O USO DA MATRIZ EXTRACELULAR (MEC) RECELULARIZADA COMO ARCABOUÇO PARA O ESTABELECIMENTO DE UM FÍGADO BIOARTIFICIAL: UM

MODELO EXPERIMENTAL

1Nélson Alexandre Kretzmann Filho, 1Gustavo Ochs de Muñoz, 1Ursula da Silveira Matte

1-Centro de Terapia Gênica, Centro de Pesquisas do Hospital de Clínicas de Porto Alegre

E-mail: nakfilho@gmail.com

Resumo. Um fornecimento insuficiente de órgãos apropriados para transplante tem limitado a capacidade de curar muitos casos de doenças hepáticas. Órgãos Bioartificiais (OBA) não são uma alternativa permanente para os transplantes, porém o surgimento de matrizes decelularizadas como arcabouço para órgãos bioartificiais abre uma nova perspectiva para o tratamento de doenças crônicas. Objetivos: Estudar a viabilidade do uso da matriz extracelular recelularizada como arcabouço para o transplante de fígado. Metodologia: Foram utilizados camundongos C57Bl6. A decelularização foi realiazada segundo a técnica descrita por Shupe et al., com modificações. Soluções detergentes isotônicas de 1, 2 e 3% de Triton X-100 foram perfundidas (50mL/hora) seguidas pela perfusão com 0,1% de SDS. Ao final 1 mL de soro fetal bovino (SFB) foi instilado para dentro da matriz. Todas as soluções continham 1% de antibiótico/micótico. Para o estabelecimento da recelularização primeiramente a MEC foi recelularizada com a linhagem celular Huh7. As células hepáticas parenquimatosas e não parenquimatosas foram isoladas segundo o protocolo de Seglen (1976) modificado. O lóbo direito do fígado foi mantido em um sistema de circulação semi-fechado. Foi dosada uréia durante o período de recelularização. Resultados: Ao final da decelularização a matriz extracelular apresentou característica semi-transparente. A arquitetura da matriz foi preservada mantendo as características morfológicas externas do fígado, assim como os vasos e os espaços dos sinusóides hepáticos. Foi possível verificar a ausência de células tanto com HE quanto ao microscópio de fluorescência (DAPI). A recelularização com as células Huh7 mostrou-se eficaz (HE e DAPI) observado marcação para ki67 (proliferação) assim como AFP. A produção de ureia dosada no meio de cultivo mostrou atividade bioquímica das células em 24, 48, 72, 96 horas, 5 e 10 dias. Conclusão: A decelularização e a recelularização da matriz hepática possibilitam a utilização de um órgão bioartificial como arcabouço para o transplante hepático.

Palavras Chave: Recelularização, Fígado Bioartificial, Matriz Extracelular

INTRODUÇÃO

O fígado é um órgão importante na manutenção da homeostase metabólica, no processamento de aminoácidos, carboidratos, lipídios e vitaminas da dieta, no metabolismo do colesterol e das toxinas, na produção de fatores de coagulação e no armazenamento da glicose (Neuberger 2010 e Shupe 2010). A injúria ao parênquima hepático, de variadas etiologias, associada com um influxo de células inflamatórias é um evento denominado hepatite (Franceschi 2006). A cirrose é o resultado do processo inflamatório onde há o estímulo crônico à fibrogênese com a consequente fibrose difusa e a desarquiteturização do parênquima com a formação de nódulos (Schiano 2003).

As doenças hepáticas crônicas são de alta prevalência e incidência causadas mais frequentemente pelos vírus das hepatites B e C, alcoolismo, doenças auto-imunes, alterações metabólicas, tóxicas ou colestáticas. As injúrias crônicas ao fígado podem evoluir para a cirrose por mecanismos fisiopatológicos diversos em que há uma persistente tentativa de reconstituição do parênquima resultando em fibrose e nodulações difusas. Estima-se que

aproximadamente 80% a 90% do parênquima hepático deva estar modificado para que ocorra disfunção hepatocelular e manifestações clínicas, as complicações, que configuram a descompensação decorrente da natureza e magnitude subjacentes (Heidelbaugh 2006).

Um fornecimento insuficiente de órgãos apropriados para transplante tem limitado a capacidade de curar muitos casos de doenças hepáticas. Órgãos Bioartificiais (OBA) não são uma alternativa permanente para os transplantes. Em vez disso, podem ser utilizados para manter um paciente crítico até que um doador adequado se torne disponível. OBA geralmente consiste em sistemas fechados e ex vivo com células funcionais que cresceram em uma matriz sintética(Zeilinger 2004). Em teoria, o sangue de um paciente pode ser transmitido através destes sistemas, permitindo a desintoxicação de xenobióticos e amônia, bem como o fornecimento de proteínas do plasma, glicose e até mesmo as trocas gasosas. Embora este conceito possa parecer simples, complicações na manutenção destas células funcionais em cultura tridimensional têm limitado o desenvolvimento destes sistemas (Zeilinger 2011). Matrizes sintéticas têm provado ser sub-ótimas em relação tanto a extensão das colônias, bem como na manutenção a longo prazo da funcionalidade e da viabilidade celular (Uygun 2010).

O aumento das taxas de incidência e prevalência das doenças crônicas levam os pacientes, na maioria dos casos, a quadros terminais. A escassez de órgãos viáveis e as inúmeras intercorrências agudas ou crônicas do transplante, tornam ainda mais difícil a sua sobrevida. Devido aos fatos supra citados, torna-se de suma importância o desenvolvimento científico nas áreas relacionadas aos órgãos bioartificias e sua utilização em transplantes.

O surgimento de matrizes decelularizadas como arcabouço para órgãos bioartificiais abre uma nova perspectiva para o tratamento de doenças crônicas. Entretanto, o papel da matriz extracelular no desencadeamento e manutenção de processos patofisiológicos ainda é pouco conhecido.

MATERIAIS E MÉTODOS

Decelularização do Fígado

Foi utilizada a técnica descrita por Shupe e colaboradores com modificações. Após a anestesia os animais foram posicionados para a cirurgia e os ligamentos ao redor do fígado foram liberados para futura retirado do órgão. Foi realizado o isolamento do lobo direito do fígado seguido da canulação da veia cava suprahepática (VCS). O lodo direito canulado e isolado foi retirado para perfusão in vitro. Para limpar o sangue do órgão, o fígado foi perfundido com 30 ml de PBS (pH 7,4) e, posteriormente, perfundido com detergentes biológicos para solubilizar as membranas celulares. Soluções isotônicas (PBS) de 1, 2 e 3% (peso/volume) de Triton X-100 (30 mL) foram perfundidas através do órgão por meio de uma bomba peristáltica com vazão de 50 mL/hora. Imediatamente seguido pela perfusão com 30 mL de PBS contendo 0,1% SDS (peso/volume). As soluções contendo detergente foram retiradas do fígado a partir da perfusão com 30 mL de PBS. Por fim, 1 mL de soro fetal

bovino (SFB) foi instilado dentro do órgão. Todas as soluções de perfusão (incluindo SFB) continham 1% de antibiótico/micótico (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Isolamento das células hepáticas

Foram utilizados camundongos C57Bl6 com dano hepático causado por CCl4(1mL/Kg) pesando de 20-30 gramas. O isolamento foi realizado por perfusão do fígado com Colagenase em duas etapas segundo o protocolo de Seglen (1976) modificado. Na primeira etapa, a veia porta foi canulada e a veia cava inferior aberta, assim se fez circular uma solução para remover a sangue de meio HBSS e EDTA com fluxo de 200 mL/h controlado por uma bomba de infusão. Na segunda etapa, o fígado foi removido em uma segunda solução de meio HBSS, Cloreto de Cálcio e Colagenase tipo I e II (0,05%). Logo após a perfusão o fígado foi transportado para uma capela de fluxo laminar estéril, cortado em pequenos fragmentos e incubado à 37ºC sendo agitado em vórtex 4 vezes a cada 5 min. Foram utilizados os antibióticos penicilina e streptomicina na concentração de 1% durante todo o procedimento e, como antimicótico, foi utilizada a fungizona.

As células foram transferidas para um tubo Falcon de 50 mL e o volume ajustado com o tampão de suspensão Seglen (Percoll, NaCl, KCl e Hepes). As células foram deixadas em repouso por gravidade por 20 min, após esse período as células do parênquima formaram uma camada distinta inferior. A camada superior, que contém células predominantemente não parenquimatosas, foi cuidadosamente separada, transferida e centrifugada por duas vezes consecutivas (50 g por 1 min) para remover contaminação de células parenquimatosas. As células não-parenquimatosas foram então sedimentadas por centrifugação (500 g por 3 min), seguido por uma nova ressuspensão (50 mL) e centrifugação (500 g por 3 min). A fração de células parenquimatosas foi purificada por uma centrifugação inicial (50 g por 1 min), seguido por duas resuspenssões (50 mL) e centrifugações (50 g por 1 min) conforme descrito por Seglen (1973). Logo a viabilidade e o número de células foi determinados por Azul de Tripan em câmera de Neubauer. Para manter as células primárias em cultivo foi utilizado o meio DMEM com 20% de SFB e 4 µg/mL de Insulina.

Recelularização da MEC hepática

Para a recelularização da MEC hepática o lóbulo direito do fígado foi mantido em um sistema de circulação semi-fechado fazendo com que o órgão seja recelularizado in vitro em condições assépticas. Tendo a VCS ligada à um equipo, por sua vez conectado à uma bomba de infusão. Primeiramente, foram introduzidas as células Huh7 por 5 dias através de 4 infusões com intervalo de 10 minutos. Foram influndidas 12,5 x 106 células em cada uma das quatro etapas. Após as quatro etapas de infusão o órgão foi mantido em circulação semi-fechada e em condições normais de cultivo. Durante os 5 dias de cultivo do fígado recelularizado foram tomadas amostras de meio para avaliação funcional (ureia) por metodologia de rotina em laboratório de patologia clínica. Os órgãos recelularizados foram mantidos em um bioreator com fluxo contínuo de meio de cultivo infundidos pela VCS com vazão de 10 mL/hora sendo recirculado com a utilização de uma segunda bomba de infusão. Após os 5 dias o tecido foi fixado e corado para as análises histopatológicas.

A

E

FD

G

B

C

Avaliação anatomopatológica

Os fragmentos dos tecidos foram primeiramente fixados, na etapa seguinte, os blocos de parafina foram fixados ao Micrótomo (Leitz1512) onde se realizou cortes com 3 micra (3). Na fase de coloração, as lâminas foram mergulhadas nos corantes hematoxilina-eosina (coloração ou contra-coloração para a imunohistoquímica). Na fase de desidratação, as estruturas passaram por 3 recipientes com álcool absoluto e por 2 de xilol. Colocou-se a lamínula sobre a lâmina utilizando-se Bálsamo do Canadá ou Entellan, finalizando, assim, o processo de preparação. Para a coloração com o DAPI (avaliação da decelularização e da recelularização) as lâminas foram apenas cortadas e montadas com meio de montagem contendo o corante fluorescente. As lâminas foram analisadas em microscópio binocular Nikon Labophot.

RESULTADOS

Após a perfusão do fígado com PBS para a retirada do sangue, soluções contendo Triton X100 (1, 2 e 3%) foram utilizadas para solubilizar as membranas. O detergente SDS (0,1%) foi utilizado para a total retirada dos núcleos possivelmente remanescentes na matriz extracelular. Após a lavagem do lobo remanescente com PBS, para a retirada dos detergentes da matriz, foi possível observar a preservação das estruturas hepáticas após a decelularização (Figura 1A). A análise histológica da decelularização nos mostra ausência de células hepáticas assim como a preservação das fibras da matriz extracelular. A coloração de H&E (figura 1 B e C) mostra a cápsula densa na borda do lobo hepático assim a estrutura vascular e o espaço do parênquima com aspecto de esponja da MEC decelularizada.

Fig. 1: Análise histológia e imunohistoquímica de Matriz Extracelular Decelularizada e Recelularizada. (B, C) MEC decelularizada. (D, E) Matriz Extracelular recelularizada. H&E 400X (F) Matriz Extracelular

recelularizada marcada com AFP. (G) Matriz Extracelular recelularizada marcada com Ki67. 200X.

A recelularização com as células Huh7 foi efetiva (figura 1 D e E) mostrando estas células no novo parênquima hepático. Através da imunohistoquímica foi possível verificar a

marcação positiva das células Huh7 após 5 dias da recelularização tanto para alfafeto proteína quanto para Ki67 (Figura 1F e G) . A análise histológica da recelularização com a linhagem Huh7 após 5 dias utilizando o corante DAPI mostrou os núcleos das células difusos na MEC com sua localização esperada no meio do novo parênquima hepático, não se depositando juntos às regiões dos vasos.

Fig 2: Análise de fluorescência da Matriz Extracelular Recelularizada. Núcleos marcados com DAPI (azul). 200X.

Ao início da recelularização foram coletados 1 mL do meio de cultivo utilizado para perfundir o lobo hepático durante o experimento. Foi realizada a avaliação da produção de ureia nos meios de cultivo em 24, 48, 72, 96 horas, 5 e 10 dias de experimento. Conforme a figura 3 pode constatar há produção de ureia pela matriz recelularizada com um comportamento tempo dependente.

Fig 3: Produção de ureia no meio de cultivo da matriz recelularizada

Por fim foi realizado o isolamento de células hepáticas e padronizado um protocolo para manter estas células viáveis sendo possível expandir as células para obter um número adequado no momento da recelularização da MEC. A figura 4 mostra hepatócitos cultivados 10 dias após o isolamento formando novos conjuntos de células em mono camadas.

Fig 4: Cultivo primário de hepatócitos para a recelularização da MEC. (A e B) Hepatócitos cultivados por 10 dias em meio DMEN suplementado com insulina (100X e 200X respectivamente).

DISCUSSÃO

Neste trabalho desenvolvemos adaptações das metodologias até o momento utilizadas por outros autores (Baptista 2009). A decelularização in vitro nos permite controlar de maneira positiva as condições de perfusão e assepsia do órgão para a futura recelularização. Outros autores utilizam um sistema parecido com o utilizado neste trabalho, porém, com um custo operacional muito elevado o que dificultaria uma estrapolação para o uso na rotina clínica (Shupe 2010 e Uygun 2010).

A preservação da MEC decelularizada é crucial para que se tenha efetividade na repopulação desta MEC. No presente trabalho foi possível preservar a estrutura anatomopatológica da MEC. Além da estrutura externa do órgão preservada também é necessário que histologicamente os ramos de perfusão hepáticos sejam preservados demonstrando ausência total das células originais deste órgão antes da decelularização. Os achados deste estudo reproduzem as mesmas condições da MEC decelularizada disponíveis na literatura (Shupe 2010). Também observamos a arquitetura dos vasos preservada como em estudos com a decelularização in vivo. Diversos estudos avaliaram diferentes formas de infundir as células assim como a solução de perfusão mais propícia para preparar o ancoramento das células administradas (Barakat 2012 e Lang 2011). Este estudo, assim como outros trabalhos, utilizou a infusão das células dividida em fases promovendo um melhor ancoramento das células na MEC decelularizada (Baptista 2009). Podemos observar a aderência das células Huh7 após 5 dias, pela primeira vez utilizadas com este objetivo, na sua maioria em zona 1 e 2. Provavelmente, para que as células ocupem de forma mais homogenia a zona 3, seja necessário um maior período de cultivo.

Este estudo foi capaz de demonstrar atividade proliferativa de característica hepática através da imunohistoquímica para AFP assim como outros estudos que demonstram a produção de albumina pelas células utilizadas na recelularização da MEC. O presente estudo demonstrou a expressão de Ki67 nas células ancoradas na MEC indicando que as células de origem hepática estão ativas e proliferando. Este é o primeiro estudo que demonstra atividade proliferativa de células na MEC recelularizada. Também demonstramos neste trabalho a presença das células Huh7 ancorada na MEC através da coloração com DAPI. A positividade dos núcleos marcados em azul indicam que as células tiveram uma dispersão de acordo com sua origem no parênquima hepático não ocupando locais onde as células não-parenquimatosas devem se alojar. Estudo de Baptista et al., administrou células não parenquimatosas e parenquimatosas na mesma infusão (Baptista 2011). Este trabalho sugere que a zona 3 deve ser pré-ocupada por células parenquimatosas antes da administração das células não-parenquimatosas.

Além de observar as células Huh7 formando o novo parênquima hepático foi possível determinar a produção de ureia no meio de cultivo que perfundiu o lobo hepático recelularizado por até 10 dias. A ureia é um composto gerado pelas células hepáticas a partir da amônia produzida pela desaminação dos aminoácidos e é o principal produto final do

catabolismo das proteínas (Sies 2011). Este estudo é pioneiro na avaliação da ureia como indicador de metabolismo nas MEC recelularizadas.

Por fim obtivemos sucesso no desenvolvimento de um protocolo de isolamento e manutenção de hepatócitos primários por mais de 10 dias. Para o isolamento utilizamos um protocolo modificado favorecendo a obtenção de células do fígado independente da condição histopatológica, assim como das condições de perfusão deste órgão doador das células para o cultivo primário. A incubação do fígado com a colagenase in vitro promove uma melhor dissociação das células do parênquima hepático. Muitos são os meios de cultivos já descritos na literatura para a manutenção de hepatócitos primários em cultivo (Barakat 2012, Skardal 2012 e Török 2011). Nosso protocolo utiliza reagentes de baixo custo e fácil obtenção podendo ser utilizada a insulina clinicamente administrada em pacientes diabéticos. A concentração de 20% de SFB e 0,4 µg/mL de insulina ainda não foram descritas na literatura e necessitam maiores reproduções para que se confirme como um meio simples e de baixo custo para o cultivo primário de células hepáticas por períodos longos, fazendo com que estas células mantenham sua capacidade regenerativa antes observada dentro o órgão.

CONCLUSÕES

Foi possível obter uma MEC decelularizada que preservasse a arquitetura hepática promovendo o ancoramento de células Huh7, assim como a viabilidade e proliferação destas células. A utilização desta ferramenta pode abrir um novo panorama no enfrentamento das doenças hepáticas.

AGRADECIMENTOS: FIPE-HCPA, GPPG-HCPA, Centro de Terapia Gênica do HCPA e CAPES.

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USE OF RECELLULARIZED EXTRACELLULAR MATRIX AS FRAMEWORK FOR THE ESTABLISHMENT OF A LIVER BIOARTIFICIAL: AN EXPERIMENTAL MODEL

1Nélson Alexandre Kretzmann Filho, 1Gustavo Ochs de Muñoz, 1Ursula da Silveira Matte

1-Centro de Terapia Gênica, Centro de Pesquisas do Hospital de Clínicas de Porto Alegre

E-mail: nakfilho@gmail.com

Abstract. An insufficient supply of organs suitable for transplantation has limited the ability to cure many cases of liver diseases. Bioartificial Organs (BAO) are not a permanent alternative to transplantation, but the appearance of decellularized matrix as scaffold for bioartificial organs opens a new perspective for the treatment of chronic diseases. Objectives:

To study the feasibility of using recellularized extracellular matrix as a framework for a liver transplant. Methods: C57Bl6 mice were used. The decellularization was made according to the technique described by Shupe et al. with modifications. Isotonic detergent solutions 1, 2 and 3% Triton X-100 were perfused (50mL/hour) followed by perfusion with 0.1% SDS. At the end 1 mL of fetal bovine serum (FBS) was instilled into the matrix. All solutions contained 1% antibiotic/mycotic. To establish the first repopulation, the ECM was recellularized with the Huh7 cell line. Parenchymal or nonparenchymal liver cells were isolated according to protocol of Seglen (1976) modified. The right lobe of the liver was kept in a semi-closed circulation system. Urea was measured during the repopulation. Results: At the end of the extracellular matrix decellularization semi-transparent characteristic was presented. The architecture of the matrix was preserved by keeping the external morphology of the liver as well as the vessels and the spaces of sinusoids. It was possible to verify the absence of cells with both HE and DAPI staining on the fluorescence microscope. The repopulation with Huh7 cells was efficient (HE and DAPI) labeling observed for Ki67 (proliferation) as well as AFP. The production of ureria dosed into the medium proved biochemical activity of cells in 24, 48, 72, 96 hours, 5 and 10 days. Conclusion: The decellularization and repopulation of the matrix liver allow the use of a bioartificial organ as a framework for liver transplantation.

Key-words: Recellularization, Bioartificial Liver, Extracelular Matrix.