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SÁVIA PERINA PORTILHO FALCI

ÓLEO DE MELALEUCA SP. COMO

AGENTE ANTIMICROBIANO EM

FERIDAS CONTAMINADAS POR

STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM

RATAS

Trabalho Final do Mestrado Profissional,

apresentado à Universidade do Vale do

Sapucaí, para obtenção do título de Mestre

em Ciências Aplicadas à Saúde.

POUSO ALEGRE – MG

2015

ii

SÁVIA PERINA PORTILHO FALCI

ÓLEO DE MELALEUCA SP. COMO

AGENTE ANTIMICROBIANO EM

FERIDAS CONTAMINADAS POR

STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM

RATAS

Trabalho Final do Mestrado Profissional,

apresentado à Universidade do Vale do

Sapucaí, para obtenção do título de Mestre

em Ciências Aplicadas à Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Manoel Araújo Teixeira

Coorientadora: Prof.ª Dr. ª Beatriz Bertolaccini Martinez

POUSO ALEGRE – MG

2015

iii

UNIVERSIDADE DO VALE DO SAPUCAÍ

MESTRADO PROFISSIONAL EM

CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE

COORDENADOR: Prof. Dr. Taylor Brandão Schnaider

Linha de Atuação Científico-Tecnológica: Fitoterapia

iv

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho ao meu pai Benedito (in memorian) e minha mãe Helena por sua

capacidade de acreditar e de investir em mim, à minha irmã Rúbia, aos meus familiares e

amigos pelas alegrias, tristezas e dores compartilhadas no processo de obtenção deste título

tão almejado.

v

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr MANOEL ARAÚJO TEIXEIRA, professor orientador do programa de

pós-graduação em Ciências Aplicadas a Saúde da Universidade do Vale do Sapucaí

(UNIVÁS), orientador deste trabalho, pelo direcionamento, orientações, correções, sugestões

e por sua incansável paciência no decorrer de todo o processo e principalmente por me ensinar

a ser pesquisadora.

À Prof.a Dr.a BEATRIZ BERTOLACCINI MARTINEZ, professora orientadora do

programa de pós-graduação em Ciências Aplicadas a Saúde da UNIVÁS, pela coorientação

deste trabalho, pelas correções e sugestões.

À Prof.a Dr.a DANIELA FRANCISCATO VEIGA, professora orientadora do

programa de pós-graduação em Ciências Aplicadas a Saúde da UNIVÁS pelas orientações e

sugestões, a minha admiração por tanta dedicação e competência.

Aos Professores LYDIA MASAKO FERREIRA, ANDY PETROIANI, DIBA

MARIA SEBBA TOSTA DE SOUZA, JOSÉ DIAS SILVA NETO, GERALDO MAGELA

SALOMÉ, JOEL VEIGA FILHO, MARIA JOSÉ AZEVEDO DE B. ROCHA, TAYLOR

BRANDÃO SCHNAIDER, ANA BEATRIZ ALKMIM TEIXEIRA LOYOLA e ADRIANA

RODRIGUES DOS ANJOS MENDONÇA por todos os ensinamentos, orientações e

sugestões tão importantes para realização deste trabalho.

Ao Prof. Dr NEIL FERREIRA NOVO e à Prof.a Dr.ª YARA JULIANO, professores

de bioestatística do programa de pós-graduação em Ciências Aplicadas a Saúde da UNIVÁS,

pela orientação e condução da análise estatística dos resultados deste trabalho.

À ILZAMARA MOREIRA SANTOS, VÂNIA DE FÁTIMA BARBOSA e

ELIZAMA SIQUEIRA BITTENCOURT, acadêmicas do curso de Enfermagem, LUIZ

ANDRE DE OLIVEIRA COSTA e TIAGO JARDIM DE OLIVEIRA, acadêmicos do curso

de Biologia pelo auxílio durante todo o decorrer da pesquisa, no preparo da anestesia dos

ratos, no processo de confecção, limpeza e curativo das feridas e na realização das culturas no

Laboratório de Cirurgia Experimental da UNIVÁS.

vi

A PABLO FERREIRA DAS CHAGAS, acadêmico do curso de Biologia da UNIVÁS

por sua ajuda na realização dos testes in vitro no laboratório de microbiologia da UNIVÁS.

A WELLINGTON DELFINO, coordenador do Comitê de Ética no Uso de Animais-

CEUA e veterinário do biotério por seu auxílio nos processos de anestesia, confecção das

feridas, coleta do material biológico e eutanásia dos animais no final do experimento.

A IVAN LÚCIO DE MELO funcionário do Laboratório de Cirurgia Experimental, por

suas sugestões que foram de muita ajuda para que todo o experimento decorresse da melhor

forma e por dispor recursos da estrutura laboratorial da UNIVÁS.

A LUIZ FRANCISLEY DE PAIVA, funcionário do Laboratório de Pesquisas básicas

da UNIVÁS por sua importante ajuda no preparo dos meios de cultura, na realização das

diluições das amostras dos lavados das feridas dos ratos e na realização das culturas.

A JOSÉ DONIZETI DOS REIS, funcionário do Laboratório de Botânica da UNIVÁS

por sua indispensável ajuda na obtenção do óleo de Melaleuca sp.

À amiga SAMANTA BORGES PEREIRA por toda ajuda e incentivo no início deste

projeto e aos meus amigos pela paciência na “fase mestrado”.

Aos amigos e patrões Dr. ANISIO EUSTÁQUIO DOS ANJOS SILVA e Dr.ª LUZIA

HELENA ALMEIDA DOS ANJOS proprietários do Méthodos Laboratório de análises

clínicas de Pouso Alegre por todo o apoio e ajuda financeira na realização deste sonho.

vii

O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo.

Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas

admiráveis.

José de Alencar

viii

SUMÁRIO

1 - CONTEXTO ....................................................................................................................................1

2 - OBJETIVO .......................................................................................................................................6

3 - MÉTODOS .......................................................................................................................................7

3.1 - EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE MELALEUCA SP. ............................................7

3.2 - AVALIAÇÃO DA CONSTITUIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO MELALEUCA SP. .............8

3.3 - ISOLAMENTO E TESTES COM STAPHYLOCOCCUS AUREUS ....................................8

3.3.1 - AMOSTRAS BACTERIANAS ...................................................................................... 8

3.3.2 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) .............. 9

3.3.3 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM) ..... 10

3.4 - INFECÇÃO ESTAFILOCÓCICA EM ANIMAIS ............................................................... 10

3.4.1 - ANIMAIS ...................................................................................................................... 11

3.4.2 - CONFECÇÃO DAS FERIDAS .................................................................................... 11

3.4.3 - INFECÇÃO POR S. AUREUS NOS RATOS ............................................................... 12

3.4.4 - LIMPEZA DAS FERIDAS E APLICAÇÃO DO PRINCÍPIO ATIVO ....................... 13

3.4.5 - QUANTIFICAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS NAS LESÕES PELO

MÉTODO DA IRRIGAÇÃO-ASPIRAÇÃO ........................................................................... 14

3.5 - ANÁLISE ESTATÍSTICA ...................................................................................................... 18

4 - RESULTADOS/PRODUTO ........................................................................................................19

4.1 - IDENTIFICAÇÃO CROMATOGRÁFICA DOS COMPONENTES DO ÓLEO DA

MELALEUCA SP. ............................................................................................................................... 19

4.2 - ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) E

CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM) ............................................................. 21

4.3 - TRATAMENTO DAS INFECÇÕES ESTAFILOCÓCICAS EM RATOS ...................... 22

5 - APLICABILIDADE ......................................................................................................................30

6 - CONCLUSÕES .............................................................................................................................36

7 – IMPACTO SOCIAL .....................................................................................................................37

8 - REFERÊNCIAS .............................................................................................................................38

9 - NORMAS ADOTADAS ..............................................................................................................44

10 - APÊNDICES ................................................................................................................................45

Apêndice: Contagem de UFC nas diluições 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 e 10-7 em cada

grupo, no decorrer do tratamento. .....................................................................................................45

11 - ANEXOS ......................................................................................................................................49

ix

ANEXO I - Microscopia óptica – microorganismos do gênero Staphylococcus: cocos Gram-

positivos únicos, aos pares ou agrupados. ........................................................................................49

ANEXO II – Cultura de Staphylococcus aureus .......................................................................... 540

ANEXO III – Padrão de sensibilidade e resistência aos antibióticos de bactéria isolada de

lesão de pé pelo aparelho MicroScan® auto SCAN-4 System da SIEMENS. ........................ 561

ANEXO IV – Padrão de sensibilidade e resistência aos antibióticos de bactérias isoladas de

lesão de joelho pelo aparelho MicroScan® auto SCAN-4 System da SIEMENS ...................................52

ANEXO V – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da UNIVÁS ................................. 543

ANEXO VI –Informativo sobre o filme de cobertura da ferida ................................................. 544

ANEXO VII – Meios de cultivo de microrganismos ................................................................. 546

x

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Hidrodestilação - aparelho do tipo Clevenger - Departamento de botânica –

UNIVÁS .................................................................................................................................................7

FIGURA 2: Ensaio para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e

Concentração Bactericida Mínima (CBM) ......................................................................................10

FIGURA 3: Ato cirúrgico para produção das feridas: a) Área epilada. b) Demarcação sob

pressão com o punch. c) Incisão da pele. d) Ferida cutânea expondo a fáscia muscular ...........12

FIGURA 4: Infecção da ferida: a) Inoculação de 0,5 mL de uma suspensão bacteriana de 1,5

x 108 UFC/mL de S. aureus. b) Fixação de filme adesivo protetor ..............................................13

FIGURA 5: Aplicação do tratamento com o auxílio do “prompt” de dispensação de 1 mL ...14

FIGURA 6: Coleta do material da ferida pelo método irrigação e aspiração. a) Obtenção do

lavado da ferida. b) Acondicionamento do lavado em tubo de ensaio estéril ............................14

FIGURA 7: Exemplo do processo de diluição seriada .................................................................16

FIGURA 8: Ágar sal manitol ..........................................................................................................16

FIGURA 9: Cultura e contagem de UFC. a) Inoculação do material para o meio de ágar sal

manitol. b) bactérias com aspecto de colônias características típicas do crescimento de

Staphylococcus aureus c) Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) ..................17

FIGURA 10: CIM para Bac 1 (lesão pé) : Tubo 7 – 0,1% Tubo 8 – 0,05% Tubo 9 –

0,025% ............................................................................................................................................... 171

FIGURA 11: CIM para Bac 2(lesão joelho) e Bac 3(ATCC® 25923™): Tubo 6 - 0,2%

Tubo 7 – 0,1% Tubo 8 – 0,05% Tubo 9 – 0,025% .................................................................... 212

FIGURA 12: Contagem de UFC na diluição 10 -1 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,

5 , 8, 12 e 15 de tratamento ................................................................................................................45


5, 8, 12 e 15 de tratamento .................................................................................................................45


5, 8, 12 e 15 de tratamento ................................................................................................................ 46


5, 8, 12 e 15 de tratamento ................................................................................................................ 46

FIGURA 16: Contagem de UFC na diluição 10 -5 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1

5, 8, 12 e 15 de tratamento .................................................................................................................47


5, 8, 12 e 15 de tratamento .................................................................................................................47

xi


5, 8, 12 e 15 de tratamento .................................................................................................................48

xii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Analitos identificados no óleo de Melaleuca sp. ....................................................20

TABELA 2 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus nos 10 ratos de cada

grupo na diluição 10 -1 no decorrer dos 15 dias de tratamento. .....................................................24

TABELA 3 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus dos 10 ratos de cada












TABELA 9 - Teste de Friedman - Diminuição do número de UFC no decorrer do tratamento

dentro do mesmo grupo. .....................................................................................................................27

TABELA 10 - Teste de Kruskal Wallis - Diminuição do número de UFC no decorrer do tratamento

entre os 4 grupos estudados. ...................................................................................................................28

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

% por cento – uma parte em cem partes

& substitui a conjunção aditiva “e”

® marca registrada

° graus

°C graus Celsius

µL microlitro

ad libitum à vontade

ATCC American Type Culture Collection

CBM Concentração Bactericida Mínima

CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais

CIM Concentração Inibitória Mínima

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

cm centímetro

COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

et al e colaboradores

IRAS Infecções Relacionadas à Assistência em Saúde,

IV infusão venosa

Kg quilograma

M. alt Melaleuca alternifolia

M. sp Melaleuca sp.

mg miligrama

mL mililitro

MRSA Staphylococcus aureus meticilina – resistentes

OE óleo essencial

OMS Organização Mundial de Saúde

psi medida de pressão

S. aureus Staphylococcus aureus

Tea tree árvore do chá

TTO óleo da árvore do chá

UFC unidades formadoras de colônias

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

xiv

RESUMO

Objetivo: Avaliar, o efeito inibitório do óleo da planta Melaleuca sp. no crescimento de

isolados de Staphylococcus aureus, provenientes de feridas de membros inferiores resistentes

a diferentes antibióticos. Métodos: A extração do óleo foi por hidrodestilação por arraste de

vapor. Após a obtenção do óleo da planta Melaleuca sp., testes in vitro determinaram a

Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) desse

óleo em relação a três cepas de S. aureus. O trabalho in vivo foi realizado com a inoculação da

bactéria S. aureus (isolado de lesão de membro inferior) na concentração de 1,5 x 108

UFC/mL, em 40 ratos fêmeas, que foram subdivididos em quatro grupos de dez indivíduos a

saber: ratos fêmeas tratadas com gel de carbopol; com tetraciclina; com óleo de Melaleuca

alternifólia e com óleo de Melaleuca sp. Resultados: A planta mostrou uma maior

quantidade de eucaliptol e terpenos. A CIM foi de 0,2% e a CBM foi de 0,4%. O melhor

tratamento in vivo foi com o antibiótico tetraciclina que diferenciou estatisticamente dos

demais tratamentos. Os óleos foram melhores que o tratamento controle, mas não obtiveram a

descolonização das feridas. Conclusão: In vitro o óleo de Melaleuca sp. cultivado no Brasil

apresentou um bom potencial bactericida; In vivo a capacidade antimicrobiana foi diminuída

mas com comportamento igual ao da Melaleuca alternifólia; A tetraciclina apresentou

melhores resultados neste estudo e é o tratamento mais adequado para esse tipo de ferida.

Palavras chaves: 1.Fitoterapia; 2.Óleo de Melaleuca; 3.Bactericidas; 4.Staphylococcus

aureus; 5. In vitro; 6. Feridas abertas.

xv

ABSTRACT

Objective: To evaluate the inhibitory effect of the plant Melaleuca sp. oil on the grouth of

Staphylococcus aureus from wounds of the lower limbs are resistant to various antibiotics.

Methods: The extraction of oil was carried out by hydrodistilation by drag ateam. After

obtaining the Melaleuca sp. plant oil, in vitro tests determined the minimum inhibitory

concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of this oil for three

strains of S. aureus. The in vivo study was inoculation of S. aureus bactéria (isolated lower

extremity injury) at a concentration of 1.5 x 108 CFU/mL in 40 rats, which were divided into

four groups of ten subjects namely: rats treated with tetracycline; Melaleuca alternifolia with

oil, oil of Melaleuca sp. and carbopol gel. Results: The plant showed a higher amount of

terpenes and eucalyptol. The MIC was 0,2% and MBC 0,4%. The best treatment in vivo was

with the antibiotic tetracycline statistically different from the other treatments. The oils were

better than control, but did not achieve the decolonization on the wounds. Conclusion: In

vitro oil Melaleuca spp. cultivated in Brazil has a good bactericidal potential; In vivo

antimicrobial capacity was diminished but with behavior equal to the Melaleuca alternifolia;

Tetracycline showed better results in this study and is the most appropriate treatment for this

type of wound. Keywords: 1.Phytotherapy; 2.Tea Tree Oil; 3.Bactericidal; 4. Staphylococcus

aureus; 5. In vitro; 6. Open wounds

1

1 - CONTEXTO

A infecção das feridas é uma das maiores preocupações dos profissionais que

lidam diretamente com essa temática pelos custos gerados decorrentes do processo infeccioso

(BOWLER et al., 2001). A presença de microrganismos infecciosos é uma das principais

causas do insucesso em processos de cicatrização de feridas (TAZIMA et al., 2008). Deve-se

considerar que toda ferida está colonizada, já que as bactérias existentes na pele podem

colonizar a lesão, mas isso não significa que esteja infectada (PRISTO, 2013).

RODEHEAVER (1997) recomendou para a limpeza da ferida infectada,

contaminada ou com área de necrose, o uso de irrigação da superfície da ferida para remoção

de restos avasculares e de bactérias, e ainda que a pressão do fluido de irrigação seria o fator

determinante para o sucesso da descontaminação.

Para resolver uma ferida é indicado tratar a infecção local com desbridamento

amplo, remoção de corpos estranhos e de tecido desvitalizado, acompanhado de limpeza,

curativos e o uso de antibióticos sistêmicos se necessário (PAGGIARO et al., 2010).

As infecções de feridas estão associadas a diversos fatores incluindo aos

procedimentos cirúrgicos e a queimaduras e têm, frequentemente, como agente etiológico os

Staphylococcus aureus, seguidos pelos Estafilococos coagulase negativa, Enterococcus sp. e

Escherichia coli (BORGES et al., 2008).

Microrganismos do gênero Staphylococcus são cocos Gram positivos, imóveis,

não formadores de esporos, que dão origem a células arredondadas com cerca de um mícron

de diâmetro. Quando observados em microscopia óptica, aparecem geralmente como células

únicas, aos pares ou agrupadas, com aparência de cacho de uvas (Anexo 1). A maioria das

espécies são aeróbicas ou anaeróbicas facultativas, com multiplicação rápida na maioria dos

meios de cultura a 37º C. As colônias de Staphylococcus aureus em meio sólido têm formas

arredondadas e aparência rugosa elevada e brilhante, com coloração amarelo-ouro. (Anexo 2)

(BROOKS et al., 2009; LEVINSON, 2010).

O gênero Staphylococcus faz parte da microbiota humana e pode provocar

doenças que vão desde uma infecção simples, como espinhas e furúnculos, até as mais graves,

como pneumonia, meningite, endocardite, síndrome do choque tóxico, septicemia, entre

outras (DUARTE e SÁ, 2011). Normalmente, o controle dessa bactéria é realizado com

antibióticos, mas devido à sua capacidade de adaptação e resistência, tornou-se uma das

espécies de maior importância no quadro das infecções hospitalares (DUARTE e SÁ, 2011).

2

As fossas nasais, garganta, intestinos e pele são as regiões do corpo que possuem o maior

índice de colonização (PALOS et al., 2009).

Em um estudo sobre a prevalência e os fatores associados à colonização de feridas

em pacientes internados no interior do nordeste do Brasil, encontrou-se uma proporção

elevada de feridas colonizadas por S. aureus e S. aureus meticilina-resistentes (MRSA). Nesse

trabalho ficou evidenciado que a colonização nasal por S. aureus pode ser uma fonte para a

colonização das feridas, ilustrando a importância de prevenir a contaminação cruzada em

ambientes hospitalares, principalmente entre os idosos (ALMEIDA et al., 2014). LAVERY et

al. (2014), em um estudo para determinar os fatores de risco para infecções do pé diabético

por MRSA, encontraram uma prevalência de 42,1% de S. aureus, e 70% desses isolados

foram resistentes à meticilina. No geral, a prevalência de MRSA em infecções do pé diabético

foi de 29,8%. Três fatores de risco foram evidenciados na pesquisa desses autores, a presença

de organismos multirresistentes, a história de uma infecção do pé diabético por MRSA e uma

cultura de MRSA nasal positivo. Em outro estudo ZALAVRAS et al. (2009) estudaram 26

pacientes com infecção após o tratamento operatório de fraturas de tornozelo, sendo que o

S. aureus foi identificado em 17 pacientes (65%) e oxacilina resistente em seis (23%).

Bactérias patogênicas S. aureus são responsáveis por uma mortalidade superior às

verificadas pelo vírus da imunodeficiência adquirida (HIV), tuberculose e hepatite viral

juntas, nos Estados Unidos (BOUCHER e COREY, 2008). É comum encontrar esse

microrganismo associado às infecções em feridas, a procedimentos cirúrgicos e a

queimaduras (BORGES et al., 2008). Também está relacionado, frequentemente, na

ocorrência das infecções relacionadas à assistência em saúde (IRAS), devido a sua alta

patogenicidade e à grande prevalência nas instituições de saúde.

Estima-se que cerca de 30% da população geral dos Estados Unidos seja

colonizada por S. aureus e 1,5% por MRSA (SIGEL et al., 2007; TENOVER, 2006;

ELSTON e BARLOW, 2009). No Brasil, não há dados sistematizados que apontem as taxas

de colonização por MRSA na população em geral, sendo que alguns estudos realizados em

populações específicas, por exemplo, em pacientes atendidos em Ambulatórios de

Dermatologia, apontam a prevalência de S. aureus, variando entre 15,5% e 68,79%

(WALTER et al., 2003 e DRYDEN et al., 2004).

O uso indiscriminado de antibióticos contra infecções estafilocócicas foi uma

prática utilizada em todo mundo, que proporcionou o aumento de isolados de MRSA, ou de

outro perfil de resistência antimicrobiana (CRUVINEL et al., 2011).

3

As terapias orais utilizadas no tratamento de MRSA incluem a tetraciclina e a

rifampicina (em terapia de combinação), bem como a clindamicina, a linezolida e o

trimetoprim-sulfametoxazol (TMP-SMX, embora o seu uso seja restrito em alguns países). As

tetraciclinas que atuam por inibição da síntese proteica bacteriana têm boa biodisponibilidade

e são de fácil penetração nos tecidos, fazendo dessa classe de drogas (que inclui a doxiciclina

de espectro estendido e a minociclina) uma opção para o tratamento ambulatorial de infecções

por MRSA (RUHE e MENON, 2007).

Essa classe de antibióticos possui atividade bacteriostática contra ampla variedade

de bactérias gram-positivas bem como gram-negativas aeróbias e anaeróbias. Mostra-se

intrinsicamente mais ativo contra os microrganismos gram-positivos do que contra os gram-

negativos. As tetraciclinas inibem a síntese bacteriana das proteínas por meio de sua ligação

ao ribossomo 30S da bactéria, impedindo o acesso do aminoacil-tRNA ao local aceptor no

complexo mRNA-ribossomo (BRUNTON et al., 2010).

A resistência é disseminada e, com frequência, induzível. Os três principais

mecanismos de resistência são: diminuição do acúmulo de tetraciclina (redução do influxo do

antibiótico ou aquisição de uma via de efluxo dependente de energia), produção de uma

proteína ribossômica que desloca a tetraciclina de seu alvo proporcionando uma “proteção”

que também pode ocorrer por mutação e inativação enzimática das tetraciclinas. (BRUNTON

et al., 2010).

O uso dos óleos essenciais como agentes medicinais é conhecido desde a remota

antiguidade. Registros de seis mil anos atrás relatam que os egípcios realizavam práticas

religiosas associadas à cura de males, às unções da realeza e à busca de bem-estar físico, por

meio dos aromas obtidos de folhas, de flores, de sementes e de outras partes específicas de

certos vegetais (TYRREL, 1990). Já sabiam há mais de 4.000 anos das propriedades do ópio

(Papaver somniferum) como sedativo e calmante, da hortelã pimenta (Mentha piperita) como

digestivo e da cila (Drimia urticaria) como estimulante cardíaco; sabiam também, como

preparar diuréticos, vermífugos, purgantes e antissépticos a partir das plantas (BHATTARAM

et al., 2002).

Estima-se que, entre 70 e 90% da população, em alguns países como França, Itália

e Alemanha, recorrem ao conhecimento popular, sob a forma de “medicina complementar”,

“alternativa” ou “não convencional”. Isso também é observado em países em

desenvolvimento, sob outra concepção, uma vez que, o acesso aos medicamentos ocorre de

forma precária, e a medicina popular, muitas vezes, é a principal fonte de prevenção, de

tratamento e de manutenção da saúde de grande parte da população nesses países (PROBST,

2012).

4

No trabalho de YUNES et al. (2001) foi descrito a necessidade do

desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e de fitofármacos no Brasil. Os autores

apontaram algumas vantagens que justificam o uso de fitoterápicos, como os efeitos

sinérgicos, a associação de mecanismos por compostos agindo em alvos moleculares

diferentes bem como menores riscos de efeitos colaterais e de custos em pesquisas.

O mercado global de medicamentos em 2011 (sintéticos e naturais) alcançou a

cifra de U$ 800 bilhões, variando esse valor de acordo com as condições econômicas e sociais

de cada região do mundo, enquanto o mercado para os fitoterápicos atingiu o patamar de

U$ 26 bilhões, com uma desigualdade regional semelhante. Na Europa, encontra-se o maior

mercado, sendo que cerca de 50% desse encontra-se na Alemanha. A América Latina com

sete países com uma imensa biodiversidade participou apenas com 5% desse total. Nesse

mesmo período, o mercado de fitoterápicos movimentou cerca de R$ 1,1 bilhão no Brasil,

quando foram comercializados 43 milhões de unidades desse tipo de medicamento,

representando um aumento de 13% em relação ao ano anterior (ALVES, 2013).

As pesquisas sobre a ação dos óleos essenciais de algumas plantas têm ficado

mais populares, porque muitas drogas sintéticas são relacionadas a efeitos colaterais

desagradáveis, como a nefrotoxicidade e a otoxicidade (LANG e BUCHBAUER, 2012).

Dentre os fitoterápicos estudados, a árvore do chá (Melaleuca alternifólia Cheel) é uma das

mais importantes, pois já demostrou ação contra MRSA (CARSON et al., 1995),

Streptococcus (CARSON et al., 1996) Staphylococcus coagulase negativa e coliformes

(HAMMER et al., 1996). Essa planta pertence à família Myrtaceae, que é composta por

vários genêros e cerca de 3500 espécies distribuídas por todo o mundo, preferencialmente, nas

zonas tropicais e subtropicais da América e da Austrália. Estão amplamente distribuidas pelas

florestas brasileiras e muitas de suas espécies são cultivadas por conta de seus frutos

comestíveis, com finalidade ornamental, como fonte de madeira, ou ainda como fonte de

essências de valor comercial. A maior aplicação biológica dos óleos essenciais é sua ação

como agente antimicrobiano, representando uma extensão do próprio papel que exercem nas

plantas protegendo-as da ação de bactérias e de fungos fitopatogênicos. Os quatro genêros

mais importantes desta família são: Eucalyptus, Melaleuca, Eugenia e Psidium (SIANI et al.,

2000).

A Melaleuca alternifolia é internacionalmente conhecida como “tea tree” ou

árvore do chá. Originária da Austrália, possui um grande valor econômico devido à presença

de óleo essencial armazenado em seus tecidos foliares. O óleo essencial é utilizado

principalmente na produção de cosméticos, de germicidas e de agentes antissépticos. Eles são

também utilizados no tratamento de várias doenças (FARAG et al., 2004).

5

A Austrália foi o país pioneiro a trabalhar com óleo desse gênero (CARSON et

al., 2006). No entanto, existem várias plantas espalhadas pelo mundo, como as espécies de

Melaleuca armillaris, M. acuminata e M. Stypheloiodes, cultivadas na Tunisia (AMRI et al.,

2012). No Egito, FARAG et al. (2004) isolaram óleos das espécies M. ericifolia, M.

leucadendron, M. armillaris e M. styphelioides. Foram descritas também a M. leucadendron

na Malásia e no Vietinã (BRINKMAN e XUAN, 1991) e nos EUA a M. Quinquenervia

(PORAZINSKA, 2007).

No Brasil, SILVA et al. (2010) trabalharam com as espécies de M. hypericifolia e

M. thymifolia na Universidade Federal de Viçosa. E no sul de Minas Gerais, PEREIRA e

TEIXEIRA (2012) trabalharam com o óleo de Melaleuca sp., cultivado como planta

ornamental, na cidade de Pouso Alegre e conseguiram a inibição da bactéria S. aureus in vitro

e de outros patógenos. Essa pesquisa abriu possibilidades para que o óleo produzido por essa

planta possa ser estudado, idenficando propriedades iguais ou similares às da M. alternifolia.

6

2 - OBJETIVO

Avaliar o efeito inibitório do óleo da planta Melaleuca sp. no crescimento de

Staphylococcus aureus, proveniente de feridas de membros inferiores resistentes a

antibióticos.

7

3 - MÉTODOS

3.1 - EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE MELALEUCA SP.

O óleo da folha da planta foi extraído por meio da hidrodestilação, utilizando o

equipamento do tipo Clevenger (Hermex Glasware – Brasil). Foram colocados 400 gramas de

folhas de Melaleuca sp. em um balão com 300 mL de água. Esse balão foi colocado sobre

uma manta aquecedora que aqueceu a mistura até à ebulição, liberando o vapor que arrasta

com ele o óleo da Melaleuca sp. O vapor passando pelo condensador foi resfriado e voltou

novamente à fase líquida. No balão de recolhimento, os líquidos que não eram solúveis entre

si separam-se (Figura 1). Depois de retirado, o óleo da Melaleuca sp. foi acondicionado em

frasco escuro e mantido em geladeira a uma temperatura de 5o C até o momento do envio da

amostra para análise dos constituintes químicos.

FIGURA 1: Hidrodestilação - aparelho do tipo Clevenger - Departamento de botânica –

UNIVÁS.

Fonte: Falci, S.P.P.

8

3.2 - AVALIAÇÃO DA CONSTITUIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO MELALEUCA SP.

A amostra do óleo foi enviada para o laboratório do Instituto de Química da

Universidade de Campinas (UNICAMP). A identificação das propriedades químicas foi

realizada por cromatografia gasosa, em cromatógrafo a gás (modelo 7890, Agilent, EUA) com

espectrofotômetro de massa tipo quadrupolo linear (modelo 5975, Agilent, EUA). A

identificação dos compostos do óleo foi realizada com base nos dados de espectro de massas

NIST11 (fabricado nos EUA) e no programa Automated Mass Spectral Deconvolution Mass e

Identification System (AMDIS – fabricado nos EUA). A concentração dos compostos foi

expressa em porcentagem de área normalizada dos picos. O índice adotado de qualidade foi

acima de 70%.

3.3 - ISOLAMENTO E TESTES COM STAPHYLOCOCCUS AUREUS

3.3.1 - AMOSTRAS BACTERIANAS

Foram avaliados dois isolados de S. aureus provenientes de feridas de membros

inferiores de pacientes, sexo feminino e com idades de 36 e 57 anos e uma cepa controle de

Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC® 25923™). O isolado proveniente de lesão do

pé demostrou resistência aos antibióticos Amoxilina/Ácido Clavulânico,

Ampicilina/Sulbactam, Ceftriaxona, Eritromicina, Oxacilina, Penicilina e Tetraciclina. Para o

antibiótico Clindamicina a resistência foi intermediária (Anexo 3). O isolado de lesão de

joelho foi resistente aos antibióticos Amoxilina/Ácido Clavulânico, Ampicilina/Sulbactam,

Ceftriaxona, Ciprofloxacin, Clindamicina, Eritromicina, Levofloxacina, Moxifloxacina,

Oxacilina, Penicilina e Synercid (Anexo 4).

A identificação dos microrganismos e o teste de suscetibilidade aos

antimicrobianos foram realizados por automação no aparelho MicroScan® auto SCAN-4

System da SIEMENS (Alemanha) com a utilização do painel Pos Combo Type 41

(Alemanha).

Após identificação, os isolados foram preservados em meio líquido Trypticase

Soy Agar (TSA - Himedia®), e a semeadura foi realizada em diversos tubos inclinados como

culturas estoque, a partir das quais foram reativados e inoculados para determinação da

Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM).

9

3.3.2 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM )

A partir das culturas estoques, os estafilococos foram transferidos para o meio

Tioglicolato (Himedia®), incubado a 37°C por 24 horas e em seguida semeados em meio ágar

sal manitol e novamente, incubados a 37°C por 24 horas. A concentração para a inoculação de

cada espécie de S. aureus foi de 1x106 UFC (Unidades Formadoras de Colônias) /mL e obtida

utilizando-se um swab esterilizado que foi tocado na superfície de 4 a 5 colônias grandes

isoladas na placa de ágar sal manitol e emulsionados em 3 mL de água para inóculo (água

desionizada autoclavada). A turvação final foi equivalente à de um padrão de turvação 0,5 da

escala de McFarland. Turvação essa confirmada através da utilização do medidor de turvação

MicroScan® com um intervalo de 0,08 ± 0,02. (Manual de procedimento para painéis de

Gram-Positivos Desidratados- MicroScan®– SIEMENS).

Na determinação da CIM foram utilizados 14 tubos de ensaio com 5 mL de caldo

Tioglicolato (Himedia®) para cada uma das cepas utilizadas. Em 12 tubos foram acrescidas

concentrações progressivas do óleo extraído, sendo o 12o tubo usado como controle, ou seja,

com a menor concentração do óleo, mas sem inóculo. O 13o tubo foi usado como controle

positivo de crescimento, isto é, sem o óleo, porém com o inóculo, e o 14o usado como

controle negativo, sem o óleo e sem o inóculo, apenas o meio de cultura. As concentrações

utilizadas foram 8; 4; 2; 1; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125 e 0,00625%. O ensaio foi

realizado com três repetições para cada tubo. Após a adição do óleo, os 11 primeiros tubos e o

13º tubo (controle positivo) receberam 250 µL de um mesmo inóculo contendo 1x106

UFC/mL. Todos os tubos foram acondicionados em incubadora a 37°C de temperatura,

durante 18 horas. Decorrido esse período, os tubos foram examinados visualmente para

comprovar a presença de turvação. O primeiro tubo no qual não se observou turvação foi

considerado como contendo a CIM (Figura 2).

A CIM foi estabelecida para a bactéria isolada da lesão do pé, para a lesão do

joelho e para a cepa de Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC® 25923™), que é uma

cepa americana padronizada (Figura 2).

10

FIGURA 2: Ensaio para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM). Fonte: Falci, S.P.P.

3.3.3 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CB M)

Nos tubos que não se mostraram turvos, foram retiradas alíquotas de 100 µL, que

foram depositadas em placas de Petri contendo ágar sal-manitol (Difco Co), espalhadas com o

auxílio da alça de Drigalski e encubadas invertidas a 37º por 18 horas. A primeira

concentração que não permitiu o crescimento de nenhuma colônia sobre a superfície do ágar

foi considerada como a CBM, ou seja, a concentração capaz de matar todos os

microrganismos.

3.4 - INFECÇÃO ESTAFILOCÓCICA EM ANIMAIS

O experimento foi realizado no laboratório de Cirurgia Experimental, para os

procedimentos com os ratos, e no Laboratório de Microbiologia, para os procedimentos de

cultura microbianas e contagem de unidades formadoras de colônias (UFC), da Faculdade de

Ciências da Saúde Dr. José Antônio Garcia Coutinho da Universidade do Vale do Sapucaí

(UNIVÁS), em Pouso Alegre, Minas Gerais.

11

Desenho da pesquisa:

Tratou-se de estudo experimental com ratos, primário, intervencional,

prospectivo, analítico e controlado. Os princípios éticos para o uso de animais de laboratório

foram seguidos conforme preconiza o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

(COBEA). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animal (CEUA) da

Universidade do Vale do Sapucaí (UNIVÁS), sob o protocolo 187/13 (Anexo 5).

3.4.1 - ANIMAIS

A amostra foi constituída por 40 ratos (Rattus Norvegicus albinus) da linhagem

Wister, fêmeas, com 3 a 4 meses de vida, com massa corpórea de aproximadamente 300 g,

proveniente do biotério da Universidade do Vale do Sapucaí, MG, Brasil (UNIVÁS).

Os animais ficaram dez dias em adaptação, alojados e mantidos no biotério em

caixas moradias individuais de polipropileno (Caixa GK 115 – Beira Mar), com dimensão de

49x34x16 centímetros (cm), identificadas com números de 1 a 40. A iluminação foi

controlada com ciclo claro/escuro de doze horas. Os animais receberam ração padronizada

(ração extrusada presence da marca Evitalis) e água ad libitum. A higienização das gaiolas foi

realizada duas vezes por semana, com troca das maravalhas.

3.4.2 - CONFECÇÃO DAS FERIDAS

Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia geral, por meio

de administração intramuscular de 0,1 mL de cloridrato de quetamina (Dopalen, Agribrands),

associado a 0,05 mL de cloridrato de xylazina (Rompun, Bayer), para cada 100 gramas de

peso do animal.

Com o animal anestesiado, por meio de um molde de papelão e com uma caneta

dermográfica, demarcou-se no dorso uma área quadrangular de 5 cm no eixo longitudinal por

5 cm no eixo transversal, iniciada a partir da margem inferior das escápulas. Essa área foi

epilada manualmente.

Antes da incisão, o local da ferida foi estabelecido como uma área circular de 2,5

cm de diâmetro, no plano transverso, com seu centro na linha mediana dorsal seguindo em

sentido caudal, iniciando-se a 1 cm da margem inferior das escápulas.

Na mesa cirúrgica, a região demarcada em cada rato foi limpa com solução salina

a 0,9%, e a antissepsia realizada com álcool 70% (Figura 3A). Com um “punch” de aço

12

inoxidável de 2,5 cm de diâmetro e extremidade cortante em bisel fez-se pressão contra a pele

o que produziu um corte circular superficial (Figura 3B). Com bisturi e tesoura íris foram

completadas a incisão e a ressecção da pele e do panículo carnoso até a fáscia muscular

superficial (Figura 3C), produzindo a ferida conforme técnica preconizada por OLIVEIRA et

al., 2000 com adaptação de ATZINGEN et al.(2013) (Figura 3D).

FIGURA 3: Ato cirúrgico para produção das feridas: A) Área epilada. B) Demarcação sob pressão com o punch. C) Incisão da pele. D) Ferida cutânea expondo a fáscia muscular. Fonte: Falci, S.P.P.

3.4.3 - INFECÇÃO POR S. AUREUS NOS RATOS

A seguir ao procedimento cirúrgico, cada animal recebeu sobre a ferida 0,5 mL de

uma suspensão bacteriana de 1,0 x 106 UFC/mL de S. aureus (turbidez de 0,5 na escala de Mc

Farland). Nesse experimento utilizou-se o S. aureus isolado da lesão do joelho por apresentar

resistência a um número maior de antibióticos que as outras duas cepas utilizadas nos testes

de CIM e CBM (Figura 4A).

A B

C D

13

Esse procedimento foi efetuado em todos os animais, sendo esse dia considerado

como dia zero da infecção. Em seguida, a ferida foi coberta com filme transparente adesivo

(Smith & Nephew® Inglaterra, modelo OpSite Flexigrid) com dimensão de 2,5x3,0cm (Anexo

VI). Para a fixação do filme transparente, a película que protege a parte adesiva foi removida,

sendo o filme aderido à área ao redor da ferida e, em seguida, foi removida a camada externa,

ficando, apenas a camada do meio, fina e flexível aderida ao dorso do animal (Figura 4B).

Depois o animal foi recolocado na gaiola.

FIGURA 4: Infecção da ferida: A) Inoculação de 0,5 mL de uma suspensão bacteriana de 1,0 x 106 UFC/mL de S. aureus. B) Fixação de filme adesivo protetor. Fonte: Falci, S.P.P.

Após dois dias da infecção foi realizada a separação dos animais em quatro grupos

distintos a saber:

a) grupo controle (n=10) – o tratamento das feridas dos ratos foi realizado com 1 mL de gel

de carbopol;

b) grupo tetraciclina (n=10) – as feridas deste grupo de ratos receberam 1 mL de tetraciclina

a 1% em gel de carbopol, obtido em farmácia de manipulação;

c) grupo Melaleuca alternifolia (n=10) – neste grupo foi aplicado 1 mL de óleo de Melaleuca

alternifolia a 1% em gel de carbopol, obtido em farmácia de manipulação;

d) grupo Melaleuca sp. (n=10) – as feridas dos ratos receberam 1 mL do óleo de Melaleuca

sp. (extraído no laboratório de botânica da UNIVÁS) a 1% em gel de carbopol que foi

preparado em farmácia de manipulação.

3.4.4 - LIMPEZA DAS FERIDAS E APLICAÇÃO DO PRINCÍPIO ATIVO

Diariamente, sempre antecedendo à aplicação do tratamento, foi realizado o

desbridramento da ferida quando necessário, com o auxílio de pinça e gaze embebida em soro

A B

14

fisiológico 0,9% esterilizado por meio de um procedimento rápido, invadindo minimamente

os tecidos vivos. Em seguida foi realizada a limpeza da ferida com 5 mL de soro fisiológico a

0,9%.

Para os tratamentos realizados a partir do estabelecimento da infecção foi usado

um “prompt” com capacidade de dispensação de 1 mL da substância utilizada em cada grupo,

de forma a preencher toda a superfície da lesão e desta forma padronizar a quantidade de

tratamento aplicada nos quatro grupos (Figura 5). Esses tratamentos foram realizados durante

um período de 15 dias.

Após a limpeza e o tratamento, as feridas permaneceram cobertas por filme

transparente adesivo durante todo o experimento. A analgesia dos animais durante o

experimento foi feita com Cetoprofeno (3 dias) e Dipirona gotas (12 dias), diluídos na água

que os ratos beberam, na quantidade de 5 mg/Kg e 15 mg/kg, respectivamente.

FIGURA 5: Aplicação do tratamento com o auxílio do “prompt” de dispensação de 1 mL. Fonte: Falci, S.P.P.

3.4.5 - QUANTIFICAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS NAS LESÕE S PELO MÉTODO DA IRRIGAÇÃO-ASPIRAÇÃO

A coleta do lavado da ferida para quantificação das UFC foi realizada nos 1º, 5º,

8º, 12º e 15º dias, contados depois do processo de infecção. A cada avaliação foram

depositados sobre a ferida, com o auxílio de uma seringa com capacidade de dez mL acoplada

a uma agulha estéril de calibre 25x7, 5 mL de soro fisiológico a 0,9%, esterilizado. A solução

do soro fisiológico lavou todo o leito da lesão. Com uma seringa de 3 mL, foi expirado

exatamente 2 mL dessa solução do soro com os microrganismos existentes na lesão e

15

transferidos para um tubo de ensaio esterilizado. Este foi vedado com tampa de rosca e

imediatamente encaminhado ao laboratório de microbiologia.

Para possibilitar a coleta do lavado das lesões, evitando a perda dessa solução com

as bactérias, foi utilizado um suporte confeccionado a partir do corte do embolo de seringa de

20 mL e afixado manualmente ao redor da lesão pelo pesquisador. Esse suporte e a seringa de

3 mL foram trocados a cada nova coleta em cada rato (Figura 6A e 6B).

FIGURA 6: Coleta do material da ferida pelo método irrigação e aspiração. A) Obtenção do lavado da ferida. B) Acondicionamento do lavado em tubo de ensaio estéril. Fonte: Falci, S.P.P.

A alíquota de 1 mL da mistura do soro com os microrganismos foi retirada da

amostra e submetida à técnica de diluição seriada. Com uma pipeta automática esterilizada

repassou-se 1,0 mL do lavado da ferida para outro tubo de ensaio com 9,0 mL de solução

esterilizada de cloreto de sódio a 0,9%, obtendo a diluição 10-1. Esse procedimento foi

repetido até a diluição 10-7 (Figura 7). Após a diluição foi transferido 100µL de cada uma das

sete diluições, começando da mais diluída para a menos diluída, para a superfície do meio

ágar sal manitol, seletivo para bactérias do gênero Staphylococcus (Figura 8). Para cada

diluição, foram realizados três plaqueamentos.

A B

16

FIGURA 7: Exemplo do processo de diluição seriada. Fonte: https://bacilosnasopa.wordpress.com/tag/tecnica-de-diluicao-seriada/

FIGURA 8: Ágar sal manitol. Fonte: Falci, S.P.P.

O inóculo foi espalhado com o auxílio da alça de Drigalsky sobre a superfície do

ágar sal manitol (Figura 9A). As placas foram incubadas invertidas, a uma temperatura de

37ºC, por 24h, quando então foi feita a contagem de bactérias com aspecto de colônias

características típicas do crescimento de S. aureus (colônias com halo amarelo ao redor,

resultado da fermentação do manitol (Figura 9B) com o auxílio do contador de colônias

17

mecânico CP 602 (Phoenix) (Figura 9C). A quantificação de UFC indicou quantas bactérias

havia, por mililitros, na suspensão original da ferida.

No décimo sétimo dia do experimento, o animal foi submetido à anestesia geral e

em seguida realizada a retirada do material biológico para futuros estudos. A eutanásia foi

realizada com cloreto de potássio 19% via intracardíaca.

FIGURA 9: Cultura e contagem de UFC. A) Inoculação do material para o meio de ágar sal manitol. B) Bactérias com aspecto de colônias características típicas do crescimento de S. aureus C) Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC). Fonte: Falci, S.P.P.

A B

C

18

3.5 - ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram processados pelo software Statistical Package for the Social

Sciences (SPSS), versão 18. Por meio do teste de Kruskal Wallis, foi avaliada entre os grupos

a diferença quantitativa do número de UFC nos 5 dias de coleta do lavado das feridas e nas 7

diluições no decorrer dos 15 dias de tratamento. Foi avaliada também dentro de cada grupo a

variação de crescimento de UFC nos 5 dias de coleta do lavado das feridas no decorrer do

tratamento e nas 7 diluições, pelo teste de Friedman.

O nível de rejeição da hipótese de nulidade foi fixado em 5%, considerando-se

significantes os valores de p menores ou iguais a 0,05.

19

4 - RESULTADOS/PRODUTO

4.1 - IDENTIFICAÇÃO CROMATOGRÁFICA DOS COMPONENTES DO ÓLE O

DA MELALEUCA SP.

No óleo de Melaleuca sp. foram detectados 27 picos, dos quais 21 são

apresentados na Tabela 1. Os seis picos não identificados podem estar relacionados a novas

estruturas que não foram reconhecidas pela biblioteca de dados do programa ou podem ser

picos que não se separaram uns dos outros durante a cromatografia. Houve uma pequena

prevalência de monoterpenos (57,2%) em relação à presença de sesquiterpenos (42,8%). Os

principais monoterpenos foram o eucaliptol ou 1,8 cineol com 70,08%, seguidos de terpineol

com 8,95% e limonemos com 8,25%. Dos sesquiterpenos encontrados, o mais abundante foi o

globulol, seguido de octahidro tetrametil ciclopropazuleno com 0,62% e 0,50%. Todos os

constituintes identificados no óleo estão dispostos na Tabela 1.

20

TABELA 1 – Analitos identificados no óleo de Melaleuca sp.

Pico tR Nome do Composto % A Qualidade

1 8,88 Trimetil Biciclico Hepteno 3,39 97

2 10,20 Dimetil Metileno Biciclico Heptano 1,09 97

3 10,67 Mirceno 1,99 AMDIS

4 11,04 Metileno Metiletenil Cicloexano 0,15 76

5 11,44 Metil Metiletilideno Cicloexano 0,20 95

6 11,69 Tetrametl Benzeno 0,13 81

7 11,82 Limoneno 8,25 99

8 11,89 Eucaliptol 70,08 99

9 12,76 Terpineno 0,64 94

10 13,67 Isopropilideno Metil Biciclico Hexano 0,13 89

11 16,03 Terpineol (isômero) 0,22 AMDIS

12 16,33 Terpineol (isômero) 0,84 93

13 16,72 Terpineol (isômero) 7,89 87

14 22,76 Não determinado 0,15 -


16 23,51 Decahidro Trimetil Metileno

Ciclopropazuleno

0,50 95

17 24,06 Aloaromadendreno 0,27 99

18 24,91 Octahidro Tetrametil Ciclopropazuleno 0,62 96

19 25,56 Hexahidro Dimetil Metil Etil Naftaleno 0,43 90



22 27,03 Globulol 0,82 98

23 27,23 Octahidro Dimetil Metil Etenil Azuleno 0,45 87


25 27,45 Eudesmol 0,29 AMDIS


27 28,03 Hexahidro Dimmetil Metiletil Naftaleno 0,23 87

Pico: Número do pico pela ordem de eluição da coluna tR = Tempo de retenção do composto na coluna em minutos Nome do composto: Nome mais comum do composto identificado. %A = Porcentagem de área normalizada a qual indica a distribuição relativa dos compostos na amostra. Qualidade: é o índice de pesquisa na base de dados que reflete a similaridade do espectro de massas obtido com os registrados nas bibliotecas utilizadas. Foram adotados índices de qualidade > 70. Fonte: Falci, S.P.P.

21

4.2 - ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) E

CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM)

A partir de inóculos padronizados de cada amostra bacteriana testada foram

obtidos os resultados de CIM e CBM para o óleo de Melaleuca sp. cultivado no Brasil.

Houve crescimento bacteriano em todos os tubos com meio de cultura sem adição

do óleo teste. A CIM do óleo de Melaleuca sp. mostrou diferentes resultados para as bactérias

testadas, sendo que, os S. aureus, proveniente da lesão do pé e a cepa controle, ATCC®

25923™ foram mais resistentes ao óleo testado, quando comparados ao S. aureus proveniente

da lesão do joelho. O óleo da Melaleuca sp. apresentou CIM de 0,1% para o isolado de S.

aureus proveniente da lesão no pé e para a cepa controle ATCC® 25923™. Para o isolado da

lesão no joelho, a CIM foi de 0,2%

A CBM do óleo de Melaleuca sp. foi a mesma para todas as bactérias testadas, e a

ausência de crescimento se deu a partir do tubo 5 a 0,4%. Portanto, os resultados obtidos para

CIM e CBM foram respectivamente 0,1% e 0,4% para o isolado de S. aureus proveniente da

lesão no pé (Figura 10) e de 0,2% e 0,4% para o isolado da lesão no joelho. Para a cepa

ATCC® 25923™, a CIM e a CBM foram respectivamente 0,2% e 0,4% (Figura 11).

FIGURA 10: CIM para Bac 1 (lesão pé): Tubo 7 - 0,1%; Tubo 8 - 0,05%; Tubo 9 - 0,025%. Fonte: Falci, S.P.P.

7 8

9

22

FIGURA 11: CIM para Bac 2 (lesão joelho) e Bac 3 (ATCC® 25923™): Tubo 6 - 0,2; Tubo 7 - 0,1%; Tubo 8 - 0,05%; Tubo 9 - 0,025%. Fonte: Falci, S.P.P.

4.3 - TRATAMENTO DAS INFECÇÕES ESTAFILOCÓCICAS EM RATOS

Na diluição 10-1 houve um aumento no número de UFC/mL do grupo controle

entre a primeira (dia 1) e a segunda (dia 5) leituras de avaliação do experimento (Tabela 2).

Quando esse resultado foi analisado, o aumento no número de bactérias S. aureus não foi

significativo. A partir de então, houve uma inversão desse resultado, e nas demais passaram a

ser observadas reduções no número de UFCs das leituras do oitavo dia (197,9), do décimo

segundo (37,3) e do décimo quinto dia (11,9), conforme descrito na Tabela 2.

Reduções estatísticamente significantes foram encontradas na comparação das

primeiras leituras (dias 1 e 5) com as duas últimas (dias 12 e 15). Outra diferença estatística

significativa encontrada foi na comparação do número de bactérias obtidas na terceira leitura

(dia 8) em relação ao número de bactérias obtidas na última leitura (dia 15). Esses dados estão

disponíveis na Tabela 9. Portanto, neste trabalho, o comportamento do tratamento controle

mostrou que o simples fato de se lavar uma ferida contribuiu para a redução do número de S.

aureus que estavam presentes na infecção inicial.

No segundo dia de coleta (dia 5) e na diluição de 10-1 houve uma diminuição

significativa no número de UFC no grupo tratado com a tetraciclina em relação ao controle e

ao tratamento com Melaleuca alternifolia (Tabela 10). A tetraciclina não se diferenciou da

Melaleuca sp., mas foi mais eficiente na redução do número de microrganismos (Tabela 2).

6 7 8 9

23

Quando se analisa a diferença do crescimento dos microrganismos dentro do mesmo grupo, os

resultados mostraram que o número contado na primeira leitura (dia 1) em relação à terceira, à

quarta e à quinta leituras (dias 8, 12 e 15) foi significativo (Tabela 9). Também foi observada

uma diferença significativa entre o número de S. aureus encontrados na segunda leitura (dia

5) e na última (dia 15), conforme Tabela 9.

Quando se observam os tratamentos da Melaleuca alternifolia na diluição de 10-1,

em relação ao controle não houve diferença estatística entre eles, e nessa primeira avaliação

de resultados coube a ela o pior desempenho entre os tratamentos aplicados no combate ao

S. aureus (Tabela 2). O tratamento com o óleo de Melaleuca alternifólia não diminuiu

significativamente o número de S. aureus da primeira leitura (um dia) em comparação ao

número desses microrganismos da segunda leitura (cinco dias). A diminuição se tornou

significativa quando se comparou essas primeiras leituras com as duas últimas (doze e quinze

dias), conforme Tabela 9. Quando se comparou a terceira leitura (oito dias) com a última

(quinze dias), também houve diferença significativa (Tabela 9).

Avaliando ainda os resultados da diluição 10-1, a Melaleuca sp. reduziu bastante o

número de microrganismos em relação ao controle, mas não foi tão eficiente como a

tetraciclina e nem tão ineficaz como foi a Melaleuca alternifolia, nos primeiros cinco dias de

observação dos dados (Tabela 2). No tratamento com o óleo da planta Melaleuca sp. foi

observada uma redução significativa de propágulos de S. aureus entre a primeira leitura (dia

1) quando comparada à quarta e à quinta leituras (dias 12 e 15). Também foi observada uma

diferença significativa entre o número de S. aureus encontrados na segunda leitura (cinco

dias) e na terceira leitura (oito dias) em relação à quinta leitura (15 dias), conforme descrito na

Tabela 9.

A partir do oitavo dia de observação, a tetraciclina continua sendo o melhor

tratamento de combate à bactéria S. aureus, diferenciando estatisticamente de todos os outros

tratamentos (Tabela 10). O controle continua também com um número de microrganismos

maior que os demais tratamentos (Tabela 2). No entanto, quando se comparam os tratamentos

da Melaleuca alternifolia e Melaleuca sp., observa-se uma redução não significativa (Tabela

2) do número de bactérias controladas pelo tratamento com o óleo de M. alternifolia.

No décimo quinto dia, o melhor resultado observado continuou sendo para o

tratamento com tetraciclina que diferenciou estatisticamente do controle e da Melaleuca sp.

(Tabela 10), mas não diferenciou do tratamento com o óleo da Melaleuca alternifolia.

24

TABELA 2 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus nos 10 ratos de cada

grupo na diluição 10-1 no decorrer dos 15 dias de tratamento.

Grupos dia 1 dia 5 dia 8 dia 12 dia 15

Controle 279,7 334,2 197,9 37,3 11,9

Tetra 339,7 30,5 13 9,2 1,1

M. alt 368,5 283,6 133,6 28,6 8,9

M. sp. 361,6 195,8 160,2 61 15,8

Nas diluições 10-2 e 10-3 os resultados foram exatamente iguais aos observados na

diluição 10-1, exceto quando foram observados os tratamentos com Melaleuca sp. e M.

alternifolia. Na diluição 10-2 o tratamento com o óleo de Melaleuca alternifolia foi melhor

que o da Melaleuca sp., fato inversamente observado na diluição 10-1 (Tabela 3).




Controle 209,4 184,2 30,2 3 0,7

Tetra 241,8 3,3 1,4 0,3 0

M. alt 185,5 51,9 9,6 2,8 0,3

M. sp. 122,9 100 25,5 4,2 1,2

Na diluição 10-3 foram analisados os dados até à quarta leitura (dia 12), pois na

última leitura não houve crescimento de microrganismos que permitisse uma comparação

entre os tratamentos (Tabela 4).

25




Controle 50,7 19,9 4,5 0,3 0,1

Tetra 40,3 0,1 0 0 0

M. alt 29,3 5,9 0,8 0,2 0

M. sp. 22,2 14,5 0,3 0,1 0

Nas diluições 10-4, 10-5, 10-6 e 10-7 não houve crescimento de microrganismos

suficiente para uma análise estatística, conforme mostram as Tabelas 5, 6, 7 e 8.


grupo na diluição 10 -4 no decorrer dos 15 dias de tratamento.


Controle 8,7 2,1 0,3 0 0

Tetra 3,1 0 0 0 0

M. alt 41,7 0,3 0 0 0

M. sp. 7,6 1,3 0 0 0




Controle 0,8 0 0 0 0

Tetra 1,2 0 0 0 0

M. alt 2,4 0 0 0 0

M. sp. 0,1 0 0 0 0

26





Tetra 0,2 0 0 0 0

M. alt 0,8 0 0 0 0

M. sp 0 0 0 0 0





Tetra 0,5 0 0 0 0

M. alt 0,4 0 0 0 0

M. sp 0 0 0 0 0

27

TABELA 9 – Teste de Friedman - Diminuição do número de UFC no decorrer do tratamento

dentro do mesmo grupo.

(1º DIA X 5º DIA X 8º DIA X 12º DIA X 15º DIA)

CONTROLE TETRACICLINA MELALEUCA ALTERNIFOLIA MELALEUCA SP

DILUIÇÃO 10 -1

( p < 0,0001)

1º e 5º DIAS > 12º e

15º DIAS

8º DIA > 15º DIA

( p < 0,0001 )

1º DIA > 8º, 12º e 15º

DIAS

5º DIA > 15º DIA

( p < 0,0001 )

1º e 5º DIAS > 12º e 15º DIAS

8º DIA > 15º DIA

( p < 0,0001 )

1º DIA > 12º e 15º

DIAS

5º e 8º DIAS > 15º

DIA

DILUIÇÃO 10-2

( p < 0,0001)

1º DIA > 15º DIA

5º DIA > 12º e 15º

DIAS

( p < 0,0001 )

1º DIA > 8º, 12º e 15º

DIAS

5º DIA > 15º DIA

( p < 0,0001 )

1º DIA > 8º, 12º e 15º DIAS

5º DIA > 12º e 15º DIAS

( p < 0,0001 )

1º e 5º DIAS > 12º e

15º DIAS

DILUIÇÃO 10-3

( p = 0,0047 )

5º DIA > 15º DIA

( p = 0,0005 )

1º DIA > 5º, 8º, 12º e

15º DIAS

( p < 0,0001 )

1º DIA > 8º, 12º e 15º DIAS

( p = 0,0004 )

1º DIA > 8º, 12º e 15º

DIAS

DILUIÇÃO 10-4 ( p = 0,0668 )

( p = 0,1257 )

( p = 0,0418 )

( p = 0,0563 )

DILUIÇÃO 10-5

( p = 0,5249 )

( p = 0,2873 )

( p = 0,7725 )

( p = 0,9953 )

DILUIÇÃO 10-6

( p = 0,7725 )

( p = 0,9384 )

( p = 0,9384 )

( p = 1,0000 )

DILUIÇÃO 10-7

( p = 0,9384 )

( p = 0,7725 )

( p = 0,9953 )

( p = 1,0000 )

28

TABELA 10 - Teste de Kruskal Wallis - Diminuição do número de UFC no decorrer do

tratamento entre os 4 grupos estudados.

CONTROLE X TETRACICLINA X MELALEUCA ALTERNIFÓLIA X MELALEUCA SP

DIA 1 DIA 5 DIA 8 DIA 12 DIA 15

DILUIÇÃO 10 -1

( p = 4757 )

( p < 0,0001 )

* TETRACICLINA

< CONTROLE

* TETRACICLINA

< MELAL.

ALTERNIFOLIA

( p = 0,0002 )

* TETRACICLINA

< CONTROLE

* TETRACICLINA

< MELAL.

ALTERNIFOLIA

* TETRACICLINA

< MELAL. SP

( p = 0,0071 )

* TETRACICLINA

< CONTROLE

* TETRACICLINA

< MELAL.

ALTERNIFOLIA

* TETRACICLINA

< MELAL. SP

( p = 0,0027 )

* TETRACICLINA

< CONTROLE

* TETRACICLINA

< MELAL. SP.

DILUIÇÃO 10 -2

( p = 0,8838 )

( p = < 0,0001 )

* TETRACICLINA

< CONTROLE

* TETRACICLINA

< MELAL.

ALTERNIFOLIA

* TETRACICLINA

< MELAL. SP

( p = 0,0013 )

* TETRACICLINA

< CONTROLE

* TETRACICLINA

< MELAL.

ALTERNIFOLIA

* TETRACICLINA

< MELAL. SP

( p = 0,0146 )

* TETRACICLINA

< CONTROLE

( p = 0,4600 )

DILUIÇÃO 10 -3

( p = 0,9480 )

( p = 0,0014 )

* TETRACICLINA

< CONTROLE

( p = 0,0298 )

* TETRACICLINA

< CONTROLE

( p = 0,7271 )

( p = 0,9744 )

DILUIÇÃO 10 -4

( p = 0,8395 )

( p = 0,2549 )

( p = 0,9744 )

( p = 1,0000 )

( p = 1,0000 )

DILUIÇÃO 10 -5

( p = 0.3894 )

( p = 1,0000 )

( p = 1,0000 )

( p = 1,0000 )

( p = 1,0000 )

DILUIÇÃO 10 -6

( p = 0,7016 )

( p = 1,0000 )

( p = 1,0000 )

( p = 1,0000 )

( p = 1,0000 )

DILUIÇÃO 10-7 ( p = 0,7129 ) ( p = 1,0000 ) ( p = 1,0000 ) ( p = 1,0000 ) ( p = 1,0000 )

29

A técnica de irrigação-aspiração demonstrou ser eficiente. Em trabalhos

realizados por essa técnica é necessário fazer diluições apenas entre 10-1 e 10-3, quando se

tratar de estudos referentes à quantificação de S. aureus em feridas de ratos.

30

5 - APLICABILIDADE

CARSON et al. (2006) descreveram que o óleo isolado da árvore do chá (M.

alternifolia) é formada de hidrocarbonetos de terpeno, principalmente de monoterpenos e

sesquiterpenos e outros alcoóis associados. O mesmo foi observado no presente estudo, com

porcentagens bem similares. No entanto, quando se compararam os compostos das duas

plantas, Melaleuca sp. e M. alternifolia, perceberam-se diferenças na constituição dos óleos,

como a prevalência do eucaliptol (1,8 cineol) na amostra brasileira em relação ao terpinen-4-

ol, principal constituínte descrito para amostras australianas (CARSON et al., 2006).

Uma das dificuldades de se estabelecer a fitoterapia como prática médica é a falta

de padronização dos constituintes químicos das plantas. Isso tem sido relatado com frequência

nas literaturas, e outros autores descreveram que o óleo de Melaleuca alternifolia e outras

espécies sofrem variações na sua constituição, quando se trata das mesmas variedades ou

quimiotipos ou mesmo de lote para lote. (CARSON et al., 2006 e QUINTÃO, 2013).

O óleo extraído da Melaleuca sp. é rico em eucalitol (1,8 cineol), e somente nos

últimos anos, as pesquisas mostraram existir uma ação antimicrobiana atribuída a essa

molécula, que age como um facilitador da permeabilidade da membrana em microrganismos

como S. aureus (CARSON et al., 2006). O eucaliptol encontrado na amostra brasileira abre a

possibilidade para que trabalhos posteriores busquem o entendimento da ação dessa

substância em bactérias patogênicas, principalmente as do gênero S. aureus, pois in vitro sua

ação foi tão eficaz quanto à dos óleos cultivados na Austrália, que possuem o terpinen-4-ol

como principal agente antimicrobiano.

A Standards Association of Australian (1985), por meio da AS 2782, e a

International Standards Organization (1996), por meio da ISO 4730 preconizaram que, para

que o óleo da árvore do chá (TTO) seja comercializado deverá seguir alguns parâmetros de

qualidade, nos quais foi estabelecido que, a quantidade de 1.8- cineol (eucaliptol) deve ser

abaixo de 15% e a de terpinen-4-ol, acima de 30% para que, se tenha eficácia mínima como

antisséptico. Neste trabalho, a amostra de óleo da planta Melaleuca sp. não atingiu a

qualidade pré-estabelecida pelo comitê australiano e pelo comitê internacional. Outros

trabalhos de pesquisa precisam ser feitos com essa planta, sobretudo no aspecto agronômico,

para que possam ser estabelecidas as condições ideais de cultivo, de clima, de horário de

coleta, entre outros fatores, que poderão colaborar para a produção de algumas moléculas

antimicrobianas como o terpinen-4-ol, que não foi encontrada na amostra de óleo da planta

brasileira. Todavia, o padrão internacional para produção e para comercialização do óleo de

TTO não especifica quais espécies do gênero Melaleuca devem ser utilizadas. Das literaturas

31

consultadas, a grande maioria das amostras cromatográficas referem-se ao óleo de Melaleuca

alternifolia (CARSON et al., 2006).

Outras espécies como a Melaleuca hyperycifolia e a M. thymifolia são cultivadas

no Brasil e produziram em torno de 88% e 7,7%, respectivamente, de 1,8-cineol. As espécies

da famíla Myrtaceae, também cultivadas em solo brasileiro, são produtoras dessa molécula

como, por exemplo, as espécies de Callistemon viminalis, C. polandii e Kunzea ericoides que

produziram, respectivamente, em torno de 65%, 77% e 16,4% (SILVA et al., 2010). A

espécie mais famosa de Myrtaceae e produtora de eucaliptol é a Eucalyptus globulus, na qual

se tem relatos que a extração dessa molécula chega a uma concentração média de 80% (VITTI

e BRITO, 2003).

O 1,8-cineol (eucaliptol) é usado na medicina tradicional na Alemanha e está

registrado como produto há muitos anos, que é consumido em cápsulas para o tratamento de

bronquite aguda e crônica, sinusite e infecções respiratórias (JUERGENS et al., 2003). Outros

trabalhos mostram aplicações dessa molécula para aumentar a penetração de drogas

percutâneas, como descongestionante nasal, antitosse, na aromaterapia e na odontologia

(KALRA. et al., 2011, OLIVEIRA et al., 2011)

O terpineol é uma molécula que possui atividade antimicrobiana. Pesquisas que se

dedicaram ao estudo do óleo da planta de Melaleuca alternifolia descreveram essa

característica, principalmente, quando estudaram o terpineol separadamente

(LOUGHLIN et al., 2008). Ela possui ampla aplicação industrial, a começar pela perfumaria,

(ABURJAI e NATSHEH, 2003 e BICAS et al., 2011), como constituinte de perfumes e

cosméticos na indústria de produtos de limpeza e como repelente de insetos (LIU et al.,

2013), desinfetante (YANG et al, 2004), aromatizante (BICAS et al., 2011), na indústria

farmacêutica, como antifúngico e antisséptico (HAMMER et al., 2004) e na indústria de

processamento de minerais como agentes de flotação (BASAROVÁ, 2005).

O limonemo é vastamente encontrado nas plantas cítricas, apesar de já ser decrito

em mais de 300 plantas. Essa molécula é utilizada como solvente para resinas, síntese de

outros compostos químicos, aplicações em borracha, tintas, agente dispersante para óleo, além

da utilização na síntese química do mentol (MARÓSTICA JUNIOR e PASTORE, 2007). É

também considerado como percursor de terpineol (YUASA, 2006).

SILVA et al. (2010) trabalharam com a composição de M. linariifolia , planta cultivada

também no estado de Minas Gerais, na cidade de Viçosa (550 km de distãncia da coleta

realizada neste trabalho), na qual encontraram uma alta concentração de methyleugenol e

traços de E-methylisoeugenol. O limoneme foi o único composto comum nas duas

32

cromatografias, mas na análise realizada na cidade de Viçosa a quantidade foi quatro vezes

menor do que a encontrada na espécie Melaleuca sp., em Pouso Alegre.

Dados relacionados à CIM e à CBM foram igualmente obtidos por COX et al.

(2000) quando trabalharam com a árvore do chá para controlar Escherichia coli (AG 100) e S.

aureus (NCTC 8325). A CIM obtida por esses autores para o isolado de S.aureus (ATCC®

25923), patógeno oral, foi de 0,1% e a CBM 0,4%. Outros trabalhos mostraram que óleos

ricos em monoterpenos e sesquiterpenos possuem características bactericidas e

bacteriostáticas (MAYAUD et al., 2008 e HAMMER et al., 2011) O óleo da Melaleuca sp.

controlou as cepas bacterianas de maneira eficaz e numa concentração muito baixa,

demostrando ser um bom agente antimicrobiano in vitro.

É possivel que nem sempre os isolados de S. aureus sejam inibidos em doses tão

baixas do óleo de Melaleuca sp., pois resultados de suscetibilidades observados em 20

amostras clínicas de MRSA obtidas de pacientes da Coreia do Sul mostraram CIM e CBM

bem acima das observadas neste estudo (PARK et al., 2007). Nessa mesma linha de trabalho,

foi avaliado a CIM de 13 óleos essenciais em relação a 65 estirpes bacterianas, dentre elas S.

aureus, as quais existiam duas estirpes susceptiveis à metaciclina e cinco suscetiveis à

meticilina (MAYAUD et al., 2008). Os autores classificaram os óleos com base nas atividades

antimicrobianas, em relação ao gênero Staphylococcus. O óleo da planta Melaleuca

alternifolia foi incluído no grupo em que ocorreu atividade bactericida em concentrações

superiores a 2% e após 24 horas (MAYAUD et al., 2008). Mostraram também que outros

tipos de óleos essenciais apresentaram ação bactericida superior, em que a ação ocorreu em

concentrações menores ou iguais a 2% e com um tempo de ação que não ultrapassou 30

minutos (MAYAUD et al., 2008).

A partir dos anos 90, os estudos com plantas do gênero Melaleuca foram

direcionados à obtenção de resultados que mostrassem ação bactericida sobre microrganismos

que adquiriram resistência a antibióticos, principalmente aos S. aureus resistentes à meticilina

(CARSON et al., 2006). A busca por princípios ativos com capacidade de substituir os

antibióticos usuais, aos quais muitas cepas de microrganismos já apresentam resistência, tem

sido uma das prioridades no cenário mundial.

O baixo crescimento de propágulos da bactéria S. aureus no tratamento controle

entre a primeira e a segunda leitura mostrou que as feridas dos ratos não estavam infectadas, e

sim colonizadas e contaminadas, segundo os conceitos de SCHULTS et al. (2003). Ele e seus

colaboradores descreveram que feridas colonizadas são aquelas em que se encontram

microrganismos, mas esses não estão se multiplicando; já o conceito de feridas contaminadas

foi descrito como aquela situação em que se encontram os microrganismos com ativa

33

multiplicação. Essa observação pode ser justificada pelo fato de que nem todas as bactérias

inoculadas conseguiram ser ativadas, ou seja, parte delas não cresceu. Por último, o conceito

de ferida infectada foi proposto por eles como sendo aquela situação em se encontram os

microrganismos colonizando inclusive os tecidos saudáveis adjacentes ao local da ferida, fato

não observado neste trabalho.

O trabalho de RODRIGUES e SILVA (2012) mostrou que a limpeza da ferida por

meio de uma solução líquida é importante no tratamento, pois ajuda na prevenção da infecção

e ajuda na remoção de material solto, agentes patogênicos, corpos estranhos, tecido necrosado

e no excesso de exsudado que podem contribuir para o desenvolvimento da infecção. Essa

observação foi confirmada por RESENDE et al. (2012) que realizou a limpeza de feridas com

água de torneira. Os resultados desse experimento mostraram que a simples limpeza com a

água de torneira influencia na colonização microbiana das feridas realizadas em pele de ratos,

assim como acontece com a limpeza de feridas quando se utiliza solução salina a 0,9%.

MARTINS e MENEGHIN (2012) fizeram uma avaliação de três técnicas de

limpeza do sítio cirúrgico infectado, utilizando soro fisiológico como fluido de irrigação, em

pacientes com feridas infectadas e internados no Hospital Universitário de Londrina. O

trabalho mostrou redução do número de bactérias, em todas as técnicas, destacando como a

mais eficiente a irrigação do soro fisiológico sobre a ferida com seringa de 20 mL e agulha

25x8 (21 Gauges – pressão de 12,5 psi) em primeiro lugar, seringa 20 mL e agulhas 40x12

(18 Gauges- pressão de 9,5 psi) em segundo lugar e remoção mecânica com pinças e gases em

último lugar.

Não foi o foco desta pesquisa, mas vale mencionar a eficiência da técnica de

irrigação-aspiração como uma técnica fidedigna de quantificação de microrganismos em

feridas em ratos. Poucos trabalhos foram dedicados a mencionar essa técnica no Brasil, a

exceção de FERREIRA et al. (2004), que fizeram um trabalho em que relataram a diferença

entre a quantificação de microrganismos por essa técnica e a compararam com a

quantificação de microrganismos pela técnica mais popular, a do “Swab”. Esses autores

observaram uma diferença significativa quanto ao número de bactérias, quando comparado o

material coletado mediante irrigação-aspiração e a técnica do “Swab”. Entre os resultados

observados neste trabalho, destacou-se que das 46 colônias que cresceram em ambas as

técnicas, 36 (78,3%) delas apresentaram maior número de UFC/mL pela técnica de irrigação-

aspiração quando comparadas com 8 (17,4%) colônias identificadas pela técnica de “swab”,

sendo que apenas 2 (4,3%) colônias apresentaram o mesmo número de UFC/mL em ambas

técnicas. No entanto, somente para a bactéria Pseudomonas aeruginosa, capturada pela

34

técnica de irrigação-aspiração, houve diferença estatisticamente significante (p < 0,05) no

número de UFC.

A tetraciclina foi o melhor dos tratamentos para eliminação de S. aureus,

resultado já esperado, pois esse antibiótico possui características e resultados

comprovadamente positivos de ação sobre esse microrganismo. Apesar de haver a redução

dos microrganismos devido à lavagem das feridas, a ação antimicrobiana do antibiótico ficou

evidenciada ao mostrar-se a redução e a eliminação no número de S. aureus durante todo

experimento. Nesse caso, o tratamento com antibiótico foi eficiente na descolonização e na

descontaminação da ferida. Para BOWLER et al. (2001), quanto antes realizar a eliminação

dos microrganismos, mais importante será o produto em termos de eficiência para se evitar

um processo infeccioso. Apesar da tetraciclina ser recomendada como um antibiótico de uso

sistêmico (DE OLIVEIRA e DE PAULA, 2012), neste trabalho, o uso tópico apresentou um

bom resultado contra a cepa de S. aureus isolada da lesão de joelho e inoculada nas lesões dos

ratos.

Os princípios gerais do tratamento de feridas referem que a infecção pode

influenciar negativamente a cura de duas maneiras distintas: ação no local da lesão ou de

maneira sistêmica. Evidências sugerem que a presença de bactérias na ferida interfere em

várias etapas do processo de cicatrização. A infecção prolonga a fase inflamatória e interfere

na epitelização, contração e deposição de colágeno. As endotoxinas e metaloproteases

bacterianas alteram a resposta inflamatória na ferida e liberam colagenases que contribuem

para o turnover de colágeno e destruição tecidual (PAGGIARO et al., 2010) retardando assim

o processo de cicatrização.

Neste trabalho não foi percebida uma descolonização das feridas dos ratos por

nenhum dos óleos testados, fato observado por outros autores quando trabalharam com o óleo

da M. alternifolia in vivo. EDMONDSON et al. (2011) testaram o óleo derivado de M.

alternifolia na descolonização de MRSA em feridas não controladas, abertas. Como resultado

primário, esses autores também não obtiveram o êxito na descolonização de feridas agudas,

crônicas e de etiologias mistas que estavam colonizadas por MRSA- positivo. No entanto, o

trabalho relatou que existe uma inibição das bactérias e uma contribuição do óleo na redução

do tamanho das feridas. O óleo também foi apontado por DRYDEN et al. (2004) e CAELLI

et al. (2000) como um medicamento utilizado para a descolonização de S. aureus, apesar de

não serem estatisticamente significativos, quando comparados a outras terapias. Em se

tratando ainda de descolonização, os tratamentos tópicos são amplamente empregados e

avaliados, destacando-se como os principais agentes antimicrobianos testados para tal função:

mupirocina, clorohexidina, dicloridrato octenidine, povidine-iodine, óleo tea tree, prontoderm

35

e polisporin (BATRA et al., 2010, SIMOR et al., 2007, HACEK et al., 2008. BODE et al.,

2010, MODY et al., 2003).

A partir do 8º dia de leitura do experimento, o óleo da Melaleuca alternifolia foi

mais eficiente que o óleo da Melaleuca sp., apesar de não haver diferenças estatísticas. No

entanto, a partir dessa leitura também houve uma redução dos microrganismos no tratamento

controle, fato esse que sugere que a aparente ação do óleo da M. alternifolia pode estar

relacionada com a limpeza das feridas por meio da lavagem por aspersão do que pela ação do

óleo da planta.

O óleo de Melaleuca sp. possui uma ação importante nos primeiros dias de

tratamento (até o 5º dia) e depois passou a apresentar resultados menos expressivos no

decorrer de toda a pesquisa. Isso pode ter acontecido por uma série de fatores, que devem ser

melhor estudados, como a via de administração inadequada (tratamento tópico), baixa

concentração do princípio ativo (foi utilizado o óleo da Melaleuca sp. a 1% baseado nos

resultados dos testes “in vitro” CIM = 0,2% e CBM = 0,4%) ou ainda atribuído ao baixo

número de aplicações diárias (1 vez ao dia). Ainda assim, o trabalho mostrou que existe um

resultado positivo desse fitoterápico em relação ao controle e que sua ação é muito similar ao

tratamento realizado com o óleo da Melaleuca alternifolia, que já é um óleo bastante estudado

e comercializado em todo o mundo.

Outros estudos devem ser realizados com o óleo de Melaleuca sp., objetivando,

principalmente, relacionar o teor de 1,8 cineol ou eucaliptol com a atividade antimicrobiana,

assim como determinar a concentração ideal, a melhor via de administração e o número de

aplicações diárias.

A utilização de várias diluições mostrou ser desnecessária para avaliação desse

tipo de experimento, pois os resultados foram obtidos até a diluição de 10-3, enquanto que as

demais não apresentaram crescimento de S. aureus (Tabelas 5, 6, 7, 8, 9 e 10). As diluições

em que se percebem os resultados mais significantes são as de 10-1 e 10-2. Os resultados

avaliados na diluição 10-1 mostraram que a Melaleuca sp. obteve um melhor resultado em

relação à M. alternifolia. Por outro lado, esse resultado não foi confirmado nas demais

diluições 10-2 e 10-3. Neste trabalho a leitura dos resultados foi descrita e tomaram com base a

diluição de 10-1, mas se faz necessária uma melhor discussão sobre qual das diluições pode

ser a melhor indicada para avaliação de resultados ao se empregar a metodologia de irrigação

e de aspiração.

36

6 - CONCLUSÕES

O óleo da planta Melaleuca sp. cultivada no Brasil, mais precisamente na cidade

de Pouso Alegre – MG, mostrou um bom potencial bactericida in vitro, mas quando foi

avaliada in vivo a sua capacidade antibacteriana foi diminuída. Ainda assim, o seu

comportamento antibacteriano é igual ao do óleo de M. alternifolia.

Para as cepas testadas neste experimento não se recomenda o tratamento com os

óleos fitoterápicos estudados, e sim com tetraciclina.

37

7 - IMPACTO SOCIAL

O óleo da Melaleuca sp. mostrou ser eficiente contra algumas cepas de

Staphylococcus aureus, nas condições in vitro e in vivo, tendo seus resultados semelhantes aos

descritos e observados com o óleo da Melaleuca alternifolia. A contribuição do presente

trabalho está na identificação de uma planta ainda pouco estudada e bem adaptada ao

ambiente na região do sul de Minas Gerais, a qual poderá ser futuramente utilizada como um

fitoterápico no controle de bactérias do gênero S. aureus. Desta forma, contribuirá para um

tratamento mais barato e com eficiência similar ao óleo de Melaleuca alternifolia. Essa planta

é amplamente comercializada em todo mundo, na forma de produtos como shampoos, cremes,

sabonetes, enxaguantes bucais, esmaltes, géis de limpeza, desinfetantes, fungicidas e

bactericidas para a agricultura. Acredita-se que esses produtos também possam ser

desenvolvidos no Brasil com o óleo da Melaleuca sp. Outra forma de impacto social indireto

na região é na agricultura, por meio do cultivo da planta, bem como o uso na indústria, por

meio da produção de um óleo de boa atividade antimicrobiana no Brasil.

38

8 - REFERÊNCIAS

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44

9 - NORMAS ADOTADAS

C.O.B.E.A. (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal) – Princípios éticos da

experimentação animal. Disponível no endereço eletrônico:

http://www.meusite.com.br/cobea/index.htm.

Manual de procedimento para painéis de Gram-Positivos Desidratados-

MicroScan®– SIEMENS.2010; 31-32.

A Standards Association of Australian (1985), por meio da AS 2782, e

International Standards Organization (1996),

45

10 - APÊNDICES

Apêndice: Contagem de UFC nas diluições 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 e 10-7 em cada

grupo, no decorrer do tratamento.

FIGURA 12: contagem de UFC na diluição 10-1 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1, 5

, 8, 12 e 15 de tratamento.

FIGURA 13: contagem de UFC na diluição 10-2 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,

5, 8, 12 e 15 de tratamento.

46



FIGURA 15: contagem de UFC na diluição 10-4 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1, 5,

8, 12 e 15 de tratamento.

47

FIGURA 16: contagem de UFC na diluição 10-5 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1 5,

8, 12 e 15 de tratamento.



48



49

11 - ANEXOS

ANEXO I - Microscopia óptica – microorganismos do gênero Staphylococcus: cocos

Gram-positivos únicos, aos pares ou agrupados.

Fonte: http://cit.vfu.cz/alimentarni-onemocneni/xsa/xsa01.jpg

50

ANEXO II - Cultura de Staphylococcus aureus.

Fontes: http://medchrome.com/wp-content/uploads/2010/05/s.aureus-agar.jpg

http://medchrome.com/wp-content/uploads/2010/05/s.aureus-agar.jpg

51

ANEXO III : Padrão de sensibilidade e resistência aos antibióticos de bactéria isolada de

lesão de pé pelo aparelho MicroScan® auto SCAN-4 System da SIEMENS.

ANTIBIOGRAMA AUTOMATIZADO Amostra: Lesão Pé

52

ANEXO IV: Padrão de sensibilidade e resistência aos antibióticos de bactéria isolada de

lesão de joelho pelo aparelho MicroScan® auto SCAN-4 System da SIEMENS

ANTIBIOGRAMA AUTOMATIZADO Amostra: Lesão Joelho

53

ANEXO V - Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da UNIVÁS

54

ANEXO VI – Informativo sobre o filme de cobertura da ferida

INSTRUÇÕES DE USO

OpSite* FLEXIGRID*

Curativo de Filme Transparente

DESCRIÇÃO

OPSITE* FLEXIGRID* é um curativo formado por uma película fina e transparente de poliuretano,

coberta com adesivo acrílico. Esta película é sustentada por um filme plástico que proporciona um

sistema de aplicação simples, e possui PDMS (Polidimetilsiloxano), mais comumente conhecido como

silicone, que melhora as propriedades de anticisalhamento do filme, evitando assim o atrito entre o

filme e quaisquer coberturas.

MODO DE AÇÃO E INDICAÇÃO

Quando aplicado sobre lesões, o curativo OPSITE* cria um meio úmido através da retenção do

exsudato. A película é permeável a vapores úmidos, permitindo assim a evaporação do excesso de

exsudato e prevenindo a maceração da pele. OPSITE* FLEXIGRID é impermeável a água e bactérias,

prevenindo a contaminação externa. A película é altamente flexível e confortável, sendo portanto

facilmente adaptável a áreas de contorno do corpo. O filme plástico de suporte, por ser quadriculado,

pode ser utilizado para mapear a evolução do processo de cicatrização.

INSTRUÇÕES DE USO

1. Limpe, seque e desengordure a área de aplicação.

2. Remova o papel protetor do adesivo.

3. Aplique o curativo, pressionando-o para fixá-lo.

4. Se necessário, desenhe o contorno da lesão no quadriculado verde do filme plástico de suporte antes

de removê-lo.

5. Remova o suporte plástico, ao mesmo tempo que fixa a película pressionando-a sobre a pele.

6. Para remover o curativo, descole delicadamente uma das pontas da película e estique-a no sentido

paralelo à pele. O curativo pode permanecer aplicado à pele por até 14 dias, dependendo do caso que

pode requerer acompanhamento de profissional de saúde.

PRECAUÇÕES DURANTE O USO

OPSITE* FLEXIGRID* pode ser utilizado em lesões infectadas se as seguintes precauções forem

seguidas:

• O paciente deverá estar sob supervisão médica/clínica.

• O curativo deverá ser trocado diariamente.

• O paciente deverá estar recebendo medicação sistêmica adequada.

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Pacientes imunodeprimidos e diabéticos podem requerer cuidados especiais. Nestes casos deve-se

tomar o cuidado de evitar qualquer tipo de dano à pele através de repetidas aplicações, o mesmo se

aplicando a pacientes com pele muito fina e frágil.

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ANEXO VII – Meios de cultivo de microrganismos

ÁGAR SAL MANITOL : é um meio de cultura muito utilizado para o isolamento de

Staphyloccocus aureus de amostras biológicas como urinas, secreções, feridas e exudatos.

Contém peptona de caseína, peptona de carne, extrato de carne, D-manitol, cloreto de sódio,

vermelho de fenol e ágar. A degradação do manitol com a produção de ácido muda a cor do

meio de rosado a amarelo. Devido ao seu alto conteúdo de cloreto de sódio pode-se fazer uma

inoculação maciça da amostra em estudo. Geralmente se incubadas as placas por mais ou

menos 36 horas, aparecem as colônias de estafilococos não-patogênicos de tamanho pequeno

e rodeadas de uma zona vermelha. As colônias de Staphylococcus aureus fermentadores do

manitol são maiores e rodeadas de uma zona amarela.

O meio se apresenta vermelho rosado.

CALDO DE TIOGLICOLATO : é um meio altamente nutritivo e versátil, utilizado para a

cultura de microrganismos anaeróbios, microaerófilos e aeróbicos em materiais oriundos de

sítios estéreis. A presença de tioglicolato (agente redutor) e cistina aumentam a recuperação

de anaeróbios Contém peptona de caseína, extrato de levedura, glicose, cloreto de sódio, L-

cistina, Tioglicolato sódico e ágar.

A turvação do meio indica crescimento de microorganismos.

Referências:

MBiolog Diagnósticos Ltda (www.mbiolog.com.br)

mbiolog.com.br/produtos/Agar_Sal_Manitol.pdf

mbiolog.com.br/produtos/Caldo_Tioglicolato.pdf

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