otimizaÇÃo da produÇÃo de endoxilanaseslivros01.livrosgratis.com.br/cp007426.pdf · os...

Rodrigo Pires do Nascimento

OOTTIIMMIIZZAAÇÇÃÃOO DDAA PPRROODDUUÇÇÃÃOO DDEE EENNDDOOXXIILLAANNAASSEESS

PPOORR SSttrreeppttoommyycceess mmaallaayyssiieennssiiss AAMMTT--33 UUTTIILLIIZZAANNDDOO

RREESSÍÍDDUUOOSS AAGGRROO--IINNDDUUSSTTRRIIAAIISS

Orientadores:

Profª. Rosalie Reed Rodrigues Coelho (Instituto de Microbiologia – CCS)

Profª. Elba Pinto da Silva Bon (Instituto de Química – CT)

Prof. Nei Pereira-Jr. (Escola de Química – CT)

Universidade Federal do Rio de Janeiro Rio de Janeiro

2006

Tese apresentada ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, visando a obtenção do Grau de

Doutor em Ciências (Microbiologia).

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Nascimento, R.P.

ii

Ficha Catalográfica

ascimento, Rodrigo Pires

ndoxilanases por Streptomyces malaysiensis AMT-3 Utilizando

utorado: Doutor em Ciências (Microbiologia)

da Produção

eral do Rio de Janeiro – Brasil

dustrial – Portugal

N

Estudo da Produção de E

Resíduos Agro-Industriais.

x, 164 fls.

Tese de Do

1. Streptomyces malaysiensis AMT-3

2. Xilanases

3. Otimização

4. Solo de Cerrado

I. Universidade Fed

II. Instituto Nacional de Engenharia e Tecnologia In

III. Título

Nascimento, R.P.

iii

Um especialista é aquele que comete um grande número de erros em uma área

Niels Böhr

muito específica do conhecimento.

Nascimento, R.P.

iv

Trabalho realizado no Laboratório de Biotecnologia de

Actinomicetos do Departamento de Microbiologia Geral do

Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, sob a

orientação da Drª Rosalie Reed Rodrigues Coelho sob a co-

orientação dos Drs. Elba Pinto da Silva Bon e Nei Pereira Jr,

em colaboração com Unidade de Fisiologia Microbiana e

Bioprocessos do Departamento de Biotecnologia do Instituto

Nacional de Engenharia e Tecnologia Industrial, sob a

coordenação dos Drs. Francisco Gírio e Alberto Reis.

Nascimento, R.P.

v

À Deus, presente em todas as horas durante a

minha vida, pois serviram para o meu

crescimento espiritual.

Nascimento, R.P.

vi

Dedico aos meus pais Luiz Paulo e Scheila Pires,

minha avó Maria Alice e a minha tia Regina Célia

por me darem o apoio necessário para seguir este

caminho tão pleno de oportunidades e alegrias.

Nascimento, R.P.

vii

AGRADECIMENTOS

Este trabalho se constitui parte de um ampl

potenci

as e instituições, às quais

gostaria

rigues Coelho, nossa orientadora, pelo constante incentivo,

paciênc

n e Dr. Nei Pereira Jr., nossos co-orientadores, pela

grande

r. Alberto Reis, pela grande oportunidade e pelo constante

apoio, i

ientífica e

pelo in

Marta Helena Branquinha, Alane Beatriz Vermelho,

Rosang

Microbiologia, Dilma, que sempre com seu carinho, sua

atenção

izade, paciência e apoio, sempre

demons

os meus colegas de laboratório: Adriana Linhares Sousa, Adriana Fróes, Andre

Grigorewski, Doralice Rodrigues Sacramento, Erick Aniszweski, Felipe Mendes, Júlio Cesar

o projeto, cujo objetivo principal é estudar o

al biotecnológico de actinomicetos isolados de ambientes naturais brasileiros.

Particularmente, no presente caso, pretende-se otimizar, estudar o escalonamento e caracterizar as

endoxilanases produzidas por Streptomyces malaysiensis AMT-3, isolado de solo de cerrado,

determinando as condições ótimas de produção e atividade enzimática.

Este trabalho só foi possível devido ao auxílio de diversas pesso

de agradecer em especial.

À profª. Rosalie Reed Rod

ia e sabedoria sempre demonstrados.

Aos Profs Dr. Elba Pinto da Silva Bo

oportunidade de participação no projeto Brasil–Portugal e pelo constante apoio, incentivo,

e sabedoria sempre demonstrados.

Aos Dr Francisco Gírio e D

ncentivo, e sabedoria durante a elaboração do trabalho no INETI, em Portugal.

Ao prof. Luiz Fernando de Toledo Luna Linhares pela valiosa colaboração c

centivo nos momentos de incerteza.

Às profªs. Eliana Barreto Bergter,

ela Araújo Soares e Celuta Sales Alviano pelo apoio, colaboração e pela constante

amizade demonstrados a todo tempo.

À bibliotecária do Instituto de

e presteza, emprestou-me mais do que simples livros.

À amiga Claudia Masini D’Avila-Levy pela grande am

trados.

À todos

Nascimento, R.P.

viii

Venânc

osé Carlos Júnior, Cláudia Jiovanetti,

Bruno

ento de Biotecnologia do Instituto Nacional de

Engenh

obiologia e

Imunol

pre demonstrados.

cados a nossa

disposi

-4), ao Conselho de Ensino e para Graduados e Pesquisas da UFRJ (CEPG), à

Coorde

io, Luzia Soares Semêdo, Luciana Insuellas de Azeredo, Marta de Sousa Ferreira, Nelson

Alves Júnior, Rodrigo Fonseca de Souza e Rosana Canuto Gomes pela constante colaboração,

paciência e pelo carinho e amizade sempre demonstrados.

Aos meus grandes amigos Lysianne Pinto, Rodrigo Souza, André Grigorewski, Gisele

Cunha, Eugênia Cunha, Sandra Cunha, Danilo Camargo, J

Lima Ribeiro, Vera Brilhante, Conceição Cândido, Tânia, pela amizade e confiança

sempre demonstradas em qualquer situação.

Aos amigos da Unidade de Fisiologia Microbiana e Bioprocessos e Unidade de

Bioengenharia e Bioprocessos do Departam

aria e Tecnologia Industrial (INETI), em Portugal: Susana Marques, Luis Alves, Luis

Duarte, Helena Alberguaria, Florbela Carvalheiro, Maria Amélia, Ana Mendes, Manoela Lageiro,

João Sousa, Cristina Máximo pela amizade, paciência e apoio sempre demonstrados.

À coordenadora do curso de Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia Prof. Thais

Souto-Padrón pela competência em administrar o curso de pós-graduação em Micr

ogia dentro da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Aos colegas dos laboratórios situados no Departamento de Microbiologia Geral do

Instituto de Microbiologia pelo apoio, amizade e paciência sem

À todo corpo docente e discente do Instituto de Microbiologia da UFRJ na pessoa de seu

diretor, Prof.ª Ângela Hampshire Lopes, pelos recursos materiais e humanos colo

ção.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq – Processo

201080/2004

nação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à Fundação de

Amparo a Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ) pelo auxílio financeiro dispensado durante a

realização deste trabalho.

Nascimento, R.P.

ix

RESUMO Os estreptomicetos são de grande potencial para a produção de enzimas, como as xilanases,

importantes para a indústria papeleira, têx ia. O objetivo do presente trabalho foi a

otimi

A melhor produção de CMCases (710 U/L) foi obtida em 2,5% (p/v)

drech

o, foi detectada utilizando SDS-PAGE contendo 0,1% (p/v) de

gelati

til e alimentíc

zação da produção de endoxilanase por Streptomyces malaysiensis AMT-3 utilizando

substratos de baixo custo. A otimização do meio de cultivo foi conduzida em frascos agitados,

utilizando um planejamento fatorial (23), em que dreche cervejeiro e farelo de trigo foram

testados como fontes de carbono, nas concentrações de 0,5 e 2,5% (p/v), e milhocina e extrato de

levedura como fonte de nitrogênio, nas concentrações de 0,1 e 1,2% (p/v). A fermentação foi

conduzida a 200 rpm, 28ºC, por 6 dias. A maior atividade enzimática (45,8 U/mL) foi obtida após

6 dias de fermentação a 28ºC, utilizando 2,5% (p/v) de farelo de trigo e 1,2% (p/v) de milhocina.

Utilizando a melhor composição de meio de cultivo, a produção de endoxilanases foi também

conduzida em biorreator de 2L. A taxa de aeração (0,5 e 1,5 vvm) e a velocidade (300 e 600 rpm)

foram otimizadas utilizando planejamento fatorial 22. O melhor resultado para a produção de

endoxilanases (média de 56,5 U/mL) foi observado quando 300 rpm e 0,5 vvm foram utilizados,

correspondendo a um aumento de 1,2 vezes, quando comparado com o observado em frasco

agitado. Os parâmetros cinéticos para a atividade endoxilanásica, utilizando uma xilana solúvel,

foram 1,56 mg/mL de xilana (Km) e 1,58 µmoles de xilose/mL.min (Vmax), mostrando uma alta

especificidade e uma velocidade baixa. A concentração de 1,5% (p/v) de xilana e o tempo de

reação de 6 min foram escolhidos como as melhores condições para o ensaio enzimático. A

melhor atividade enzimática foi observada em pH 6,0, a 60ºC. A enzima reteve 50% da atividade

após 6 horas à 50ºC.

A atividade de CMCase também foi estudada nos sobrenadantes obtidos da cultura de S.

malaysiensis AMT-3.

e cervejeiro e 1,2% (p/v) milhocina, após 4 dias de fermentação. As atividades enzimáticas

apresentaram um ótimo de temperatura a 50ºC e pH 4,0, e o extrato bruto reteve 50% da

atividade após 2 horas a 50ºC.

A atividade de protease, investigada em todos os sobrenadantes obtidos no desenho

experimental em frasco agitad

na. Todos os substratos testados foram capazes de induzir a produção de proteases, mas a

combinação farelo de trigo e extrato de levedura apresentou o melhor resultado, sendo as

melhores condições, da atividade enzimática, observadas a 37ºC, pH 7,0. Ao todo, 10 enzimas

Nascimento, R.P.

x

proteolíticas (6 serina- e 4 metalo-proteases) foram observadas nos filtrados da cultura de S.

malaysiensis AMT-3, correspondendo a proteínas com massa molecular aparente variando de 30

a 200 kDa, detectadas em SDS-PAGE corado com Comassie Blue.

Os resultados obtidos sugerem que a produção de endoxilanases pode ser conduzida por S.

malaysiensis AMT-3 utilizando resíduos agro-industriais, minimizando o impacto no custo da

produção e consequentemente contribuindo para o uso de tecnologias mais limpas.

Nascimento, R.P.

xi

SUMMARY

The streptomycetes are of great p me production, as xylanases, important

for pap

is AMT-

3. The

protease activity, assayed in all supernatants obtained in the experimental design, was

detected on Comassie Blue-stained SDS-PAGE.

otential for enzy

er, textile and food industries. The aim of the present work was the optimization of the

production of endoxylanase by Streptomyces malaysiensis AMT-3 using cheap hemicellulosic

substrates. The optimization of the medium was performed in shake flasks, using a 23 factorial

design, brewer’s spent grain and wheat bran were tested as carbon sources, at 0.5% (w/v) and

2.5% (w/v) concentration, and corn steep liquor and yeast extract as nitrogen sources, at 0.1%

(w/v) and 1.2% (w/v). The fermentation systems were carried out at 200 rpm, 28ºC for 6 days.

The highest enzyme activity (45.8 U/mL) was obtained after 6 days–fermentation at 28°C using

2.5% (w/v) wheat bran and 1.2% (w/v) corn steep liquor. Using the best medium composition,

the endoxylanase production was also assayed in a 2L bioreactor. The aeration rate (0.5 and 1.5

vvm) and speed (300 and 600 rpm) were tested using a 22 factorial design. The best result for

endoxylanase production (56.5 U/mL) was observed when 300 rpm and 0.5 vvm were used,

corresponding to 1.2 fold those obtained in shake flasks. Best enzyme activity was observed at

60oC and pH 6.0. The kinetic parameters for endoxylanase activity, using a soluble xylan, were

1.56 mg/mL xylan (Km) and 1.58 µmol xylose/mL.min (Vmax), showing a high specificity and

low speed rate. One point five (w/v) oat spelts xylan and 6 min. were chosen as best conditions

for the enzymatic assay. The enzyme retained 50% of its activity after 6 hours at 50°C.

CMCase activity was also assayed in the supernatants obtained by S. malaysiens

best cellulase production (710 U/L) was obtained in brewer’s spent grain [2.5% (w/v)] and

corn steep liquor [1.2% (w/v)] after 4-days fermentation. The best enzyme activities were

observed at 50°C and pH 4.0, and the crude extract retained 50% of its activity after 2 hours at

50°C.

The

detected using SDS-PAGE containing gelatine 0.1% (w/v). All substrates tested were capable of

inducing proteases production, but the combination of wheat bran and yeast extract gave the best

results, being 37°C and pH 7.0 the best conditions for enzyme activity. Ten proteolytic enzymes

(6 serina-proteinases and 4 metalo-proteinases) were observed on of S. malaysiensis AMT-3

filtrates, corresponding to proteins of apparent molecular masses ranging from 30 to 200 kDa,

Nascimento, R.P.

xii

The results obtained suggest that endoxylanases production can be carried out by

Streptomyces malaysiensis using agro-industrial by-products, minimizing the impact of the

production, and consequently contributing for the use of cleaner technologies.

Nascimento, R.P.

xiii

ÍNDICE Agradecimentos vii

Resumo ix

o o icetos e sua Importância Biotecnológica

. Materiais e Métodos 38

Summary xi

1. Introduçã 1 1.1. Os Actin m 1

1.2. Biomassa Vegetal 3

1.2.1. Celulose 6

1.2.2. Hemiceluloses 7

1.2.3. Lignina 10

1.3. Enzimas Lignocelulolíticas 11

1.3.1. Complexo Xilanases 12

1.3.2. Complexo Celulases 16

1.4. Proteases 17

1.5. Aplicações Biotecnológicas das Xilanases, Celulases e Proteases 19

1.5.1. Xilanases 21

1.5.2. Celulases 22

1.5.3. Proteases 23

1.6. Otimização e Desenho Experimental 24

1.7. Biotecnologia e Processos Fermentativos 28

1.8. Processo de Escalonamento 34

2. Relevância e Objetivos do Trabalho 36

3

3.1. Manutenção da Estirpe 38

3.2. Produção de Endoxilanases em Frascos Agitados 38

3.3. Otimização do Processo Fermentativo em Frascos Agitados 38

3.4. Produção de Endoxilanases em Biorreator de 2L 39

3.5. Produção de Endoxilanases em Biorreator de 16 L 41

3.6. Cinética Enzimática 42

Nascimento, R.P.

xiv

3.7. Ensaios Analíticos 42

3.7.1. Dosagem da Proteína Total Solúvel 43

3.7.2. Determinação do pH 43

3.7.3. Atividade de Endoxilanases 43

3.7.4. Atividade de Carboximetilcelulases (CMCase) 43

3.8. Caracterização da Atividade Endoxilanásica 44

3.8.1. Determinação do Perfil de Temperatura 44

3.8.2. Determinação do Perfil de pH 44

3.8.3. Estabilidade a Temperatura 44

3.8.4. Influência de Íons Metálicos e Outros Aditivos 45

3.9. Caracterização da Atividade de CMCase 45

3.9.1. Determinação do Perfil de Temperatura 45

3.9.2. Determinação do Perfil de pH 45

3.9.3. Estabilidade a Temperatura 46

3.10. Eletroforese (Zimograma) 46

3.10.1. Endoxilanases 46

3.10.2. CMCases 47

3.10.3. Peptidases 47

Resultados 49

Discussão 90

Conclusões 113

Referências Bibliográficas 115

Produção Científica 132

Anexos 135

Nascimento, R.P. Introdução

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Os Actinomicetos e sua Importância Biotecnológica

Os actinomicetos são bactérias Gram positivas que apresentam um DNA rico em guanina

e citosina (G+C > 72%, no gênero Streptomyces e G+C de 64 a 72% no gênero Nocardia)

possuindo a capacidade de formar filamentos em algum estágio de seu desenvolvimento (Leblond

& Decaris, 1994). As colônias de actinomicetos são formadas por uma massa de hifas,

constituindo o micélio. Essa massa é formada a partir do desenvolvimento inicial de esporos,

esporângios ou fragmentos de hifas em meio sólido, constituindo primeiramente o micélio

vegetativo, de caráter hidrofílico. Crescendo verticalmente, algumas estirpes de actinomicetos

diferenciam seu micélio vegetativo em micélio aéreo, de caráter hidrofóbico, o que provoca uma

alteração nas características morfogenéticas, fisiológicas e ultraestruturais (Vobis, 1997).

Estes microrganismos se encontram distribuídos no solo, águas e outros ambientes, porém

o solo é o seu habitat mais comum (Goodfellow & Cross, 1984). Eles têm sido descritos como os

principais produtores de antibióticos no solo, e também como um dos principais grupos

microbianos produtores de enzimas de interesse comercial. Além disso, exercem um papel

importante na ciclagem de compostos orgânicos nos ambientes naturais e desempenham um

papel promissor na agricultura, visto que alguns gêneros como Frankia são capazes de fixar o

nitrogênio atmosférico em plantas não-leguminosas (Goodfellow et al.,1988).

A instabilidade genética é uma característica bastante encontrada nos actinomicetos,

podendo a freqüência de mutação chegar a pelo menos 1 em cada 103 células no gênero

Streptomyces. Assim sendo, a maioria das características fenotípicas relacionadas à diferenciação

e metabolismo secundário são geneticamente instáveis, tais como: formação de micélio aéreo,

pigmentação, esporulação, resistência a agentes genotóxicos e resistência e/ou produção de

antibióticos e enzimas (Leblond & Decaris, 1994).

Por muitos anos, os actinomicetos, principalmente os do gênero Streptomyces, foram

conhecidos como sendo os principais microrganismos produtores de antibióticos (Goodfellow et

al., 1988, Sanglier et al., 1993, Kim et al., 2000). A heterogeneidade bioquímica dos

actinomicetos, sua diversidade ecológica e sua capacidade para a produção de metabólitos

secundários os fazem um bom alvo para a produção de enzimas, desempenhando novas


2

atividades e/ou especificidades (Goodfellow et al., 1988). As enzimas produzidas pelos

actinomicetos são capazes de degradar compostos nitrogenados orgânicos, carboidratos, vários

esteróides como colesterol, uma variedade de compostos aromáticos, acetileno e muitos outros.

Estudos recentes vêm apontando os actinomicetos como fontes emergentes promissoras de uma

ampla faixa de importantes enzimas de interesse industrial e ambiental, como àquelas envolvidas

na degradação de materiais lignocelulósicos (Goodfellow et al., 1988; Flores et al., 1997). A

decomposição dos resíduos lignocelulósicos pelos actinomicetos os fazem potenciais fontes para

a bioconversão de resíduos em substâncias químicas de interesse industrial (Piret & Demain,

1988).

Os actinomicetos estão adaptados a se desenvolverem em substratos sólidos. Suas fontes

primárias de carbono no solo são de baixa solubilidade e poliméricos, necessitando da secreção

de uma série de enzimas extracelulares, quando ocorre a colonização do substrato pelas hifas

(Piret & Demain, 1988). As celulases, por exemplo, são capazes de degradar a celulose, podendo

ser úteis nas indústrias têxteis e de detergentes, mas também possuem aplicações na área

ambiental, auxiliando no tratamento de efluentes da indústria de papel e celulose. Podemos citar

ainda as xilanases que são responsáveis pela degradação das xilanas, utilizadas em indústrias de

alimento e papeleira, para a fabricação de produtos dietéticos e clareamento de polpas de papel,

respectivamente (Stutzenberger & Bodine, 1992; Breccia et al., 1995). Além disso, estas

desempenham um papel importante na decomposição de hemicelulose em solos e na recuperação

de açúcares fermentáveis a partir de hemiceluloses (Belfaquih & Penninckx, 2000; Stutzenberger

& Bodine, 1998; Garg et al., 1996). Temos ainda as quitinases, que são responsáveis pela

degradação da quitina, o polímero aminado mais abundante na natureza, e encontrado em

crustáceos, fungos e insetos. Estas enzimas vem sendo utilizadas como controle biológico no

combate a fungos fitopatogênicos (Gupta et al., 1995). Já as proteases, que apresentam variadas

classes, em especial, metalo e serina proteinases, agem sobre uma gama de substratos protéicos,

sendo aplicadas na indústria do couro, tratamento de efluentes e vários processos de

biorremediação (Böckle et al., 1995; Mohamedin, 1999).


3

1.2. Biomassa Vegetal

Anualmente, o uso da biomassa (alimentos, combustíveis, fibras, materiais de construção

e muitos outros produtos) gera grandes quantidades de resíduos orgânicos, tais como resíduos

agrícolas, resíduos de madeira florestal, obtidos após processamento em indústrias madereiras,

resíduos da indústria papeleira, restos e resíduos do processamento alimentar e resíduos urbanos

sólidos (Klass, 1983; Ingram & Doran, 1995). Uma variedade de problemas ambientais e sociais

e a compreensão de que fontes fósseis são limitadas, tem estimulado investigações adicionais de

novas tecnologias para converter materiais lignocelulósicos renováveis em etanol combustível

e/ou outros substituintes do petróleo, levando em consideração ser essa uma fonte alternativa de

energia barata (Ingram & Doran, 1995; Aristidou & Penttilä, 2000).

A parede celular vegetal é o maior reservatório de fonte de carbono renovável fixado na

natureza, e contém três importantes constituintes poliméricos: a celulose (fibras insolúveis de β-

1,4-glucanas, correspondendo a cerca de 30-45% do peso total), as hemiceluloses

(polissacarídeos não-celulósicos, incluindo glucanas, mananas, arabinanas, galactanas e xilanas,

correspondendo a cerca de 25-45% do peso total) e a lignina (estrutura polifenólica complexa,

correspondendo a cerca de 15 a 30% do peso total). Sendo o principal componente do suporte

estrutural, a parede celular vegetal é construída para resistir a degradação microbiana (Klass,

1983; Aristidou & Penttilä, 2000). A distribuição relativa dos componentes lignocelulósicos na

parede celular do vegetal depende da espécie do vegetal e do estágio de crescimento e

desenvolvimento do mesmo (Prade, 1995). A composição monomérica do material

lignocelulósico pode variar amplamente, dependendo da fonte da biomassa (Tabela 1). Estes

elementos não tendem a se acumular na natureza, pois sofrem degradação microbiana, como

parte integrante do ciclo do carbono (Klass, 1983; Puls & Schuseil, 1993; Aristidou & Penttilä,

2000). Em geral, a fração de carboidratos contém primariamente açúcares tipo hexose, como a

glucose e em menor quantidade manose e galactose; entretanto, a fração de pentoses é mais

significante: xilose (5– 20%) e arabinose (1– 5%). A xilose é o segundo açúcar mais abundante

na natureza após a glucose e é ainda o mais comum em resíduos hemicelulósicos de hardwood

(Aristidou & Penttilä, 2000).


4

Tabela 1: Composição de diferentes biomassas vegetais com relação a presença (%) de carboidratos (pentoses C5 ou hexoses C6) e outros componentes.

Sabugo de milho

Farelo de trigo

Farelo de arroz

Casca de arroz

Fibra de bagaço-cana

Papel de imprensão

Carboidrato Glucose (C6) 39,0 36,6 41,0 36,1 38,1 64,4 Manose (C6) 0,3 0,8 1,8 3,0 - 16,6 Galactose (C6) 0,8 2,4 0,4 0,1 1,1 - Xilose (C5) 14,8 19,2 14,8 14,0 23,3 4,6 Arabinose (C5) 3,2 2,4 4,5 2,6 2,5 0,5 Total C6 40,1 39,8 43,2 39,2 39,2 81,0 Total C5 18,0 21,6 19,3 16,6 25,8 5,1 Não-carboidrato Lignina 15,1 14,5 9,9 19,4 18,4 21,0 Cinzas 4,3 9,6 12,4 20,1 2,8 0,4 Proteína 4,0 3,0 - - 3,0 - Fonte: Aristidou & Penttilä, 2000.

A degradação da parede celular vegetal por microrganismos é geralmente vista como um

processo enzimático, sendo um fenômeno complexo ainda não compreendido totalmente. Sabe-se

que certos microrganismos têm desenvolvido estratégias efetivas para invadir plantas e hidrolisar

polissacarídeos (Lequart et al, 2000). Em tecidos lignificados, a abertura da estrutura da parede

celular pode ser muito dificultada em parte pela presença de polímeros de lignina inseridos, o que

faz com que polissacarídeos se tornem menos acessíveis as celulases e hemicelulases microbianas

(Blanchette, 1995). A barreira de lignina na ligninocelulose pode ser removida pela utilização de

lignina peroxidases, deixando a estrutura mais susceptível ao ataque das celuloses e

hemiceluloses (Wong et al., 1988; Tuncer et al., 1999). Uma esquematização do arranjo

molecular da parede celular secundária do vegetal esta representada na Figura 1 (Bidlack et al.,

1992).


5

Figura 1: Esquema da estrutura da parede celular secundária vegetal. Os componentes são arranjados de forma que as cadeias de celulose e hemicelulose fiquem embebidas pela lignina. pCA – ácido p-coumárico FA – ácido ferúlico BA – ácido p-hidroxibenzóico AS – ácido sinápico CA - ácido cinâmico

Fonte: Bidlack et al., 1992


6

1.2.1. Celulose

A celulose, o maior carboidrato sintetizado pelos vegetais, é um polissacarídeo formado

por unidades residuais de β-D-glucose, que interagem entre si por ligações β-1,4 mantendo uma

estrutura linear e plana, sendo a celobiose, o dissacarídeo 4-O-β-D-glucopiranosil-D-

glucopiranose, a unidade repetitiva do polímero (Bayer & Lamed, 1992). A celulose é muito

rígida, e podem ser encontrados em sua estrutura cerca de 4000–8000 moléculas de glucose

conectadas por ligações β-1,4 (Aristidou & Penttilä, 2000).

Nas celuloses naturais, as cadeias se alinham de modo a formar fibrilas complexamente

organizadas, em estruturas ora cristalinas (regiões de alta ordem) ora amorfas (regiões de baixa

ordem). Estas fibrilas são estabilizadas entre si por ligações de hidrogênio inter-cadeias, que

individualmente são fracas, mas coletivamente resultam em uma força associativa considerável,

conferindo uma certa resistência à fibra celulósica (Bayer & Lamed, 1992). Outras ligações de

hidrogênio entre as cadeias adjacentes induzem-nas a interagirem fortemente umas com as outras

(Fig. 2). Desse modo, as microfibrilas se organizam em fibrilas maiores, que por sua vez são

organizadas em lamelas (finas camadas), formando uma rede de várias camadas da parede celular

do vegetal (Coughlan, 1990).

A estrutura da celulose pode ser avaliada por níveis ultraestruturais ou mesmo globais. A

nível global, a maioria das informações vem sendo obtida a partir de espectroscopia e

cristalografia. A nível ultraestrutural, a microscopia eletrônica de transmissão revela detalhes das

microfibrilas de celulose, refletindo os avanços tecnológicos nesta áera (Bayer et al, 1998).

Nos ambientes naturais, a celulose constitui cerca de 1/3 da matéria orgânica vegetal,

sendo o principal componente da parede celular em vegetais (Norkrans, 1967). Em contraste com

o amido, polímero de glucose de reserva, o papel da celulose é exclusivamente estrutural. A alta

força de tensão da celulose permite às células vegetais suportar a pressão osmótica e é

responsável pela resistência da planta ao estresse mecânico (Béguin & Aubert, 1994).

A decomposição da celulose parece depender da habilidade das enzimas responsáveis em

penetrar entre as cadeias adjacentes da fibra. O ataque às fibras de celulose é realizado pelos

microrganismos celulolíticos por intermédio das celulases, que agem em sítios onde a estrutura

do substrato é mais acessível, ou seja, onde a fibra perdeu seu aspecto reticulado (cristalino), em

proveito de um aspecto mais frouxo e amorfo (Bayer & Lamed, 1992; Béguin & Aubert, 1994).


7

a

b

Região Cristalina Região Cristalina Região Amorfa

Figura 2: Esquematização da estrutura da fibra de celulose. (a) Ligações de Hidrogênio entre as microfibrilas de celulose; (b) Disposição das microfibrilas, formando as regiões cristalinas e regiões amorfas da fibra celulósica. Fonte: Bhat, 2000.

1.2.2. Hemiceluloses

As hemiceluloses são polissacarídeos não-celulósicos que são encontrados em tecidos

vegetais, compostos de polímeros complexos de carboidrato, onde as xilanas e as glucomananas

são os principais componentes. Em paredes celulares de plantas terrestres, a xilana é o

polissacarídeo hemicelulósico mais comum, representando de 20–40% do peso seco do vegetal,

sendo depois da celulose, o polissacarídeo renovável mais abundante na natureza com um alto

potencial para a degradação em produto final utilizável (Béguin & Aubert, 1994; Sunna &

Antranikian, 1997; Thomson, 1993).


8

Os polímeros constituintes das hemiceluloses são de alto peso molecular, alguns

insolúveis ou mesmo associados a celulose e lignina. As hemiceluloses são também altamente

variáveis em suas estruturas, e, embora o número de ligações químicas diferentes seja limitado,

elas podem apresentar uma grande variabilidade em arranjos moleculares, podendo ser

classificadas como xilanas, arabinoxilanas, arabinanas, galactomananas, mananas,

arabinogalactana, entre outras (Fig. 3). A degradação eficiente do polímero requer uma ação

concernida de muitas enzimas que têm que trabalhar sinergisticamente (Shallom & Shoham,

2003). Como a hidrólise do polímero ocorre fora da célula, os microrganismos precisam

assegurar que pelo menos parte dos açúcares solúveis resultantes da hidrólise estarão disponíveis

para eles. Finalmente, as células necessitam de um mecanismo para sinalizar a presença do

polímero e induzir a produção das enzimas correspondentes. Juntando todos estes fatores, não

seria surpresa a natureza nos proporcionar uma espetacular variedade de estruturas modulares e

diferentes estratégias fisiológicas para degradar a parede celular vegetal (Shallom & Shoham,

2003).

De acordo com a literatura, existe uma ligação covalente entre a lignina e a hemicelulose,

provavelmente através da xilana, bem como evidências para a existência de uma outra ligação

entre arabinose e lignina, e uma ligação tipo éster entre a lignina e os ácidos glucurônicos

(Kulkarni et al., 1999). A presença de compostos fenólicos nas ligações cruzadas entre xilanas, e

entre xilanas e outros polissacarídeos também tem sido sugerida. Associações não-covalentes

entre as xilanas e outros carboidratos também podem ocorrer. As xilanas tendem a se adsorver a

celulose e a agregados por meio de ligações de hidrogênio, bem como também a outros

componentes hemicelulósicos (Thomson, 1993). As cadeias laterais determinam a solubilidade, a

conformação física e a reatividade da xilana com outros componentes hemicelulósicos e por isso

podem influenciar enormemente o modo e a extensão da clivagem enzimática, além de não

interferirem na geometria das ligações glicosídicas (Kulkarni et al., 1999).


9

Xilana

Xilobiose

Galacto-glucomanana

Manobiose

Α-1,6-L-Arabinana Arabinogalactana

Figura 3: Estrutura básica dos componentes encontrados na hemicelulose. A maioria das hemiceluloses prevalentes é do grupo das xilanas, compostas por unidades de D-xilopiranosil ligados por ligações glicosídicas do tipo β-1,4. β-Mananas também são grandes polímeros dentro das hemiceluloses, onde seu esqueleto principal é composto por ligações β-1,4 entre resíduos de manose–manose ou manose–glicose, ligados randomicamente. Fonte: Shallom & Shoham, 2003

A xilana é um polissacarídeo formado por unidades residuais de β-D-xilopiranosil

interagidos entre si por ligações β-1,4, sendo o principal componente hemicelulósico depositado

durante a fase de diferenciação do xilema (Flores et al., 1997; Gregory et al. , 1998; Nascimento

et al., 2002). Os constituintes mais comuns encontrados na cadeia principal da xilana são resíduos

de acetil, arabinofuranosil e/ou glucuronil (Sunna & Antranikian, 1997). Baseado nos

substituintes comuns encontrados na cadeia principal, as xilanas são categorizadas como


10

homoxilana linear, arabinoxilana, glucuroxilana e glucuroarabinoxilana. Entretanto, em cada

categoria delas existe uma heterogeneidade com respeito ao grau e natureza da ramificação. A

cadeia principal da xilana está demonstrada na Fig. 3. (Kulkarni et al., 1999).

A maioria das xilanas ocorre como heteropolissacarídeos, contendo diferentes grupos

substitutos na cadeia do esqueleto principal e em cadeias ramificadas. As homoxilanas, por outro

lado, consistem-se exclusivamente de resíduos de xilosil. Este tipo de xilana não é muito comum

em ambientes naturais e tem sido isolada de alguns tipos de grama, em caule de tabaco e em

casca da semente guar (Thomson, 1993; Sunna & Antranikian, 1997).

As xilanas de madeira existem como O-acetil-4-O-metilglucuroxilana em hardwood ou

como arabino-4-O-metilglucuroxilana em softwood (Kulkarni et al., 1999). Existem vários tipos

de hemiceluloses disponíveis no mercado, como por exemplo, xilana de madeira dura

(hardwood), xilana de madeira macia (softwood), xilana de bétula (birchwood), xilana de farelo

de aveia (oat spelts), xilana de lariço (larchwood) e xilana de gramíneas (grass), entre outras,

sendo todas extraídas de diferentes vegetais. As ligações glicosídicas encontradas em

hemiceluloses são facilmente hidrolisadas por ácidos diluídos a elevadas temperaturas, rendendo

um xarope contendo xilose e arabinose no caso de resíduos agrícolas e madeira dura ou manose,

xilose e glucose no caso de madeiras macias (Ingram & Doran, 1995).

1.2.3. Lignina

A lignina, a macromolécula aromática mais abundante da Terra, é construída a partir de

unidades de fenilpropano. Estes compostos fenólicos podem também estar envolvidos nas

ligações cruzadas entre moléculas de xilana e na ligação da xilana a outros polissacarídeos

(Tuncer et al., 1999). A lignina é encontrada na parede celular de vegetais, predominantemente

nos tecidos vasculares especializados para o transporte de líquidos em vegetais superiores, como

as gimnospermas e as angiospermas, e também em samambaias. Os precursores diretos da lignina

são os lignóis, representados pelas moléculas de coniferil, sinapil e p-coumaril (Higuchi, 1990;

Schoemaker, 1990).

Apesar de ser um composto macromolecular aromático, a lignina difere dos outros

componentes presentes na biomassa do vegetal, na medida que sua estrutura tridimensional não

possui ligações repetitivas entre os resíduos monoméricos constituintes da macromolécula.


11

Pela sua complexidade estrutural, a lignina confere rigidez à parede celular, e, nas porções

encontradas na madeira, age como um agente permanente de ligação entre as células, gerando

uma estrutura resistente ao impacto, compressão e dobra (D’Almeida, 1988).

1.3. Enzimas Lignocelulolíticas

Nos últimos 10 anos, têm-se observado um crescente interesse em sistemas enzimáticos

microbianos que degradem o principal componente hemicelulósico em vegetais, a xilana. Os

organismos procariotos hemicelulolíticos têm um papel fundamental na decomposição de

materiais de origem vegetal, em especial as bactérias do gênero Bacillus, que têm sido

frequentemente isoladas de solos, feno e adubos, dentre outros (Dahlberg, Holst & Kristjansson,

1993). Além disso, tanto bactérias aeróbicas quanto anaeróbicas podem degradar hemiceluloses

presentes em efluentes de indústrias de papel e de celulose (Sunna, Puls & Antranikian, 1996;

Chen, Chen & Lin, 1997). As arqueas e linhagens de bactérias termofílicas têm sido descritas

como sendo capazes de hidrolisar polissacarídeos complexos, incluindo a xilana. Os fungos e

actinomicetos produzem, em sua grande parte, xilanases extracelulares, o que diminui o custo

com sua recuperação em processamentos utilizando fermentadores para aplicação industrial ou

mesmo em processos de purificação. Este é o caso do Streptomyces cyaneus (Wang, Mason &

Broda, 1993) e Streptomyces malaysiensis (Nascimento et al., 2003), dos actinomicetos

termofílicos Thermomonospora sp. e Saccharomonospora sp. (Curotto et al., 1994) e dos fungos

termofílicos Penicillium janthinelum, Humicola grisea var. thermoidea e Thermomyces

lanuginosus (Monti, Terezin & Jorge, 1991; Hoq et al., 1995; Damaso, 2000). No entanto, a

maior parte das informações sobre enzimas xilanolíticas tem sido encontrada em publicações

sobre a aplicação de xilanases de estreptomicetos mesofílicos, no tratamento de polpas na

indústria do papel (Garg et al., 1996; Stutzenberger & Bodine, 1998). As xilanases e celulases de

actinomicetos são enzimas extracelulares induzidas, que são freqüentemente produzidas

simultaneamente (Ball & McCarthy, 1988, Nascimento et al., 2002).


12

1.3.1. Complexo Xilanases

A heterogeneidade e complexidade estrutural das xilanas resultam numa abundância de

enzimas xilanolíticas com variações na especificidade, nas sequências primárias e tamanho, além

das limitações destas enzimas pela especificidade ao substrato (Collins et al., 2005). Dentre as

enzimas do complexo enzimático destacamos as β-1,4-endoxilanases (β-1,4-D-xylan

xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), que despolimerizam a xilana pela hidrólise randômica do esqueleto

principal e as β-xilosidases (β-1,4-D-xyloside xylohydrolase; EC 3.2.1.37), que quebram

pequenos oligossacarídeos. Os grupamentos laterais presentes na xilana são liberados pela ação

das α-L-arabinofuranosidases, α-glucuronidases e acetilxilana esterases. Todas estas enzimas

agem cooperativamente, de modo a converter a xilana em seus açúcares constituintes (Fig. 4). A

presença de tais sistemas xilanolíticos multifuncionais é comum em bactérias e fungos (Sunna &

Antranikian, 1997; Birsan et al., 1998; Belfaquih & Penninckx, 2000; Subramaniyan & Prema,

2002).

As β-1,4-endoxilanases podem ser encontradas tanto em vegetais como em

microrganismos, incluindo as arqueas, as bactérias, os actinomicetos e os fungos (Coughlan &

Hazlewood, 1993; Nakamura, 1994, Nascimento et al., 2003). A hidrólise enzimática de

heteroxilanas vegetais envolve a ação de uma série de enzimas, na qual a β-1,4- endoxilanase é a

enzima crucial para a despolimerização completa da xilana (Biely et al., 1992, Biely, 1985).


13

2 |1αMeGlA

O

HH

H

OOH

H OH

H

CH3

OOH

O

HOH

H

H

OHH

OH

O

O

OHO

HH

H

H

HOHO

HO

OH

HH

H

H

O

HO

OH

HH

H

H

O

HO

OH

HH

H

H

OOH

HO

HH

H

H

OHO

H

CH3CH3

O

O

O

-4 lβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-Xi2 |1αMeGlA

α1 |3

2 |

Arab

Ac

Ac|3

Xilβ1-4Xilβ1-

endo -1,4-β−xilanase (E.C. 3.2.1.8)

β−xilosidase (E.C. 3.2.1.37)

α−glucuronidase (E.C. 3.2.1)

α−L- arabinofuranosidase (E.C. 3.2.1.55)

acetilesterase (E.C. 3.1.1.6)

Figura 4: Estrutura da xilana e os sítios de ataque das enzimas do complexo xilanolítico. O esqueleto principal é composto por resíduos de xilose ligados por ligações β-1,4. Ac.: grupo acetil α-araf.: α-arabinofuranose α-4-O-Me-GlcUA.: ácido α-4-O-metilglucurônico pcou.: ácido p-coumárico fer.: ácido ferúlico Fonte: Milagres et al., 2005

A maioria das β-1,4-endoxilanases hidrolisam as ligações glicosídicas internas ao longo

do esqueleto principal da heteroxilana, resultando num decréscimo no grau de polimerização

(DP) do substrato. O ataque ao substrato não é aleatório, e as ligações, para serem hidrolisadas,

dependem da natureza do mesmo. Durante a hidrólise inicial da xilana os principais produtos

formados são xilooligossacarídeos, os quais com a continuidade da hidrólise serão hidrolisados a

xilotriose, xilobiose e xilose (Sunna & Antranikian, 1997; Silveira et al., 1999).

As β-D-xilosidases são exoglicosidases que hidrolisam pequenos xilo-oligossacarídeos e

xilobiose de terminais não-redutores, liberando xilose (Sunna & Antranikian, 1997). São


14

produzidas por uma variedade de fungos e bactérias, podendo ser intra ou extracelulares, ou ainda

ligadas à membrana, dependendo do microrganismo produtor e do tempo de cultivo. Estas

enzimas podem ser proteínas mono ou diméricas, com valores de massa molecular na faixa de 60

a 360 kDa. A maioria das β-xilosidases, segundo estudos aprofundados, são completamente

inibidas pelo seu próprio produto de hidrólise, a xilose (Coughlan & Hazlewood, 1993; Sunna &

Antranikian, 1997).

Apesar da importância desempenhada pelas arabinosidases na hidrólise da xilana,

somente algumas enzimas têm sido isoladas e caracterizadas. As α-L-arabinofuranosidases têm

sido isoladas de várias fontes, incluindo plantas, bactérias e fungos. Existem dois tipos de

arabinosidases, aquelas de ação exo, como é o caso da α-L-arabinofuranosidase, que é ativa

contra p-nitrofenil-α-L-arabinofuranosídeo e arabinanas ramificadas, e aquelas de ação endo,

como o da 1,5-α-L-arabinase, que é ativa somente em arabinanas lineares (Coughlan &

Hazlewood, 1993; Sunna & Antranikian, 1997).

As α-D-glucuronidases hidrolisam as ligações α-1,2 entre o ácido glucurônico e resíduos

de xilose em glucuroxilanas. Apesar do papel desempenhado pela α-glucuronidases na

biodegradação da xilana, poucas enzimas têm sido detalhadamente descritas (Sunna &

Antranikian, 1997). A bactéria Fibrobacter succinogenes, isolada de rúmen, produz uma α-

glucuronidase que é incapaz de liberar ácido 4-O-metilglucurônico da xilana intacta. Esta enzima

é ativa contra fragmentos de glucuroxilanas de baixo peso molecular resultantes da hidrólise da

xilana por endoxilanase (Sunna & Antranikian, 1997).

A acetil-xilana esterase, libera substituintes de ácido acético diretamente da xilana

polimérica, removendo o grupamento O-acetil das posições C-2 e C-3 dos resíduos de xilose na

acetil-xilana. A troca da solubilidade dos polissacarídeos hemicelulósicos efetuada pela redução

da interação nas cadeias laterais também pode ser iniciada pela ação de enzimas que clivam as

cadeias laterais, tal como a acetil-xilana esterase (Puls & Schuseil, 1993). Outras esterases, como

por exemplo, a ácido fenólico esterase, fazem parte do sistema xilanolítico produzido por alguns

microrganismos, removendo o ferulato da cadeia principal da xilana (Coughlan & Hazlewood,

1993).

Muitas estruturas de xilanases estão descritas na literatura, e o mecanismo de ação de

várias β-1,4-endoxilanases tem sido estudado utilizando tanto a cinética como, técnicas de análise

dos produtos finais de hidrólise (Li et al., 2000). As enzimas xilanolíticas possuem diferentes


15

propriedades e especificidades, mesmo quando são da mesma fonte. Vários microrganismos são

capazes de produzir múltiplas xilanases, adicionalmente as outras enzimas do complexo

xilanolítico (Biely et al., 1997; Sunna & Antranikian, 1997; Collins et al., 2005). Estas, por sua

vez, apresentam diversas propriedades fisico-quimicas, estruturais, atividades específicas, bem

como a sobreposição de especificidades e desse modo aumentando a eficiência e extensão da

hidrólise, como também a diversidade e complexidade das enzimas. Alguns exemplos clássicos

de microrganismos que produzem isoenzimas xilanolíticas são Aspergillus niger, que produz 15

xilanases extracelulares, e o Trichoderma viridae, que secreta 13 xilanases (Collins et al., 2005).

Entretanto, a habilidade de sintetizar várias xilanases com especificidades sobrepostas, parece

trazer para o organismo a vantagem de garantir reservas de carbono e energia a partir da xilana e

também dos diferentes tipos de associações com outros polímeros (Bastawde, 1992; Coughlan,

1992). Contudo, as bactérias além da capacidade de secretar multiplas xilanases, também podem

produzir uma estrutura análoga ao celulossoma, o xilanossoma. Os xilanossomas são discretos,

multifuncionais, representando um papel chave na degradação de hemiceluloses. O complexo

xilanossomo extracelular B de Butyvibrio fibrisolvens H17c existe como uma proteína

multifuncional agregada com uma massa molecular aparente superior a 669 kDa (Jiang et al.,

2005; Pohlschröder & Leschine, 1994). Entretanto, existem poucos dados na literatura sobre as

propriedades fisico-químicas destes complexos xilanolíticos.

Baseados na similaridade das seqüências de ácidos aminados, as xilanases podem ser

divididas em 2 grandes famílias de glicosil hidrolases, a família 10 (F) e a 11 (G). A relação das

enzimas destas famílias pode ser demonstrada pelo alinhamento pareado da seqüência da proteína

ou pela utilização do programa BLAST, para discernir a similaridade entre as seqüências. Nas

pesquisas BLAST utilizando seqüências de xilanase, as Famílias 10 (F) ou 11 (G) identificam

conjuntos de enzimas que sejam mutualmente exclusivas (Jeffries, 1996). Pesquisas BLAST com

seqüências da Família 10 (F) têm grandes similaridades a β-1,3 e β-1,4-glucanase (Jeffries, 1996;

Ali et al., 2001). A Família 10 (F) das xilanases consiste de um domínio ligante de celulose e um

domínio catalítico conectado por uma região ligante flexível. A Família 11 (G) é composta de

endoxilanases de baixo peso molecular altamente específicas, encontradas em procariotos e

eucariotos, onde a identidade das seqüências varia de 40-90% (Törronen & Rouvinen, 1997).

Um dos sistemas xilanolíticos melhor caracterizado em termos de isoformas de β–1,4–

endoxilanases é o de Streptomyces lividans. Este microrganismo produz um sistema que é


16

composto de 3 β–1,4–endoxilanases codificadas por 3 diferentes genes xln, designados xlnA, xlnB

e xlnC. XlnA faz parte da família F das glucanases, que mostra atividade de exoxilanase e

endoglucanase. Por outro lado, XlnB e XlnC são membros da família G (Biely et al., 1993;

Sunna & Antranikian, 1997). Vários fatores podem ser responsáveis pela multiplicidade das

xilanases. Isto inclui processamento diferencial do RNAm, modificação pós-secrecional por

digestão proteolítica e modificação pós-traducional como glicosilação e autoagregação. As

múltiplas xilanases podem ser um produto de diferentes alelos do mesmo gene. Entretanto,

algumas das xilanases múltiplas são resultados de genes independentes, ou seja, de genes que não

estão relacionados entre si (Biely, 1985).

1.3.2. Complexo Celulases

A estrutura da celulose pode ser clivada por intermédio de enzimas que reconhecem

ligações β-1,4 entre moléculas de glucose, denominadas celulases (Aristidou & Penttilä, 2000).

As celulases são membros da família de glicosil hidrolases, que hidrolizam oligossacarídeos e/ou

polissacarídeos (Bayer et al., 1998). As etapas envolvidas na degradação microbiana da celulose

ainda não estão totalmente esclarecidas. Sendo a célula microbiana impermeável à molécula

polissacarídica, esta deve ser clivada pela ação das celulases, sintetizadas intracelularmente e

liberadas para o meio extracelular (Ghosh & Ghosh, 1993). As celulases são produzidas como um

sistema multienzimático, compreendendo basicamente 3 enzimas que agem sinergisticamente na

hidrólise da celulose: endoglucanases (E.C. 3.2.1.4), que clivam randomicamente o polímero de

celulose, alterando rapidamente o grau de polimerização da celulose, as celobiohidrolases (E.C.

3.2.1.91), que hidrolizam o polímero nos terminais não-redutores, liberando celobiose e as

celobiases (β-glucosidase, E.C. 3.2.1.21) que são responsáveis pela clivagem de pequenas cadeias

de celooligossacarídeos e celobiose a glucose, utilizada nas vias metabólicas do microrganismo

(Wood & Garcia-Campayo, 1990; Pérez Pons et al., 1995; Aristidou & Penttilä, 2000; Cao &

Tan, 2002).

As celulases são enzimas modulares que são compostas independentemente do formato

(α/β), unidades estruturais e funcionalmente discretas, referidas tanto como domínios como

módulos (Bayer et al., 1998). A hidrólise da celulose é acompanhada tanto pela inversão quanto

pela retenção da configuração do carbono anomérico, onde em ambos os casos, é catalisada


17

primariamente por 2 grupos carboxilas localizados no sítio ativo da enzima. As celulases

bacterianas e fúngicas usualmente compreendem 2 ou mais domínios estruturais e funcionais, tal

como um domínio catalítico associado ao domínio celulose-ligante (CBD) comumente

organizados em enzimas de sistemas não complexados de organismos aeróbios, e um domínio

catalítico associado a um domínio dockerin, responsável pelo complexo celulosomo, comumente

organizado em enzimas com sistemas complexados de alguns organismos anaeróbios (Ohmiya et

al., 1997, Bayer et al., 1998). Em adição, muitas celulases incluem um domínio homólogo a

camada S (SLH), domínio fibronectina III, domínio NodB-like e varias regiões com funções

desconhecidas. Estes domínios são frequentemente conectados por sequências ligantes

enriquecidas em ácidos pro e hidroxiaminos (Treonina e Serina). Dentre os vários domínios, os

domínios catalítico e celulose-ligante são geralmente reconhecidos por serem importantes para a

hidrólise da celulose (Tomme et al., 1995, Ohmiya et al., 1997).

1.4. Proteases

As proteases (peptidases) são uma classe única de enzimas que catalisam a hidrólise das

proteínas através da clivagem de ligações peptídicas. De acordo com a nomenclatura enzimática,

as proteases são classificadas no subgrupo 4 do grupo 3 das hidrolases (International Union of

Biochemistry, 1992). Entretanto, devido a imensa diversidade de ação e estrutura, as peptidases

não obedecem facilmente ao sistema de classificação e nomenclatura criado para as enzimas em

geral. Tal fato tem gerado esforços para o desenvolvimento de outras formas de classificação para

este grupo em particular. Três critérios estão atualmente em uso para a classificação das

peptidases: a reação catalisada, a natureza química do sítio catalítico e a relação evolucionária

revelada pela sua estrutura. De acordo com a nomenclatura sugerida pelo sistema MEROPS, as

peptidases estão subdivididas em dois grupos principais dependendo do seu sítio de ação: as

exopeptidases e as endopeptidases (Rawlings et al., 2006).

As exopeptidases clivam a ligação peptídica próxima ao terminal amino ou carboxi das

cadeias polipeptídicas presentes no substrato. Baseado no seu sítio ativo de ação, no terminal C

ou N, elas são classificadas como carboxi ou aminopeptidases, respectivamente. As

aminopeptidases atuam no terminal N livre da cadeia polipeptídica e liberam um resíduo único de

aminoácido, ou dipeptídeo, ou um tripeptídeo. Elas ocorrem numa ampla variedade de espécies


18

microbianas incluindo bactérias e fungos, em geral intracelularmente (Morihara & Tsuzuki,

1971). As carboxipeptidases atuam no C terminal de uma cadeia polipeptídica e liberam um

aminoácido simples ou um dipeptídeo, e podem ser divididas em 3 grupos maiores: serina-

carboxipeptidases, metalo-carboxipeptidases e cisteína-carboxipeptidases (Rao et al., 1998).

As endopeptidases clivam as ligações peptídicas nas regiões interiores da cadeia

polipeptídica distante do terminal amino ou carboxi. A clivagem proteolítica de ligações

peptídicas é uma das modificações mais freqüentes que ocorre nas proteínas. A presença de um

aminoácido livre e de um grupo carboxi tem uma influência negativa na atividade enzimática

(Priest, 1977; Rawling et al., 2006). Baseado no grupo funcional presente no sítio ativo, as

endopeptidases são classificadas em 6 grupos com base na seqüência de aminoácidos

provenientes como: glutâmico-peptidase, serina-peptidases, cisteína-peptidases, aspártico-

peptidases e metalo-peptidases.

As serina-peptidases são caracterizadas pela presença de um aminoácido serina no seu

sítio ativo. Elas são numerosas e amplamente distribuídas entre os vírus, bactérias e eucariotos,

sugerindo que elas são vitais aos organismos. Elas podem ser classificadas em 3 grupos, baseados

principalmente na sua preferência primária ao substrato: o tipo tripsina que cliva após resíduos

positivamente carregados, o tipo quimiotripsina que cliva após grandes resíduos hidrofóbicos e o

tipo elastase, que cliva após pequenos resíduos hidrofóbicos (Rao et al., 1998). Ja as metalo-

peptidases são as proteases mais diversas em relação ao sítio catalítico e ao mecanismo de ação,

diferindo sutilmente das demais peptidases. Elas dependem da presença de ligações de cátions

divalentes e podem ser inativadas por diálise ou pela adição de agentes quelantes. Elas incluem

enzimas de uma variedade de origens tais como as colagenases de organismos superiores, toxinas

hemorrágicas de venenos de cobras e termolisina de bactérias (Rao et al., 1998).

Devido a sua ocorrência em todas as formas de vida, as peptidases são importantes na

condução de funções metabólicas e regulatórias, e apresentam um papel crítico em muitos

processos fisiopatológicos tendo inclusive sido cogitadas como fatores de virulência numa

variedade de doenças causadas por microrganismos patogênicos (Brown, 1994). Os

microrganismos representam uma excelente fonte de enzimas por possuírem várias características

como ampla distribuição na natureza, crescimento rápido, espaço limitado para o cultivo, ampla

diversidade bioquímica e susceptibilidade a manipulação genética, propiciando toda uma geração

de novas enzimas com propriedades alteradas. O crescente interesse por enzimas microbianas


19

deve-se a falta de habilidade das peptidases de origem vegetal e animal em atender a demanda do

mercado mundial. Além deste fato, as peptidases microbianas possuem quase todas as

características desejadas para aplicações biotecnológicas (Rao et al, 1998).

As enzimas proteolíticas sintetizadas por microrganismos têm se tornado um atrativo para

pesquisas devido a sua ampla aplicação nas diferentes áreas da indústria e medicina, bem como

pela sua participação no metabolismo microbiano. Elas têm sido utilizadas nas indústrias do

couro, farmacêutica e de alimentos, na hidrólise de substratos utilizados na preparação de meios

microbiológicos e na alimentação parenteral, preparação de detergentes e em cosméticos. Na

medicina, preparações enzimáticas são particularmente importantes para a limpeza de

queimaduras, na remoção de tecidos necrosados e para lise de coágulos sanguíneos (Landau &

Egorov, 1996).

Os estreptomicetos produzem uma variedade de peptidases extracelulares, incluindo

serina, metalo, endopeptidases, amino e carboxipeptidases com especificidade por vários

substratos, alem de produzirem também vários inibidores de peptidases (Chandrasekaran & Dhar,

1987). As várias peptidases obtidas de estreptomicetos, como as serina-peptidases de S.

exfoliatus, serina e metalo-peptidases de S. lactamdurans e serina-peptidase de S. pactum, estão

envolvidas na assimilação de fontes protéicas de nitrogênio, na degradação de micélio aéreo, em

processos de esporulação e na produção de antibióticos (Ginther, 1979; Kim & Lee, 1996). Como

na maioria das peptidases microbianas, a secreção dessas enzimas proteolíticas extracelulares em

actinomicetos, particularmente Streptomyces, ocorre no fim da fase logarítmica de crescimento,

geralmente coincidindo temporariamente com a produção de metabólitos ou diferenciação celular

na fase estacionária (Kim & Lee, 1996, Nascimento et al., 2005).

1.5. Aplicações Biotecnológicas das Xilanases, Celulases e Peptidases

Uma crescente necessidade de preparações enzimáticas, a partir de fontes diferentes das

clássicas, vem estimulando a busca no universo microbiano (Peczynsha-czoch & Mordarski,

1988). Atualmente, as enzimas são comumente utilizadas em muitas aplicações industriais, e a

demanda por enzimas mais estáveis, altamente ativas e específicas está crescendo rapidamente.

Estimou-se em 1995, que a venda mundial de enzimas industriais superou a quantia de 1 bilhão

de dólares, enquanto que o mercado mundial para enzimas industriais é esperado ser em torno de


20

1,7 a 2,0 bilhões de dólares para o ano de 2006, podendo ser cada vez maiores. De acordo com

dados da literatura, as enzimas industriais têm realmente atingido um mercado de 1,6 bilhões de

dólares. Interessantemente, 60% da fonte do mercado mundial das enzimas industriais se

encontra na Europa e os 40% restantes nos EUA e Japão. Aproximadamente 75% das enzimas

industriais são hidrolases, onde as carbohidrolases são o segundo maior grupo das hidrolases

industriais (Demain, 2000, Bhat 2000).

O estudo na área de biotecnologia das celulases e hemicelulases teve início nos anos 80,

primeiramente em rações animais, e depois aplicações nas indústrias alimentícias.

Subsequentemente, estas enzimas foram utilizadas nas industrias têxtil, lavanderia, bem como nas

indústrias de papel e celulose. Durante as últimas duas décadas, o uso de celulases e

hemicelulases tem aumentado consideravelmente, especialmente nas indústrias têxtil, alimentícia,

panificação, vinho, bem como nas indústrias de papel e celulose (Godfrey & West, 1996; Uhlig

1998, Bhat 2000). Hoje em dia, estas enzimas contabilizam uma fatia aproximada de 20% do

mercado mundial de enzimas, sendo a maioria produzida por Aspergillus e Trichoderma (Bhat

2000). As celulases, hemicelulases e peptidases tem um amplo potencial de aplicações nas

diversas áreas industriais.


21

1.5.1. Xilanases

INDÚSTRIA APLICAÇÃO FUNÇÃO REF.

Processamento de frutas e vegetais, produção de

vinho, cervejaria

Sucos de frutas e vegetais, néctares e purês, óleos (azeite de oliva, óleo de milho) e vinhos.

Melhorar a maceração e clarificação dos sucos, redução da viscosidade. Melhorar o rendimento da extração e filtração, desempenho do processo e qualidade do produto

Collins et al. 2005, Bhat 2000, Galante et al. 1998b, Wong & Saddler 1993.

Panificação Produtos derivados do pão Melhorar a elasticidade e a força da massa do pão, permitindo desse modo, facilitar a manipulação, aumentar o volume do pão e textura do pão melhorada.

Dutron et al. 2004, Bhat 2000, Maat et al., 1992

Ração Animal Ração monogástrica (aves domésticas e suínos) e ruminante

Diminuição do teor de polissacarídeos não amiláceos, reduzindo desse modo a viscosidade intestinal e melhorando a utilização de proteínas e amido. Melhorar o desempenho animal, aumentando a digestabilidade e o valor nutritivo de alimentos de dificil digestão (cevada e trigo).

Bhat 2000, Mathlouthi et al. 2002

Polpa e Papel Biobranqueamento de polpas Kraft, Polpagem biomecânica, Biomodificação das fibras, Biodescoloração

Redução do consumo de cloro e descargas tóxicas, Facilitação do processo de polpagem e redução do uso de métodos mecânicos de polpagem, reduzindo o consumo de energia, Melhoramento da fibrilação e das propriedades de drenagem da polpa, melhorando a eficiência do processo e a força do papel, Facilita o processo de descoloração e redução do uso de álcalis.

Collins et al. 2005, Beg et al. 2001, Viikari 1994, Bhat 2000, Pala et al. 2004

Amido Separação do glúten Redução da viscosidade, melhora a aglomeração do glúten e a eficiência do processo.

Frederix et al. 2003

Têxtil Maceração do linho, rami, cânhamo

Maceração enzimática, redução e substituição dos métodos químicos de maceração

Beg et al., 2001, Sharma 1987.

Biorremediação / Bioconversão

Tratamento de efluentesagrícolas, municipais e da indústria de alimentos

Tratamento e Reciclagem de efluentes. Produção de produtos fermentáveis, combustível renovável (bioetanol) e química fina.

Mielenz 2001, Saha 2003.


22

1.5.2. Celulases


Alimentos

Melhoramento na prensagem e extração de suco de frutas e óleos de olivas, liberando o sabor, enzimas, proteinas, polissacarídeos, amido e agar

Melhoramento na eficiência de molhagem, absorção homogênea da água pelo cereal, qualidade nutritiva de alimentos fermentados, produção de oligossacarídeos como alimentos funcionais e conversão de biomassa, rehidratação de vegetais secos e sopas;

Controlador de doenças do sistema cardíaco, como coronárias e arteriosclerose, redução do desperdício de comida

Hidrólise da celulose, diminuição da viscosidade mantendo a textura de sucos de frutas

Hidrólise parcial ou completa de celulose substituída

Liberação de antioxidantes de frutas e cascas de vegetais

Bhat 2000

Heldt-Hansen 1997

Ração Animal

Melhoramento na qualidade nutricional da ração animal e consequentemente o desempenho dos ruminantes e monogástricos

Hidrólise parcial de materiais lignocelulósicos, descascagem de grãos de cereais, hidrólise de β-glucanas, diminuição da viscosidade intestinal, melhor emulsificação e flexibilidade de materiais alimentícios

Bhat 2000

Galante et al. 1998b

Têxtil e Lavanderia

Bioestonagem do tecido denim; produção de sabão em pó de alta qualidade e não-poluente

Biopolimento de algodão e tecidos não-denim

Remoção do excesso de corantes do tecido denim; amaciar a tela de algodão sem danificar a fibra

Remoção do excesso de microfibrilas da superfície do algodão e tecidos não-denim

Bhat 2000

Galante et al. 1998a

Papel e Celulose Polpagem biomecanica; modificação das propriedades das fibras; descoloramento de fibras recicladas

Modificação mecânica da polpa grossa e das propriedades da força da folha de mão; hidrólise parcial de carboidratos e liberação do corante da superficie da fibra

Bhat 2000


23

1.5.3. Peptidases


Detergentes / Lavanderia

Remoção de resíduos protéicos em lentes de contato, dentadura, tecidos e pratos

Combinada com lipases, celulases e amilases, atuam de forma mais eficiente na hidrólise de manchas proteináceas em tecidos e pratos (serina peptidase)

Rao et al. 1998

Curtume Remoção de couro animal e pele assistida por proteases alcalinas

Hidrólise seletiva de constituintes não-colágenos da pele e remoção de proteínas não-fibrilares, como albumina e globulinas (elastina e querastina)

Rao et al. 1998

Biorremediação Remoção de residuos protéicos (penas, chifres, pelos)

Conversão de resíduos em biomassa aproveitável, proteina animal concentrada ou aminoácidos obtidos de hidrólise parcial (endopeptidases)

Rao et al. 1998

Alimentícia Fabricação de queijos

Remoção do glúten do trigo, melhoramento da extensibilidade e força da massa do pão

Hidrólise de ligações peptídicas específicas (Phe105-Met106) para gerar para-k-caseína e macropeptídeos, preferencialmente realizada pela quimosina (aspártico peptidase)

Hidrólise limitada do glúten do trigo, melhorando a expansão e resistência da massa, além de reduzir o tempo de mistura, resultando em pães mais volumosos (endo e exopeptidases)

Rao et al. 1998

Luecke et al. 1996

Anwar & Saleemuddin 1998

Farmacêutica Tratamento de queimaduras e feridas

Auxiliar digestivo

Tratamento de leucemia

Hidrólise parcial da fibra colágena, diminuindo o tempo e melhorando as condições de recuperação (colagenase)

Correção, via oral, em indivíduos com distúrbios nas enzimas líticas do trato digestivo (tripsina e quimotripsina)

Remoção de resíduos de asparagina nos diferentes linfócitos (asparaginase)

Rao et al. 1998

Chiplonkar et al. 1985

1.6. Otimização e Desenho Experimental

O método de desenho experimental pode ser amplamente encontrado em diversas

áreas, sendo uma ferramenta criticamente importante na engenharia para aumentar o

desempenho de processos de produção (Montgomery, 1997). A pronta aplicação de técnicas

de desenho experimental pode resultar em: (i) rendimento do processo aumentado; (ii) tempo

de desenvolvimento reduzido; (iii) custos totais reduzidos; (iv) variabilidade reduzida e

conformidade mais próxima do requerimento alvo (Montgomery, 1997).

Em um experimento de caracterização, usualmente determina-se as variáveis do

processo que afetam a resposta. A etapa mais lógica a seguir será a otimização, para a qual é

necessário determinar a região de importância em que os fatores podem dar uma melhor

resposta (Montgomery, 1997). A otimização pode ser dividida em estágios que caracterizam-

se por: (i) definição da função objetivo (resposta), podendo ser observado um ou mais

critérios; (ii) determinação dos fatores (variáveis) que apresentam influências significativas

sobre a resposta que deseja-se otimizar; (iii) otimização propriamente dita, isto é, procurar a

combinação dos valores dos fatores selecionados que resultem na melhor resposta

(maximização ou minimização).

Um procedimento criterioso para a otimização deve envolver as seguintes etapas de:

(i) Realização de experimentos de varredura para caracterizar as variáveis do sistema, usando

um planejamento fatorial; (ii) Localização da região ótima ou ideal usando o método simplex;

(iii) Certificação e/ou ajuste fino da região ótima, usando planejamento fatorial e/ou superfície

de respostas, dependendo de quão apurados se desejam os resultados (Eiras et al., 1994;

Fisher, 1935).

Muitos experimentos envolvem o estudo de efeitos de 2 ou mais fatores. Geralmente,

os desenhos fatoriais são mais eficientes para este tipo de experimento. O planejamento

fatorial tem sido muito aplicado em pesquisas básicas e tecnológicas e é classificado como um

método do tipo simultâneo, no qual as variáveis de interesse que realmente apresentam

influências significativas na resposta são avaliadas ao mesmo tempo (Routh et al., 1977). Para

realizar um planejamento fatorial, escolhem-se as variáveis a serem estudadas e efetuam-se

experimentos em diferentes valores destes fatores. A seguir, um exemplo demonstrará

experimentos realizados para todas as combinações possíveis dentro dos níveis selecionados

(Barros Neto et al., 1995; Brereton 1987; Montgomery, 1997).

De um modo geral, o planejamento fatorial pode ser representado por ba, no qual "a" é

o número de fatores e o "b" é o número de níveis escolhidos. Em função do número de fatores

e de níveis, o planejamento fatorial pode ser indicado como sendo 2³, quando são estudados 3

variáveis, sugerindo que o número de experimentos diferentes sejam 8.

Em geral, os planejamentos fatoriais do tipo 2ª são os mais comuns. Um dos aspectos

favoráveis deste tipo de planejamento é a realização de poucos experimentos. Entretanto, a

utilização de um número reduzido de níveis não permite explorar de maneira completa uma

grande região no espaço das variáveis. Entretanto podemos observar tendências importantes

para a realização de investigações posteriores. Contudo, alguns cuidados devem ser

observados para que se possa obter o máximo de informação na realização do planejamento

fatorial. As replicatas devem ser repetições autênticas, devendo representar adequadamente o

espaço experimental no qual o planejamento fatorial foi desenvolvido. Outro cuidado a ser

observado refere-se à realização dos experimentos. É importante que todos os ensaios e

replicatas previstos no desenvolvimento do fatorial sejam realizados de forma aleatória. Estes

cuidados visam evitar distorções estatísticas que possam comprometer a qualidade dos

resultados obtidos e dos efeitos calculados para as variáveis estudadas.

Nos planejamentos experimentais em que as variáveis são exploradas em 2 níveis é

comum codificá-los usando os sinais (+) e (-). A atribuição destes sinais aos níveis superiores

ou inferiores é feita de forma arbitrária e não interfere na realização dos experimentos ou

interpretação dos resultados, além de permitir esquematizar o planejamento na forma de

matrizes. Os efeitos são definidos como "a mudança ocorrida na resposta quando se move do

nível baixo (-) para o nível alto (+)" e podem ser classificadas em duas categorias: efeitos

principais e efeitos de interação. Para o cálculo dos efeitos, além da codificação das variáveis

utilizando os sinais (+) e (-), é necessário incluir mais colunas na matriz de planejamento. O

conteúdo das novas colunas representa o efeito de interação entre as variáveis e é obtido

levando-se em consideração os sinais já atribuídos às variáveis envolvidas, como se fosse uma

operação matemática de multiplicação. A resposta seria, por exemplo, o rendimento de uma

planta piloto industrial.

O efeito principal é calculado como a média dos efeitos individuais e permite definir

qual o efeito médio da variável examinada sobre as condições das demais variáveis, usando a

Tabela de Coeficientes em Contrastes [sinais (+) e (-)]. Matematicamente o efeito principal

pode ser representado por:

Efeito Principal = 2 (Σy+ - Σy-) / (ba)

Onde: y corresponde a média dos efeitos individuais da medida, (+) e (-) corresponde ao nível

alto e nível baixo e ba corresponde ao número total de experimentos do planejamento.

Pode-se demonstrar que, para um fatorial do tipo 2ª, a estimativa da variância dos

efeitos pode ser dada por:

Onde: n corresponde ao número de replicatas de cada conjunto, a é o número de fatores e S² é

a estimativa amostral da variância da população.

Assumindo-se que existem n replicatas para cada um dos 2ª experimentos do

planejamento, e se yi1, yi2, yi3, ..., yin são observações do i-ésimo experimento, pode-se então

dizer que:

é uma estimativa da variância para o i-ésimo experimento, em que i=1,2,3,..., 2a e a

respectiva média. Combinando-se as estimativas dos 2ª experimentos, tem-se a estimativa da

variância total:

Considerando-se então que S² é uma boa estimativa da variância populacional σ2,

pode-se escrever que:

A interpretação do resultado pode ser facilitada com o auxílio da Figura 5, na qual

estão representadas graficamente as respostas obtidas para os experimentos realizados como

função das variáveis estudadas. Este tipo de representação é bastante utilizada e tem como

objetivo fornecer uma visão global de como as variáveis otimizadas atuam sobre a resposta do

sistema exemplificado.

Figura 5: Representação de um exemplo de fatorial 2³

O planejamento fatorial não determina valores ótimos em uma única etapa, porém este

procedimento indica satisfatoriamente o caminho a ser tomado para que se possa atingir o

objetivo proposto.

1.7. Biotecnologia e Processos Fermentativos

A fermentação é uma das tecnologias mais antigas conhecidas pelo Homem. As

capacidades fermentativas dos microrganismos ja têm sido utilizadas há milhares de anos.

Usualmente, os microrganismos degradam fontes de carbono e energia de alta massa

molecular em pequenas moléculas, convertendo-as em aminoácidos, nucleotídeos, vitaminas,

carboidratos, ácidos graxos e finalmente utilizam estes materiais básicos na construção de

proteínas, co-enzimas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e lipídeos, utilizados para o seu

próprio crescimento e manuntenção (Sanchez & Demains, 2002).

Na prática, o termo fermentação pode apresentar diferentes significados. O clássico

significado bioquímico relaciona a geração de energia ao catabolismo de compostos

orgânicos, enquanto que o significado na microbiologia industrial tende a ser muito mais

amplo. Na indústria, a fermentação não é muito utilizada no seu significado clássico, mas tem

sido extendido a descrever qualquer processo químico catalisado por sistemas enzimáticos

microbianos, que por sua vez são produzidos durante a fase de crescimento do microrganismo

(Scragg, 1991; El-Mansy & Bryce, 1999). A fermentação é utilizada para produzir materiais

por uma via que poderia ser complicada ou ser muito despendiosa se métodos químicos

específicos fossem escolhidos para a síntese e, por vezes, é o único caminho a ser adotado.

Adicionalmente, centenas de enzimas têm que ser sintetizadas e agirem de uma maneira

integrada. O metabolismo tem que ser coordenado para garantir que, em qualquer momento

particular, somente as enzimas necessárias e a quantidade de cada uma delas, seja sintetizada

(Sanchez & Demain, 2002). Uma vez que, em particular, quantidade suficiente de um

determinado material é produzida, as enzimas envolvidas na etapa de formação não tardam a

serem sintetizadas e o desempenho da atividade das enzimas controlado por um número de

mecanismos regulatórios específicos. Desta forma, normalmente as células não produzem

metabólitos em excesso, mesmo em seu ambiente, permitindo uma espécie competir

eficientemente com outras formas de vida e sobreviver na natureza. Alguns dos importantes

mecanismos de controle responsáveis por estas funções são: a indução pelo substrato, a

regulação por feedback e a regulação nutricional. A modificação de tais mecanismos em

certos microrganismos tipo-selvagem, isolados da natureza e/ou a modificação feita

intencionalmente em laboratórios rendem superprodução de certos metabólitos primários e

secundários (enzimas, antibióticos). Esta é a essência da fermentação e dos bioprocessos

industriais (Sanchez & Demain, 2002).

Os bioprocessos compreendem um conjunto de operações que incluem o tratamento da

matéria-prima, o preparo de meios de propagação e produção, a esterilização, fermentação,

separação e a transformação do substrato em produto(s) por rota bioquímica. A distinção entre

bioprocessos e processos químicos esta baseado na natureza dos catalisadores utilizados em

suas reações. Os bioprocessos são conduzidos mediante ação de microrganismos, células

animais ou vegetais, ou ainda de enzimas por elas produzidas, sendo, entretanto todas as

transformações dos bioprocessos catalisadas enzimaticamente (Bon & Pereira Jr., 1999).

Algumas transformações microbianas, analogamente as reações químicas, atingem

rendimentos próximos ao máximo estequiométrico (produtos do metabolismo primário),

embora apresentando taxas globais de produção reduzidas. Outras transformações, como as

resultantes do metabolismo secundário resultam em baixos valores de rendimento e

produtividade, havendo enorme campo para avanços em ambos os casos. Os progressos serão

alcançados através da maior compreensão da fisiologia microbiana e da interação do

microrganismo com o ambiente químico e fisico no biorreator (McNeil & Harvey, 1990; Bon

& Pereira Jr., 1999).

A mistura reacional constituída de meio de cultivo (fermentação) e microrganismo é

processada em biorreatores, mantidos sob condições ideais para o microrganismo expressar o

máximo de sua atividade metabólica. No biorreator, vários fenômenos químicos, fisicos e

biológicos ocorrem concomitantemente. Assim sendo, o desenvolvimento de bioprocessos

constitui em uma das mais complexas e fascinantes áreas de atuação da Engenharia

Bioquímica. No projeto de um biorreator, devem ser levados em consideração os seguintes

aspectos: (i) a cinética microbiana (ou enzimática), (ii) o cálculo das tubulações e

equipamentos necessários para manutenção da esterilidade, (iii) as características

hidrodinâmicas do meio de fermentação, (iv) a transferência de massa de nutrientes na célula,

(v) a transferência de massa de oxigênio da fase gasosa para a fase líquida e para as células,

(vi) a transferência de massa de produtos e subprodutos das vizinhanças das células para o

meio de fermentação, (vii) a transferência de calor metabólico e (viii) o controle da fisiologia

microbiana (Demain & Solomon 1986; Bon & Pereira Jr., 1999).

Atualmente, podemos observar uma grande variedade de configurações de

biorreatores, sendo os biorreatores agitados mecanicamente (STR – stirred tank reactor) os

mais estudados e mais utilizados pelas indústrias. Apesar da sua flexibilidade, os biorreatores

do tipo STR apresentam certas desvantagens, como: (i) demanda de grande aporte energético

para agitação mecânica, (ii) tendência a afetar a morfologia microbiana, e (iii) dificuldade em

fazer escalonamento. A Fig. 6 ilustra algumas das configurações possíveis que um biorreator

do tipo STR pode apresentar (Ansejo & Merchuck, 1995, Bon & Pereira Jr., 1999).

Figura 6: Configurações de biorreatores do tipo STR.

As principais subdivisões de um biorreator de bancada são: (i) componentes-base

incluem um motor de agitação e desmultiplicador, calefação e sistema de resfriamento,

bombas, controle de gás, etc; (ii) coluna de líquido e acessórios; (iii) equipamentos periféricos

(incluindo recipientes para preparação de meios de cultura); (iv) instrumentação, sensores e

controle.

Estes componentes, por sua vez, combinam para melhorar as seguintes funções: (i)

fornecer uma operação livre de contaminantes; (ii) manter uma temperatura específica; (iii)

controlar o pH da cultura; (iv) permitir o monitoramento e/ou controle do oxigênio dissolvido;

(v) permitir a alimentação de solução de nutrientes e reagentes; (vi) fornecer pontos de acesso

para inoculação e amostragem; (vii) usar encaixes e geometria relevante para escalonamento;

(viii) minimizar a perda de líquido da coluna; (ix) facilitar o crescimento de uma ampla faixa

de organismos (El Mansi & Bryce, 1999).

A forma mais utilizada de condução de um bioprocesso é a Batelada Simples. O

principal problema deste modo de operação é decorrente de fenômenos de inibição pelo

substrato, produto, ou outros metabólitos. Algumas razões podem explicar a inibição do

agente biológico por altas concentrações de substrato, como a repressão na síntese de enzimas

e a desidratação dos sistemas enzimáticos, devido à perda de água da célula ou à inibição do

transporte de nutrientes para o seu interior. Entretanto, uma maneira de contornar este

problema é através da operação denominada Batelada Alimentada, que possibilita a

manutenção da concentração desses inibidores/repressores em níveis sub-inibitórios/sub-

repressores, com implicações diretas no desempenho do biocatalisador. A batelada alimentada

é definida como um modo de operação em que um ou mais nutrientes necessários ao

crescimento celular são adicionados ao biorreator intermitentemente ou continuamente, sem

que ocorra a retirada de material durante a operação. Bateladas alimentadas podem ser

operadas sob diversas formas, através do ajuste da taxa de alimentação, utilizando-se

controles feedforward ou feedback (Bon & Pereira Jr., 1999). Uma das vantagens de se

utilizar a batelada alimentada é que uma maior variedade de meios de cultivo pode ser

utilizada sem que ocorra repressão na formação de produtos, como mencionado

anteriormente.

Uma das características da produção de enzimas extracelulares, assim como de outros

produtos decorrentes do metabolismo secundário, é que estas biomoléculas não são, em geral,

produzidas durante a fase exponencial em um biorreator operado sob batelada. Na produção

de enzimas, é comum a utilização de meios de cultivo quimicamente complexos e de baixa

solubilidade, que são metabolizados lentamente pelo microrganismo. Por sua vez, a produção

pode ser por fermentação submersa ou semi-sólida. Os processos submersos apresentam

grandes vantagens sobre os processos conduzidos em superficie sólida, como fácil

manipulação, maior volume de meio, submersão total da massa microbiana no meio de cultivo

de maneira uniforme, podendo ser ajustado para fornecer as condições ideais de crescimento e

produção. A absorção de nutrientes e excreção de metabólitos ocorre de maneira eficiente,

levando a um tempo mais reduzido de fermentação, e consequentemente, maior produtividade

(Bon & Pereira Jr., 1999).

No que diz respeito a processos biotecnológicos dentro dos casos de transferência de

massa entre fases, é particularmente importante, o fornecimento de oxigênio às células. Em

bioprocessos aerados, o oxigênio é forçado a entrar no sistema, sendo esterilizado por

filtração. O oxigênio gasoso é borbulhado, geralmente, no meio de cultivo a 1 atm, e as bolhas

de ar contêm 0,22 atm de oxigênio. Contudo, as células apenas conseguem utilizar o oxigênio

dissolvido. Porém, sua solubilidade é muito baixa, tornando a fermentação um processo

frequentemente limitado pela taxa de transferência do oxigênio da bolha de ar para o líquido

(Bon & Pereira Jr., 1999; Roseiro, 2003). A limitada solubilidade e o ávido consumo de

oxigênio pelos microrganismos durante a fermentação torna necessário o seu fornecimento

sempre constante, de forma a não se tornar limitante. Presença de oxigênio nas culturas de

microrganismos é uma constante em fermentação, sendo utilizado nas funções de

manutenção, respiração, crescimento e oxidação dos substratos. O oxigênio é transferido das

bolhas de ar para o meio líquido onde só então é transferido para a biomassa. Entretanto, o

oxigênio passa por resistências, constituídas por filmes estagnantes ao redor da interface

líquido-gás e outras interfaces. Estes filmes, camadas de moléculas fixadas por forças

eletroestáticas que sofrem alterações dinâmicas e se situam nas regiões fronteiriças dos

elementos de fermentação, constituem resistência à passagem das moléculas através deles.

Existem diversas classes de resistência, tais como (i) resistência difusional do gás para o

líquido; (ii) resistência por difusão e convecção e (iii) resistência difusional do líquido para a

biomassa (Roseiro, 2003).

Os filmes estagnantes envolvem a bolha de ar nas duas faces, envolvendo também os

filamentos agregados e bactérias unicelulares. A taxa que o oxigênio fica disponível para as

células é controlada pela passagem através dos vários filmes e a resistência à transferência

diminui com a agitação do meio. Se esta agitação for suficientemente elevada o fator limitante

do processo de transferência passa a ser o movimento das moléculas de oxigênio através da

interface gás-líquido, sendo o verdadeiro controle do fenômeno de transferência (Roseiro,

2003).

A taxa de transferência de oxigênio (KLa) é substancialmente melhorada com o

aumento da área interfacial. Durante o borbulhamento de um reator, quanto menor o tamanho

da bolha, maior a área interfacial. Para se determinar a taxa ótima de transferência de massa

de oxigênio da fase gasosa para a líquida, é importante considerar 2 aspectos: o suprimento e

a demanda de oxigênio. O suprimento está relacionado com as variáveis de ordem fisica

(vazão de ar, velocidade de agitação, grau de mistura, temperatura, geometria do biorreator,

etc.). Já a demanda está associada a fisiologia celular, no que diz respeito a quantidade de

oxigênio dissolvido necessária ao cultivo, sendo, portanto, proporcional a biomassa celular e é

definida como a quantidade de oxigênio necessária por unidade de tempo e por unidade de

volume de meio de cultivo ou em fermentação, sendo expresso matematicamente pela

seguinte expressão:

( ) XqCCaKdt

dCOLSL

L2

−−=

Onde:

dCL/dt = taxa de transferência de O2 ou taxa de absorção de O2, moles de O2/m3.h

KL = coeficiente global de transferencia de massa de O2 na fase líquida, m/h

a = área específica da superficie de interface, m-1

CS = concentração de saturação de O2 dissolvido, moles/m3

CL = concentração de O2 dissolvido no seio do meio em fermentação, moles/m3

qO2 = demanda específica de oxigênio, moles de O2/g células. h

X = concentração de células no meio em fermentação, g/m3.

De maneira prática, o ideal e o modo mais econômico seria que o suprimento fosse

igual a demanda. Entretanto, esta situação é dificil de se obter, devido a baixa solubilidade do

oxigênio em meios líquidos. As temperaturas para a produção de biomoléculas, através de

processos fermentativos, situam-se em 30ºC, na qual a solubilidade do oxigênio em água pura

é apenas 7 ppm, diminuindo notoriamente com o aumento da temperatura. Em um meio de

cultivo, a solubilidade do oxigênio diminui, em função da presença de solutos (células e

substrato). Desta forma, o potencial de transferência de oxigênio encontra-se limitado pelo

valor de CS. Adicionalmente, a alta resistência a dissolução do oxigênio resulta em um baixo

valor para a capacidade de oxigenação do biorreator (KLa). A taxa de reação em biorreatores é

diretamente proporcional à concentração da massa celular (Bon & Pereira Jr., 1999). De uma

maneira geral, a determinação do KLa em biorreatores é essencial para estabelecer a eficiência

de aeração e para quantificar os efeitos das variáveis operantes na provisão do oxigênio.

1.8. Processo de Escalonamento

A extrapolação de escala é um problema comum dentro da engenharia. O

escalonamento (scale-up) é um procedimento para o desenho e a construção de um sistema

em larga escala, baseado nos resultados experimentais de equipamentos em escala reduzida. O

escalonamento de um bioprocesso deve seguir 3 estágios: (i) escala laboratorial, na qual

estudos elementares são desenvolvidos; (ii) escala piloto, na qual as otimizações dos

processos são determinadas; (iii) produção em larga escala, na qual o processo é realizado

para fins econômicos (Ju & Chase, 1992). No processo de scale-up, são utilizados dados

obtidos de processos de otimização em escala piloto ou laboratorial, estabelecendo as

variáveis de operação em uma escala industrial. O principal objetivo é manter as condições

ambientais ótimas. Existem vários critérios para o scale-up, e a aplicação de cada um deles ou

sua combinação com outros depende de uma série de fatores, característicos de cada processo

(Mavituna, 1996). Existem alguns critérios de similaridade que são utilizados no processo de

scale-up, como:

1) similaridade geométrica: relação constante entre as dimensões lineares correspondentes nas

duas escalas;

2) similaridade cinemática: manutenção da velocidade de fluído em pontos equivalentes nas

duas escalas;

3) similaridade dinâmica: manutenção das forças aplicadas nas duas escalas;

4) similaridade térmica: manutenção da temperatura em pontos equivalentes nas duas escalas;

5) similaridade química: manutenção da composição química do meio em pontos equivalentes

nas duas escalas.

Os efeitos de natureza física das condições a serem estudadas dependem das

dimensões do biorreator. Caso a escala ampliada seja diferente da escala em que o processo

foi otimizado, as variações de resposta podem ser grandes. Por outro lado, ao se aplicar a

similaridade geométrica plena, verifica-se que a relação entre a área superficial e o volume de

um biorreator decresce acentuadamente, implicando diretamente na transferência de calor

para a esterilização do meio e do equipamento, bem como para o controle de temperatura do

processo de fermentação. Um outro exemplo que impede que a similaridade geométrica plena

seja adotada em biorreatores de mistura completa, está associado à velocidade periférica,

definida matematicamente como Vp = πDN (em que D = diâmetro do impelidor e N =

velocidade de agitação). Ao se ampliar a escala, mantendo-se a velocidade de agitação

contante, os valores deste parâmetro serão diferentes, refletindo diretamente na reologia do

sistema. Adicionalmente, cultivo com microrganismos filamentosos (fungos e actinomicetos)

ou suscetíveis a forças cisalhantes podem ter sua morfologia alterada, resultando em

diferentes respostas metabólicas ou mesmo a perda da viabilidade. Em fermentações aeróbias,

o critério mais indicado seria a manutenção do KLa. Desta forma, o sistema é projetado,

mantendo este critério de ampliação de escala, enquanto que os outros parâmetros podem

sofrer variações (Pereira Jr., 2003).

Dos quatro métodos principais para a aproximação do scale-up, um dos mais

comumente utilizados é o do rules of thumb (Kossen & Oosterhuis, 1985), nos quais os

critérios mais utilizados são: (i) entrada de energia específica constante (P/V); (ii) KLa

constante; (iii) velocidade linear constante da extremidade do impelidor; (iv) concentração de

oxigênio dissolvido constante (Mavituna, 1996). A Tabela 4 mostra a percentagem de cada

critério utilizado numa fermentação industrial. Os diferentes critérios de scale-up

normalmente resultam em condições de processo inteiramente diferentes na produção em

ampla escala. Assim é impossível manter todos os parâmetros na mesma proporção que no

outro. As consequências de tais cálculos para 2 sistemas tanque agitados similares

geometricamente com o sistema de modelo volumétrico, Vm = 10L e o sistema de produção

volumétrico, Vp = 10 m3 (escalonamento linear de fator 10), estão demonstrados na Tabela 5.

Tabela 4: Critérios de scale-up em fermentações industriais

Critérios utilizados para o Scale-up Percentagem aproximada das industrias utilizando os critérios

P/V constante 30

KLa constante 30

Vtip constante 20

pO2 constante 20 Fonte: Mavituna, 1996.

Tabela 5: Diferentes critérios de scale-up e suas consequências

Valores na escala 10 m3 (V= 10L) Critérios scale-up

P P/V N ND Re N/D

P/V igual 103 1 0.22 2.15 21.5 0.022

N igual 105 102 1 10 102 0.1

Velocidade da ponta igual

102 0.1 0.1 1 10 10-2

Número de Re igual 0.1 10-4 10-2 0.1 1 10-3

Razão entre tensão de corte e fluxo igual

108 105 10 102 103 1

Fonte: Kossen & Oosterhuis, 1985. P (potência); V (velocidade); Re (nº Reynolds); D (diâmetro)

Na prática, todos os 4 métodos são utilizados em combinação um com o outro e as

vezes o método tentativa-erro tem que ser incluido também. Para o scale-up de uma

fermentação aeróbia, o efeito do transporte de massa gás-liquido é o fator mais significativo

(Hubbard et al., 1994). O scale-up de uma fermentação aeróbia é frequentemente realizado

baseado em valores de KLa constante. O sucesso dos processos de scale-up são usualmente

confirmados por resultados experimentais que mostrem que não houve diferença entre a

fermentação conduzida em escala reduzida e em escala ampliada, sob a mesma taxa de

transferência de oxigênio.

2. RELEVÂNCIA E OBJETIVOS DO TRABALHO

A produção de xilanases a baixo custo é de extrema importância para processos

que requeiram sua utilização em larga escala. Estudos vêm sendo realizados com

substratos indutores de baixo custo, visando minimizar o impacto dos custos da matéria-

prima e do processamento na produção de xilanases, tanto em escala de bancada como

em escala piloto, utilizando biorreatores de diversas escalas.

O processo de escalonamento é importante quando se pensa em produção a nível

industrial e a comercialização do produto em questão. No que diz respeito às enzimas, a

produção em larga escala depende de vários fatores que podem onerar os custos de

produção, como a matéria-prima, a quantidade de energia aplicada ao sistema e os

custos com a recuperação do produto. O mercado mundial de enzimas cresceu cerca de

1 bilhão de euros em 1995 para quase 2 bilhões de euros em 2001 e continua

aumentando com novas enzimas e aplicações sendo descobertas. Somente para o setor

de processamento enzimático de grãos (que atualmente conta com aproximadamente 25-

28% da venda total de enzimas), é previsto um aumento de volume nos valores de

mercado de 510 milhões de euros em 2001 para 760 milhões em 2010 (Godfrey &

West, 1996; Godfrey, 2003). Atualmente, as indústrias técnicas, dominadas pelas

indústrias de detergente, amido, têxtil e álcool combustível, contabilizam a maioridade

do total do mercado de enzimas, juntamente com as enzimas da indústria de rações e

alimentos, totalizando somente cerca de 35% do mercado. Entretanto, recentemente, a

venda em algumas das principais indústrias técnicas se encontra estagnada (queda de

3% em 2001), enquanto as vendas nas indústrias de alimentos e rações estão

aumentando com uma taxa de crescimento anual prevista para aproximadamente 4-5%

(Godfrey, 2003). As hidrolases constituem 75% do mercado de enzimas industriais,

como as glucosidases (celulases, amilases e hemicelulases), constituindo o segundo

maior grupo depois das peptidases (Bhat, 2000). As xilanases constituem a maior

proporção comercial das hemicelulases, mas representa somente uma pequena

percentagem do total de venda de enzimas. Entretanto, espera-se um aumento das

vendas, visto que estas enzimas têm atraído uma crescente atenção devido ao seu

potencial para o uso em diversas aplicações. De fato, “The United States Patent” e

“Trademark Office” (www.uspto.gov) lista 468 patentes introduzidas desde 2001, com

referência a xilanases (pesquisa realizada em todos os campos). Desta forma, estudar a

http://www.uspto.gov/

produção de xilanases, objetivando a minimização dos custos de processo e visando sua

comercialização é de grande valia para o mercado mundial de enzimas.

Vários trabalhos vêm sendo realizados com xilanases no âmbito industrial, em

especial na indústria de papel e celulose. Alguns trabalhos (Nascimento et al., 2002,

Nascimento et al., 2003) sobre produção de xilanases em diferentes substratos indutores

já foram realizados com a estirpe xilanolítica Streptomyces malaysiensis AMT-3,

isolada de solo de cerrado. Estes estudos serviram de base para a presente tese, no qual

o estudo otimizado da produção de xilanases foi o objetivo geral. Sendo assim, os

objetivos específicos foram:

1. Através do sistema de análise do desenho experimental (23), investigar

diferentes substratos de baixo custo, em diferentes concentrações, para a

produção de endoxilanases por S. malaysiensis em frascos agitados.

2. Determinar as melhores condições de pH e temperatura para a atividade

xilanolítica no extrato bruto, bem como sua termoestabilidade e reação frente a

íons metálicos.

3. A partir dos resultados obtidos no item 1, melhorar as condições de produção de

endoxilanases por S. malaysiensis em biorreatores do tipo STR de capacidade

volumétrica de 2L, avaliando as condições de tempo de cultivo, aeração e

agitação, empregando Planejamento Fatorial Simples (22).

4. Estudar o processo de produção de endoxilanases em escala ampliada, utilizando

um biorreator do tipo STR de capacidade volumétrica de 16L, nas condições

pré-determinadas em biorreator de 2L.

5. Paralelamente, estudar o perfil de produção de CMCases e peptidases nos

extratos obtidos, através de ensaios enzimáticos e técnicas eletroforéticas

(zimograma).

A realização do presente trabalho só foi possível através da colaboração bilateral

Brasil-Portugal, sendo o trabalho relacionado com a parte microbiológica e fermentativa

realizado nos laboratórios de Biotecnologia de Actinomicetos, no Instituto de

Microbiologia Prof. Paulo de Góes, na UFRJ e a parte relacionada ao estudo em

biorreatores foi realizada na Unidade de Bioengenharia e Bioprocessos do Dep.

Biotecnologia do INETI, em Portugal.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Manutenção da Estirpe

A estirpe xilanolítica Streptomyces malaysiensis AMT-3, isolada de solo de cerrado

(Nascimento et al., 2003), foi mantida em glicerol 20% a –20°C na forma de suspensão de

esporos padronizada (4x1010 UFC / mL), de acordo com Hopkins et al. (1985).

3.2. Produção de Endoxilanases em Frascos Agitados

Para a produção de endoxilanases em fermentação submersa, as células foram

cultivadas em meio de sais mineirais (Breccia et al., 1995) modificado contendo (g/L): 9,0

KH2PO4; 1,5 K2HPO4; 0,2 MgSO4.7H2O; 0,05 CaCl2; 0,01 MnSO4.7H2O; 0,001

ZnSO4.7H2O, suplementado com diferentes concentrações de fonte de carbono (farelo de trigo

e dreche cervejeiro) e fontes de nitrogênio orgânica (milhocina e extrato de levedura), como

descrito na Tabela 6. A descrição e composição das fontes que foram utilizadas como matéria-

prima se encontram no ANEXO I. A estirpe S. malaysiensis AMT-3 foi cultivada em frascos

Erlenmeyer (250 mL) contendo 50 mL de meio descrito previamente (pH 6,8), sendo

inoculada com 50 µL de suspensão de esporos padronizada (4×109 UFC/mL), de modo que a

concentração final no meio fosse de aproximadamente 106 UFC/mL. Os frascos foram

agitados em agitador orbital, a 200 rpm durante 144 horas (6 dias), sendo retirados 2 frascos

em intervalos de 24 horas para amostragem e o volume total centrifugado (4.000 rpm/4ºC) e

filtrado. Os sobrenadantes brutos foram congelados (-20°C) para análises posteriores.

3.3. Otimização do Processo Fermentativo em Frascos Agitados

Na tentativa de otimizar as condições de produção de endoxilanase, foi adotada a

metodologia do planejamento fatorial 23. A variável dependente selecionada para este estudo

foi a atividade xilanolítica, expressa em U/mL, enquanto que as variáveis independentes

foram a concentração das fontes de carbono e de nitrogênio, e o tempo. Como fontes de

carbono, foram utilizados farelo de trigo e dreche cervejeiro, enquanto que como fontes de

nitrogênio, foram empregados a milhocina e o extrato de levedura. O planejamento fatorial

gerou um conjunto de 8 experimentos, representado na Tabela 6, sendo o programa

STATISTICA (versão 6.0) utilizado para as análises de regressão e elaboração dos gráficos de

superfície de resposta. O sistema foi conduzido em frascos de Erlenmeyers (250 mL), por

fermentação submersa, em duplicata. A melhor combinação fonte de carbono e fonte de

nitrogênio foi selecionada para estudos estatísticos (farelo de trigo e milhocina), avaliando a

superfície de resposta e a curva de pareto como ferramentas estatísticas.

Tabela 6: Esquematização do planejamento fatorial 23 com os níveis e as concentrações estudadas.

Concentração das fontes e níveis do planejamento Ensaio Fonte de Carbono

(% p/v) Fonte de Nitrogênio

(% p/v) Tempo (dias)

1 0,5 (-1) 0,1 (-1) 2 (-1)

2 2,5 (+1) 0,1 (-1) 2 (-1)

3 0,5 (-1) 1,2 (+1) 2 (-1)

4 2,5 (+1) 1,2 (+1) 2 (-1)

5 0,5 (-1) 0,1 (-1) 6 (+1)

6 2,5 (+1) 0,1 (-1) 6 (+1)

7 0,5 (-1) 1,2 (+1) 6 (+1)

8 2,5 (+1) 1,2 (+1) 6 (+1)

3.4. Produção de Endoxilanases em Biorreator de 2 L

Para a produção de endoxilanases em biorreator do tipo STR de 2L (Setric Genie

Industriel – França, Fig. 7), as células foram cultivadas em meio de sais minerais modificado,

previamente descrito no item 3.3., utilizando a melhor condição prevista no planejamento

fatorial [2,5% (p/v) farelo de trigo e 1,2% (p/v) milhocina]. A estirpe S. malaysiensis AMT-3

foi cultivada em 1000 mL de meio de cultivo (pH 6,8), sendo inoculado com 1 mL de

suspensão de esporos padronizada (4×109 UFC/mL). O efeito das variáveis velocidade de

agitação e taxa de aeração na produção de endoxilanases foi estudado, utilizando

planejamento fatorial 22 (Tabela 7). A fermentação foi conduzida por 144 horas (6 dias), e a

cada 24 horas, uma alíquota de 15 mL era retirada e o volume total centrifugado (4.000

rpm/4ºC) e filtrado, sendo os sobrenadantes brutos congelados (-20°C) para análises

posteriores. Os parâmetros pH e oxigênio dissolvido foram monitorados ao longo do processo

fermentativo e os experimentos conduzidos em duplicata. O esquema do biorreator se

encontra no ANEXO 2A.

Tabela 7: Esquematização do planejamento fatorial 22 com os níveis estudados.

Ensaio Agitação (rpm) Aeração (vvm) 1 300 (-1) 0,5 (-1) 2 600 (+1) 0,5 (-1) 3 300 (-1) 1,5 (+1) 4 600 (+1) 1,5 (+1)

Figura 7: Fermentação submersa com S. malaysiensis AMT-3 utilizando farelo de trigo (2,5%) e milhocina (1,2%) em biorreator do tipo STR 2L (Setric Genie Industriel).


Para o estudo da produção de endoxilanases em sistema de maior volume, foi utilizado

um biorreator do tipo STR de 16L (Bioengineering – Fig. 8), o que promoveu um aumento de

escala de 1:8. As células foram cultivadas no meio de sais mineirais modificado, previamente

descrito no item 3.3., utilizando a melhor condição prevista no planejamento fatorial [2,5%

(p/v) farelo de trigo e 1,2% (p/v) milhocina]. O esquema do biorreator encontra-se no

ANEXO 2B.

A estirpe S. malaysiensis AMT-3 foi cultivada em 10.000 mL de meio de cultivo (pH

6,8), sendo inoculado com 1 mL de suspensão de esporos padronizada (4×1010 UFC/mL).

Como parâmetros de escalonamento, foram utilizados KLa constante (fator de transferência de

massa) e velocidade linear constante da extremidade do agitador (fator geométrico). A

determinação destes parâmetros em estudos de aumento de escala foi obtida através dos

cálculos apresentados no ANEXO 2. O KLa foi determinado de acordo com o método de

desgaseificação, utilizando nitrogênio para previamente desaerar o sistema (Roseiro, 2003).

Por ser um gás inerte, o nitrogênio expulsa o oxigênio do biorreator, permitindo um aumento

da faixa de estudo do oxigênio dissolvido.

Parâmetro Geométrio (P/V)

Velocidade constante da ponta do impelidor (tip speed)

vp= π.D N

(vp)1 = (vp)2

D1 N1 = D2 N2

Parâmetro de Transferência de Massa (KLa constante)

KLa constante, mantendo a agitação (300 rpm), alterando a aeração (0,65 vvm), para o

biorreator do tipo STR de 16 litros.

Figura 8: Fermentação submersa com S. malaysiensis AMT-3 utilizando farelo de trigo (2,5%) e milhocina (1,2%) em biorreator do tipo STR de capacidade nominal de 16 L.

3.6. Cinética Enzimática

A caracterização da cinética enzimática da endoxilanase no extrato bruto obtido em

fermentação nos frascos agitados foi realizada analisando-se os parâmetros Km e Vmax,

necessários para se otimizar a quantificação da enzima estudada, trabalhando desta forma em

velocidade inicial e velocidade máxima. Para tanto, foram construídas curvas de progresso

que consistem da quantificação de produto formado (xilose) em diferentes concentrações do

substrato (xilana birchwood) após diferentes tempos de incubação. A partir dos dados obtidos,

foi possível determinar as curvas de tempo de incubação versus µmoles de xilose liberados

durante a reação enzimática. Os parâmetros foram determinados graficamente pelo método de

Lineweaver-Burk. Também foi estudado o efeito da diluição do extrato na atividade

enzimática, utilizando-se as diluições 1:20 e 1:50, em um intervalo de tempo de 1 a 12

minutos.

3.7. Ensaios Analíticos

Os experimentos realizados em frascos agitados foram acompanhados pelas atividades

de endoxilanase e celulase, acúmulo de proteínas totais solúveis e alteração de pH no extrato.

Além disso, foram determinados os parâmetros cinéticos para a atividade de xilanase. Nos

experimentos conduzidos em biorreator foram determinados a atividade de endoxilanase e a

alteração do pH ao longo do processo, além da dosagem de oxigênio dissovildo.

3.7.1. Dosagem da Proteína Total Solúvel

A proteína total solúvel, presente nos filtrados obtidos após crescimento em diferentes

substratos, em frascos agitados, foi estimada espectrofotometricamente pelo método de

Bradford (1976), utilizando-se a albumina sérica bovino (BSA) como padrão.

3.7.2. Determinação do pH

Os valores de pH dos diferentes extratos foram determinados com auxílio de um

potenciômetro, previamente calibrado com tampões 4,0 e 7,0.

3.7.3. Atividade de Endoxilanases

A atividade xilanolítica (ensaio otimizado) foi determinada através da medida dos

açúcares redutores produzidos durante a incubação de 0,5 mL do sobrenadante da cultura com

1,5 mL de xilana oat spelts 1,5% (p/v) em tampão citrato de sódio 50mM pH 5,3, a 50ºC

durante 6 minutos. Esta medida foi realizada espectrofotometricamente, pelo método do DNS,

onde o produto da reação foi medido a 540nm (Miller, 1959), após interrupção da reação

enzimática por imersão em gelo. Para o branco da reação, foram adotadas as mesmas condições

(Bailey et al., 1992). Uma unidade de atividade endoxilanase (U) corresponde a liberação de 1

µmol de xilose equivalente por minuto nas condições do ensaio.

3.7.4. Atividade de Carboximetilcelulases (CMCase)

A atividade celulolítica (CMCase) foi determinada através da medida dos açúcares

redutores produzidos durante a incubação de 1 mL do sobrenadante da cultura com 1 mL de

carboximetilcelulose (na forma de sal sódico) 2% (p/v) em tampão citrato de sódio 50mM pH

4,0, a 50ºC durante 30 minutos. Esta medida foi realizada espectrofotometricamente, pelo

método do DNS, onde o produto da reação foi medido a 540nm (Miller, 1959), após

interrupção da reação enzimática por imersão em gelo. Para o branco da reação, foram adotadas

as mesmas condições (Ghose, 1987). Uma unidade de atividade CMCase (U) corresponde a

liberação de 1 µmol de glucose equivalente por minuto nas condições do ensaio.

3.8. Caracterização da Atividade Endoxilanásica

A caracterização parcial da atividade xilanolítica foi realizada com o sobrenadante

obtido na melhor condição observada para a produção em frascos agitados.

3.8.1. Determinação do Perfil de Temperatura

Para o estudo do efeito da temperatura, a atividade endoxilanásica foi determinada sob

as mesmas condições descritas no item 3.6.4., analisando-se o parâmetro de temperatura de

incubação na faixa entre 20–90oC (Bailey et al., 1992). A mistura reacional foi incubada em

banho-maria, nas respectivas temperaturas, a pH 5,3, e após o tempo de reação (6 min.), a

atividade foi interrompida em banho de gelo. O teor de açúcares redutores produzidos após

atividade enzimática foi determinado pelo método DNS (Miller, 1959).

3.8.2. Determinação do Perfil de pH

Para o estudo do efeito de pH, a atividade endoxilanásica foi determinada no ótimo de

temperatura, a diferentes valores de pH, segundo o item 3.6.4., utilizando-se como tampões:

glicina-HCl 50mM (pH 2,0–3,0), citrato de sódio 50mM (pH 3,0–6,0), fosfato de sódio

50mM (pH 6,0–8,0), tris-HCl 50mM (pH 8,0–9,0) e glicina-NaOH (pH 9,0–10,0). Os

tampões foram preparados de acordo com os procedimentos descritos por Colowick & Kaplan

(1955). A mistura reacional foi incubada em banho-maria, nas respectivas faixas de pH, e

após o tempo de reação a atividade foi interrompida em banho de gelo. A dosagem dos

açúcares redutores produzidos após atividade enzimática foi determinada pelo método DNS

(Miller, 1959).

3.8.3. Estabilidade a Temperatura

As preparações enzimáticas foram pré-incubadas em diferentes faixas de temperatura,

em intervalos de tempo de 30 min, 1, 2, 4, 6, 8, 16, 18, 20, 22 e 24 horas, sendo a atividade

residual de endoxilanase determinada ao longo dos tempos pré-definidos. Também foi

verificada a capacidade de resistência da enzima ao processo de congelamento e

descongelamento, por um período de 6 meses.

3.8.4. Influência de Íons Metálicos e Outros Aditivos

O efeito de diferentes íons metálicos na atividade endoxilanásica foi estudado a partir

da determinação da atividade enzimática na presença da solução do respectivo sal na

concentração de 10mM na mistura reacional. O ensaio enzimático foi realizado na presença

de sais de cloreto de: magnésio (MgCl2), zinco (ZnCl2), sódio (NaCl), cálcio (CaCl2),

manganês (MnCl2), potássio (KCl), ferro III (FeCl3), bário (BaCl2) e cobre (CuCl2). Também

foi estudado o efeito do EDTA na atividade endoxilanásica. A quantidade de açúcares

redutores produzidos durante a incubação de 0,25 mL de amostra, 0,25 mL de solução de íons

(80mM) com 1,5 mL de xilana oat spelts 1,5% (p/v) nas condições ótimas de temperatura e

pH, durante 6 minutos, foi medida pelo método do DNS a 540nm (Miller, 1959), após

interrupção da reação enzimática por imersão em gelo (Marques et al., 1998).

3.9. Caracterização da Atividade de CMCase

A caracterização parcial da atividade celulolítica foi realizada com o sobrenadante

obtido na melhor condição de produção em frasco agitado.

3.9.1. Determinação do Perfil de Temperatura

Para o estudo do efeito da temperatura, a atividade de CMCase foi determinada sob as

mesmas condições descritas no item 3.6.5., analisando-se o parâmetro de temperatura de

incubação na faixa entre 20–100ºC. A mistura reacional foi incubada em banho-maria, nas

respectivas temperaturas, a pH 5,0, e após o tempo de reação (30 min.), a atividade foi

interrompida em banho de gelo. O teor de açúcares redutores produzidos após atividade

enzimática foi determinado pelo método DNS (Miller, 1959).

3.9.2. Determinação do Perfil de pH

Para o estudo do efeito de pH, a atividade de CMCase foi determinada no ótimo de

temperatura, a diferentes valores de pH, segundo o item 3.6.5., utilizando-se como tampões:

glicina-HCl 50mM (pH 2,0–3,0), citrato de sódio 50mM (pH 3,0–6,0), fosfato de sódio

50mM (pH 6,0–8,0), tris-HCl 50mM (pH 8,0–9,0) e glicina-NaOH (pH 9,0–10,0). Os

tampões foram preparados de acordo com os procedimentos descritos por Colowick & Kaplan

(1955). A mistura reacional foi incubada em banho-maria, nas respectivas faixas de pH e após

o tempo de reação, a atividade foi interrompida em banho de gelo. A dosagem dos açúcares

redutores produzidos após atividade enzimática foi determinada pelo método DNS (Miller,

1959).

3.9.3. Estabilidade a Temperatura

As preparações enzimáticas foram pré-incubadas em diferentes temperaturas (40º, 50º

e 60ºC), em intervalos de tempo de 30 min, 1, 2, 4, 6, 8, 16, 18, 20, 22 e 24 horas, sendo a

atividade residual de CMCase determinada ao longo dos tempos pré-definidos.

3.10. Eletroforese (Zimograma)

Para análise das características moleculares das enzimas presentes nos sobrenadantes

obtidos em fermentação em frascos agitados, as amostras foram aplicadas em gel sob

condições desnaturantes contendo SDS 10% (CMCases e peptidases) e sob condições não-

desnaturantes (endoxilanases). O preparo das soluções e dos géis se encontram no ANEXO 3.

3.10.1. Endoxilanases

Para a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), foi preparado um gel de

gradiente de poliacrilamida (7–20% para o gel de concentração e 5% para o gel de resolução),

contendo 0,12% de xilana oat spelts. O volume de cada amostra corrida no gel continha uma

atividade enzimática de endoxilanase de 150 mU. Paralelamente, foram injetados marcadores

de massa molecular entre 67 e 690 kDa (HMW electrophoresis calibration kit – Pharmacia

Biotech), de forma a permitir determinar a massa molecular aparente de cada enzima

detectada. A corrida foi processada a 85 mV, durante 23 horas a 4º C (Laemmli, 1970; Morag

et al., 1990; César & Mrsa, 1996).

Ao fim da corrida, o gel foi revelado para a detecção de atividade enzimática de

endoxilanase, através do zimograma. Para tal, o gel foi incubado sob as condições ótimas da

enzima, durante 6 minutos, e em seguida o gel foi mergulhado em solução de Vermelho do

Congo (0,1% p/v) durante overnight, sendo o excesso de corante removido por lavagens

sucessivas em 1M de NaCl (César & Mrsa, 1996; Morag et al., 1990). Ao final, com auxílio

de um transluminador, foram observadas zonas de hidrólise no gel indicando, assim, as

enzimas com suas respectivas massas moleculares aparentes.

3.10.2. CMCases

Para a eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS–PAGE), foi preparado

um gel de poliacrilamida (10% para o gel de concentração e 3% para o gel de resolução),

contendo 0,2% de carboximetilcelulose (na forma de sal sódico) (SIGMA). O volume de cada

amostra corrida no gel continha uma atividade enzimática de CMCase de 500 mU.

Paralelamente, foram injetados marcadores de massa molecular entre 37,4 e 176,5 kDa

(Pharmacia), de forma a permitir determinar a massa molecular aparente de cada enzima

detectada. A corrida foi realizada a 150 mV, durante 2 horas a 4ºC (Laemmli, 1970; Morag et

al., 1990; César & Mrsa, 1996).

Ao fim da corrida, o gel foi revelado para a detecção de atividade enzimática de

CMCase, através do zimograma. Para tal, o gel foi incubado sob as condições ótimas da

enzima, durante 30 minutos e em seguida, o gel foi mergulhado em solução de Vermelho do

Congo (0.1% p/v) durante 10 minutos, sendo o excesso de corante removido por lavagens

sucessivas em 1M de NaCl (César & Mrsa, 1996; Morag et al., 1990). Ao final, com auxílio

de um transluminador, foram observadas zonas de hidrólise no gel, indicando assim, as

enzimas com suas respectivas massas moleculares aparentes.

3.10.3. Peptidases

Para a eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS–PAGE), os

sobrenadantes estudados foram passados por filtração (0,45 µm) e então misturados com

tampão de amostra [125 mM Tris, pH 6,8, 4% (p/v) dodecil sulfato de sodio (SDS), 20% (p/v)

glicerol e 2% (p/v) azul de bromofenol] e adicionados ao gel de poliacrilamida (Heussen &

Dowdle, 1980), numa proporção 7:3 (extrato enzimático : tampão de amostra – v/v).

Alternativamente, 10 mM 1,10-phenanthroline ou 1 mM PMSF também foram adicionados no

tampão de amostra simultaneamente à mistura com os extratos. As peptidases foram

caracterizadas parcialmente, quanto ao perfil de temperatura, termoestabilidade, perfil de pH e

classificação enzimática, onde o melhor extrato enzimático foi selecionado (farelo de trigo e

milhocina) para estes estudos.

A habilidade das peptidases em degradar diferentes fontes proteináceas também foi

estudada, em sistema SDS-PAGE (10%) contendo 0,1% de gelatina, caseina, hemoglobina ou

BSA. Após corrida eletroforética, a uma voltagem constante de 200 mV, durante 4 horas a

4ºC, as tiras do gel foram mergulhadas por 30 minutos em solução Triton-X 100 [2,5% (v/v)],

em banho de gelo, e em seguida incubadas em tampão fosfato 50 mM, pH 7,0, por 4 horas a

37ºC. Os géis foram corados por 1 hora com solução de 0.1% Comassie Blue R-250 em

metanol–ácido acético–água (30:10:60) e descoradas com o mesmo sistema solvente

(Laemmli, 1970). A massa molecular das peptidases foi calculada através da comparação com

a mobilidade de padrões de massa molecular entre 14,4 e 212 kDa (Pharmacia).

O efeito de temperatura, pH e inibidores de peptidases na atividade proteolítica

extracelular foi realizado sob as mesmas condições descritas acima, utilizando 0.1% de

gelatina como substrato (Heussen & Dowdle, 1980). O efeito da temperatura foi determinado

pela incubação das tiras dos géis por 4 horas em tampão fosfato 50 mM, pH 7.0, a 28º, 37º,

50º, 60º e 70ºC. O efeito do pH foi realizado na melhor temperatura (37ºC), por 4 horas,

variando os valores de pH utilizando os seguintes tampões (50 mM): citrato de sódio (3,0–

5,0), citrato fosfato (6.0), fosfato (7,0 e 8,0) e glicina-NaOH (9,0 e 10,0). Em adição, as

classes das peptidases extracelulares produzidas pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 foram

estudadas pela incubação dos géis por 30 minutos em solução Triton X-100 (2.5%) em banho

de gelo, na presença ou ausência de inibidor proteolítico, seguido de incubação por 4 horas a

37ºC em tampão fosfato pH 7,0, contendo ou não: 2 mM ditiothreitol (DTT) (Sigma), 10 µm

trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino) butane (E-64) (Sigma), 10 mM 1,10-

phenanthroline (Sigma), 1 mM phenyl-methyl sulfonyl-fluoride PMSF (Sigma), 0,5 mM

benzamidine (Sigma), e 1 µm Pepstain A (Sigma).

Para estudar a termoestabilidade das peptidases extracelulares, o sobrenadante bruto

foi pré-incubado a 28°, 37°, 50°, 60° e 70° C por 30, 120 e 480 minutos em tampão fosfato 50

mM, pH 7,0. Após esta pré-incubação, os sobrenadantes foram adicionados ao tampão de

amostra contendo SDS, na proporção descrita acima, e em seguida aplicados ao gel, seguindo

uma corrida eletroforética previamente descrita. Após a corrida, os géis foram mergulhados

em solução Triton X-100 [2,5% (v/v)] por 30 minutos em banho de gelo e depois incubados

em tampão fosfato 50mM pH 7,0, por 4 horas a 37ºC.

Nascimento, R.P. Resultados

49

4. RESULTADOS 4.1. Determinação dos Parâmetros Cinéticos para Endoxilanase (Km e Vmax)

A determinação dos parâmetros cinéticos de atividade enzimática são de extrema

importância para um melhor conhecimento bioquímico da enzima a ser estudada. A partir

do sobrenadante obtido em fermentação submersa de estudos preliminares, os parâmetros

cinéticos enzimáticos foram determinados. Para a construção das primeiras curvas de

progresso foram utilizadas as concentrações de xilana de 0,3%, 0,9%, 1,5%, 2,1%, 2,7% e

3,0% (p/v) e testadas 2 diluições (1:20 e 1:50) (Fig. 9). De acordo com os resultados

obtidos a diluição 1:20 foi utilizada para os ensaios posteriores.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

0 3 6 9 12 15 18

Tempo (min.)

Prod

uto

[um

ol/m

E.B. (1:50)E.B. (1:20)

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

0 3 6 9 12 15 18

Tempo (min.)

Prod

uto

[um

ol/m

E.B. (1:50)E.B. (1:20)

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

0 3 6 9 12 15 18Tempo (min.)

Prod

uto

[um

ol/m

E.B. (1:50)E.B. (1:20)

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

0 3 6 9 12 15 18

Tempo (min.)

Prod

uto

[um

ol/m

E.B. (1:50)E.B. (1:20)

Xilana = [0,3% (p/v)] Xilana = [0,9% (p/v)]Pr

odut

o [µ

mol

/mL

] Pr

odut

o [µ

mol

/mL

]

Prod

uto

[µm

ol/m

L]

Prod

uto

[µm

ol/m

L]

Xilana = [1,5% (p/v)] Xilana = [2,1% (p/v)]

Figura 9: Efeito da diluição do Extrato Enzimátivo Bruto nas Curvas de Progresso de Atividade Endoxilanásica de S. malaysiensis AMT-3, utilizando Xilana birchwood como substrato. E.B. = Extrato Bruto


50

A partir dos valores obtidos de produto (xilose) formado ao longo do tempo, pode-

se determinar a velocidade inicial atingida para cada concentração de xilana estudada (Fig.

10). Os valores resultantes do cálculo das velocidades iniciais estão apresentados na Tabela

8, e neste caso pode-se verificar que a concentração de 1,5% (p/v) foi a que forneceu os

maiores valores de produto formado, sendo o tempo intermediário de 6 minutos escolhido

como mais adequado para trabalhar em velocidade inicial de reação.

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tempo (min)

Prod

uto

(mic

rom

ol x

ilose

0,3%

0,9%

1,5%

2,1%

2,7%

3,0%

Figura 10: Curvas de Progresso obtidas com o Extrato Enzimático Bruto (diluição 1:20) de S. malaysiensis AMT-3 produzido por fermentação submersa.

Tabela 8: Valores Estimados para as Velocidades Iniciais de Atividade Endoxilanásica.

Concentração de Xilana (%)

Velocidade Inicial (µmoles xilose/min)

0,3 8,97 0,9 11,49 1,5 13,10 2,1 11,03 2,7 10,54 3,0 9,75

Pro

du

to [

µm

ol x

ilos

e/m

L]


51

y = 0,9887x + 0,6342R2 = 0,9554

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

0,0000 0,1000 0,2000 0,3000 0,4000

1/S [L/g]

1/V

[mL.

min

/ um

ol x

ilos

1/V

[m

L.m

in/µ

mol

xil

ose]

Figura 11: Curva de Lineweaver-Burk levantada a partir dos Valores de Concentração de Xilana [S] e de Velocidade Inicial [V].

A partir dos resultados apresentados na Tabela 8, foi possível traçar a curva de

Lineweaver-Burk (Fig. 11). Os valores referentes as concentrações 2,1; 2,7 e 3,0% não

foram utilizados para a linearização. No método de Lineweaver-Burk, o coeficiente angular

da reta corresponde a Km/Vmax, enquanto que o coeficiente linear corresponde a 1/Vmax.

Assim sendo, os valores de Km e Vmax (regressão linear) descritos na Tabela 9, revelaram

que a atividade endoxilanásica segue os padrões cinéticos de Michaelis-Menten. O erro

observado na regressão linear (< 3%) é considerado como baixo, tendo em vista a

determinação experimental dos pontos selecionados. Adicionalmente, os resultados obtidos

pelo método de Lineweaver-Burk mostraram uma inibição da atividade enzimática em altas

concentrações de substrato (2,1; 2,7 e 3,0%). A média dos valores do Km aparente estimado

para endoxilanase foi de 1,56 mg xilana/mL, denotando alta afinidade pelo substrato.


52

Tabela 9: Valores Aparentes Estimados dos Pâmetros Cinéticos

Parâmetros Lineweaver-Burk Erro Relativo

Km (mg xylan . mL-1) 1,56 2,85%

Vmax (µmol xilose/mL.min) 1,58 2,85%

A influência do substrato na atividade enzimática também foi investigada. Foram

utilizados dois substratos comerciais (xilana oat spelts e xilana birchwood) para investigar

o grau de afinidade do extrato enzimático em relação ao substrato. Em virtude da baixa

solubilidade observada para o substrato xilana oat spelts, a investigação dos parâmetros de

Km e Vmax foi realizada utilizando-se uma xilana de fácil solubilidade (birchwood). Tendo

em vista os melhores resultados obtidos com xilana oat spelts (Fig. 12) e os valores

observados serem semelhantes àqueles obtidos com xilana birchwood, os ensaios

posteriores foram realizados com este substrato.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

XBW XOS

Substrato [1,5% (p/v)]

Prod

uto

[um

ol/m

Prod

uto

[µm

ol x

ilose

/mL

]

Figura 12: Efeito do substrato na atividade enzimática, utilizando uma concentração de 1,5% (p/v) de xilana comercial (XOS = xilana oat spelts / XBW = xilana birchwood), e um tempo de reação de 6 min.


53

4.2. Produção de Endoxilanases em Frascos Agitados

O perfil cinético da produção enzimática em meio líquido de sais minerais,

contendo a combinação de 2 fontes de carbono (farelo de trigo e dreche cervejeiro) e

nitrogênio (milhocina e extrato de levedura), em diferentes concentrações cada uma, foi

obtido após 6 dias de cultivo sob agitação (200 rpm), a 28ºC (Fig. 13 e 14). A maior

atividade endoxilanásica (média de 45,8 U/mL) ocorreu no 6º dia de fermentação, quando o

farelo de trigo [2,5% (p/v)] foi utilizado como fonte de carbono e a milhocina 1,2% (p/v)]

como fonte de nitrogênio, de acordo com o ensaio 4 (Fig. 13B). Entretanto, quando o

extrato de levedura foi utilizado como fonte de nitrogênio, na concentração mínima [0,1%

(p/v)], a atividade máxima de endoxilanase (31,3 U/mL) foi obtida ao fim de 5 dias de

fermentação (Fig. 13A). Quando da utilização da combinação milhocina [0,1% (p/v) e

farelo de trigo [2,5% (p/v)], a atividade endoxilanásica foi considerável já ao fim de 3 dias

(15,2 U/mL), mas muito baixa após 6 dias (2,75 U/mL). Por outro lado, a utilização de

dreche cervejeiro como fonte de carbono e milhocina como fonte de nitrogênio, nas

concentrações máximas, forneceu uma produção máxima de endoxilanases (21,2 U/mL) ao

término de 6 dias (Fig. 14A), enquanto que a combinação de dreche cervejeiro e extrato de

levedura, no ensaio 2, mostrou uma boa produção de endoxilanases (19,0 U/mL) no 5º dia

de fermentação (Fig 14B).


54

0,05,0

10,015,020,025,030,035,040,045,050,0

0 1 2 3 4 5 6 7Tempo (dias)

A

(U.

Ativ

idad

e X

ilano

lític

aA

tivid

ade

Xila

nolít

ica

(U/m

L)

0,05,0

10,015,020,025,030,035,040,045,050,0

0 1 2 3 4 5 6 7Tempo (dias)

Ativ

idad

e X

ilano

lític

a (U

Ativ

idad

e X

ilano

lític

a (U

/mL

) B

Figura 13: Produção de endoxilanases por S. malaysiensis AMT-3 a 28ºC, em meio de sais minerais contendo: (A) farelo de trigo e extrato de levedura; (B) farelo de trigo e milhocina, em diferentes concentrações como descrito a seguir: (-∆-) ensaio 1 [C 0,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-□-) ensaio 2 [C 2,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-▲-) ensaio 3 [C 0,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]; (-■-) ensaio 4 [C 2,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]. O gráfico representa a média das réplicas (Desvio Padrão máximo de 3,1).


55

A

0,05,0

10,015,020,025,030,035,040,045,050,0

0 1 2 3 4 5 6 7Tempo (dias)

(U

Ativ

idad

e X

ilano

lític

aA

tivid

ade

Xila

nolít

ica

(U/m

L)

0,05,0

10,015,020,025,030,035,040,045,050,0

0 1 2 3 4 5 6 7Tempo (dias)

Ativ

idad

e X

ilano

lític

a (U

Ativ

idad

e X

ilano

lític

a (U

/mL

) B

Figura 14: Produção de endoxilanases por S. malaysiensis AMT-3 a 28ºC, em meio de sais minerais contendo: (A) dreche cervejeiro e milhocina; (B) dreche cervejeiro e extrato de levedura, em diferentes concentrações como descrito a seguir: (-∆-) ensaio 1 [C 0,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-□-) ensaio 2 [C 2,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-▲-) ensaio 3 [C 0,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]; (-■-) ensaio 4 [C 2,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]. O gráfico representa a média das réplicas (Desvio Padrão máximo de 2,6).


56

Com relação aos valores de pH, quando se utilizou milhocina como fonte de

nitrogênio, tanto com farelo de trigo, como com dreche cervejeiro, não houve muita

alteração, mantendo-se entre 7,0 e 7,5. Por outro lado, quando se utilizou extrato de

levedura como fonte de nitrogênio, em concentração de 1,2% (p/v), houve um aumento

significativo do valor de pH, atingindo valores superiores a 8,5. Contudo, ao se utilizar o

extrato de levedura na concentração mínima (0,1% p/v), os valores do pH se mantiveram

entre 7,0 e 7,4.

Baseado em estudos preliminares, as concentrações das fontes de carbono e

nitrogênio foram identificadas como os principais fatores que afetam a produção de

endoxilanases por S. malaysiensis AMT-3. Assim sendo, estas variáveis, carbono e

nitrogênio, além da variável tempo, foram estatisticamente otimizadas, com o auxílio do

planejamento fatorial, utilizando 2 níveis e 3 variáveis (23). O melhor sistema apontado

pelo planejamento fatorial está descrito na Tabela 10. A melhor produção de endoxilanase

(45,8 U/mL) foi observada no ensaio 8, quando os níveis máximos de concentração de

farelo de trigo [2,5% (p/v)], de concentração de milhocina [1,2% (p/v)] e tempo (6 dias)

foram utilizadas. O valor máximo de atividade foi confirmado com a réplica deste ensaio.

Com um nível de 5% de probabilidade (95% de confiabilidade estatística), o coeficiente

linear de X1 (concentração de farelo de trigo), X2 (concentração de milhocina), X3 (tempo)

e os coeficientes de interação X1X2, X2X3 foram significativos. O modelo matemático que

representa a atividade endoxilanásica (Z) na região experimental estudada, considerando o

tempo de 6 dias, pode ser expressa pela equação abaixo:

Z = 10,3932 – 22,5568X2 – 0,7901X1 + 6,30682X1*X2 – 16,3182

O modelo forneceu um coeficiente de regressão, R2, de 0,941. A superfície de

resposta descrita no modelo da equação Z, para estimar a atividade endoxilanásica sobre as

variáveis independentes: tempo (X3), concentração de farelo de trigo (X1) e milhocina (X2),

pode ser observada na Fig. 15. A produção de endoxilanases atingiu os máximos valores na


57

região dos níveis ‘+1’ tanto para o parâmetro concentração de fonte de carbono e fonte de

nitrogênio, como também para o parâmetro tempo.

Tabela 10: Planejamento fatorial (23) e resultados obtidos no melhor sistema (farelo de trigo e milhocina).

Níveis Atividade Endoxilanases

(U/mL) Ensaio

X1 X2 X3 Observado Predito

1 –1 –1 –1 2,0 5,81

2 +1 –1 –1 1,7 - 2,21

3 –1 +1 –1 1,9 -1,26

4 +1 +1 –1 2,2 6,16

5 –1 –1 +1 9,9 6,98

6 +1 –1 +1 2,0 6,21

7 –1 +1 +1 25,4 27,66

8 +1 +1 +1 46,1 42,33

9* –1 –1 –1 2,7 5,81

10* +1 –1 –1 0,8 - 2,21

11* –1 +1 –1 2,5 -1,26

12* +1 +1 –1 3,2 6,16

13* –1 –1 +1 11,0 6,98

14* +1 –1 +1 3,5 6,21

15* –1 +1 +1 23,0 27,66

16* +1 +1 +1 45,5 42,33 * replicata do sistema


58

Figura 15: Superfície de Resposta para a Otimização da Produção de Endoxilanases em diferentes concentrações de farelo de trigo e de milhocina. O modelo do desenho padrão (23) utilizado para a metodologia de superficie de resposta prevê a tendência do melhor ponto para a produção de endoxilanases.

Baseado no modelo obtido, observou-se uma tendência de melhoramento da

produção de endoxilanase e as condições de trabalho foram definidas com o intuito de

atingir a máxima produção de endoxilanases, através da maximização das concentrações de

farelo de trigo e milhocina. Assim sendo, o ponto assinalado como ótimo corresponde a

2,5% (p/v) de farelo de trigo e 1,2% (p/v) de milhocina. Nestas condições, o modelo prevê

uma produção de endoxilanase de 44,0 U/mL, sendo possível atingir valores máximos de

48,7 U/mL.

O Diagrama de Pareto fornece o efeito quantitativo estimado que cada uma das

variáveis possui sobre a atividade endoxilanásica (Fig. 16), estabelecendo quais destes

efeitos encontram-se dentro do grau de confiança estabelecido para a análise estatística

(95%). Cabe destacar que os fatores correspondentes ao efeito linear das variáveis tempo

[(3) T] e concentração da fonte de nitrogênio [(2) N], mostraram significância estatística,


59

do mesmo modo que as interações lineares entre as variáveis tempo e concentração de fonte

de nitrogênio (2 by 3) e concentração de fonte de carbono e concentração de fonte de

nitrogênio (1 by 2). A variável concentração de fonte de carbono [(1) C], bem como sua

interação com a variável tempo (1 by 3) não apresentaram significância estatística.

Efeito Estimado (valores absolutos)

Figura 16: Diagrama de Pareto para o efeito estimado de cada variável. Planejamento Fatorial Simples (23)

Erro Puro = 0,765

Variáveis Dependentes = tempo (T) e concentrações de fontes de carbono (C) e nitrogênio (N)

4.3. Produção de Endoxilanases em Bioreatores de 2L

O perfil cinético da produção enzimática em meio líquido contendo sais minerais

em biorreator de 2L, nas melhores condições obtidas em frascos agitados [2,5% (p/v) farelo

de trigo e 1,2% (p/v) de milhocina], foi obtido durante 6 dias de cultivo em diferentes

condições de agitação e aeração, a 30ºC. A maior atividade endoxilanásica (média de 56,5

U/mL) foi obtida após 5 dias de fermentação, empregando 300 rpm de agitação e 0,5 vvm

de aeração, de acordo com o ensaio 1, exibido na Fig. 17. Nesta mesma figura, observa-se


60

que quando a agitação e a aeração foram utilizadas em níveis máximos (600 rpm e 1,5

vvm), a atividade endoxilanásica foi muito baixa (5,9 U/mL). O aumento da velocidade de

agitação para 600 rpm, porém com uma taxa de aeração baixa (0,5 vvm), a atividade

endoxilanásica também foi bastante alta ao término de 6 dias de cultivo (46,4 U/mL). Por

outro lado, a utilização de uma velocidade de agitação de 300 rpm e uma taxa de aeração

maior (1,5 vvm) resultou numa produção máxima de endoxilanase de apenas 12,2 U/mL.

Com relação aos valores de pH, não foi detectada grandes alterações em quaisquer

situações estudadas. Os valores de pH ficaram entre os 7,0 e 7,6.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

0 1 2 3 4 5 6 70,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

Ativ

idad

e X

ilana

se (U

/mA

tivid

ade

Xila

nolít

ica

(U/m

L)

% O

.D.

% O

.D.

Tempo (dias)Tempo (dias)

Figura 17: Produção de endoxilanases por S. malaysiensis AMT-3 a 30ºC, em biorreator de 2L contendo meio de sais minerais suplementado com 2.5% (p/v) farelo de trigo e 1.2% (p/v) milhocina nas seguintes condições: Atividade enzimática: (-▲-) ensaio 1 [300 rpm e 0,5 vvm]; (-■-) ensaio 2 [600 rpm e 0,5 vvm]; (-♦-) ensaio 3 [300 rpm e 1,5 vvm]; (- -) ensaio 4 [600 rpm e 1,5 vvm]. % Oxigênio Dissolvido (O.D.): (-∆-) ensaio 1 [300 rpm e 0,5 vvm]; (- -) ensaio 2 [600 rpm e 0,5 vvm]; (- -) ensaio 3 [300 rpm e 1,5 vvm]; (- -) ensaio 4 [600 rpm e 1,5 vvm]. O gráfico representa a média das réplicas (Desvio Padrão máximo de12,48).


61

No presente trabalho, as variáveis aeração e agitação foram estatisticamente

melhoradas, com o auxílio do planejamento fatorial, utilizando 2 níveis e 2 variáveis (22). O

melhor sistema apontado pelo planejamento fatorial está descrito na Tabela 13. A melhor

produção de endoxilanase (56,5 U/mL) foi observada no ensaio 1, quando os níveis

mínimos de agitação [300 rpm] e aeração [0,5 vvm] foram utilizados, ao término de 5 dias.

Com um nível de 5% de probabilidade (95% de confiabilidade estatística), o

coeficiente linear de X1 (agitação), X2 (aeração) e o coeficiente de interação X1X2, foram

significativos. O modelo matemático que representa a atividade endoxilanásica (Z) na

região experimental estudada pode ser expressa pela equação abaixo:

A resposta de superfície descrita no modelo da equação Z para estimar a atividade

endoxilanásica sobre as variáveis independentes agitação (X1) e aeração (X2) pode ser

observada na Fig. 18. A produção de endoxilanases atingiu os máximos valores na região

dos níveis ‘-1’ tanto para o parâmetro agitação (300 rpm) como também para o parâmetro

aeração (0,5 vvm).

Tabela 13: Planejamento fatorial (22) e resultados obtidos.

Níveis Atividade Endoxilanase

(U/mL) Ensaio

X1 X2 Observado Predito

1 –1 –1 65,2 56,5

2 +1 –1 7,5 9,7

3 –1 +1 5,5 5,1

4 +1 +1 5,0 4,1

5* –1 –1 47,8 56,5

6* +1 –1 11,9 9,7

7* –1 +1 4,7 5,1

8* +1 +1 3,2 4,1

Z = 151,9 – 0,2323*X1 – 97,2*X2 + 0,1527*X1*X2


62

Figura 18: Superfície de Resposta para a Otimização da Produção de Endoxilanases em diferentes valores de velocidade agitação e taxa de aeração investigados. O modelo do desenho padrão (22) utilizado para a metodologia de superficie de resposta prevê o melhor ponto para a produção de endoxilanases.

Baseado no modelo obtido, as condições melhoradas de trabalho foram definidas

com o intuito de atingir a máxima produção de endoxilanases, através da minimização da

velocidade de agitação e da taxa de aeração. Assim sendo, o ponto assinalado como ótimo

corresponde a uma velocidade de agitação de 300 rpm e uma taxa de aeração de 0,5 vvm.

Nestas condições, o modelo prevê uma produção de endoxilanase de 57,0 U/mL, sendo

possível atingir valores máximos de 63,7 U/mL.

O Diagrama de Pareto fornece o efeito quantitativo estimado que cada uma das

variáveis possui sobre a atividade endoxilanásica (Fig. 19), estabelecendo quais destes

efeitos encontram-se dentro do grau de confiança estabelecido para a análise estatística

(95%). Cabe destacar que os fatores correspondentes ao efeito linear das variáveis


63

velocidade de agitação [(1) rpm] e taxa de aeração [(2) vvm], mostraram significância

estatística, de ordem inversa, ao contrário do observado para a interação linear entre estas

variáveis (1 by 2).

Efeito Estimado (valor absoluto)

Figura 19: Diagrama de Pareto para o efeito estimado de cada variável. Planejamento Fatorial Simples (22)

Erro Puro = 27,75

Variáveis Dependentes = velocidade de agitação (rpm) e taxa de aeração (vvm)


Com o intuito de se avaliar o desempenho do estreptomiceto produtor de

endoxilanase, procedeu-se ao estudo em escala ampliada (aumento de 8 vezes), utilizando

um biorreator do tipo STR de capacidade nominal 16L, fabricado pela Bioengeneering.

Empregou-se a melhor condição obtida em biorreator de 2L e como critérios de ampliação

de escala foram utilizados o geométrico, baseando na manutenção da velocidade periférica


64

do impelidor e o de transferência de massa, baseado na manutenção do valor de KLa. Para a

utilização do critério da aeração é necessário determinar os valores de KLa para cada

biorreator, a fim de, através da fixação deste parâmetro, fazer a ampliação de escala. Os

valores de KLa medidos para os biorreatores de 2 e 16L estão apresentados na Fig. 20.

Comparando os dois critérios, o critério geométrico apresentou maior influência na

produção de endoxilanases, embora o valor da atividade enzimática (3,2 U/mL) tenha caído

mais de 94%. O criterio de KLa apresentou valores muito inferiores aqueles obtidos em 2L

e também em 16L, pelo critério geométrico, chegando a atividade máxima de 0,9 U/mL, ao

fim de 4 dias.


65

0

15

30

45

60

75

90

105

120

KL

a (h

-

135

150

0,17 0,25 0,33 0,42

Q/V (vvm)

A

1K

La

(h-1

)

B

0,0

15,0

30,0

45,0

60,0

75,0

90,0

105,0

120,0

135,0

150,0

0,25 0,50 0,75 1,00

Q/V (vvm)

KL

a (h

-1 K

La

(h-1

)

0,0

15,0

30,0

45,0

60,0

75,0

90,0

105,0

120,0

135,0

150,0

150 200 250 300

V (rpm)

C

KL

a (h

-1K

La

(h-1

)

Figura 20: Determinação do KLa pelo método de desgaseificação no biorreator de 2L (A), e no biorreator de 16L, fixando a agitação em 300 rpm (B) e a aeração em 0,5 vvm (C).


66

4.6. Caracterização Parcial das Endoxilanases

Utilizando-se o extrato do sobrenadante obtido em 2,5% (p/v) farelo de trigo e 1,2%

(p/v) milhocina, foi possível determinar o perfil de temperatura e pH da atividade

endoxilanásica produzida (Fig. 21). A temperatura ótima de atividade enzimática foi a

60oC, enquanto que entre 40o e 70o C observou-se uma atividade enzimática relativa

superior a 60%. Além disso, 90ºC ainda pode-se observar uma atividade relativa de 20% da

original. Quanto ao pH, a endoxilanase apresentou um ótimo em pH 6,0 (Fig. 22),

mantendo mais de 60% do máximo da atividade na faixa de pH 5,0–9,0, podendo estas

serem importantes características quando se pensa em aplicações industriais.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Temp (°C)

Ativ

idad

e R

elat

iva

Ativ

idad

e R

elat

iva

(%)

Temp (ºC)

Figura 21: Efeito da temperatura na atividade endoxilanásica produzida extracelularmente pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3, crescida a 28°C por 6 dias em farelo de trigo e milhocina, ensaio 4. A atividade relativa está expressa como a percentagem do máximo (100% de atividade = 51,9 U/mL).


67

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0

pH

Ativ

idad

e R

elat

iva

Ativ

idad

e R

elat

iva

(%)

pH

Figura 22: Efeito do pH na atividade endoxilanásica produzida extracelularmente pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3, crescida a 28°C por 6 dias em farelo de trigo e milhocina, ensaio 4. A força iônica dos tampões foi de 50 mM: glicina-HCl ( ), citrato de sódio ( ), fosfato ( ), Tris-HCl ( ), glicina-NaOH (-x-). A atividade relativa está expressa como a percentagem do máximo (100% de atividade = 58,1 U/mL).

O estudo de termoestabilidade da preparação enzimática demonstrou que a atividade

endoxilanásica se manteve bastante estável a 50ºC, retendo 50% e 18% da atividade

original após, respectivamente, 6 e 20 horas de pré-incubação a pH 6,0. Tal aspecto não foi

observado para a temperatura de 60ºC, em que se verificou uma total inativação após 2

horas de pré-incubação (Fig. 23).


68

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Tempo (horas

Ativ

idad

e R

elat

iva

Ativ

idad

e R

elat

iva

(%)

)Tempo (h)

Figura 23: Estudo da termoestabilidade na atividade endoxilanásica, produzida extracelularmente pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3, crescida a 28°C por 6 dias em farelo de trigo e milhocina, ensaio 4, utilizando temperaturas de 60ºC ( ) e de 50ºC ( ).

A estabilidade a estocagem também foi estudada. O extrato enzimático obtido foi

estocado a -20ºC e a cada 60 dias uma amostra foi retirada e a atividade xilanolítica

determinada. Os resultados demonstraram uma alta estabilidade mesmo após 240 dias,

perdendo aproximadamente 10% da atividade enzimática original.

No que diz respeito aos íons metálicos, a atividade de endoxilanase não sofreu

nenhum efeito de ativação. Entretanto, na presença de íons, como Cu2+ (13,2%), Zn2+

(14,6%) Fe2+ (29,8%) e Mn2+ (9,5%) provocaram uma forte inibição (superior a 70%) da

atividade, enquanto que os íons Na2+ (56,3%), K+ (65,1%) e Mg2+ (54,4%), provocaram um

fraco efeito inibitório (inferior a 46,0%) (Tabela 14).


69

Tabela 14: Efeito dos diferentes íons metálicos na atividade xilanolítica produzida extracelularmente pela S. malaysiensis AMT-3, cultivada a 28ºC durante 6 dias em farelo de trigo (2,5%) e milhocina (1,2%). O valor correspondente a 100% de atividade de endoxilanase foi de 58,1 U/mL).

Íon Metálico

(10mM) Atividade Relativa (%)

Controle (sem adição)

100,0

Mg2+ 54,4 Zn2+ 14,6 Cu2+ 13,2 Na2+ 56,3 Ba2+ 94,5 Mn2+ 9,5 Fe2+ 29,8 Ca2+ 99,0 K+ 65,1

EDTA 58,0

Observou-se no zimograma (Fig 24) a produção de endoxilanases em todas as

condições testadas. Em todos os extratos obtidos, foram detectadas 3 bandas distintas,

provenientes das diversas condições investigadas dentro do planejamento fatorial, uma na

região de 690 kDa, uma em 180 kDa e outra em 142 kDa, indicando portanto 2 enzimas

diferentes e a presença de 1 complexo xilanossomo, diferenciando apenas na intensidade

delas. Com relação aos extratos obtidos em farelo de trigo e milhocina, as bandas

apresentaram maior intensidade.


70

1 2 3 4 5 6 7 8

690 180

142

Figura 24: Análise de zimograma da atividade xilanolítica no sobrenadante da estirpe S.

malaysiensis AMT-3, crescida em:

linha 1 (farelo de trigo e extrato de levedura, ensaio 1, 4º dia) ; linha 2 (farelo de trigo e extrato de

levedura, ensaio 2, 5º dia); linha 3 (dreche cervejeiro e extrato de levedura, ensaio 2, 5º dia); linha

4 (dreche cervejeiro e extrato de levedura, ensaio 1, 4º dia); linha 5 (farelo de trigo e milhocina,

ensaio 4, 6º dia); linha 6 (farelo de trigo e milhocina, ensaio 3, 5º dia); linha 7 (dreche cervejeiro e

milhocina, ensaio 2, 6º dia); linha 8 (dreche cervejeiro e milhocina, ensaio 4, 6º dia).

Foram aplicados no gel 150 mU de atividade xilanásica. O gel contendo os marcadores de massa

molecular foi corado através do Comassie Blue, e a massa molecular calculada (kDa) se encontra do

lado esquerdo da figura.

4.7 Estudo da Produção de CMCases e Caracterização Parcial

Para acompanhar a produção concomitante de celulases ao longo do processo

fermentativo, dentro do estudo de planejamento fatorial, também foram analisadas as

melhores condições para obter maiores valores de atividade enzimática celulolítica. O perfil

cinético da produção enzimática em meio líquido de sais minerais, contendo a combinação

alternada de 2 fontes de carbono (farelo de trigo e dreche cervejeiro) e nitrogênio


71

(milhocina e extrato de levedura), em diferentes concentrações cada uma, foi obtido após 6

dias de cultivo sob agitação (200 rpm), a 28ºC (Fig. 25). A maior atividade de CMCase

(720 U/L) foi obtida após 4 dias de fermentação, utilizando dreche cervejeiro [0,5% (p/v)]

como fonte de carbono e milhocina 1,2% (p/v)] como fonte de nitrogênio, de acordo com o

ensaio 3 (Fig. 25A). Por outro lado, quando utilizou-se o extrato de levedura como fonte de

nitrogênio, no nível mínimo (0,1%), observou-se uma produção máxima de CMCase (580

U/L) ao fim de 4 dias, e mesmo com 3 dias, observou-se valores promissores (440 U/L)

quando comparada com a fonte milhocina (Fig. 25B). A utilização da combinação das

fontes farelo de trigo (0,5%) e extrato de levedura (0,1%) não foi favorável a produção de

CMCases, com valores máximos de atividade enzimática (340 U/L), obtidos ao fim de 5

dias (Fig. 26B). Por outro lado, com a utilização de milhocina como fonte de nitrogênio,

nas concentrações máximas, obteve-se uma produção máxima de CMCases (510 U/L) ao

fim de 6 dias (Fig. 26A).


72

A

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 1 2 3 4 5 6

Tempo (dias)

Ativ

idad

e C

MC

ase

(UA

tivid

ade

Cel

ulol

ítica

(U/L

)

7

B

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 1 2 3 4 5 6 7

Tempo (dias)

Ativ

idad

e CM

Case

(U

Ativ

idad

e C

elul

olíti

ca (U

/L)

Figura 25: Produção de CMCases por S. malaysiensis AMT-3 a 28ºC, em meio de sais minerais contendo: (A) dreche cervejeiro e milhocina; (B) dreche cervejeiro e extrato de levedura, em diferentes concentrações como descrito a seguir: (-∆-) ensaio 1 [C 0,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-□-) ensaio 2 [C 2,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-▲-) ensaio 3 [C 0,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]; (-■-) ensaio 4 [C 2,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]. O gráfico representa a média das réplicas (Desvio Padrão máximo < 10%)


73

A

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 1 2 3 4 5 6 7Tempo (dias)

Ativ

idad

e C

MC

ase

(UA

tivid

ade

Cel

ulol

ítica

(U/L

)

B

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 1 2 3 4 5 6 7

Tempo (dias)

Ativ

idad

e C

MC

ase

(UA

tivid

ade

Cel

ulol

ítica

(U/L

)

Figura 26: Produção de CMCases por S. malaysiensis AMT-3 a 28ºC, em meio de sais minerais contendo: (A) farelo de trigo e milhocina; (B) farelo de trigo e extrato de levedura, em diferentes concentrações como descrito a seguir: (-∆-) ensaio 1 [C 0,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-□-) ensaio 2 [C 2,5% (p/v) e N 0,1% (p/v)]; (-▲-) ensaio 3 [C 0,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]; (-■-) ensaio 4 [C 2,5% (p/v) e N 1,2% (p/v)]. O gráfico representa a média das réplicas (Desvio Padrão máximo < 10%).


74

Desta forma, utilizou-se o extrato obtido em dreche cervejeiro e milhocina, ensaio

3, para determinar o perfil de temperatura e pH da atividade celulásica produzida. A

temperatura ótima de atividade enzimática foi a 50oC, ainda retendo entre 40º e 60ºC

valores próximos a 100% (Fig. 27), enquanto que entre 20o e 70oC observou-se uma

atividade enzimática relativa superior a 50%. Além disso, a 90ºC, ainda pode-se observar

uma atividade relativa superior a 20%. Quanto ao pH, a CMCase apresentou uma atividade

máxima em pH 4,0 (Fig. 28), mantendo mais de 60% do máximo da atividade na faixa de

pH 2,0–9,0, podendo estas serem importantes características quando se pensa em aplicações

industriais.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Temp(oC)

R

esid

ual A

ctiv

ityA

tivid

ade

Rel

ativ

a (%

)

Temp (ºC)

Figura 27: Efeito da temperatura na atividade celulolítica produzida extracelularmente pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3, crescida a 28°C por 4 dias em dreche cervejeiro e milhocina, ensaio 3. A atividade relativa está expressa como a percentagem do máximo (100% de atividade = 700 U/L).


75

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

pH

Rel

ativ

e A

ctiv

ity

Ativ

idad

e R

elat

iva

(%)

pH

Figura 28: Efeito do pH na atividade celulolítica produzida extracelularmente pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3, crescida a 28°C por 4 dias em dreche cervejeiro e milhocina, ensaio 3. A força iônica dos tampões foi de 50 mM: glicina-HCl ( ), citrato de sódio ( ), fosfato ( ), Tris-HCl (-x-), glicina-NaOH ( ). A atividade relativa está expressa como a percentagem do máximo (100% de atividade = 620 U/L).

O estudo de termoestabilidade da preparação enzimática demonstrou que a atividade

de celulase se manteve bastante estável a 40ºC, retendo 80% e 50% da atividade original

após, respectivamente, 6 e 24 horas de pré-incubação a pH 4,8. Tal aspecto não foi

observado para as temperaturas de 50º e 60ºC, em que se verificou uma forte perda de

atividade após 4 horas de pré-incubação, rentendo apenas 12% de atividade (50ºC) e uma

total inativação após 1 hora de pré-incubação a 60ºC (Fig. 29).


76

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Tempo (h)

Ativ

idad

e R

elat

iva

Ativ

idad

e R

elat

iva

(%)

Tempo (h)

Figura 29: Estudo da termoestabilidade na atividade celulolítica produzida extracelularmente pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3, crescida a 28°C por 4 dias em dreche cervejeiro e milhocina, ensaio 3, utilizando temperaturas de 60ºC ( ), 50º ( ) e 40ºC ( ).

Observou-se no zimograma (Fig 30) a produção de CMCases em algumas das

condições testadas. Ao todo foram detectadas duas bandas distintas, provenientes das

melhores condições estudadas dentro do planejamento fatorial, uma em 178 kDa e outra em

51 kDa, indicando portanto duas enzimas diferentes.

Nos extratos obtidos com 2,5% (p/v) farelo de trigo e 0,1% (p/v) milhocina, 0,5%

(p/v) dreche cervejeiro e 1,2% (p/v) milhocina, 0,5% (p/v) dreche cervejeiro e 0,1% (p/v)

extrato de levedura, observaram-se apenas duas bandas, sendo que a melhor condição para

a produção de celulase (dreche cervejeiro e milhocina, ensaio 3), apresentou maior

intensidade na banda de 178 kDa (Fig. 30). Não se observou muita alteração de intensidade

na banda de 51 kDa para os três extratos testados.


77

1 2 3

178 51

Figura 30: Análise de zimograma da atividade celulolítica no sobrenadante da estirpe S. malaysiensis AMT-3, crescida em: linha 1 (farelo de trigo e milhocina, ensaio 2, 4º dia) ; linha 2 (dreche cervejeiro e milhocina, ensaio 3, 5º dia); linha 3 (dreche cervejeiro e extrato de levedura, ensaio 1, 4º dia); Foram aplicados no gel 500 mU de atividade celulásica. O gel contendo os marcadores de massa molecular foi corado através do Comassie Blue, e a massa molecular calculada (kDa) se encontra do lado esquerdo da figura.

4.8. Estudo da Produção de Peptidases e Caracterização Parcial

Paralelamente ao estudo da produção de xilanases, foi realizado um estudo para

avaliar a capacidade da estirpe S. malaysiensis AMT-3 em produzir peptidases, utilizando a

técnica de SDS-PAGE. A habilidade das peptidases produzidas extracelularmente em

degradar diferentes substratos protéicos foi ensaiada utilizando 4 diferentes substratos

(gelatina, BSA, caseína e hemoglobina) incorporados ao gel. O sobrenadante utilizado

inicialmente foi aquele obtido com o crescimento da estirpe em farelo de trigo [2,5% (p/v)]

e extrato de levedura [0,1% (p/v)]. Somente a peptidase contendo uma massa molecular

aparente de 116 kDa teve a habilidade em hidrolisar os 4 substratos testados, enquanto que

a peptidase que migrou a 212 kDa degradou o substrato gelatina, BSA e hemoglobina (Fig.

31). Entretanto, após ferver o extrato bruto na presença de DTT, verificou-se que as


78

proteínas com massa molecular aparente de 212 e 116 kDa provavelmente correspondiam a

agregados de diferentes proteínas, tendo em vista o desaparecimento destas bandas no gel e

o surgimento de novas bandas com menor massa molecular. A análise em SDS-PAGE

desta amostra foi realizada e indicou que as enzimas foram irreversivelmente destruídas

com este tratamento. As peptidases remanescentes (20, 35, 43, 50, 70, and 100 kDa)

detectadas neste estudo foram capazes de degradar somente a gelatina, sendo este substrato

adotado para estudos posteriores em sistema SDS-PAGE (Fig. 31).

Figura 31: Efeito de diferentes substratos proteícos incorporados a 10% SDS-PAGE na detecção de peptidases extracelulares produzidas por S. malaysiensis AMT-3: (G) gelatina, (C) caseína, (H) hemoglobina, (B) albumina sérica bovino. A massa molecular aparente, calculada de acordo com a migração dos marcadores, em kDa, está indicado no lado esquerdo da figura.

A produção de peptidases foi examinada na presença de farelo de trigo e extrato de

levedura em diferentes concentrações, de acordo com os ensaios 1 a 4 descritos

anteriormente. Verificou-se inicialmente que a melhor produção, examinada no 5º dia, foi

obtida na menor concentração de extrato de levedura [0,1% (p/v)] combinada com a maior

concentração de farelo de trigo [2,5% (p/v)] (ensaio 2) (Fig. 32A). Quando o farelo de

trigo foi utilizado na menor concentração [0,5% (p/v)] (ensaios 1 e 3), a enzima proteolítica


79

que migrou a 100 kDa não apresentou uma banda de grande intensidade, enquanto que a de

20 kDa não foi detectada. Por outro lado, quando a máxima concentração de extrato de

levedura [1,2% (p/v)] foi utilizada, para ambas as concentrações de farelo de trigo (ensaios

3 e 4), as peptidases que migraram em 43 e 70 kDa não foram detectadas, enquanto que

outras, como as de 20, 35 e 50 kDa não apresentaram bandas com grande intensidade (Fig.

32A).

A cinética de produção de peptidases em farelo de trigo [2,5% (p/v)] e extrato de

levedura [0,1% (p/v)] (ensaio 2) está apresentada na Fig. 32B. Podemos observar que a

partir do 3ºdia de fermentação, as primeiras bandas proteolíticas, em 43 e 50 kDa começam

a ser produzidas, sendo a máxima produção de peptidases detectada ao término de 5 dias de

fermentação. Entre as massas moleculares aparentes de 35 e 43 kDa, podemos observar

uma fraca banda proteolítica.


80

A B

Figura 32: Estudo da produção de peptidases pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 utilizando farelo de trigo e extrato de levedura como substratos. (A) SDS-PAGE dos sobrenadantes obtidos em diferentes concentrações de C e N após 5 dias de incubação: linha 1 (ensaio 1), linha 2 (ensaio 2), linha 3 (ensaio 3) e linha 4 (ensaio 4). (B) Cinética da produção de peptidases observada através do SDS-PAGE, a partir dos sobrenadantes obtido em 2,5% (p/v) farelo de trigo e 0,1% (p/v) de extrato de levedura (ensaio 2): linhas de 1 a 6, 1º ao 6º dia, respectivamente. A massa molecular aparente, calculada de acordo com a migração dos marcadores, em kDa, está indicado no lado esquerdo da figura. Os ensaios de 1 a 4 estão descritos nos Materiais e Métodos.


81

Quando foram utilizadas as fontes dreche cervejeiro e milhocina, não se observou o

mesmo perfil de produção de peptidases como observado para farelo de trigo e extrato de

levedura. Nas menores concentrações estudadas, observou-se uma maior produção de

peptidases ao fim de 5 dias de fermentação, apresentando bandas entre 212 e 35 kDa (Fig.

33A), sendo as bandas de 116 kDa as com maior intensidade. Ao aumentar a concentração

de dreche cervejeiro para 2,5% (p/v), mantendo-se a concentração de 0,1% (p/v) de

milhocina, a banda com 212 kDa não foi detectada (Fig. 33B). Contudo, quando se utilizou

0,5% (p/v) de dreche cervejeiro com 1,2% (p/v), houve uma boa produção de peptidases já

a partir do 3º dia, mantendo-se praticamente estável ao longo de todo o processo

fermentativo (Fig. 33C), e observando-se diversas bandas proteolíticas (212, 116, 50, 35 e

29 kDa). Já ao se utilizar as concentrações máximas de dreche cervejeiro [2,5% (p/v)] e

milhocina [1,2% (p/v)], praticamente não houve produção de peptidases, sendo apenas

detectadas algumas bandas ao término de 6 dias de fermentação (Fig. 33D).


82

A B

1 2 3 4 1 2 3 4

176.5 113.7

80.9 63.8

49.5 37.4 26.0

176.5 113.7

80.9 63.8

49.5 37.4 26.0

D C

176.5 113.7

80.9 63.8 49.5 37.4

176.5 113.7

80.9 63.8 49.5 37.4

1 2 3 4 1 2 3 4

Figura 33: Estudo da produção de proteases pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 utilizando dreche cervejeiro e milhocina como substratos. (A) SDS-PAGE da condição 0,5% (p/v) dreche cervejeiro e 0,1% (p/v) de milhocina (ensaio 1): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (B) SDS-PAGE da condição 2,5% (p/v) dreche cervejeiro e 0,1% (p/v) de milhocina (ensaio 2): linha 1 (5º dia), linha 2 (3º dia), linha 3 (4º dia) e linha 4 (6º dia). (C) SDS-PAGE da condição 0.5% (p/v) dreche cervejeiro e 1.2% (p/v) de milhocina (ensaio 3): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (D) SDS-PAGE da condição 2,5% (p/v) dreche cervejeiro e 1,2% (p/v) de milhocina (ensaio 4): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). A massa molecular aparente dos marcadores encontra-se ao lado esquerdo de cada gel


83

Já quando as fontes dreche cervejeiro e extrato de levedura foram utilizadas um

novo perfil de produção de peptidases se apresentou, diferente daqueles observados para

farelo de trigo e extrato de levedura ou mesmo para dreche cervejeiro e milhocina. Ao

utilizar dreche cervejeiro e extrato de levedura nas menores concentrações estudadas,

observou-se uma maior produção de peptidases ao término de 4 dias de fermentação,

apresentando bandas proteolíticas entre 145 e 29 kDa (Fig. 34A). Ao aumentar a

concentração de dreche cervejeiro para 2,5% (p/v), mantendo a concentração de 0,1% (p/v)

de extrato de levedura, as bandas apresentaram uma grande intensidade, embora sendo

detectadas apenas 3 peptidases, com 145 kDa, 64 kDa e 35 kDa (Fig. 34B), com início

apenas a partir do 4º dia. Contudo, quando se utilizou 0,5% (p/v) de dreche cervejeiro com

1,2% (p/v) de extrato de levedura, houve uma pequena produção de peptidases já a partir do

3º dia, mantendo-se praticamente estável ao longo do processo fermentativo (Fig. 34C).

Porém, quando se utilizou as concentrações máximas de dreche cervejeiro [2,5% (p/v)] e

extrato de levedura [1,2% (p/v)], praticamente não houve produção de peptidases com 3 e 4

dias, sendo apenas detectadas algumas bandas ao fim de 5 dias de fermentação, mas com

bandas com grande intensidade ao fim de 6 dias (Fig. 34D).

A utilização de farelo de trigo e milhocina, melhor condição para a produção de

xilanases, não foi favorável para a produção de peptidases, como foi observado com a

condição farelo de trigo e extrato de levedura. Ao utilizar farelo de trigo e milhocina nas

menores concentrações estudadas, houve uma pequena produção de peptidases já a partir

do 3º dia, mantendo-se praticamente estável ao longo do processo fermentativo (Fig. 35A),

sendo detectado bandas proteolíticas com 116, 50, 35 e 29 kDa. Ao aumentar a

concentração de farelo de trigo [2,5% (p/v)] observou-se uma maior produção de peptidases

ao término de 4 dias de fermentação, apresentando um perfil similar àquele obtido com a

utilização de farelo de trigo em menor concentração (Fig. 35B). Quando se utilizou a

milhocina na concentração de 1,2% (p/v), a produção de peptidase teve início a partir do 4º

dia, apresentando poucas bandas, atingindo um nível máximo após 5 dias de fermentação,

na concentração mínima de farelo de trigo (Fig. 35C) e após 6 dias na concentração

máxima de farelo de trigo (Fig. 35D).


84

A B

176.5 113.7

80.9

63.8

49.5 37.4

26.0 1 2 3 4 1 2 3 4

176.5 113.7

80.9

63.8

49.5 37.4

26.0

176.5 113.7 80.9 63.8

49.5 37.4

C D

176.5 113.7 80.9 63.8

49.5 37.4

1 2 3 4 1 2 3 4

Figura 34: Estudo da produção de proteases pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 utilizando dreche cervejeiro e extrato de levedura como substratos. (A) SDS-PAGE da condição 0,5% (p/v) dreche cervejeiro e 0,1% (p/v) de extrato de levedura (ensaio 1): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (B) SDS-PAGE da condição 2,5% (p/v) dreche cervejeiro e 0,1% (p/v) de extrato de levedura (ensaio 2): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (C) SDS-PAGE da condição 0,5% (p/v) dreche cervejeiro e 1,2% (p/v) de extrato de levedura (ensaio 3): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (D) SDS-PAGE da condição 2,5% (p/v) dreche cervejeiro e 1,2% (p/v) de extrato de levedura (ensaio 4): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). A massa molecular aparente dos marcadores encontra-se ao lado esquerdo de cada gel.


85

A B

176.5 113.7 80.9 63.8 49.5

37.4 26.0

1 2 3 4 1 2 3 4

C

176.5 113.7 80.9 63.8 49.5

37.4 26.0

D

176.5

113.7 80.9

63.8

49.5

37.4 26.0

1 2 3 4 1 2 3 4

176.5

113.7 80.9

63.8

49.5

37.4 26.0

Figura 35: Estudo da produção de proteases pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 utilizando farelo de trigo e milhocina como substratos. (A) SDS-PAGE da condição 0,5% (p/v) farelo de trigo e 0,1% (p/v) de milhocina (ensaio 1): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (B) SDS-PAGE da condição 2,5% (p/v) farelo de trigo e 0,1% (p/v) de milhocina (ensaio 2): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (C) SDS-PAGE da condição 0,5% (p/v) farelo de trigo e 1,2% (p/v) de milhocina (ensaio 3): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). (D) SDS-PAGE da condição 2,5% (p/v) farelo de trigo e 1,2% (p/v) de milhocina (ensaio 4): linha 1 (3º dia), linha 2 (4º dia), linha 3 (5º dia) e linha 4 (6º dia). A massa molecular aparente dos marcadores encontra-se ao lado esquerdo de cada gel.


86

As peptidases foram caracterizadas parcialmente em sistema SDS-PAGE, utilizando

a melhor condição observada (farelo de trigo e extrato de levedura, ensaio 2). O perfil de

temperatura das peptidases estudadas apresentou um ótimo a 37ºC. Contudo também foi

verificada uma boa atividade proteolítica a altas temperaturas, como 60º e 70ºC (Fig. 36).

Para as peptidases com massa molecular acima de 116 kDa, o ótimo de pH foi

observado em 7,0, mas níveis significativos de atividade foram detectados numa faixa de

pH entre o 6,0 e o 8,0 (Fig. 37).

Figura 36: Efeito da temperatura da atividade proteolítica de S. malaysiensis AMT-3, analisada em SDS-PAGE. As tiras do gel foram incubadas por 4 horas, em diferentes temperaturas (28°, 37°, 50°, 60° e 70°C) em tampão fosfato 50 mM pH 7,0. A linha C é uma tira de gel corada imediatamente após tratamento com Triton X-100. A massa molecular calculada (kDa) se encontra no lado esquerdo da figura.


87

pH

Figura 37: Efeito do pH da atividade proteolítica de S. malaysiensis AMT-3, analisada em SDS-PAGE. As tiras do gel foram incubadas por 4 horas, em diferentes tampões com força iônica de 50 mM, variando o pH de 3 – 10,0, a 37ºC. A linha C é uma tira de gel corada imediatamente após tratamento com Triton X-100. A massa molecular calculada (kDa) encontra-se no lado esquerdo da figura.

Os perfis obtidos para a termoestabilidade das atividades proteolíticas produzidas

por S. malaysiensis AMT-3, em pH 7,0 estão representados na Fig. 38. Quando o

sobrenadante bruto foi pré-incubado a 60ºC, pelo menos parte da atividade proteolítica,

especialmente a banda de 35 kDa, foi retida, mesmo após 480 minutos de exposição a esta

temperatura. A banda proteolítica de 35 kDa foi totalmente inativada apos 120 min. de pré-

incubação a 70ºC.

As bandas proteolíticas de 212, 116, 100 e 35 kDa foram classificadas como sendo

pertencentes a classe de serina-peptidase, uma vez que elas foram inibidas por PMSF (Fig.

39, linha B e benzamidina (dado não mostrado).Todas as outras enzimas detectadas foram

classificadas como sendo metalo-peptidases, baseado na inibição por 1,10-fenantrolina

(Fig. 39, linha C). É importante ressaltar que cada inibidor foi adicionado ao tampão de

amostra SDS-PAGE, com o intuito de prevenir a atividade proteolítica de bandas com alto

peso molecular ao longo da corrida eletroforética. Outros inibidores foram utilizados, como

o agente DTT, o inibidor especifico de cisteina peptidase (E-64) e o inibidor de aspártico


88

peptidase (pepstatina A), mas não apresentaram qualquer efeito nas bandas proteolíticas

detectadas.

Figura 38: Termoestabilidade das atividades proteolíticas da estirpe S. malaysiensis AMT-3. O sobrenadante da cultura foi pré-incubado em diferentes temperaturas (28°, 37°, 50°, 60° e 70°C) por 30, 120 e 480 minutos e a atividade enzimática residual foi determinada através da gelatina-SDS-PAGE. As tiras do gel foram incubadas por 4 horas a 37ºC, em tampão fosfato 50 mM, pH 7,0.


89

Figura 39: Perfil de inibição da atividade proteolítica produzida pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 em gelatina-SDS-PAGE. As tiras do gel foram incubadas por 4 horas, a 37ºC em tampão fosfato 50 mM pH 7,0: (A) sem inibidor, (B) 1µM PMSF, (C) 10 mM 1,10-fenanthrolina. As letras s e m referem a classe proteolítica, serina e metalo peptidase, respectivamente.

Nascimento, R.P. Discussão

90

5. DISCUSSÃO

Dentre os vários microrganismos degradadores de materiais lignocelulósicos, os

actinomicetos, um grupo de bactérias filamentosas Gram positivas, são considerados

grandes produtores de enzimas lignocelulolíticas (Wang et al., 1993, Lima et al., 2005),

sendo a atividade xilanolítica uma das mais abundantes (Nascimento et al., 2003). A

grande maioria dos representantes dos actinomicetos cresce em forma miceliar,

invasiva, semelhantemente aos fungos filamentosos. Esta característica torna-se

vantajosa para o microrganismo, pois aumenta a área de contato com o substrato e

consequentemente aumenta sua capacidade de degradação. Por habitarem o solo, os

actinomicetos já estão adaptados a colonizar resíduos sólidos, como restos vegetais e

animais, participando ativamente da ciclagem da matéria orgânica. No presente

trabalho, a estirpe xilanolítica Streptomyces malaysiensis AMT-3, isolada de solo sob

vegetação de cerrado, foi utilizada em estudos de otimização e escalonamento da

produção de xilanases utilizando resíduos de baixo custo. Outros estudos, visando a

caracterização da atividade xilanolítica também foram realizados.

O estudo cinético para análise de qualquer reação química é uma ferramenta de

extrema importância, implicando na determinação das taxas de transformação dos

reagentes em produtos assim como na determinação da influência do meio reacional

sobre as taxas das transformações químicas. O valor de Km (1,56 mg/mL) obtido para a

endoxilanase produzida pela estirpe S. malaysiensis AMT-3 sugere que a enzima possui

alta afinidade pelo substrato. Uma reação do tipo uni-uni, que apresente um baixo valor

de Km implica em uma elevada estabilidade do complexo ES, com pouca tendência de

dissociação (Fonseca, 1998). Sendo assim, a presença de um sítio ativo da enzima com

grupos químicos capazes de interagir de forma eficiente com o substrato pode ser

sugerida.

Damaso e colaboradores (2000) observaram valores de Km (1,78 mg/mL) da

mesma magnitude para endoxilanase produzida por uma estirpe de Thermomyces

lanuginosus. Entretanto, Cesar e Mrsa (1996) observaram valores mais elevados de Km

(7,3 mg/mL) para uma outra linhagem do mesmo microrganismo. Belfaquih e

colaboradores (2002) obtiveram valores de 5,0; 6,1 e 3,3 mg/mL para três enzimas

xilanolíticas produzidas por Streptomyces sp., utilizando xilana beechwood como

substrato. Comparando os valores de Km obtidos pela estirpe S. malaysiensis AMT-3


91

com os descritos na literatura para outros actinomicetos e fungos, confirma-se alta

afinidade que a endoxilanase produzida pelo estreptomiceto apresenta pelo substrato.

A comparação de valores de Vmax também podem ser validados quando

expressos em atividade específica, pois a velocidade máxima é diretamente dependente

da concentração de enzima que se encontra ativa (Fonseca, 1998). O valor de Vmax para

S. malaysiensis foi 1,58 µmoles xilose/mL.min. Diferentes valores de Vmax aparente

(2198, 2269 e 302 µmoles xilose/mL.h) foram obtidos por Belfaquih e colaboradores

(2002) utilizando xilana beechwood como substrato. As diferenças encontradas entre os

valores de Vmax para diversos microrganismos, sejam fungos ou actinomicetos, pode ser

devido a diferentes especificidade das xilanases produzidas, à heterogeneidade da

xilana, como também ao uso de diferentes temperaturas e métodos de quantificação dos

açúcares redutores durante a determinação da atividade enzimática.

Para que a enzima seja saturada pelo substrato, é necessário que uma

concentração superior ao valor de Km deva ser utilizada. Bailey e colaboradores (1992)

observaram que a concentração máxima para substratos poliméricos, como a xilana, não

deve ultrapassar 1%, devido a baixa solubilidade. Contudo, este valor não garante uma

condição de saturação, devendo esta ser determinada através de uma curva que

relacione a velocidade da reação com a concentração de substrato. Valores superiores a

1,5% de xilana [2,1; 2,7 e 3,0% (p/v)] foram responsáveis por um efeito inibitório na

atividade enzimática produzida por S. malaysiensis. Belfaquih e colaboradores (2002)

não observaram inibição da atividade xilanásica quando na presença de xilose em

diferentes concentrações (5–50 mM), indicando que nesta faixa de concentração a

enzima não sofre inibição pelo produto de sua ação catalítica. Através da curva de

progresso utilizando xilana birchwood na concentração 1,5% (p/v), pôde-se selecionar o

tempo de reação enzimática, que foi de 6 minutos. Desta forma, foi possível otimizar a

metodologia utilizada para a dosagem da atividade endoxilanásica. Porém, os estudos

posteriores foram conduzidos com xilana oat spelts, em virtude dos melhores valores de

atividade enzimática observados quando este substrato foi utilizado, indicando uma

maior afinidade da enzima por este tipo de xilana.

A maioria das pesquisas referentes à produção de enzimas de interesse industrial

vem utilizando cultura submersa, a qual permite um controle do grau de aeração, pH e

temperatura do meio, bem como o controle de outros fatores ambientais requeridos para

o crescimento ótimo do microrganismo (Souza, Souza & Peralta, 2001). Neste tipo de


92

cultivo, o acúmulo de açúcares redutores tem sido relatado como um efeito negativo na

produção de xilanases (Biswas et al., 1988; Gosh & Nanda, 1994), já que a presença de

açúcares inibe a produção da enzima pela estirpe produtora.

As fontes de carbono e nitrogênio utilizadas no meio de produção são os

principais fatores que afetam a produção de enzimas e seus níveis. Por outro lado,

parece óbvio que os custos de produção são diretamente proporcionais ao tempo de

produção, de modo que para minimizar os custos de produção a enzima deveria ser

produzida no menor tempo possível. Como a xilana no meio de produção é uma

macromolécula complexa, a produção enzimática requerida para hidrolisar tal estrutura

macromolecular pode atingir seu máximo somente após a biomassa bacteriana ter

atingido certo nível (Seyis & Aksoz, 2003; Seyis & Aksoz, 2005). Processos baseados

em microrganismos têm custos de produção específicos. Aproximadamente 30–40% do

custo de produção de muitas enzimas é atribuido ao custo do substrato de crescimento

(Hinnman, 1994, Techapun et al., 2003a). Consequentemente espera-se reduzir os

custos de produção de maneira significante com o uso de substratos de baixo custo para

a produção de enzimas industriais. Os altos custos do extrato de levedura como fonte de

nitrogênio (US$ 1800.00/ton) impossibilita seu uso na produção de enzimas industriais.

Certamente, os custos de produção de xilanases pela estirpe S. malaysiensis AMT-3

podem sofrer grandes reduções utilizando-se farelo de trigo (US$ 175.00/ton) e

milhocina (US$ 80.00/ton) como matérias-prima, se comparado com alguns dos meios

de fermentação contendo substrato comercial, como a xilana, ou como suplemento de

nitrogênio, utilizar extrato de levedura. O uso de xilana purificada como um substrato

para a produção de xilanases torna-se economicamente inviável, já que tais enzimas

serão utilizadas em grandes quantidades e, consequentemente, o uso de resíduos

agrícolas de baixo custo, ricos em xilana, para produção de xilanases é de fundamental

importância. Assim sendo, resíduos agro-industriais como farelo de trigo, dreche

cervejeiro, em diferentes concentrações foram suplementados como fontes de carbono,

bem como extrato de levedura (fonte de custo elevado) e milhocina como fonte de

nitrogênio para a produção de endoxilanases por S. malaysiensis AMT-3.

A produção máxima de endoxilanase em resíduos agro-industriais pela estirpe S.

malaysiensis AMT-3, especialmente em farelo de trigo e milhocina, ao término de 6

dias de fermentação (45,8 U/mL) foi consideravelmente superior aquela obtida em

dreche cervejeiro (21,2 U/mL). Utilizando uma fonte orgânica e complexa de nitrogênio

(milhocina) na concentração de 1,2% (p/v) e uma fonte de carbono complexa (farelo de


93

trigo), na concentração de 2,5% (p/v), obteve-se o melhor resultado. Entretanto, quando

se utilizou 0,1% (p/v) extrato de levedura, a atividade xilanolítica foi de 31,2 U/mL.

Fontes de nitrogênio inorgânica foram testadas em estudos anteriores e somente o

nitrato de potássio a 0,12% teve algum efeito na produção de xilanases, quando xilana

larchwood foi utilizada como fonte de carbono (Nascimento et al., 2002). Quando

houve a utilização de extrato de levedura (0,5%) combinado com triptona (0,3%), na

presença de xilana larchwood, a atividade máxima de xilanase (116,0 U/mL) foi obtida

ao cabo de 6 dias (Nascimento et al., 2003). Isto pode indicar que o melhoramento da

produção de xilanases com meio de cultura contendo fontes de nitrogênio orgânico é

devido presumivelmente a complementação dos componentes moleculares destas

fontes. Fontes de nitrogênio como extrato de levedura podem conter 6–17% de

carboidratos, aminoácidos e ácidos nucléicos em adição às proteínas (Subramayian et

al., 2001). A produção de endoxilanase pela estirpe Streptomyces malaysiensis AMT-3,

utilizando farelo de trigo e milhocina, como matérias-prima, apresentou valores

relativamente elevados (45,8 U/mL) de atividade enzimática quando comparado aos

descritos na literatura para outras espécies de Streptomyces (Sunna & Antranikian,

1997; Beg et al., 2000).

Embora vários relatos estejam disponíveis a respeito do rendimento da produção

de endoxilanases, é difícil comparar os resultados obtidos, uma vez que os

microrganismos produtores das enzimas-alvo, as condições de cultivo e produção, o

substrato testado, as condições dos ensaios enzimáticos e a forma de definir as unidades

são bastante variáveis. Entretanto, outros autores têm descrito valores de 14,3 U/mL

(Liu et al., 1998), 17,0 U/mL (Damaso et al, 2000), 30,0 U/mL (Lemos et al., 2000),

22,5 U/mL (Bocchini et al., 2002) e 10,3 U/mL (Wang et al., 2003), utilizando

diferentes microrganismos sob diferentes condições de crescimento e de produção

enzimática. Porém, de um modo geral, aparentemente a estirpe S. mayalsiensis AMT-3

é uma excelente produtora de endoxilanase, fornecendo valores de atividade enzimática

bem superiores ou comparáveis a literatura, quando utilizado resíduos agro-industriais.

Subramaniyan e colaboradores (2001) verificaram que a maior produção de

xilanase (380 U/mL) com uma estirpe de Bacillus sp. foi obtida, após 96 horas de

cultivo, no meio contendo extrato de levedura e peptona [0,25% (p/v)] como fontes de

nitrogênio e xilana oat spels como fonte de carbono [1% (p/v)]. Entretanto, quando o

extrato de levedura (1%) e a peptona (1%) foram adicionadas separadamente, as

máximas de atividade xilanolítica obtidas foram de 150 e 218 U/mL, respectivamente.


94

Também verificaram que outras fontes de nitrogênio, orgânicas ou inorgânicas não

tiveram um efeito significativo na produção de xilanases. Altas concentrações de fontes

complexas de nitrogênio para bactérias produtoras de hidrolases podem melhorar o

crescimento em relação a produção da enzima, devido a presença de açúcares simples.

Também, fontes complexas como extrato de levedura, triptona e peptona podem liberar

amônia, o que poderia estimular o crescimento e ao mesmo tempo aumentar o

rendimento da produção da enzima por causa de uma possível inibição natural de

peptidases que poderiam estar presentes no sobrenadante (Subramaniyan et al., 2001).

George e colaboradores (2001) verificaram que na presença de extrato de levedura, o

nível de produção das xilanases por Thermomonospora sp. foi melhor (115,0 U/mL),

sendo considerado uma ótima fonte de nitrogênio orgânico. Outros resultados

comparativos foram obtidos quando foram utilizados peptona (105,0 U/mL), triptona

(98,0 U/mL) e farelo de soja (103,0 U/mL), verificando-se também uma boa indução da

produção de xilanases, porém não superiores aos obtidos com extrato de levedura.

Entretanto, quando se utilizou fonte de nitrogênio inorgânico, como o sulfato de

amônio, o nível máximo de produção de xilanase foi de 86,0 U/mL. Deng e

colaboradores (2005) verificaram que a produção de xilanases por Streptomyces

olivaceoviridis variou de acordo com a fonte de nitrogênio. Entre as várias fontes

inorgânicas e orgânicas de nitrogênio testadas, a triptona foi a melhor na estimulação da

produção de xilanases (1568 U/mL).Uma Maheswari e Chandra (2000) observaram uma

boa produção de xilanases (24,0 U/mL) em xilana birchwood, 1% (p/v), após 5 dias de

fermentação, utilizando Streptomyces cuspidosporus. Entretanto, quando utilizou-se

farelo de trigo como fonte de carbono na concentração de 10 %, observou uma grande

produção de xilanase (105 U/mL). Por outro lado, o farelo de trigo induziu a produção

de um coquitel de enzimas extracelulares, quando comparado com a xilana birchwood.

Uma variedade de substratos, principalmente resíduos agrícolas, podem ser

avaliados para a produção de xilanases. George e colaboradores (2001) observaram que

o substrato Celulose Paper Powder (CPP) a 4% induziu uma maior produção de

xilanase (115 U/mL) pelo Thermomonospora sp quando comparados com outros

substratos, como sabugo de milho (105 U/mL), farelo de trigo (30 U/mL), xilana (22

U/mL) e palha de arroz (18 U/mL). Também observou que combinando a melhor fonte

de carbono com diferentes fontes de nitrogênio, a atividade máxima de endoxilanase foi

obtida com extrato de levedura (115 U/mL) sendo a fonte sulfato de amônia (86 U/mL)

a melhor fonte de nitrogênio inorgânico.


95

Nas últimas décadas, mesmo que vários artigos abordando a otimização da

produção de xilanases tenham sido publicados, pouca informação sobre a otimização

desta enzima por processo de fermentação submersa, utilizando espécies de

Streptomyces, está disponível na literatura científica (Techapun et al, 2002). Alguns

destes estudos com outras bactérias relatam a utilização de métodos estatísticos no

processo de otimização (Bocchini et al., 2002, Heck et al., 2005). A otimização do meio

de crescimento e as condições de cultivo tem sido aplicadas com sucesso para aumentar

os rendimentos tanto de produtos primários como de produtos secundários de uma

ampla variedade de microrganismos. Estudos de otimização do meio de cultivo

descritos na literatura têm sido conduzidos seja por aproximação de “uma variável a

cada vez” seja por resposta de superfície, sendo esta mais completa em relação a outra,

pois revela possibilidades de interações entre as variáveis. Entretanto, a aproximação de

“uma variável a cada vez” pode ser útil para estimar intervalos operacionais apropriados

para importantes variáveis de efeito estimulatório/inibitório, na condução de estudos em

resposta de superfície (Wejse et al., 2003).

Geralmente, um conhecimento prévio de procedimentos matemáticos é

necessário para que se desenvolva um modelo estatístico. As três etapas de um desenho

experimental incluem fazer experimentos estatisticamente desenhados, estimar os

coeficientes em modelos matemáticos predizendo a resposta, e checar a aplicabilidade

do modelo (Techapun et al., 2002). Para a otimização das condições do meio de cultivo,

foram utilizadas quatro fontes diferentes, sendo duas de carbono (farelo de trigo e

dreche cervejeiro) e duas de nitrogênio (milhocina e extrato de levedura), bem como o

tempo de cultivo. De acordo com a teoria da Superfície de Resposta, a atividade de

endoxilanase das amostras estudadas pode ser descrita como uma função das variáveis

selecionadas. A função exata é desconhecida, mas este tipo de resposta pode usualmente

ser aproximado por um polinomial de 2ª ordem com a seguinte equação:

Z = β0 + Σ βiXi + Σ βiiXi2 + Σ βijXiXj

Onde:

Z = variável de resposta; β0 = constante; βi = coeficiente do efeito linear; βii =

coeficiente para o efeito quadrático; βij = coeficiente do efeito de interação; Xi e Xj =

níveis das variáveis.


96

Baseado em estudos anteriores, a concentração de fontes de carbono e nitrogênio

de baixo custo e o tempo de cultivo foram identificados como os principais fatores que

afetavam a produção de xilanases por S. malaysiensis AMT-3. No presente trabalho,

estas variáveis foram estatisticamente otimizadas com a ajuda do desenho fatorial 23

utilizando o método de superfície de resposta. A maior atividade xilanolítica (46,1

U/mL) foi obtida no ensaio 8, na qual os fatores concentração de fonte de carbono

(farelo de trigo), concentração de fonte de nitrogênio (milhocina) e o tempo de cultivo

foram utilizados nos seus níveis máximos (25,0 g/L, 12,0 g/L, 6 dias), respectivamente.

O valor observado no presente trabalho, após planejamento fatorial, foi 1,6 vezes maior

que o originalmente obtido em estudos anteriores, quando se utilizou 1% (p/v) de farelo

de trigo como única fonte de carbono, após 10 dias de fermentação (Nascimento et al.,

2002). A maior atividade (46,1 U/mL) obtida no presente trabalho foi, por sua vez, 2,2

vezes maior do que a observada para a combinação das fontes dreche cervejeiro e

milhocina, nas mesmas condições. Também foi observado um bom valor de atividade

xilanolítica (25,4 U/mL) no ensaio 7, utilizando as mesmas fontes de carbono e

nitrogênio, ao fim de 6 dias de fermentação. Techapun e colaboradores (2002),

utilizando a estirpe Streptomyces sp. Ab106, observaram as máximas produções de

endoxilanase quando utilizou meio de cultura contendo extrato de levedura e peptona

como fontes de nitrogênio combinadas (0,075 g/L cada) e bagaço de cana como fonte de

carbono (10 g/L), variando os valores de temperatura (28–71ºC) e pH (3,6–9,6). Quando

combinou-se as variáveis temperatura (50ºC) e pH (6,5), a atividade máxima observada

foi 14,8 U/mL. Com relação ao teste T-Student e os valores de p-level (significância de

cada coeficiente), Techapun e colaboradores (2002) verificaram que os baixos valores

de p-level (inferiores a 0,05) indicam uma correlação mais significante dos coeficientes.

Também verificou que as variáveis independentes (temperatura e pH) tinham um efeito

significante na produção de xilanases e a interação destas variáveis de baixa

significância, devido ao valor de p-level ser superior a 0,05.

Bocchini e colaboradores (2002) observaram que em 5% de nível de

probabilidade, o coeficiente linear do fator tempo de cultivo e os coeficientes de

interação entre os fatores tempo de cultivo e concentração de xilana foram

significativos. A significância estatística do modelo de equação proposto por Bocchini e

colaboradores (2002) mostrou que esta regressão é estatisticamente significante a 99%

de nível de confiança. Desta forma, conclui-se que a estirpe S. malaysiensis AMT-3 é


97

uma boa produtora de endoxilanase. A partir do experimento fatorial 23, uma curva de

superfície de resposta foi gerada e indicou que a produção de endoxilanases pode ser

extrapolada acima do valor máximo, dentro do intervalo de variáveis dependentes

estudadas. A maior atividade xilanolítica (46,1 U/mL) obtida com o desenho fatorial 23

foi 38,4% maior que àquela obtida no meio inicial (Nascimento et al., 2002). Diferentes

desenhos experimentais foram conferidos por Pham e colaboradores (1998) com o

objetivo de otimizar um meio de cultivo para a produção de xilanases por Bacillus sp. 1-

1018. A xilana, hidrolisado de caseína e concentração de NaCl foram otimizadas pela

superfície de resposta. A composição ótima do meio nutriente foi determinada sendo

3,16 g/L de xilana, 1,94 g/L de caseína hidrolisada e 0,8 g/L de NaCl. A maior produção

de xilanases observada foi 151 U/mL. O cultivo de Bacillus sp. 1-1018 no meio

otimizado resultou no aumento de 135% da produção de xilanases, comparado com o

meio inicial. Métodos de superfície de resposta foram também utilizados para otimizar o

meio de cultura no que diz respeito a produção de xilanases por Schizophyllum

commune (Haltrich et al., 1993). No presente trabalho, o aumento da produção de

xilanases é comparável com aqueles observados por Haltrich e colaboradores (1993) e

maior que os observados por Pham e colaboradores (1998).

No presente trabalho, os fatores tempo e concentração de nitrogênio foram

estatisticamente significantes, apresentando um valor de p-level inferior a 0,01 (99% de

confiabilidade estatística), o que indica que eles podem agir como fatores limitantes.

Mesmo pequenas variações nos seus valores poderão alterar a atividade endoxilanásica

a uma extensão considerável, observando um efeito significante entre as interações dos

fatores concentração de fonte de carbono e fonte de nitrogênio (X1X2) e entre a

concentração da fonte de nitrogênio e o tempo (X2X3). Contudo, a interação entre o

fator concentração de fonte de carbono e tempo (X2X3) teve um efeito insignificante na

atividade endoxilanásica. Heck e colaboradores (2005) observaram valores de p-level

inferiores a 0,02 para o fator tempo e 0,008 para o fator pH.

Muitas das xilanases utilizadas na indústria hoje em dia parecem ser de origem

mesofílica e/ou neutrofílica, ainda que enzimas de fontes extremofílicas podem ser de

grande utilidade em muitos processos biotecnológicos. Em particular, enzimas que

combinam um número de características extremofílicas poderiam ser utilizadas em

muitos processos tecnológicos (Collins et al, 2005). A maior aplicação das xilanases

hoje em dia é na indústria de polpa e papel, onde altas temperaturas (55–70ºC) e pH


98

alcalino do substrato da polpa requerem a utilização de enzimas termo-alcalofílicas para

um biobranqueamento eficiente (Beg et al., 2001; Collins et al., 2005). Xilanases termo-

alcalofílicas ou mesmo termo-acidofílicas podem ser utilizadas em processos de

bioconversão, onde uma variedade de tratamentos, incluindo água quente e explosão a

vapor, alcalino, pré-tratamento com solventes ou ácidos podem ser utilizados

previamente no tratamento enzimático (Saha, 2003; Collins et al., 2005). Xilanases

adaptadas ao frio, que podem ser ativas em temperaturas baixas ou intermediárias,

podem oferecer vantagens sobre as xilanases utilizadas atualmente em muitos dos

processos com temperatura moderada, em particular na indústria de alimentos. Por

exemplo, as xilanases poderiam ser as mais aptas para o uso na indústria de panificação,

como no preparo da massa de pão, sendo geralmente conduzida à temperaturas abaixo

de 35ºC (Collins et al., 2005).

Xilanases estáveis e ativas a altas temperaturas e condições alcalinas são mais

susceptíveis a aplicações biotecnológicas. Uma das alternativas para identificar as

enzimas, que são termoestáveis e ativas a pH alcalinos, é explorar fontes naturais que se

encontram organismos alcalotermofílicos. Eles são conhecidos por produzirem enzimas

com maior termoestabilidade que aqueles derivados das suas contrapartes mesofílicas.

A estabilidade da enzima também pode ser aumentada através de modificação química,

ligações cruzadas, imobilização, tratamento com aditivos e engenharia de proteína. A

adição de pequenos compostos na solução de proteínas e modificação de

microambientes provém uma simples medida prática para aumentar a estabilidade da

enzima (George et al. 2001).

O efeito da temperatura na atividade de endoxilanases, observada no

sobrenadante dialisado da cultura testada, demonstrou um perfil ótimo com um máximo

de 60ºC. Estes resultados indicam que a estirpe S. malaysiensis AMT-3, sendo uma

estirpe mesofílica, é capaz de produzir enzimas que podem ser consideradas

termotolerantes a 30ºC. Contudo, foi observada uma boa atividade à 70oC, na qual foi

retida mais de 70% da atividade enzimática original máxima. Lemos e colaboradores

(2000) relataram uma faixa ótima de temperatura para atividade de endoxilanase em

Aspergillus awamori entre 50o e 70oC, com um ótimo de 60oC. Beg e colaboradores

(2000) demonstraram valores ótimos de temperatura em uma faixa de 50o a 65oC,

mesmo retendo uma atividade residual superior a 80% em 75oC para a estirpe

Streptomyces QG-11-3. Flores e colaboradores (1997) relataram um ótimo a 60oC para a

estirpe Streptomyces CH-M-1035, embora também tenha detectado uma atividade


99

enzimática residual superior a 70% na faixa de 55o a 65oC. Marques e colaboradores

(1998) também demonstraram um ótimo à 60oC, em Bacillus sp., e mesmo ainda uma

atividade residual acima de 70% detectada a 50oC. Os resultados aqui apresentados

sugerem que a atividade enzimática da nossa estirpe apresenta um perfil amplo em

termos de temperatura, importante ferramenta quando se sugere uma utilização para

processos biotecnológicos, principalmente na área de papel e celulose ou mesmo na área

alimentícia, em processos como extração de sucos e clarificação de vinhos.

Para o uso em processos de biobranqueamento, as xilanases poderiam não

somente ser livres de celulases, como tambem ativas em altas temperaturas,

termoestáveis e alcalofílicas. Devido a altas temperaturas do processo de

biobranqueamento da polpa celulósica, é desejável que a enzima seja hábil em

condições alcalinas (pH 8,0–10,0) e altas temperaturas (60–90ºC), com períodos de

incubação entre 3 e 5 horas. O uso de xilanases para a deslignificação na indústria

papeleira tem sido desmotivado pela falta de disponibilidade de enzimas ativas em pH

acima de 8,0 e temperatura em torno de 60ºC, que são condições prevalentes em muitos

processos de branqueamento (Beg et al., 2000, Techapun et al., 2003a). Muitas

xilanases livres de celulases produzidas por microrganismos mesofilicos não são

termoestáveis, como observado em Streptomyces albus, S. lividans e S. cuspidosporus

que produzem xilanases estáveis a temperaturas inferiores a 70ºC (Techapun et al.,

2003a).

A avaliação da capacidade da enzima em manter sua atividade intacta ao longo

do tempo, uma etapa importante para a viabilização comercial da enzima, consiste na

estabilidade a estocagem. Este fator torna-se importante quando se pensa em escala

industrial, onde o tempo de durabilidade da atividade enzimática pode viabilizar ou não

sua comercialização. A estabilidade da enzima pode ser aumentada por modificação

química, ligações cruzadas, imobilização, tratamento com aditivos e engenharia de

proteínas (Gupta, 1991; George et al., 2001).

Em processos industriais, o tempo é fundamental. O estudo de termoestabilidade

enzimática em diferentes tempos de incubação é importante para determinar o quanto e

por quanto tempo a preparação enzimática pode suportar as condições aplicadas à

indústria de interesse. A maioria das xilanases termoestáveis conhecidas é produzida por

estirpes de Thermatoga, tendo uma meia vida de 90 minutos a 95°C (Sunna &

Antranikian, 1997), porém termoestabilidades de grande significância tem sido relatadas

para xilanases de muitas estirpes de Streptomyces, incluindo Streptomyces T7, com uma


100

estabilidade a 50oC em pH 6,0 durante 6 dias (Keskar, 1992). No presente trabalho, a

preparação enzimática produzida por S. malaysiensis AMT-3 foi capaz de reter 70% e

49,5% da atividade total por 18 e 24 horas, respectivamente, a 55°C, sugerindo que a

enzima pode ser uma importante ferramenta em aplicações que requeiram temperaturas

entre 50 e 70ºC.

O perfil de pH do melhor sobrenadante produzido por S. malaysiensis,

apresentou os melhores resultados na faixa entre 5,0 e 9,0, com um ótimo em 6,0. Estes

valores são similares àqueles obtidos para outras endoxilanases de várias estirpes de

Streptomyces (Kluepfel et al., 1992; Patel & Ray, 1994; Flores et al., 1997; Georis et

al., 2000). De acordo com Viikari e colaboradores (1994), algumas xilanases comerciais

testadas para auxiliar o branqueamento de polpas deram bons resultados com pH entre

5,0 e 7,0, a 35–55oC. Beg e colaboradores (2000) observaram que o ótimo de pH para

atividade de endoxilanase produzida por Streptomyces sp. QG-11-3, crescido em meio

de sais contendo xilana e sulfato de amónia, foi 8,6 a 60ºC, rentendo uma atividade

relativa superior a 75% na faixa entre 5,0 e 9,2. A atividade endoxilanásica também

demonstrou uma estabilidade de mais de 85% após 1 hora de pré incubação numa faixa

de pH entre 5,4 e 9,4, a 50ºC. O pH otimo de xilanases de actinomicetos, leveduras e

fungos é geralmente encontrado na faixa do ácido ao neutro. O pH ótimo para xilanases

de S. viridosporus T7A (Magnuson & Crawford, 1997) foi relatado entre 7,0 e 8,0. Por

outro lado, o ótimo de xilanases produzidas por Aspergillus fischeri Fxnl (Raj &

Chandra, 1996), A. oryzae NRRL 1808 (Cristov et al., 1999) e Gliocladium viride CBS

5870 (Cristov et al., 1999) foi 6,0 e sua estabilidade ao pH foram de 5,5 a 6,5; 5,0 a 6,0

e 5,0, respectivamente, retendo cerca de 80% da sua atividade original. Belfaquih e

colaboradores (2002) observaram que as xilanases das estirpes S2 e S3 (Streptomyces

sp.) mostraram um perfil similar para o ótimo de pH e estabilidade com uma importante

atividade xilanásica em condições alcalinas e praticamente zero na faixa compreendida

entre 4,0 e 6,0. Em contraste, a xilanase de S1 mostrou um perfil diferente com

atividade máxima em pH 6,5 (Belfaquih et al., 2002). No que diz respeito a

temperatura, a hidrólise máxima ocorreu entre 60 e 65ºC, após 10 minutos, observados

para as 3 estirpes de Streptomyces sp. Embora a maioria dos actinomicetos expressem

uma atividade máxima de endoxilanase em pH sensivelmente ácido a neutro, uma

ampla faixa de pH ótimo tem sido demonstrado para algumas estirpes de

Thermomonospora fusca (McCarthy et al, 1985) e Streptomyces (Belfaquih et al.,

2002). Este foi o caso da estirpe S. malaysiensis que apresentou um ótimo de pH em 6,0,


101

mas com atividade superior a 60% na faixa do pH 5,0 a 8,0. Em estudos anteriores,

utilizando xilana oat spelts como fonte de carbono no meio de cultivo, a estirpe S.

malaysiensis apresentou um ótimo em pH 6,0, mas quase foi totalmente inativada em

pH 9,0, demonstrando alteração das propriedades bioquímicas das endoxilanases

produzidas (Nascimento et al., 2002).

Os dados referentes à inibição ou estímulo de íons metálicos na atividade

enzimática de enzimas de interesse industrial são de fundamental importância, pois

permite selecionarmos previamente certas condições do processo, impedindo prejuízos

futuros quando se passa da escala laboratorial para a escala industrial. Assim sendo, os

resultados obtidos no estudo do efeito dos íons metálicos demonstraram que na presença

de alguns dos íons testados (Ba2+ e Ca2+), a atividade enzimática total quase não sofreu

alteração, seja de forma positiva, seja de forma negativa. Alguns íons estudados foram

capazes de provocar uma leve inibição da atividade enzimática total. Outros autores

descrevem o estímulo da atividade de endoxilanase na presença de íons metálicos, como

Co2+, Mn2+ e Fe2+ (Cesar & Mrsa, 1997, Heck et al., 2005), e inibição na presença de

EDTA, Ca2+, Zn2+ e Co2+ (Liu et al., 1998, Heck et al., 2005). Interessantemente, dados

disponíveis na literatura indicam que na presença de Co2+, Mn2+ e Fe2+ pode haver um

estímulo da atividade de endoxilanase. Estes resultados não foram observados nas

preparações enzimáticas do presente trabalho, onde os íons Fe3+ (29,8%) e Mn2+ (9,5%)

provocaram um forte efeito inibitório na atividade xilanolítica. Beg e colaboradores

(2000) observaram que as endoxilanases de Streptomyces sp. QG-11-3 foram

marginalmente estimuladas em 1mM de Ca2+. Por outro lado, Cd2+, Co2+, Cr3+, ácido

iodoacético e iodoacetamida inibiram a atividade endoxilanásica até 35% a 1mM,

enquanto que Hg2+ inibiu completamente a enzima. A inibição de xilanases por Zn2+,

SDS, Co2+ e o estímulo da atividade enzimática na presença de Mn2+, Fe2+ e beta-

mercaptoetanol também já foram observadas (Beg et al., 2000). Heck e colaboradores

(2005) verificaram que os íons Mn2+ (124,2%) e Co2+ (159,3%) promoveram um

aumento na atividade enzimática, enquanto que na presença de Ca2+ (9,9%), Zn2+

(36,9%), Ba2+ (54,9%), Mg2+ (44,1%) e EDTA (43,2%) promoveram um decréscimo. Já

os íons Fe3+ (83,7%) e o Cu2+ (74,7%) produziram inibições discretas.

Quando cada fração do sobrenadante derivado das diferentes condições foi

introduzida no gel de poliacrilamida (PAGE), padrões semelhantes foram observados

em todas as condições, variando apenas a intensidade das bandas, consoante a

concentração das fontes de carbono e nitrogênio. Deng e colaboradores (2005)


102

observaram que os xilanossomos (complexos ou agregados enzimáticos de alto peso

molecular) derivados de culturas com triptona, peptona de carne, nitrato de sódio e

fosfato monoácido de amônia apresentavam diferenças significantes quanto a atividade

específica da xilanase quando S. olivaceoviridis foi crescido em meio contendo estas

fontes de nitrogênio. Fontes de nitrogênio orgânico são geralmente melhores que as

fontes inorgânicas para a maioria dos microrganismos. A variação na composição de

muitos complexos xilanolíticos de alto peso molecular (xilanossomos), produzidos

extracelularmente por S. olivaceoviridis E-86 com várias fontes de nitrogênio, pode ser

devido a própria fonte de nitrogênio induzir várias atividades proteolíticas. Contudo, a

alteração da concentração dos sais fosfato no meio, das concentrações das fontes de

carbono (farelo de trigo e dreche cervejeiro) e das fontes de nitrogênio (extrato de

levedura e milhocina), foi suficiente para causar uma alteração da massa molecular

aparente das enzimas estudadas, quando comparado com estudos anteriores com a

mesma estirpe (Nascimento et al., 2002). As enzimas que antes tinham uma massa

molecular aparente de 170 e 240 kDa, além da presença de 2 complexos xilanossomos,

após o processo de otimização das condições de produção da enzima, apresentaram

apenas um possível complexo xilanossomo e 2 bandas com 142 e 180 kDa, sugerindo

uma possível alteração na estrutura quaternária da enzima, devido as condições de

cultivo alteradas. Na análise do zimograma, as atividades endoxilanásicas detectadas

correspondiam a região de alto peso molecular do PAGE-NATIVO, sugerindo a

formação de xilanossomos a partir das endoxilanases presentes no sobrenadante.

Cada organismo ou estirpe tem o seu próprio requerimento de condições

especiais para uma máxima produção de enzimas. Stress ambiental, tal como a depleção

de nutrientes, composição do meio de cultivo, oxigênio dissolvido, íons H+, bem como a

fase da cultura do inóculo, podem ter profundos efeitos na produção de qualquer

enzima, inclusive as xilanases (Beg et al., 2003). A produção de compostos bioativos ou

mesmo biomassa por microrganismos em laboratórios de escala piloto é um grande

desafio. A manutenção das condições ideais de crescimento e produção destes

compostos, mantendo o sistema livre de contaminação, representa um outro desafio para

qualquer indústria. Para manter estas condições sob controle, a produção é conduzida

em sistemas fechados, altamente controlados, conhecidos por fermentadores ou

biorreatores (Roseiro, 2003).


103

O estudo da produção de endoxilanases em biorreatores foi conduzido no

presente trabalho com o objetivo de avaliar a produção em uma escala maior, visando

melhorar a produtividade obtida em frascos agitados (250 mL). Muita informação pode

ser obtida utilizando desenho experimental baseado em princípios estatísticos,

determinando um número mínimo de experimentos (Barros Neto et al., 1995). No

presente trabalho, as variáveis velocidade de agitação e taxa de aeração foram

estatisticamente otimizadas com a ajuda do desenho fatorial 22 utilizando o método de

superfície de resposta, com o intuito de determinar a melhor agitação e a melhor aeração

em biorreator do tipo STR de 2L, com um volume útil de 1L. O valor máximo de

atividade endoxilanásica (56,5 U/mL) observado no presente trabalho, após

planejamento fatorial, foi 2,0 vezes maior que o originalmente obtido em estudos

anteriores (28,4 U/mL), quando se utilizou 1% (p/v) de farelo de trigo como única fonte

de carbono, após 10 dias de fermentação (Nascimento et al., 2002) e 1,2 vezes maior

que o obtido na melhor condição em frascos agitados (45,8 U/mL).

No presente trabalho, os fatores aeração e agitação foram significantes,

apresentando um valor de p-level inferior a 0,01 (99% de confiabilidade estatística), o

que indica que estas variáveis podem agir como fatores limitantes e mesmo pequenas

variações nos seus valores irão alterar a atividade endoxilanásica a uma extensão

considerável, observando um efeito significante entre as interações destes fatores

(X1X2). Entretanto, a influência da aeração se dá de forma inversa e muito significativa,

indicando que o sistema tem uma melhor resposta para a produção de xilanases quanto

menor for a vazão de oxigênio (≤ 0,5 vvm). Reddy e colaboradores (2002) verificaram

uma máxima produção de xilanases (404,2 U/mL) por Thermomyces lanuginosus SSBP

utilizando 0,75 vvm, a 500 rpm, após 48 horas de fermentação, em biorreator de 30L.

Quando houve um aumento da vazão de oxigênio para 1,25 vvm, foi observado um

decréscimo da atividade enzimática, atingindo um máximo de 149,7 U/mL ao fim de 72

horas. Resultados similares foram observados por Hoq e colaboradores (1994),

utilizando T. lanuginosus RT9, que relataram um aumento da atividade de xilanase com

o aumento da aeração, sendo o máximo atingido a uma vazão de 1,0 vvm. Entretanto,

quando a aeração passou para 1,5 vvm, a atividade xilanolítica caiu 1,5 vezes. O mesmo

foi observado para a estirpe S. malaysiensis AMT-3, tendo sido verificado que quanto

menor a taxa de aeração, maior a atividade enzimática. Entretanto, quando se utilizou

valores de aeração elevados (1,5 vvm), a produção de xilanases foi severamente afetada,


104

indicando um possível efeito inibitório da produção em altas concentrações de oxigênio,

em virtude da toxicidade do oxigênio em altas concentrações.

Techapun e colaboradores (2003b) realizaram um estudo sobre o efeito da

agitação e da aeração na produção de xilanases por Streptomyces sp. Ab106, baseado no

desenho experimental com ponto central, em biorreator de 5L. Utilizando uma agitação

de 150 rpm e aumentando a aeração de 0 a 1,0 vvm, Techapun e colaboradores (2003b)

observaram um aumento na produção de xilanases, atingindo o nível máximo de

produção ao fim de 6 dias de fermentação. No entanto, quando o valor de aeração foi

superior a 1,0 vvm, houve um decréscimo da produção. Estudos em microscopia

revelaram que altas velocidade de agitação alteraram a morfologia do Streptomyces sp.

Ab106, o que resultou na redução da produtividade. Palma e colaboradores (1996) e

Cho e colaboradores (2002) também observaram uma alteração da morfologia dos

fungos Penicillium janthinellum e Paecilomyces sinclairii em alta velocidade de

agitação. A estirpe S. malaysiensis AMT-3 também apresentou alteração de morfologia

quando se utilizou 600 rpm de agitação, o que pode ser um fator importante para

explicar a baixa atividade enzimática. Contudo, quando se utilizou uma vazão de

oxigênio de 0,5 vvm, a produção de xilanases, ao término de 6 dias, foi de 56,5 U/mL, o

que sugere a forte influência de ordem inversa da aeração na resposta do sistema.

Analisando os perfis obtidos em biorreator de 2L (Fig. 15), verificou-se que a

maior produção de xilanases aconteceu no sistema em que ocorreu o maior consumo de

oxigênio (300 rpm e 0,5 vvm). Porém, quando se analisou a 2ª condição na qual houve

maior consumo de oxigênio (300 rpm e 1,5 vvm), a produção de xilanase não foi a 2ª

maior, sugerindo que os fatores agitação e aeração não são os principais fatores que

interferem na produção de xilanases. A alteração da taxa de aeração de 0,5 vvm para 1,5

vvm foi o suficiente para interferir negativamente no sistema, diminuindo a produção de

xilanases. Todavia, fatores como a composição do meio, força iônica, turbilhonamento,

dentre outros, podem estar envolvidos na produção de xilanases. Até o presente

momento, não há dados na literatura que possam justificar esse efeito inverso observado

na estirpe S. malaysiensis AMT-3, relacionando a velocidade de agitação com a taxa de

aeração.

Após determinar as melhores condições de agitação e aeração em biorreator de

2L agitado mecanicamente, um estudo em biorreator, do mesmo tipo, de maior

capacidade (16L) foi realizado. O estudo de scale-up pode ser feito baseado em alguns


105

critérios de extrema importância. Os critérios adotados no presente estudo foram o

critério geométrico, visando a manutenção da velocidade periférica (na ponta do

impelidor) constante, e o critério de transferência de massa, que visa a manutenção da

capacidade de oxigenação do sistema (KLa). Este último critério pode ainda ser

conseguido por duas estratégias; um mantendo a velocidade de agitação constante e

alterando a taxa de aeração e outro, mantendo a taxa de aeração e alterando a velocidade

de agitação. Algumas variáveis podem afetar o KLa do biorreator, como a altura da

coluna líquida, a vazão do oxigênio, o tipo de impelidor, viscosidade e a velocidade de

agitação. Uma maior velocidade de agitação implica num aumento do turbilhonamento

e, consequentemente, em um aumento na taxa de transferência de oxigênio, em virtude

da diminuição da espessura da película líquida ao redor da bolha gasosa (Kossen &

Oosterhuis, 1985; Bon & Pereira Jr., 1999, Roseiro, 2003). A determinação do KLa pode

ser feita por métodos indiretos, como a desgaseificação, que envolve a eliminação do

oxigênio no interior do biorreator, por borbulhamento de nitrogênio, a fim de levar a

zero a concentração inicial do oxigênio e, desta forma, aumentar a faixa para o estudo

dinâmico da absorção de oxigênio. Quando o oxigênio dissolvido atinge um valor

mínimo (próximo a zero), reverte-se o processo, suprimindo o borbulhamento do

nitrogênio e acionando a aeração. O processo é seguido por uma sonda de oxigênio

dissolvido que produz um registro gráfico idêntico ao apresentado nas Figuras A2-I e

A2-III (vide ANEXO 2).

O processo de aeração provoca um aumento da concentração do oxigênio

dissolvido, gerando a equação:

( )LSLL CCaK

dtdC

−=

Que após integração, resulta em:

( ) taKCCLn LLS ⋅∝−

Portanto, coloca-se diretamente os dados experimentais em gráfico, apresentado

nas Figuras A2-II e A2-IV (vide ANEXO 2), cuja inclinação da reta corresponde ao

coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio, o KLa (Roseiro, 2003).

Para um determinado tipo de reologia introduzido pelos componentes do meio e

pelas células microbianas, a agitação é o parâmetro que tem maior influência na


106

transferência de oxigênio. A agitação aumenta a área de contato gás-líquido por

dispersar o ar sob a forma de pequenas bolhas, aumentando o tempo de permanência das

bolhas no seio da cultura e evitando a coalescência das bolhas de ar (Pereira Jr., 2003).

O grau de agitação utilizado provém da rotação de turbinas ligadas a um motor e pode

ser expresso em termos de potência absorvida no interior do vaso em condições de

processo. Assim, ampliar a escala de produção de um sistema de fermentação

corresponde a utilização de condições de reação que permitam manter o rendimento e

produtividade do processo, aumentando a quantidade final do produto. A escala de

bancada, em que a operação tem como objetivo estudar a fisiologia microbiana, as

culturas são desenvolvidas em condições de boa homogeneização, que é facilmente

conseguida utilizando um volume pequeno. Na escala piloto, estudam-se essencialmente

os problemas de transferência e problemas típicos da produção em escala elevada, como

a deficiência de aeração. Nesta escala, há uma incidência de estudos de engenharia os

quais permitem resolver problemas que ocorrem durante a fase de produção (Stanbury

& Whitaker, 1984; Thiry & Cingolani, 2002; Roseiro, 2003).

A otimização da produção de enzimas é um fator chave para o sucesso na

implementação de enzimas em uso sintético. Exemplos na literatura para biorreatores de

pequena escala reforçam a importância das condições do meio de cultura para obter uma

boa produção de uma dada enzima. A ampliação dessa escala implica no estudo de

fatores de ordem fisica que interferem diretamente no metabolismo do microrganismo

(Junker et al., 2001). Tentativas em produzir endoxilanases por S. malaysiensis AMT-3

em uma escala ampliada (biorreator de 16L), não foi bem sucedida. Provavelmente, a

dissimilaridade geométrica dos biorreatores empregados (diferença das dimensões

geométricas, presença de dois impelidores, dentre outros) associado a uma instabilidade

fisiológica dos estreptomicetos, podem ter sido a causa para tão baixa produção.

Contudo, para comprovar se algum destes efeitos foi realmente o responsável pela baixa

produção, um estudo paralelo foi realizado em biorreator de 2L para testar a viabilidade

da estirpe. Foi constatado, que na melhor condição (300 rpm e 0,5 vvm) houve um

decréscimo de 74% da atividade enzimática, sugerindo que a estirpe não estava em

condições adequadas. Outro fator impotante foi a utilização de uma segunda suspensão

de esporos, em virtude do término do primeiro estoque, diferente daquela obtida

inicialmente, a qual gerou todo o trabalho em frascos agitados e biorreatores de 2L.

Considerando os resultados obtidos neste trabalho, podemos dizer que a estirpe

selecionada, o Streptomyces malaysiensis AMT-3, possui sob vários aspectos, um


107

importante potencial para aplicações biotecnológicas, em especial indústria papeleira e

indústria alimentícia. O gênero Streptomyces por si só já representa um papel

importante, visto que pode ser considerado seguro para manuseio humano, e vários

procedimentos já têm sido relatados com xilanases de estreptomicetos mesofílicos não

só no tratamento da polpa de papel (Garg et al., 1996) como também em aplicações na

indústria alimentícia. Por outro lado, a aplicação das xilanases, em conjunto com

celulases, na conversão de biomassa renovável em combustível líquido, ainda não é

economicamente viável. Entretanto, as severas regulações ambientais e a necessidade de

reduzir a emissão de gases que provocam o efeito estufa, tem impulsionado o

desenvolvimento de futuras pesquisas no estudo das xilanases (Kulkarni et al., 1999)

para esta finalidade.

Paralelamente ao estudo da produção de endoxilanases, foi realizado um estudo

para verificar a capacidade da estirpe S. malaysiensis AMT-3 em produzir celulases

(CMCases). A atividade simples de endoglucanase é frequentemente representada pela

atividade de carboximetilcelulase (CMCase). A atividade de CMCase pode ser utilizada

para refletir toda a atividade de celulase livre ou ligada durante a hidrólise enzimática da

celulose para certas reações do sistema celulose-celulase (Zhou et al., 2004).

Curiosamente, a melhor condição observada para a produção de CMCases pela estirpe

S. malaysiensis AMT-3 não foi a mesma observada para a produção de endoxilanases.

O perfil cinético da produção de CMCases em meio de sais minerais, contendo farelo de

trigo ou dreche cervejeiro como fontes de carbono, e milhocina ou extrato de levedura

como fontes de nitrogênio, em diferentes concentrações, indicou uma maior atividade

de CMCases (720 U/L) ao fim de 4 dias de fermentação, utilizando dreche cervejeiro

[0,5% (p/v)] como fonte de carbono e milhocina [1,2% (p/v)] como fonte de nitrogênio.

Este fato é importante ressaltar pois a melhor condição para produção de CMCases não

foi a mesma para a produção de xilanases, o que sugere uma possível aplicação deste

extrato enzimático em processos da indústria papeleira, embora valores superiores a 500

U/L tenham sido observados. Estes valores são relativamente baixos quando

comparados com dados na literatura para outros microrganismos. George e

colaboradores (2001) observaram uma máxima produção de CMCase em um

actinomiceto termoalcalofílico de 23 U/mL ao fim de 5 dias, utilizando cellulose paper

powder, a 4% (p/v). A utilização de farelo de trigo (8,5 U/mL) e sabugo de milho (12,5

U/mL) também induziram a níveis consideráveis de CMCase. Jang & Chen (2003)


108

observaram uma produção máxima de CMCase (40,3 U/mL), com 1,5% (p/v) de

carboximetilcelulose (CMC), utilizando uma estirpe transformada de Streptomyces T3-

1. Lima e colaboradores (2005) observaram uma produção máxima de CMCase (595

U/L) em meio contendo 1,0% (p/v) de CMC e 0,3% (p/v) de extrato de levedura, ao fim

de 3 dias, utilizando a estirpe S. drozdowiczii M-7a. Surpreendentemente, o aumento da

concentração de extrato de levedura para 1% levou a uma ligeira queda na produção de

CMCase no 4º dia. Entretanto, o máximo de atividade celulolítica (300 U/L) foi

observado ao fim de 2 dias. Através da combinação de farelo de trigo [1,0% (p/v)] e

milhocina [0,3% (p/v)] foi possível obter uma produção máxima de CMCase (230 U/L)

ao fim de 4 dias. A estirpe S. malaysiensis AMT-3 foi capaz de produzir valores

superiores a estirpe S. drozdowiczii M-7a, obtendo um valor de 510 U/L quando se

utilizou estas fontes, embora em concentrações diferentes.

A aplicação de enzimas nas indústrias de papel, detergentes e couro demanda

identificação de enzimas altamente estáveis e ativas a valores de temperaturas e pH

extremos. Existe um número de artigos na literatura relatando a produção de celulases

por microrganismos termófilos. As celulases têm sido investigadas principalmente no

que diz respeito ao seu potencial uso industrial na bioconversão de biomassa agrícola

em produtos com valor comercial. Recentemente, as celulases têm sido aplicadas com

sucesso em aditivos nos detergentes de lavanderia. A proporção corrente da produção

total de enzimas para o mercado da indústria de lavanderia excede os 30%. Devido ao

aumento da pressão ambiental nas indústrias de papel e têxtil, as celulases são esperadas

para desempenharem um papel importante no desenvolvimento de tecnologias limpas

no processamento do denim e na descoloração do papel (George et al., 2001). Desta

forma, a maior aplicação das celulases hoje em dia é na indústria têxtil, onde altas

temperaturas (50–65ºC) e pH alcalino requer a utilização de enzimas termo-alcalofílicas

para um biopolimento e e bioestonagem eficientes (Bhat, 2000). Durante o processo de

bioestonagem, as celulases agem no algodão fabril e quebram os terminais das pequenas

fibras na superfície do fio, desse modo perdendo o indigo, que é facilmente removido

por abrasão mecânica nos ciclos de lavagens (Bhat, 2000). O biopolimento é usualmente

realizado durante a etapa têxtil do processo de secagem e inclui degomagem,

escorrimento, branqueamento, coloração e finalização. Durante este processo, as

celulases agem nos terminais das pequenas fibras que ressaltam da superfície fabril,

onde a ação mecânica remove estas fibras e poli o tecido fabril (Bhat, 2000).


109

O efeito da temperatura na atividade de CMCases, observada no sobrenadante

dialisado da cultura testada, demonstrou um perfil ótimo com um máximo de 50ºC.

Contudo, foi observada uma boa atividade entre 30º e 70oC, onde foi retida mais de

50% da atividade enzimática original máxima. Lima e colaboradores (2005) observaram

um ótimo de temperatura a 50ºC, retendo mais de 80% de atividade residual a 60ºC para

a estirpe S. drozdowiczii M-7a. Jang & Chen (2003) observaram um ótimo de 50ºC,

retendo ainda uma atividade residual máxima acima dos 70% entre 40º e 75ºC, com a

estirpe transformada Streptomyces T3-1. Os resultados aqui apresentados sugerem que a

atividade enzimática da nossa estirpe apresenta um perfil amplo em termos de

temperatura, importante característica para aplicações biotecnológicas. O estudo de

termoestabilidade enzimática em diferentes tempos de incubação é importante para

determinar o quanto e por quanto tempo a preparação enzimática pode suportar as

condições aplicadas à indústria de interesse. Jang & Chen (2003), verificaram que a

CMCase produzida por Streptomyces T3-1 foi altamente estável a 40º e 50ºC, retendo

mais de 90% da atividade residual, mesmo após 180 horas. George e colaboradores

(2001) observaram uma alta estabilidade da CMCase produzida por um actinomiceto

alcalotermotolerante, retendo mais de 98% da atividade, ao fim de 20 horas, a 50ºC. No

presente trabalho, a preparação enzimática foi capaz de reter 50% da atividade total por

2 e 24 horas, respectivamente, a 50° e 40ºC, sugerindo alguma possibilidade de

aplicação biotecnológica.

O perfil de pH apresentou os melhores resultados na faixa entre 2,0 e 9,0, com

um ótimo em 4,0. Estes valores não são muito comuns àqueles obtidos para outras

CMCases de várias estirpes de Streptomyces (Jang & Chen, 2003, George et al., 2001).

George e colaboradores (2000), observaram um ótimo de pH a 5,0, retendo apenas 10%

da atividade residual em pH 8,0, utilizando uma estirpe de actinomiceto

alcalotermofílico. Jang & Chen (2003) observaram que o ótimo de pH para atividade de

CMCase produzida pela estirpe transformada Streptomyces T3-1, crescido em meio de

sais foi 7,0, rentendo uma atividade relativa superior a 50% na faixa entre 5,0 e 9,0. O

pH ótimo de CMCases de actinomicetos, leveduras e fungos é geralmente encontrado na

faixa do ácido ao neutro. Este foi o caso da estirpe S. malaysiensis que apresentou um

ótimo de pH em 4,0, mas com atividade superior a 60% na faixa do pH 2,0 a 9,0.

As frações dos sobrenadantes das melhores condições para a produção de

CMCases foram introduzidas no PAGE, e padrões semelhantes foram observados em

todas as condições, variando apenas a intensidade das bandas, consoante ao tipo e


110

concentração das fontes de carbono e nitrogênio. Somente foram detectadas 2 bandas

celulolíticas no PAGE-nativa, sendo uma provável justificativa para o gráfico de pH

onde se observa um padrão duplo, indicando a presença de 2 isoformas. Atualmente

existem poucos dados na literatura sobre a caracterização de celulases, a nivel de

zimograma. Kaur e colaboradores (2005) observaram 2 endoglucanases de massa

molecular aparente de 40 e 50 kDa produzidas por Melanocarpus sp. MTCC 3922 em

meio de sais minerais suplementado de glucose e extrato de levedura.

O uso de celulose como um substrato para ser utilizado na produção de celulases

é economicamente viável, em que a utilização de outras fontes de baixo custo ricas em

celulose, visto que a maioria dos substratos disponíveis são de baixo custo, pode ser

uma outra alternativa de minimizar ainda mais os custos. Desta forma a utilização de

resíduos agrícolas torna-se atraente sob o ponto de vista da valorização e diminuição do

custo de produção. Assim sendo, a utilização da estirpe S. malaysiensis AMT-3 na

produção de CMCases pode apresentar um atrativo biotecnológico, embora os valores

de atividade sejam relativamente baixos.

As peptidases constituem um dos mais importantes grupos de enzimas

industriais, contabilizando pelo menos ¼ do mercado mundial de produção de enzimas

(Layman, 1986, Anwar & Saleemuddin, 1998). As peptidases são um grupo importante

de enzimas produzidas comercialmente, sendo utilizadas em detergentes, proteínas,

ração animal, material fotográfico, couro. Atualmente, a indústria de detergentes emerge

como o principal consumidor de várias enzimas hidrolíticas com ação em pH alcalino.

O principal uso de peptidases compatíveis com detergentes é na formulação de

detergentes para lavanderia (Anwar & Saleemuddin, 1998).

As peptidases utilizadas na indústria podem ser obtidas de microrganismos

selvagens ou geneticamente modificados. A produção de peptidases por microrganismos

e suas potenciais aplicações biotecnológicas ja vêm sendo estudada há muito tempo. Por

outro lado, a produção de peptidases por microrganismos pode apresentar um certo

desfavorecimento, quando se visa a produção de outras enzimas hidrolíticas, como as

degradadoras de materiais lignocelulósicos. Assim sendo, faz-se importante estudar a

produção e um possível efeito das peptidases no rendimento da atividade enzimática de

outras hidrolases. Sabe-se que a produção de peptidases extracelulares em actinomicetos

é influenciada por parâmetros como pH, temperatura, meio de cultivo, composição do

meio e tipo de metabolismo (Kumar and Takagi 1999; Moreira et al. 2003). Devido a


111

estes fatores, uma grande heterogeneidade pode ser observada na produção de

peptidases, em resposta aos tipos e concentrações de substratos no meio de cultivo. Até

o presente momento, não há relatos na literatura que descrevam o efeito da combinação

de fontes como farelo de trigo, dreche cervejeiro, extrato de levedura e milhocina na

produção de peptidases.

O perfil de produção de peptidases, pela estirpe S. malaysiensis, em diferentes

fontes de carbono e nitrogênio mostrou-se bastante variado. Ao se alterar a

concentração das fontes estudadas, observou-se uma alteração do perfil das peptidases

produzidas, sugerindo que a concentração destas fontes, como por exemplo, dreche

cervejeiro e milhocina, pode influenciar diretamente o metabolismo do microrganismo e

consequentemente a expressão destas enzimas. Ao se utilizar a máxima concentração

estudada, a produção de peptidases, para esta combinação de fontes foi bastante

prejudicada, enquanto que na menor concentração, houve uma expressão mais

significativa. No que diz respeito a combinação farelo de trigo e extrato de levedura,

observamos que apenas alterando a concentração destas fontes, é possível alterar o

perfil de produção de peptidases, sugerindo a importância da concentração de fontes

protéicas na expressão de peptidases extracelulares (Nascimento et al., 2005), como o

observado para a estirpe S. malaysiensis AMT-3. De Azeredo e colaboradores (2003)

observaram que a produção de peptidases extracelulares por Streptomyces sp. 594 tinha

início a partir do 3º dia de fermentação, tal como observado para a estirpe S.

malaysiensis AMT-3, correspondendo, em ambos, ao início da fase estacionária. No

gênero Streptomyces, encontra-se descrito na literatura, que as peptidases da classe

serina- são expressas na fase estacionária, e regulam o processo de morfogênese

intimamente associado ao crescimento micelial (Kim & Lee 1995, Lopes et al. 1999).

Esta característica é similar àquelas descritas na literatura para outros actinomicetos

produtores de peptidases, como o Streptomyces sp. G157 (Sampath et al. 1997) e

Nocardiopsis spp. (Moreira et al. 2003). Certamente, peptidases e outras enzimas

utilizadas em formulações de detergentes podem ter alta atividade e estabilidade numa

ampla faixa de pH e temperatura (Kumar and Takagi 1999). Serina-peptidases de

estreptomicetos descritas na literatura usualmente apresentam massa molecular aparente

entre 22 e 30 kDa (Yeoman & Edwards 1994), exceto àquelas relatadas por De Azeredo

e colaboradores (2004), na qual uma serina peptidase de 113.7 kDa foi observada.

Serina e metalopeptidases têm sido descritas comumente no gênero Streptomyces, como

observado com as estirpes Streptomyces sp. 594, S. malaysiensis AMT-3 (De Azeredo


112

et al. 2004; Nascimento et al, 2005). Entretanto, a natureza e características de cada

componente do complexo peptidase, derivado dos estreptomicetos, não foi ainda

extensivamente estudada. Traçando um perfil comparativo com a condição ótima

observada para a produção de endoxilanases, a condição ótima para a produção de

peptidases foi em farelo de trigo e extrato de levedura, embora o perfil cinético seja

muito semelhante com o observado para as endoxilanases.

A estirpe S. malaysiensis AMT-3 foi capaz de produzir peptidases com

diferentes massas moleculares, dentro de duas classes, serina e metalo peptidases. Com

características peculiares, especialmente no que diz respeito a resistência a altas

temperaturas, estas peptidases apontam para uma possível aplicação biotecnológica,

sendo necessários estudos mais aprofundados dentro desta área para determinar a

potencialidade desta estirpe e das peptidases produzidas por ela.

Nascimento, R.P. Conclusão

113

6. CONCLUSÕES

A atividade máxima de endoxilanases em frascos agitados (média de 45,8 U/mL) foi

observada quando as fontes farelo de trigo e milhocina foram utilizadas nas concentrações de

2,5% (p/v) e 1,2% (p/v), respectivamente, após 6 dias de fermentação.

A utilização de 1,2% (p/v) de extrato de levedura, independentemente da fonte de

carbono, influenciou negativamente a produção de xilanases, aumentando os valores de pH do

meio de cultivo e diminuindo os valores de endoxilanases produzidas. Com relação a

concentração de fonte de carbono, seja dreche cervejeiro ou farelo de trigo, a que melhor

influenciou positivamente a produção de endoxilanases pela estirpe S. malaysiensis AMT-3

foi a de 2,5% (p/v).

Em termos estatísticos, no nível de 5% de grau de confiança (95% de confiabilidade

estatística), o coeficiente linear X1 (concentração de farelo de trigo), X2 (concentração de

milhocina) e o coeficiente de interação X1X2 foram significativas, devido aos baixos valores

de p-level (<0,05).

A estirpe aumentou a produção de endoxilanases em 1,2x em bioreator do tipo STR de 2L

(média de 56,5 U/mL), quando comparado com os valores de atividade obtidos na melhor

condição vista em frascos agitados (45,8 U/mL).

A taxa de aeração e a velocidade de agitação apresentaram efeito estatistico significante,

sendo a aeração o fator com maior efeito de ordem inversa na resposta (produção de xilanase),

em biorreator de 2L.

O estudo de produção de endoxilanases em escala ampliada (1:8), em biorreator de 16L

não foi bem sucedida, devido a interferência de fatores de ordem física e biológica,

necessitando novos estudos nesta área.

A atividade xilanolítica produzida pela estirpe de Streptomyces malaysiensis AMT-3 foi

considerada bastante vantajosa pois é estável a 50°C e mantém mais de 60% da atividade

máxima entre 40º e 70ºC. Além disso, possui um ótimo de pH em 6,0 e ainda consegue reter

Nascimento, R.P. Conclusão

114

60% da atividade entre pH 5,0 e 9,0. A estabilidade ao congelamento e descongelamento

mostram a resitência do extrato bruto a processos fisicos relacionados a temperatura,

mantendo atividade superior a 96%, mesmo após 6 meses de estocagem.

A atividade celulolítica detectada nos sobrenadantes foi baixa quando comparada com

outras estirpes na literatura, mas apresentou características peculiares, como uma boa atuação

numa ampla faixa de pH (2,0–9,0) e temperatura (40–60ºC). Os valores de CMCase

observados, a princípio não representam efeito de caráter negativo na produção das

endoxilanases.

As peptidases produzidas em frascos agitados apresentaram características que indicam

uma possível aplicação biotecnológica. Com estabilidade a 60ºC por 120 minutos e atividade

em pH variando de 6,0 a 9,0, as peptidases produzidas por S. malaysiensis, a princípio, não

exerceram efeito negativo sobre as xilanases.

O estudo da utilização de resíduos agro-industriais como fontes alternativas para a

produção de endoxilanases revelou farelo de trigo e milhocina como ótimos indutores. A

produção de xilanases nestes resíduos pode representar, em nível industrial, um processo

importante no aproveitamento de resíduos agro-industriais e na indústria alimentícia.

Nascimento, R.P. Referências Bibliográficas

115

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• AKHNAZAROVA, S. & KAFAROV, V. Experiment optimization in chemistry and

chemical engineering. Moscow: Mir. 1982.

• ALI, M. K., KIMURA, T., SAKKA, K. & OHMIYA, K. The multidomain xylanase

Xyn10B as a cellulose-binding protein in Clostridium stercorarium. FEMS.

Microbiol. Lett. v. 198, pp. 79-83, 2001.

• ALMAN, A.R. Fermentors: design, operation and applications. In: Fermentation

Microbiology and Biotechnology. EL-MANSI, M. & BRYCE, C. (eds). pp. 9-48.

Taylor & Francis, London, 1999.

• ANSEJO, J. A. & MERCHUCK, J. C. Bioreactor system design. Marcel Dekker,

Inc. New York. 1995.

• ANWAR, A. & SALEEMUDDIN, M. Alkaline proteases: A review. Biores.

Technol. v. 64, pp. 175–183, 1998.

• ARISTIDOU, A. & PENTTILÄ, M. Metabolic engineering applications to

renewable resource utilization. Curr. Opin. Biotechnol. v. 11, pp. 187-198, 2000.

• BAILEY, M. J., BIELY, P. & POUTANEN, K. Interlaboratory testing of methods

for assay of xylanase activity. J. Biotech. v. 23, pp. 257-270, 1992.

• BALL, A. S. & MCCARTHY, A. J. Saccharification of straw by actinomycete

enzymes. J. Gen. Microbiol. v. 134, pp. 2139-2147, 1988.

• BARRET, A.J. Proteolytic enzymes: serine and cysteine peptidases. Methods

Enzymol. v. 244, pp.1-15, 1994.

• BARROS NETO, B., SCARMÍNIO, I.S., BRUNS, R.E. "Planejamento e

Otimização de Experimentos". Editora da Unicamp, Campinas, Brasil. 1995.

• BASTAWDE, K. B. Xylan structure, microbial xylanases and their mode of action.

World J. Microbiol. Biotechnol. v. 8, pp. 353-368, 1992.

• BAYER, E. A & LAMED, R. The cellulose paradox: pollutant par excellence and/or

a reclaimable natural resource? Biodegradation v. 3, pp. 171-188, 1992.

• BAYER, E.A., CHANZY H., LAMED, R. & SHOHAM, Y. Cellulose, cellulases

and cellulosomes. Curr. Opi. Struc. Biol. v. 8, pp. 548-557, 1998.

• BEG, Q. K., BHUSHAN, B., KAPOOR, M. & HOONDAL, G.S. Production and

characterization of thermostable xylanase and pectinase from Streptomyces sp. QG-

11-3. J. Ind. Microbiol. Biotech. v. 24, pp. 396-402, 2000.


116

• BEG, Q.K., KAPOOR, M., MAHAJAN, L. & HOONDAL, G.S. Microbial

xylanases and their industrial applications: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol. v.

56, pp. 326–338, 2001.

• BEG, Q.B., SAHAI, V. & GUPTA, R. Satistical model optimization and alkaline

protease production from Bacillus mojavensis in a bioreactor. Proc. Biochem. v. 39,

pp. 203-209, 2003.

• BÉGUIN, P. & AUBERT, J.P. The biological degradation of cellulose. FEMS

Microbiol. Rev. v. 13, pp. 25-58, 1994.

• BELFAQUIH, N. & PENNINCKX, M. J. A bifunctional β-xylosidase-xylose

isomerase from Streptomyces sp. EC 10. Enz. Microb. Tecnol. v. 27, pp. 114-121,

2000.

• BELFAQUIH, N., JASPERS, CH., KURZATKOWSKI, W. & PENNINCKX, M. J.

Properties of Streptomyces sp. endo-β-xylanases in relation to their applicability in

kraft pulp bleaching. W. J. Microbiol. Biotechnol. v. 18, pp. 699–705, 2002.

• BHAT, M.K. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Biotech. Adv. v. 18,

pp. 355–383, 2000.

• BIDLACK, J., MALONE, M. & BENSON, R. Molecular structure and component

integration of secondary cell walls in plants. Proc. Okla. Acad. Sci. v. 72, pp. 51-56,

1992.

• BIELY, P. Microbial xylanolytic systems. Trends Biotechnol. v. 3 (11), pp. 286-

290, 1985.

• BIELY, P., VRSANSKÁ, M. & KUCÁR, S. Identification and mode of action of

endo-(1→4)-β-xylanases. In: Xylans and Xylanases, Progress in Biotechnology 7.

VISSER, J., BELDMAN, G., KUSTERS-VAN SOMEREN, M. A. & VORAGEN,

A. G. J. (eds.) Elsevier. 1992.

• BIELY, P., KLUEPFEL, D., MOROSOLI, R. & SHARECK, F. Mode of action of

three endo-β-1,4-xylanases of Streptomyces lividans. Biochim. Biophys. Acta v.

1162, pp. 246-254, 1993.

• BIELY, P., VRSANSKÁ, M., TENKANEN, M. & KUEPFEL, D. Endo-β-1,4-

xylanase families: differences in catalytic properties. J. Biotechnol. v. 57, pp. 151-

166, 1997.

• BIRSAN, C., JOHNSON, P., JOSHI, M., MCLEOD, A., MCINTOSH, L.,

MONEM, V., NITZ, M., ROSE, D. R., TULL, D., WAKARCHUCK, W. W.,


117

WANG, Q., WARREN, R. A. J., WHITE, A., WITHERS, S. G. Mechanisms of

cellulases and xylanases. Biochem. Soc. Trans. v. 26, pp. 156-160, 1998.

• BISWAS, S. R., MISHRA A. K., NANDA, G. Induction of xylanase in Aspergillus

ochraceus. Folia Microbiol. v. 33, 355-359, 1988.

• BLANCHETTE, R. A. Degradation of the ligocellulose complex in wood. Can. J.

Bot. v. 73, pp. S999 – S1010, 1995.

• BOCCHINI, D.A., ALVES-PRADO, H.F., BAIDA, L.C., ROBERTO, I.C.,

GOMES, E. & DA SILVA, R.. Optimization of xylanases production by Bacillus

circulans D1 in submerged fermentation using response surface methodology. Proc.

Biochem. v. 38, pp. 727-731, 2002.

• BÖCKLE, B., GALUNSKY, B. & MÜLLER R. Characterization of a keratinolytic

serine proteinase from Streptomyces pactum DMS 40530. Appl. Environm.

Microbiol. v. 61, pp. 3705-3710, 1995.

• BON, E. P. S. & PEREIRA JR., N. Bioprocessos Industriais, In: Tecnologia

Enzimática, pp. 24–46. Rio de Janeiro, RJ. 1999.

• BOX, G.E.P. & WILSON, K.B. On the experimental attainment of optimum

conditions. J.R. Statist. Soc. v. 13, pp. 1-45, 1951.

• BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.

Biochem. v. 72, pp. 248-254, 1976.

• BRECCIA, J. D.; CASTRO, G. R.; BAIGARI, M. D. & SIÑERIZ, F. Screening of

xylanolitic bacteria using a colour plate method. J. Appl. Bacteriol. v. 78, pp. 469-

472, 1995.

• BRERETON, R. G. "Chemometrics in Analytical Chemistry - A Review", Analyst

v. 112, pp.1635–1657, 1987.

• BROWN, P. D. Clinical trials of low molecular weight matrix metalloproteinase

inhibitors in cancer. Inhibition of matrix metalloproteinases. Therapeutic potential.

AN. NY Acad. Sci. v. 732, pp. 217-221, 1994.

• CAO, Y. & TAN, H. Effects of cellulase on the modification of cellulose.

Carbohyd. Res. v. 337, pp.1291-1296, 2002.

• CESAR, T., MRSA, V. Purification and properties of the xylanase produced by

Thermomyces lanuginosus. Enz. Microb. Technol. v. 19, pp. 289-296, 1996.


118

• CHANDRASEKARAN, S. & DHAR, S.C. Multiple proteases from Streptomyces

moderatus. II. Physiochemical and enzymatic properties of the extracellular

proteases. Arch. Biochem. Biophys. v. 257, pp. 402-408, 1987.

• CHEN, C., CHEN, J. L. & LIN, T. Y. Purification and characterization of a

xylanase from Trichoderma longibrachiatum for xylooligosaccharide production.

Enz. Microb. Technol. v. 21, pp. 91-96, 1997.

• CHIPLONKAR, J. M., GANGODKAR, S. V., WAGH, U. V., GHADGE, G. D.,

RELE, M. V. & SRINIVASSAN, M. C. Applications of alkaline protease from

Conidiobolus in animal cell culture. Biotechnol. Lett. v. 7, pp. 665-668, 1985.

• CHO, Y.J., HWANG, H.J., KIM, S.W., SONG, C.H. & YUN, J.W. Effect of carbon

source and aeration rate on broth rheology and fungal morphology during red

pigment production by Paecilomyces sinclairii in a batch bioreactor. J. Biotechnol.

v. 95, pp. 13-23, 2002.

• COLLINS, T.; GERDAY, C. & FELLER, G. Xylanases, xylanase families and

extremophilic xylanases. FEMS Microbiology Rev. v. 29, pp. 3-23, 2005.

• COLOWICK, S. P. & KAPLAN, N. O. (eds.) Section I. General Preparative

Procedures. Methods in Enzymology. v. 1, pp. 138-146, 1955.

• COUGHLAN, M. P. Cellulose degradation by fungi. In: Microbial Enzymes and

Biotechnology, FOGARTY, W.M. AND KELLY, C.T. (eds.), 2nd ed., pp. 1-36.

Elsevier Applied Science. 1990.

• COUGHLAN, M. P. Towards an understanding of the mechanism of action of main

chain-hydrolysing xylanases. In: Xylans and Xylanases, Progress in Biotechnology

7. VISSER, J., BELDMAN, G., KUSTERS-VAN SOMEREN, M. A. &

VORAGEN, A. G. J. (eds.) Elsevier. 1992.

• COUGHLAN, M. P. & HAZLEWOOD, G. P. β-1,4-D-xylan-degrading enzyme

systems: biochemistry, molecular biology and applications. Biotechnol. Appl.

Biochem. v. 17, pp. 259-289, 1993.

• CRISTOV, L.P., SAZACKS, G. & BALAKRISHNAN, H. Production, partial

characterization and use of fungal cellulase-free xylanases in pulp bleaching. Proc.

Biochem. v. 34, pp. 511 – 517, 1999.

• CUROTTO, E., CONCHA, M., CAMPOS, V., MILAGRES, A. M. F. & DÚRAN,

N. Production of extracellular xylanases by Penicillium janthinellum. Appl.

Biochem. Biotechnol. v. 48, pp. 107-116, 1994.


119

• DAHLBERG, L., HOLST, O. & KRISTJANSSON, J. K. Thermostable xylanolytic

enzymes from Rhodothermus marinus grown on xylan. Appl. Biochem. Biotechnol.

v. 40, pp. 63-68, 1993.

• DAMASO, M. C. T., ANDRADE, C. M. M., JUNIOR, N. P. Use of corncob for

endoxylanase production by thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus IOC-

4145. Appl Biochem Biotechnol. v. 84-86, pp. 821-34, 2000.

• D’ALMEIDA, M. L. O. Celulose e Papel: Tecnologia de fabricação do papel. São

Paulo: Instituto de Pesquisas Tecnológicas – IPT. 2v 2a ed (ISBN: 85-09-00039-5 –

obra completa), 1988.

• DE AZEREDO, L.A.I., CASTILHO, L.R., LEITE, S.G.F., COELHO, R.R.R. &

FREIRE, D.M.G., Protease production by Streptomyces sp. isolated from Brazilian

cerrado soil. Optimization of culture medium employing satistical experimental

design. App. Biochem. Biotechnol. v. 105-108, pp. 749-755, 2003.

• DE AZEREDO, L.A.I., FREIRE, D.M.G., SOARES, R.M.A., LEITE, S.G.F. &

COELHO, R.R.R. Production and partial characterization of thermophilic proteases

from Streptomyces sp. isolated from Brazilian cerrado soil. Enz. Microbial Technol.

v. 34, pp. 354-358, 2004.

• DEMAIN, A. L. & SOLOMON, N. A. Manual of Industrial Microbiology and

Technology. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1986.

• DEMAIN, A. L. Microbial biotechnology. Trends Biotechnol. v. 18, pp. 26-31,

2000.

• DENG W., JIANG, Z.Q., LI, L.T., WEI, Y., SHI, B. & KUSAKABE, I. Variation of

xylanossomal subunit composition of Streptomyces olivaceoviridis by nitrogen

sources. Biotechnol. Lett. v. 27, pp. 429 – 433, 2005.

• DUTRON, A., GEORIS, J., GENOT, B., DAUVRIN, T., COLLINS, T., HOYOUX,

A. & FELLER, G. Use of family 8 enzymes with xylanolytic activity in baking. In:

World Intellectual Property Organization, PCT, WO 2004/023879 A1. 2004.

• EIRAS, S.P., CUELBAS, C. J., DE ANDRADE, J.C. "Um Estudo Comparativo

sobre a Eficiência de Estratégias Quimiométricas de Otimização", Química Nova v.

16, pp. 216–219, 1994.

• EL-MANSI, M. & BRYCE, C. Fermentation Biotechnology: an historical

perspective. In: Fermentation Microbiology and Biotechnology. Taylor & Francis

Group, London. 1999.


120

• FISHER, R. A. "The Design of Experiments". Oliver & Boyd, Edinburg, 1935.

• ROUTH, M.W., SWARTZ, P.A E DENTON, M. B. "Performance of the super

modified simplex" Anal. Chem. v. 49, pp. 1422–1428, 1977.

• FLORES, M. E., PÉREZ, R. & HUITRÓN, C. β-Xylosidase and xylanase

characterization and production by Streptomyces sp. CH-M-1035. Lett. Appl.

Microbiol. v. 24, pp. 410-416, 1997.

• FONSECA, M.C.C. Produção de xilanases por Aspergillus awamori em bagaço de

cana. Rio de Janeiro, Brasil. Escola de Quimica, UFRJ, p.147, Dissertação

(mestrado). 1998.

• FREDERIX, S.A., COURTIN, C.M. & DELCOUR, J.A. Impact of endoxylanases

with different substrate selectivity on gluten-starch separation. In: Recent Advances

in Enzymes in Grain Processing. COURTIN, C.M., VERAVERBEKE, W.S. &

DELCOUR, J.A. (eds), pp. 247–254. Kat. Univ. Leuven, Leuven. 2003.

• GALANTE, Y. M., DE CONTI, A. & MONTEVERDI, R. Application of

Trichoderma enzymes in textile industry. In: Trichoderma and Gliocladium –

Enzymes, Biological Control and Commercial Applications. HARMAN, G.E. &

KUBICEK, C.P. (eds), pp. 311–327. Taylor and Francis, London. 1998a.

• GALANTE, Y. M., DE CONTI, A. & MONTEVERDI, R. Application of

Trichoderma enzymes in food and feed industries. In: Trichoderma and Gliocladium

– Enzymes, Biological Control and Commercial Applications. HARMAN, G.E. &

KUBICEK, C.P. (eds), pp. 327–342. Taylor and Francis, London. 1998b.

• GARG, A. P., MCCARTHY, A. J. & ROBERTS, J. C. Biobleaching effect of

Streptomyces thermoviolaceus xylanase preparations on birchwood kraft pulp. Enz.

Microb. Technol. v. 18, pp. 261-267, 1996.

• GEORGE, S.P., AHMAD, A. & RAO, M.B. Studies on carboxymethyl cellulase

produced by an alkalothermophilic actinomycete. Biores. Technol. v. 77, 171-175,

2001.

• GEORIS, J., GIANNOTTA, F., BUYL, E. D., GRANIER, B. & FRÉRE, J.M.

Purification and properties of three endo-β-1,4-xylanases produced by Streptomyces

sp. Strain S38 which differ in their ability to enhance the bleaching of kraft pulps.

Enz. Microb. Technol. v. 26, pp. 178-86, 2000.

• GHOSE T.K. Measurement of cellulase activities. Pure Appl Chem v. 59, pp. 257-

268, 1987.


121

• GINTHER, C. L. Sporulation and the production of serine protease and cephamycin

C by Streptomyces lactamdurans. Antimicrob. Agents Chemotherapy. v. 15, pp.

522-526, 1979.

• GHOSH, B. K. & GHOSH, A. Degradation of cellulose by fungal cellulase. In:

Microbial Degradation of Natural Products. pp 84-121. G. WINKELMAN (ed.)

VCH. 1993.

• GOSH, M. & NANDA, G. Physiological studies on xylose induction and glucose

repression of xylanolytic enzymes in Aspergillus syndowii MG 49. FEMS

Microbiol. Lett. v. 117, pp. 151-156, 1994.

• GODFREY, T. & WEST, S. Textiles. In: Industrial Enzymology, pp. 360-371. T.

GODFREY & S. WEST (eds) 2nd edition, Macmilliam Press, London. 1996.

• GODFREY, T. .The enzymes market for grain processing In: Recent Advances in

Enzymes in Grain Processing. COURTIN, C.M., VERAVERBEKE, W.S. AND

DELCOUR, J.A. (eds.), pp. 401–406. Kat. Univ. Leuven, Leuven. 2003.

• GOODFELLOW, M. & CROSS, T. Classification. In: The Biology of the

Actinomycetes, pp. 74-91. M. GOODFELLOW, M. MORDARSKI & S.T.

WILLIAMS (eds.) Academic Press, London. 1984.

• GOODFELLOW, M., WILLIAMS, S.T. & MORDARSKI, M. Actinomycetes in

Biotechnology. M. GOODFELLOW, S.T. WILLIAMS & M. MORDARSKI (eds.).

Academic Press, London. 1988.

• GREGORY, A. C. E., O’CONNEL, A. P. & BOLWELL, G. P. Xylans. Biotechnol.

Gen. Engin. Rev. v. 15, pp. 439-455, 1998.

• GUPTA, R.; SAXENA, R. K.; CHATURVEDI, P. & VIRDI, J.S. Chitinase

production by Streptomyces viridificans: its potential in fungal cell wall lysis. J.

Appl. Bacteriol. v. 78, pp. 378-383, 1995.

• HALTRICH, D., PREISS, M. & STEINER, W. Optimization of a culture medium

for increased xylanase production by a wild strain of Schizophylum commune. Enz.

Microb. Technol. v. 15, pp. 854–860, 1993.

• HECK, J.X., FLORES, S.H., HERTZ, P.F. & AYUB, M.A.Z. Optimization of

cellulose-free xylanase activity produced by Bacillus coagulans BL69 in solid-state

fermentation. Proc. Biochem. v. 40, pp. 107– 112, 2005.


122

• HELDT-HANSEN, H. P. Development of enzymes for food applications. In:

Biotechnology in the food chain – New tools and applications for future foods.

POUTANEN, K. (ed). Helsink, Finland: VTT symp. v. 177, pp. 45–55, 1997.

• HEUSSEN C. & DOWDLE E.B. Electrophoretic analysis of plasmintogen

activators in polyacrilamide gels containing sodium dodecyl sulphate and

copolymerized substrates. Anal. Biochem. v. 102, pp. 196-202, 1980.

• HIGUCHI, T. Lignin biochemistry: Biosynthesis and degradation. Wood Sci.

Technol. v. 24, pp. 23-63. 1990.

• HINNMAN, R.L. The changing face of the fermentation industry. Chem. Technol.

v. 24, pp. 45–48, 1994.

• HOPKINS, D. W., BIBB, M. J., CHATER, K. F., KIESER, C., BRUTON, C. J.,

KIEZER, H. M., LYDIATE D. J., SMITH, C. P., WARD, J. M. & SCHREMPF, H.

Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory Manual. The John Innes

Institute, Norwich, United Kingdom. 1985.

• HOQ, M.M., HEMPEL, C. & DECWER, W.D. Cellulase-free xylanase by

Thermomyces lanuginosus RT9: effect of agitation, aeration and medium

components on production. J. Biotechnol. v. 37, pp. 49-58, 1994.

• HOQ, M. M., SOLOMON, B. O., HEMPEL, C., RINAS, U. & DECKWER, W.D.

The kinetics of cellulase-free xylanase excretion by Thermomyces lanuginosus RT9.

J. Chem. Technol. Biotechnol. v. 63, pp. 229-236, 1995.

• HUBBARD, D. W., LEDGER, S. E. & HOFFMAN, J. A. Scaling-up aerobic

fermentation which produce non-newtonian, viscoelastic broths. In: Advances in

Bioprocess Engineering. GALINDO, E. & RAMIREZ O. T. (eds) pp. 95-101,

Kluwer Academic Publishers, Netherlands. 1994.

• INGRAM, L. O. & DORAN, J.B. Conversion of cellulosic materials to ethanol.

FEMS Microbiol. Rev. v. 16, pp. 235-241, 1995.

• International Union of Biochemistry. Enzyme nomenclature. Academic Press, Inc.,

Orlando, Florida. 1992.

• JANG, H.D. & CHEN, K.S. Production and characterization of thermostable

cellulases from Streptomyces transformant T3-1. W. J. Microbiol. Biotechnol. v. 19,

263-268, 2003.

• JEFFRIES, T. W. Biochemistry and genetics of microbial xylanases. Cur. Opin.

Biotechnol. v. 7, pp. 337-342, 1996.


123

• JIANG, Z. Q., DENG, W., LI, X. T., AI, Z. L., LI, L. T. & KUSAKABE, I.

Characterization of a novel, ultra-large xylanolytic complex (xylanosome) from

Streptomyces olivaceoviridis E-86. Enz. Microbial Technol. v. 36, pp. 923-929,

2005.

• JU, L. K. & CHASE, G. G. Improved scale-up strategies of bioreactors. Bioproc.

Eng. v. 8, pp. 49–55, 1992.

• JUNKER, B., MOORE, J., STURR, M., MCLOUGHLIN, K., LEPORATI, J.,

YAMASAKI, S., CHARTRAIN, M. & GREASHAM, R. Pilot-scale production of

intracellular and extracellular enzymes. Bioproc. Bios. Eng. v. 24, pp. 39-49, 2001.

• KAUR, J., CHADHA, B.S., KUMAR, B.A. & SAINI, H.S. Purification and

characterization of two endoglucanases from Melanocarpus sp. MTCC 3922.

Biores. Technol. In Press, 2005.

• KESKAR, S. S. High activity xylanase from thermotolerant Streptomyces T7

cultural conditions and enzyme properties. Biotechnol. Lett. v. 14, pp. 481-486,

1992.

• KIM, I. S. & LEE, K. J. Trypsin-like protease of Streptomyces exfoliates SMF13, a

potential agent in mycelial differentiation. Microbiol. v. 142, pp. 1797-1806, 1996.

• KIM, B., AL-TAI, A.M., KIM, S. B., SOMASUNDARAM, P. & GOODFELLOW,

M. Streptomyces thermocoprophilus sp. nov., a cellulase-free endo-xylanase-

producing streptomycete. Inter. J. Syst. Evol. Microbiol. v. 50, pp. 505-509, 2000.

• KLASS, D. L. Energy and synthetic fuels from biomass and wastes. In: Handbook

of Energy Technology and Economics, pp. 712-788. MEYERS, R. A. (ed.), Wiley,

1983.

• KLUEPFEL, D., DAIGNEAULT, N., MOROSOLI, R. & SHARECK, F.

Purification and characterization of a new xylanase (xylanase C) produced by

Streptomyces lividans 66. Appl. Microbiol. Biotechnol. v. 36, pp. 626-631, 1992.

• KOSSEN, N. W. F. & OOSTERHUIS, N. M. G. Modelling and Scaling-up of

Bioreactors. In: Biotechnology. REHM, H. J. & REED, G. (eds), 2nd edition, VGH-

Verlag, Weinheim, Germany, 1985.

• KULKARNI, N., SHENDYE, A. & RAO, M. Molecular and biotechnological

aspects of xylanases. FEMS Microbiol. Rev. v. 23, pp. 411-456, 1999.

• KUMAR, C.G. & TAKAGI, H. Microbial alkaline proteases: from bioindustrial

viewpoint. Biotechnol. Adv. v. 17, pp. 561-594, 1999.


124

• LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head

of bacteriophage T4. Nature (London) v. 227, pp. 680-685, 1970.

• LANDAU, N. S. & EGOROV, N. S. Proteolytic enzymes of Nocardia minima:

accumulation in the medium and some properties. Microbiol. v. 65, pp. 36-40, 1996.

• LAYMAN, P.L. Industrail enzymes: battling to remain specialities. Chem. Eng.

News. v. 64, pp. 11-14, 1986.

• LEBLOND, P. & DECARIS, B. New insights into the genetic instability of

Streptomyces. FEMS Microbiol. Lett. v. 123, pp. 223-232, 1994.

• LEMOS, J. L. S., BON, E. P. S., SANTANA, M. F. E. & JUNIOR, N. P. Thermal

stability of xylanases produced by Aspergillus awamori. Braz. J. Microbiol. v. 31,

pp. 206-211, 2000.

• LEQUART, C., RUEL, K., LAPIERRE, C., POLLET, B. & KUREK, B. Abiotic

and enzymatic degradation of wheat stram cell wall: a biochemical and

ultraestructural investigation. J. Biotechnol. v. 80, pp. 249-259, 2000.

• LI, K., AZADI, P., COLLINS, R., TOLAN, J., KIM, J. S. & ERIKSSON, K. E. L.

Relationships between activities of xylanases and xylan structures. Enz. Microb.

Technol. v. 27, pp. 89-94, 2000.

• LIMA, A.L.G., NASCIMENTO, R.P., BON, E.P.S. & COELHO, R.R.R. Cellulase activity produced by Streptomyces drozdowiczii using low cost agri-industrial by-products and tests for biotechnological application. Enz. Microbial Technol. v. 37, pp. 272-277, 2005.

• LIU, W., ZHU, W., LU, Y., KONG, J. & MA, G. Production, partial purification and characterization of xylanase from Trichosporon cutaneum SL409. Proc. Biochem. v. 33, 331-336, 1998.

• LOPES, A., COELHO, R.R.R., MEIRELLES, M.N.L., BRANQUINHA, M.H. &

VERMELHO, A.B. Extracellular serine-proteinases isolated from Streptomyces

alboniger: partial characterization and effect of aprotinin on cellular structure. Mem.

Inst. Oswaldo Cruz v. 94 (6), pp. 763-770, 1999.

• LUECKE, F., FRIEDIRCH, F. & CARL, L. Lactic acid bacteria involved in food

fermentations, their present and future uses in food industry: A review. NATO. Asi.

Ser. v. 98, pp. 81-99, 1996.

• MAAT, J., ROZA, M., VERBAKEL, J., STAM, H., DASILRA, M.J.S., EGMOND,

M.R., HAGEMANS, M.L.D., VAN GARCOM, R.F.M., HESSING, J.G.M., VAN

DERHONDEL, C. & VAN ROTTERDAM, C. Xylanases and their applications in


125

baking. In: Xylan and Xylanases. VISSER, J., BELDMAN, G., VAN SOMEREN,

M.A.K. & VORAGEN, A.G.J. (eds), pp. 349–360. Elsevier, London, 1992.

• MAGNUSON, T.S. & CRAWFORD, D.L. Purification and characterization of an

alkaline xylanase from Streptomyces viridosporous T7A. Enz. Microbial Technol. v.

21, pp. 160–164, 1997.

• MARQUES, S., ALVES, L., RIBEIRO, S., GÍRIO, F. M. & AMARAL-

COLLAÇO, M. T. Characterization of a thermotolerant and alkalotolerant xylanase

from a Bacillus sp. Appl. Biochem. Biotechnol. v. 73, pp. 159-172, 1998.

• MATHLOUTHI, N., LALLES, J.P., LEPERCQ, P., JUSTE, C. & LARBIER, M.

Xylanase and beta-glucanase supplementation improve conjugated bile acid fraction

in intestinal contents and increase villus size of small intestine wall in broiller

chickens fed a rye-based die. J. Anim. Sci. v. 80, pp. 2773–2779, 2002.

• MAVITUNA, F. Strategies for bioreactor scale-up. In: Computer and Information

Science Application in Bioprocess Engineering. MOREIRA, A. R. & WALLACE,

K. K. (eds), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands. 1996.

• McCARTHY, A.J., PEACE, E., & BRODA, P. Studies on the extracellular xylanase

activity of some thermophilic actinomycetes. App. Microbiol. Biotechnol. v. 21, pp.

238-244, 1985.

• MCNEIL, B. & HARVEY, L. M. Fermentation – A practical approach. Oxford

University Press, Oxford. 1990.

• MIELENZ, J.R. Ethanol production from biomass: technology and

commercialization status. Curr. Opin. Microbiol. v. 4, pp. 324–329, 2001.

• MILAGRES, A. Aplicação de enzimas na indústria de polpa e papel. XXIII

Congresso Brasileiro de Microbiologia, Santos. 2005.

• MILLER, L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing

sugar. Anal. Chem. v. 31, pp. 426-428, 1959.

• MOHAMEDIN, A.H. Isolation, identification and some cultural conditions of a

protease-producing thermophilic Streptomyces strain grown on chicken feather as a

substrate. Int. Biodeter. Biodegr. v.43, pp. 13-21, 1999.

• MONTGOMERY, D. C. Design and Analysis of Experiments. Chapter 1, 6, 7. 4th

edition. John Wiley & Sons, New York. 1997.


126

• MONTI, R., TEREZIN, H. F. & JORGE, J. A. Purification and properties of an

extracellular xylanase from the thermophilic fungus Humicola grisea var.

thermoidea. Can. J. Microbiol. v. 37, pp. 675-681, 1991.

• MORAG, E., BAYER, E.A., LAMED, R. Relationship of cellulosomal and

noncellulosomal xylanases of Clostridium thermocellum to cellulose-degrading

enzymes. J. Bacteriol. v. 172, pp. 6098-6105, 1990.

• MOREIRA, K.A., PORTO, T.S., TEIXEIRA, M.F.S., PORTO, A.L.F. & LIMA

FILHO, J.L. New alkaline protease from Nocardiopsis sp.: partial purification and

characterization. Proc. Biochem. v. 39, pp. 67-72, 2003.

• MORIHARA, K. & TSUZUKI, H. Comparative study of various neutral proteinases

from microorganisms: specificity with oligopeptides. Arch. Biochem. Biophys. v.

146, pp. 291-296, 1971.

• NAKAMURA, S. NAKAI, R., WAKABAYASHI, K., ISHIGURO, Y. AONO, R.

& HORIKOSHI, K. Thermophilic alkaline xylanase from newly isolated

alkalophilic and thermophilic Bacillus sp. strain TAR-1. Biosci. Biotechnol.

Biochem. v. 58 (1), pp. 78-81, 1994.

• NASCIMENTO, R.P., COELHO, R.R.R., MARQUES, S., ALVES, L., GÍRIO,

F.M., BON, E.P.S. & AMARAL-COLLAÇO, M.T. Production and partial

characterisation of xylanase from Streptomyces sp. Strain AMT-3 isolated from

Brazilian cerrado soil. Enz. Microbial Technol. v. 31, 549-555, 2002.

• NASCIMENTO, R.P., MARQUES, S., ALVES, L., GÍRIO, F.M., AMARAL-

COLLAÇO, M.T., SACRAMENTO, D.R., BON, E.P.S., & COELHO, R.R.R. A

novel strain of Streptomyces malaysiensis isolated from Brazilian soil produces high

endo-β-1,4-xylanase titres. W. J. Microb. Biotechnol. v. 19, pp. 879-881, 2003.

• NASCIMENTO R.P., D’AVILA-LEVY, C.M., SOUZA, R.F., BRANQUINHA,

M.H., BON, E.P.S., PEREIRA JR., N. & COELHO, R.R.R. Production and partial

characterization of extracellular proteinases from Streptomyces malaysiensis AMT-3

isolated from a Brazilian cerrado soil. Arch. Microbiol. v. 184 (3), pp. 194-198,

2005.

• NORKRANS, B. Cellulose and cellulosys. Appl. Microbiol. v. 9, pp. 91-130, 1967.

• OHMIYA, K., SAKKA, K., KARITA, S. & KIMURA, T. Structure os cellulases

and their applications. Biotechnol. Gen. Eng. Rev. v. 14, pp. 365-414, 1997.


127

• PALA, H., MOTA, M. & GAMA, F.M. Enzymatic versus chemical deinking of

non-impact ink printed paper. J. Biotechnol. v. 108, pp. 79–89, 2004.

• PALMA, M.B., MILAGRES, A.M.F., PRATA, A.M.R. & MANCILHA, I.M.

Influence of aeration and agitation rate on the xylanase activity from Penicillium

janthinellum. Proc. Biochem. v.31, pp. 141-145, 1996.

• PATEL B. & RAY R.M. Production and characterization of xylanase from

Streptomyces species grown on agricultural wastes. W. J. Microbio. Biotechnol. v.

10, pp. 599-604, 1994.

• PECZYNSKA-CZOCH, W. & MORDARSKI, M. Actinomycetes enzymes. In:

Actinomycetes in biotechnology. M. GOODFELLOW, S. T. WILLIAMS, M.

MORDARSKI (eds.). pp. 219-283.Academic Press. 1988.

• PEREIRA, JR. Notas de Aula. In: Engenharia Bioquímica. Curso de Pós Graduação

do Programa de Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de

Química – CT., 2003.

• PÉREZ PONS, J. A., REBORDOSA, X. & QUEROL, E. Induction and preliminary

characterization of intracellular β-glucosidases from a cellulolytic Streptomyces

strain. FEMS Microbiol. Lett. v. 128, pp. 235-239, 1995.

• PHAM, P.L., TAILLANDIER, P., DELMAS, M. & STREHANIANO, P.

Optimization of a culture medium for xylanase production by Bacillus sp. using

statistical experimental designs. W. J. Microbiol. Biotechnol. v. 14, pp. 185–190,

1998.

• PIRET, J. M. & DEMAIN, A. L. Actinomycetes in Biotechnology: An overview. In:

Actinomycetes in Biotechnology. GOODFELLOW, M., WILLIAMS, S. T. &

MORDARSKI, M. (eds). Academic Press, London. 1988.

• POHLSCHRÖDER, M., LESCHINE, S.B. & CANALE-PAROLA, E.

Multicomplex cellulase-xylanase system of Clostridium papyrosolvens C7.

Bacteriol. v. 176, pp. 70-76, 1994.

• PRADE, R. A. Xylanases: from biology to biotechnology. Biotechnol. Gen.

Enginee. Rev. v. 13, pp. 101-131, 1995.

• PRIEST, F. G. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. Bacteriol. Rev.

v. 41, pp. 711-753, 1977.

• PULS, J. & SCHUSEIL, J. Chemistry of hemicelluloses: relationship between

hemicellulose structure and enzymes required for hydrolysis. In: Hemicellulose and


128

Hemicellulases. COUGHLAN, M. P. & HAZLEWOOD, G. P. (eds.) pp. 1-28.

Portland Press, London. 1993.

• RAJ, K.C. & CHANDRA, T.S. Purification and characterization of xylanase from

alkali-tolerant Aspergillus fischeri Fxnl. FEMS Microbiol. Lett. v. 145, pp. 457 –

461. 1996.

• RAO, M. B., TANKSALE, A. M., GHATGE, M. S. & DESHPANDE, V. V.

Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol. Mol.

Biol. Rev. v. 62, pp. 597-635, 1998.

• RAWLINGS, N.D., MORTON, F.R. & BARRETT, A.J. MEROPS: the peptidase

database. Nucleic Acids Res v. 34, D270–D272, 2006.

• REDDY, V., REDDY, P., PILLAY, B. & SINGH, S. Effect of aeration on the

production of hemicellulases by T. lanuginosus SSBP in a 30 l bioreactor. Proc.

Biochem. v. 37, pp. 1221-1228, 2002.

• ROSEIRO, J.C.P. Tecnologia de Fermentações. Art.9º, linha A, Decreto-Lei 301/72.

Dep. Química, Universidade de Évora, Portugal, pp. 86-133, 2003.

• SAHA, B.C. Hemicellulose bioconversion. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. v. 30, pp.

279–291. 2003.

• SAMPATH, P., SUBRAMANIAN C. & CHANDRAKASAN, G. Extracellular

proteases from Streptomyces spp. G157: purification and characterization.

Biotechnol. Appl. Biochem. v. 26, pp. 85-90, 1997.

• SANCHEZ, S. & DEMAIN, A. L. Metabolic regulation of fermentation processes.

Enz. Microbial Technol. v. 31, pp. 895-906, 2002.

• SANGLIER, J. J., HAAG, H., HUCCK, T. A. & FEHR, T. Novel bioactive

compounds from actinomycetes (1988-1992). Res. Microbiol. v. 144, pp. 633-642,

1993.

• SCHOEMAKER, H. E. On the chemistry of lignin biodegradation. Recl. Trav.

Chim. Pays-Bas v. 109, pp. 255-272, 1990.

• SCRAGG, A. H. Aerobic batch culture of Saccharomyces cerevisae using 2% as a

carbon source. In: Bioreactors in Biotecnology: a practical approach. Ellis

Horwood Limited, England. 1991.

• SEYIS, I. & AKSOZ, N. Determination of some physiological factors affecting

xylanase production from Trichoderma harzianum 1073 D3. Microbiologica. v. 26,

pp. 75–81, 2003.


129

• SEYIS, I. & AKSOZ, N. Effect of carbon and nitrogen sources on xylanase

production by Trichoderma harzianum 1073 D3. Int. Biodeter. Biodegr. v. 55 (2),

pp.115-119, 2005.

• SHALLOM, D. & SHOHAM, Y. Microbial hemicellulases. Curr. Opi. Microbiol. v.

6, pp. 219-228, 2003.

• SHARMA, H.S.S. Enzymatic degradation of residual non-cellulosic polysaccharides

present on dew-retted flax fibers. Appl. Microbiol. Biotechnol. v. 26, pp. 2714–

2723, 1987.

• SILVEIRA, F. P. Q., SOUSA, M. V., RICART, C. A. O., MILAGRES, A. M. F.,

MEDEIROS, C. L. & FILHO, E. X. F. A new xylanase from Trichoderma

harzianum strains. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.. v. 23, pp. 682-685, 1999.

• SOUZA, D. F., SOUZA, C. G. M. & PERALTA, R. M. Effect of easily

metabolizable sugars in the production of xylanase by Aspergillus tamarii in solid-

state fermentation. Proc. Biochem. v. 36, pp. 835-838, 2001.

• STANBURY, P.F. & WHITAKER, A. Microbial growth kinetics. In: Principles of

fermentation technology. pp. 11-25. Pergamon Press, United Kingdom, 1984.

• STUZENBERGER, F. J. & BODINE, A. B. Xylanase production by

Termomonospora curvata. J. Appl. Bacteriol. v. 72, pp. 504-511, 1992.

• STUZENBERGER, F. J. & BODINE, A. B. Thermostable β-xylosidase from

Termomonospora curvata. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. v. 20, pp. 55-60, 1998.

• SUNNA, A. PULS, J. & ANTRANIKIAN, G. Purification and characterization of

two thermostable endo-1,4-β-xylanases from Thermotoga thermarum. Biotechnol.

Appl. Biochem. v. 24, pp. 177-185, 1996.

• SUBRAMANIYAN, S., SANDHIA, G.S. & PREMA, P. Control of xylanase

production with out protease activity in Bacillus sp. by the selected nitrogen source.

Biotechnol Lett. v. 23, 369-372, 2001.

• SUBRAMANIYAN, S. & PREMA, P. Biotechnology of microbial xylanases:

enzymology, molecular biology, and application. Crit. Rev. Biotechnol. v. 22 (1),

pp. 33-64, 2002.

• SUNNA, A. & ANTRANIKIAN, G. Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria.

Crit. Rev. Biotechnol. v. 17 (1), pp. 39-67, 1997.

• TECHAPUN C., CHAROENRAT T., WATANABE M., SASAKI K. &

POOSARAN N. Optimization of thermostable and alkaline-thermotolerant


130

cellulase-free xylanase production from agricultural waste by thermotolerant

Streptomyces sp. Ab106, using the central composite experimental design. Biochem.

Eng. J. v. 12, pp. 99–105, 2002.

• TECHAPUN, C., POOSARAN, N., WATANABE, M. & SASAKI, K.

Thermostable and alkaline-tolerant microbial cellulase-free xylanases produced

from agricultural wastes and the properties required for use in pulp bleaching

bioprocesses: a review. Proc. Biochem. v. 38, 1327-1340, 2003a.

• TECHAPUN, C., POOSARAN, N., WATANABE, M. & SASAKI, K. Optimization

of aeration and agitation rates to improve cellulase-free xylanase production by

thermotolerant Streptomyces sp. Ab106 and repeated fed-batch cultivation using

agricultural waste. J. Biosc. Bioeng. v. 95, pp. 298-301, 2003b.

• THIRY, M. & CINGOLANI, D. OPTIMIZING SCALE-UP FERMENTATION

PROCESSES. TRENDS Biotechnol. v. 20 (3), pp. 103-105, 2002.

• THOMSON, J. A. Molecular biology of xylan degradation. FEMS Microbiol. Rev.

v. 104, pp. 65–82, 1993.

• TOMME, P., WARREN, R. A. J. & GILKES, N. R. Cellulose hydrolysis by

bacteria and fungi. Adv. Microb. Physiol. v. 37, pp. 1-81, 1995.

• TÖRRONEN, A. & ROUVINEN, J. Structural and functional properties of low

molecular weight endo-β-1,4-xylanases. J. Biotechnol. v. 57, pp. 137-149, 1997.

• TUNCER, M., BALL, A. S., ROB, A. & WILSON, M. T. Optimization of

extracelullar lignocellulolytic enzyme production by a thermophilic actinomycete

Thermomonospora fusca BD 25. Enz. Microb. Technol. v. 25, pp. 38-47, 1999.

• UHLIG, H. Industrial enzymes and their applications. John Wiley & Sons Inc., pp.

435, New York. 1998.

• UMA MAHESWARI, M. & CHANDRA, T.S. Production and potential

applications of a xylanase from a new strain of Streptomyces cuspidosporus. W. J.

Microbiol. Biotechnol. v. 16, pp. 257-263, 2000.

• VIIKARI, L., KANTELINEN, A., SUNDQUIST, J. & LINKO, M. Xylanases in

bleaching: from an idea to the industry. FEMS Microbiol. Rev. v. 13, pp. 335-50,

1994.

• VOBIS, G. Morphology of actinomycetes. In: Atlas of Actinomycetes. HAMADA,

M., HOTTA, K., KUDO, T., SEINO, A., VOBIS, G. & YOKOTO, A. (eds.) pp.

178–191. Asakura Publishing Co. ltda. Tokyo. 1997.


131

• WANG, P., MASON, C. & BRODA, P. Xylanases from Streptomyces cyaneus:

their production, purification and characterization. J. Gen. Microbiol. v. 139, pp.

1987-1993, 1993.

• WANG, S.L., YEN, Y.H., SHIH, I.L., CHANG, A.C., CHANG, W.T., WU, W.C. &

CHAI, Y.D. Production of xylanases from rice bran by Streptomyces actuosus A-

151. Enz. Microbial Technol. v. 33, pp. 917-925, 2003.

• WEJSE, P.L., INGVORSEN, K. & MORTENSEN, K.K. Xylanase production by a

novel halophilic bacterium increased 20-fold by response surface methodology. Enz.

Microbial Technol. v. 32, pp. 721-727, 2003.

• WONG, K. K. Y., TAN, L. U. L. & SADDLER, J. N. Multiplicity of β-1,4-xylanase

in microorganisms: functions and applications. Microbiol. Rev. v. 52 (3), pp. 305-

317, 1988.

• WONG, K.K.Y. & SADDLER, J.N. Applications of hemicellulases in the food, feed

and pulp and paper industries. In: Hemicelluloses and Hemicellulases.

COUGHLAN, M.P. & HAZLEWOOD, G.P. (eds), pp. 127–143. Portland Press,

London. 1993.

• WOOD, T. M. & GARCÍA-CAMPAYO, V. Enzymology of cellulose degradation.

Biodegradation. v. 1, pp. 147-161, 1990.

• YEOMAN, K.H. & EDWARDS, C. Protease production by Streptomyces

thermovulgaris grown on rapemeal-derived media. J. Appl. Bacteriol. v. 77, pp.

264-270, 1994.

• ZHOU, X., CHEN, F. & LI, Z. CMCase activity assay as a method for cellulase

adsorption analysis. Enz. Microbial Technol. v. 35, pp. 455-459, 2004.

Nascimento, R.P. Produção Científica

132

PRODUÇÃO CIENTÍFICA Publicações em anais de eventos científicos:

Nascimento, R.P.; Pereira-Jr., N.; Bon, E.P.S.; Coelho R.R.R.; Girio, F. & Reis, A. 2006.

Estudo da produção de xilanases em bioreator por Streptomyces malaysiensis utilizando

resíduos agro-industriais. III Workshop de Biocatálise e II Encuentro Regional de

Biocatálisis y Biotransformaciones (São Paulo, Brasil) – apresentação oral.

Nascimento, R.P.; Pereira-Jr., N.; Bon, E.P.S.; Junior, N.A. & Coelho R.R.R. 2005.

Xylanase production by Streptomyces malaysiensis AMT-3 using agro-industrial by-

product. Congresso Portugues de Microbiologia e Biotecnologia – MICROBIOTEC

(Póvoa de Varzim, Portugal) – apresentação oral.

Nascimento, R.P.; Pereira-Jr., N.; Bon, E.P.S.; Coelho R.R.R.; Gírio, F. & Reis, A. 2005.

Optimization of xylanase production by Streptomyces malaysiensis AMT-3 using

experimental design. Congresso Portugues de Microbiologia e Biotecnologia (Póvoa de

Varzim, Portugal) – apresentação poster.

Nascimento, R.P.; Bon, E.P.S.; Pereira-Jr., N.; Junior, N.A. & Coelho R.R.R. 2005. Produção de xilanases por Streptomyces malaysiensis AMT-3 utilizando resíduos agro-

industriais. XIII Congresso Brasileiro de Microbiologia (Santos, SP) – apresentação

poster.

Nascimento, R.P.; Junior, N.A.; Venancio, J.C.C.; Tavares, L.F.D.; Pereira-Jr., N.; Bon,

E.P.S. & Coelho R.R.R. 2005. CMCase production by Streptomyces malaysiensis using

agro-industrial by-products. XV Simpósio Nacional de Bioprocessos – XVI SINAFERM

(Recife, PE) – apresentação poster.

Nascimento, R.P.; Pereira-Jr, N.; Bon, E.P.S. & Coelho, R.R.R. 2004. Otimização da

produção de xilanases por Streptomyces malaysiensis AMT-3, isolado de solo de cerrado.

IX Encontro Nacional de Microbiologia Ambiental (Curitiba, PR) – apresentação oral.

Nascimento, R.P.; d’Avila-Levy, C.M.; Souza, R.F.; Branquinha, M.H.; Bon, E.P.S.;

Pereira Jr., N. & Coelho, R.R.R. 2004. Production of proteases by Streptomyces

malaysiensis AMT-3 using wheat bran. 12th International Biotechnology Symposium and

Exhibition (Santiago, Chile) – apresentação poster.

Rondon, A.M.R.; Nascimento, R.P.; Bon, E.P.S.; Pereira Jr., N. & Coelho, R.R.R. 2004.

Produção de xilanases e celulases por Streptomyces malaysiensis AMT-3, isolado de solo

de cerrado, utilizando farelo de trigo. XIX Reunião Anual Federação de Sociedades de

Biologia Experimental – FESBE (Caxambu, MG) – apresentação poster.


133

Nascimento, R.P.; D’Avila-Levy, C.M.; Souza, R.F.; Branquinha, M.H.; Pereira-Jr, N.;

Bon, E.P.S. & Coelho, R.R.R. 2004. Produção de proteases por Streptomyces malaysiensis

AMT-3, isolado de solo de cerrado, utilizando farelo de trigo. 6° Seminário Brasileiro de

Tecnologia Enzimática – ENZITEC (Rio de Janeiro, RJ) – apresentação oral.

Nascimento, R.P.; Rondon, A.M.R.; Bon, E.P.S.; Pereira Jr., N. & Coelho, R.R.R. 2004.

Produção de xilanases e celulases por Streptomyces malaysiensis AMT-3 utilizando farelo

de trigo. 6º Seminário Nacional de Tecnologia Enzimática – ENZITEC (Rio de Janeiro,

RJ) – apresentação poster.

Nascimento, R. P.; Souza, R. F.; Tavares, L. F. D.; Bon, E. P. S.; Pereira Jr., N. &

Coelho, R. R. R. 2003. Produção de xilanases em farelo de trigo por Streptomyces

malaysiensis AMT-3. XXII Congresso Brasileiro de Microbiologia (Florianópolis, SC) –

apresentação poster.

Artigo Publicado:

• Nascimento R.P.; d’Avila-Levy, C.M.; Souza, R.F.; Branquinha, M.H.; Bon, E.P.S.;

Pereira Jr., N.; Coelho, R.R.R. (2005). Production and partial characterization of extracellular

proteinases from Streptomyces malaysiensis AMT-3 isolated from a Brazilian cerrado soil.

Archives of Microbiology , vol 184 (3), pp. 194-198.

Artigos Submetidos:

• Nascimento, R.P.; Junior, N.A.; Pereira-Jr., N.; Bon, E.P.S. & Coelho R.R.R. 2006.

Cellulase production by Streptomyces malaysiensis in submerged fermentation using agro-

industrial by-products. Applied Biochemistry and Biotechnology.

• Nascimento, R.P.; Pereira-Jr., N.; Bon, E.P.S. & Coelho R.R.R. 2006. Optimization of

xylanase production by Streptomyces malaysiensis AMT-3 using agro-industrial by-products.

Journal of Biotechnology.

Artigos em Manuscrito:

• Nascimento R. P., Bon E. P. S., Pereira-Jr. N., Coelho R. R. R., Girio F., Reis A. Effect

of aeration, agitation and scale-up on xylanase production by S. malaysiensis on 2L and 16 L

bioreactor.


134

• Nascimento R. P., Bon E. P. S., Pereira-Jr. N., Coelho R. R. R., Girio F., Reis A.

Xylanase production by Streptomyces malaysiensis using a non-cost wheat residue by central

composite experimental design.

Nascimento, R.P. Anexos

135

ANEXOS

ANEXO 1 – Descrição e Composição das Fontes de Carbono e Nitrogênio Utilizadas

como Matéria-Prima

Milhocina (“Corn Steep Liquor”) – É um subproduto do processamento do milho contendo

aproximadamente 40% de sólidos totais e correspondendo a água de lavagem e embebição

dos grãos quando do fracionamento em amido e germe (óleo). A composição química é

complexa, tendo na sua grande maioria compostos orgânicos nitrogenados

Farelo de Trigo (“Wheat Bran”) – É um subproduto obtido na etapa de moagem do trigo

durante o processamento da farinha de trigo. É um produto comercializado, apresentando uma

composição variada, contendo proteínas (≅ 13%), hemicelulose (≅ 33%), celulose (≅ 10%),

lignina (≅ 3%), amido (≅ 12%), além de sais, gordura e outros componentes. Pode ser

considerada uma boa fonte de baixo custo para produção de hidrolases.


136

Dreche Cervejeiro (“Brewer’s Spent Grain”) – É o principal produto residual da indústria

cervejeira, representando cerca de 85% do total de subprodutos gerados. É um componente

lignocelulósico contendo cerca de 17% de celulose, 28% de polissacarídeos não-celulósicos

(principalmente arabinoxilana) e 28% de lignina.

ANEXO 2 – Esquematização dos Biorreatores do tipo STR de 2 e 16L


137

Impelidor

Eletrodo de pH

Difusor de ar

Coletor de amostras

Zona de inóculo

Motor

Zona de escape

Eletrodo de O2

A – esquema do biorreator STR de 2L da Setric Genie Industriel (SGI)


138

Zona de escape

Eletrodo de pH Filtro de ar

Eletrodo de O2

Impelidor

Motor Difusor de ar

Coletor de Amostras

B – esquema do biorreator STR de 16L da Bioengineering


139

ANEXO 3 – Cálculos de Determinação do KLa e método geométrico de escalonamento

A) Parâmetro Geométrio (P/V)

Velocidade constante da ponta do impelidor (tip speed)

[NiVi = Nii Vii]

N1 = 300 rpm

Diâmetro do Impelidor - Fermentador 2L = 4,8 cm (1)

Diâmetro do Impelidor - Fermentador 16L = 8,0 cm (2)

πD1N1 = πD2N2

4,8 x 300 = 8,0 x N2

N2 = 180 rpm

B) Parâmetro de Transferência de Massa (KLa constante)

KLa do Fermentador de 2L KLa do Fermentador de 16L

0,5 vvm e 250 rpm = 66,48 h-1 0,5 vvm e 300 rpm = 60.5 h-1

0,5 vvm e 500 rpm = 104,64 h-1 0,75 vvm e 300 rpm = 82,8 h-1

0,5 vvm e 300 rpm = 74,11 h-1 0,65 vvm e 300 rpm = 74,11 h-1KLa constante

* KLa constante, mantendo a agitação, alterando a aeração (0,25; 0,5; 0,75; 1,0 vvm)


140

A

B

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Time (s)

% D

.O

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Time (s)

% D

.O

Figura A3-I – Determinação do declive e subida da taxa de oxigênio, em função da pressão

por nitrogênio em bioreator de 16L. O gráfico representa as triplicatas, fixando a agitação

(300 rpm), e alterando a aeração em 0,5 (A) e 0,75 vvm (B).


141

0,5 vvm / 300 rpm 0,75 vvm / 300 rpm

Tempo (s) ln (100% O2) 40 4,2822063 50 4,11632347 60 3,97092065 70 3,79173684 80 3,61001661 90 3,47300111

100 3,29212629 110 3,12822146 120 2,95317266 130 2,76211742

Tempo (s) ln (100% O2) 50 3,994524227 60 3,772760938 70 3,553441483 80 3,33220451 90 3,098589659 100 2,879198457 110 2,614959778 120 2,3857 130 2,170956651

y = -0,0168x + 4,9635R2 = 0,9994

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

0 100 200 300 400Tempo (s)

ln (1

00%

O2

y = -0,023x + 5,157R2 = 0,9996

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 100 200 300 400

Tempo (s)

ln (1

00%

O2

KLa = - 0,0168/s KLa = - 0,0230/s

Figura A3-II – Determinação do valor de KLa baseado no cálculo da subida e inclinação do

oxigênio.

* KLa constante, mantendo a aeração, alterando a agitação (150, 200, 250, 300 rpm)


142

A

B

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Time (s)

% D

.O

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Time (s)

% D

.O

igura A3-III – Determinação do declive e subida da taxa de oxigênio, em função da pressão F

por nitrogênio em bioreator de 16L. O gráfico representa as triplicatas, fixando a aeração (0,5

vvm), e alterando a agitação em 150 (A) e 200 rpm (B).


143

150 rpm / 0.5 vvm 200 rpm / 0.5 vvm

Tempo (s) ln(100-%O2) 150 3,843030134 160 3,796986195 173 3,750288082 180 3,697178257 190 3,648925139 200 3,560098664 210 3,440418095 220 3,373026505 230 3,363841595 240 3,340503313 250 3,260657359 260 3,210843653 270 3,169685581 280 3,113515309 290 3,052427617 300 2,978925155

y = -0,0058x + 4,7185R2 = 0,9887

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 100 200 300 400

Tempo (s)

ln (1

00%

O2

y = -0,0074x + 4,6946R2 = 0,9979

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 100 200 300 400

Tempo (s)

ln (1

00%

O2

KLa = - 0,0058/s KLa = - 0,0074/s

igura A3-IV – Determinação do valor de KLa baseado no cálculo da subida e inclinação do

2) Tempo (s) ln(100-%O150 3,583518938 160 3,479186701 170 3,398972687 180 3,364994333 190 3,301990732 200 3,24128942 210 3,147021721 220 3,069602122 230 2,985681938 240 2,91416062 250 2,85263143 260 2,772588722 270 2,683302031 280 2,610069793 290 2,531047806 300 2,456735773

F

oxigênio.


144

ANEXO 4 – Soluções Tampão e Eletroforese

0,8 mL

3-1. Tampão de amostra (2x concentrado)

Tris-HCl 1 M (pH 6,8)

Glicerol 0,5 mL

Azul de bromofenol 0,2% 0,1 mL

Água q.s.q. 1,1 mL

3-2. Tampão de corrida

0,025 M 15,14 g/ 1 L Tris base (pH 8,3)

Glicina 0,192 M 72,06 g/ 1 L

Água q.s.p. - 500 mL

3-3. Gel de resolução (10%)

10%

Tris 1,5 M pH 8,8 (mL) 2,25

Persulfato de amônia 10% (µL) 125,0

Acrilamida (30%) / Bis acrilamida (0,8%) (mL) 3,0

SDS 10 % (µL) 125,0

TEMED (µL) 12,5

Água destilada 2,3

-4. Gel de separação (gradiente em poliacrilamida)

20%

3

7,5%

Tris 1,5 M pH 8,8 (mL) 10 10,0

Persulfato de amônia 10% (µL) 85 55

Glicerol 100% (mL) - 2,0

Acrilamida (30%) / Bis (0,1%) 10 26,6

Bis acrilamida 1,5% (mL) 4 -

TEMED (µL) 8,5 5,5

Água destilada 16,0 1,4


145

ANEXO 5 – Artigo Publicado

ASCIMENTO R.P., D’AVILA-LEVY, C.M., SOUZA, R.F., BRANQUINHA, M.H.,

N

BON, E.P.S., PEREIRA JR., N. & COELHO, R.R.R. Production and partial characterization

of extracellular proteinases from Streptomyces malaysiensis AMT-3 isolated from a Brazilian

cerrado soil. Arch. Microbiol. v. 184 (3), pp. 194-198, 2005

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas










http://www.livrosgratis.com.br/cat_1/administracao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_2/agronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_3/arquitetura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_4/artes/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_5/astronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_6/biologia_geral/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_8/ciencia_da_computacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_9/ciencia_da_informacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_7/ciencia_politica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_10/ciencias_da_saude/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_11/comunicacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1















http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1







Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo

http://www.livrosgratis.com.br/cat_28/literatura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_30/literatura_de_cordel/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_29/literatura_infantil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_32/matematica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_33/medicina/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_34/medicina_veterinaria/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_35/meio_ambiente/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_36/meteorologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_45/monografias_e_tcc/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_37/multidisciplinar/1





http://www.livrosgratis.com.br/cat_38/musica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_39/psicologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_40/quimica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_41/saude_coletiva/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_42/servico_social/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_43/sociologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_44/teologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_46/trabalho/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_47/turismo/1







otimizaÇÃo da produÇÃo de endoxilanaseslivros01.livrosgratis.com.br/cp007426.pdf · os...

Documents