obtenção de calos a partir de explantes foliares de

XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS

IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008

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OBTENÇÃO DE CALOS A PARTIR DE EXPLANTES FOLIARES DE CULTIVARES DE Coffea arabica L. PARA PRODUÇÃO DE CAFÉS ESPECIAIS

ELIZÂNGELA ALMEIDA ROCHA 1, LILIAN MAYUMI KURIBAYASHI 2, LUCIANO

VILELA PAIVA 3, GUILHERME ARAÚJO LACERDA4, FABIANA BARBOSA DE PAULA5

RESUMO A melhora da qualidade do café deveu-se a uma série de procedimentos tanto na condução da cultura quanto no processamento do grão, principalmente durante as fases de colheita, seca e armazenamento. O objetivo deste trabalho foi a comparação entre os diferentes meios de indução de calos descritos sobre os explantes foliares de 4 cultivares relacionados com a produção de cafés especiais no sul de Minas Gerais. Explantes foliares de aproximadamente 1cm2 foram plaqueados com a face adaxial em contato com os diferentes meios de cultura, denominados de MIT1 e PM, e cultivados sob escuro durante 3 e 4 semanas consecutivamente. Em ambos os meios de indução os calos se apresentam com aspecto vitrificado, portanto friáveis nas bordas dos explantes, sendo estas as regiões que sofreram injúrias. A taxa de formação de calos primários nos 4 cultivares testados foi em torno de 50 – 93%. Podemos avaliar as diferentes respostas obtidas pela indução de calos, mostrando que o percentual de calos induzidos foi maior nos cultivares Catiguá MG2, Catuaí Amarelo 62 e Catucaí Amarelo no meio de indução PM. Já o cultivar Bourbon Amarelo apresentou o maior potencial de indução de calos no meio MIT1. A quantidade de calos primários variou de explante para explante e destes pelo cultivar. A capacidade de um explante foliar formar um calo primário (células reativas) depende do genótipo e da condição e estádios fisiológicos da planta. Palavras-chave: calos primários, proliferação celular, indução de calos, 2iP, 2,4-D. INTRODUÇÃO

A melhora da qualidade do café deveu-se a uma série de procedimentos tanto na condução da cultura quanto no processamento do grão, principalmente durante as fases de colheita, seca e armazenamento. Atualmente, em várias regiões do país, cafés com qualidade igual a dos melhores cafés colombianos vêm sendo produzidos e exportados (SOUZA et al., 2002).

Com a globalização da economia, dois fatores são essenciais para que o Brasil continue competitivo em relação aos concorrentes produtores de café. O primeiro deles refere-se à qualidade da bebida e o segundo, ao custo de produção. Quanto à primeira condição, a tecnologia disponível associada a condições edafo-climáticas permitem produzir cafés de altíssima qualidade. Entretanto, no que se referem, ao custo de produção, vários fatores devem ser trabalhados no sentido de tornar a cultura menos vulnerável à variação sazonal de preços, o que é típico para esta cultura (TEIXEIRA et al., 2004).

1Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular, E-mail: [email protected] 2 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Ciência dos Alimentos, E-mail: [email protected] 3 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Química, E-mail: [email protected] 4Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail: [email protected] 5Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular.



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Neste aspecto diversos trabalhos foram realizados utilizando cultura de tecidos para a propagação de variedades comercias de café, regenerando plantas através de neoformação de gemas, de entrenós verdes, de ramos ortotrópicos e por indução de embriogênese somática a partir de explantes foliares (DUBLIN, 1981; HERMAN & HAAS, 1975; PIERSON et al., 1983; SÖNDAHL & SHARP, 1977).

Os primeiros trabalhos de micropropagação de café via embriogênese somática foram publicados por Staritsky (1970) para Coffea canephora e por Herman & Haas (1975) para Coffea arabica. Posteriormente, Söndahl & Sharp (1977) ampliaram o trabalho de Herman & Haas (1975) e apresentaram em definitivo os fundamentos básicos para a multiplicação clonal de plantas de Coffea arabica via embriogênese somática.

Embriões somáticos de café podem ser produzidos via direta ou indireta. No primeiro caso, os embriões são produzidos diretamente do tecido foliar em cultivo in vitro, enquanto que no segundo, inicialmente observa-se uma proliferação de calos, nos quais ocorre a formação de um segundo tipo de calos de características embriogênicas (TEIXEIRA et al., 2004).

Este tipo de calos pode ser subcultivado por um período de tempo relativamente longo, durante o qual pode ser transferido para meios apropriados à formação de grande número de embriões somáticos (SONDAHL & SHARP, 1977; SONDAHL et al., 1979; BOXTEL & BERTHOULY, 1996).

Os calos embriogênicos podem ser cultivados em meio líquido em frascos de Erlenmeyer (BOXTEL & BERTHOULY, 1996), em biorreatores de imersão contínua (NORIEGA & SONDAHL, 1993) e biorreatores de imersão temporária (TEISSON et al., 1995).

Os biorreatores permitem o cultivo tanto de gemas nodais como calos embriogênicos de café, o que constitui um dos meios mais promissores no sentido de aumentar a eficiência do processo. Em meio líquido tanto a gema nodal quanto os calos embriogênicos podem ser cultivados em condições ótimas desde que alguns parâmetros sejam ajustados, como tipo de explante, meio de cultivo, sobretudo quanto à qualidade e quantidade de reguladores de crescimento, ciclos de imersão/emersão, temperatura e luminosidade (TEIXEIRA et al., 2004). Esta alternativa de cultivo permite uma melhor uniformidade dos embriões produzidos, uma vez que é possível induzir a sincronização do processo embriogênico (NORIEGA & SONDAHL, 1993). Da mesma forma, a diferenciação do embrião pode ser conduzida de forma mais adequada, além de oferecer a oportunidade de encapsulamento do embrião diferenciado em larga escala. Estas vantagens comparativas poderão contribuir para uma substancial redução de custo da muda final de café (TEIXEIRA et al., 2004).

O objetivo deste trabalho foi a comparação entre os diferentes meios de indução de calos descritos por Boxtel & Berthouly (1996) e Teixeira et al. (2004) sobre os explantes foliares de 4 cultivares relacionados com a produção de cafés especiais no sul de Minas Gerais. MATERIAL E MÉTODOS

Mudas dos 4 cultivares foram transplantadas para vaso de 5 L em substrato padrão do Setor de Cafeicultura do Departamento de Agricultura e cultivadas em casa de vegetação no Departamento de Solos, ambos na Universidade Federal de Lavras. As plantas foram semanalmente pulverizadas com fungicida e regadas com adubo.

Folhas jovens foram coletadas e levadas ao Laboratório Central de Biologia Molecular onde foram desinfestadas utilizando hipoclorito de cálcio a 6% por 20 minutos e 3 lavagens com água destilada autoclavada por 5 minutos.



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O protocolo descrito por Boxtel & Berthouly (1996) foi inicialmente avaliado no Laboratório de Cultura de Tecidos II da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Posteriormente, uma série de adaptações foram conduzidas nesta metodologia, visando melhorar a eficiência do processo para produção de mudas de café de vários genótipos (TEIXEIRA et al., 2004). Logo, buscou-se a comparação entre esses dois protocolos e sua adaptação para os cultivares elite do Sul de Minas Gerais no Laboratório Central de Biologia Molecular da Universidade Federal de Lavras.

De acordo com protocolo adaptado de Teixeira et al. (2004) inicialmente explantes foliares de aproximadamente 1cm2 foram plaqueados com a face adaxial em contato com um meio de cultura, denominado de PM (meio primário), e cultivados durante um mês. O meio PM é formado por metade dos sais MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), vitaminas MS, 100 mg L-1 de caseína hidrolisada, 400 mg L-1 de extrato de malte, 20 µM de ácido 2,4 diclofenoxiacético (2,4-D), 9,84 µM de ácido indol-3-butírico (AIB), 9,84 µM de isopenteniladenina (2iP), solidificado com 6 g.L-1 de ágar e acrescido de 20 g.L-1 de sacarose. O pH dos meios foram ajustados em 5,7 e os meios de cultura foram autoclavados a 121 ºC por 20 min. Após inoculados, os explantes foram mantidos em sala de crescimento a 27 ± 2 ºC em condições de obscuridade. Após 4 semanas em meio PM os explantes foram transferidos para meio SM, no qual a concentração de 2,4-D é reduzida para 10 µM sendo avaliados a percentagem de explantes com calos induzidos.

De acordo com protocolo adaptado de Boxtel & Berthouly (1996) o meio MIT1 (meio de indução de calos) é formado por sais MS, vitaminas VT1, caseína hidrolisada (100 mg L-1), extrato de malte (400 mg L-1), 2,4-D (2,26 µM), AIB (4,92 µM), 2iP (9,84 µM), sacarose (30 g L-1) e ágar (6 g L-1). O pH dos meios foram ajustados em 5,6 e os meios de cultura foram autoclavados a 121 ºC por 20 min. Após inoculados, os explantes foram mantidos em sala de crescimento a 27 ± 2 ºC em condições de obscuridade. Após 3 semanas em meio MIT1 os explantes foram transferidos para meio MET2, no qual a concentração de 2,4-D é aumentada para 4,52 µM e o AIB é substituído pelo BAP (17,76 µM) sendo avaliados a percentagem de explantes com calos induzidos.

Os dados foram submetidos à análise de variância pelo software Sisvar (FERREIRA, 2000). Sendo os efeitos dos 2 meios de indução do calos e dos 4 cultivares comparados pelo Teste Scott-Knott ao nível nominal de 5%. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Depois de um mês de cultivo, observou-se intensa proliferação celular nas bordas dos explantes. Segundo Quiroz-Figueroa et al. (2002), esta proliferação ocorre nas células do câmbio vascular, o que leva a formação de calos primários (Figura 1).

Em ambos os meios de indução os calos se apresentam com aspecto vitrificado, portanto friáveis nas bordas dos explantes, sendo estas as regiões que sofreram injúrias, sendo assim denominados de calos primários (TEIXEIRA et al., 2004).

A taxa de formação de calos primários nos 4 cultivares testados foi em torno de 50 – 93%. Os cultivares abordados no trabalho, bem como o percentual de explantes com calos são visualizados na Tabela 1.



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Figura 1. Calos oriundos de explantes foliares de mudas de Coffea arabica L. de acordo com protocolo de Boxtel & Berthouly (1996) com 2 semanas de cultivo. A) Bourbon Amarelo; B) Catiguá MG2; C) Catuaí Amarelo 62; D) Catucaí amarelo. Barra = 1 mm

Tabela 1. Valores das percentagens de calos induzidos para os diferentes meios de indução MIT1 (BOXTEL & BERTHOULY, 1996) e PM (TEIXEIRA et al, 2004).

Cultivar Meio de indução Percentual de

explantes com calos MIT1 75,00 a Catiguá MG2

PM 90,00 a MIT1 66,07 a Catuaí Amarelo 62

PM 93,75 a MIT1 57,81 a Catucaí Amarelo

PM 59,72 a MIT1 63,89 a Bourbon Amarelo

PM 59,38 a * Médias seguidas de letra e número distintas entre si pelo Teste Scott-Knott, a 5% de probabilidade

Observa-se que o teste estatístico Scott-Knott, a 5% de probabilidade, não

demonstrou diferença significativa entre os cultivares ou na interação destes com os 2 meios de indução. Apesar disso, no gráfico (Figura 2) podemos avaliar as diferentes respostas obtidas pela indução de calos, mostrando que o percentual de calos induzidos foi maior nos cultivares Catiguá MG2, Catuaí Amarelo 62 e Catucaí Amarelo no meio de indução PM (TEIXEIRA et al, 2004). Já o cultivar Bourbon Amarelo apresentou o maior potencial de indução de calos no meio MIT1 (BOXTEL & BERTHOULY, 1996).



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0

20

40

60

80

100

MIT1 PM MIT1 PM MIT1 PM MIT1 PM

CatiguáMG2

CatiguáMG2

Catuaíamarelo

62

Catuaíamarelo

62

Catucaíamarelo

Catucaíamarelo

Bourbonamarelo

Bourbonamarelo

% d

e ca

los

ind

uzi

do

s

Figura 2. Gráfico ilustrando as percentagens de calos induzidos nos diferentes meios MIT1

(BOXTEL & BERTHOULY, 1996) e PM (TEIXEIRA et al, 2004) testados para estes cultivares.

De acordo com Teixeira et al. (2004) ao contrário do esperado, quanto mais vigoroso

o calo primário, menor era a freqüência de formação de setores embriogênicos. Parece haver uma competição entre o crescimento de calos primários e a indução de formação de setores embriogênicos.

CONCLUSÃO A quantidade de calos primários variou de explante para explante e destes pelo cultivar. A capacidade de um explante foliar formar um calo primário (células reativas) depende do genótipo e da condição e estádios fisiológicos da planta. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BOXTEL, J.; BERTHOULY, M. High frequency somatic embryogenesis from coffee leaves. Factors influencing embryogenesis, and subsequent proliferation and regeneration on liquid medium. Plant cell, Tissue and Organ Culture, Amsterdam, v. 44, p. 7-17, 1996. DUBLIN, P. Multiplication vegetative “ in vitro” de l’arabusta. Café, Cação, Thé, Paris, v. 24, n. 4, p. 181-190, oct./dec. 1980. FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do Sisvar para Windows versão 4.0. In...45a Reunião Anual da Região Brasileira da Sociedade internacional de Biometria. UFSCar, São Carlos, SP, Julho de 2000. p. 255-258. HERMAN, E. B.; HAAS, G. J. Clonal propagation of Coffea arabica L. from callus culture. HortScience, Alexandria, VA, v. 10, n. 6, p. 588-589, 1975. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, n. 3, p. 473-497, 1962. NORIEGA, C.; SONDAHL, M. R. Arabica coffee micropropagation trought somatic embryogenesis via bioreactors. In: Biotechnologie Asic Colloque, 15, 1993, Montpellier. [Anais…]. [S.I: s.n.], [1993]. p. 73-80. PIERSON, E. S; VAN LAMMENRN, A.; SCHEL, J. H.; STARITSKY, G. In vitro development of embryoids from punched leaf disc of Coffea canephora. Protoplasma, Vienne, v. 115, n. 2/3, p. 208-216, 1983.



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