).
Os inibidores fisiológicos das MMPs são a α2 macroglobulina e, principalmente,
as TIMPs (inibidores teciduais de metaloproteinases)(PARDO; SELMAN,1996).
A maioria das MMPs, cuja atividade proteolítica está associada com
remodelação tecidual, é solúvel e eficientemente inibida pelos inibidores teciduais de
34
metaloproteinases da matriz (TIMPs) (YU; STAMENKOVIC, 2002), através da
formação de um complexo não covalente estável (FOWLKES; WINKLER, 2002).
Há quatro tipos de TIMPs: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4, as quais são
produzidas por vários tipos celulares, como fibroblastos, queratinócitos, células
endoteliais e osteoblastos. A TIMP-3 é estimulada por mitógenos, ésteres de forbol e
TGF- β, e é inibida por TGF-α (KAHARI; KERE,1999). Todas as TIMPs são capazes
de inibir todas as MMPs ( WOESSNER, 1999).
As TIMPs inibem a invasão celular in vitro, tumorigênese, metástase in vivo e
angiogênese, e são importantes não somente no processo de renovação da matriz,
mas também em algumas atividades celulares. As MMPs também podem ser
inibidas por inibidores endógenos e α-macroglobulinas (NAGASE; WOESSNER,
1999).
Conforme Yu e Stamenkovic (2002) a remodelação tecidual associada ao tumor
está baseada em uma complexa relação entre pelo menos três classes de
moléculas: receptores de adesão, MMPs, citocinas e fatores de crescimento. Em
outras palavras, a regulação coordenada de metaloproteinases e seus inibidores
governam a clivagem, liberação de muitos fatores de crescimento importantes e de
receptores de superfície celular. E os fatores de crescimento, por sua vez, controlam
a expressão das MMPs.
Segundo Birkedal-Hansen (1993,1995), os fatores TGF-α, EGF e TGF-β, entre
outros, participam da indução de MMps, sendo que o TGF-β também participaria da
repressão de MMPs.
Em contrapartida, as MMPs tem sido relacionadas com a transformação de Pro-
TGF-α em TGF-α madura através da clivagem proteolítica do domínio pré-catalítico
da primeira (HINKLE et al.,2003).
35
Para que se possa compreender o mecanismo através do qual esses processos
ocorrem, é necessário um breve comentário sobre esses fatores de crescimento e o
receptor EGFR na membrana celular, os quais, sabidamente, participam da
proliferação de células tumorais em outras lesões (SHRESTHA et al., 1992).
.
2.3. FATORES DE CRESCIMENTO
Os fatores de crescimento são polipeptídeos que estão presentes no soro ou
são produzidos pelas células, e que modificam a proliferação celular. A biologia
dessas moléculas difere um pouco da dos hormônios clássicos porque seus sítios de
síntese e de atuação estão restritos a tecidos definidos. Alguns fatores de
crescimento são chamados fatores de competência, pois não estimulam diretamente
a síntese de DNA, mas tornam as células em G0 e G1 competentes a fazê-lo. Outros
são considerados fatores de progressão, já que estimulam a síntese de DNA
(CARPENTER; COHEN, 1990; ROBBINS et al., 2000).
A MEC funciona como um reservatório para citocinas e fatores de crescimento
latentes. A liberação e ativação desses fatores de crescimento pode depender do
processo de proteólise mediado pelas MMPs (MOTT; WERB, 2004).
2.3.1. Receptor para o Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR )
O EGFR é uma glicoprotéina membro da família erbB de receptores
tirosinoquinases, por esse motivo sendo também conhecido por erbB1 (SOARES et
al., 2000). Em outras palavras, esse receptor é uma proteína transmembrana que
possui atividade intrínseca de ativação fosfotransferase (EL-RAYES; LORUSSO,
2004). A expressão de EGFR é observada no epitélio normal, incluindo a mucosa
36
oral, além de ser encontrado em tecidos de desenvolvimento dentário (VERED;
SHOHAT; BUCHNER, 2003).
A porção extracelular do EGFR possui uma porção amino-terminal que funciona
como sítio de reconhecimento para determinados fatores de crescimento. Uma
região hidrofóbica que representa o segmento transmembrana, e sua estrutura
intracelular pode ser alinhada a proteínas tirosinoquinases e à subunidade catalítica
das quinases dependentes do cAMP (AMP cíclico). A ligação de moléculas a esse
receptor é específica e de alta afinidade (BOULOUGOURIS; ELDER, 2001).
O EGFR pode se ligar e ser ativado por alguns fatores de crescimento,
codificados por vírus, entre outros (BOULOUGOURIS; ELDER, 2001; EL-RAYES;
LORUSSO, 2004; SHRESTHA et al., 1992). EGF e TGF-α contêm vários tipos de
aminoácidos que possuem um papel importante em sua ligação com o receptor. A
estimulação promovida por um desses ligantes pode promover replicação de DNA
seguida por divisão celular. Esse sistema parece ser uma das influências mais
importantes no crescimento de células epiteliais e de outros tipos
(BOULOUGOURIS; ELDER, 2001).
A ativação de EGFR leva à proliferação celular, o que pode explicar como a
presença desse receptor em tumores pode contribuir para o seu crescimento
(BOULOUGOURIS; ELDER, 2001; EL-RAYES; LORUSSO, 2004).
A função de EGFR está desregulada em várias desordens malignas, nas quais
podemos encontrar super expressão do receptor (EL-RAYES; LORUSSO, 2004;
MULET et al., 2006; VERED; SHOHAT; BUCHNER, 2003; YAMADA et al., 1989),
mutação do receptor que resulta em ativação independente de ligante e ativação
autócrina a partir de superprodução dos ligantes (BOULOUGOURIS; ELDER, 2001;
EL-RAYES; LORUSSO, 2004). Nesses tumores, o EGFR está envolvido na
37
transformação maligna e no crescimento tumoral, a partir da inibição da apoptose,
proliferação celular, promoção de angiogênese e metástase (EL-RAYES;
LORUSSO, 2004).
É importante ressaltar que, para que possa gerar proliferação exagerada, a
expressão de EGFR deve ser acompanhada da presença de ligantes ativos, já que o
surgimento de um fenótipo maligno depende da exposição das células a altas
concentrações de EGF. A hiperproliferação também pode estar relacionada a uma
alteração do meio que promova a apresentação do receptor à fluidos secretórios
contendo EGF, implicando em sinalização e proliferação inesperada.
(BOULOUGOURIS; ELDER, 2001).
Em relação à angiogênese, o EGFR presente em células endoteliais pode
participar indiretamente do crescimento tumoral, sinalizando a proliferação do
endotélio vascular (YAMADA et al., 1989).
Boulougouris e Elder (2001) verificaram, em seus estudos, que carcinomas
mamários que exibiam EGFR em suas células normalmente eram os que mais se
disseminavam. Este fato pode estar relacionado ao aumento da produção de
proteases que degradam a MEC através desse receptor, e às alterações que sua
ativação promove na adesão e motilidade celulares.
Uma correlação interessante entre o EGFR e as MMPs foi verificada por Mott e
Werb (2004), Schenk e Quaranta (2003) e Carpenter e Cohen (1990). Esses autores
comentam que a MMP-2, ao clivar a laminina-5, promove a liberação do Domínio III
da corrente γ2 da molécula (DIII), o qual pode ligar-se ao EGFR e ativar eventos
inerentes à sua sinalização, promovendo assim motilidade celular. Schenk e
Quaranta (2003) informam ainda que, em contraste com a molécula intacta de
38
laminina-5, o DIII estimula a expressão do gene que codifica a MMP-2, e pode
aumentar a migração celular.
Shrestha et al. (1992) realizaram um estudo para verificar a presença de EGFR
em cistos e tumores odontogênicos, e relataram que as células neoplásicas do
ameloblastoma eram destituídas de EGFR. Segundo os autores, a ausência desse
receptor poderia explicar o comportamento biológico menos agressivo do
ameloblastoma e outros tumores odontogênicos, que é caracterizado por
crescimento lento do tumor e invasão mínima das estruturas adjacentes. No entanto,
o caráter agressivo, se presente, deve-se a outros fatores de proliferação que não os
mediados pelo EGFR.
Ueno et al. (1994) também se propuseram a investigar presença e localização
do EGFR no ameloblastoma. Em suas pesquisas, verificaram que, em
ameloblastomas foliculares, a imunorreação do receptor foi usualmente observada
nas células centrais das ilhas de tumor, e que a coloração era mais intensa quando
estas células apresentavam metaplasia escamosa. Já nas células colunares
periféricas, o EGFR foi raramente detectado, e geralmente era encontrado no lado
basal dessas células. Já o ameloblastoma do tipo plexiforme, algumas células
cuboidais periféricas apresentaram imunorreação ao anti-EGFR, principalmente em
suas membranas celulares. O tecido conjuntivo que compunha o estroma próximo às
células tumorais também apresentou alguma imunorreação ao EGFR. Desse modo,
observou-se que houve uma incidência significativamente maior da expressão de
EGFR nas células semelhantes ao retículo estrelado do que nas células colunares.
Neste mesmo estudo foi verificada também a expressão de PCNA, e concluiu-se que
a localização do EGFR no ameloblastoma não era concordante com a localização
das células positivas para PCNA. Então, os autores sugerem que a ativação do
39
EGFR pode não estar agindo como um fator mitogênico no ameloblastoma. Como
EGFR é observado mais em áreas com queratinização, a interação desse receptor
com o fator de crescimento pode promover diferenciação escamosa no
ameloblastoma.
Vered, Shohat e Buchner (2003), realizando também um experimento para
verificar a presença de EGFR no ameloblastoma, verificaram que todos os
espécimes de ameloblastoma, independente do seu tipo histológico, eram
imunohistoquimicamente positivos para EGFR, e que a coloração encontrada era
membranosa e/ou citoplasmática. As discrepâncias de resultado entre sua pesquisa
e a de Shrestha et al. (1992) podem ter ocorrido devido ao uso de procedimentos
técnicos diferentes. Os autores sugerem ainda que, devido à presença extensiva de
EGFR no tumor, ele pode ser um candidato para o uso de tratamentos com anti-
EGFR, particularmente em casos de tumores extensos e recorrências.
2.3.2. Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) e Fator Transformador de
Crescimento α (TGF- α)
Após alguns anos de estudo, foi descoberto que o EGF e o TGF-α fazem parte
da mesma família de fatores de crescimento, mas que são codificadas por genes
distintos. Dessa família também fazem parte os fatores de crescimento do pox vírus,
a anfiregulina, entre outros. Essas moléculas caracterizam-se por possuir alta
afinidade ao receptor EGFR e por produzir resposta proliferativa em células
sensíveis à sinalização de EGF (CARPENTER; COHEN, 1990).
40
Ambos os fatores conservam uma estrutura molecular em comum, o domínio
EGF, compostos por seis resíduos de cisteína que formam uma estrutura importante
para sua ligação com o receptor. No entanto, os domínios transmembrana e
citoplasmático de TGF-α e EGF não apresentam similaridades, o que pode explicar
algumas diferenças de função entre eles (KUMAR; BUSTIN; MCKAY, 1995).
O EGF, também conhecido por urogastrona, é um fator de progressão que
estimula a divisão celular por se ligar a receptores específicos de tirosinoquinase na
membrana da célula. Foi descoberto inicialmente por sua capacidade em causar
erupção precoce de dentes, e está amplamente distribuído nas secreções e líquidos
tissulares como saliva, urina e conteúdos intestinais (ROBBINS et al., 2000).
O EGF possui um importante papel na regulação da proliferação tanto de
células normais quanto células neoplásicas (SHRESTHA et al., 1992). Sua presença
é essencial para a indução da mitose. Além do mais, reduz o contato célula-célula, o
que comprova sua habilidade em promover a motilidade de queratinócitos,
fibroblastos e células endoteliais (BOULOUGOURIS; ELDER, 2001). De acordo com
Ueno et al. (1994), o EGF também parece ter um papel na estimulação ou
manutenção da proliferação de células indiferenciadas durante os estágios iniciais
do desenvolvimento dental.
De acordo com Boulougouris e Elder (2001), para linhas de células tumorais
que apresentam super expressão de EGFR, o EGF pode atuar de duas maneiras.
Em baixas concentrações, ele estimula o crescimento, mas em altas concentrações
ele o inibe e parece induzir diferenciação.
Algumas evidências sugerem que o sistema regulatório celular estimulado por
EGF pode desenvolver um importante papel na carcinogênese. Esse fator de
crescimento é capaz de promover a carcinogênese viral e a expressão de proto-
41
oncogenes, além de apresentar atividade imunossupressora (STOSCHECK; KING
JR; 1986).
Mori et al. (1987) pesquisaram, através de imuno-histoquímica, a distribuição de
EGF em 152 casos de tumores de glândulas salivares. A sua presença na maioria
dos casos estudados sugere que EGF pode ser um novo marcador para estas
neoplasias e que tem um papel biológico na proliferação do tumor.
O TGF-α é um polipeptídeo de 50 aminoácidos que foi extraído inicialmente de
células transformadas pelo vírus do sarcoma e por esse motivo foi considerado seu
envolvimento na transformação de células normais em cancerosas (ROBBINS et al.,
2000; KUMAR; BUSTIN; MCKAY, 1995). Ele é estrutural e funcionalmente similar ao
EGF, compartilhando uma identidade de 33%, segundo Soares et al. (2000), e de
42%, de acordo com Humphreys e Hennighausen, (2000).
O TGF-α maduro e solúvel é processado a partir de um precursor
transmembrana, o pró-TGF-α. Essa molécula é formada por um domínio extracelular
aminoterminal e está ancorado no plasma a partir de uma porção hidrofóbica
aminoácida intermediária, possuindo ainda uma porção citoplasmática C-terminal
(KUMAR; BUSTIN; MCKAY, 1995).
O pro-TGF-α passa por uma clivagem endoproteolítica seqüencial para que
haja a liberação da forma ativa do fator. A forma transmembrana também é
biologicamente ativa e pode interagir com o receptor EGFR em células adjacentes.
Existe ainda uma forma mais agressiva desse fator transmembrana, o pro-TGF-α
que sofreu apenas clivagem em sua porção N-terminal, e que foi detectado na
membrana plasmática em certas linhas de células tumorais. Esse precursor
apresenta uma capacidade aumentada de ativar EGFR e isso vem sendo associado
com maior crescimento em alguns tumores (MULET et al., 2006).
42
O TGF-α é encontrado em embriões em desenvolvimento e em vários tecidos
normais adultos. Em muitos casos, sua distribuição está associada à do EGFR, o
que conduziu à idéia de que o TGF-α é um regulador autócrino e parácrino do
crescimento normal e desenvolvimento. Está relacionado à cicatrização e
homeostase em tecidos como pele, glândulas mamárias, fígado e rins. É produzido
por macrófagos ativos e eosinófilos, sugerindo uma função imunológica. Em
queratinócitos, o TGF-α promove migração celular e proliferação (HINKLE et al.,
2003; KUMAR; BUSTIN; MCKAY, 1995).
Além de sua função na formação, manutenção e reparação tecidual, tem sido
relacionada à progressão, invasão e metástase de uma série de neoplasias, tanto
pelo suprimento sanguíneo, devido ao potencial angiogênico de TGF-α que promove
a vascularização do tumor, quanto pela proliferação celular e depósito de matriz
extracelular (WELLS,1999; BOULOUGOURIS; ELDER,2001).
Sugere-se que o TGF-α também esteja envolvido com a iniciação da
proliferação vascular através da mediação de outros fatores angiogênicos, tais como
o VEGF. Assim, o TGF-α induziria fortemente a síntese de fator de permeabilidade
vascular (VPF) e fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) em
queratinócitos, exercendo um papel significante na iniciação e na manutenção da
permeabilidade vascular aumentada e proliferação (SOARES et al, 2000). Segundo
Boulougouris e Elder (2001) e Mulet et al. (2006), o TGF-α é um fator angiogênico
mais potente que EGF.
A super expressão de TGF-α e/ou EGFR vêm sendo detectadas em muitos
tipos de tumores humanos (SOARES et al, 2000). Kumar, Bustin e Mckay (1995)
afirmam que existe uma alta prevalência de TGF-α em carcinomas escamosos,
melanomas e carcinomas mamários. Boulougouris e Elder (2001) comentam que
43
carcinomas escamosos, renais e mamários, e tumores de origem neuroectodermal
como melanomas que têm expressão aumentada de EGFR, freqüentemente co-
expressam TGF-α. Segundo Mulet et al. (2006), co-expressão de TGF-α e EGFR
indicam um prognóstico ruim para diversos tipos de tumores epiteliais.
Mulet et al. (2006), em seus experimentos, observaram que seria possível
desenvolver uma imunoterapia para bloquear a via autócrina de EGFR/TGF-α, a
qual poderia ser eficaz no tratamento contra tumores que desenvolvessem
resistência à vacina contra EGF.
Experimentos realizados por Lyons et al. (1993), utilizando queratinócitos da
mucosa de camundongos em cultura, demonstraram que EGF e TGF-α são potentes
indutores das MMP-1 e MMP-9.
O-Charoenrat et al. (2000), estudando a ação de fatores de crescimento da
família EGF em carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, através da
técnica de PCR, observaram que as células incubadas com TGF-α e EGF
expressavam uma maior quantidade de mRNA de MMP-9, que gera uma maior
produção dessa MMP. Liu e Klominek (2003), realizando estudos zimográficos no
mesotelioma maligno (tumor da cavidade pleural), verificou que o TGF-α, assim
como o EGF, são capazes de aumentar a atividade da MMP-9. Nos dois estudos,
observou-se também que a atividade da MMP-2 não foi alterada por nenhum desses
fatores de crescimento.
Ueno et al. (1994) verificaram a localização de EGF no ameloblastoma, e
observaram que a imunorreação ao anticorpo anti-EGF foi observada principalmente
nas células estreladas do ameloblastoma folicular, e raramente encontradas no
padrão plexiforme. Desse modo, a distribuição de EGF através das células do tumor
44
foi semelhante à do EGFR, o que suporta o mecanismo autócrino de secreção desse
fator de crescimento.
Até a presente data, não foi verificado na literatura a existência de trabalhos que
relacionem o TGF-α ao ameloblastoma.
2.3.3. Fator Transformador de Crescimento β1 (TGF- β1)
O TGF- β corresponde a uma família de fatores de crescimento polipeptídicos
diméricos que também inclui proteínas morfogênicas ósseas e activinas. Existem
três isoformas do TGF-β: TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3, cada uma delas codificada por
um gene distinto (BLOBE; SCHEIMANN; LODISH, 2000). Alguns membros da
família estão expressos apenas em algumas células ou por períodos limitados de
tempo durante o desenvolvimento, enquanto outros, como o TGF-ß1, estão
amplamente distribuídos pelas células (MASSAGUÉ; BLAIN; LO, 2000 ). Cada uma
das isoformas do fator pode produzir efeitos diferentes dependendo do tipo, do
estado de diferenciação e das condições fisiológicas das células alvo (KAMINSKA;
WESOLOWKA; DANILKIEWICKS, 2005).
Todas as células do organismo, incluindo células epiteliais, endoteliais
(ROBBINS et al., 2000), hematopoiéticas, neuronais e células do tecido conjuntivo
produzem e apresentam receptores para TGF-ß (BLOBE; SCHEIMANN; LODISH,
2000). Assim, é de se esperar que as células do epitélio odontogênico também
produzam esse fator de crescimento (TAKATA et al., 2000).
O TGF-ß regula a proliferação e diferenciação celular, bem como a cicatrização,
devido à indução da produção de componentes da MEC (KAMINSKA;
WESOLOWKA; DANILKIEWICKS, 2005), o desenvolvimento embriogênico, (OFT;
HEIDER; BEUG, 1998) e a angiogênese (BLOBE; SCHEIMANN; LODISH, 2000). O
45
TGF-ß também pode induzir morte celular programada, e a perda dessa função pode
permitir o acúmulo de células pré-malignas (MASSAGUÉ; BLAIN; LO, 2000).
Em relação à sua estrutura molecular, o TGF-ß é um dímero, que apresenta
locais para ligar-se aos receptores do tipo I e II (MASSAGUÉ; BLAIN; LO, 2000).
Cada isoforma é sintetizada como parte de uma grande molécula precursora, que
contém um pró-peptídeo em adição ao TGF-ß (BLOBE; SCHEIMANN; LODISH,
2000; KAMINSKA; WESOLOWKA; DANILKIEWICKS, 2005). Esse pró-peptídeo,
conhecido como LAP (latency-associated protein), impede o acesso do TGF-ß aos
receptores da membrana (MASSAGUÉ; BLAIN; LO, 2000).
Após sua secreção, a maior parte do TGF-ß é armazenada na matriz
extracelular como um complexo formado pelo fator de crescimento, pelo pró-
peptídeo (LAP) e por uma proteína chamada LTBP (latent TGFß- binding protein). A
união do TGF-ß a esta proteína faz com que o fator permaneça em estado latente
(BLOBE; SCHEIMANN; LODISH, 2000). A permanência do TGF-ß em estado latente
previne que o fator gere uma resposta sem que ocorram certas condições
fisiológicas ou até que a célula alvo tenha sido atingida (KAMINSKA; WESOLOWKA;
DANILKIEWICKS, 2005).
In vivo, o TGF-ß é ativado pela ação da trombospondina 1, que parece atuar
mudando a conformação da LTBP. O fator pode também ser ativado por clivagem do
complexo latente mediada por plasmina, que é capaz de clivar o LAP (BLOBE;
SCHEIMANN; LODISH, 2000; KAMINSKA; WESOLOWKA; DANILKIEWICKS, 2005;
YU; STAMENKOVIC, 2002). Outras proteínas que participam da clivagem da forma
inativa do TGF-ß são integrinas e as MMP-2 e -9. (KAMINSKA; WESOLOWKA;
DANILKIEWICKS, 2005).
46
A principal resposta gerada pela sinalização do TGF-ß é a inibição da
proliferação celular. Em células epiteliais, endoteliais, hematopoiéticas, neurais, e
certos tipos de células mesenquimais, o fator é capaz de induzir respostas
antiproliferativas em qualquer ponto do ciclo celular, mas elas só são eficazes
durante a fase G1 (MASSAGUÉ; BLAIN; LO, 2000). Em células normais, age como
supressor de tumor, uma vez que inibe a proliferação celular ou promove
diferenciação ou apoptose (BLOBE; SCHEIMANN; LODISH, 2000).
De acordo com Blobe, Scheimann e Lodish (2000), o TGF-ß é um dos
reguladores mais potentes da produção de MEC, já que estimula fibroblastos e
outras células a produzirem proteínas (incluindo colágeno, fibronectina e integrinas),
e provoca a diminuição da produção de enzimas que degradam essa matriz
(colagenase, heparinase), bem como o aumento da outras enzimas que inibem a
sua ação (inibidor tecidual de metaloproteinases – TIMPs). Ele ainda estimula
diretamente a angiogênese in vivo.
Em carcinomas, o TGF-ß-1 é tanto um supressor quanto promotor da
tumorigênese (DUMONT; ARTEAGA, 2000; MASSAGUÉ; BLAIN; LO, 2000). Os
resultados de algumas pesquisas permitiram a verificação de que, em estágios
iniciais do tumor, o TGF-ß age como supressor tumoral. Após algum tempo, as
células perdem a capacidade de ter seu crescimento inibido pela ação do TGF-ß,
como resultado da mutação ou perda da expressão de determinados genes. Em
estágios avançados, tanto as células tumorais quanto as célula do estroma ao redor
do tumor geralmente aumentam sua produção de TGF-ß e, em resposta a esse
aumento, tornam-se mais invasivas, em parte como resultado da angiogênese, da
mobilidade celular, da supressão do sistema imune e de uma maior interação das
células do tumor com a MEC (BLOBE; SCHEIMANN; LODISH, 2000).
47
O TGF-ß também possui a habilidade de induzir um processo denominado EMT
(epithelial-to-mesenchymal transition). O EMT é caracterizado pela inibição da
produção de proteínas envolvidas na adesão celular e aumento da produção de
moléculas importantes para associações na matriz extracelular, como as MMPs, que
por sua vez estimulam propriedades migratórias e invasivas da célula (MASSAGUÉ;
BLAIN; LO, 2000; DUMONT; ARTEAGA, 2005). O EMT faz com que células
epiteliais polarizadas e não invasivas adquiram fenótipo de células mesenquimais
(OFT; HEIDER; BEUG, 1998). Conforme Dumont e Arteaga (2005), o EMT parece
ser iniciado pelo TGF-ß produzido por células peritumorais e depois mantido por
TGF-ß autócrino, quando as próprias células do tumor passam a secretá-lo.
A estimulação da angiogênese pode ser um outro mecanismo através do qual
TGF-ß estimula o crescimento de tumores tardios (BLOBE; SCHEIMANN; LODISH,
2000 ; DUMONT; ARTEAGA, 2005; MASSAGUÉ; BLAIN; LO, 2000; OFT; HEIDER;
BEUG 1998; YU; STAMENKOVIC, 2002). Particularmente o TGF-ß1 parece regular
formação de novos vasos sanguíneos tanto in vitro quanto in vivo, através de uma
combinação de respostas que inclui aumento da produção e facilitação de VEGF
(KAMINSKA; WESOLOWKA; DANILKIEWICKS, 2005), facilitação do fator de
crescimento básico de fibroblastos (bFGF), inibição da migração de células
endoteliais, aumento da produção de matriz extracelular, entre outros (DUMONT;
ARTEAGA, 2005).
A produção e secreção de TGF-ß por certas células cancerosas são capazes
de suprimir a atividade de células imunes infiltrativas, ajudando o tumor a escapar da
vigilância do sistema imune no organismo (BLOBE; SCHEIMANN; LODISH, 2000;
KAMINSKA; WESOLOWKA; DANILKIEWICKS, 2005; MASSAGUÉ; BLAIN; LO,
2000; YU; STAMENKOVIC, 2002; OFT; HEIDER; BEUG, 1998). Segundo Dumont e
48
Arteaga (2005), TGF-ß1 e TGF-ß2 são imunossupressores potentes, e elevados
níveis desses fatores secretados por tumores pode potencialmente inibir o efeito das
células imunes e favorecer a progressão do tumor.
Salo et al. (1991) observaram, em cultura de queratinócitos humanos, que TGF-
β1 aumenta a síntese de MMP-2 e MMP-9, facilitando a migração dos
queratinócitos da membrana basal para a região lesada, acelerando o processo de
cicatrização.
TGF-β1 e IL-6, produzidos em grandes quantidades por fibroblastos de
pacientes com fibromatose gengival hereditária, pomovem um aumento de colágeno
tipo I e reduzem a expressão de MMPs 1 e 2 nestas lesões (MARTELLI-JR et al.,
2003).
Segundo Ogawa et al. (2004), o TGF-β participa da modulação da resposta
inflamatória e outros processos biológicos através da sua regulação sobre a
produção de MMPs. Dumont e Arteaga (2005) revelam que a expressão de algumas
MMPs, incluindo a MMP-2 e a MMP-9, podem ser induzidas por TGF-β e que TGF-
β1 é capaz de induzir seletivamente a atividade da MMP-9 em tumores de próstata
de ratos metastáticos, implicando que a resposta induzida por essa isoforma pode
ser uma fase fundamental na progressão do tumor. Esses autores sugerem ainda
que as MMPs parecem participar da indução de neovascularização no tumor, e que
seu aumento pode ser um componente importante nos processos angiogênicos
mediados por TGF-β.
Yu e Stamenkovic (2002), Ogawa et al. (2004), e Kaminska, Wesolowka e
Danilkiewicks (2005) relatam que a MMP-9 é capaz de clivar TGF- β latente,
podendo participar de sua ativação. De acordo com Mott e Werb (2004), as MMPs -2
e -9, entre outras, atuam diretamente na ativação do TGF- β via clivagem do LAP.
49
Além do mais, a proteólise do LTBP ou de outras moléculas ligadas a ele pode ser
uma dos fatores responsáveis pelo lançamento da molécula de TGF- β latente a
partir da MEC.
Takata et al. (2000) realizaram uma pesquisa com o intuito de verificar a
localização de TGF-β no ameloblastoma desmoplásico, para então discutir sua
participação na síntese ativa de matriz extracelular. Houve uma imunoexpressão
acentuada de TGF-β no ameloblastoma desmoplásico nas células periféricas e
centrais dos ninhos do tumor, especialmente em seus núcleos. A marcação de
fibroblastos em áreas densamente colagenizadas também foi observada. Não houve
marcação positiva para TGF-β em ameloblastomas do tipo folicular e plexiforme. Já
em lesões híbridas, esse fator de crescimento foi expresso intensamente na área
desmoplásica, mas não na área folicular do tumor. Através desses dados, os autores
lançaram a hipótese de que o TGF-β produzido por células tumorais participa
ativamente da proeminente formação de matriz, bem como da inibição das enzimas
que a degradam.
Com base em todos esses estudos acerca das MMPs e fatores de crescimento
e na interação de ambos para a progressão de tumores, Pinheiro et al. (2004)
elaboraram uma hipótese para explicar o crescimento do ameloblastoma. Assim,
esses autores especularam que a secreção de MMPs pelo ameloblastoma inicia um
processo de reabsorção óssea e solubilização da matriz. Então, há o lançamento de
fatores de crescimento e citocinas da matriz óssea degradada, e esses compostos
ficam disponíveis para as células do tumor localizadas próximo ao osso. As citocinas
e fatores de crescimento podem estimular a secreção de mais MMPs pelas células
do ameloblastoma. Além do mais, por serem mitógenos, os fatores de crescimento
podem promover um aumento na proliferação das células do ameloblastoma
50
localizadas próximas ao osso. Como esta proliferação é estimulada casualmente, o
crescimento do ameloblastoma poderia ocorrer como cordões ramificando-se a partir
da porção central da neoplasia. Essas projeções poderiam penetrar profundamente
no osso, contribuindo para a invasividade local do ameloblastoma.
MMPs secretadasMMPs
Figura 2.2: Hipótese para invasividade local do ameloblastoma. Produção de MMPs pela neoplasia
(1), secreção das MMPs pelas células neoplásicas (2), liberação das citocinas pelo tecido ósseo
reabsorvido e conseqüente aumento do número de mitoses e produção de MMPs (3), crescimento
irregular em forma de projeções ou cordões que dificulta a remoção cirúrgica e ação sinérgica das
citocinas e MMPs mediando o crescimento e invasividade do ameloblastoma (4) (PINHEIRO et al,
2004).
OSSO NEOPLASIA OSSO NEOPLASIA
OSSO NEOPLASIA OSSO NEOPLASIA
Citocinas
Citocinas liberadas
Reabsorção óssea
21
MMPs
Mitose4
Crescimento em forma de projeções ou
3 em cordões Infiltrando o osso
51
3 PROPOSIÇÃO
Espera-se demonstrar a expressão de MMPs 1, 2 e 9, TIMPs 1 e 2, fatores de
crescimento EGF, TGF-α, TGF-β e EGFR estudados no ameloblastoma utilizando
imunohistoquímica.
Objetivos específicos:
1- Verificar se há diferença significativa entre a imunorreatividade das
metaloprteinases 1, 2 e 9 nas células epiteliais e mesenquimais do
ameloblastoma.
2- Verificar se há diferença significativa entra a imunorreatividade dos
inibidores teciduais das MMPs nas células epiteliais e mesenquimais do
ameloblastoma.
3- Verificar se há diferença sinificativa entre a imunorreatividade dos fatores
de crescimento EGF, TGF-α, TGF-β e o receptor EGFR nas células
epiteliais e mesenquimais do ameloblastoma.
Objetivos gerais:
52
4 MATERIAL E MÉTODOS
Este protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa do
.1. MATERIAL
.1.1. Amostras de tecido
foram selecionadas nos arquivos do Departamento de
.1.2. Materiais de Laboratório
na;
Hospital Universitário João de Barros Barreto da Universidade Federal do Pará
(Anexo- A).
4
4
As amostras estudadas
Anatomia Patológica do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do
Pará, do Laboratório Paulo Azevedo e do Serviço de Patologia do Hospital Ofir
Loyola, sendo composta por 13 (treze) blocos de parafina (correspondentes à
amostra de treze indivíduos) contendo fragmentos de tecido obtido através de
biópsia incisional, diagnosticados microscopicamente como ameloblastoma. Todas
as amostras consistiam em tumores primários, pertencentes à variante
sólida/multicística da neoplasia e, de acordo com o padrão histológico, essas
amostras foram divididas em 5 (cinco) foliculares, 3 (três) plexiformes, 3 (três) de
células granulares e 2 (dois) acantomatosos. Para materiais que tinham menos de 5
(cinco) anos de arquivados, o termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido
mediante contato com o paciente.
4
• Micrótomo de parafi
53
• Vidrarias de Laboratório (lâminas, lamínulas, tubos de ensaio, entre
• Micropipeta;
(Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA);
TRIS (Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA);
de amônia a 10%;
uímica: anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-
•
.A.;
o;
e terciário – LSAB (DAKO Corporation,
•
r;
us CH-30;
;
ão dos testes estatísticos.
outros);
• Organosilano
• BSA;
• Tampão
• Xilol;
• Etanol;
• Hidróxido
• Anticorpos para imunohistoq
MMP-9, anti-TIMP-1, anti-TIMP-2 (Neomarkers, Fremont, CA, USA),
anti-EGFR (Neomarkers, Fremont, CA, USA), anti-EGF (Santa Cruz
Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-TGF-α (Neomarkers,
Fremont, CA, USA) e anti-TGF-β1 (Serotec Ltd, Oxford, UK).
Ácido cítrico;
• Álcool metílico P
• Peróxido de hidrogêni
• Anticorpos secundário
Carpinteria CA, EUA);
Diaminobenzidina;
• Hematoxilina de Maye
• Microscópio de luz Olymp
• Retículo milimetrado para microscópio
• Contadores de células;
• Computador para aplicaç
54
• EDTA – sal dissódico (INLAB)
• Tris 99% (INLAB)
• Tween 20 (INLAB)
.2. MÉTODOS
.2.1. Tratamento das Amostras
m formol tamponado a 10%, desidratadas em
realizados cortes seriados nos blocos de parafina com 3 micrômetros
.2.2. Histopatologia
hematoxilina-eosina foi realizada para confirmação do
drões
4
4
As amostras foram fixadas e
concentrações crescentes de etanol, diafanizadas em xilol e emblocadas em
parafina.
Foram
(µm) de espessura. Para a técnica de imunohistoquímica, os cortes foram colhidos
em lâminas tratadas com organosilano (3-aminopropil-triethosilano, Sigma Chemical
Co. St. Louis, MO, USA), permitindo sua fixação e evitando a perda de material
durante as etapas do experimento.
4
Coloração com
diagnóstico de ameloblastoma e definição dos padrões histológicos do tumor.
As amostras de ameloblastoma utilizadas para a análise incluíam os pa
histológicos folicular (5), plexiforme (3), de células granulares (3) e acantomatoso (2)
do ameloblastoma sólido/multicístico.
55
4.2.3. Imunohistoquímica
a mamário (2 blocos) foram usadas como controle
:
MMP-9 (Neomarkers, Fremont, CA, USA ),
TIMP-1(Neomarkers, Fremont, CA, USA ),
TIMP-2 (Neomarkers, Fremont, CA, USA ),
EGFR (Neomarkers, Fremont, CA, USA),
izada foi a da imunoperoxidase (HSU;
de:
(por 15 minutos);
ante 10 minutos;
ndas por 15 minutos, divididos em 3 ciclos
comendado pelo fabricante);
Amostras de carcinom
positivo. Substituição do anticorpo primário por BSA e soro fetal bovino em tampão
TRIS foi utilizado como controle negativo.
Foram empregados anticorpos contra
MMP-1(Neomarkers, Fremont, CA, USA ),
MMP-2 (Neomarkers, Fremont, CA, USA ),
EGF (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA),
TGF-α (Neomarkers, Fremont, CA, USA) e
TGF-β1 (Serotec Ltd, Oxford, UK).
A técnica de imunohistoquímica real
RAINE; FANGER, 1981), consistindo
a. Desparafinização dos cortes em xilol em duas etapas: a 60º C (por 15
minutos) e a temperatura ambiente
b. Reidratação em série com concentrações descendentes de etanol (a 80%, a
70% e a 50%);
c. Remoção de pigmento formólico utilizando-se hidróxido de amônio a 10% em
etanol a 95º, dur
d. Recuperação antigênica:
-usando-se ácido cítrico em microo
de 5 minutos cada um (quando re
56
- usando-se EDTA, Tris 99% e Tween 20 (INLAB) em panela de pressão por 3
minutos após fervura;
e. Bloqueio da peroxidase endógena com álcool metílico P.A. e peróxido de
hidrogênio por 30 minutos, proporção 1:1, realizando-se duas trocas;
anti-MMP-1 (Neomarkers, Fremont, CA, USA - diluição 1:50),
ição 1:50),
O Corporation
otina;
j.
r Scientic, Fair Law, NJ, USA).
f. Eliminação de anticorpos inespecíficos, aplicando-se BSA e soro fetal bovino
por 1 h;
g. Incubação dos seguintes anticorpos primários durante 1 hora:
anti-MMP-2 (Neomarkers, Fremont, CA, USA - diluição 1:50),
anti-MMP-9 (Neomarkers, Fremont, CA, USA - diluição 1:100),
anti-TIMP-1 (Neomarkers, Fremont, CA, USA - diluição 1:50),
anti-TIMP-2 (Neomarkers, Fremont, CA, USA - diuição 1:50),
anti-EGFR (Neomarkers, Fremont, CA, USA – diluição 1:50),
anti-EGF (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA - dilu
anti-TGF-α (Neomarkers, Fremont, CA, USA - diluição 1:50) e
anti-TGF-β1 (Serotec Ltd, Oxford, UK - diluição 1:50).
h. Incubação de anticorpos secundário e terciário (LSAB, DAK
Carpinteria CA, USA) para o método estreptoavidina bi
i. Revelação com diaminobenzidina;
Contra-coloração com hematoxilina de Mayer;
k. Desidratação e diafanizanização;
l. Montagem das lâminas em PermountTM (Fische
57
4.2.4. Análise dos Resultados
A imunolocalização das MMPs, das TIMPs, do receptor e dos fatores de
las foram consideradas
crescimento estudados foi quantitativamente analisada. Célu
positivas quando houve marcação, independente da intensidade da mesma. Os
cortes foram avaliados através de microscopia de luz (microscópio Olympus CH-30),
em um aumento de 400x, utilizando-se retículo milimetrado para microscópio. Esta
análise foi feita em várias etapas, por dois examinadores calibrados. Tanto o epitélio
odontogênico quanto o estroma que compõem o ameloblastoma foram avaliados.
Para cada um desses tecidos, 1.000 (mil) células, divididas em 5 (cinco) campos
contendo 200 (duzentas) células cada, foram observadas, totalizando 2.000 (duas
mil) células por lâmina. A análise quantitativa para a expressão de MMP-1, MMP-2,
MMP-9, TIMP-1, TIPM-2, EGFR, EGF, TGF-α e TGF-ß1 foi realizada utilizando-se o
índice de positividade (IP), calculado pelo número de células positivas para o
anticorpo testado, dividido por 1000 células contadas para cada tecido estudado
(epitélio odontogênico e estroma) e multiplicado por 100:
IP= nº de células positivas x 100
1000
Desse modo, para cada corte, obteve-se um IP para células epiteliais tumorais
troma (IPest).
uição . Optou-se então por aplicar o
(IPepit) e outro para células do es
Através do teste estatístico D´Agostino, foi observado que os IPs obtidos não
apresentavam normalidade na curva de distrib
teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis, para verificar se havia diferença de
imunorreação entre os anticorpos testados. Essa diferença foi considerada
estatisticamente significantemente quando o valor p encontrado foi menor que 0,05.
Para os testes estatísticos foi utilizado o programa BIOESTAT 3.0.
58
5 RESULTADOS
O
As amostras de ameloblastoma utilizadas para a análise incluíam os padrões
xiforme (3), de células granulares (3) e acantomatoso (2)
olunares alongadas, hipercromáticas e com
em longos cordões de epitélio que se
das
sentam citoplasma abundante com grânulos
eosinofílicos (Figura 5.1 D).
mostras de carcinoma mamário foram usadas como controle positivo (Figura
do como controle negativo. (Figura 5.2 B).
5.1. HISTOPATOLÓGIC
histológicos folicular (5), ple
do ameloblastoma sólido/multicístico.
As amostras de ameloblastoma folicular apresentavam ilhas de epitélio
odontogênico formadas por células c
polarização nuclear invertida, em estroma composto por tecido conjuntivo maduro.
As ilhas possuíam uma área central constituídas por células dispostas frouxamente,
similar ao retículo estrelado (Figura 5.1 A).
O padrão plexiforme foi caracterizado pela presença de células colunares com
polarização invertida do núcleo organizadas
anastomosavam e formavam plexos no estroma de sustentação (Figura 5.1 B).
O padrão acantomatoso foi representado por extensa metaplasia escamosa,
por vezes envolvendo formação de ceratina nas porções centrais das ilhas forma
por células neoplásicas (Figura 5.1 C).
No padrão de células granulares, foi observada a presença de ilhas formadas
por células redondas ou ovais, que apre
5.2. IMUNOHISTOQUÍMICA
A
5.2 A).
Substituição do anticorpo primário por BSA e soro fetal bovino em tampão TRIS
foi utiliza
59
As células neoplásicas e do estroma positivas para as moléculas estudadas,
obtiveram padrão de marcação granular dentro do citoplasma, ora condensadas
padrões histológicos folicular (Figura 5.3 A) e acantomatoso (Figura 5.3
C), marcação citoplasmática foi observada nas células neoplásicas colunares,
especialmente no pólo celular voltado para membrana basal, e nas células centrais
das ilhas de tumor.
No padrão plexiforme (Figura 5.3 B), a marcação encontrada nas células
neoplásicas foi predominantemente citoplasmática.
No padrão de células granulares (Figura 5.3 D), foi evidenciada marcação
bém apresentaram marcação
5.4 A) marcação citoplasmática foi
bservada em algumas células neoplásicas colunares, especialmente no pólo celular
embrana basal, e também em algumas células centrais das ilhas de
no citoplasma das células epiteliais que formavam os plexos característicos dessa
focalmente, ora apresentando distribuição difusa. Em alguns casos, houve também
marcação na membrana plasmática.
5.2.1 MMP-1
Nos
granular citoplasmática nas células granulares.
Em todos os padrões, as células do estroma tam
granular citoplasmática (Figura 5.3 – setas).
5.2.2 MMP-2
No padrão histológico folicular (Figura
o
voltado para m
tumor.
No padrão plexiforme (Figura 5.4 B), a marcação encontrada foi predominante
variante.
60
A variante acantomatosa (Figura 5.4 C), apresentou marcação em suas
porções ceratinizadas.
No padrão de células granulares (Figura 5.4 D), foi evidenciada marcação
es, as células do estroma também apresentaram marcação
a 5.5 A) e acantomatoso (Figura 5.5
), marcação citoplasmática foi observada nas células neoplásicas colunares,
no pólo celular voltado para membrana basal, e nas células centrais
riante.
p
lulas do estroma também apresentaram marcação
e acantomatoso (Figura 5.6
C), marcação citoplasmática foi observada nas células neoplásicas colunares,
granular citoplasmática.
Em todos os padrõ
granular citoplasmática (Figura 5.4 – setas).
5.2.3 MMP-9
Nos padrões histológicos folicular (Figur
C
especialmente
das ilhas de tumor. A variante acantomatosa apresentou ainda marcação em suas
porções ceratinizadas.
No padrão plexiforme (Figura 5.5 B), a marcação encontrada foi
predominantemente citoplasmática nas células epitelias que formavam os plexos
característicos dessa va
No adrão de células granulares (Figura 5.5 D), foi evidenciada marcação
granular citoplasmática em várias células.
Em todos os padrões, as cé
granular citoplasmática (Figura 5.5 – setas).
5.2.4 TIMP-1
Nos padrões histológicos folicular (Figura 5.6 A)
especialmente no pólo celular voltado para membrana basal, e nas células centrais
61
das ilhas de tumor. A variante acantomatosa apresentou uma discreta marcação em
suas porções ceratinizadas.
No padrão plexiforme (Figura 5.6 B), a marcação citoplasmática foi encontrada
nas células epiteliais que formavam os plexos característicos dessa variante.
No padrão de células granulares (Figura 5.6 D), foi evidenciada marcação
ação
a 5.7 A) e acantomatoso (Figura 5.7
), marcação citoplasmática foi observada nas células neoplásicas colunares,
no pólo celular voltado para membrana basal, e nas células centrais
lulas granulares (Figura 5.7 D), foi observada intensa
am marcação
Nos padrões histológicos folicular e acantomatoso (Figura 5.8
, marcação citoplasmática foi observada nas células neoplásicas colunares,
granular citoplasmática em poucas células.
Em todos os padrões, as células do estroma também apresentaram marc
granular citoplasmática (Figura 5.6 – setas).
5.2.5 TIMP-2
Nos padrões histológicos folicular (Figur
C
especialmente
das ilhas de tumor. A variante acantomatosa apresentou ainda marcação em suas
porções ceratinizadas.
No padrão plexiforme (Figura 5.7 B), a marcação encontrada nos cordões de
células epiteliais neoplásicas foi predominantemente citoplasmática.
No padrão de cé
marcação granular citoplasmática nas células granulares.
Em todos os padrões, as células do estroma também apresentar
granular citoplasmática (Figura 5.7 – setas).
5.2.6 EGFR
(Figura 5.8 A)
C)
62
especialmente no pólo celular voltado para membrana basal, e nas células centrais
lasmática também foi notada.
granular citoplasmática (Figura 5.8 – setas).
, plexiforme (Figura 5.9 B) e
(Figura 5.9 C), marcação citoplasmática foi observada
rimordialmente no pólo voltado para a membrana basal das células neoplásicas
no citoplasma das células poliédricas que lembram o retículo estrelado
igura 5.9 - setas).
das ilhas de tumor. A variante acantomatosa apresentou ainda marcação em suas
porções ceratinizadas.
No padrão plexiforme (Figura 5.8 B), a marcação encontrada foi predominante
na membrana das células epiteliais que formavam os plexos característicos dessa
variante. Marcação citop
No padrão de células granulares (Figura 5.8 D), foi evidenciada marcação
granular citoplasmática em poucas células.
Em todos os padrões, as células do estroma também apresentaram marcação
5.2.7 EGF
Nos padrões histológicos folicular (Figura 5.9 A)
acantomatoso
p
colunares e
do órgão do esmalte. As porções ceratinizadas, no caso da variante acantomatosa,
também apresentaram marcação.
No padrão de células granulares (Figura 5.9 D), marcação granular
citoplasmática foi bastante evidente.
Em todos os padrões, as células do estroma também apresentaram alguma
marcação granular citoplasmática (F
63
5.2.8 TGF-α
Nos padrões histológicos folicular (Figura 5.10 A) e acantomatoso (Figura 5.10
), marcação citoplasmática perinuclear foi notada nas células neoplásicas
olunares e no citoplasma das células poliédricas que lembram o retículo estrelado
esmalte. As porções ceratinizadas, no caso do ameloblastoma
acantomatoso, também exibiram marcação.
ra 5.10 D), foi evidenciada marcação
células do estroma também exibiram marcação
nas células neoplásicas colunares.
s células centrais das ilhas e as porções ceratinizadas, no caso do ameloblastoma
também exibiram marcação.
lulas.
C
c
do órgão do
No padrão plexiforme (Figura 5.10 B), a marcação encontrada foi predominante
citoplasmática perinuclear nas células epitelias que formavam os plexos
característicos dessa variante.
No padrão de células granulares (Figu
perinuclear nas células limitantes das ilhas tumorais, e marcação granular
citoplasmática variando de intensa a discreta em algumas células granulares.
Em todos os padrões, as
granular citoplasmática. (Figura 5.10 - setas).
5.2.9 TGF-ß1
Nos padrões histológicos folicular (Figura 5.11 A) e acantomatoso (Figura 5.11
C), marcação citoplasmática granular foi notada
A
acantomatoso,
No padrão plexiforme (Figura 5.11 B), marcação citoplasmática das células
colunares quase não foi observada.
No padrão de células granulares (Figura 5.11 D), marcação granular
citoplasmática foi observadas em algumas cé
64
Em todos os padrões, as células do estroma também exibiram marcação
granular citoplasmática. (Figura 5.11 - setas).
65
Figura 5.1 – Cortes histológicos corados em hematoxilina e eosina (HE), exibindo os padrões
morfológicos do ameloblastoma utilizados nesse estudo: folicular (A), plexiforme (B), acatomatoso (C)
ulas granulares (D).
FIGURA-5.1
e de cél
66
C
A
B
D
67
Figura 5.2 – Amostra de carcinoma mamário utilizada como controle positivo (A). Substituição do
nticorpo primário por BSA e soro fetal bovino em tampão TRIS utilizado como controle negativo (B)
FIGURA-5.2
a
68
B
A
69
Figura 5.3 - Padrões de expressão imunohistoquímica de MMP-1 no ameloblastoma. Observou-se
arcação citoplasmática nas células neoplásicas colunares, especialmente no pólo celular voltado
ara membrana basal, nos padrões histológicos folicular (A) e acantomatoso (C). No padrão
plexiforme (B), a marcação encontrada nas células neoplásicas foi citoplasmática. No padrão de
as granulares (D), houve marcação granular citoplasmática nas células granulares. As setas
m
p
célul
indicam células do estroma que apresentaram marcação.
FIGURA-5.3
70
71
igura 5.4 - Padrões de expressão imunohistoquímica de MMP-2. No padrão histológico folicular (A)
arcação citoplasmática foi observada em algumas células neoplásicas colunares e também em
lgumas células centrais das ilhas de tumor. A marcação encontrada no padrão plexiforme (B), foi
predominante no citoplasma das células epiteliais. A variante acantomatosa (C), apresentou
marcação em suas porções ceratinizadas. No padrão de células granulares (D), foi evidenciada
marcação granular citoplasmática. As setas indicam células do estroma que apresentaram marcação.
F
m
a
FIGURA-5.4
72
73
Figura 5.5 - Padrões de expressão imunohistoquímica de MMP-9. Nos padrões histológicos folicular
(A) e acantomatoso (C), marcação citoplasmática foi observada nas células neoplásicas colunares e
nas células centrais das ilhas de tumor. A variante acantomatosa apresentou ainda marcação em
suas porções ceratinizadas. A marcação encontrada no padrão plexiforme (B), foi
predominantemente citoplasmática nas células epitelias que formavam os plexos característicos
dessa variante. No padrão de células granulares (D), foi evidenciada marcação granular
citoplasmática em várias células. As setas indicam células do estroma que apresentaram marcação.
FIGURA-5.5
74
75
Figura 5.6 - Padrões de expressão imunohistoquímica de TIMP-1. Verificou-se marcação
citoplasmática nas células neoplásicas colunares e nas células centrais das ilhas de tumor, nos
padrões folicular (A) e acantomatoso (C). A variante acantomatosa apresentou uma discreta
marcação em suas porções ceratinizadas. No padrão plexiforme (B), a marcação citoplasmática foi
encontrada nas células epiteliais que formavam os plexos característicos dessa variante. Foi
evidenciada marcação granular citoplasmática em poucas células, no padrão de células granulares
(D). As setas indicam células do estroma que apresentaram marcação.
FIGURA-5.6
76
77
Figura 5.7 - Padrões de expressão imunohistoquímica de TIMP-2. Nos padrões folicular (A) e
acantomatoso (C), marcação citoplasmática foi observada nas células neoplásicas colunares,
especialmente no pólo celular voltado para membrana basal, e nas células centrais das ilhas de
tumor. A variante acantomatosa apresentou ainda marcação em suas porções ceratinizadas. No
padrão plexiforme (B), a marcação encontrada nos cordões de células epiteiais neoplásicas foi
predominantemente citoplasmática. No padrão de células granulares (D), foi observada intensa
marcação granular citoplasmática nas células granulares. As setas indicam células do estroma que
apresentaram marcação.
FIGURA-5.7
78
79
Figura 5.8 – Padrões de expressão imunohistoquímica do receptor EGFR no ameloblastoma.
Observou-se marcação no pólo basal das células neoplásicas e das células centrais das ilhas de
tumor, nas variantes folicular (A), e acantomatosa (C), sendo que esta ultima apresentou também
imunorreação em suas porções ceratinizadas. No padrão plexiforme (B), a marcação encontrada foi
na membrana das células neoplásicas. Já no de células granulares (D), foi notada imunorreação
granular citoplasmática em algumas células. As setas indicam células do estroma que apresentaram
marcação.
FIGURA-5.8
80
81
Figura 5.9 – Padrões de expressão imunohistoquímica do EGF no ameloblastoma. Verificou-se
imunorreação citoplasmática no pólo basal das células neoplásicas colunares e nas células
poliédricas que lembram o retículo estrelado do órgão do esmalte, nas variantes folicular (A),
plexiforme (B) e acantomatosa (C). Já na variante de células granulares (D), observou-se marcação
granular citoplasmática. As setas indicam células do estroma que apresentaram imunorreação.
FIGURA-5.9
82
83
Figura 5.10 – Padrões de expressão imunohistoquímica do TGF-α no ameloblastoma. Nas variantes
folicular (A) e acantomatosa (C), notou-se marcação citoplasmática perinuclear das células
neoplásicas colunares e das células poliédricas que lembram o retículo estrelado do órgão do
esmalte. As porções ceratinizadas do padrão acantomatoso também apresentaram imunorreação. Na
variante plexiforme (B), a marcação das células neoplásicas foi predominantemente citoplasmática.
Já no padrão de células granulares (D), evidenciou-se imunorreação perinuclear nas células
limitantes das ilhas tumorais, e marcação granular citoplasmática variando de intensa a discreta em
algumas células granulares. As setas indicam células do estroma que apresentaram imunorreação.
FIGURA-5.10
84
85
Figura 5.11 – Padrões de expressão imunohistoquímica do TGF-β1 no ameloblastoma. Nas
variantes folicular (A) e acantomatosa (C), foi observada marcação citoplasmática granular nas
células neoplásicas colunares, nas células centrais das ilhas de tumor, e nas porções ceratinizadas
(no caso do padrão acantomatoso). Na variante plexiforme (B), imunorreação granular citoplasmática
foi notada em algumas células neoplásicas. Já no padrão de células granulares (D), houve marcação
granular citoplasmática em poucas células. As setas indicam células do estroma que apresentaram
imunorreação.
FIGURA-5.11
86
87
5.3. ÍNDICE DE POSITIVIDADE NAS MMPs
5.3.1. Índice de Positividade nas células neoplásicas
A distribuição do índice de positividade no epitélio odontogênico do
ameloblastoma (IPepit) está demonstrada no gráfico abaixo:
Gráfico 5.1: Distribuição dos valores de IPepit encontrados para MMP-1, MMP-2 E MMP-9.
O IPepit apresentou as seguintes medianas (Md) para as MMPs estudadas:
Tabela 5.1: Valores das medianas dos Índices de Positividade do Epitélio (IPepit) para as MMPs
MMP IPepit(Md) MMP-1 94.4MMP-2 52.0MMP-9 97.0
88
Através do teste de Kruskal-Wallis, foi feita uma comparação entre os IPepit de
todas as MMPs estudadas.
Levando-se em consideração apenas os resultados estatisticamente
significantes, verificou-se que a diferença entre o IPepit da MMP-2 e o IPepit da MMP-9
foi significativa (p<0,05). Em outras palavras, a MMP-9 está expressa em maior
número de células neoplásicas do que a MMP-2.
5.3.2 Índice de Positividade (IP) nas células do estroma
A distribuição do índice de positividade estroma (IPest) está demonstrada no
gráfico a seguir:
Gráfico 5.2: Distribuição dos valores de IPest encontrados para MMP-1, MMP-2 E MMP-9.
89
O IPest apresentou os seguintes valores medianos para as MMPs estudadas:
Tabela 5.2: Valores das medianas dos Índices de Positividade do Estroma (IPest) para as MMPs
MMP IPest(Md) MMP-1 59.9MMP-2 9.7MMP-9 94.4
Através do teste de Kruskal-Wallis, foi feita uma comparação entre os IPest das
MMPs estudadas.
Levando-se em consideração apenas os resultados estatisticamente
significantes, verificou-se que a diferença entre o IPest da MMP-2 e o IPest da MMP-9
foi significativa (p<0,05). Em outras palavras, a MMP-9 está expressa em maior
número de células do estroma do que a MMP-2.
Utilizando-se o teste de Kruskal-Wallis, não foi verificada diferença
estatisticamente significante entre o IPepit e o IPest para uma mesma MMP.
90
5.4. ÍNDICE DE POSITIVIDADE NAS TIMPs
5.4.1. Índice de Positividade nas células neoplásicas
A distribuição do índice de positividade no epitélio odontogênico do
ameloblastoma (IPepit) está demonstrada no gráfico abaixo:
Gráfico 5.3: Distribuição dos valores de IPepit encontrados para TIMP-1 e TIMP-2.
O IPepit apresentou as seguintes medianas (Md) para as TIMPs estudadas:
Tabela 5.3: Valores das medianas dos Índices de Positividade do Epitélio (IPepit) para as TIMPs.
TIMP IPepit(Md) TIMP-1 46.3TIMP-2 96.7
91
Através do teste de Kruskal-Wallis, foi feita uma comparação entre os IPepit das
TIMPs estudadas. Verificou-se que a diferença entre o IPepit da TIMP-1 e o IPepit da
TIMP-2 foi estatisticamente significante (p<0,05). Em outras palavras, a TIMP-2 está
expressa em maior número de células neoplásicas do que a TIMP-1.
5.4.2 Índice de Positividade (IP) nas células do estroma
A distribuição do índice de positividade estroma (IPest) está demonstrada no
gráfico a seguir:
Gráfico 5.4: Distribuição dos valores de IPest encontrados para TIMP-1 e TIMP-2.
92
O IPest apresentou os seguintes valores medianos para as TIMPs estudadas:
Tabela 5.4: Valores das medianas dos Índices de Positividade do Estroma (IPest) para as TIMPs
TIMP IPest (Md) TIMP-1 10.9TIMP-2 91.5
Através do teste de Kruskal-Wallis, foi feita uma comparação entre os IPest das
TIMPs estudadas. Observou-se que a diferença entre o IPest da TIMP-1 e o IPest da
TIMP-2 foi estatisticamente significante (p<0,05). Em outras palavras, a TIMP-2 está
expressa em maior número de células do estroma do que a TIMP-1.
Utilizando-se o teste de Kruskal-Wallis, não foi verificada diferença
estatisticamente significante entre o IPepit e o IPest para uma mesma TIMP.
93
5.5.ÍNDICE DE POSITIVIDADE NOS FATORES DE CRESCIMENTO E RECEPTOR
5.5.1. Ìndice de Positividade (IP) nas células neoplásicas
A distribuição do índice de positividade no epitélio odontogênico do
ameloblastoma (IPepit) está demonstrada no gráfico abaixo:
Gráfico 5.5: Distribuição dos valores de IPepit encontrados para EGF, EGFR, TGFα- e TGF-β1 .
O IPepit apresentou as seguintes medianas (Md) para o receptor e fatores de
crescimento estudados:
Tabela 5.5: Valores das medianas dos Índices de Positividade do Epitélio (IPepit)
Fator de Crescimento/
Receptor IPepit(Md)
EGFR 75.4 EGF 98.6 TGF-α 87.4 TGF-ß1 16.3
94
Através do teste de Kruskal-Wallis, foi feita uma comparação entre os IPepit de
todas as moléculas estudadas.
Levando-se em consideração apenas os resultados estatisticamente
significantes, verificou-se que a diferença entre o IPepit do EGFR e o IPepit do EGF foi
significativa (p<0,05). Em outras palavras, a expressão de EGF nas células
neoplásicas do tumor é significativamente maior que a expressão de seu receptor.
A diferença entre o IPepit do EGF e o IPepit do TGF-ß1 também foi
estatisticamente significante (p<0,05). Ou seja, a expressão de TGF-ß1 é
significativamente menor do que a de EGF.
Observou-se ainda que a diferença entre o IPepit do TGF-α e o IPepit do TGF-ß1
é estatisticamente significante (p<0,05). Ou seja, a expressão de TGF-ß1 é
significativamente menor do que a de TGF-α.
5.5.2 Índice de Positividade (IP) nas células do estroma
A distribuição do índice de positividade estroma (IPest) está demonstrada no
gráfico a seguir:
Gráfico 5.6: Distribuição dos valores de IPest encontrados para EGF, EGFR, TGFα- e TGF-β1.
95
O IPest apresentou os seguintes valores medianos para o receptor e fatores de
crescimento estudados:
Tabela 5.6: Valores das medianas dos Índices de Positividade do Estroma (IPest)
Fator de Crescimento/
Receptor IPest (Md)
EGFR 18.0 EGF 79.8 TGF-α 67.8 TGF-ß1 20.1
Através do teste de Kruskal-Wallis, foi feita uma comparação entre os IPest de
todas as moléculas estudadas.
Levando-se em consideração os resultados estatisticamente significantes,
verificou-se que a diferença entre o IPest do EGF e o IPest do TGF-ß1 foi significativa
(p<0,05). Em outras palavras, a expressão de EGF nas células do estroma é
significativamente maior que a expressão de TGF-ß1.
Utilizando-se o teste de Kruskal-Wallis, não foi verificada diferença
estatisticamente significante entre o IPepit e o IPest para um mesmo fator de
crescimento.
95
6 DISCUSSÃO
O conhecimento dos mecanismos de ação dos fatores de crescimento, bem
como de suas interações com as metaloproteinases da matriz e seus inibidores
teciduais, é importante para a compreensão não só da manutenção da homeostase
e regeneração tecidual, mas, principalmente, da progressão de processos
patológicos.
Os resultados desta pesquisa demonstraram que todas as amostras teciduais
de ameloblastoma analisadas apresentaram imunorreatividade aos anticorpos contra
MMP-1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, EGFR, EGF, TGF-α e TGF-ß1.
Tomando-se como base o número de células neoplásicas e do estroma
marcadas pelos anticorpos (expresso pelos valores IPepit e IPest), pode-se notar que
a quantidade de células marcadas foi diferente para cada uma das moléculas
estudadas.
Entre as MMPs e TIMPs, a que apresentou maiores índices de positividade foi
MMP-9 (IPepit= 97.0 e IPest= 94.4 ), seguida por TIMP-2 (IPepit= 96.7 e IPest= 91.5),
MMP-1(IPepit= 94.4 e IPest= 59.9), MMP-2 (IPepit= 52.0 e IPest= 9.7 ) e TIMP-1
(IPepit= 46.3 e IPest= 10.9) .
Esses resultados vão ao encontro dos obtidos por Kumamoto et al. (2003) e
Pinheiro et al. (2004), os quais demonstraram a presença de MMPs 1, 2 e 9 no
ameloblastoma.
Porém, os resultados da pesquisa de Kumamoto et al. (2003) mostraram que,
na maioria dos casos, a imunorreação das MMPs foi especialmente proeminente no
estroma ao redor das ilhas ou ninhos celulares do ameloblastoma. Além do mais,
verificou-se que a expressão de MMP-1, apesar de detectada nas células do
96
estroma, não foi detectada nas células do tumor, denotando que as células do
estroma têm uma grande participação na progressão do ameloblastoma. As MMP-2
e 9 também foram detectados nas células do estroma, mas foram fracamente
detectados nas células periféricas colunares ou cuboidais do tumor. O que difere dos
achados deste trabalho, onde foi observada a marcação tanto em células
neoplásicas quanto em estroma.
Já Pinheiro et al. (2004), além de verificarem presença de MMPs 1, 2 e 9 em
ameloblastomas, no epitélio e no estroma neoplásico, demonstraram que as
mesmas encontravam-se em suas formas lantente e ativa, sugerindo o envolvimento
das MMPs na proliferação celular e invasão do ameloblastoma. Nossos achados, em
imunohistoquímica, condizem com esses e colaboram no sentido de quantificar a
imunoexpressão dessas moléculas, através de contagem de células e aplicação de
testes estatísticos.
Estudos que sugerem que a invasividade de células normais e tumorais, pode
estar associada com a expressão elevada de MMPs e/ou expressão diminuída de
TIMPs (Lyons et al.,1993), nos levou a estudar também a imunoexpressão destas
últimas. Uma expressão significante de TIMP-2 nos leva a crer que é necessária a
preservação, em parte, da MEC para que possa haver migração celular, este um
fator importante na invasividade tumoral. Por outro lado, a maior expressão dessa
molécula pode significar uma maior inibição das MMPs resultando no
comportamento biológico benigno do ameloblastoma.
O EGF foi o fator de crescimento que apresentou os maiores índices de
positividade (IPepit= 98.6 e IPest= 79.8), seguido pelo TGF-α ( IPepit= 87.4 e
IPest= 67.8), EGFR (IPepit= 75.4 e IPest= 18.0) e TGF-ß1 (IPepit= 16.3 e IPest= 20.1).
97
Em relação ao receptor EGFR, os achados desta pesquisa são compatíveis
com os de Ueno et al. (1994) e Vered, Shohat e Buchner (2003), pois esses autores
também comprovaram, através de estudos imunohistoquímicos, que o EGFR está
presente no ameloblastoma. Ambos os trabalhos detectaram a localização
predominante desse receptor no pólo basal das células neoplásicas. Ueno et al.
(1994) destacam ainda que a imunorreação ao anti-EGFR era particularmente mais
proeminente nas áreas centrais do tumor, especialmente quando essas
apresentavam metaplasia escamosa (o que ocorre no padrão histológico
acantomatoso), bem como o estroma também apresentou marcação,o que condiz
com os achados obtidos neste estudo.
No entanto, Shrestra et al. (1992), realizando um estudo imunohistoquímico
para verificar a presença de EGFR no ameloblastoma, não encontraram expressão
desse receptor. As diferenças de resultados entre as pesquisas podem ter ocorrido
devido a discrepâncias na técnica imunohistoquímica empregada, como diferentes
métodos de recuperação antigênica, uso de marcas e concentrações diferentes do
anticorpo, tempos de incubação diferentes, entre outros fatores. Esses autores
afirmaram ainda que o ameloblastoma poderia ter perdido sua dependência em
relação a esse receptor para crescer, o que não nos parece plausível, já que
acreditamos que a interação desse receptor com seus ligantes possa desempenhar
um papel importante no crescimento do tumor.
A expressão de EGF, um dos componentes da família de ligantes do EGFR,
também foi estudada no ameloblastoma por Ueno et al. (1994), os quais observaram
que a distribuição desse fator de crescimento através das células do tumor foi
semelhante à do EGFR, corroborando os resultados deste estudo. Esses autores
também observaram que as células do padrão plexiforme raramente apresentavam
98
imunoexpressão de EGF, fato que não foi verificado neste trabalho, uma vez que as
células desse padrão histológico apresentaram marcação freqüente.
Existe apenas um estudo na literatura a respeito da presença de TGF-ß no
ameloblastoma. Takata et al. (2000) verificaram uma imunoexpressão acentuada de
TGF-β1 e ß2 no ameloblastoma desmoplásico. Dentre as amostras de tecido
estudadas nesta pesquisa, não havia nenhum caso de ameloblastoma
desmoplásico, o que dificulta uma análise comparativa entre os dois trabalhos. Os
autores comentam também que não houve marcação positiva para TGF-β em
ameloblastomas do tipo folicular e plexiforme, e que em lesões híbridas, o TGF-ß só
foi expresso intensamente na área desmoplásica, mas não na área folicular do
tumor. Contradizendo esses resultados, verificamos imunoexpressão, embora
discreta, de TGF-ß1 em todos os padrões histológicos por nós avaliados. Essa
diferença de resultado pode ter ocorrido por diferenças nas técnicas laboratoriais de
imunohistoquímica.
Até a presente data, nenhum estudo acerca da expressão de TGF-α no
ameloblastoma foi conduzido. Por isso, acreditamos ter descoberto um possível fator
atuante no processo de invasividade do ameloblastoma.
Diversos trabalhos já foram realizados com o intuito de esclarecer os
mecanismos que permeiam a invasividade do ameloblastoma. Depois que autores
como Rosa, Jaeger e Jaeger (1997) verificaram que apenas metade das células do
ameloblastoma estão em estado proliferativo, a mitogênese não pode ser
considerada como o único fator responsável pela agressividade da neoplasia. Na
busca pela elucidação desse mecanismo, moléculas como a IL-1, (PRIPATNANONT
et al., 1998), TNF-α, RANKL (SANDRA et al., 2005), que poderiam conferir uma
99
maior capacidade osteolítica à lesão, e a laminina-5 (SALO et al.,1999) foram
estudadas no ameloblastoma.
Atualmente, grande parte dos estudos acerca do potencial invasivo do
ameloblastoma está sendo direcionada para a interação da neoplasia com as
moléculas que compõem a MEC. De acordo com Mott e Werb (2004) e Schenk e
Quaranta (2003), a MEC atua como reservatório de citocinas e fatores de
crescimento, e a proteólise, um dos principais eventos promotor de mudanças da
matriz, pode lançar esses fatores e disponibilizá-los para as células.
As MMPs são as grandes responsáveis pelo processo de degradação da matriz
e promovem a remodelação da MEC. Lyons et al. (1993), sugerem que a
invasividade tanto de células normais quanto tumorais está associada com a
expressão elevada de MMPs e/ou expressão diminuída de seus inibidores. Desse
modo, a indução de MMPs seria capaz de conceder agressividade a tumores em
desenvolvimento.
Após verificar que uma grande parte das células do ameloblastoma permanece
em intérfase, ou seja, em intensa atividade de síntese protéica, Rosa, Jaeger e
Jaerger (1997) supuseram que os produtos dessa síntese poderiam de alguma
forma participar do crescimento do tumor. As MMPs poderiam figurar entre as
proteínas produzidas nesta fase e o ameloblastoma, como uma neoplasia
potencialmente invasiva, poderia utilizar-se de suas propriedades para promover sua
auto-disseminação. Com a comprovação da imunoexpressão das MMPs -1, -2 e -9
no ameloblastoma (KUMAMOTO et al., 2003; PINHEIRO et al., 2004), essa hipótese
torna-se bastante aceitável.
Nagase e Woessner (1999) relatam que as MMPs participam da disseminação
de células cancerígenas através do colapso da MEC, e criam um ambiente que
100
suporta a iniciação e manutenção do crescimento de tumores primários e
metastáticos.
Conforme Yu e Stamenkovic (2002) a remodelação tecidual associada ao tumor
está baseada em uma complexa relação entre pelo menos três classes de
moléculas: receptores de adesão, MMPs, citocinas e fatores de crescimento. Em
outras palavras, a regulação coordenada de metaloproteinases e seus inibidores
governa a clivagem, lançamento de muitos fatores de crescimento importantes e de
receptores de superfície celular. E os fatores de crescimento, por sua vez, controlam
a expressão das MMPs.
Levando em consideração que as MMPs e fatores de crescimento estão
intimamente ligados, e que esses fatores também modulam importantes funções
tanto em células normais quanto neoplásicas, passamos a considerá-los como
peças importantes no complexo mecanismo de invasividade do ameloblastoma.
O receptor EGFR, por exemplo, apresenta uma interessante correlação com a
MMP-2 que, ao clivar a laminina-5, promove a liberação do Domínio III da corrente
γ2 da molécula (DIII), capaz de ativar eventos inerentes à sua sinalização, como a
motilidade celular. Por sua vez, a ativação de EGFR pelo DIII estimula a expressão
do gene que codifica a MMP-2, levando ao aumento de sua expressão (MOTT;
WERB, 2004; SCHENK; QUARANTA, 2003). Segundo Yamada et al. (1989), a
sinalização mediada por EGFR é capaz de promover a angiogênese, e assim pode
participar indiretamente do crescimento tumoral. Visto que a MMP-2 e o EGFR estão
expressos no ameloblastoma, especialmente nas células colunares neoplásicas,
pode-se supor que a interação entre essas duas moléculas gere respostas que
levem à disseminação da lesão. A função angiogênica mediada por EGFR também
pode fornecer suporte ao tumor.
101
Os fatores de crescimento EGF e TGF-α, que se ligam ao receptor EGFR,
também participam da regulação de MMPs. Lyons et al. (1993), em seus
experimentos, comprovaram que esses dois fatores são potentes indutores das
MMP-1 e MMP-9. O-Charoenrat et al. (2000), por sua vez observaram que as células
de carcinoma de células escamosas incubadas com TGF-α e EGF expressavam
uma maior quantidade de mRNA de MMP-9, o que gera uma maior produção dessa
MMP. Liu e Klominek (2003), através de estudos zimográficos no mesotelioma,
observaram que o TGF-α e o EGF são capazes de aumentar a atividade da MMP-9.
Além dessas propriedades, o EGF, e principalmente o TGF-α, também estão
envolvidos com a iniciação da proliferação vascular, através da mediação de certos
fatores angiogênicos, exercendo um papel significante na iniciação e na manutenção
da permeabilidade vascular aumentada e proliferação (SOARES et al., 2000).
O fato de o TGF-α ser um potente fator angiogênico e de estar relacionado à
secreção de MMPs são dados muito importantes quando considerada sua
significativa expressão no ameloblastoma, observada nesse estudo. A partir dessa
constatação, se pode supor que o TGF-α forneça subsídios para a formação de
suporte vascular, bem como participe da degradação da MEC através da indução de
MMPs, eventos necessários para o desenvolvimento do tumor.
O EGF possui um importante papel na regulação da proliferação de células
neoplásicas (SHRESTHA et al., 1992), pois é capaz de reduzir o contato célula-
célula, promovendo sua motilidade. (BOULOUGOURIS; ELDER, 2001). Essa
propriedade do EGF também poderia ser responsável pela propagação das células
do ameloblastoma.
Já o TGF-ß1, conforme Ogawa et al. (2004), participa de vários processos
biológicos através da sua regulação sobre a produção de MMPs. Dumont e Arteaga
102
(2005) revelaram que a expressão de MMP-2 e -9 pode ser induzida por esse fator,
o qual também é capaz de induzir seletivamente a atividade da MMP-9 em tumores
de próstata de ratos metastáticos. Juntamente com o TGF-ß, as MMPs parecem
participar da indução de neovascularização no tumor, e seu aumento pode ser um
componente importante nos processos angiogênicos mediados por TGF-β.
Em contrapartida, as MMPs tem sido relacionadas com a transformação de Pro-
TGF-α em TGF-α madura a través da clivagem proteolítica do domínio pré-catalítico
da primeira (HINKLE et al.,2003).
Ainda, as MMPs -2 e -9 atuam diretamente na ativação do TGF- β via clivagem
do LAP (MOTT; WERB, 2004). Da mesma maneira que ocorre com o EGFR, o TGF-
ß estimula a produção da MMP responsável por promover a clivagem de sua forma
inativa, gerando um ciclo de mútua ativação.
Com base em todos esses dados, elaboramos um diagrama que exibe, de
maneira simplificada, os mecanismos biológicos que podem promover a invasividade
local do ameloblastoma.
Figura 6.1: Hipótese para ação dos fatores de crescimento na invasividade local do ameloblastoma.
103
Os fatores de crescimento (oriundos do parênquima, estroma e osso
reabsorvido) podem estar envolvidos em várias interações que permeiam a
invasividade local do ameloblastoma. Eles podem induzir a ativação e produção de
MMPs, assim como as MMPs participam, em alguns casos, da ativação dos fatores
de crescimento. Além do mais, as propriedades angiogênicas desses fatores
também parecem fornecer subsídios para que o ameloblastoma torne-se localmente
agressivo, uma vez que disponibilizariam nutrientes para as células neoplásicas
executarem suas funções.
Apesar de termos verificado a expressão de EGFR, EGF, TGF-α e TGF-ß1 no
ameloblastoma, é interessante que a expressão dessas proteínas possa ser
identificada nesta neoplasia por outros métodos de pesquisa como western blot, por
exemplo, como foram identificadas as MMPs 1, 2 e 9 por Pinheiro et al. (2004).
Considerando-se as relações entre as MMPs e os fatores de crescimento, suas
atuações no desenvolvimento de diversos tumores (citados anteriormente), bem
como sua expressão no ameloblastoma, podemos, a partir dos resultados
encontrados nesse estudo, sugerir que uma complexa interação entre esses
mecanismos permeie a invasividade desse tumor.
104
7 CONCLUSÕES
Com base nos resultados oriundos do estudo imunohistoquímico de cortes
histológicos de ameloblastoma, concluímos que:
1- As células neoplásicas do ameloblastoma expressam MMPs 1, 2 e 9, TIMPs
1 e 2, EGFR, EGF, TGF-α e TGF-β1, assim como as células do estroma.
2- A marcação das MMPs, TIMPs, receptor e fatores de crescimento estudados
foi proeminente no pólo voltado para a membrana basal das células colunares
periféricas, para todos os padrões histológicos pesquisados.
3- A MMP-9 apresentou os maiores índices de positividade entre as MMPs
testadas, seguida por MMP-1 e MMP-2. As diferenças de imunorreação foram
estatisticamente significantes entre MMP-2 e MMP-9, tanto em células neoplásicas
quanto no estroma.
4- Entre as TIMPs, a que apresentou maior marcação foi a TIMP-2, seguida de
TIMP-1. As diferenças de imunorreação foram estatisticamente significantes entre
TIMP-1 e TIMP-2, nas células neoplásicas e no estroma.
5- O EGF foi o fator de crescimento que apresentou os maiores índices de
positividade de marcação, seguido pelo TGF-α, EGFR e TGF-ß1. As diferenças de
imunorreação foram estatisticamente significantes entre EGF/EGFR, EGF/TGF-ß1 e
TGF-α/TGF-ß1 nas células neoplásicas, e entre EGF/TGF-ß1 no estroma.
6- Não foi verificada diferença estatisticamente significante entre os índices de
positividade nas células neoplásicas e do estroma para uma mesma molécula.
105
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112
APÊNDICE
APÊNDICE A - VALORES DOS ÍNDICES DE POSITIVIDADE DO EPITÉLIO
NEOPLÁSICO (IPepit) E DO ESTROMA (IPest)
IPepit
Lâmina MMP-1 MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2 EGFR EGF TGF-α TGF-β1 OD 04 98 92.1 97.7 87.4 89.7 75.4 97.1 54.0 79.1
415 96.8 8.5 96.3 65.2 97.7 51.6 97.2 88.5 92.61725 18.1 96.2 99.8 46.3 99.1 81.8 100.0 94.6 8.23360 92.7 0.7 47.1 20.7 62.9 91.7 90.4 33.6 10.13742 98.5 84.6 99.8 80.1 96.7 94.3 98.1 98.2 15.14037 94.4 77.1 96.5 7.2 93.6 97.8 99.9 90.4 16.35030 72.8 11.3 95.8 8.8 86.5 76.6 99.6 81.6 25.7
16548 96.5 15.8 99.2 58.4 98.2 39.0 99.0 87.0 12.225754 95.9 1.6 96.1 56.6 98.3 13.5 98.7 95.0 14.529011 37.7 32.3 98.8 5 94.4 32.1 95.0 87.4 33.229505 99.1 98.8 96.3 63.5 99.3 61.2 95.7 85.5 68.730951 68.1 79.8 98.7 17.9 96.5 78.2 99.5 92.8 65.935128 91.2 52 100 27 98.5 43.4 98.6 76.5 6.7
IPest
Lâmina MMP-1 MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2 EGFR EGF TGF-α TGF-β1 OD 04 45.1 9.7 96.8 10.3 67.8 33.5 83.2 14.2 49.5
415 74.6 3.4 94.4 61.7 88.9 7.9 79.8 38.9 39.11725 28.2 11.8 92.6 10.9 91.5 75.5 93.1 71.8 17.83360 51.8 2.9 60.9 2.2 92.8 10.6 81.0 54.7 4.93742 68.8 11.6 93.9 1.3 97 77.9 82.8 83.9 20.14037 77.9 6.6 91.5 2.3 79 96.6 37.6 58.6 4.65030 32.9 3.1 77.9 3.4 87.1 18.0 79.8 67.8 8.5
16548 68.7 9.3 98.4 46 92.9 21.3 92.3 92.0 23.325754 70.6 8.8 98.9 43.9 99.5 45.1 89.6 93.8 48.129011 41.2 72.7 98.8 8.5 88.7 6.7 72.2 92.4 41.729505 72.9 14 27.3 55 98.2 14.9 72.6 63.6 11.430951 22.5 18.1 99.1 21 80.5 7.3 69.9 60.6 21.935128 59.9 53 99.7 49.1 95.7 16.5 78.5 75.5 19.3
113
ANEXOS
ANEXO A - PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
114
ANEXO B -TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Projeto: "Cooperação entre fatores de crescimento, metaloproteinases e seus
inibidores na invasividade local do ameloblastoma."
a) Como e quem irá obtê-lo: O termo de consentimento livre e esclarecido será
obtido mediante contato com o paciente, pela aluna de mestrado, Márcia
Regina Dias de Carvalho, quando o material tiver menos de cinco anos
arquivado.
Nota: A amostra coletada já conta com mais de cinco anos de arquivo.
b) Descrição de riscos com avaliação da gravidade:
O material utilizado representará risco mínimo para o paciente, pois, será
utilizado material de arquivo (blocos). Os blocos serão obtidos dos arquivos
do Departamento de Anatomia Patológica da UFPA e do Laboratório Paulo
Azevedo.
c) Medidas de proteção de risco e à confidencialidade
A utilização do bloco se limitará à utilização de material necessário a
pesquisa, devendo permanecer no mesmo bloco, material suficiente para
novo diagnóstico histopatológico. Não serão veiculados em plano de
pesquisa, publicações e mídia o nome, número de documento ou quaisquer
outros dados que possam identificar os pacientes em questão, mantendo
íntegro seu anonimato.
115
ESCLARECIMENTO DA PESQUISA
1) A pesquisa objetiva detectar fatores importantes no crescimento do tumor
estudado.
2) O risco será mínimo, já que o material a ser utilizado pertence a arquivo, não
havendo cirurgia para remoção de tecido.
3) O aumento do conhecimento da doença pode resultar em um melhor
tratamento a longo prazo.
4) Os resultados divulgados não incluem o nome do paciente.
5) Qualquer dano seja moral, psicológico ou físico, desde que comprovado será
amparado ou reparado.
6) O paciente é livre para participar e retirar-se da pesquisa a qualquer momento
sem que haja represália dos pesquisadores.
____________________________________________ Assinatura do pesquisador
Nome: Márcia Regina Dias de Carvalho
Orientador: João de Jesus Viana Pinheiro
116
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CURSO DE ODONTOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ANATOMIA PATOLÓGICA
PROTOCOLO DE PESQUISA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO NOME DO PACIENTE: _______________________________________ ENDEREÇO:_________________________________________________ DOCUMENTO DE IDENTIDADE:_______________________________ NOME DO PESQUISADOR: __________________________________ As informações contidas nas f ichas clínicas foram levantadas pela aluna Márcia Regina Dias de Carvalho, sob orientação do Profº João de Jesus Viana Pinheiro.
Os blocos e fragmentos de ameloblastoma uti l izados para este estudo foram cedidos para a aluna Márcia Regina Dias de Carvalho, para uso na pesquisa “Cooperação entre fatores de crescimento, metaloproteinases e seus inibidores na invasividade local do ameloblastoma”, sob coordenação do Profº João de Jesus Viana Pinheiro. Objetivo: Firmar acordo por escrito mediante o qual, o voluntário da pesquisa (paciente ou responsável) autoriza o uso de amostra de ameloblastoma emblocada em parafina, com pleno conhecimento do caráter da pesquisa e que os resultados serão publicados, tendo capacidade de l ivre arbítr io e sem qualquer coação, para esta doação. * Observação: Para maiores informações estamos à disposição no Departamento de Anatomia Patológica, anexo ao Hospital Universitário Barros Barreto, no telefone (0xx91) 3283 6111.
Belém, ____/_____/_______
____________________________________________ Assinatura do pesquisador
Nome: Márcia Regina Dias de Carvalho
Orientador: João de Jesus Viana Pinheiro
117
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que l i as informações acima sobre a pesquisa, que me sinto perfeitamente esclarecido sobre o conteúdo da mesma, assim como dos seus riscos e benefícios. Declaro ainda que, por minha l ivre vontade, aceito participar da pesquisa cedendo material de arquivo a mim pertencente.
Assinatura do sujeito da pesquisa ou responsável
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