FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE COIMBRA

TRABALHO FINAL DO 6º ANO MÉDICO COM VISTA À ATRIBUIÇÃO DO GRAU DE

MESTRE NO ÂMBITO DO CICLO DE ESTUDOS DE MESTRADO INTEGRADO EM

MEDICINA

SOFIA FARINHA PEREIRA

O PAPEL DA UBIQUITINAÇÃO NA DEGRADAÇÃO DA

CONEXINA EM HIPERGLICEMIA

ARTIGO CIENTÍFICO

ÁREA CIENTÍFICA DE BIOLOGIA CELULAR

TRABALHO REALIZADO SOB A ORIENTAÇÃO DE:

HENRIQUE GIRÃO

CARLA MARQUES

Setembro de 2012

2

O papel da ubiquitinação na degradação da conexina em

hiperglicemia

Sofia Pereira1, Henrique Girão

2, Carla Marques

3

1 Faculdade de Medicina, Universidade de Coimbra, Portugal; Endereço de correio eletrónico:

sofia295@msn.com

2Centro de Oftalmologia e Ciências da Visão, IBILI - Faculdade de Medicina, Universidade

de Coimbra, Portugal; Endereço de correio eletrónico: hmgirao@fmed.uc.pt

3 Centro de Oftalmologia e Ciências da Visão, IBILI - Faculdade de Medicina, Universidade

de Coimbra, Portugal; Endereço de correio eletrónico: carla@ibili.uc.pt

3

Resumo

A comunicação entre células adjacentes ocorre através de gap junctions (GJ), sendo estas

constituídas por canais de proteínas denominadas conexinas (Cx). Uma das formas de regular

a comunicação intercelular é através da degradação das Cx. A ubiquitinação de Cx43 é um

sinal bem conhecido para a internalização e degradação das GJ. Apesar de estar bem descrito

que em condições de hiperglicemia (HG) ocorre um aumento da degradação da Cx43, o

mecanismo endocítico associado é ainda desconhecido. Assim, o principal objetivo deste

trabalho é identificar os mecanismos e vias de sinalização envolvidos na degradação da Cx43

em células expostas a altas concentrações de glucose (HG). Os resultados obtidos neste estudo

mostraram que em HG ocorre um aumento da ubiquitinação da Cx43, mediada pela proteína

ligase de ubiquitina Nedd4, levando a uma diminuição nos seus níveis na membrana

plasmática (MP) e a um concomitante aumento na sua degradação.

Palavras-chave

Conexina; Ubiquitina; Nedd4; Degradação; Hiperglicemia.

4

Abstract

Communication between adjacent cells occurs through gap junctions (GJ) and these are

formed of channels composed of proteins called connexins (Cx). One way to regulate the

intercellular communication is through the Cx degradation. Cx43 ubiquitination is a well-

known signal of internalization and degradation of GJ. Although it is well known that in

conditions of high glucose (HG), there is an increase of Cx43 degradation, the endocytic

mechanism involved is yet unknown. Therefore, the main objective of this work is to identify

the mechanisms and signaling pathways involved in Cx43 degradation in cells exposed to

high glucose mediums (HG). The obtained results showed that in HG occurs an increase in

Cx43 ubiquitination, mediated by the ubiquitin protein ligase Nedd4, resulting in a decrease

in its levels on the plasma membrane, with the concomitant increase in its degradation.

Key-words:

Connexin; Ubiquitin; Nedd4; Degradation; High glucose.

5

Introdução

As gap junctions (GJ) são estruturas intercelulares presentes na membrana plasmática (MP),

que permitem a comunicação direta entre células eucariotas. Estas estruturas permitem a

passagem de substâncias de baixo peso molecular (< 1 kDa)1, tais como metabolitos, iões e

segundos mensageiros, através de células adjacentes, favorecendo o acoplamento metabólico

e elétrico das células2, fundamental para a regulação de funções como a diferenciação,

desenvolvimento, polaridade, crescimento e morfogénese. Cada GJ é formado por dois

hemicanais, denominados conexões, sendo cada um destes composto por seis conexinas (Cx).

As GJ existem na MP das células em placas, formadas por milhares de canais individuais3, e

encontram-se em diferentes células e tecidos, nomeadamente no músculo cardíaco, nos

neurónios, nas células endoteliais ou nas células do epitélio pigmentado da retina (RPE). A

comunicação intercelular através das GJ (GJIC) pode ser regulada a diferentes níveis,

nomeadamente através da abertura e fecho dos canais, ou pelo número de canais presentes na

MP. Um dos mecanismos mais importantes que contribui para a regulação da quantidade de

canais presentes na MP é a internalização, e consequente degradação4. A importância da

comunicação intercelular nas células do RPE foi já demonstrada5, tendo sido sugerido que

alterações que comprometam este mecanismo poderão estar envolvidas no desenvolvimento

de doenças oculares, tais como a retinopatia diabética e a degenerescência macular

relacionada com a idade. Apesar de ter sido já demonstrado que, quando uma célula é exposta

a altas concentrações de glucose, ocorre uma diminuição dos níveis de Cx436, os mecanismos

moleculares envolvidos são ainda desconhecidos. Segundo a hipótese deste estudo, que

podemos visualizar na figura 1, a hiperglicémia (HG) conduz a uma ativação da proteína

cinase C (PKC), que leva à fosforilação da Cx43. Esta, por sua vez, constitui um sinal para

ubiquitinação, mediada pela proteína ligase de ubiquitina E3 Nedd4, permitindo o

recrutamento de um adaptador da via endocítica já conhecido, Eps157, que reconhece

6

proteínas ubiquitinadas. Uma vez internalizadas, as vesículas endocíticas contento annular GJ

são degradadas no lisossoma. Assim, o principal objetivo deste projeto consiste em avaliar se

a ubiquitinação da Cx43 constitui o sinal para internalização e degradação das GJ, em

condições de HG. Para além disso, com este trabalho pretende-se identificar as vias de

sinalização e proteínas envolvidas neste mecanismo de degradação.

Figura 1 – Modelo proposto para a sinalização da internalização da Cx43. A

activação da PKC em condições de HG é responsável pela hiperfosforilação da Cx43

presente na MP. A fosforilação da Cx43 constitui um sinal para ubiquitinação da Cx43,

mediada pela Nedd4. Uma vez ubiquitinada, a Cx43 será reconhecida pelo adaptador da

via endocítica, Eps15, que reconhece o sinal da ubiquitina ligada à Cx43 e promove a

internalização das GJ.

7

Resultados

Incubação de células do RPE em condições de hiperglicémia resulta na diminuição dos

níveis de Cx43

Foi já demonstrado, em vários estudos, que a regulação da GJIC nas células do RPE é

importante para a manutenção da função da retina5. Por outro lado, resultados obtidos em

diferentes tipos de células de mamíferos, mostraram que concentrações elevadas de glucose

conduzem á degradação de Cx436. Assim, numa primeira fase deste estudo, procedeu-se à

avaliação dos níveis da Cx43 numa linha celular do epitélio pigmentado da retina, ARPE-19,

incubada na presença ou ausência de elevadas concentrações de glucose. Uma vez que a

população de Cx43 presente em placas de GJ, na MP, é resistente à solubilização por Triton

X-100 1%8, avaliou-se o efeito da HG nos níveis de Cx43 presente na fração solúvel e na

fração insolúvel. Para isso, as células foram incubadas com concentrações de 5 mM (LG) e 25

mM de glucose (HG), após o que as amostras foram lisadas, na presença de 1% de Triton X-

100. As proteínas presentes nos extractos solúveis e insolúveis, obtidos após centrifugação,

foram separadas por SDS-PAGE, e os níveis de Cx43 determinados por Western blot (WB),

usando um anticorpo policlonal produzido em coelho, contra uma sequência do terminal

carboxílico da proteína.

Os resultados presentes na figura 2 mostram que a incubação das células ARPE-19 com 25

mM de glucose resulta numa diminuição dos níveis de Cx43, tanto na fração solúvel, como na

fração insolúvel, em comparação com as células incubadas com 5 mM de glucose. A

diminuição de Cx43 na fração insolúvel em Triton X-100 sugere que a HG conduz a uma

degradação das Cx43 localizada na MP, muito provavelmente inserida em placas de GJ.

8

Em condições de hiperglicemia há diminuição da Cx43 localizada na MP

Uma vez demonstrado que há uma diminuição dos níveis totais de Cx43 presente em células

incubadas em HG (Figura 2), procedeu-se, em seguida, à avaliação do efeito da HG na

distribuição subcelular da Cx43, por Microscopia Confocal. Para determinar a presença de

Cx43 na MP, utilizou-se, como marcador de MP, a proteína ZO-1, que interage com a Cx43

na MP9. Os resultados obtidos e presentes na figura 3 mostram que, em condições controlo

(LG), uma significativa população de Cx43 co-localiza com a ZO-1, indicando que está

presente na MP. No entanto, em condições de HG verifica-se uma diminuição da marcação da

Cx43 na MP, sugerindo fortemente que a HG resulta num aumento da internalização e,

possivelmente, na degradação da Cx43.

A HG resulta num aumento da ubiquitinação da Cx43

Resultados obtidos no nosso laboratório demonstraram que a ubiquitinação constitui um sinal

para a internalização e degradação da Cx438. Assim, numa fase posterior deste estudo,

avaliámos o efeito da HG nos níveis de ubiquitinação da Cx43. Para isso, células ARPE-19

foram incubadas com meios contendo concentrações de 5 mM (LG) ou 25 mM de glucose

(HG). Os níveis de ubiquitinação da Cx43 foram determinados por WB, utilizando um

anticorpo contra a ubiquitina, após imunoprecipitação da Cx43. Amostras incubadas na

ausência do anticorpo contra a Cx43 foram usadas como controlo de imunoprecipitação. De

acordo com o descrito anteriormente, os resultados presentes na figura 4, em baixo, mostram

que em HG há uma diminuição dos níveis de Cx43. Na mesma figura, em cima, podemos ver

que a quantidade de ubiquitina ligada à Cx43 aumenta em células incubadas com HG. Estes

resultados sugerem, fortemente, que a ubiquitinação da Cx43 constitui um sinal para

degradação em condições de HG.

9

A degradação da Cx43 em condições de hiperglicemia depende da presença da ligase de

ubiquitina Nedd4

Estudos desenvolvidos no nosso laboratório demonstraram que a Nedd4 é a ligase da

ubiquitina responsável pela ubiquitinação da Cx437. Assim, de forma a testar a hipótese de

que o mecanismo de degradação da Cx43 em condições de HG depende da ubiquitinação da

Cx43, fomos avaliar o efeito da depleção da Nedd4 nos níveis de Cx43. O silenciamento da

Nedd4 foi obtido através da incubação com siRNA dirigido contra a Nedd4. Deste modo, as

células foram incubadas com concentrações de 5 mM (LG) e 25mM de glucose (HG), na

presença ou ausência do siRNA contra a Nedd4. Os níveis totais de Cx43 e Nedd4 foram

avaliados por WB. Os resultados apresentados na figura 5 mostram que, na ausência de

Nedd4, os níveis de Cx43 em incubadas com HG é semelhante ao controlo (comparar linha 1

e linha 4), ou seja, a Nedd4 é necessária para que haja degradação da Cx43 induzida por HG.

Estes resultados sugerem que a Nedd4 é responsável pela ubiquitinação da Cx43, e que esta

constitui um sinal para degradação da Cx43 em condições de HG.

A HG conduz a uma diminuição da comunicação intercelular

A diminuição da comunicação intercelular está associadas a alterações patogénicas que

ocorrem tanto na Diabetes mellitus tipo 1, como na tipo 210

. Por outro lado, a implicação

funcional mais óbvia para a degradação da Cx43 consiste na diminuição da comunicação

celular. Uma vez demonstrado que a HG resulta na diminuição dos níveis de Cx43, avaliou-

se, em seguida, a consequência dessa alteração em termos da eficiência da comunicação

intercelular. Para isso, usou-se um ensaio, denominado scrape-loading, que, através da

distância percorrida por uma sonda (Lucifer yellow), permite avaliar a GJIC. Assim, células

ARPE-19 expostas a concentrações de 5 mM (LG) e 25mM de glucose (HG) foram incubadas

10

com 0,5% Lucifer yellow, que passa através das GJ, durante 8 minutos. Em seguida, as

amostras foram fixadas e foi determinada a distância percorrida pela sonda, ao longo da

monocamada, através do microscópio de fluorescência. Os resultados apresentados na figura

6 mostram que, em comparação com as células incubadas com LG, em condições de HG há

uma significativa diminuição da difusão da sonda, desde as células na zona do rasgo. Uma

vez que a distância percorrida pela sonda é proporcional ao nível de comunicação intercelular,

este resultado demonstra que a HG conduz a uma diminuição da Cx43 e, consequentemente, a

uma inibição da comunicação intercelular.

11

Discussão

Os resultados apresentados neste estudo mostram claramente que, em condições de HG,

ocorre uma diminuição dos níveis de Cx43, nomeadamente na MP, bem como aumento da sua

forma conjugada com a ubiquitina, e que a degradação da Cx43 ocorre na dependência da

Nedd4. Estes resultados sugerem que, em condições de HG, a célula responde a este estímulo

através do aumento da sinalização para internalização e subsequente degradação da Cx43. Por

outro lado, a importância destas alterações reflete um compromisso ao nível da comunicação

entre células adjacentes. Seria pertinente, de modo a aprofundar o conhecimento deste

mecanismo, realizar experiências que permitissem avaliar a semi-vida da Cx43 em HG,

avaliar os níveis de ubiquitinação na presença ou na ausência de Nedd4, através do

silenciamento da mesma, e também utilizar outras técnicas para avaliar as alterações dos

níveis de Cx43 na MP, como a biotinilação.

Estudos anteriores mostraram que em hiperglicemia (Diabetes mellitus) as células da retina

aumentam a degradação da Cx43 através da via proteossómica6. Estas alterações, por sua vez,

levam a uma aceleração da apoptose das células vasculares da retina, alterando o transporte de

moléculas sinalizadoras essenciais à sobrevivência da célula, aspeto fundamental que

caracteriza as alterações verificadas na doença microvascular da Diabetes mellitus10

. Os

resultados obtidos neste projecto sugerem que o aumento na degradação da Cx43 pode

implicar um mau funcionamento na comunicação entre as células vizinhas afetadas, e, no caso

particular do RPE, estar associado às alterações vasculares precoces verificadas na

Retinopatia Diabética, nomeadamente alterações na fagocitose de discos membranáceos dos

fotorreceptores quando estes se encontram disfuncionais.

12

Material e Métodos

Cultura de células e transfeções

As células ARPE-19 foram cultivadas em Dulbecco's Medium Modified Eagle's (DMEM)

suplementado com 10% fetal soro bovino e penicilina/estreptomicina. As células foram

incubadas na presença de 5 mM (LG) ou 25mM de glucose (HG) durante 5 dias diferentes. As

transfeções transitórias das células foram realizadas com Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de

acordo com as recomendações do fabricante. O silenciamento da Nedd4 foi obtido através da

transfecção das células ARPE-19 com siRNA dirigido contra a proteína.

Imunoprecipitação e WB

As células foram lavadas com PBS a 4°C, ressuspensas em tampão de lise (190 mM NaCl, 50

mM Tris-HCl, 6 mM EDTA, 1% Triton X-100, pH 8.3) suplementado com um cocktail

inibidor de proteases (Roche), 2 mM PMSF, 10mM de iodacetamide (que alquila resíduos de

cisteína nas enzimas desubiquitinates (DUBs) em locais activos, inibindo-as), e incubadas em

gelo durante 10 minutos. As amostras foram então centrifugadas a 10.000g durante 10

minutos, e os sobrenadantes foram utilizados para imunoprecipitação. Resumidamente, a

proteína A foi incubada com anticorpos policlonais contra Cx43 (Zymed), ou Nedd4, por 1 h,

a 4°C ou em soro de coelho não imune, seguido de incubação com sobrenadantes, durante 3h

a 4°C. As amostras foram então centrifugadas e os sedimentos da proteína A-sepharose foram

lavados três vezes num tampão de lavagem adequado (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 6

mm EDTA, 1% Triton X-100, pH 8,3), ressuspensas em tampão de Laemmli e desnaturadas a

37 ° C, durante 30 min. Para a análise de WB das proteínas imunoprecipitadas, as amostras

13

foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de nitrocelulose, e

marcadas com anticorpos apropriados.

Imunofluorescência

Células cultivadas em lamelas foram fixadas com paraformaldeído a 4% em tampão fosfato

salino (PBS). As amostras foram então lavadas com PBS, permeabilizadas com 0,2% v/v

Triton X-100 em PBS e bloqueados com soro de cabra durante 20 minutos antes da incubação

com anticorpos primários. Fez-se a incubação com anticorpos primários contra Cx43

(Transdução Lab) durante 1hora a temperatura ambiente. As amostras foram então lavadas

três vezes com PBS antes da incubação com o anticorpo secundário durante 1 hora, à

temperatura ambiente. As amostras foram lavadas em PBS e montadas com Glycergel (Dako).

Todas as soluções foram elaboradas a partir de 0,2% w/v BSA (Sigma), contendo 0,02% de

azida de sódio (Sigma) em PBS. Para os controlos, os anticorpos primários foram omitidos.

As imagens de microscopia confocal foram obtidas usando um microscópio Zeiss LSM710.

Ensaio de comunicação intercelular

A avaliação da comunicação intercelular entre células através das GJ foi efectuada através de

ensaios de scrape-loading. Esta técnica baseia-se na permeabiliadade passiva das GJ a

substâncias com peso molecular inferior a 1000 Da, como é o caso da Lucifer yellow, que uma

vez introduzida numa célula, passa, através das GJ, para células vizinhas. A distância

percorrida pela sonda é proporcional à eficiência da comunicação intercelular.

As células ARPE-19 foram incubadas com concentrações de 5 mM (CT) e 25mM de glucose

(HG). Posteriormente, fizeram-se 3 “rasgos” na monocamada de células aderentes a lamelas

14

de vidro, após o que foram incubas com 0,5% Lucifer yellow, durante 8 minutos. As amostras

foram depois lavadas com PBS e fixadas com 4% PFA. De seguida, foi determinada a

distância percorrida pela sonda, ao longo da monocamada, através do microscópio de

fluorescência.

15

Agradecimentos

Um agradecimento especial ao meu orientador, Professor Henrique Girão, pela

disponibilidade, paciência e atenção, e sem o qual este trabalho não seria possível, e à minha

co-orientadora, Professora Carla Marques.

Às várias pessoas com as quais trabalhei no laboratório e que me ajudaram durante

estes três anos.

Aos meus pais, que me deram suporte emocional para nunca desistir.

16

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17

Legenda das Figuras

Figura 2 – Efeito da HG na quantidade e solubilidade em Triton X-100. Células ARPE-19

foram incubadas na presença de 5 mM (LG) e 25mM de glucose (HG) durante 5 dias. As

amostras recolhidas foram lisadas utilizando um tampão contendo 1% de Triton X-100 e a

quantidade de Cx43 na fração solúvel (Triton soluble) e insolúvel (Triton insoluble) foi

determinada por WB usando anticorpos contra a Cx43.

Figura 3 – A HG induz uma redistribuição subcelular da Cx43. Células ARPE-19 foram

incubadas na presença de 5 mM (LG) e 25mM de glucose (HG) durante 5 dias, sendo

posteriormente fixadas e incubadas com anticorpos contra Cx43 (monoclonal – vermelho) e

ZO-1 (policlonal - verde). Foram visualizadas através de microscopia confocal.

Figura 4 – Os níveis de ubiquitinação da Cx43 aumentam em HG. Células ARPE-19

foram incubadas na presença de 5 mM (LG) e 25mM de glucose (HG) durante 5 dias. Após

imunoprecipitação da Cx43, usando anticorpos policlonais contra a Cx43, as amostras foram

separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida, e os conjugados de ubiquitina detetados

por WB usando anticorpos contra a ubiquitina.

Figura 5 – A degradação da Cx43 em HG requer a presença de Nedd4. Células ARPE-19

foram incubadas em meio contendo 5 mM (LG) ou 25mM de glucose (HG), durante 5 dias, na

presença ou ausência de siRNA contra a Nedd4. Posteriormente, as amostras foram analisadas

por WB, utilizando um anticorpo contra a Nedd4 e contra a Cx-43.

18

Figura 6 - A HG induz uma diminuição da comunicação intercelular mediada por GJ.

Células ARPE-19 foram incubadas com 5 mM (LG) ou 25mM de glucose (HG) durante 5

dias. A avaliação da comunicação intercelular foi feita através de ensaios de scrape loading/

dye transfer. A distância percorrida pela sonda Lucifer yellow foi determinada por

microscopia de fluorescência.

19

Figura 2 – Efeito da HG na quantidade e solubilidade em Triton X-100

Figuras

20

Figura 3 – Efeito da HG na distribuição subcelular da Cx43.

21

Figura 4 – Efeito da HG na ubiquitinação da Cx43.

22

Figura 5 – Na ausência de Nedd4, os níveis de Cx-43 aumentam em HG.

23

Figura 6 - Efeito da HG na comunicação intercelular.