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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO

SEMIÁRIDO

AMANDA LEITE GUIMARÃES

ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO IN VITRO DE Spondias tuberosa

ARRUDA (ANACARDIACEAE)

PETROLINA

2015

AMANDA LEITE GUIMARÃES

ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO IN VITRO DE Spondias tuberosa

ARRUDA (ANACARDIACEAE)

Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Vale do São Francisco, como

parte das exigências do Programa de

Pós-graduação em Recursos Naturais

do Semiárido, para obtenção do título de

Mestre em Recursos Naturais.

Orientadora: Prof. Dra. Edigênia

Cavalcante da Cruz Araújo

PETROLINA

2015

Ficha

catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da Univasf Bibliotecário (a): Maria Betânia de Santana da Silva CRB4-1747.

Guimarães, Amanda Leite

G963e Estudo fitoquímico e biológico in vitro de Spondias tuberosa Arruda (Anacardiaceae) / Amanda Leite Guimarães—Petrolina, 2015.

XIX, 156 p.: 30 cm

Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) - Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina, Petrolina- PE, 2015.

Orientadora: Profa. Dra. Edigênia Cavalcante da Cruz Araújo.

1. Spondias tuberosa - Fitoquímica. 2. Atividade biológica in vitro. 3. Anacardiaceae - Química vegetal. 4. Plantas medicinais. 5. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.

CDD: 581.634

“Acreditar sempre; desesperar jamais…quem acredita em Deus não desanima nunca, nem se desespera porque para Deus não há becos sem saída, não há problemas sem solução”.

Cleto Coelho

“Tudo posso naquele que me fortalece’

Bíblia Sagrada

iv

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por ter me concedido saúde, proteção e força para

chegar até aqui e por me mostrar os caminhos certos nas horas incertas.

Aos meus pais Domingos e Aparecida, pelo amor e carinho dedicado a nossa

família, por sempre acreditarem em mim, pelo exemplo de caráter e por me

ensinarem que mesmo em meio as dificuldades não devemos desanimar e nem tão

pouco perder a dignidade. Amo muito vocês.

Ao meu irmão, Danillo, por sempre acreditar no meu potencial e me incentivar

ir adiante e pelo seu jeito brincalhão de ser que por muitas vezes me distraiu nos

momentos de estudo com suas brincadeiras.

Aos meus avós Terezinha, Laurindo, Lídia pelas orações e o carinho imenso

e, em especial meu avô Joaquim (in memorian), agradeço por tudo que fez por mim

e pela minha família, por sempre incentivar nos estudos e por todos ensinamentos

dados que me fizeram ser a pessoa que sou hoje.

A todos meus tios e tias e, em especial titia Lourdes e tia Francinete por

sempre estarem presentes em todos os momentos de minha vida desde o meu

nascimento. E a todos os meus primos por todos os incentivos dados.

Ao meu namorado Murielton Allison, por estar sempre ao meu lado, além do

apoio e compreensão nas ocasiões em que me ausentei. Agradeço principalmente

por te me consolado nos momentos mais difíceis dessa caminhada. Obrigada por

tudo e saiba que você é o meu maior incentivador. Amo-te.

Ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais do Semiárido pela

oportunidade de qualificação profissional;

À Profª. Dra. Edigênia Cavalcante da Cruz Araújo, minha orientadora, pessoa

que aprendi a admirar cada vez mais. Agradeço pela orientação, apoio, dedicação,

transmissão de conhecimentos e amizade que contribuíram, e muito, para a minha

qualificação.

Ao Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, por ter me inserido no

mundo da pesquisa, e por sempre incentivar a qualificação profissional. Agradeço

também pela força dada na realização desse projeto, principalmente pelas análises

dos óleos fixos.

Ao Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais (NEPLAME), nas

pessoas de Alessandra Pacheco, Ana Paula de Oliveira, Grazielly Rocha e

v

Raimundo Oliveira Júnior, pela torcida e a ajuda em alguns experimentos deste

projeto.

À Profa. Débora Santos Carvalho dos Anjos do IF Sertão Pernambucano pela

inspiração e incentivos dados durante a graduação e, pela ajuda na realização do

experimento no infravermelho.

Aos professores do colegiado de Ciências Farmacêuticas da Univasf, em

especial, Arlan de Assis, Cleônia Roberta, Edilson Beserra, Gabriela Lemos e Xirley

Pereira, pelos incentivos dados e por compreender quando não foi possível dar o

suporte em algumas aulas práticas.

Aos meus colegas de profissão, os técnicos em química da Univasf, Ana

Paula de Oliveira e Cícero Corcino que me deram uma imensa ajuda para que eu

chegasse até o fim.

A Antônio Fernando e Clóvis pelo incentivo e a compreensão dos horários

que tive que me ausentar do trabalho para assistir às aulas do mestrado.

Aos funcionários terceirizados da UNIVASF Francisca, Maica, Maria

Margarida, Neide e Seu Fernandes pelas palavras de carinho e apoio.

Às minhas companheiras de turma: Ana Paula, Deize Raquel, Eriane Dantas,

Fernanda Granja, Georgia Sueley, Jackeline Ferreira, Kíscyla Oliveira, Naiane

Darklei, Paloma Clemetino, Sandra Kelle, pelas risadas, brincadeiras e o

companheirismo em sala de aula.

À Camila Araújo, Edja Elisa, Eliatania, Fernanda Ribeiro, Juliane, Suzana,

Larissa Macedo e Sarah por todas as palavras de estímulo que me deram.

Às minhas companheiras de laboratório Elizabeth, Geórgia e Inaiara nas

quais encontrei uma amizade sincera que irei levar comigo para sempre. Obrigada

pelos momentos de descontração que fizeram os últimos meses serem mais fáceis.

Ao Prof. Dr. Raimundo Braz Filho (UENF) pela obtenção e ajuda com alguns

espectros de RMN.

Ao Prof. Dr. Edilberto Rocha Silveira e suas alunas Karísia e Nayara pelos

espectros feitos no CENAUREMN/UFC.

À Profa. Larissa Rolim por toda atenção, ideias e pela imensa ajuda no

experimento realizado no HPLC.

Ao CNPq e à FACEPE pelo apoio financeiro para a realização da pesquisa.

Enfim, obrigada a todos que de certa forma contribuíram direta ou

indiretamente na realização deste trabalho.

vi

RESUMO

Este trabalho descreve os resultados obtidos do estudo fitoquímico e biológico in vitro da espécie Spondias tuberosa Arruda, pertencente à família Anacardiaceae. Esta espécie é nativa do semiárido brasileiro, ocorrendo desde o Piauí até o norte de Minas Gerais, conhecida popularmente por umbuzeiro, é comumente utilizada na medicina popular para o tratamento de algumas patologias, entre estas diabetes, inflamações, cólicas uterinas, dores de estômago como depurativo e para constipação. O material vegetal da espécie foi coletado separadamente (cascas, folhas e talos) e após extração resultou nos extratos hexânico bruto (St-Hex1) e etanólico bruto (St-EEB) de cada uma das partes coletadas. Os extratos etanólicos foram particionados através de cromatografia líquida a vácuo, obtendo-se as frações hexânica (St -Hex), clorofórmica (St-CHCl3), acetato de etila (St-AcOEt) e metanólica (St-MeOH). Realizou-se uma triagem fitoquímica com os extratos e frações, a qual revelou a presença de flavonoides na maioria das amostras analisadas. Na análise dos óleos fixos (cascas, folhas e talos) da espécie S. tuberosa foram identificados os ésteres metílicos correspondentes aos seguintes ácidos graxos de cadeia longa: palmítico, esteárico e triacontanoico. Durante a concentração do extrato etanólico das folhas ocorreu a precipitação de um sólido amorfo de cor marrom clara, que foi identificado como um derivado quinol denominado 2,4,6-trihidroxi-4-(hidroximetil)ciclohexa-2,5-dien-1-ona. Durante a preparação da fração St-MeOH das folhas, percebeu-se a formação de um precipitado de coloração amarela, o mesmo foi purificado através de colunas cromatográficas, e identificado como sendo o flavonoide denominado quercetina 3-O-α-L-raminopiranosil(1’’’→6’’)-β-glucopiranosídeo (Rutina). A fração St-AcOEt dos talos também foi submetida a procedimentos cromatográficos que resultou na identificação do Trans-p-cumarato de eicosanila. As estruturas das substâncias isoladas foram determinadas através da análise dos espectros de RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais e por comparação com dados da literatura. Na avaliação da atividade antioxidante in vitro, St-AcOEt dos talos mostrou maior atividade antioxidante no método do DPPH (CE50 4,38 ± 0,21) e a St-CHCl3 das folhas apresentou melhor atividade no método de co-oxidação do β-caroteno (64,95% ± 15,29). Na determinação de fenóis totais, a fração que apresentou o maior teor de fenóis foi a St-EtOH dos talos (459,20 ± 21,07 mg EqAG/g), enquanto que na determinação de flavonoides totais, St-MeOH dos talos apresentou o maior teor (129,00 ± 4,91 mgEqC/g). Na avaliação da atividade antibacteriana in vitro, destacaram-se as amostras St-EtOH e a St-AcOEt das folhas contra a bactéria Enterococcus faecalis. Desta forma, este estudo contribuiu para o conhecimento quimiotaxonômico do gênero Spondias e da família Anacardiaceae.

Palavras-chave: Estudo fitoquímico e biológico in vitro. Anacardiaceae.

Spondias tuberosa.

vii

ABSTRACT

This work describes the results obtained from the phytochemical and biological in vitro study of species Spondias tuberosa Arruda, belonging to the Anacardiaceae family. This species is native to the Brazilian semiarid region, occurring from Piauí to the north of Minas Gerais, known popularly as umbuzeiro is commonly used in folk medicine for the treatment of some diseases, among them diabetes, inflammation, uterine cramps, stomach pain and constipation as cleanser. The plant material of the species was collected separately (barks, leaves and stems) and obtained the hexane (St-Hex1) and ethanol (St-EEB) extracts of each party collected. The ethanol extracts was partitioned by vacuum liquid chromatography to give the fractions hexane (St-Hex), chloroform (St-CHCl3), ethyl acetate (St-AcOEt) and methanol (St-MeOH). We performed a phytochemical screening with all ethanol extracts and fractions, which showed the presence of flavonoids in most samples. In the analysis of the fixed oils (barks, leaves and stems) of the species S. tuberosa were identified methyl esters corresponding the following long-chain fatty acids: palmitic, stearic and triacontanoic. During the concentration of the ethanolic extract of the leaves precipitated amorphous light brown solid which was identified as a quinoline derivative named 2,4,6-trihydroxy-4-(hydroxymethyl)cyclohexa-2,5-dien-1-one. During the preparation of St-MeOH fraction of the leaves, saw the formation of a yellow color precipitate, it was purified by chromatography columns, and identified as the flavonoid called quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl (1’’’→ 6’’) - β-glucopyranoside (Rutin). St-AcOEt of the stems was submitted to chromatographic procedures and isolated a substance which was identified as Eicosanyl-trans-p-coumarate. The structures were determinate from the analysis of NMR spectra (1H, 13C, 1D, 2D) and compared with literature data. In the evaluation of the antioxidant activity in vitro St-AcOEt stems showed the highest antioxidant potency method of DPPH (IC50 4.38 ± 0.21) and St-CHCl3 of the leaves on co-oxidation of β-carotene method (64.95% ± 15.29). In the determination of total phenols, the fraction that had the highest content of phenols was the St-EtOH the stems (459.20 ± 21.07 mg EqAG/g), while in the determination of total flavonoids, St-MeOH the stems showed the highest content (129.00 ± 4.91 mgEqC/g). In evaluation the antibacterial activity in vitro, stood out the St-EtOH and the St-AcOEt of the leaves against the bacterium Enterococcus faecalis. Thus, this study contributes to the knowledge chemotaxonomic of the genus Spondias and Anacardiaceae family. Keywords: Phytochemical and biological studies in vitro. Anacardiaceae. Spondias tuberosa.

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Esquema dos principais fatores que podem influenciar o acúmulo

de metabólitos secundários nas plantas........................................................... 22

Figura 2 - Spondias tuberosa Arruda.............................................................. 24

Figura 3 – Árvore do umbuzeiro na época de estiagem (A); umbuzeiro após

as primeiras chuvas (B); inflorescência (C) e fruto (D)....................................... 44

Figura 4 – Interconversão entre quinonas e os fenóis por oxirredução........... 46

Figura 5 – Estrutura química dos principais ácidos hidroxibenzoicos............... 47

Figura 6 – Estrutura química dos principais ácidos hidroxicinâmicos............... 47

Figura 7 – Esquema adaptado de SIMÕES e colaboradores (2010) da

biossíntese dos fenilpropanoides..................................................................... 48

Figura 8 – Esquema simplificado da origem biossintética dos flavonoides

adaptado de SIMÕES e colaboradores (2010)................................................. 49

Figura 9 – Núcleo fundamental dos flavonoides e sua numeração................... 50

Figura 10 – Esquema simplificado da formação da rutina a partir da

quercetina adaptado de PEDRIALI (2005)........................................................ 53

Figura 11 - Esquema da hidrólise da rutina a quercetina-3-glicose e, em

seguida a quercetina........................................................................................ 55

Figura 12 – Esquema simplificado de um cromatógrafo CLAE (VILA, 2006).... 56

Figura 13 – Foto da exsicata de Spondias tuberosa de número 18319.......... 64

Figura 14 – Cromatograma de íons totais do óleo fixo das cascas de

Spondias tuberosa............................................................................................ 84

Figura 15 – Cromatograma de íons totais do óleo fixo das folhas de Spondias

tuberosa............................................................................................................ 85

Figura 16 – Cromatograma de íons totais do óleo fixo dos talos de Spondias

tuberosa............................................................................................................ 85

Figura 17 – Estrutura química do 3-n-pentadecilfenol...................................... 87

Figura 18 – Reação de descarboxilação do ácido anacárdico.......................... 88

Figura 19 – Estrutura proposta para St-01........................................................ 90

Figura 20 – Espectro de RMN de 13C/DEPT Q de St-01 (DMSO, 125 MHz)...... 91

Figura 21 – Espectro de RMN de 1H de St-01 (DMSO, 500 MHz)..................... 91

ix

Figura 22 – Expansão do espectro de RMN de 1H δ 2,0-5,2 de St-01 (DMSO,

500 Hz)............................................................................................................. 92

Figura 23 – Espectro de correlação 1H x1H- COSY de St-01 (DMSO, 500

MHz)................................................................................................................. 92

Figura 24 – Expansão do espectro de correlação 1H x1H- COSY de St-01

(DMSO, 500 MHz)............................................................................................. 93

Figura 25 – Espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de St-01 (DMSO, 500

MHz, 125 MHz)................................................................................................. 93

Figura 26 – Espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de St-01 (DMSO, 500

MHz, 125 MHz)................................................................................................. 94

Figura 27 – Derivados do quinol isolados da espécie Ajuga parviflora.............. 95

Figura 28 – Gráfico com os picos de absorção da substância St-02 na região

do ultravioleta.................................................................................................... 97

Figura 29 – (A) Espectro na região do infravermelho (IV) de St-02 em

pastilha de KBr; (B) e (C) Expansões do espectro do IV................................... 97

Figura 30 – Estrutura química de St-02............................................................ 99

Figura 31 – Espectro de RMN de 1H de St-02 (MeOD, 300 MHz)..................... 101

Figura 32 – Expansão do espectro de RMN de 1H δ 4,5-7,8 de St-02 (MeOD,

300 MHz).......................................................................................................... 101

Figura 33 – Expansão do espectro de RMN de 1H δ 3,2-3,9 de St-02 (MeOD,

300 MHz).......................................................................................................... 102

Figura 34 – Espectro de RMN de 13C de St-02 (MeOD, 75 MHz)...................... 102

Figura 35 – Espectro de RMN DEPT 135 de St-02 (MeOD, 75 MHz)............. 103

Figura 36 – Espectro de correlação 1H x 1H - COSY de St-02 (MeOD, 300

MHz)................................................................................................................. 103

Figura 37 – Espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de St-02 (MeOD, 300

MHz e 75 MHz.................................................................................................. 104

Figura 38 – Expansão do espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de St-02

(MeOD, 300 MHz e 75 MHz)........................................................................... 104

Figura 39 –. Espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de St-02 (MeOD, 300

MHz e 75 MHz)................................................................................................. 105

Figura 40 – Expansão do espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de St-02

(MeOD, 75 MHz e 50 MHz................................................................................. 105

Figura 41 – Espectro de massas de St-02........................................................ 108

x

Figura 42 – Estrutura proposta para a substância St-03................................... 109

Figura 43 – Espectro de RMN de 1H de St-03 (CDCl3, 500 MHz)..................... 111

Figura 44 – Expansão do espectro de RMN de 1H δ 6,1-7,5 de St-03 (CDCl3,

500 MHz).......................................................................................................... 111

Figura 45– Expansão do espectro de RMN de 1H δ 1,9-4,3 de St-03 (CDCl3,

500 MHz).......................................................................................................... 112

Figura 46 – Expansão do espectro de RMN de 1H δ 0,65-1,85 de St-03

(CDCl3, 500 MHz)............................................................................................. 112

Figura 47 – Espectro de RMN de 13C de St-03 (CDCl3, 125 MHz)..................... 113

Figura 48 – Expansão do espectro de RMN de 13C δ 110-180 de St-03

(CDCl3, 125 MHz)............................................................................................. 113

Figura 49 – Espectro RMN de DEPT Q de St-03 (CDCl3, 125 MHz).................. 114

Figura 50 – Espectro de correlação 1H x 1H - COSY de St-03 (CDCl3, 500

MHz)................................................................................................................. 114

Figura 51 – Espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de St-03 (MeOD, 500

MHz e 125 MHz)............................................................................................... 115

Figura 52 – Expansão do espectro de correlação 1H x 13C - HSQC de St-03

(MeOD, 500 MHz e 125 MHz)........................................................................... 115

Figura 53 – Espectro de correlação 1H x 13C - HMBC de St-03 (CDCl3, 500

MHz e 125 MHz)............................................................................................... 116


(MeOD, 500 MHz e 125 MHz)........................................................................... 116


(MeOD, 500 MHz e 125 MHz)........................................................................... 117

Figura 56 – Reação do ácido gálico com molibdênio presente no regente

Folin-Ciocalteau................................................................................................ 120

Figura 57 – Complexo Flavonoide-Al3+............................................................. 121

Figura 58 – DPPH na forma radicalar (I) e na forma reduzida (II)...................... 123

Figura 59 – Relação estrutura-atividade de flavonol e flavona.......................... 125

Figura 60 – Estrutura do β-caroteno (I) e do ácido linoleico (II)......................... 126

Figura 61 – Espectro de UV com as bandas absorção da rutina obtido por

CLAE-DAD....................................................................................................... 131

Figura 62 – Cromatogramas dos extratos etanólicos das cascas, folhas e

talos e do padrão rutina..................................................................................... 131

xi

Figura 63 – Curva de calibração da rutina........................................................ 132

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Exemplos de flavonoides encontrados em diversas espécies da

família Anacardiaceae...................................................................................... 29

Tabela 2 - Exemplos de atividades biológicas testadas com extratos e/ou

fases de algumas espécies do gênero Spondias............................................... 37

Tabela 3 - Exemplos de alguns metabólitos secundários encontrados no

gênero Spondias............................................................................................... 41

Tabela 4 - Exemplos de substâncias antioxidantes naturais e sintéticas

(Adaptada de ALVES e colaboradores, 2010)................................................... 59

Tabela 5 - Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os

principais metabólitos secundários da espécie Spondias tuberosa (WAGNER;

BLADT, 1996)................................................................................................... 68

Tabela 6 - Fracionamento cromatográfico da fração metanólica das folhas...... 73

Tabela 7- Fracionamento cromatográfico da fração acetato de etila dos

talos.................................................................................................................. 74

Tabela 8 - Gradientes de eluição utilizado na análise por CLAE....................... 80

Tabela 9 - Identificação das principais classes de constituintes do extrato

etanólico, extrato hexânico e as fases (St-Hex, St-CHCl3, St-AcOEt e St-

MeOH) das cascas........................................................................................... 82



MeOH) das folhas............................................................................................. 83



MeOH) dos talos............................................................................................... 83

Tabela 12 - Composição química dos óleos fixos das cascas (OFC), folhas

(OFF) e talos (OFT) de Spondias tuberosa...................................................... 86

Tabela 13 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (125 MHz) referentes à

substância St-01............................................................................................... 94

Tabela 14 - Dados de RMN de 1H (400 MHz) e 13C (100 MHz) em CDCl3

referentes ao composto 2 (AKBAR; NAWAZ; MALIK, 2001)............................. 95

xiii

Tabela 15 - Comparação dos dados de RMN de 1H (300 MHz) e 13C (75 MHz)

referentes à substância St-02 com dados da literatura...................................... 106

Tabela 16 - Comparação dos dados de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (125

MHz) referentes à substância St-03 com dados da literatura............................ 118

Tabela 17 - Determinação de fenóis totais e flavonoides totais do extrato

etanólico (St-EtOH), hexânico (St-Hex1) e as frações (St-Hex, St-CHCl3, St-

AcOEt e St-MeOH) das cascas, folhas e talos................................................... 122

Tabela 18 - Atividade antioxidante in vitro do extrato etanólico (St-EtOH),

hexânico (St-Hex1) e as frações (St-Hex, St-CHCl3, St-AcOEt e St-MeOH)

das cascas, folha, talos e padrões (ácido ascórbico, BHA e BHT)..................... 127

Tabela 19 - Atividade antibacteriana de St-EtOH, St-AcOEt e St-MeOH das

cascas de Spondias tuberosa e do padrão Gentamicina................................... 129

Tabela 20 - Atividade antibacteriana de St-EtOH, St-AcOEt, St-MeOH e St-

02 das folhas de Spondias tuberosa. ................................................................ 129

Tabela 21 - Atividade antibacteriana de St-EtOH, St-AcOEt e St-MeOH dos

talos de Spondias tuberosa .............................................................................. 130

Tabela 22 - Quantidades de rutina em µg/mL encontradas nos extratos

etanólicos das cascas, folhas e talos................................................................. 132

xiv

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Exemplo de algumas subclasses de flavonoides........................... 51

xv

LISTA DE FLUXOGRAMAS

Fluxograma 1 - Obtenção e fracionamento do extrato etanólico das cascas

de Spondias tuberosa....................................................................................... 66

Fluxograma 2 - Obtenção e fracionamento do extrato etanólico das folhas

de Spondias tuberosa....................................................................................... 66

Fluxograma 3 - Obtenção e fracionamento do extrato etanólico dos talos de

Spondias tuberosa....................................................................................... 67

xvi

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

CC: Cromatografia em Coluna

CCD: Cromatografia em Camada Delgada

CCDA: Cromatografia em Camada Delgada Analítica

CG-EM: Cromatografia Gasosa acoplada à espectrometria de massas

COSY: Correlation Spectroscopy

d: dupleto

dd: duplo dupleto

δ: Deslocamento químico

DEPT Q: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Including the

Detection of Quaternary Nuclei

DEPT 135: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer, pulse with φ3

has flip angle of 135o

HMBC: Correlação heteronuclear de múltiplas ligações (multiple bond

correlation)

HSQC: Correlação heteronuclear quântica simples (heteronuclear single

quantum correlation)

Hz: Hertz

IV: Infravermelho

J: constante de acoplamento

KBr: Brometo de potássio

m: multipleto

mg EqAG/g: miligrama de equivalentes de ácido gálico por grama de amostra

mg EqC/g: miligrama de equivalentes de catequina por grama de amostra

NCCLS: National Commitee of Clinical Laboratory Standards

xvii

NEU: Solução metanólica a 1 % de difenilborinato de amino-2-etila

Rf: Retenction factor (Fator de retenção)

RMN de 1H: Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN de 13C: Ressonância Magnética Nuclear de Carbono Treze

s: simpleto

St-AcOEt: Fração acetato de etila

St-CHCl3: Fração clorofórmica

St-EtOH: Extrato etanólico

St-Hex1: Extrato hexânico

St-Hex: Fração hexânica

St-MeOH: Fração metanólica

St-01: Substância 1



t: tripleto

UFLC: Cromatografia Líquida Ultra Rápida

UV: Ultravioleta

OBS.: abreviaturas e símbolos utilizados neste trabalho que não constam nesta

relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas

universalmente.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 20

2. OBJETIVOS.................................................................................................... 25

2.1. Objetivo geral................................................................................................ 26

2.2. Objetivos específicos.................................................................................... 26

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA...................................................................... 27

3.1. Considerações sobre a família Anacardiaceae............................................. 28

3.2. Considerações sobre o gênero Spondias.................................................... 36

3.3. Considerações sobre a espécie Spondias tuberosa................................... 43

3.4. Considerações gerais sobre quinonas........................................................ 46

3.5. Considerações gerais sobre os ácidos fenólicos......................................... 46

3.6. Considerações gerais sobre os flavonoides................................................ 49

3.7. Considerações sobre a rutina e quercetina............................................... 53

3.8. Considerações sobre cromatografia líquida de alta eficiência com detector

de UV com arranjo de diodos (CLAE-DAD).......................................................... 55

3.9. Considerações sobre as atividades antioxidante e antibacteriana............ 57

4. PARTE EXPERIMENTAL.............................................................................. 63

4.1. Coleta do material botânico......................................................................... 64

4.2. Processamento do material vegetal............................................................ 65

4.3. Triagem fitoquímica preliminar dos extratos e frações................................ 67

4.4. Extração dos óleos fixos.............................................................................. 69

4.5. Métodos de análise...................................................................................... 70

4.5.1. Métodos cromatográficos........................................................................ 70

4.5.2. Métodos espectrofotométricos................................................................. 70

4.5.3. Métodos espectrométricos........................................................................ 71

4.5.4. Ponto de fusão.......................................................................................... 72

4.5.5. Análise dos óleos fixos............................................................................. 72

4.5.6. Análise por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa

(CLAE-FR)........................................................................................................... 73

4.6. Isolamento e purificação das substâncias................................................... 73

4.7. Determinação do teor de fenóis totais......................................................... 75

4.8. Determinação do teor de flavonoides totais................................................ 75

4.9. Avaliação da atividade antioxidante – sequestro do radical livre DPPH (2,2-

difenil-1- picrilhidrazil) e a co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido

linoleico................................................................................................................ 76

4.10. Avaliação da atividade antibacteriana........................................................ 78

4.11. Quantificação por CLAE-FR do flavonoide quercetina 3-O-α-L-

ramnopiranosil(1’’’→6’’)-β-glucopiranosídeo (rutina) na espécie Spondias

tuberosa............................................................................................................... 79

4.12. Análise estatística....................................................................................... 80

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................... 81

5.1. Perfil fitoquímico preliminar dos extratos e frações...................................... 82

5.2. Composição dos óleos fixos......................................................................... 84

5.3. Caracterização estrutural das substâncias St-01, St-02 e St-03.................. 89

5.4. Determinação de fenóis totais, flavonoides totais........................................ 120

5.5. Atividade antioxidante – sequestro do radical DPPH (2,2-difenil-1-

picrilhidrazil) e a co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico................. 123

5.6. Atividade antibacteriana............................................................................... 128


ramnopiranosil(1’’’→6’’)-β-glucopiranosídeo (Rutina) na espécie Spondias

tuberosa............................................................................................................... 130

6. CONCLUSÕES............................................................................................... 133

REFERÊNCIAS................................................................................................... 136

APÊNDICES........................................................................................................ 153

1. INTRODUÇÃO

21 Estudo fitoquímico e biológico in vitro de Spondias tuberosa Arruda (Anacardiaceae)

1. INTRODUÇÃO

Desde épocas remotas, as sociedades humanas acumulam informações e

experiência sobre o ambiente que as cercam, para com ele interagir e prover suas

necessidades de sobrevivência (RANGEL; BRAGANÇA, 2009). Ao longo do

processo evolutivo, o homem foi aprendendo a selecionar plantas para a sua

alimentação e para o alívio de seus males e doenças. O resultado desse processo é

que muitos povos passaram a dominar o conhecimento do uso de plantas e ervas

medicinais (FERREIRA; PINTO, 2010).

No Brasil, a história da utilização de plantas no tratamento de doenças

apresenta influências da cultura africana, indígena e europeia. A contribuição dos

escravos africanos com a tradição do uso de plantas medicinais em nosso país se

deu por meio das plantas que trouxeram consigo, que eram utilizadas em rituais

religiosos e também por suas propriedades farmacológicas, empiricamente

descobertas (TOMAZZONI et al., 2006).

Muitas destas propriedades terapêuticas das plantas são relatadas pela

população, as quais são confirmadas em sua maioria nos estudos farmacológicos,

comprovando assim a importância da pesquisa etnofarmacológica. Tais propriedades

propiciaram o desenvolvimento de vários medicamentos, entre eles está a procaína,

cloroquina ou ainda fármacos como vimblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®) e o

taxol (Taxol®), os quais podem ser obtidos por síntese a partir de molécula protótipo

ou através de isolamento, algumas vezes, biomonitorado (MACIEL et al., 2002;

HOSTETTMANN et al., 2003). A maioria dos princípios ativos de importância

farmacológica encontrada nos extratos vegetais, de modo geral, é oriunda de uma

variedade de metabólitos secundários (FERREIRA; PINTO, 2010).

Os metabólitos secundários têm sido sumariamente definidos como

compostos pouco abundantes, com uma frequência inferior a 1% do carbono total,

ou pelo fato de sua estocagem ocorrer em órgãos ou células específicos

(FUMAGALI et al., 2008). A produção dos metabólitos secundários é de fundamental

importância para a adaptação das plantas aos seus ambientes; essas moléculas

contribuem para que as mesmas possam ter uma boa interação com os diferentes

ecossistemas (FUMAGALI et al., 2008). Os metabólitos secundários despertam

interesse não só pelas atividades biológicas (ex: antioxidante, antibióticos,

antifúngicos e antivirais) produzidas pelas plantas em resposta aos estímulos do


meio ambiente mas pela imensa atividade farmacológica desses compostos (ALVES,

2001). A síntese destas substâncias pelas plantas consiste em um processo de

várias etapas influenciadas por diferentes variáveis. Os metabólitos secundários

representam uma interface química entre as plantas e o ambiente circundante,

portanto, fatores bióticos e abióticos podem interferir com a qualidade e a

quantidade de produtos secundários resultantes do metabolismo de uma planta em

determinado momento (Figura 1, p.22) (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).

Figura 1. Esquema dos principais fatores que podem influenciar o acúmulo de

metabólitos secundários nas plantas (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).

Os produtos naturais são responsáveis direta ou indiretamente por cerca de

40% de todos os fármacos disponíveis na terapêutica atual e, se for considerado

aqueles usados como antibióticos e antitumorais, esta porcentagem chega a

aproximadamente 70% (CAVALCANTE et al., 2013).

Apesar de todos os dados apresentados acima é importante ressaltar que a

quantidade de plantas existentes no planeta, reconhecidas sob o ponto de vista

científico, situa-se entre 250 a 550 mil espécies, sendo que somente 5% têm sido


estudadas fitoquimicamente e uma porcentagem menor avaliada sob os aspectos

biológicos. No Brasil, até 2009, apenas 8% das espécies nativas e menos de 2% das

espécies exóticas, foram estudadas em busca de moléculas bioativas

(CAVALCANTE et al., 2013).

O Brasil é o país com maior potencial para pesquisa com espécies vegetais,

pois detém a maior e mais rica biodiversidade do planeta, distribuída em seis biomas

distintos (NOLDIN; ISAIAS; FILHO, 2006). Estimativas da Convenção da Diversidade

Biológica (CDB) mostra que o Brasil hospeda entre 15 e 20% de toda a

biodiversidade mundial, sendo considerado o maior do planeta em número de

espécies endêmicas (BARREIRO; BOLZANI, 2009).

Dentre os biomas brasileiros está o bioma Caatinga, que ocupa uma área de

cerca de 844.453 quilômetros quadrados, o equivalente a 11% do território nacional

e que engloba os estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Maranhão, Pernambuco,

Paraíba, Rio Grande do Norte, Piauí, Sergipe e o norte de Minas Gerais (BRASIL,

2014). A Caatinga é também caracterizada por um sistema de chuvas extremamente

irregular de ano para ano, o que resulta em secas severas periódicas (LEAL et al.,

2005). Apesar de ser a única grande região natural brasileira cujos limites estão

inteiramente restritos ao território nacional, pouca atenção tem sido dada à

conservação da variada e marcante paisagem da Caatinga, e a contribuição da sua

biota à biodiversidade extremamente alta do Brasil tem sido subestimada (SILVA et

al., 2004).

Entre as inúmeras espécies vegetais do bioma Caatinga, encontra-se a

espécie Spondias tuberosa Arruda (Anacardiaceae) (Figura 2, p.24), conhecida

popularmente como umbuzeiro, imbuzeiro ou ambuzeiro, entre outros. É nativa do

semiárido brasileiro, e uma das espécies de grande importância socioeconômica

dentro de Anacardiaceae Lindl, pois além de fornecer frutos saborosos e nutritivos,

xilopódios ricos em água (NASCIMENTO-SILVA; CHINALIA; PAIVA, 2008),

representa uma importante fonte de renda através do extrativismo (ARAÚJO; NETO,

2002).


Figura 2. Spondias tuberosa Arruda. Foto: Amanda Leite Guimarães

Levando-se em consideração a influência de fatores externos, como índice

pluviométrico, altitude, entre outros, sob o metabolismo das plantas, acredita-se que

a região do semiárido seja uma área que influencie na produção de variados tipos de

metabólitos secundários com importantes atividades biológicas, como por exemplo

antioxidante e antibacteriana (GOBO-NETO & LOPES, 2007). Diante disto, este

trabalho descreve o estudo fitoquímico com a determinação estrutural de metabólitos

secundários isolados e a avaliação das atividades antioxidante e antibacteriana in

vitro da espécie Spondias tuberosa, contribuindo assim para o conhecimento

quimiotaxonômico e farmacológico da espécie, pois a partir do levantamento

bibliográfico foram encontrados poucos relatos sobre a composição química e

atividade farmacológica desta espécie.

2. OBJETIVOS


2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Contribuir para o estudo fitoquímico do gênero Spondias bem como da família

Anacardiaceae.

2.2. Específicos

Coletar e identificar taxonomicamente a espécie S. tuberosa;

Preparar extratos hexânicos e etanólicos com as partes aéreas (folhas e

talos) e da casca do tronco da espécie;

Particionar o extrato etanólico das partes da planta estudadas;

Extrair os constituintes presentes no óleo fixo e identificá-los através da

técnica hifenada CG-EM;

Isolar os constituintes químicos através de métodos cromatográficos

usuais;

Identificar a estrutura química dos constituintes isolados através de

técnicas espectrométricas adequadas;

Determinar o teor de fenóis e flavonoides totais nos extratos e frações

obtidos;

Realizar ensaios de atividade antioxidante e antibacteriana in vitro dos

extratos, frações e das substâncias isoladas;

3. FUNDAMENTAÇÃO

TÉORICA


3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 Considerações sobre a família Anacardiaceae

A família Anacardiaceae pertence à ordem Sapindales, que compreende

aproximadamente 81 gêneros e 800 espécies, presentes em ambientes secos a

úmidos, principalmente em terras baixas nas regiões tropicais e subtropicais em todo

o mundo, estendendo-se até regiões temperadas (LUZ, 2011). Os gêneros desta

família são subdivididos em cinco tribos (Anacardieae, Dobineae, Rhoeae,

Semecarpeae e Spondiadeae) (CORREIA; DAVID; DAVID, 2006). No continente

americano existem aproximadamente 32 gêneros nativos, sendo que 77% das

espécies são endêmicas do continente americano e apenas os gêneros Antrocaryon,

Campnosperma, Cotinus, Pistacia, Rhus, Spondias e Toxicodendron possuem

representantes também em outros continentes (LUZ, 2011). No Brasil estão

catalogados 14 gêneros com 57 espécies de Anacardiaceae, sendo que 14 delas

são restritas ao país (SILVA-LUZ; PIRANI, 2010).

As espécies desta família são arbustos ou árvores, raramente lianas ou ervas

aromáticas. Diversas delas apresentam frutos ou pseudofrutos comestíveis,

podendo também ser utilizadas na ornamentação de ruas e praças (SANTOS, 2010).

Do fruto do cajueiro (Anacardium occidentale L.) obtém-se a castanha de caju,

enquanto o pedicelo floral espessado (hipocarpo ou fruto acessório) é

comercializado in natura. Outros frutos de importância comercial ou regional incluem

a manga (Mangifera indica L.), os cajás (Spondias spp.), o umbu (Spondias tuberosa

Arruda) e a seriguela (Spondias purpurea L.). Schinus terebinthifolius Raddi, Schinus

molle L. e Rhus succedanea L. são exemplos de plantas utilizadas na ornamentação

de ruas e praças (LUZ, 2011).

Aproximadamente 25% dos gêneros dessa família são conhecidos como

tóxicos e causadores de dermatite de contato severa. De modo geral, as espécies

venenosas desta família estão restritas às tribos Anacardieae, Rhoeae e

Semecarpeae. A dermatite de contato provocada por essas plantas é atribuída

principalmente a compostos fenólicos e catecólicos ou à mistura destas substâncias,

denominados lipídios fenólicos. Estas substâncias podem estar presentes em

diferentes partes do material vegetal, ocorrendo principalmente em espécies do

gênero Rhus. Nos últimos anos, a origem dos lipídios fenólicos e derivados também


foi objeto de investigação; além disso, espécies da família Anacardiaceae têm se

mostrado bastante promissoras na busca de substâncias bioativas. Do ponto de

vista químico, os gêneros mais estudados nesta família são Mangifera, Rhus

(Toxicodendron), Anacardium, Spondias, Lannea, Semecarpus, Schinus, Pistacia,

Lithraea, Tapirira e Melanorrhoea. Mangifera, Rhus e Anacardium, as quais

destacam-se pelo número de investigações relativas à composição química de suas

espécies e atividades biológicas de seus extratos e metabólitos. Os estudos destas

espécies possibilitaram verificar a ocorrência de flavonoides, terpenos, esteroides,

xantonas e, principalmente, dos lipídios fenólicos e derivados. Destaca-se que entre

os flavonoides, os biflavonoides são os mais frequentes (CORREIA; DAVID; DAVID,

2006), alguns exemplos de flavonoides encontrados em espécies da família

Anacardiaceae estão listados na tabela 1, p.29-35.

Tabela 1 - Exemplos de flavonoides encontrados em diversas espécies da família

Anacardiaceae

Espécie Estrutura química Referência

bibliográfica

Buchanania

lazan

O

O

OR

OH

OR1

OHOH

OH

R = β-D-galactosil

R1 = α -L-ramnosil

Miricetina 3-O-α-ramnosil-3’-β-galactosil

ARYA et al, 1992

Continua


Tabela 1 (Continuação)

Campnosperma

panamense

O

O

OOH

OH

O

OH

OH

OHOH

Lanaroflavona

WENIGER et al.,

2004

Cotinus

coggygria

O

OH

OH

OH

Sulferitina

WESTENBURG

et al., 2000

Lannea alata

(Engl.) Engl.

OO

OH

OH

O

OH

OH

OCH3

Lanneaflavonol

OO

OH

OH

O

OH

OH

OCH3

Dihidrolanneaflavonol

OKOTH;

CHENIA;

KOORBANALLY,

2013

Continua



Lannea

coromandelica

O

OH

OH

OR

OOH

OH

R = arabinosil

Quercetin-3-O-arabinosil

SUBRAMANIAN;

NAIR, 1971

Rhus alata

O

O

O

OH

OH O

OH

OH

O

OH

Hinokiflavona

PARVEEN;

KHAN, 1987

Rhus corlaria

OO

O

OH

OHOH

OH

OH

O

OH

Agathisflavona

OO

OH

OH

O

OH

OH

OH O

OH

Amentoflavona

VAN LOO; DE

BRUYN;

VERZELE, 1988

Continua



Rhus corlaria

O

O

O

OH

OH O

OH

OH

O

OH

Hinokiflavona

O

OOH

OH OOH

OH

OH O

OH

OH

Sumaflavona

VAN LOO; DE

BRUYN;

VERZELE, 1988

Rhus lancea

O

OH

OCH3

OH

OH

OH

H3CO

O

7,4’ – di-O-metilmiricetina

NAIR; KOTIYAL;

BHARDWAJ,

1983

Continua



Rhus

succedanea

O

OOH

OH

OH

OHOH

OH

O

O

Rhusflavanona

LIN et al., 1997

Rhus

retinorrhoea

O

OH O

OH

OH

H3CO

OCH3

Rhamnazina

AHAMED et al.,

2001

Schinus

lentiscifolius

OOH

OH O

OR

OH

OH

R

Quercetina H

Quercetrina ramnosil

GEHRKE et al.,

2013

Continua



Schinus

terebinthifolius

O

R'

OH

OH

OR

OOH

OH

R R’

Miricetrina Ramnose OH

Quercitrina Ramnose H

Miricetina H OH

CERUKS et al.,

2007

Sclerocarya

birrea

OOH

OH O

OR

OH

R = ramnosil

Kaempferol 3-O-α-L- ramnosil

BRACA et al.,

2003

Continua



Searsia

chirindensis L.

OOH

OH O

OR1

OH

R2

R3

R1 R2 R3

Miricetina-3-O-arabinopiranosídeo arabinopiranosil OH OH

Miricetrina-3-O-ramnosídeo ramnosil OH H

Kaempferol-3-O-ramnosideo ramnosil OH OH

Quercetin-3-O-arabinofuranosídeo arabinofuranosil OH H

MADIKIZELA;

ADEROGBA;

VAN STADEN,

2013

Semecarpus

prainii

O

O

OH

OH O

OH

OH

OH O

OH

I3’, II8- Binaringenina

AHAMAD et

al.,1981

Além dos flavonoides foram encontradas também outras classes de

metabólitos secundários nas espécies da família, dentre elas estão os terpenoides,

esteroides, lipídios fenólicos e os benzenoides. Muitos destes metabólitos são

responsáveis por diversas atividades biológicas apresentadas pelos extratos de

espécies da família Anacardiaceae, entre as atividades testadas com as espécies da

família destacam-se os testes realizados com o extrato aquoso das cascas de uma

variedade de M. indica (manga) que resultou em uma formulação farmacêutica com

nome fantasia de Vimang®. Este extrato apresenta atividades imunoestimulante


(MAKARE; BODHANKAR; RANGARI, 2001), anti-inflamatória (GARRIDO et al.,

2004), antioxidante (SANCHEZ et al., 2000; SELLES et al., 2002), citotóxica e

antineoplásica (BELTRÁN et al., 2004). Destaca-se também os biflavonoides

hinokiflavona, agathisflavona e robustaflavona, isolados da espécie Rhus

succedanea. Eles apresentaram a propriedade de inibir a replicação do vírus HIV

pela inibição da enzima transcriptase reversa HIV-1-RT (LIN et al., 1997); e ainda

quando comparada com outros 65 flavonoides, a hinokiflavona mostrou-se mais

ativa na inibição da atividade pró-coagulante de monócitos humanos aderentes,

estimulada por endotoxina e interleucina-1β (MESESANE et al., 2000). Outros

biflavonoides do gênero Rhus apresentaram atividades biológicas importantes, como

antimalárica (AHAMED et al., 2001), antiviral (ZEMBOWER et al., 1998) e citotóxica

(LIN, 1989). Os poucos exemplos de atividades biológicas dos extratos de espécies

da família Anacardiaceae citadas acima demonstram o quanto estas espécies são

promissoras na busca de novos medicamentos.

3.2 Considerações sobre o gênero Spondias

Spondias é um gênero tropical da família Anacardiaceae que abrange de 14 a

20 espécies que são distribuídas mundialmente, e dentre estas, 4 a 7 espécies são

encontradas nas Américas. Na Ásia ocorrem cultivos comerciais de S. mombin e S.

purpurea, dentre outras 10 espécies nativas (SILVA et al., 2014).

Dentro deste gênero destacam-se as espécies Spondias mombin L. (Cajá),

conhecida em certas regiões brasileiras como cajá, cajá-mirim ou taperebá; S.

purpurea L. (Siriguela), S. tuberosa Arr. Câmara (Umbu ou imbu); S. dulcis ou S.

cytherea Parkinson (Cajarana ou cajá-manga) e duas espécies taxonomicamente

indefinidas, mas consideradas híbridos naturais, cajá-umbu ou umbu-cajá (S.

mombin × S. tuberosa) e umbuguela (S. tuberosa × S. purpurea) (SILVA, 2009).

No Brasil, dentre as espécies do gênero Spondias, podemos destacar a

importância comercial do cajá (S. mombin), umbu (S. tuberosa) e cajá-umbu (S.

mombin x S. tuberosa). Seus frutos são comercializados in natura ou processados

na forma de polpas, sucos e outros produtos alimentícios. Devido à utilização

comercial destes frutos, estudos vêm abordando as suas características de cultivo,

assim como as características físico-químicas, maturação e estabilidade, e os


constituintes químicos. Além do uso comercial, está descrito na literatura também a

utilização de espécies deste gênero na medicina tradicional em diversas regiões do

mundo. Espécies deste gênero são utilizadas para o tratamento de desordens

infecciosas, e como abortivo ou tônico (SILVA et al., 2014).

A tabela 2, p.37-39 mostra exemplos de atividades biológicas testadas com

extratos de algumas espécies do gênero.

Tabela 2. Exemplos de atividades biológicas testadas com extratos e/ou fases de

algumas espécies do gênero Spondias.

Espécie Atividade

biológica

Parte do

vegetal

utilizada

Solvente

utilizado na

extração

Referência

Spondias

dulcis

Antimicrobiana Folhas e

frutos Metanol ISLAM et al., 2014 Antioxidante

Citotóxica

Spondias

mangifera

Antibacteriana

Cascas Metanol ARIF et al., 2008 Antidiarreica

Antiulcerogência

S. mombin

Abortiva

e

Anticoncepcional

Folhas Etanol: Água

(7:3)

CHUKWUKA; ISEK,

2008

Antibacteriana

Antibacteriana

Folhas Água e

Etanol

AJAO; SHONUKAN;

FEMI-ONADEKO,

1985

Folhas

Acetona,

água, etanol

e metanol

AROMOLARAN;

BADEJO, 2014

Antibacteriana e

Antifúngica

Folhas e

cascas do

caule

Metanol ABO; OGUNLEYE;

ASHIDI, 1999

Antibacteriana in

vivo Folhas Metanol

OLADUNMOYE,

2007

Continua



S. mombin

Antiviral Folhas e

caules Etanol

CORTHOUT et al.,

1991

Anti-helmíntica

in vitro e in vivo Folhas

Água e

Etanol

ADEMOLA;

FAGBEMI; IDOWU,

2005

Anti-inflamatória Casca do

caule Etanol

ABAD et al.,

1996

Cardioprotetora Folhas Metanol:

Água (4:1)

AKINMOLADUN et

al., 2010

Leishmanicida Folhas Metanol:

Água (4:1) ACCIOLY et al., 2012

Spondias

mombin

aff.

tuberosa

Antimicrobiana Folhas Metanol SILVA et al., 2012

S. pinnata

Analgésica Cascas Etanol PANDA et al., 2009

Antibacteriana

Casca do

caule Etanol

VALSARAJ et al.,

1997

Cascas Etanol

Clorofórmio DAS et al., 2011

Resina da

casca

Etanol,

metanol,

acetato de

etila,

clorofórmio,

benzeno, éter

de petróleo e

hexano

GUPTA et al., 2010

Continua



S. pinnata

Antibacteriana

Folhas Água SHARMEEN et al.,

2012

Folhas Água FOYSAL; RAHMAN;

ALAM, 2011

Anticâncer in

vitro

Folhas Etanol: Água

(7:3)

DADUANG et al.,

2011

Casca do

caule

Metanol:

Água

(7:3)

GHATE et al., 2014

Antidiabética Casca do

caule Água

ATTANAYAKE et al.,

2014

Antioxidante in

vitro

Polpa do

fruto Etanol

MAISUTHISAKUL;

SUTTAJIT;

PONGSAWATMANIT,

2007

Cascas

Metanol:

Água

(7:3)

HAZRA; BISWAS;

MANDAL, 2008

Antiplasmodial Raízes

Água,

diclorometano

e metanol

HOUT et al., 2006

Antiviral Folhas Hexano SILPRASIT et al.,

2011

Anti-helmíntica Cascas Metanol GANGARAO;

JAYARAJU, 2009

Leishmanicida Cascas Metanol TAKAHASHI et al.,

2004

As atividades biológicas demonstradas por algumas espécies do gênero

Spondias (tabela 2) podem estar relacionadas com alguns constituintes químicos

presentes neste gênero. A espécie Spondias mombim (sinônimo Spondias lutea)


destaca-se pelo número relevante de substâncias identificadas e isoladas, o que

leva aos mais variados usos populares desta planta. Nos frutos desta espécie

observou-se a presença de carotenoides e vitamina A, contendo como principal

carotenoide a β-criptoxantina, seguido da luteína (HAMANO; MERCADANTE, 2001).

Estudo fitoquímico realizado com as folhas de S. mombim indicou a presença das

seguintes classes de metabólito secundários: taninos, saponinas, antraquinonas e

alcaloides (ABO; OGUNLEYE; ASHIDI, 1999). Foram isolados desta espécie dois

elagiotaninos a Geraniina, o constituinte principal, e galiolgeraniina que

apresentaram atividade antiviral pronunciada contra os vírus Coxsachie e Herpes

simplex (CORTHOUT et. al., 1991), essas substâncias podem ser os principais

responsáveis pela atividade antiviral atribuída aos extratos das folhas e cascas do

caule de S. mombim. Outros metabólitos secundários foram isolados das folhas e

cascas desta espécie, identificados como ácido 2-O-cafeicol-(+)-alohidroxicítrico e

butil éster de ácido clorogênico, que também mostraram considerável atividade

antiviral (CORTHOUT et al., 1992), bem como, o ácido elágico e a quercetina

isolados das folhas, apresentaram atividade antiviral contra o vírus da dengue tipo 2

(SILVA et al., 2011).

Na espécie S. pinnata foram identificados vitamina C, compostos fenólicos e

flavonoides, relacionando estes compostos com a atividade antioxidante. Na triagem

fitoquímica preliminar do extrato metanólico revelou a presença de taninos,

saponinas, terpenoides fitosteróis (SILVA et al., 2014).

Na espécie Spondias cytherea Sonn., também conhecida como S. dulcis

foram analisados os compostos voláteis dos extratos de frutos maduros e verdes

através das seguintes técnicas CG/FID, CG/EM e olfatometria. Os principais

compostos identificados foram 1,8-cineol, α-pineno, β-pineno, terpinoleno, limoneno,

α-terpineol, acetato de butila, γ-terpineno e terpinen-4-ol, dentre os mais de 50

componentes identificados. A característica do odor desses extratos pode ser

correlacionada com os álcoois e ésteres, monoterpenos menores e derivados

hexânicos e graxos (JIROVETZ; BUCHBAUER; NGASSOUM, 1999).

Na tabela 3, p.41-43 estão descritos outros metabólitos secundários

encontrados no gênero Spondias.


Tabela 3: Exemplos de alguns metabólitos secundários encontrados no gênero

Spondias.

Espécie Referência

Terpenoides e esteroides

Spondias

Mangifera

OH

COOH

Ácido oleanólico

OH

β-Amirina

SINGH;

SAXENA, 1976

O

24-Metileno cicloartanona

Spondias

pinnata

TANDON;

RASTOGI, 1976

Continua



Espécie Referência

Terpenoides e esteroides

O

H

H

H

H

Stigmast-4-en-3-ona

OH

O

Ácido lignocérico

H

H

H

OH

H

β-sitosterol

Spondias

pinnata

TANDON;

RASTOGI, 1976

Continua



Lipídio fenólico

OH

COOH

Ácido 2-hidroxi-6-(heptadeca-8,11,14-trieno)

benzoico

Spondias

mombin

COATES et al,

1994

Benzenóide

O

OH

OH

O

COOH

H

HOOO OH

COOH

Ácido 2-O-cafeicol-(+)-alohidroxicítrico

Spondias

mombin

CORTHOUT et

al., 1992

3.3 Considerações sobre a espécie Spondias tuberosa

Spondias tuberosa é uma espécie nativa do semiárido brasileiro, bioma

Caatinga, ocorrendo desde o Piauí até o norte de Minas Gerais. Esta espécie

apresenta muitas utilidades econômicas, sendo seu fruto comercializado in natura ou

em forma de polpa. Pode ser cultivada em larga escala, tanto para a alimentação

humana, quanto para suplementação alimentar de animais. Suas raízes e folhas

também podem ser utilizadas como alimento, e a água armazenada nas raízes é

utilizada na medicina popular (NADIA; MACHADO; LOPES, 2007).


A espécie Spondias tuberosa é facilmente reconhecida na Caatinga, pois

apresenta uma copa característica, baixa e ampla, de galhos cinzentos e

emaranhados. O umbuzeiro perde totalmente as folhas durante o estio anual, mas

logo após as primeiras chuvas reveste-se rapidamente de folhas. A floração tem

início quase sempre um pouco antes das primeiras chuvas, quando a planta

apresenta-se ainda desfolhada. A frutificação ocorre no período chuvoso e é

abundantíssima, durando aproximadamente dois meses (Figura 3, p.44). Como as

chuvas da Caatinga não iniciam na mesma época, a floração e a produção de frutos

varia de local para local (MAIA, 2004). Deste modo o umbuzeiro apresenta grande

importância para os sertanejos, pois em tempos de seca o umbuzeiro mostra-se

como uma fonte de renda, pois o mesmo floresce em meio da Caatinga cinzenta

fornecendo frutos dos quais muitas famílias tiram seu sustento com venda dos

mesmos, além de fornecer suas túberas as quais servem como reservatório de água

e ainda são comestíveis apresentando sabor doce e agradável. Além dos frutos, as

folhas desta planta também são utilizadas como uma fonte de alimento

principalmente pelos animais.

Figura 3. Árvore do umbuzeiro na época de estiagem (A); umbuzeiro após as primeiras chuvas (B); inflorescência (C) e fruto (D). Fotos: Amanda Leite Guimarães

http://www.google.com.br/search?hl=pt-BR&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Gerda+Nickel+Maia%22&source=gbs_metadata_r&cad=3


Sob o ponto de vista etnofarmacológico, a espécie Spondias tuberosa

apresenta diversos usos para o tratamento de algumas patologias, entre estas

diabetes, inflamações, cólicas uterinas e dores de estômago (LINS NETO; PERONI;

ALBUQUERQUE, 2010).

O uso desta planta para diversos fins terapêuticos pode estar relacionado

com os constituintes presentes nesta espécie. Os frutos do umbuzeiro apresentaram

pronunciada atividade antioxidante e sequestro de radicais livres, pela presença de

compostos fenólicos e vitamina C, bem como relatos da presença de flavonoides,

antocianinas e carotenoides. Quando avaliada a presença de compostos fenólicos

de baixo peso molecular, ou fenólicos simples por UFLC, constatou-se a presença

de ácido gálico, clorogênico, protocatecuico, p-cumárico, vanílico e ferúlico, bem

conhecidos por suas propriedades terapêuticas. O fenólico simples majoritário foi o

ácido clorogênico (SILVA et al., 2014).

O extrato das folhas do umbuzeiro (S. tuberosa) apresentou melhor atividade

antiviral contra o vírus da dengue tipo 2 do que o extrato das folhas da cajazeira (S.

mombin), devido à presença das seguintes substâncias: ácido elágico, quercetina e

rutina (SILVA et al., 2011). Ao ser avaliado os efeitos anticâncer dos extratos de 72

amostras de espécies do Nordeste brasileiro, dentre elas a S. tuberosa apresentou

atividade inibitória sobre as células malignas do tumor de Walker (SILVA et al.,

2014).

Em um estudo realizado com 23 polpas de frutas nativas do Nordeste foi

identificado, nas polpas de umbu, flavonoide (quercetina), ácido elágico e

hidroxicinâmicos, e foram avaliados os potenciais inibitórios das enzimas α-amilase

e α-glicosidase, e não apresentaram efeito antidiabético (GONÇALVES, LAJOLO;

GENOVESE, 2010).

O único trabalho encontrado na literatura que trata de isolamento de

substâncias da espécie Spondias tuberosa foi descrito por Silva e colaboradores

(2011). Este artigo relata o isolamento do ácido elágico, da quercetina e rutina.

Levando em consideração a presença de flavonoides e taninos nos frutos e

casca do caule do umbuzeiro, associado ao conhecimento popular dos seus efeitos

anti-inflamatórios e cicatrizantes esta espécie mostra-se promissora para

bioprospecção e descoberta de novos fármacos (ARAÚJO et al., 2008).


3.4 Considerações gerais sobre quinonas As quinonas são compostos orgânicos que podem ser considerados como

produtos de oxidação de fenóis; da mesma forma, a redução de quinonas pode

originar os correspondentes fenóis (Figura 4, p.46). Sua principal característica é a

presença de dois grupos carbonílicos que formam um sistema conjugado com pelo

menos duas ligações dupla C-C. As quinonas podem ser sintetizadas por meio de

várias rotas metabólicas, sendo as principais a via do ácido chiquímico e acetato ou

totalmente via acetato (SIMÕES et al., 2010).

Figura 4. Interconversão entre quinonas e os fenóis por oxirredução

OH

OH

O

O

Oxidação

Redução

Fenol Quinona

As reações de oxirredução são responsáveis pelo papel importante das

quinonas como carregadores de elétrons nos processos metabólicos das células.

Assim, as atividades e propriedades das quinonas baseiam-se primariamente em

ambientes físico ou biológico (SIMÕES et al., 2010).

3.5 Considerações gerais sobre os ácidos fenólicos Outra classe de metabólitos secundários é a dos ácidos fenólicos, estes estão

dentre os compostos fenólicos mais abundantes nos alimentos (OLIVEIRA;

BASTOS, 2011). Os ácidos fenólicos apresentam um grupo funcional carboxila e são

divididos em duas classes: os ácidos hidroxibenzoicos (Figura 5, p.47) e os

hidroxicinâmicos (Figura 6, p.47) (D’ARCHIVIO, 2007). Os ácidos hidroxibenzoicos

são componentes das complexas estruturas dos taninos hidrolisáveis e são menos

abundantes nos vegetais consumidos pelos humanos (MANACH, 2004). Já os

ácidos hidroxicinâmicos estão presentes em vários alimentos e bebidas de origem

vegetal, como o café, erva mate. São exemplos de ácido hidroxicinâmico os

seguintes ácidos: cafeico, p-cumárico, ferúlico e sinápico que, na maioria dos


alimentos, encontram-se esterificados ao ácido quínico, ácido tartárico ou

carboidratos e derivados (OLIVEIRA; BASTOS, 2011).

Figura 5. Estrutura química dos principais ácidos hidroxibenzoicos

Ácido salicílico: R1 = OH; R2 = R3 = R4 = H

Ácido gentísico: R1 = R4 = OH; R2 = R3 = H

Ácido p-hidroxibenzóico: R1 = R2 = R4; R3 = OH

Ácido protocatequínico: R1 = R4 = H; R2 = R3 = OH

Ácido vanílico: R1 = R4 = H; R2 = OCH3; R3 = OH

Ácido gálico: R1 = H; R2 = R3 = R4 = OH

Ácido siríngico: R1 = H; R2 = R4 = OCH3; R3 = H

R1

R2

R3

R4

OOH

Figura 6. Estrutura química dos principais ácidos hidroxicinâmicos

Ácido sinápico: R1 = H; R2 = R4 = OCH3; R3 = OH

Ácido cinâmico: R1 = R2 = R3 = R4 = H

Ácido o-cumárico: R1 = OH; R2 = R3 = R4 = H

Ácido m-cumárico: R1 = R3 = R4 = H; R2 = OH

Ácido p-cumárico: R1 = R2 = R4 = H; R3 = OH

Ácido caféico: R1 = R4 = H; R2 = R3 = OH

Ácido ferúlico: R1 = R4 = H; R2 = OCH3; R3 = OH

R2

R1

R3

R4

OOH


Os ácidos cinâmico e p-cumárico são formados a partir da rota biossintética

do ácido chiquímico, os quais sofrem reações de redução enzimática, oxidação com

degradação das cadeias laterais e ciclização enzimática intramolecular dando

origem aos fenilpropanoides (Figura 7, p.48). Os fenilpropanoides são menos

abundantes do que os terpenoides e possuem em suas estruturas um anel

benzênico com uma cadeia lateral composta de três carbonos, que apresentam uma

dupla ligação e podem ter um grupo funcional com oxigênio (ANDRADE, 2010).

Figura 7. Esquema adaptado de SIMÕES e colaboradores (2010) da biossíntese

dos fenilpropanoides

OHO

OH

OH

OH

Várias reações

NH2

O-

R

O

R = H

R = OH

Fenilalanina

Tirosina

Fenilalanina amonialiase

R

O

OH

R = H

R = OH

Ácido cinâmico

Ácido p-cumárico

R R

O

R R O O

redução oxidação redução ciclização

R = H

R = OH


3.6 Considerações gerais sobre os flavonoides Os flavonoides. Os flavonoides são biossintetizados a partir da via dos

fenilpropanoides, constituem uma importante classe de polifenóis, presentes em

relativa abundância entre os metabólitos secundários de vegetais. Uma “substância

fenólica ou polifenólica” é aquela que possui um ou mais núcleos aromáticos

contendo substituintes hidroxilados e/ou seus derivados funcionais (ésteres, éteres,

glicosídeos e outros). Entretanto, uma definição levando em conta somente a

estrutura química não é apropriada, uma vez que existem compostos contendo

hidroxilas fenólicas, que fazem parte de outras classes de metabólitos. Dessa forma,

é mais conveniente empregar-se uma definição que leva em conta também a origem

biogenética (SIMÕES et al., 2010). Os flavonoides são formados pela combinação

de derivados sintetizados a partir da fenilalanina (via metabólica do ácido

chiquímico) e do acetato (via metabólica do acetato, acetil coenzima A), o esquema

simplificado da origem biossintética dos flavonoides está apresentada na figura 8,

p.49.

Figura 8. Esquema simplificado da origem biossintética dos flavonoides adaptado de

SIMÕES e colaboradores (2010).


Podem-se encontrar flavonoides em diversas formas estruturais. Entretanto, a

maioria dos representantes dessa classe possui 15 átomos de carbonos em seu

núcleo fundamental, constituído de duas fenilas ligadas por uma cadeia de três

carbonos entre elas. Nos compostos tricíclicos, as unidades são chamadas núcleos

A, B e C e os átomos de carbonos recebem a numeração com números ordinários

para os núcleos A e C e os mesmos números seguidos de uma linha (') para o

núcleo B (Figura 9, p.50) (SIMÕES et al., 2010).

Figura 9. Núcleo fundamental dos flavonoides e sua numeração

O

O

8

7

6

5

2

3

2'3'

4'

5'

6'

B

CA

Os flavonoides são subdividos de acordo com sua estrutura em diversas

classes, sendo que as principais são: flavonas, flavonóis, chalconas, auronas,

flavanonas, flavanas, antocianidinas, leucoantocianidinas, proantocianidinas e

isoflavonas (Quadro 1, p.51-52) (BRAVO, 1998). A diversidade estrutural dos

flavonoides pode ser atribuída ao nível de oxidação e às variações no esqueleto

carbônico básico, promovidas por reações de alquilação, glicosilação ou

oligomerização (COUTINHO; MUZITANO; COSTA, 2009).


Quadro 1: Exemplo de algumas subclasses de flavonoides

O

Chalcona

O

Di-hidro-chalcona

O

O

Flavona

O

O

OH

Flavonol

O

O

OH

Di-hidro-flavonol

O

O

Flavanona

O

OH

Flavanol

O

OH

OH

Flavan-3,4-diol ou leucoantocianidina

O+

OH

Antocianidina

O

O

O

O

Biflavonoide

Continua


Quadro 1 (Continuação)

Isoflavonoides

O

O

O

Proantocianidina ou Tanino condensado

O

O

H3CO O

O

Neoflavonoide

Os flavonoides de origem natural apresentam-se, frequentemente,

oxigenados e um grande número ocorre conjugado com açúcares. Esta forma,

chamada conjugada, também é conhecida como heterosídeo. São denominados de

O-heterosídeos quando a ligação se dá por intermédio de uma hidroxila e de C-

heterosídeos quando a ligação se dá com um átomo de carbono, quando estão na

sua forma livre são chamados de aglicona (SIMÕES et al., 2010).

Diante da grande diversidade de flavonoides existentes, diversas atividades

biológicas são atribuídas a essa classe de polifenóis o que lhe confere significativa

importância farmacológica (COUTINHO; MUZITANO; COSTA, 2009). Diversos

ensaios in vivo e in vitro vêm comprovando e determinando a ampla variedade das

atividades biológicas dos compostos flavonoídicos. Destacam-se, dentre outros, os

seguintes efeitos dos flavonoides sobre os sistemas biológicos: capacidade

antioxidativa (esta constitui a atividade mais elucidada pelos estudos até agora

desenvolvidos); atividades anti-inflamatória e de efeito vasodilatador; ação

antialérgica; atividade contra o desenvolvimento de tumores, anti-hepatotóxica,

antiulcerogênica; atuação antiplaquetária, bem como ações antimicrobianas e

antivirais (LOPES et al., 2000). Dentre os 40 fármacos anti-inflamatórios aprovados


entre 1983 e 1994, 12 foram derivados ou baseados em polifenóis de origem natural

(COUTINHO; MUZITANO; COSTA, 2009). Na família Anacardiaceae esta classe de

metabólito secundário destaca-se entre os demais produtos naturais já encontrados

nesta família, principalmente a subclasse dos biflavonoides.

3.7 Considerações sobre a Rutina e Quercetina

Em meio aos flavonoides encontra-se a rutina, um flavonol O-glicosilado

(glicose + ramnose) na posição 3 do anel C da quercetina (Figura 10, p.53). Este

flavonoide é encontrado em várias fontes alimentares como cebola, uva, trigo

serraceno, feijão vermelho, maçãs, tomates e bebidas como vinho tinto e chá preto.

Entre os vegetais as principais fontes da rutina são: a árvore japonesa pagoda

(Sophora japônica L.) de seus botões e flores são extraídos de 15 a 20% de rutina,

trigo sarraceno (Faopyrum esculentum Moech, F. tataricum L. Gaenth) suas folhas

contêm 2-8% de rutina e os frutos (favas) do faveiro (Dimophandra mollis Benth) que

contém rutina na proporção de 8g para 100g de pericarpo (BECHO; MACHADO;

GUERRA, 2009).

Figura 10. Esquema simplificado da formação da rutina a partir da quercetina

adaptado de PEDRIALI, 2005.

Quercetina

O

OOH

OH

OH

OH

OH

UDP-D-glicose

Quercetina-3-O-glucosídeo

Rutina

UDP-L-ramnose

O

OOH

OH

OH

OH

O

OOH

OH

OH

OH

O

OOH

OH

OH

OH

O

OOH

OH

OH

O

OH

OH

OH


Os glicosídeos ligados a quercetina apresentaram afinidade pela membrana

das células epiteliais exercendo assim um importante papel na absorção dos

compostos lipofílicos. Já a absorção no intestino delgado é dificultada devido aos

açúcares ligados à sua molécula (MUROTA; TERAO, 2003).

Apesar da dificuldade na absorção no intestino delgado, a rutina tem se

destacado entre os flavonoides estudados em função das suas diversas atividades

farmacológicas. Entre as atividades terapêuticas da rutina, está a melhora nos

sintomas de insuficiência dos vasos linfáticos e venosos associados com algumas

doenças hemorrágicas ou de hipertensão, por promover a normalização da

resistência e permeabilidade da parede destes vasos (BECHO; MACHADO;

GUERRA, 2009). Além de várias outras atividades da rutina que vêm sendo

desvendadas, como por exemplo, a eficiência no tratamento da artrite por Candida

albicans e atividade anti-candida (HAN, 2009), a atividade antihiperlipidêmica

(SANTOS et al., 1999), o efeito anticonvulsivante em ratos (NASSIRI-ASL;

SHARIATI-RAD; ZAMANSOLTANI, 2008), a supressão da imunidade celular

(MIDDLETON et al., 2000), a atividade anticarcinogênica (MACHADO, 2005) e o

efeito anti-inflamatório (GUARDIA et al., 2001).

Em relação à aglicona da rutina, a quercetina, trata-se do flavonoide mais

difundido na natureza, presente em grandes quantidades em vegetais, frutas, chás e

vinho tinto. Representa um dos antioxidantes de origem vegetal com maior potencial

antioxidante, protegendo as células contra as Espécies Reativas de Oxigênio (ERO)

(BONA, 2010). Estima-se que são ingeridas 25 mg por dia de quercetina em uma

dieta normal humana (DAJAS et al., 2003). Trabalhos experimentais utilizando

quercetina obtiveram redução das lesões no tecido hepático e verificaram que sua

administração aumenta as defesas antioxidantes, diminui o dano oxidativo no fígado,

a proliferação do ducto biliar e a fibrose (BONA, 2010).

Diversos estudos relatam as propriedades biológicas da rutina, sendo que boa

parte dos seus efeitos benéficos são similares às propriedades farmacológicas da

quercetina (BECHO; MACHADO; GUERRA, 2009). A semelhança nas propriedades

farmacológicas é justificada pelo fato de que a rutina pode ser completamente

hidrolisada pelas enzimas glicosidades produzidas por enterobactérias, além de

sofrer hidrólise em pH estomacal, dando origem à quercetina-3-glicosídica e,

posteriormente, a quercetina, como pode ser observado na figura 11, p.55

(ARAÚJO, 2013).


Figura 11. Esquema da hidrólise da rutina a quercetina-3-glicose e, em seguida a quercetina

O

OOH

OH

OH

OH

OH

Rutina

Quercetina-3-O-glucosídeo

Quercetina

pH ácido

pH ácido

O

OOH

OH

OH

OH

O

OOH

OH

OH

O

OH

OH

OH

O

OOH

OH

OH

OH

O

OOH

OH

OH

OH

3.8 Considerações sobre Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de UV com arranjo de diodos (CLAE-DAD)

Existem diversas formas de identificar e quantificar flavonoides em extratos

vegetais, porém, a técnica CLAE se destaca das demais por apresentar eficiência e

confiabilidade nos dados obtidos. A cromatografia líquida na análise de flavonoides é

uma técnica bastante eficiente na separação destas substâncias, mesmo em

misturas complexas (VILA, 2006).

O equipamento de CLAE consiste de uma bomba de alta pressão, injetor,

coluna, detector e um registrador de dados como está representado na figura 12,

p.56. Esta técnica emprega colunas relativamente pequenas (cerca de 2-5 mm de

diâmetro interno e comprimento de 3 a 25 cm), operando em temperaturas que

chegam até cerca de 75°C e pressões de até 400 atm. Um detector colocado na


saída da coluna permite o registro contínuo da composição do efluente, resultando

em um cromatograma, no qual torna-se possível identificar e quantificar os

flavonoides da amostra (VILA, 2006).

Figura 12. Esquema simplificado de um cromatógrafo CLAE (VILA, 2006)

O detector de UV-Visível é o mais empregado em CLAE para as análises de

flavonoides, principalmente porque estas substâncias apresentam duas bandas de

absorção bem características no UV (YAO et al. 2004; MARKHAM, 1982). Há três

tipos de detectores UV-Visível: o detector de comprimento fixo, o detector de

comprimento de onda variável e detector por arranjo de fotodiodos. O detector por

arranjo de diodos se sobressai dos demais, pois é um tipo de detector de

comprimento de onda variável que opera na região do ultravioleta, e torna possível

análises em diferentes comprimentos de onda simultaneamente, pois possibilitam

uma “varredura” na região UV-Vis em uma única corrida cromatográfica,

disponibilizando-o mesmo após ter sido realizada (VILA, 2006).


3.9 Considerações sobre as atividades antioxidante e antibacteriana

Sabe-se que diversas plantas da flora brasileira são utilizadas no tratamento

de vários tipos de enfermidades, uma forma de comprovar este uso é através da

realização de testes biológicos e ensaios químicos com os extratos destas espécies.

Estes experimentos podem ser realizados tanto in vitro (ocorre fora de um

organismo) quanto em in vivo (ocorre dentro de um organismo). Os ensaios in vitro

normalmente são realizados inicialmente, pois estes podem fornecer respostas

rápidas através de experimentos simples e seu resultado permite rejeitar um

possível ensaio biológico in vivo, pois um extrato que exibe um resultado não

satisfatório in vitro provavelmente não exibirá bons resultados em ensaios in vivo.

A avaliação da atividade antioxidante e antibacteriana in vitro são os

experimentos mais utilizados por apresentarem uma metodologia de fácil

reprodutibilidade, apesar da simplicidade do experimento, o mesmo pode justificar

algumas propriedades farmacológicas apresentadas pelo vegetal, como por

exemplo, ação anti-inflamatória ou antidiarreica e também determinar se é

necessário da sequência nos ensaios in vivo ou não.

Atividade antioxidante

Atualmente existe um grande interesse no estudo dos antioxidantes devido,

principalmente, às descobertas sobre o efeito dos radicais livres no organismo. A

oxidação é parte fundamental da vida aeróbica e do nosso metabolismo e, assim, os

radicais livres são produzidos naturalmente. Esses radicais livres cujo elétron

desemparelhado encontra-se centrado nos átomos de oxigênio ou nitrogênio são

denominados Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) ou Espécies Reativas de

Nitrogênio (ERN). (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).

O organismo humano sofre ação constante de ERO e ERN geradas em

processos inflamatórios, por alguma disfunção biológica ou provenientes dos

alimentos. As principais ERO distribuem-se em dois grupos, os radicalares: hidroxila

(HO•), superóxido (O2•−), peroxila (ROO•) e alcoxila (RO•), e os não-radicalares:

oxigênio, peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso. Dentre as ERN incluem-se o

óxido nítrico (NO•), óxido nitroso (N2O3), ácido nitroso (HNO2), nitritos (NO2−), nitratos

(NO3−) e peroxinitritos (ONOO−). Enquanto alguns deles podem ser altamente


reativos no organismo atacando lipídios, proteínas e DNA, outros são reativos

apenas com os lipídios (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).

Nos últimos anos, uma quantidade substancial de evidências tem indicado o

papel chave desses radicais livres e outros oxidantes como grandes responsáveis

pelo envelhecimento e pelas doenças degenerativas associadas ao envelhecimento,

como câncer, doenças cardiovasculares, catarata, declínio do sistema imune e

disfunções cerebrais (SOUSA et al., 2007).

Uma forma de evitar os danos causados pelos radicais livres e outros

oxidantes é eliminando o excesso dos mesmos do organismo. Esse excesso é

combatido por antioxidantes produzidos pelo corpo ou são absorvidos em uma dieta

que contenha substâncias que atuem como antioxidantes. De acordo com Halliwell

“Antioxidante é qualquer substância que, quando presente em baixa concentração

comparada à do substrato oxidável, regenera o substrato ou previne

significativamente a oxidação do mesmo” (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006). O

nosso corpo é capaz de produzir antioxidantes e agem enzimaticamente, a exemplo

da se-glutationa peroxidase (GPx), catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD)

(FINKEL; HOLBROOK, 2000) ou, os que não agem enzimaticamente, como por

exemplo, glutationa (GSH), peptídeos de histidina, proteínas ligadas ao ferro

(transferrina e ferritina), ácido diidrolipóico e CoQH2 (BARREIROS; DAVID; DAVID,

2006). Além dos antioxidantes produzidos pelo corpo, o organismo utiliza aqueles

provenientes da dieta como o α-tocoferol (vitamina-E), β-caroteno (pró-vitamina-A),

ácido ascórbico (vitamina-C), e compostos fenólicos onde se destacam os

flavonoides e poliflavonoides (Tabela 4, p.59-60) (BARREIROS; DAVID; DAVID,

2006).

Outro interesse ligado aos antioxidantes é a sua aplicação na indústria, na

proteção de cosméticos, fármacos e alimentos, prevenindo a decomposição

oxidativa desses pela ação da luz, temperatura e umidade (BARREIROS; DAVID;

DAVID, 2006). Muitos dos antioxidantes utilizados na indústria são de origem

sintética, como por exemplo a mistura de dois o 2 e o 3-terc-butil-4-hidroxianisol

(BHA) e o di-terc-butil metil fenol (BHT) (Tabela 4, p.59-60).


Tabela 4. Exemplos de substâncias antioxidantes naturais e sintéticas (Adaptada de ALVES e colaboradores, 2010) Substância

antioxidante Estrutura Origem

Ácido

ascórbico

O

OH OH

OOH

OH

Natural

e

sintética

Ácido gálico

OHO

OH

OH

OH

Natural

α-tocoferol

O

OH

Natural

β-caroteno

Natural

Continua



BHA

OH

OCH3

Sintética

BHT

OH

OH

Sintética

Galato de n-

propila

OO

OH

OH

OH

Sintética

Trolox®

OOH

OOH

Sintética

Quercetina

O

OOH

OH

OH

OH

OH

Natural


Existem diversos métodos para avaliar a atividade antioxidante in vitro de

substâncias biologicamente ativas, envolvendo desde ensaios químicos com

substratos lipídicos a ensaios mais complexos utilizando as mais diversas técnicas

instrumentais. Estes testes têm se tornado ferramentas usuais e extremamente

necessárias na seleção inicial de substâncias que possam ser utilizadas como

fármacos, auxiliando os pesquisadores na avaliação da atividade de substâncias

isoladas de produtos naturais, bem como obtidas de fontes sintéticas. Além disso,

estes métodos podem auxiliar na escolha das espécies de planta para estudos

químicos e farmacológicos (ALVES et al., 2010).

Atividade antibacteriana

O estudo de agentes antimicrobianos tem grande abrangência, sendo ponto

crucial em vários setores do campo farmacêutico e cosmético. Outro ponto a ser

ressaltado é a utilização desse estudo como primeiro screening na descoberta da

atividade farmacológica de novos agentes, sendo de extrema importância,

principalmente em um país como o Brasil, que oferece uma imensa biodiversidade

(OSTROSKY et al., 2008).

Existe outra questão que não pode deixar de ser mencionada, o uso

indiscriminado e prolongado de antimicrobianos químicos sintéticos. Esse tipo de

uso tem levado à seleção de microrganismos patogênicos mutantes resistentes a

esses compostos, tornando o uso de antimicrobianos de origem natural uma

alternativa eficaz e econômica (VARGAS et al., 2004). O problema da resistência

microbiana é crescente e a perspectiva de uso de drogas antimicrobianas no futuro é

incerta e uma das soluções para este problema é o desenvolvimento de novas

drogas, tanto sintéticas como naturais (NASCIMENTO et al., 2000).

A atividade antibacteriana de extratos vegetais é avaliada através da

determinação de uma pequena quantidade da substância necessária para inibir o

crescimento da bactéria-teste. Esse valor é conhecido como Concentração Inibitória

Mínima (CIM). Um aspecto bastante relevante na determinação da CIM de extratos

vegetais é a preocupação em relação aos aspectos toxicológicos, microbiológicos e

legais pertinentes aos compostos naturais ou suas combinações. As variações

referentes à determinação da CIM de extratos de plantas podem ser atribuídas a

vários fatores, dentre eles podemos citar a técnica aplicada, o microrganismo e a


cepa utilizada no teste, à origem da planta, a época da coleta, se os extratos foram

preparados a partir de plantas frescas ou secas e a quantidade de extrato testada.

Assim, não existe método padronizado para expressar os resultados de testes

antimicrobianos de produtos naturais (OSTROSKY et al., 2008).

4. PARTE EXPERIMENTAL


4. PARTE EXPERIMENTAL

4.1. Coleta do material botânico

As folhas, talos e cascas de Spondias tuberosa Arr. foram coletadas em

janeiro e junho de 2013, no campus de ciências agrárias da Universidade Federal do

Vale do São Francisco localizado em Petrolina-PE (Coordenadas: 09°19'53,90" S;

040°32'47,60" W). A exsicata desta espécie (Figura 13, p.64) encontra-se depositada

no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) na Universidade Federal do Vale do

São Francisco (UNIVASF) sob o registro nº 18319.

Figura 13. Foto da exsicata de Spondias tuberosa de número 18319.


4.2. Processamento do material vegetal

Preparação do extrato de S. tuberosa

As partes da planta coletadas no mês de janeiro permaneceram em estufa de

ar circulante à temperatura de 40ºC por 72 horas para retirada de umidade. Após a

secagem e completa estabilização (eliminação de água, inativação de enzimas, etc.)

o material foi pulverizado em moinho, obtendo-se um material vegetal seco e

pulverizado das cascas (320,4 g), folhas (126,5 g) e dos talos (174,3 g). O material

botânico foi devidamente acondicionado em um recipiente de aço inoxidável,

inicialmente foi realizada uma extração com o solvente n-hexano, a fim de retirar os

constituintes apolares presente no material botânico, para tanto realizou-se três

extrações num intervalo de 72 horas entre cada extração, os extratos obtidos desta

primeira maceração das partes utilizadas (folhas, talos e cascas) foram

denominadas de Hex-1. Em seguida o material contido no recipiente foi submetido à

maceração exaustiva com etanol 95%. Realizou-se várias extrações num intervalo

de 72 horas entre cada extração até completa extração dos metabólitos. As soluções

extrativas, hexânica e alcoólica, passaram por um processo de destilação do

solvente em evaporador rotativo à pressão reduzida a uma temperatura média de 50

°C.

Na solução extrativa etanólica das folhas foi evidenciada a presença de um

precipitado amorfo com a coloração marrom claro e solúvel em dimetilsulfóxido

(DMSO), o qual foi separado e identificado como substância 1 (St-01) (4,8 mg).

Partição do extrato etanólico de S. tuberosa

Uma pequena porção do extrato etanólico (EtOH) das partes estudadas foi

separada para ensaios químicos, biológicos e para a avaliação fitoquímica

preliminar. O restante foi particionado através de cromatografia líquida a vácuo com

solventes em gradiente crescente de polaridade (hexano, clorofórmio, acetato de

etila e metanol) e as frações obtidas foram submetidas à avaliação da atividade

antioxidante e do teor de fenóis e flavonoides. O estudo foi continuado com a fase

que mostrou melhores resultados nas atividades avaliadas com a finalidade do

isolamento dos constituintes químicos.


As quantidades de cada fração obtida no fracionamento do extrato etanólico

das cascas, folhas e talos estão descritas nos fluxogramas 1, 2 e 3, p. 66-67.

Fluxograma 1. Obtenção e fracionamento do extrato etanólico das cascas de

Spondias tuberosa.

Fluxograma 2. Obtenção e fracionamento do extrato etanólico das folhas de Spondias tuberosa.


Fluxograma 3. Obtenção e fracionamento do extrato etanólico dos talos de

Spondias tuberosa.

4.3. Triagem fitoquímica preliminar dos extratos e frações

A triagem fitoquímica preliminar dos extratos e das frações foi avaliada por

meio de um método que consiste na aplicação das amostras sobre uma placa de

cromatografia em camada delgada analítica com auxílio de um capilar, e a eluição

da mesma foi realizada em sistemas de solventes específicos para cada classe de

metabólito secundário investigado. Essa metodologia identifica os principais grupos

de metabólitos secundários que compõem os extratos e fases estudados. A triagem

fitoquímica consiste em um exame rápido e superficial, realizado através de

reagentes de coloração que irão revelar ou não a presença de determinada classe

metabólitos secundários em um extrato (WAGNER; BLADT, 1996). As classes dos

constituintes químicos que foram investigados, bem como os sistemas de solvente e

reveladores utilizados estão demonstrados na tabela 5, p.68.

Estudo fitoquímico e biológico in vitro de Spondias tuberosa Arruda (Anacardiaceae)

68

Tabela 5. Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os principais metabólitos secundários da espécie Spondias tuberosa (WAGNER; BLADT, 1996).

Classe química Sistema eluente Revelador

Alcaloides Tolueno:acetato de etila:dietilamina

(70:20:10) Dragendorff

Cumarinas Tolueno:éter etílico

(1:1, saturado com ácido acético 10%) KOH etanólico 10%

Derivados antracênicos Acetato de etila:metanol:água

(100:13,5:10) KOH etanólico 10%

Flavonoides e taninos Acetato de etila:ácido fórmico:ácido acético glacial:água

(100:11:11:26) NEU

Mono e diterpenos Tolueno:acetato de etila

(93:7) Vanilina sulfúrica

Naftoquinonas Tolueno:ácido fórmico

(99:1)

KOH etanólico 10%

Triterpenos e esteroides Tolueno:clorofórmio:etanol

(40:40:10) Lieberman-Burchard

Saponinas Clorofórmio:ácido acético:metanol:água

(64:32:12:8) Anisaldeído-sulfúrico


4.4. Extração dos óleos fixos

As partes da planta (folhas, talos e cascas) foram coletadas em junho de

2013, e levadas para uma estufa de ar circulante a temperatura de 40ºC por 72

horas para retirada da umidade. Após a secagem e completa estabilização o

material foi pulverizado em moinho de facas, obtendo-se um material vegetal seco e

pulverizado das folhas (7,4 g), cascas (82,3 g) e dos talos (16,9 g). O material

botânico foi submetido a uma extração com éter de petróleo em um aparelho de

Soxhlet, durante duas horas. Após a destilação do solvente obteve-se os óleos fixos

das folhas (770,0 mg), cascas (126,1 mg) e dos talos (310,0 mg). Para a análise dos

óleos realizou-se uma reação de saponificação seguida de uma metilação dos

ácidos graxos presentes no óleo. Para tanto, utilizou-se a metodologia descrita por

MATOS e colaboradores (1992).

Saponificação

As amostras de 126 a 300 mg de cada óleo foram saponificadas em um

sistema de refluxo em 50 mL de metanol contendo 0,5-1,0g de KOH, durante 30

minutos. Em seguida, o metanol foi destilado até a redução do volume a 10 mL, o

qual foi completado para 50 mL por adição de água destilada. O material

insaponificável foi extraído da mistura alcalina com éter etílico.

Metilação dos ácidos graxos (Técnica semi-micro)

Após a saponificação, as soluções alcalinas foram aciduladas até pH = 2 com

uma solução aquosa de ácido clorídrico a 10% e os ácidos graxos extraídos com

éter etílico. Após a remoção da água restante através do tratamento com sulfato de

sódio anidro e do éter etílico por destilação em evaporador rotativo à pressão

reduzida, os ácidos graxos foram metilados de acordo com a técnica semi-micro. As

amostras contendo entre 20-30 mg foram colocadas em um sistema de refluxo

durante dois minutos com 2-3 gotas de ácido clorídrico concentrado e 5 mL de

metanol. Após a adição de 10 mL de água, os ésteres metílicos (EMAG) foram

extraídos com hexano, retirou-se a água residual da solução hexânica por

tratamento com sulfato de sódio anidro, seguido de filtração e da retirada do hexano


através da destilação. Após a metilação os ésteres metílicos das folhas, cascas e

talos foram enviados para análise.

4.5. Métodos de análise

4.5.1. Métodos cromatográficos

Para o fracionamento das amostras em cromatografia de adsorção em coluna

(CC) foi utilizada sílica gel 60 (70- 230 mesh, ASTM) de partículas com dimensões

entre 0,063-0,200 mm (MERCK) e na separação dos componentes por

peneiramento molecular utilizou-se o Sephadex LH-20 (SIGMA). Ambas as técnicas

utilizadas tiveram como suporte colunas de vidro cilíndricas cujas dimensões

variaram de acordo com a quantidade de amostra utilizada. As frações foram

monitoradas por Cromatografia em Camada Delgada Analítica (CCDA) da Silicycle

TLC – Aluminum F254; as placas foram eluídas com solventes isolados ou em

misturas binárias, em gradiente crescente de polaridade. A pureza das amostras foi

determinada quando observou-se uma única mancha na placa. A revelação das

substâncias deu-se pela exposição das placas à lâmpada de irradiação ultravioleta

nos comprimentos de onda 254 e 365 nm e pela utilização de um revelador químico

(vanilina sulfúrica).

4.5.2. Métodos espectrofotométricos

Para os métodos espectrofotométricos utilizou-se o espectrofotômetro Nova

1600 UV de monofeixe, operando em uma faixa de trabalho de 190 a 1000 nm.

Através deste método determina-se a concentração de uma amostra utilizando a

técnica da espectrofotometria ou colorimetria. A mesma consiste na determinação da

concentração de uma solução a partir de sua coloração, uma vez que a intensidade

da cor é proporcional à quantidade da substância sobre a qual agiu o reativo

(ARAÚJO, 2013).


Análise das bandas de absorção na região do ultravioleta

Preparou-se uma solução da amostra a 0,05 mg/mL em metanol, e em

seguida realizou-se a leitura da absorbância da solução no intervalo de 220 a 400

nm. Neste experimento utilizou-se cubetas de quartzo e o metanol como branco. O

experimento foi realizado em triplicata.

4.5.3. Métodos espectrométricos

Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear

As análises foram realizadas pelo CENAUREMN na Universidade Federal do

Ceará utilizando o espectrômetro Bruker modelo Avance DPX-300, operando na

frequência do hidrogênio a 300 MHz e na frequência do carbono-13 a 75 MHz.

Também foram realizadas análises na Central Analítica da Universidade Estadual do

Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), utilizando espectrômetro Bruker 500 MHz,

operando na frequência do Hidrogênio a 500 MHz e na do Carbono-13 a 125 MHz.

As amostras para análise foram preparadas dissolvendo-se uma pequena

quantidade das amostras nos solventes deuterados dimetilsulfóxido (DMSO-d6),

clorofórmio (CDCl3) e metanol (CD3OD). O deslocamento químico (δ) foi

referenciado para RMN de 1H pelos picos característicos dos hidrogênios

pertencente à fração não deuterada deste solvente em relação ao TMS: DMSO (δH

= 2,49), clorofórmio (δH = 7,24) e metanol (δH = 4,84 e 3,30). Para os espectros de

RMN de 13C, em relação ao TMS foi utilizado: DMSO (δC = 39,7), clorofórmio (δC =

77,0) e metanol (δC = 49,0).

As multiplicidades dos sinais de RMN de 1H foram indicadas segundo as

convenções: s (simpleto), d (dupleto), dd (duplo dupleto), t (tripleto), q (quarteto), m

(multipleto).

Espectrometria de Massas

As análises foram realizadas em cromatógrafo a gás acoplado a

espectrômetro de massas (CG-EM) modelo QP2010Plus (Shimadzu), com fonte de

ionização por impacto eletrônico de 70 eV. A coluna utilizada foi a Factor Four/VF -

5ms (30mx25µmx0,25µm).


Espectroscopia de infravermelho

A análise de espectroscopia na região do infravermelho foi realizada na

Central Analítica do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão

Pernambucano. Os espectros no infravermelho foram obtidos após a preparação da

pastilha contendo 1 mg de amostra com 100 mg de KBr, sob varreduras num

aparelho PerkinElmer Spectrum Version 10.4.00, as absorções foram registradas

entre 4000 e 400 cm-1.

4.5.4. Ponto de fusão

O ponto de fusão foi determinado em um aparelho para ponto de fusão

(QUIMIS, modelo Q340S23), com temperatura variando entre 0 e 310 ºC. A análise

foi realizada em triplicata e o resultado expresso demonstra a média obtida entre as

leituras.

4.5.5. Análise dos óleos fixos

As substâncias presentes no óleo fixo das cascas, folhas e talos da espécie

Spondias tuberosa foram investigados no cromatógrafo a gás Shimadzu modelo QP-

2010 interface com um espectrômetro de massas (CG - EM ) com as seguintes

condições: coluna Phenomenex ZB - 5MS Zebron (30mx0,25 mm x 0,25 mm), o gás

hélio (99,999 %) transportado com um fluxo constante de 1,1 mL/min, volume de

injecção de 1 uL; razão de divisão de 1:40 injetor, temperatura do injetor 240° C;

modo de impacto de elétrons a 70 eV; temperatura da fonte de íons 280°C. A

temperatura do forno foi programada de 100°C (isotérmico durante 5 min), com um

aumento de 10°C/min até 250°C (isotérmico durante 5 min) e 10°C/min até 280°C

(isotérmica durante 15 min). Uma mistura de hidrocarbonetos lineares (C9H20 -

C40H82) foi injetada sob as mesmas condições experimentais que as amostras, e as

identificações dos componentes foram efetuadas por comparação dos espectros

obtidos com as do banco de dados de equipamentos (Wiley 7 Lib e Nist 08 Lib).


4.5.6. Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa

(CLAE-FR)

As análises foram realizadas pela Central Analítica da Universidade Federal do

Vale do São Francisco, utilizando a técnica de Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência com detector de arranjo de Diodos (CLAE-DAD) em equipamento

Shimadzu® equipado com um sistema quaternário de bombas modelo LC - 20ADVP,

degaseificador modelo DGU - 20A, detector PDA modelo SPD - 20AVP, forno modelo

CTO - 20ASVP, injetor automático modelo SIL - 20ADVP e controlador modelo SCL -

20AVP, sendo os dados tratados através do software Shimadzu® LC solution 1.0

(Japão).

4.6. Isolamento e purificação das substâncias

Isolamento e purificação de St-02

Durante a concentração da fração metanólica das folhas no evaporador

rotativo, houve a formação de um precipitado de coloração amarela no fundo do

balão. Para a separação do precipitado, a fração metanólica (4,72 g) foi submetida à

coluna cromatográfica (CC) em sílica gel (91,6 g) que foi denominada de CFM-F.

Utilizou-se como eluentes clorofórmio (CHCl3) e metanol (MeOH), em gradiente

crescente de polaridade, conforme demostrado na tabela 6, p.73. No total foram

coletadas 55 frações de 50 mL cada.

Tabela 6: Fracionamento cromatográfico da fração metanólica as folhas

Frações Sistema de solvente Proporção

1-10 CHCl3 100

11-17 CHCl3: MeOH 95:5

18-23 CHCl3: MeOH 90:10

24-34 CHCl3: MeOH 80:20

35-44 CHCl3: MeOH 50:50

45-55 MeOH 100


Após serem reunidas as frações que apresentaram as mesmas

características na análise da cromatografia em camada delgada (CCDA), gerou-se

uma fração na qual continha o precipitado em maior quantidade (Fr. 39-41). A Fr. 39-

41 foi purificada em uma coluna cromatográfica contendo Sephadex LH-20 e eluída

apenas com metanol, resultando na substância 2 (St-02) (93,2 mg).

A identificação da substância foi realizada através da técnica espectroscópica

de RMN. Determinou-se ainda o ponto de fusão, as bandas de absorção da

substância no ultravioleta (UV) e infravermelho (IV) e ainda os picos de

fragmentação no espectro de massas.

Isolamento e purificação de St-03

A fração acetato de etila dos talos (0,6 g) foi submetida à coluna

cromatográfica (CC) em sílica gel (48,6 g) que foi denominada de CFAcOEt-T.

Utilizou-se como eluentes clorofórmio (CHCl3), acetato de etila (AcOEt) e metanol

(MeOH), em gradiente crescente de polaridade, conforme demostrado na tabela 7,

p.74. Foram coletadas no total 46 frações de 50 mL cada.

.

Tabela 7: Fracionamento cromatográfico da fração acetato de etila dos talos

Frações Sistema de solvente Proporção

1-13 CHCl3 100

14-20 CHCl3: AcOEt 90:10

21-25 CHCl3: AcOEt 70:30

26-31 CHCl3: AcOEt 50:50

32-36 CHCl3: AcOEt 30:70

37-41 AcOEt 100

42-44 AcOEt: MeOH 95:5

45-46 AcOEt: MeOH 90:10

As frações foram reunidas após serem comparadas através da cromatografia

em camada delgada analítica (CCDA). Observou-se também através da CCDA a

pureza de uma fração (Fr. 6). Tal fração apresentou-se na forma de um precipitado

com aspecto de resina de coloração amarela, resultando assim na substância 3 (St-

03) (14,6 mg).


A identificação da substância foi realizada através das técnicas

espectroscópicas de RMN uni e bidimensional.

4.7. Determinação de fenóis totais

O teor de fenóis totais foi mensurado por meio do método colorimétrico que

utiliza o reagente de Folin-Ciocalteu e o ácido gálico foi utilizado como padrão

(ALMEIDA et al., 2011). Uma alíquota dos extratos e frações diluídas (40 µL) foi

adicionada a 3,16 mL de água destilada e 200 µL do reagente Folin-Ciocalteu, sendo

misturados logo em seguida. Logo após adicionou-se a mistura 600 µL de uma

solução aquosa estoque de Na2CO3 a 20% e agitou-se novamente. Após duas horas

a absorbância de cada solução foi determinada em espectrofotômetro em 756 nm

contra o branco (todos os reagentes, exceto a amostra em análise) e os resultados

foram plotados em um gráfico que correlaciona a absorbância da amostra com sua

concentração. O conteúdo de fenóis totais foi expresso em mg de equivalente de

ácido gálico por grama de amostra (mg EAG g-1), obtido por interpolação em uma

curva analítica construída com o padrão ácido gálico dissolvido em etanol e água

nas concentrações 50, 100, 150, 250, 500 e 1000 mg/L. A equação da curva foi

expressa por y = 0,0005x - 0,0076, com coeficiente de determinação igual a R² =

0,9989, onde “x” é a concentração de ácido gálico e “y” é absorbância resultante em

756 nm. Todas as análises foram realizadas em triplicata.

4.8. Determinação de flavonoides totais

O teor de flavonoides totais foi determinado através do método

colorimétrico por complexação metálica descrito por (ZHISHEN et al., 1999), neste

experimento foi utilizado como padrão a (+)-Catequina. Inicialmente, preparou-se

soluções do padrão, extratos e frações nas seguintes concentrações: 50, 100, 150,

250, 500 e 1000 mg/L. Em seguida 300 µL da solução dos extratos, frações e do

padrão foi adicionada a 1,5 mL de água destilada. Posteriormente, foram

adicionados 90 µL de uma solução de NaNO2. Após 6 minutos de reação, 180 µL de

uma olução de AlCl3.H2O 10% foram adicionados à mistura. Após 5 minutos de


reação, 600 µL de uma solução de NaOH 1M foram adicionados à mistura anterior.

Finalmente, completou-se o volume com 330 µL de água destilada e o sistema foi

homogeneizado por completo. A absorbância foi mensurada contra o branco em 510

nm, em espectrofotômetro. O branco utilizado continha todos os reagentes e, no

lugar da amostra adicionou-se 300 µL de água destilada. Os resultados foram

expressos em mg de equivalentes de catequina por grama de amostra (mg EqC g-1)

por meio da interpolação dos dados obtidos das amostras na curva padrão com o

padrão catequina dissolvido em metanol e água nas concentrações 50, 100, 150,

250, 500 e 1000 mg/L. A equação da curva foi expressa por y=0,0015x+0,0618, com

coeficiente de determinação igual a R² = 0,9873. Todo o ensaio foi realizado em

triplicata.

4.9. Atividade Antioxidante – Sequestro do radical livre DPPH (2,2-difenil-1-

picrilhidrazil) e a Co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico

Há uma grande diversidade de radicais livres e de suas diferentes formas de

atuação nos organismos vivos. Diante disso se fez necessário a realização de mais

de uma técnica para a determinação da atividade antioxidante. A atividade

antioxidante in vitro dos extratos (hexânico e etanólico) e as fases das folhas, talos e

cascas foi determinada através dos métodos de sequestro do radical DPPH e da

inibição da co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico.

Sequestro do radical livre DPPH (2,2-difenil-1- picrilhidrazil)

Neste primeiro ensaio de atividade antioxidante utilizou-se a metodologia de

sequestro do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH) descrita por Santana e

colaboradores (2012). As soluções estoques (1,0 mg/mL) das amostras e padrões

(ácido ascórbico, BHA e BHT) foram preparadas e diluídas até concentrações finais

de 243, 81, 27, 9, 3 e 1 μg/mL em etanol. A solução de DPPH na concentração de 50

μg/mL foi preparada em etanol. Em cada cubeta foi adicionado 1 mL da solução de

DPPH a 2,5 mL das soluções de diferentes concentrações das amostras e padrões,

e deixou-se reagir por 30 min à temperatura ambiente.

Em seguida, os valores de absorbância foram medidos em um


espectrofotômetro de Ultravioleta UV-Vis a um comprimento de onda em 518 nm e

convertida em percentagem da atividade antioxidante (AA), utilizando a seguinte

fórmula:

100% xA

AAAA

controle

amostracontrole

Onde:

controleA = indica a absorbância do controle negativo (1,0 mL DPPH + 2,5 mL EtOH)

amostraA = indica a absorbância para a amostra

Os controles positivos foram as soluções dos padrões: ácido ascórbico, butil-

hidroxi-anisol (BHA) e butil-hidroxi-tolueno (BHT). Os ensaios foram realizados em

triplicata e os resultados foram expressos em CE50, onde os valores foram

calculados por regressão linear.

Co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico

O segundo método utilizado foi o método da inibição da co-oxidação do

sistema β-caroteno/ácido linoleico. Esse método é baseado na perda da coloração

amarela do β-caroteno, devido à sua reação com os radicais formados pela oxidação

do ácido linoléico através da aeração do meio (SANTANA et al., 2012). A taxa de β-

caroteno pode ser retardada na presença de antioxidantes. Deste modo preparou-se

o meio oxidante, no qual foram dissolvidos 2 mg de β-caroteno em 10 mL de

clorofórmio e foram adicionados a 2 mL desta solução 40 mg de ácido linoléico e 400

mg de Tween 40. O clorofórmio foi evaporado sob vácuo a 40 °C e 100 mL de água

destilada foram adicionados. Em seguida, a mistura foi agitada vigorosamente

durante 2 minutos, conferindo a oxidação do meio. As soluções dos padrões (ácido

ascórbico, BHA e BHT) e das amostras em estudo foram preparadas em etanol na

concentração de 1 mg/mL. Em seguida transferiu-se 0,120 mL da solução dos

padrões/extratos/frações para uma cubeta, logo após adicionou-se 3,0 mL do meio

oxidante. A absorbância foi medida imediatamente a 470 nm e, em seguida, as

amostras foram incubadas em banho-maria, a 50 °C, durante 2 horas, quando a

absorbância foi medida novamente.


O controle positivo deste teste foram os seguintes padrões: ácido ascórbico,

BHT e BHA. No controle negativo, os extratos foram substituídos por um volume

igual de etanol. A porcentagem de atividade antioxidante (%) foi avaliada em termos

de branqueamento do β-caroteno utilizando a seguinte fórmula:

𝐴𝐴 % = 100 𝑥 [1 − (𝐴0 − 𝐴1)

(𝐴00 − 𝐴1

0)⁄ ]

AA % = será avaliada pelo efeito do aditivo em relação ao branco, onde:

A0= absorbância inicial da amostra e padrões

A1= absorbância final da amostra e padrões

A00= absorbância inicial do branco

A1 0= absorbância final do branco

Os dois ensaios de atividade antioxidante foram realizados em triplicata.

4.10. Avaliação da atividade antibacteriana

Os extratos e frações que apresentaram maior atividade antioxidante e maior

quantidade de fenóis e flavonoides totais foram submetidos à avaliação da atividade

antibacteriana. A atividade antibacteriana foi avaliada para as seguintes amostras:

extrato etanólico (EtOH) e as frações acetato de etila (St-AcOEt) e metanólica (St-

MeOH) das cascas, folhas e talos.

Para avaliação da atividade antibacteriana, utilizou-se as cepas bacterianas

de referência obtidas do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde

(INCQS/FIOCRUZ – Brasil). Os microrganismos utilizados foram: Bacillus cereus

(ATCC 11778), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Klebsiella pneumoniae (ATCC

13883), Salmonella enterica (ATCC 10708), Serratia marcescens (ATCC 13880),

Shigella flexneri (ATCC 12022) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923).

A avaliação da atividade antibacteriana foi determinada através de dois

métodos, o de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida

Mínima (CBM). O efeito antibacteriano foi avaliado pelo método de microdiluição

(SANTANA et al., 2012), como recomendado pelo The National Committee for


Clinical Laboratory Standards (CLSI, 2003). Primeiramente uma solução mãe de 25

mg/mL dos extratos foi preparada utilizando uma solução aquosa de DMSO a 20%

(v/v). Em seguida transferiu-se 200 μL desta diluição para a microplaca contendo

200 μL de Muller-Hinton. Em seguida, diluições seriadas foram realizadas,

resultando em concentrações de 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78; 0,39 e 0,195 e 0,0975

mg/mL dos extratos etanólicos e das frações. Para a substância St-02, foi preparada

uma solução mãe de 2 mg/mL, que após diluições seriadas, resultou em

concentrações de 1,0; 0,5; 0,025. 0,0125; 0,0062; 0,0031; 0,0015 e 0,0007 mg/mL.

O inóculo contendo 5 x 105 UFC/mL (0,5 na escala de McFarland) foi adicionado a

cada poço. Foram reservados poços nas microplacas para controle de esterilidade

do caldo, de crescimento bacteriano e da ação do antimicrobiano de referência

(Gentamicina). Para a gentamicina foi usada uma concentração inicial de 1,6 mg/mL,

a qual foi diluída para concentrações de 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125

mg/mL. As microplacas foram incubadas sob condições de aerobiose durante 18-24

horas a 37 °C, quando 10 μL de cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio (CTT) a 2% foram

adicionados a cada poço para a detecção da mudança de cor do CTT (incolor) para

vermelho, que reflete o metabolismo bacteriano ativo. A CIM foi definida com a

concentração mais baixa do extrato que visivelmente inibiu o crescimento

bacteriano.

Para determinar a CBM, alíquotas de 10 μL foram retiradas de cada um dos

poços do ensaio anterior contendo os extratos e transferidas para placas de Petri

contendo ágar Muller-Hinton. As placas foram incubadas durante 24 horas a 37 °C.

O surgimento de colônia de bactéria para uma dada concentração indica que essa

não foi capaz de matar 99,9% ou mais do inoculo bacteriano utilizado. Os ensaios

foram realizados em triplicata.



tuberosa

O extrato etanólico das cascas, folhas e dos talos foram analisados através

da técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa (CLAE-FR)

com objetivo de quantificar a rutina nas três partes da planta estudadas.


Preparação das amostras

Preparou-se soluções dos extratos etanólicos (Folhas, Talos e Cascas) em

metanol na concentração de 1 mg/mL.

O padrão da rutina foi utilizado para a obtenção da curva de calibração. O

mesmo foi solubilizado em metanol em diferentes concentrações (6,0; 12,0; 24,0;

36,0; 48,0; 60 µg/mL).

Todos os procedimentos de preparação de amostras foram realizados em

triplicata.

Condições da análise

As condições utilizadas na análise foram baseadas na metodologia descrita

por Silva e colaboradores (2012).

A análise por CLAE foi realizada utilizando uma coluna octadecilsilano (250 x

4,6 mm, 5 µm, Ascentis® C18, Marca Supelco®) na temperatura de 37°C, o sistema

de eluição utilizado foi uma proporção de uma mistura de solventes A:B (A: Solução

aquosa de ácido fosfórico a 3%, pH ≅ 3,0; B: Acetonitrila), os gradientes de eluição

estão descritos na tabela 8, p.80. O fluxo da coluna foi de 1,25 mL/min e o volume

injetado das amostras e do padrão foi de 20 µL e com detecção no comprimento de

onda 350 nm.

Tabela 8. Gradientes de eluição utilizado na análise por CLAE

Tempo (min) A (%) B (%)

0 80 20

12 80 20

17 60 40

23 60 40

25 20 80

4.12. Análise estatística

As análises foram realizadas em triplicata, e os resultados foram tratados no

programa GraphPad Prism® versão 5.0 e expressos como média ± desvio padrão

(DP). Valores foram considerados significativamente diferentes quando p <0,05.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO


5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Perfil fitoquímico preliminar dos extratos e frações

A triagem fitoquímica preliminar teve como objetivo identificar a presença das

principais classes de metabólitos secundários nos extratos ou frações analisadas

(Tabela 9, 10 e 11, p.82-83). Em todas as amostras analisadas observou-se a

ausência de saponinas, entretanto os flavonoides apareceram na maioria das

amostras analisadas. A presença de flavonoides corrobora com informações

descritas na literatura de que os flavonoides, principalmente os biflavonoides, são

considerados a classe de metabólitos secundários mais frequente na família

Anacardiaceae.

Tabela 9. Identificação das principais classes de constituintes do extrato etanólico

(St-EtOH), extrato hexânico (St-Hex1) e as frações (St-Hex, St-CHCl3, St-AcOEt e

St-MeOH) das cascas.

Classe química St-Hex1 St-

EtOH St-Hex St-CHCl3 St-AcOEt St-MeOH

Alcaloides - - - - - - Cumarinas + - - - - - Derivados

antracênicos - + - - ++ -

Flavonoides e taninos

+ ++ + + +++ +

Mono e diterpenos - - + - - - Naftoquinonas - - - - - - Triterpenos e

esteroides + - - + - -

Saponinas - - - - - -

(-): ausência do constituinte, (+) presença do constituinte, (++): presença moderada do constituinte, (+++):presença elevada do constituinte.




St-MeOH) das folhas.



Alcaloides - - + - - -

Cumarinas - - - - - -

Derivados antracênicos

- - - - - -


- + ++ - - +

Mono e diterpenos

+++ - - + - -

Naftoquinonas +++ - - - ++ -

Triterpenos e esteroides

- - - + - -


(-): ausência do constituinte, (+) presença do constituinte, (++): presença moderada do constituinte,

(+++): presença elevada do constituinte.



St-MeOH) dos talos.



Alcaloides + - - - - + Cumarinas - - - - - -

Derivados antracênicos

- - - - +++ -


- - - - +++ ++

Mono e diterpenos

++ - - - - -

Naftoquinonas + - - - - - Triterpenos e

esteroides - - - - - -


(-): ausência do constituinte, (+) presença do constituinte, (++): presença moderada do constituinte, (+++): presença elevada do constituinte.


5.2. Composição dos óleos fixos

A tabela 12, p.86 mostra o tempo de retenção (min) e a área do pico (%) no

cromatograma de cada constituinte que foi identificado nos óleos fixos obtido a partir

da espécie S. tuberosa. A figura 14, p.84 mostra o cromatograma correspondente a

análise cromatográfica (CG-MS) do óleo fixo obtido das cascas, que permitiu à

identificação de 17 constituintes diferentes, dos quais o composto fenólico 3-n-

pentadecilfenol (44,91%) foi o constituinte majoritário. O triterpeno espinaceno

(4,72%), os esteroides γ-sitosterol (4,95%), stigmast-4-en-3-ona (2,75%) e o 5α-

stigmastano-3,6-diona (1,54%) também foram identificados.

Figura 14. Cromatograma de íons totais do óleo fixo das cascas de Spondias tuberosa

Na análise do óleo fixo obtido das folhas observou-se no cromatograma

(Figura 15, p.85) a presença de 18 constituintes diferentes. Os constituintes

majoritários foram o hidrocarboneto n-Tetratetracontano (38,17%) e 2,2-Dimetil-3-

Vinil-Biciclo [2.2.1] Heptano (13,53%). Também foram identificadas nesta amostra as

seguintes substâncias: 3-n-pentadecilfenol (10,1%), o triterpeno lupeol (4,25%) e os

triterpenoides β-amirina (1,00%), β-friedelanol (2,90%) e friedelina (1,95%).


Figura 15. Cromatograma de íons totais do óleo fixo das folhas de Spondias tuberosa

O cromatograma obtido da análise do óleo fixo dos talos (Figura 16, p.85)

mostra a presença de 18 constituintes. Dentre eles estão o hidrocarboneto n-

tetratetracontano (28,57%) e o esteroide γ-sitosterol (11,35%), como os constituintes

majoritários, e os constituintes 3-n-pentadecilfenol (2,46%), lupeol (9,92%), β-amirina

(1,51%), β-friedelanol (1,06%) e friedelina (1,06%) também foram identificados.

Figura 16. Cromatograma de íons totais do óleo fixo dos talos de Spondias tuberosa


Tabela 12. Composição química dos óleos fixos das cascas (OFC), folhas (OFF) e talos (OFT) de Spondias tuberosa.

Constituinte

(%) Tempo de retenção

(min)

OFC OFF OFT

Éster metílico do ácido

Eicosanoico - - 1,31 49,15

Hexacosanoico 2,86 - - 64,19

Docosanoico 1,06 - 0,94 54,53

Tetracosanoico 4,59 - 1,76 59,53

Linoleico - - 6,20 42,23

α- Linolênico - 3,42 4,00 42,39

Octacosanoico 4,96 - - 68,56

Linoleico 1,04 - - 42,23

Esteárico 1,25 2,20 2,23 43,33

11 - Octadecenoico 4,38 - - 42,47

Oleico - - 2,83 42,46

Palmítico 2,77 5,05 6,41 36,99

Tetradecanoico - 3,17 2,70 30,07

Triacontanóico 4,60 1,21 0,74 72,65

Triterpenos

Lupeol - 4,25 9,92 73,25

Espinaceno 4,72 - - 61,36 Triterpenoides

β-amirina - 1,00 1,51 72,31 Friedelan-3β-ol - 2,90 1,06 75,63

Friedelina - 1,95 1,06 76,03 Esteroides γ-sitosterol 4,95 - 11,35 71,63

Stigmast-4-en-3-ona 2,75 - - 74,17 5α-Estigmasta-3,6 - diona 1,54 - - 77,80

Hidrocarbonetos 2,2-Dimetil-3-Vinil-Biciclo

[2.2.1] Heptano - 13,53 3,30 57,91

n-Decano - 1,20 - 4,61 n-Tetradecano - 3,54 - 6,95

n-Tetratriacontano 1,95 2,18 - 58,84 n-Tetratetracontano - 38,17 28,57 67,90

Compostos fenólicos 3-n-pentadecilfenol 44,91 10,1 2,46 58,31

Outros constituintes Pentafluoropropionato de

octatriacontila 4,34 - - 67,92

1-Hexacosanol 2,92 - - 72,11 Acetato de 4α,14-Dimetil-

9β,19-cyclo-5α-ergost-24(28)-en-3β-ol 3,69 - - 73,35

Benzeno-1,2,4-tricarboxilato de tris(2-etil-hexila)

0,72 4,14 1,93 74,45

Hexanoato de hexila - - 9,71 17,10


Nos três óleos fixos da espécie S. tuberosa foram identificados os ésteres

metílicos correspondentes aos seguintes ácidos graxos de cadeia longa: palmítico

esteárico e triacontanoico. Os ácidos palmítico e esteárico foram identificados na

semente da fruta do umbuzeiro por BORGE e colaboradores (2007). Estes ácidos

podem estar relacionados com a origem das cadeias alquílicas longas presentes nos

lipídios fenólicos, tais como o 3-n-pentadecilfenol que foi identificado na espécie em

estudo e, anteriormente isolado da espécie Anacardium occidentale, espécie que

também pertence à família Anacardiaceae (CORREIA; DAVID; DAVID, 2006). O 3-n-

pentadecilfenol (Figura 17, p.87) é considerado um lipídio fenólico, um fenol ou ainda

um alquilfenol de cadeia longa, esse composto está presente no líquido da castanha

de caju (LCC) como um dos seus constituintes que é denominado de cardanol.

Figura 17. Estrutura química do 3-n-pentadecilfenol

OH

O LCC é um subproduto da agroindústria do caju e uma importante fonte

vegetal de compostos fenólicos alquil substituídos, cujo anel aromático possui uma

cadeia lateral na posição meta com 15 átomos de carbono. Essa cadeia lateral

alifática pode ser saturada, ou ainda com uma, duas ou três insaturações, não

apresentando nenhuma conjugação entre as mesmas. O LCC pode ser obtido

através de duas técnicas: na primeira utiliza-se um solvente orgânico para sua

extração, o produto obtido denomina-se LCC natural, enquanto na segunda, o

líquido é obtido através do cozimento da castanha no próprio LCC, originando o LCC

técnico. A principal diferença entre os dois tipos de LCC diz respeito ao constituinte

majoritário, no LCC natural o ácido anacárdico encontra-se em maior quantidade,

enquanto no LCC técnico, o cardanol é o principal constituinte. Este fato deve-se a

utilização de altas temperaturas (180 – 300°C) no processo de extração do LCC

técnico ocasionando a descarboxilação do ácido anacárdico transformando-o em

cardanol (Figura 18, p.88) (OLIVEIRA, 2007).


O cardanol apresenta-se como uma substância promissora, uma vez que

existem vários estudos relacionados com as suas múltiplas propriedades. Isto deve-

se ao fato que uma vez funcionalizado, apresenta-se como uma excelente

alternativa sintética. Sob o ponto de vista químico, destaca-se a existência do grupo

fenol e a presença da cadeia lateral alifática com caráter lipofílico, o que confere a

seus derivados a solubilidade necessária no combustível diesel. Outra característica

relevante do cardanol é o fato dele privilegiar os processos ecologicamente corretos,

uma vez que é oriundo de fonte renovável (obtido da castanha de caju) e ser

biodegradável. O cardanol, um produto vegetal, degrada-se 96% em 28 dias,

apresenta solubilidade em água igual a 1,0 g/L e índice de toxicidade aguda (peixes)

menor que 11,0 g/L (OLIVEIRA, 2007).

Figura 18. Reação de descarboxilação do ácido anacárdico

OH

R

COOH

OH

R

Os lipídios fenólicos apresentam muitas atividades biológicas comprovadas,

tais atividades podem estar relacionadas com a estrutura dessas substâncias, pois

apresentam regiões hidrofílicas e hidrofóbicas que geralmente confere um caráter

anfipático. Esta característica permite que os lipídios fenólicos sejam facilmente

incorporados em membranas celulares, causando mudanças em sua estrutura e

propriedades. O efeito estabilizador dos lipídios fenólicos e derivados em

membranas também é o resultado da interação dos grupos hidroxílicos do anel

aromático com fosfolipídios por meio de ligações de hidrogênio. As cadeias

alquílicas também exercem influência significativa na atividade biológica, esta

influência pode estar relacionada com o aumento da solubilidade das porções

fenólicas nas regiões lipídicas, nas quais é requerida proteção contra degradação

biológica ou oxidação química (CORREIA; DAVID; DAVID, 2006).

Além do lipídio fenólico identificado dentre os compostos presentes nos óleos

fixos, destacam-se também outros constituintes que apresentam atividades


biológicas importantes, entre eles estão o esteroide γ-sitosterol que apresenta

atividade anti-hiperglicêmica (BALAMURUGAN; DURAIPANDIYAN; IGNACIMUTHU,

2011), o triterpeno lupeol que possui diversas atividades farmacológicas dentre elas

estão as atividades anti-inflamatória e antimicrobiana (SIDDIQUE; SALEEM, 2011).

Destacam-se também os terpenoides β-amirina e friedelina que apresentaram efeito

antinociceptivo no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético

(FILHO, 2000 e NOLDIN; ISAIAS; FILHO, 2006).

5.3. Caracterização estrutural das substâncias St-01, St-02 e St-03

Caracterização parcial da substância St-01

A substância St-01 (4,8 mg) apresentou-se como um precipitado amorfo com

a coloração marrom claro e solúvel em dimetilsulfóxido (DMSO). A partir dos dados

obtidos de RMN 13C e 1H (Tabela 13, p.94) foi possível propor a estrutura (Figura 19,

p.90) denominada 2,4,6-trihidroxi-4-(hidroximetil)ciclohexa-2,5-dien-1-ona.

O espectro de RMN de 13C/DEPT Q (125 MHz, DMSO) (Figura 20, p.91)

revelou a presença de seis sinais, sendo que um destes sinais corresponde a dois

carbonos, totalizando assim sete carbonos. Dentre estes sinais, quatro são

referentes a carbonos não hidrogenados, dois a carbonos metínicos (CH) e um a

carbono metilênico (CH2). Os C-2 (δ 168,08) e C-6 (δ 172,38) apesar de estarem no

mesmo ambiente químico apresentam valores de deslocamentos diferentes, tal

diferença pode estar relacionada com dois efeitos, o primeiro é a provável quelação

entre a hidroxila do C-6 e a carbonila, o que iria conferir ao C-6 um efeito de

desproteção, aumentando assim o valor do deslocamento; já o segundo efeito seria

o equilíbrio tautomérico entre a cetona e o grupo enol, esse efeito explicaria o fato

dos valores de deslocamento dos C-1 (δ 174,65), C-2 (δ 168,08) e C-3 (δ172,38)

estarem próximos um do outro.

O espectro de RMN de 1H de St-01 (Figuras 21 e 22, p. 91 e 92) apresentou

um sinal para dois hidrogênios ligados a carbonos metínicos em δH 4,90 (s, H-3 e H-

5); três sinais para hidrogênios de hidroxila δH 7,14 (s, H-2 e H-6), δH 3,70 (s, H-7) e

δH 3,17 (s, H-4); e dois hidrogênios ligados a um carbono metilênico δH 3,01 (d, J =

17,4 Hz, H-7) e δH 2,42 (d, J = 17,4 Hz, H-7). Os sinais dos hidrogênios (δH 3,01 e


2,42) ligados ao C-7 possuem valores de deslocamento diferentes, tal diferença

pode ser justificada pela posição destes hidrogênios no espaço e, por serem

considerados enantiotópicos, ou seja, estão ligados a um carbono pró-quiral, pois

ele se tornará centro de quiralidade (um carbono assimétrico) caso um desses

hidrogênios seja substituído por qualquer outro átomo ou grupo de átomos.

Figura 19. Estrutura proposta para St-01

OH

O

OH OH

HOH

H

12

34 5

6

7

A correlação entre os hidrogênios observada no espectro COSY (Figura 23 e

24, p. 92 e 93) confirmou o acoplamento entre os sinais em δH 3,01 (H-7) com δH

2,42 (H-7), conforme mostra a tabela 13, p.94.

Através do experimento de HSQC (Figura 25, p. 93) foi possível fazer as

seguintes correlações entre o δH 4,90 (H-3 e H-5) com δC 82,31 (C-3 e C-5); δH 2,42

(H-7) e δH 3,03 com δC 41,87.

No espectro de HMBC (Figura 26, p.94) observou-se as seguintes correlações

δH 2,42 (H-7) com δC 82,31 (C-3 e C-5) e δC 79,28 (C-4), e do δH 3,01 (H-7) com o δC

79,28 (C-4) (Figura 22, p.90).


Figura 20. Espectro de RMN de 13C/DEPT Q de St-01 (DMSO, 125 MHz)

Figura 21. Espectro de RMN de 1H de St-01 (DMSO, 500 MHz)


Figura 22. Expansão do espectro de RMN de 1H δ 2,0-5,2 de St-01 (DMSO, 500

MHz)

Figura 23. Espectro de correlação 1H x1H- COSY de St-01 (DMSO, 500 MHz);


Figura 24. Expansão do espectro de correlação 1H x1H- COSY de St-01 (DMSO,

500 MHz)

Figura 25. Espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de St-01 (DMSO, 500 MHz, 125 MHz)


Figura 26. Espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de St-01 (DMSO, 500 MHz, 125

MHz.

Tabela 13. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (125 MHz) referentes à substância

St-01

Posição 1H x 13C – HMQC 1H x 13C – HMBC

1H x 1H –

COSY

C C H 2JCH 3JCH

1 174,65 - - - -

2 168,08 - - - -

4 79,28 Ha-7

Hb-7

6 172,38 - - - -

CH

3 82,31 4,90 - Ha-7 -

5 82,31 4,90 - - -

CH2

7 41,87 H: 2,42 (d, J = 17,4 Hz)

- - H7

H: 3,03 (d, J = 17,4 Hz) H7


Com base nos dados espectrais propõe-se que St-01 trata-se da 2,4,6-

trihidroxi-4-(hidroximetil)ciclohexa-2,5-dien-1-ona, não foram encontrados relatos de

isolamento para a substância proposta. No entanto, foi encontrado dados na

literatura do isolamento de derivados do quinol da espécie Ajuga parviflora (AKBAR;

NAWAZ; MALIK, 2001) que apresenta algumas semelhanças estruturais com a

substância St-03 (Figura 27, p.95), a estrutura do composto 2 apresenta uma

estrutura que mais aproxima-se da estrutura proposta para St-01, porém seus dados

de RMN 13C e 1H não são iguais aos dados de RMN de St-01 (Tabela 14, p.95).

Figura 27. Derivados do quinol isolados da espécie Ajuga parviflora.

O

R1OR2

R3

1

12

345

6

O

OH CH2COOH

2

12

345

6

Composto 1: R1 = CH3; R2 = β-D-glucopiranosídeo; R3 = OH Composto 1a: R1 = CH3; R2 = H; R3 = OH

Tabela 14. Dados de RMN de 1H (400 MHz) e 13C (100 MHz) em CDCl3 referentes ao composto 2 (AKBAR; NAWAZ; MALIK, 2001).

Posição 1H x 13C – HMQC

C C H

1 186,5 -

4 73,2 -

1’ 179,2 -

CH

2 128,3 6,41 (d, J = 10,5 Hz)

3 148,1 6,94 (d, J = 10,5 Hz)

5 148,1 6,94 (d, J = 10,5 Hz)

6 128,3 6,41 (d, J = 10,5 Hz)

CH2

2’ 43,2 2,71 (s)


Os quinóis e seus derivados são compostos que apresentam poucos estudos

relatados na literatura, porém os poucos estudos demonstram que trata-se de uma

classe de substância promissora na busca de novas moléculas bioativas. Os quinóis

estão se desenvolvendo como uma classe de compostos com potencial anticâncer e

também têm mostrado atividade contra o parasita Trypanosoma brucei, o organismo

causador da doença do sono ou tripanossomíase africana (CAPES et al., 2012).

Caracterização estrutural da substância St-02 A substância St-02 (93,2 mg) foi isolada com aparência de pó amarelo,

solúvel em metanol. O ponto de fusão foi medido, apresentando 177 – 179 ºC. A

substância apresentou fluorescência sob luz ultravioleta no comprimento de onda de

254 e 365 nm e Rf: 0,58 no sistema de eluição acetato de etila: metanol (75:25).

A análise das bandas de absorção na região do ultravioleta da substância St-

02 em solução metanólica foi realizada a partir das leituras das absorbâncias obtidas

nos comprimentos de onda 220 a 400 nm. A partir dos dados obtidos plotou-se um

gráfico da absorbância versus o comprimento de onda (Figura 28, p.97). O perfil UV-

vis da substância apresentou absorções em 258 e 358 nm, indicativo da presença

de flavonoide. Estudos sobre flavonoides por espectrofotometria UV revelaram que a

maioria das flavonas e flavonóis exibem duas grandes bandas de absorção: Banda I

(320-385 nm) que representa a absorção anel B, enquanto Banda II (250-285 nm)

correspondente à absorção do anel A (YAO et al., 2004). Com esses resultados e

através da comparação com os dados da literatura foi possível supor que a

substância tratava-se do flavonol denominado rutina, pois este flavonoide possui os

seguintes valores nas bandas de absorção 258 e 354 nm (MOURA; VILEGAS;

SANTOS, 2011).


Figura 28. Gráfico com os picos de absorção da substância St-02 na região do

ultravioleta.

O espectro obtido na região do infravermelho da substância St-02 (Figura

29, p.97 e 98) exibiu bandas de absorção que sugeriram a presença dos seguintes

grupos funcionais que são característicos das estruturas dos flavonoides: hidroxila

(3428 cm-1), ligações carbono-hidrogênio (2937 cm-1), carbonila quelada (1654 cm-1),

ligação simples carbono-oxigênio (1204 cm-1) e a presença de anel aromático (1598

e 1457 cm-1). Os dados obtidos no experimento foram comparados com os dados da

literatura (MOURA; VILEGAS; SANTOS, 2011).

Figura 29. (A) Espectro na região do infravermelho (IV) de St-02 em pastilha de KBr; (B) e (C) Expansões do espectro do IV.

A


B

C


Os dados obtidos através dos espectros de RMN foram comparados com os

dados da literatura (OLIVEIRA et al., 2013), como pode ser observado na tabela 15,

p. 106-107. Diante dos dados obtidos no RMN, no UV e no IV foi possível identificar

que a substância St-02 tratava-se de um flavonol denominado de rutina (quercetina

3-O-α-L-ramnopiranosil(1’’’→ 6’’)-β-glucopiranosídeo) (Figura 30, p.99).

Figura 30. Estrutura química de St-02.

A análise do espectro de RMN de 1H (Figuras 31, 32 e 33, p.101-102) da

substância mostrou cinco sinais para hidrogênios aromáticos. Os dois dupletos em

δH 6,21 (J=1,95 Hz, 1H) e 6,39 (J=1,92 Hz, 1H) foram atribuídos aos hidrogênios H-6

e H-8, do anel A, respectivamente. Os dupletos em δH 7,67 (J=1,98 Hz, 1H) e 6,87

(J=8,43 Hz, 1H) e o duplo dubleto δH 7,61 (J=8,43 e 2,04 Hz, 1H) correspondem aos

hidrogênios H-2’, H-5’ e H-6’, do anel B, respectivamente. Observou-se ainda sinais

múltiplos na região entre δH 3,25 a 3,81 que sugerem a presença de duas unidades

glicosídicas. O dupletos em δH 5,10 (J=7,4 Hz, d) e 4,52 (J=1,0 Hz, d) foram

assinalados para hidrogênios anoméricos H-1’’ e H-1’’’. A primeira unidade

glicosídica foi identificada como glicose devido a presença de um dupleto referente


aos hidrogênios metilênicos em δH 3,81 e 3,40. E o dupleto em δH 1,12 (J=6,2 Hz,

3H) assinalado para hidrogênios metílicos indicam a ramnose como segunda

unidade glicosídica.

O espectro de RMN de 13C (Figura 34, p.102) apresentou vinte e sete sinais.

Através do experimento DEPT 135 (Figura 35, p.103) identificou-se quinze carbonos

metínicos e um carbono metilênico. O espectro apresentou também sinais

característicos para os carbonos anoméricos das duas unidades glicosídicas (δC

104,88 e 102,57), verificou-se ainda um sinal de carbono metilíco em δC 18,02 (C-

6’’’) confirmando a presença da unidade glicosídica da ramnose.

No espectro COSY (Figura 36, p.103) confirmaram-se os acoplamentos orto

entre o δH 6,87 (H-5’) com δH 7,61 (H-6’). Foi possível também observar as várias

correlações referentes a acoplamentos vicinais entre os hidrogênios da porção

osídica.

No HSQC (Figuras 37 e 38, p.104) mostrou correlações diretas do δH 5,10 (H-

1’’) com δC 104,88 e δH 4,52 (H-1’’’) com δC 102,57 justificando a presença de duas

unidades glicosídicas. Foi possível também identificar outras correlações diretas de

δH 7,61 (H-6’) com δC 123,71; δH 7,67 (H-2’) com δC 117,85; δH 6,87 (H-5’) com δC

116,22; δH 6,21 (H-6) com δC 100,19; δH 6,39 (H-8) com δC 95,08.

Com as correlações apresentadas no espectro de HMBC (Figuras 39 e 40,

p.105) entre δH 5,10 (H-1’’) com δC 135,77 (C-3) e δH 4,52 (H-1’’’) com δC 68,72 (H-

6’’) foi possível identificar a posição das unidades glicosídicas e ainda outros grupos

como por exemplo δH 6,39 (H-8) com δC 158,68 (C-9). As correlações entre δH 7,61 e

7,67 (H-6’ e H 2’) com δC 159,47 (C-2), sendo esta última correlação a única que não

foi condizente com o da literatura consultada (OLIVEIRA, 2013). A figura 40, p.105,

mostra as principais correlações na estrutura que ajudaram identificar a posição das

unidades glicosídicas e de outros grupos.


Figura 31. Espectro de RMN de 1H de St-02 (MeOD, 300 MHz).

Figura 32. Expansão do espectro de RMN de 1H δ 4,5-7,8 de St-02 (MeOD, 300

MHz).


Figura 33. Expansão do espectro de RMN de 1H δ 3,2-3,9 de St-02 (MeOD, 300

MHz)

Figura 34. Espectro de RMN de 13C de St-02 (MeOD, 75 MHz).


Figura 35. Espectro de RMN DEPT 135 de St-02 (MeOD, 75 MHz).

Figura 36. Espectro de correlação 1H x 1H - COSY de St-02 (MeOD, 300 MHz).


Figura 37. Espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de St-02 (MeOD, 300 MHz e 75 MHz).

Figura 38. Expansão do espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de St-02 (MeOD, 300 MHz e75 MHz).


Figura 39. Espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de St-02 (MeOD, 75 MHz e 50 MHz).

Figura 40. Expansão do espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de St-02 (MeOD,

75 MHz e 50 MHz).

106 zz


106

Tabela 15. Comparação dos dados de RMN de 1H (300 MHz) e 13C (75 MHz) referentes à substância St-02 com dados da literatura.


1H x 1H –

COSY

1H x 13C – HMQC

Rutina*

C C H 2JCH 3JCH C H

2 159,47 - - H-2’, H-

6’ - 158,69 -

3 135,77 - - H-1’’ - 136,72 -

4 179,54 - - - - 179,61 -

5 163,11 - H-6 - - 162,17 -

7 166,40 - H-8, H-6 - - 167,19 -

9 158,68 - H8 - - 159,51 -

10 105,73 - - H-6, H-8 - 106,06 -

1’ 123,29 - H-2’, H-6’ H-5’ - 123,30 -

3’ 145,99 - H-2’ H-5’ - 146,02 -

4’ 149,96 - H-5’ H-2’, H-

6’ - 150,45 -

CH

6 100,19 6,21 (d, J = 1,95) - H-8 - 100,10 6,22 (d, J=2,0 Hz)

8 95,08 6,39 (d, J = 1,92) - H-6 - 95,01 6,41 (d, J=2,0 Hz)

2’ 117,85 7,67 (d, J = 1,98) - H-6’ - 117,84 7,67 (d, J=2,0 Hz)

Continua


Continuação (Tabela 15)

5’ 116,22 6,87 (d, J = 8,43) - - - 116,22 6,88 (d, J=8,5 Hz)

6’ 123,71 7,61 (dd, J = 2,04; 8,43) H-5’ H-2’ - 123,70 7,63 (dd, J=2,0 e 8,5 Hz)

1’’ 104,88 5,10 (d, J = 7,41) - - - 104,85 5,11 (d, J=7,8 Hz)

2’’ 75,88 3,25-3,64 (m) - - - 75,90 3,26-3,48 (m)

3’’ 77,37 3,25-3,64 (m) - - - 77,41 3,26-3,48 (m)

4’’ 71,56 3,25-3,64 (m) - - - 71,57 3,26-3,48 (m)

5’’ 78,35 3,25-3,64 (m) - - - 78,36 3,26-3,48 (m)

1’’’ 102,57 4,52 (d, J = 0,99) - - - 102,58 4,52 (d, J = 1,8 Hz)

2’’’ 72,25 3,64 (dd, J = 1,5; 3,15) H-1’’’ - - 72,27 3,63 (dd, J = 1,8; 3,5)

3’’’ 72,41 3,53 (dd, J = 3,36; 9,42) - H-1’’’ - 72,41 3,54 (dd, J = 3,5; 9,5 Hz)

4’’’ 74,10 3,27 (m) H-5’’’ H-2’’’ - 74,10 3,27 (m)

5’’’ 69,86 3,40 (m) H-4’’’, H-6’’’, H-3’’’ H-1’’’ - 70,59 3,44 (m)

CH2

6’’ 68,72 α: 3,36 (m)

β: 3,81 (d, J = 10,32) - H-1’’’ - 68,72

α: 3,39 (m)

β: 3,81 (dt, J = 10,9)

CH3 -

6’’’ 18,02 1,12 (3H, d, J = 6,18) - - - 18,02 1,12 (3H, d, J = 6,1 Hz)

108 zz


108

O espectro de massas (Figura 41, p.108) da substância obtido por impacto

eletrônico foi analisado com objetivo de confirmar a massa da substância St-02. No

entanto, não foi possível observar o pico do íon molecular com razão massa/carga

(m/z) de 610, mas observou-se o pico do íon molecular em 302, confirmando assim

a aglicona do flavonoide proposto, como sendo a quercetina.

Figura 41. Espectro de massas da St-02

Relatos na literatura descrevem o isolamento da quercetina e de seus

derivados nos seguintes gêneros da família Anacardiaceae: Lanea, Schinus,

Sclerocaya, Pistacia, e Schinus. A rutina já foi identificada na espécie Rhus corlaria

(LOO; BRUYN; VERZELE, 1988), nas espécies Spondias tuberosa e Spondias

mombin a rutina foi identificada e isolada (SILVA et al., 2011).

O isolamento da rutina da fração metanólica justifica as atividades

antibacteriana e antioxidante, e os altos teores de fenóis e flavonoides apresentados

por esta fração.

109 zz


109

Caracterização estrutural da substância St-03

A substância St-03 (14,6 mg) foi isolada com aparência de resina de cor

amarela, solúvel em clorofórmio. A substância apresentou fluorescência sob luz

ultravioleta no comprimento de onda de 254 nm e Rf: 0,64 no sistema de eluição

clorofórmio: acetato de etila (75:25). A partir dos dados obtidos de RMN de 13C e 1H

foi possível propor a estrutura (Figura 42, p.109) denominada Trans-p-cumarato de

eicosanila. Os dados (Tabela 16, p.118) foram comparados com os dados da

literatura (MAHMOOD et al., 2003).

Figura 42. Estrutura proposta para a substância St-03

O-CH2-(CH2)18-CH3

OH

OH

H

H

H

H

H

6

2

3

4

57

89 1' 2' - 19' 20'

1

Na análise do espectro de RMN de 1H (Figuras 43, 44, 45 e 46, p. 111-112) da

substância observou-se um duplo dupleto em δH 7,41 e 6,82 sugerindo a presença

de um anel aromático 1,4-dissubstituído. O dupleto δH (7,41; J=5,0 Hz) foi atribuído

aos hidrogênios H-2 e H-6; já o dupleto em δH (6,82; J=5,0 Hz) atribuiu-se aos

hidrogênios H-3 e H-5. Os dois dupletos em δH (7,64 e 6,28) correspondem aos

hidrogênios olefínicos H-7 e H-8, a constante de acoplamento de 15,0 Hz entre os H-

7 e H-8 confirmou a geometria trans da molécula. O próton H-7, ligado ao carbono

que carrega o anel fenila, apresenta maior deslocamento químico (δ 7,64), uma vez

que este reside no carbono-β mais pobre de elétrons do sistema α, β-insaturado,

além de estar em uma área desblindada no campo anisotrópico gerado pelos

elétrons 𝜋 do anel aromático Foi observada ainda a presença de um tripleto

correspondente a um carbono metilênico ligado a um átomo de oxigênio (-OCH2) em

δ 4,18 (J=5,0 Hz), um tripleto em δ 0,86 (J=5,0 Hz) que sugeriu a presença de uma


metila ligada a um carbono metilênico e sinais de prótons ligados a carbonos

metilênicos na região entre δH 2,38-1,24 Hz.

O espectro de RMN de 13C (Figuras 47 e 48, p.113) apresentou vinte e nove

sinais dentre eles um sinal em δ 167,55 correspondente a uma carbonila de éster.

Através do experimento DEPT Q (Figura 49, p.114) foi possível identificar cinco

carbonos metínicos, sendo um sinal duplicado, dezenove carbonos metilênicos e um

carbono metílico.

No espectro COSY (Figura 50, p.114) confirmou-se os acoplamentos entre o

δH 6,82 (H-3) com δH 7,41 (H-2) e δH 6,28 (H-8) com δH 7,64 (H-7). Foi possível

também observar as várias correlações referentes a acoplamentos vicinais entre os

hidrogênios metilênicos.

O espectro de HSQC (Figuras 51 e 52, p.115) apresentou correlações diretas

entre o δH 7,64 e δC 144,95; δH 7,41 e δC 129,92; δH 6,82 e δC 115,86; e por fim o δH

6,28 correlacionando com o δC 114,95.

Com as correlações apresentadas no espectro de HMBC (Figuras 53, 54 e 55

p.116-117) entre os hidrogênios δH 4,16 (H-1’), 7,64 (H-7) e 6,28 (H-8) com o

carbono δC 167,55 (C-9) foi possível confirmar a posição da carbonila; já os

hidrogênios δH 7,41 (H-2 e H-6) e δH 6,82 (H-3 e H-5) correlacionaram com o

carbono δC 157,78 (C-4), sendo assim possível confirmar os valores de

deslocamento dos átomos de carbono e hidrogênio do anel aromático. Foi possível

também confirmar os deslocamentos dos últimos carbonos da cadeia alquílica

através da correlação do hidrogênio δH 0,82 (H-20) com o carbono δC 22,70 (C-29) e

δH 1,24 (C-19) com o δC 14,13 (C-20).

111 zz


111

Figura 43. Espectro de RMN de 1H de St-03 (CDCl3, 500 MHz). Figura 44. Expansão do espectro de RMN de 1H δ 6,1-7,5 de St-03 (CDCl3, 500 MHz).


Figura 45. Expansão do espectro de RMN de 1H δ 1,9-4,3 de St-03 (CDCl3, 500 MHz).

Figura 46. Expansão do espectro de RMN de 1H δ 0,65-1,85 de St-03 (CDCl3, 500 MHz).

113 zz


113

Figura 47. Espectro de RMN de 13C de St-03 (CDCl3, 125 MHz).

Figura 48. Expansão do espectro de RMN de 13C δ 110-180 de St-03 (CDCl3, 125 MHz).

114 zz


114

Figura 49. Espectro RMN de DEPT Q de St-03 (CDCl3, 125 MHz).

Figura 50. Espectro de correlação 1H x 1H - COSY de St-03 (CDCl3, 500 MHz).


Figura 51. Espectro de correlação 1H x 13C - HSQC de St-03 (MeOD, 500 MHz e 125 MHz).

Figura 52. Expansão do espectro de correlação 1H x 13C - HSQC de St-03 (MeOD, 500 MHz e 125 MHz).


Figura 53. Espectro de correlação 1H x 13C - HMBC de St-03 (CDCl3, 500 MHz e 125 MHz).

Figura 54. Expansão do espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de St-03 (MeOD, 500 MHz e 125 MHz).


Figura 55. Expansão do espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de St-03 (MeOD, 500 MHz e 125 MHz).


Tabela 16. Comparação dos dados de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (125 MHz) referentes à substância St-03 com dados da literatura.


1H x 1H –

COSY

1H x 13C – HMQC

Eicosanil trans-p-cumarato *

C C H 2JCH 3JCH C H

1 127,73 - - H-3, H-5 e H-8 - 125,84 -

4 157,78 - H-3 e H-5 H-2 e H-4 - 157,72 -

9 167,55 - H-8 H-7 e H-1’ - 167,44 -

CH

2 129,92 7,41 (d, J = 5,0 Hz) - H-6 e H-7 H-3 130,68 7,42 (d, J = 8,2 Hz)

3 115,70 6,82 (d, J = 5,0 Hz) - H-5 H-2 115,70 6,83 (d, J = 8,2 Hz)

5 115,70 6,82 (d, J = 5,0 Hz) - H-3 H-6 115,70 6,83 (d, J = 8,2 Hz)

6 129,92 7,41 (d, J = 5,0 Hz) - H-2 e H-7 H-5 130,68 7,42 (d, J = 8,2 Hz)

7 144,95 7,64 (d, J = 15,0 Hz) - H-2 e H-6 H-8 144,24 7,62 (d, J = 17,0 Hz)

8 114,95 6,28 (d, J = 15,0 Hz) - - H-7 114,83 6,30 (d, J = 17,0 Hz)

CH2

1’ 64,65 4,16 (t, J = 5,0 Hz) - - - 64,65 4,18 (t, J = 6,5 Hz)

2’ 28,77 1,6 (m) - - - 28,75 1,68 (m)

3’ – 17’ 29,08 – 29,71 1, 23 (m) - - - 29,35 -29,69 1,25 (m)

18’ 31,94 1,23 (m) H-19 H-20 - 31,92 1,25 (m)

19’ 22,70 1,23 (m) H-18 e H-20 - - 22,68 1,25 (m)

20’ 14,13 0,86 (t, J = 5,0 Hz) H-19 - - 14,11 0,87 (t, J = 6,5 Hz)

Trans-p-cumarato de eicosanila *: Valores da literatura (MAHMOOD et al.,2003)


Diante dos dados de RMN uni e bidimensionais e da comparação com os

dados da literatura foi possível propor que a substância st-03 tratava-se de um éster

do ácido p-cumárico denominado Trans-p-cumarato de eicosanila, porém ainda há

dúvida em relação ao tamanho real da cadeia alquílica, para a confirmação do

tamanho da cadeia faz-se necessária a realização do experimento de espectrometria

de massas.

Há relatos na literatura que já foram isolados da espécie Tapirira guianensis

(Anacardiaceae) outros ésteres derivados do ácido p-cumárico (CORREIA; DAVID;

DAVID, 2003), porém não foi encontrado nenhum relato do isolamento desse éster

na espécie Spondias tuberosa.


5.4. Determinação de fenóis e flavonoides totais

A determinação do teor de fenóis totais foi realizado utilizando o reagente de

Folin-Ciocalteau, este reagente consiste na mistura dos ácidos fosfomolíbdico e

fosfotunguístico, no qual o molibdênio e o tungstênio encontram-se no estado de

oxidação 6+ (cor amarela), porém na presença de certos agentes redutores, como os

compostos fenólicos, formam-se os chamados molibdênio azul e tungstênio azul,

nos quais a média do estado de oxidação dos metais está entre 5+ e 6+, e cuja

coloração permite a determinação da concentração das substâncias redutoras, que

não necessariamente precisam ter natureza fenólica. O ácido gálico, por exemplo,

um composto fenólico, sofre desprotonação em meio básico, gerando os ânions

fenolatos (Figura 56, p.120). A partir daí, ocorre uma reação de oxirredução entre o

ânion fenolato e o reagente de Folin-Ciocalteau, na qual o molibdênio, componente

do reagente, sofre redução e o meio reacional muda de coloração amarela para azul

(ARAÚJO, 2013). O resultado deste experimento foi expresso em miligramas de

equivalente de ácido gálico por grama da amostra (mg EqAG/g).

Figura 56. Reação do ácido gálico com molibdênio presente no regente Folin-Ciocalteau

COOH

OH

OH

OH

Na2CO

3

COO-

OH

OH

OH

COO-

OH

OH

OH

+ 2 Mo6+

COO-

O

OH

OH

2 Mo5++ + 2H+


Dentre os compostos fenólicos destacam-se os flavonoides por apresentarem

diversas atividades biológicas importantes, diante disto fez-se necessária uma

quantificação específica para esta classe. Para tanto utilizou-se um método

colorimétrico com cloreto de alumínio (AlCl3) para tratamento das amostras a serem

analisadas. Isto porque o cátion Al3+ forma complexos estáveis com as hidroxilas

livres dos flavonoides (Figura 57, p.121), ocasionando extensão do sistema

conjugado e, consequentemente, um desvio batocrômico, ou seja, um deslocamento

dos seus máximos de absorção para regiões de maior comprimento de onda

(MARQUES et al., 2012). O resultado deste ensaio foi expresso em miligramas de

equivalentes de catequina por grama da amostra (mg EqC/g).

Figura 57. Complexo Flavonoide-Al3+

O

O

O

O O

OH

Al3+

Al3+

Al3+

H

H

O teor de fenóis e flavonoides totais das amostras estudadas está descrito na

tabela 17, p.122. Nos resultados da determinação do teor de fenóis totais pode-se

observar que o extrato etanólico dos talos apresentou maior quantidade de

compostos fenólicos (459,2 ± 21,07 mg EqAG/g), já na quantificação de flavonoides

totais destacou-se a fração St-MeOH dos talos com 129,00 ± 4,91 mg EqC/g.

O isolamento do éster do ácido p-cumárico da fração acetato de etila dos

talos justifica o alto teor de fenóis também apresentado por essa fração (314,50 ±

3,06 mg EqAG/g).


Tabela 17. Determinação de fenóis totais e flavonoides totais do extrato etanólico

(St-EtOH), hexânico (St-Hex1) e as frações (St-Hex, St-CHCl3, St-AcOEt e St-

MeOH) das cascas, folhas e talos.

Amostra Fenóis totais (mg EqAG/g)

Flavonoides totais (mg EqC/g)

Cascas

St-Hex1 34,53 ± 11,02 nd

St-EtOH 281,20 ± 10,58 82,35 ± 2,04

St-Hex 33,87 ± 1,16 nd

St-CHCl3 27,20 ± 8,00 nd

St-AcOEt 191,90 ± 6,43 23,02 ± 1,02

St-MeOH 355,2 ± 19,08 71,91 ± 4,54

Folhas

St-Hex1 37,87 ± 3,06 nd

St-EtOH 100,50 ± 12,06 70,36 ± 1,39

St-Hex 18,53 ± 4,16 11,25 ± 4,02

St-CHCl3 33,87 ± 6,43 nd

St-AcOEt 67,87 ± 16,17 37,24 ± 2,52

St-MeOH 181,2 ± 10,58 64,35 ± 1,68

Talos

St-Hex1 20,53 ± 2,31 33,25 ± 17,52

St-EtOH 459,20 ± 21,07 97,69 ±1,92

St-Hex 33,20 ± 4,00 nd

St-CHCl3 17,20 ±0,00 0,80 ±3,46

St-AcOEt 314,50 ± 3,06 66,36 ± 3,42

St-MeOH 445,90 ± 103,2 129,00 ± 4,91 *nd: não determinado


5.5. Atividade Antioxidante – Sequestro do radical DPPH (2,2-difenil-1- picrilhidrazil) e a Co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico

A molécula de DPPH é caracterizada como um radical livre estável em virtude

da deslocalização do elétron desemparelhado por toda a molécula. Esta

deslocalização confere a esta molécula uma coloração violeta, caracterizada por

uma banda de absorção em etanol em cerca de 520 nm. Este ensaio se baseia na

medida da capacidade antioxidante de uma determinada substância em sequestrar o

radical DPPH, reduzindo-o a hidrazina (Figura 58, p.123). Quando uma determinada

substância que age como doador de átomos de hidrogênio é adicionada a uma

solução de DPPH, a hidrazina é obtida com mudança simultânea na coloração de

violeta a amarelo pálido (ALVES et al., 2010), essa reação pode monitorada por

decréscimo de absorbância em espectrofotômetro.

Figura 58. DPPH na forma radicalar (I) e na forma reduzida (II).

NO2

O2N NO2

N

N

NO2

O2N NO2

N

N

H

III

A partir dos resultados obtidos no espectrofotômetro determina-se a

porcentagem de atividade antioxidante ou sequestradora de radicais livres e/ou

porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional. A porcentagem de

atividade antioxidante (%AA) corresponde à quantidade de DPPH consumida pelo

antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante necessária para decrescer a

concentração inicial de DPPH em 50% é denominada concentração eficiente (CE50),


também chamada de concentração inibitória (CI50). Quanto maior o consumo de

DPPH por uma amostra, menor será a sua CE50 e maior a sua atividade antioxidante

(SOUSA et al., 2007).

No método do sequestro do radical DPPH, a fase St-AcOEt dos talos

apresentou o menor valor de CE50 (4,38 ± 0,21) em relação aos demais extratos,

frações e padrões testados (Tabela 18, p. 127). Este resultado pode estar

correlacionado com a quantidade significativa de fenóis (314,50 ± 3,06 mg EqAG/g)

e flavonoides (66,36 ± 3,42 mg EqC/g) encontrados nesta fração, tal atividade

também pode estar relacionada com o isolamento da substância Trans-p-cumarato

de eicosanila. A literatura descreve que este éster apresenta uma atividade

moderada no sequestro do radical DPPH, no qual 100 µg desta substância

apresenta uma atividade de 88,46% (SHAHEEN, 2011). Os compostos fenólicos

apresentam excelente atividade frente a este ensaio, tal atividade desses compostos

fenólicos deve-se principalmente às suas propriedades redutoras e estrutura

química. Estas características desempenham um papel importante na neutralização

ou sequestro de radicais livres e quelação de metais de transição, agindo tanto na

etapa de iniciação como na propagação do processo oxidativo. Os intermediários

formados pela ação de antioxidantes fenólicos são relativamente estáveis, devido à

ressonância do anel aromático presente na estrutura destas substâncias (SILVA et

al., 2007). Outra fração que também destacou-se no sequestro do radical livre

(DPPH) foi a fração metanólica das folhas (CE50 27,83 ± 1,12) tal atividade pode ser

justificada pelo flavonoide que foi isolado desta fração. A rutina apresentou um valor

de CE50 (7,95 ± 0,83) menor que o padrão BHT (CE50 9,56 ± 1,09). A atividade

antioxidante dos flavonoides está altamente relacionada à capacidade de doação de

elétrons. A etapa de transferência do hidrogênio tem se destacado, mas a atividade

antioxidante não depende apenas da força de energia da ligação O-H (SCOTTI et

al., 2007).

Estudos cinéticos avaliaram a capacidade antioxidante de substâncias de

derivados de flavonoides e observaram que a atividade antioxidante é potencializada

quando há grupos hidroxilas adjacentes no anel B (posições 3‘e 4‘), dupla ligação

C2-C3, conjugada ao grupo 4-oxo (C4), no anel C e presença de grupo hidroxila no

C3 do anel C. As hidroxilas em C5 e C7 do anel A são menos importantes para a

atividade antioxidante (Figura 59, p.125) (PANNALA et al., 2007). Sendo assim, essa

relação estrutura-atividade justifica a atividade da rutina, uma vez que a rutina


possui os substituintes importantes para a apresentar atividade antioxidante.

Figura 59. Relação estrutura-atividade de flavonol e flavona. Legenda: Em verde -

substituintes menos importantes à atividade antioxidante; Em vermelho -

substituintes importantes à atividade antioxidante.

O

O

R1

R2

OH

OH

R3R1, R2, R3 = H ou OH

Fonte: SCOTTI et al., 2007.

O método de co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico (Figura 60, p.

126) permite avaliar a capacidade de uma determinada substância prevenir a

oxidação do β-caroteno, protegendo-o dos radicais livres gerados durante a

peroxidação do ácido linoleico. A reação pode ser monitorada por espectrofotômetro

pela perda da coloração do β-caroteno em 470 nm. O β-caroteno é o mais

abundante dos carotenoides e largamente utilizado em terapias. É quase

completamente insolúvel em água, mas facilmente solúvel em ambientes

hidrofóbicos e solventes pouco polares. Tem sido reportado nos últimos 30 anos que

o β-caroteno exibe alta reatividade com eletrófilos e oxidantes. Muitos estudos têm

demonstrado que ele inibe a auto-oxidação de lipídios em tecidos biológicos e

produtos alimentícios, porém poucos detalhes da cinética e mecanismo destas

reações têm sido revelados.

No método da inibição da co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico,

a fração St-CHCl3 das folhas exibiu expressiva atividade (64,95% ± 15,29)

comparada ao padrão ácido ascórbico (10,61 ± 2,28). Este resultado pode ser

justificado por se tratar de uma fração que apresenta caráter lipofílico, e ainda pelo

resultado positivo na triagem fitoquímica para mono e diterpenos, triterpenos e


esteroides, uma vez que esse método de avaliação da atividade antioxidante é mais

sensível a amostras de alta lipofilicidade, conforme descrito na literatura (WANNES

et al., 2010).

Figura 60. Estrutura do β-caroteno (I) e do ácido linoleico (II)

COOH

I

II


Tabela 18. Atividade antioxidante in vitro do extrato etanólico (St-EtOH), hexânico

(St-Hex1) e as frações (St-Hex, St-CHCl3, St-AcOEt e St-MeOH) das cascas, folha,

talos e padrões (ácido ascórbico, BHA e BHT).

Amostra DPPH

(CE50, µg/mL)

β-caroteno

(% AA)

Cascas

St-Hex1 Nd nd

St-EtOH 9,37 ± 0,20 0,18 ± 2,01

St-Hex Nd nd

St-CHCl3 Nd nd

St-AcOEt 9,16 ± 0,12 nd

St-MeOH 7,81 ± 0,52 6,50 ± 3,68

Folhas

St-Hex1 461,4 ± 318,2 nd St-EtOH 50,22 ± 0,78 52,52 ± 5,27

St-Hex Nd 2,18 ± 3,39

St-CHCl3 40,01 ± 1,85 64,95 ± 15,29

St-AcOEt 71,59 ± 3,51 62,28 ± 9,51

St-MeOH 27,83 ± 1,12 14,88 ± 3,77

Substância St – 02 7,95 ± 0,83 17,35 ± 8,54

Talos

St-Hex1 102,20 ± 1,60 nd

St-EtOH 4,85 ± 0,07 1,59 ± 3,30

St-Hex Nd nd

St-CHCl3 Nd nd

St-AcOEt 4,38 ± 0,21 10,40 ± 0,58

St-MeOH 5,54 ± 0,12 nd

Padrões

Ácido ascórbico 5,08 ± 1,02 10,61 ± 2,28

BHA 5,55 ± 1,02 75,27 ± 9,25

BHT 9,56 ± 1,09 70,68 ± 2,49 *nd: não determinado


5.6. Atividade antibacteriana

Na atividade antibacteriana o extrato etanólico e a fração acetato de etila das

folhas apresentaram menores valores em relação aos demais extratos e frações

testadas. A concentração inibitória mínima foi de 0,195 mg/mL para a bactéria

Enterococcus faecalis, e a concentração bactericida mínima da fração acetato de

etila das folhas destacou-se entre as demais com a concentração de 0,78 mg/mL

também para a bactéria Enterococcus faecalis. Os baixos valores das concentrações

obtidos nos testes representam um ótimo resultado visto que corrobora com o uso

popular das folhas para combater a diarreia e disenteria, já que entre as espécies de

bactérias, uma das principais causadoras de infecção no homem é a Enterococcus

faecalis, representando cerca de 85% a 90% dos enterococos isolados na clínica. O

E. faecalis, além de ser o mais frequente, apresenta resistência natural a diversos

antimicrobianos (COSTA et al., 2010) (Tabelas 19, 20 e 21, p. 129-130).

O flavonoide isolado (rutina), mostrou-se mais eficiente frente as bactérias

Gram-negativas, como por exemplo, contra a bactéria Escherichia coli com

concentração inibitória mínima igual a 1mg/mL, este valor foi maior que o encontrado

na literatura para a rutina - CIM igual a 0,064 mg/mL (BASILE et al., 2000), no

entanto aproximou-se do valor obtido pela quercetina - CIM 0,5 mg/mL (TALEB-

CONTINI et al., 2003). A relação estrutura-atividade dos flavonoides foi descrita por

TALEB-CONTINI e colaboradores (2003), na qual observou-se que os flavonoides

que apresentaram atividade possuem na sua estrutura um grupo hidroxila nas

posições C7, C3 'e C4' e que apenas a quercetina que apresentou atividade contra

bactérias Gram-negativas possui na sua estrutura uma hidroxila na posição C3. No

entanto, é necessário estudo mais específico, a fim de compreender melhor o

mecanismo de ação da substância avaliada.


Tabela 19. Atividade antibacteriana de St-EtOH, St-AcOEt e St-MeOH das cascas de

Spondias tuberosa e do padrão Gentamicina.

Bactéria St-EtOH St-AcOEt St-MeOH Gentamicina

CIM CBM CIM CBM CIM CBM CIM CBM

Bacillus cereus 1,56 12,5 12,5 12,5 3,12 * 0,40 0,40

Enterococcus

faecalis

12,5 * 6,25 * 12,5 * 0,40 0,40

Escherichia coli 12,5 12,5 3,12 * 12,5 * 0,025 0,025

Klebsiella

pneumonia

12,5 12,5 * 12,5 12,5 *

Salmonela

choleraesuis

6,25 12,5 12,5 * 3,12 3,12 * 0,40

Serratia

marcescens

6,25 12,5 6,25 12,5 12,5 12,5 0,05 0,05

Shigella flexneri 6,25 6,25 6,25 12,5 3,12 12,5 0,05 0,05

Staphylococcus

aureus

12,5 12,5 12,5 12,5 6,25 12,5 * 0,025

Tabela 20. Atividade antibacteriana de St-EtOH, St-AcOEt, St-MeOH e St-2 das

folhas de Spondias tuberosa.

Bactéria St-EtOH St-AcOEt St-MeOH

Substância

St-2

CIM CBM CIM CBM CIM CBM CIM CBM

Bacillus cereus 6,25 * 6,25 12,5 12,5 * * *

Enterococcus faecalis 0,195 3,12 0,195 0,78 6,25 * 1,0 *

Escherichia coli 0,195 6,25 0,78 0,78 6,25 * * *

Klebsiella pneumonia 12,5 12,5 12,5 * * * 1,0 *

Salmonela

choleraesuis 12,5 * 6,25 12,5 12,5 12,5 * *

Serratia marcescens 12,5 * 12,5 12,5 12,5 * 1,0 1,0

Shigella flexneri 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 1,0 *

Staphylococcus

aureus 6,25 12,5 3,12 12,5 3,12 12,5 1,0 1,0

CIM: concentração inibitória mínima. CBM: concentração bactericida mínima. Os valores estão

expressos em mg/mL e indicam até qual concentração a amostra foi efetiva. (*): crescimento

bacteriano em todas as concentrações testadas.


Tabela 21. Atividade antibacteriana de St-EtOH, St-AcOEt e St-MeOH dos talos de

Spondias tuberosa.

Bactéria St-EtOH St-AcOEt St-MeOH

CIM CBM CIM CBM CIM CBM

Bacillus cereus 6,25 12,5 3,12 12,5 1,56 12,5

Enterococcus faecalis 3,12 12,5 1,56 1,56 12,5 *

Escherichia coli 1,56 12,5 3,12 3,12 12,5 12,5

Klebsiella pneumonia * * 12,5 12,5 3,12 12,5

Salmonela choleraesuis 12,5 * 3,12 12,5 1,56 *

Serratia marcescens * * 6,25 12,5 6,25 12,5

Shigella flexneri 6,25 * 6,25 12,5 1,56 12,5

Staphylococcus aureus 1,56 * 12,5 * 12,5 *

CIM: concentração inibitória mínima. CBM: concentração bactericida mínima. Os valores estão

expressos em mg/mL e indicam até qual concentração a amostra foi efetiva. (*): crescimento

bacteriano em todas as concentrações testadas.



tuberosa

Uma vez isolada uma quantidade expressiva de rutina da fração metanólica

das folhas, fez-se necessário a identificação e quantificação deste flavonoide nas

outras partes da planta estudadas. A identificação do flavonoide nas três partes da

espécie Spondias tuberosa (cascas, folhas e talos) foi realizada através da

comparação com o tempo de retenção e o espectro de absorção na região de 350

nm do padrão (Figura 61, p.131). No espectro de UV do padrão, foi possível verificar

a presença de dois máximos de absorção característicos dos flavonóis, uma banda

de absorção em 256 nm referente ao anel A e outra banda em 353 nm atribuída ao

anel B do flavonoide. Na figura 62, p.131, mostra os cromatogramas dos extratos

analisados, os quais mostram que as amostras apresentaram o mesmo pico com o

mesmo tempo de retenção do padrão utilizado, confirmando assim a presença da

rutina nos três extratos etanólicos analisados.


Figura 61. Espectro de UV com as bandas absorção da rutina obtido por CLAE-

DAD.

Figura 62. Cromatogramas dos extratos etanólicos das cascas, folhas e talos e do

padrão rutina.


Para a quantificação da rutina nas amostras utilizou-se os dados obtidos da

curva de calibração construída com a rutina (Figura 63, p. 132), as quantidades

foram expressas em µg/mL (Tabela 22, p. 132).

Figura 63. Curva de calibração da rutina

Tabela 22. Quantidades de rutina em µg/mL encontradas nos extratos etanólicos das

cascas, folhas e talos

Amostra Concentração da Rutina

(µg/mL)

Extrato etanólico – Cascas 19,28 ± 9,75

Extrato etanólico – Folhas 76,72 ± 19,33

Extrato etanólico – Talos 9,27 ± 1,94

Os resultados obtidos através da análise em CLAE-DAD, confirmam a

presença da rutina nas três partes da Spondias tuberosa, sendo que encontrou-se o

flavonoide em maior quantidade nas folhas, informação já esperada, pois foi desta

parte da planta que foram isoladas 93,2 mg de Rutina.

6. CONCLUSÕES


CONCLUSÕES

Nos óleos fixos obtidos das cascas, folhas e talos (OFC, OFF e OFT) de

Spondias tuberosa, analisados por CG-MS foram identificados os ésteres metílicos

correspondentes aos seguintes ácidos graxos de cadeia longa: palmítico, esteárico e

triacontanóico. Como constituintes majoritários foram identificadas as seguintes

substâncias: 3-n-pentadecilfenol (cascas) e o n-Tetratetracontano (folhas e talos)

Durante a preparação do extrato etanólico das folhas foi isolado um

precipitado que foi denominado como 2,4,6-trihidroxi-4-(hidroximetil)ciclohexa-2,5-

dien-1-ona, esta substância trata-se de um derivado do quinol, não há relatos de

isolamento desta classe de substâncias na família Anacardiaceae assim como

também no gênero Spondias.

O estudo fitoquímico das folhas de Spondias tuberosa resultou no isolamento

e identificação da rutina, oriunda da fração metanólica. Já o estudo fitoquímico dos

talos resultou no isolamento do Trans-p-cumarato de eicosanila, proveniente da

fração acetato de etila e relatado pela primeira vez no gênero Spondias, contribuindo

assim para o enriquecimento quimiotaxônomico deste gênero.

No ensaio de quantificação de fenóis totais, verificou-se que extrato etanólico

dos talos apresentou maior quantidade de compostos fenólicos (459,2 ± 21,07 mg

EqAG/g), já na quantificação de flavonoides totais destacou-se a fase St-MeOH dos

talos com 129,00 ± 4,91 mg EqC/g.

Na avaliação da atividade antioxidante in vitro, foi possível verificar que de

todos os extratos e frações testados, a fração St-AcOEt dos talos apresentou o

menor valor de CE50 (4,38 ± 0,21), seguido da substância St-02 (rutina) com CE50

7,95 ± 0,83 valor semelhante aos padrões. No método da inibição da co-oxidação do

sistema β-caroteno/ácido linoleico, a fração St-CHCl3 das folhas exibiu expressiva

atividade (64,95% ± 15,29) quando comparada ao padrão ácido ascórbico, um

antioxidante natural (10,61 ± 2,28), sendo assim a fração clorofórmica demonstrou

melhor eficiência em prevenir a oxidação do β-caroteno na presença do ácido

linoleico (agente oxidante).

Na atividade antibacteriana o extrato etanólico e a fase acetato de etila das

folhas apresentaram menores valores em relação aos demais extratos e fases

testados com concentração inibitória mínima de 0,195 mg/mL para a bactéria

Enterococcus faecalis, já para a concentração bactericida mínima a fase acetato de


etila das folhas destacou-se entre as demais com a concentração de 0,78 mg/mL

para a mesma cepa.

O estudo fitoquímico da espécie Spondias tuberosa levou à identificação de

três substâncias, dentre as quais se tem um derivado do quinol (2,4,6-trihidroxi-4-

(hidroximetil)ciclohexa-2,5-dien-1-ons), um flavonoide glicolisado (rutina) e um éster

do ácido p-cumárico (Trans-p-cumarato de eicosanila).

Diante do estudo realizado foi possível observar que os extratos e frações

estudados de Spondias tuberosa apresentaram resultados relevantes nas atividades

antioxidante e antibacteriana. As atividades demonstradas pelos extratos e frações

podem estar diretamente correlacionadas com a cicatrização de feridas e a

propriedade anti-inflamatória das plantas, sendo assim este estudo confirma o uso

etnofarmacológico desta espécie, além de contribuir para o conhecimento

quimiotaxonômico do gênero Spondias e da família Anacardiaceae.

REFERÊNCIAS


ABAD, M. J.; BERMEJO, P.; CARRETERO, E.; MARTINEZ-ACITORES C.; NOGUERA, B.; VILLAR, A. Antiinflammatory activity of some medicinal plant extracts from Venezuela. Journal of Ethnophamacology, v. 55, p. 63-68, 1996. ABO, K. A.; OGUNLEYE, V. O.; ASHIDI, J. S. Antimicrobial Potential of Spondias mombin, Croton zambesicus and Zygotritonia crocea. Phytotherapy Research, v. 13, p. 494–497, 1999. ACCIOLY, M. P.; BEVILAQUA, C. M. L.; RONDON, F. C. M.; MORAIS, S. M.; MACHADO, L. K. A.; ALMEIDA, C. A.; ANDRADE Jr., H. F.; CARDOSO, R. P. A. Leishmanicidal activity in vitro of Musa paradisiaca L. and Spondias mombim L. fractions. Veterinary Parasitology, v. 187, p. 79-84, 2012. ADEMOLA, I. O.; FAGBEMI, B. O.; IDOWU, S. O. Anthelmintic activity of extracts of Spondias mombin against gastrointestinal nematodes of sheep: studies in vitro and in vivo. Tropical Animal Health and Production, v. 37, p. 223-235, 2005. AHAMAD, I.; ISHRATULLAH, K.; ILYAS, M.; RAHMAN, W.; SELIGMANN, O.; WAGNER, H. Tetrahydroamentoflavone from nuts of Semecarpus prainii. Phytochemistry, v. 20, n. 5, p. 1169-1170, 1981. AHAMED, M. S.; GALAL, A. M.; ROSS, S. A.; FERREIRA, D.; ELSOHLY, M. A.; IBRAHIM, A. R. S.; MOSSA, J. S.; EL-FERALY, F. S. A weakly antimalarial biflavanone from Rhus retinorrhoea. Phytochemistry, v. 58, p. 599-602, 2001. AJAO, A. O.; SHONUKAN, O.; FEMI-ONADEKO, B. Antibacterial effect of aqueous and alcohol extracts of Spondias mombin, and Alchornea cordifolia - two local antimicrobial remedies. Phamaceutical Biology, v. 23, n. 2, p. 67-72, 1985. AKBAR, E.; NAWAZ, H. R.; MALIK, A. Dihydroquinol and Quinol Derivatives from Ajuga parviflora. Zeitschrift für Naturforschung, v. 56b, p. 842-846, 2001. AKINMOLADUN, A. C.; OBUOTOR, E. M.; BARTHWAL, M. K.; DIKSHIT, M.; FAROMBI, E. O. Ramipril-like activity of Spondias mombim L. against no-flow ischemia and isoproterenol-induced cardiotoxicity in rat heart. Cardiovascular Toxicology, v. 10, p. 295-305, 2010. ALMEIDA, J. R. G. S.; OLIVEIRA, M. R.; GUIMARÃES, A. L.; OLIVEIRA, A. P.; RIBEIRO, L. A. A.; LÚCIO, A. S. S. C.; QUINTANS-JÚNIOR, L. J. Phenolic quantification and antioxidant activity of Anaxagorea dolichocarpa and Duguetia chrysocarpa (Annonaceae). International Journal of Pharma and Bio Sciences, v.


2, n.4, p. 367-374, 2011. ALVES, C. Q.; DAVID, J. M.; DAVID, J. P.; BAHIA, M. V.; AGUIAR, R. M. Métodos para determinação de atividade antioxidante in vitro em substratos orgânicos. Química Nova, v. 33, n. 10, p. 2202-2210, 2010. ALVES, H. M. A diversidade química das plantas como fonte de fitofármacos. Cadernos Temáticos. Química Nova na Escola, v. 3, 10 – 15, 2001. AMOROSO, M. C. M. A abordagem etnobotânica na pesquisa de plantas medicinais. In: DI STASI, L.C. (Org.). Plantas medicinais: arte e ciência. São Paulo: UNESP, p. 47-68, 1996. ANDRADE, M. A. Óleos essenciais de Cinnamomum zeylanicumi, Cymbopogon nardus e Zingiber officinale: Caracterização química, atividade antioxidante e antibacteriana. Dissertação (Mestrado em Agroquímica), Universidade Federal de Lavras, Lavras-MG, 2010. ARAÚJO, C. S. Estudo fitoquímico e atividade biológica in vitro de Annona vepretorum MART. (Annonaceae). Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido), Universidade Federal do Vale do São Francisco, Petrolina-PE, 2013. ARAÚJO, F. P.; NETO, M. T. C. Influência de fatores fisiológicos de plantas-matrizes e de épocas do ano no pegamento de diferentes métodos de enxertia do umbuzeiro. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 24, n. 3, p. 752-755, 2002. ARAÚJO, T. A. S.; ALENCAR, N. L.; AMORIM, E. L. C.; ALBUQUERQUE, U. P. A new approach to study medicinal plants with tannins and flavonoids contents from the local knowledge. Journal of Ethnopharmacology, v. 120, p. 72–80, 2008. ARIF, M.; ZAMAN, K.; FAREED, S.; BADRUDDEEN; HUSSAIN, M. S. Antibacterial, antidiarrhoeal and ulcer-protective activity of methanolic extract of Spondias mangifera bark. Internacional Journal of Health Research, v. 1, n. 4 p. 177-182, 2008. AROMOLARAN, O.; BADEJO, O. K. Efficacy of fresh leaf extracts of Spondias mombin against some clinical bacterial isolates from typhoid patients. Asian Pacific Journal of Tropical Disease, v. 4, n. 6, p. 442-446, 2014. ARYA, R.; BABU, V.; ILYAS, M.; NASIM, K. T. Myricetin 3’-rhamnoside-3-galactoside


from Buchananza lanzan (Anacardiaceae). Phytochemistry, v. 31, n. 7, p. 2569-2570, 1992. ATTANAYAKE, A. P.; JAYATILAKA, K. A. P. W.; PATHIRANA, C.; MUDDUWA, L. K. B. Antihyperglycaemic, antihyperlipidaemic and β cell regenerative effects of Spondias pinnata (Linn. f.) Kurz. bark extract on streptozotocin induced diabetic rats. European Journal of Integrative Medicine, v. 6, p. 588–596, 2014. BALAMURUGAN, R.; DURAIPANDIYAN, V.; IGNACIMUTHU, S. Antidiabetic activity of γ-sitosterol isolated from Lippia nodiflora L. in streptozotocin induced diabetic rats. European Journal of Pharmacology, v. 667, p. 410–418, 2011. BARREIRO, E. J.; BOLZANI, V. S. Biodiversidade: fonte potencial para a descoberta de fármacos. Química Nova, v. 32, n. 3, p. 679-688, 2009. BARREIROS, A. L. B. S.; DAVID, J. M.; DAVID, J. P. Estresse oxidativo: relação entre geração de espécies reativas e defesa do organismo. Química Nova, v. 29, n.1, p. 113-123, 2006. BASILE, A.; SORBOA, S.; GIORDANOA, S.; RICCIARDI, L.; FERRARA, S.; MONTESANO, D.; COBIANCHIA, R. C.; VUOTTO, M. L.; FERRARA, L. Antibacterial and allelopathic activity of extract from Castanea sativa leaves. Fitoterapia, v. 71, S110-S116, 2000. BECHO, J. R. M.; MACHADO, H.; GUERRA, M. O. Rutina – Estrutura, metabolismo e potencial farmacológico. Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais, v. 1, n. 1, p. 21 - 25, 2009 BELTRÁN, A. E.; ALVAREZ, Y.; XAVIER, F. E.; HERRANZ, R.; RODRÍGUEZ, J.; NÚNEZ, A. J.; ALONSO, M. J.; SALAICES, M. Vascular effects of the Mangifera indica L. extract (Vimang). European Journal of Pharmacology, v. 499, n. 3, p. 297-305, 2004. BONA, S. Proteção antioxidante da quercetina em fígado de ratos cirróticos. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas), Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre-RS, 2010. BORGES, S. V.; MAIA, M. C. A.; GOMES, R. C. M.; CAVALCANTI, N. B. Chemical composition of umbu (Spondias tuberosa Arr. Cam) seeds. Química Nova, v. 30, n. 1, p. 49-52, 2007.


BORNHAUSEN, R.L. As ervas do sitio. São Paulo: UNESP, 1996, p.15-21. BRACA, A.; POLITI, M.; SANOGO, R.; SANOU, H.; MORELLI, I.; PIZZA, C.; TOMMASI DE, N. Chemical composition and antioxidant activity of phenolic compounds from wild and cultivated Sclerocarya birrea (Anacardiaceae) leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 51, p. 6689-6695, 2003. BRASIL. Ministério do Meio Ambiente. Caatinga. Disponível em: http://www.mma.gov.br/biomas/caatinga. Acesso em: 18 de Agosto, 2014. BRAVO, L. Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance. Nutrition Reviews, v. 56, n. 11, p. 317-333, 1998. CAPES, A.; PATTERSON, S.; WYLLIE, S.; HALLYBURTON, I.; COLLIE, I. T. MCCARROLL, A. J.; STEVENS, M. F. G.; FREARSON, J. A.; WYATT, P. G.; FAIRLAMB, A. H.; GILBERT, I. H. Quinol derivatives as potential trypanocidal agents. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 20, p.1607–1615, 2012. CAVALCANTE, G. M.; NETO, J. F. L.; BOMFIM, E. O.; SANTOS M. F. Atividade antimicrobiana de Artocarpus heterophyllus Lam. (Moraceae) sobre o desenvolvimento de Streptococcus pneumoniae e Escherichia coli. Scientia Plena, v. 9, n. 2, p. 1-7, 2013. CERUKS, M.; ROMOFF, P.; FÁVERO, O. A.; LAGO, J. H. G. Constituíntes fenólicos polares de Schinus terebinthifolius RADDI (Anacardiaceae). Química Nova, v. 30, n. 3, p. 597-599, 2007. CHIANG, J.C.H.; KOUTAVAS, A. Tropical flip-flop connections. Nature, v. 432, p. 684-685, 2004. CHUKWUKA, N.; ISEK, T. (2008). Antifertility activity of aqueous ethanolic leaf extract of Spondias mombin (Anacardiaceae) in rats. African Health Sciences, v. 8, n. 3, p. 163-167, 2008. CLINICAL LABORATORY STANDARDS INSTITUTE (CLSI). Metodologia dos testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos por diluição para bactérias de crescimento aeróbico: norma aprovada. 6ª ed., M7-A6, v. 23, n. 2, 2003. COATES, N. J.; GILPIN, M. L.; GWYNN, M. N.; LEWIS, D. E.; MILNER, P. H.; SPEAR, S. R.; TYLER, J. W. SB-202742, a Novel β-Lactamase Inhibitor Isolated from Spondias mombin. Journal of Natural Products, v. 57, n. 5, p. 654-657, 1994. CORREIA, S. J., DAVID, J. P., DAVID. J. M. Constituintes das cascas de Tapirira


guianensis (Anacardiaceae) Química Nova, v. 26, n. 1, p. 36-38, 2003. CORREIA, S.J., DAVID, J.P., DAVID. J.M. Metabólitos secundários de espécies de Anacardiaceae. Química Nova, v. 29, n. 6, p. 1287-1300, 2006. CORTHOUT, J.; PIETERS, L. A.; CLAYES, M.; VANDEN BERCHE, D.; VLIETINCK,

A. J. Antiviral caffeoyl esters from Spondias mombin. Phytochemistry, v. 31, n. 6, p.

1979-1981, 1992. CORTHOUT, J.; PIETERS, L. A.; CLAYES, M.; VANDEN BERCHE, D.; VLIETINCK, A. J. Antiviral ellagitannins from Spondias mombin. Phytochemistry, v. 30, n. 4, p. 1129- 1130, 1991. CORTHOUT, J.; PIETERS, L.; CLAEYS, M.; VANDEN BERGHE, D.; VLIETINCK, A. Antiviral caffeoyl esters from Spondias mombin. Phytochemistry, v. 31, n. 6, p. 1979-1981, 1992. COUTINHO, M. A. S.; MUZITANO, M. F.; COSTA, S. S. Flavonoides: potenciais agentes terapêuticos para o processo inflamatório. Revista Virtual de Química, v. 1, n. 3, p. 241-256, 2009. DADUANG, J.; VICHITPHAN, S.; DADUANG, S.; HONGSPRABHAS, P.; BOONSIRI, P. High phenolics and antioxidants of some tropical vegetables related to antibacterial and anticancer activities. African Journal of Pharmacy and Pharmacology, v. 5, n. 5, p. 608-615, 2011. DAJAS, F., RIVERA-MEGRET, F.; BLASINA, F.; ARREDONDO, F.; ABIN-CARRIQUIRY, J. A.; COSTA, G.; ECHEVERRY, C.; LAFON, L.; HEIZEN, H.; FERREIRA, M.; MORQUIO, A. Neuroprotection by flavonoids. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 36, n. 12, p. 1613-1620, 2003. DAS, J.; MANNAN, A.; RAHMAN, Md. M.; DINAR, Md. A. M.; UDDIN, M. E.; KHAN, I. N.; HABIB, Md. R.; HASAN, N. Chloroform and ethanol extract of Spondias Pinnata and its different pharmacological activity like-antioxidant, cytotoxic, antibacterial potential and phytochemical screening through in vitro method. International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, v. 2, n. 4, p. 1805-1812, 2011. D’ARCHIVIO, M.; FILESI, C.; DI BENEDETTO, R.; GARGIULO, R.; GIOVANNINI, C; MASELLA, R. Polyphenols, dietary sources and bioavailability. Ann Ist Super Sanità v. 43, n. 4, p. 348-361, 2007.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/003194229280344E


FERREIRA, V. F.; PINTO, A. C. A fitoterapia no mundo atual. Química Nova, v. 33, n. 9, p. 1829, 2010. FILHO, V. C. Principais avanços e perspectivas na área de produtos naturais ativos: estudos desenvolvidos no NIQFAR/UNIVALI. Química Nova, v. 23, n. 5, p. 680-685, 2000. FILHO, V. C.; YUNES, R. A. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre modificação estrutural para otimização da atividade. Química nova, v. 21, n. 3, p. 99-105, 1998. FINKEL, T.; HOLBROOK, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature, v. 408, p. 239-247, 2000. FOYSAL, M. J.; RAHMAN, M. M.; ALAM, M. Antibiotic sensitivity and in vitro antimicrobial activity of plant extracts to Pseudomonas fluorescens isolates collected from diseased fish. International Journal of Natural Sciences, v.1, n. 4, p.82-88, 2011. FUMAGALI, E.; GONÇALVES, R. A. C.; MACHADO, M. F. P. S.; VIDOTI, G. J.; OLIVEIRA, A. J. Produção de metabólitos secundários em cultura de células e tecidos de plantas: o exemplo dos gêneros Tabernaemontana e Aspidosperma. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18, n. 4, p. 627-641, 2008. GANGARAO, B; JAYARAJU, N. Anthelmintic activities of Glycosmis pentaphylla and Spondias pinnata. Journal of Pharmaceutical Research and Health, v.1, n. 1, p. 91-96, 2009. GARRIDO, G.; GONZÁLEZ, D.; LEMUS, Y.; GARCÍA, D.; LODEIRO, L.; QUINTERO, G.; DELPORTE, C.; NÚNES-SELLÉS, A. J.; DELGADO, R. In vivo and in vitro anti-inflammatory activity of Mangifera indica L. extract (VIMANG®). Pharmacological Research, v. 50, p. 143-149, 2004. GEHRKE, l. T. S.; NETO, A. T.; PEDROSO, M.; MOSTARDEIRO, C. P.; CRUZ, I. B. M.; SILVA, U. F.; ILHA, V.; DALCOL, I. I.; MOREL , A. F. Antimicrobial activity of Schinus lentiscifolius (Anacardiaceae). Journal of Ethnopharmacology, v. 148, p. 486–491, 2013.


GHATE, N. B.; HAZRA, B.; SARKAR, R.; MANDAL, N. In vitro anticancer activity of Spondias pinnata bark on human lung and breast carcinoma. Cytotechnology, v. 66, n. 2, p. 209-218, 2014. GOBBO-NETO, L.; LOPES, N. P. Plantas medicinais: fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários. Química Nova, v. 30, n. 2, p. 374-381, 2007. GONÇALVES, A. E. S. S.; LAJOLO, F. M.; GENOVESE, M. I. Chemical Composition and Antioxidant/Antidiabetic Potential of Brazilian Native Fruits and Commercial Frozen Pulps. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 58, p. 4666–4674, 2010. GUPTA, V. K.; ROY, A.; NIGAM, V. K.; MUKHERJEE, K. Antimicrobial activity of Spondias pinnata resin. Journal of Medicinal Plants research, v. 4, n. 16 p. 1656-1661, 2010. GUARDIA, T.; ROTELLI, A. E.; JUAREZ, A. Q.; PELZER, L. E., Anti-inflamatory properties os plant flavonoids. Effect of rutin, quercetin and hiperidin on adjuvant arthritis in rat. IL Pharmacology, v. 56, p. 683-687, 2001. HAMANO, P. S.; MERCADANTE, A. Z. Composition of Carotenoids from commercial products of caja (Spondias lutea). Journal of food composition and analysis, v. 14, n. 4, p. 335-343, 2001. HAN, Y. Rutin has therapeutic effect on septic arthritis caused by Candida albicans. International Immunopharmacology, v. 9, p. 207–211, 2009. HAZRA, B.; BISWAS, S.; MANDAL, N. Antioxidant and free radical scavenging activity of Spondias pinnata. BMC Complementary and Alternative Medicine, v. 8, p.1-10, 2008. HOSTETTMANN, K.; QUEIROZ, E. F.; VIEIRA, P. C.; Princípios ativos de plantas superiores, Ed. UFSC ar: São Carlos cap. 1, , 2003. HOUT, S.; CHEA, A.; BUN, S. S.; ELIAS, R.; GASQUET, M.; TIMON-DAVID, P.; BALANSARD, G.; AZAS, N. Screening of selected indigenous plants of Cambodia for antiplasmodial activity. Journal of Ethnopharmacology, v. 107, n. 1, p. 12-18, 2006. ISLAM, S. Md. A.; AHMED, K. T.; MANIK, M. K.; WAHID, Md. A.; KAMAL, C. S. I. A comparative study of the antioxidant, antimicrobial, cytotoxic and thrombolytic

http://link.springer.com/journal/10616


potential of the fruits and leaves of Spondias dulcis. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, v. 3, n. 9, p. 682-691, 2013. JIROVETZ, L.; BUCHBAUER, G.; NGASSOUM, M. B. Analysis of aroma compounds of fruit extracts of Spondias cytherea (“ambarella”) from Cameroon. Z Lebensm Unters Forsch A, v. 208, p. 74-76, 1999. KROL, M. S.; JAEGAR, A.; BRONSTERT, A.; KRYWKOW J. The semiarid integrated model (SDIM), a regional integrated model assessing water availability, vulnerability of ecosystems and society in NE-Brazil. Physics and Chemistry of the Earth (B), v. 26, n. 7-8, p. 529-533, 2001. LEAL, I. R.; SILVA, J. M. C.; TABARELLI, M.; LACHER JR, T. E. Mudando o curso da conservação da biodiversidade na Caatinga do Nordeste do Brasil. Megadiversidade, v. 1, n. 1, p, 139-146, 2005. LIN, Y. M.; ANDERSON, H.; FLAVIN, M. T.; PAI, Y. H. S.; MATA-GREENWOOD, E.; PENGSUPARP, T.; PEZZUTO, J. M.; SCHINAZI, R. F.; HUGHES, S. H.; CHEN F. C. In Vitro Anti-HIV Activity of Biflavonoids Isolated from Rhus succedanea and Garcinia multiflora. Journal of Natural Products, v. 60, n. 9, p. 884-888, 1997. LIN, Y. M.; CHEM, F. C.; LEE, K. H. Hinokiflavone, a cytotoxic principle from Rhus succedanea and the cytotoxicity of the related bioflavonoids. Planta Medica, v. 55, n. 2, p. 166-168, 1989. LINS NETO, E. M. F.; PERONI, N.; ALBUQUERQUE, U. P. Traditional Knowledge and Management of Umbu (Spondias tuberosa, Anacardiaceae): an endemic Species from the Semi–Arid Region of Northeastern Brazil. Economic Botany, v. 64, n. 1, p. 11–21, 2010. LOPES, R. M.; OLIVEIRA, T. T.; NAGEM, T. J.; PINTO, A. S. Flavonoides: farmacologia de flavonoides no controle hiperlipidêmico em animais experimentais. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, n. 17, p. 18-22, 2000. LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. Nova Odessa: Ed. Plantarum, p. 26, 1992. LOO, P. V.; BRUYN, A.; VERZELE, M. On the liquid chromatography and identification of the flavonoids, present in the "Sumach Tannic Acid" extracted from Rhus coriaria. Chromatographia, v. 25, n. 1, p. 15-20, 1988.


LUZ, C. L. S. Anacardiaceae R. Br. na flora fanerogâmica do estado de São Paulo. Dissertação (Mestrado em Botânica), Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.

MACHADO, H., Atividade dos flavonoides rutina e naringina sobre o tumor ascítico de Erlich “in vivo”. Dissertação (Mestrado em Bioquímica Agrícola), Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG, 2005. MACIEL, M. A. M.; PINTO, A. C.; VEIGA-JR, V. F.; GRYNBERG, N. F.; ECHEVARRIA, A. Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares. Química Nova, v. 25, n.3, pp. 429-438, 2002. MADIKIZELA, B.; ADEROGBA, M. A.; VAN STADEN, J. Isolation and characterization of antimicrobial constituents of Searsia chirindensis L. (Anacardiaceae) leaf extracts. Journal of Ethnopharmacology, v. 150, p. 609-613, 2013.

MAHMOOD, U.; KAUL, V. K.; ACHARYA, R.; JIROVETZ, L. p-Coumaric acid esters from Tanacetum longifolium. Phytochemistry, v. 64, p.851–853, 2003. MAIA, G. N. Caatinga: árvores e arbustos e suas utilidades. X. ed. Cidade: Editora Leitura & Arte,. 413p, 2004. MAISUTHISAKUL, P.; SUTTAJIT, M.; PONGSAWATMANIT, R. Assessment of phenolic content and free radical-scavenging capacity of some Thai indigenous plants. Food Chemistry, v.100, p. 1409-1418, 2007. MANACH, C.; SCALBERT, A.; MORAND, C.; RÉMÉSY, C.; JIMÉNEZ, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. The American Journal of Clinical Nutrition, v. 79, p. 727-747, 2004. MAKARE, N.; BODHANKAR, S.; RANGARI, V. Immunomodulatory activity of alcoholic extract of Mangifera indica L. in mice. Journal of Ethnopharmacology, v. 78, p. 133- 137, 2001. MARKHAM, K. R. Techniques of flavonoid identification. New York: Academic Press, 113p., 1982. MARQUES, G. S.; MONTEIRO, R. P. M.; LEÃO, W. F.; LYRA, M. A. M.; PEIXOTO, M. S.; ROLIM-NETO, P. J.; XAVIER, H. S.; SOARES, L. A. L. Avaliação de procedimentos para quantificação espectrofotométrica de flavonoides totais em folhas de Bauhinia forficata LINK. Química Nova, v. 35, n. 3, p. 517-522, 2012.


MENDES, B.V. Umbuzeiro (Spondias tuberosa Arr. Cam.): importante fruteira do semi-árido. Mossoró: ESAM, p. 67 (Coleção Mosoroense, v. DLXIV), 1990. MESESANE, I. B.; YEBOAH, S. O.; LIEBSCHER, J.; MÜGGE, C.; ABEGAZ, B. M. A bichalcone from the twigs of Rhus pyroides. Phytochemistry, v. 53, n. 8, p. 1005-1008, 2000.

MIDDLETON, E. JR.; KANDASWAM, C.; THEOHARIDES, T. C. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease and cancer. Pharmacological Reviews, v. 53, p. 673-751, 2000. MOURA, A. C. S.; VILEGAS, W.; SANTOS, L. C. Identificação de alguns constituintes químicos de Indigofera hirsuta Linn. (Fabaceae) por CLAE-IES-EM (TOF) e avaliação da atividade antirradicalar. Química Nova, v. 34, n. 7, p. 1136-1140, 2011. MUROTA, K.; TERAO, J. Antioxidative flavonoid quercetin: implication of its intestinal absorption and metabolism. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 417, p.12–17, 2003. MURUGANANDAN, S.; GUPTA, S.; KATARIA, M.; LAL, J.; GUPTA, P. K. Mangiferin protects the streptozotocin-induced oxidative damage to cardiac and renal tissues in rats. Toxicology, v. 176, n. 3, p. 65-173, 2002. NADIA, T. L.; MACHADO, I. C.; LOPES, A. V. Polinização de Spondias tuberosa Arruda (Anacardiaceae) e análise da partilha de polinizadores com Ziziphus joazeiro Mart. (Rhamnaceae), espécies frutíferas e endêmicas da caatinga. Revista Brasileira de Botânica, v. 30, n.1, p. 89-100, 2007. NAIR, A. G. R.; KOTIYAL, J. P.; BHARDWAJ, D. K. Myricetin 7,4’-dimethyl ether and its 3-galactoside from Rhus lancea. Phytochemistry, v. 22, n. 1, p.318-319, 1983. NASCIMENTO, G. G. F.; LOCATELLI, J.; FREITAS, P. C.; SILVA, G. L. Antibacterial activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology, v.31, n.2, p.247–256, 2000. NASCIMENTO-SILVA, O.; CHINALIA, L. A.; PAIVA, J. G. A. Caracterização histoquímica dos folíolos de Spondias tuberosa Arruda (Anacardiaceae Lindl.). Revista Caatinga, v. 21, n. 3, p. 62-68, 2008.


NASSIRI-ALS, M.; SHARIATI-RAD, S.; ZAMANSOLTAN, F., Anticonvulsive effects of intracerebroventicular administration of rutin in rats. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry, v. 32, p. 989-993, 2008. NOLDIN, V. F.; ISAIAS, D. B.; FILHO, V. C. Gênero Calophyllum: importância química e farmacológica. Química Nova, v. 29, n. 3, p. 549-554, 2006. OKOTH, D. A.; CHENIA, H. Y.; KOORBANALLY, N. A. Antibacterial and antioxidant activities of flavonoids from Lannea alata (Engl.) Engl. (Anacardiaceae). Phytochemistry Letters, v. 6, p. 476–481, 2013. OLADUNMOYE, M. K. Comparative evaluation of the effects of leaf extract from Spondias mombin on rats with induced infections from Bacillus cereus and Clostridium sporogenes. Research Journal of Phytochemistry, v. 1, p. 68-73, 2007. OLIVEIRA, D. M.; BASTOS, D. H. M. Biodisponibilidade de ácidos fenólicos. Química Nova, v. 34, n. 6, p. 1051-1056, 2011. OLIVEIRA, D. M.; SIQUEIRA, E. P.; NUNES, Y. R. F.; COTA, B. B. Flavonoids from leaves of Mauritia flexuosa. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v.23, n. 4, p. 614-620, 2013. OLIVEIRA, L. D. M. Síntese, caracterização e funcionalidade de aditivos de lubricidade, derivados do LCC. Dissertação (Mestrado em Química Inorgânica), Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007. OSTROSKY, E. A.; MIZUMOTO, M. K.; LIMA, M. E. L.; KANEKO, T. M.; NISHIKAWA, S. O.; FREITAS, B. R. Métodos para avaliação da atividade antimicrobiana e determinação da concentração mínima inibitória (CMI) de plantas medicinais. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18, n. 2, p. 301-307, 2008. PANDA, B. K.; PATRA, V. J.; MISHRA, U. S.; KAR, S.; PANDA, B. R.; HATI, M. R. Analgesic activities of the stem bark extract of Spondias pinata (Linn.f) Kurz. Journal of Pharmacy Research, v. 2, n. 5, p. 825-827, 2009. PARVEEN, M.; KHAN, N. U. Biflavones from the leaves of Rhus alata Thumb. Current Science, v. 56, n. 22, p. 1171-1172, 1987. PANNALA, A. S.; CHAN, T. S.; O’BRIEN, P. J.; RICE-EVAN, C. A. Flavonoid B-Ring


Chemistry and Antioxidant Activity: Fast Reaction Kinetics. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 282, p.1161–1168, 2007. PEDRIALI, C. A. Síntese química de derivados hidrossolúveis da rutina: determinação de suas propriedades físico-químicas e avaliação de suas atividades antioxidantes. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica), Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, São Paulo-SP, 2005. PINTO, A. C.; SILVA, D. H. S.; BOLZANI, V. S.; LOPES, N. P.; EPIFANIO, R. A. Produtos naturais: atualidade, desafios e perspectivas. Química Nova, v. 25, n. 1, p. 45-61, 2002. RANGEL, M.; BRAGANÇA, F. C. R. Representações de gestantes sobre o uso de plantas medicinais. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.11, n.1, p.100-109, 2009. SANCHEZ, G. M.; RE, L. A.; GIULIANI, A.; NÚNEZ-SELLÉS, J.; DAVISON, G. P.; LEÓN-FERNÁNDEZ, O. S. Protective effects of Mangifera indica L. extract, mangiferin and selected antioxidants against TPA-induced biomolecules oxidation and peritoneal macrophage activation in mice. Pharmacological Research, v. 42, n. 6, p. 565-573, 2000. SANTANA, C. R. R.; OLIVEIRA JUNIOR, R. G.; ARAÚJO, C. S.; SOUZA, G. R.; LIMA-SARAIVA, S. R. G.; GUIMARAES, A. L.; OLIVEIRA, A. P.; SIQUEIRA FILHO, J. A.; PACHECO, A. G. M.; ALMEIDA, J. R. G. S. Phytochemical Screening, Antioxidant and Antibacterial Activity of Encholirium spectabile (Bromeliaceae). International Journal of Sciences, v. 1, p. 1-19, 2012. SANTOS, M. M. P. Atividade antimicrobiana in vitro de extratos vegetais das espécies Mangifera indica, Eugenia jambolana, Schinus terebinthifolius, Capsicum annuum, e de análogos sintéticos da capsaicina, frente aos microrganismos da cavidade oral. Tese (Doutorado em Produção Vegetal). Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes – RJ, 2010. SANTOS, K. F. R.; OLIVEIRA, T. T.; NAGEM, T. J.; PINTO, A. S.; OLIVEIRA, M. G. A. Hypolipidaemic effects of naringenin, rutin, nicotinic acid and their associations. Pharmacological Research, v. 40, n. 6, p. 493-496, 1999. SCOTTI, L.; SCOTTI, M. T.; CARDOSO, C.; PAULETTI, P.; CASTRO-GAMBOA, I.; BOLZANI, V. S.; VELASCO, M. V. R.; MENEZES, C. M. S.; FERREIRA, E. I. Modelagem molecular aplicada ao desenvolvimento de moléculas com atividade antioxidante visando ao uso cosmético. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. v. 43, n. 2, 2007.


SELLES, A. J. N.; CASTRO, H. T; AGUËRO-AGUËRO, V. J.; GONZÁLEZ-GONZÁLEZ, J.; NADDEO, F.; DE-SIMONE, F.; RASTRELLI, L. Isolation and quantitative analysis of phenolic antioxidants, free sugars, and polyols from mango (Mangifera indica L.) stem bark aqueous decoction used in Cuba as a nutritional supplement. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 50, n.4, p. 762-766, 2002. SHAHEEN, U. Y. P-Coumaric Acid Ester with potential antioxidant activity from the Genus Salvia. Free Radicals and Antioxidants, v.1, n. 1, p. 23-27, 2011. SHARMEEN, R.; HOSSAIN, Md. N.; RAHMAN, Md. M.; FOYSAL, Md. J.; MIAH, Md. F. In-vitro antibacterial activity of herbal aqueous extract against multi-drug resistant Klebsiella sp. isolated from human clinical samples. International Current Pharmaceutical Journal, v. 1, n. 6, p. 133-137, 2012. SIDDIQUE, H. R., SALEEM, M. Beneficial health effects of lupeol triterpene: a review of preclinical studies. Life Sciences, v. 88, p. 285–293, 2011. SILVA, A. R. A.; MORAIS, S. M.; MARQUES, M. M. M.; LIMA, D. M.; SANTOS, S. C. C.; ALMEIDA, R. R.; VIEIRA, I. G. P.; GUEDES, M. I. F. Antiviral activities of extracts and phenolic components of two Spondias species against dengue virus. The Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, v. 17, p. 406-413, 2011. SILVA, A. R. A.; MORAIS, S. M.; MARQUES, M. M. M.; OLIVEIRA, D. F.; BARROS, C. C.; ALMEIDA, R. R.; VIEIRA, Í. G, P.; GUEDES, M. I. F. Chemical composition, antioxidant and antibacterial activities of two Spondias species from Northeastern Brazil. Pharmaceutical Biology, v. 50, n.6, p. 740-746, 2012. SILVA, C. J. D. Caracterização genética de Cajazeiras (Spondias mombin L.) (Anacardiaceae) por meio de marcadores moleculares. Dissertação (Mestrado em Agronomia), Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife-PE, 2009. SILVA, G. A.; BRITO, N. J. N.; SANTOS, E. C. G.; LÓPEZ, J. A.; ALMEIDA, M. G. Gênero Spondias: Aspectos botânicos, composição química e potencial farmacológico. Revista de Biologia e Farmácia, v. 10, n.1, 2014. SILVA, G. A.; LIMA, W. Q. F.; GUEDES, A. S.; RODRIGUÉZ, J. A. L. Avaliação da letalidade e atividade antimicrobiana de extratos de folhas de Spondias mombin aff. tuberosa. Revista Facider, v.1, p. 1-18, 2012. SILVA, J. M. C.; TABARELLI, M.; FONSECA, M. T.; LINS, L. V. (orgs.). Biodiversidade da Caatinga: áreas e ações prioritárias para a conservação.


Ministério do Meio Ambiente, Brasília, 2004. SILVA-LUZ, C.L.; Pirani, J.R. Anacardiaceae. In R.C. Forzza et al. (org.). Catálogo de plantas e fungos do Brasil. Rio de Janeiro: Jardim Botânico do Rio de Janeiro, v. 1, p. 599-602, 2010. SILPRASIT, K.; SEETAHA, S.; PONGSANARAKUL, P.; HANNONGBUA, S.; CHOOWONGKOMON, K. Anti-HIV-1 reverse transcriptase activities of hexane extracts from some Asian medicinal plants. Journal of Medicinal Plants Research, v. 5, n. 19, p. 4194-4201, 2011. SIMÕES, C. M. O. et al. (Org.) Famacognosia: da planta ao medicamento. 6. ed. Florianópolis: Editora da UFSC, 2010. 1104p. SINGH, R. B.; SAXENA, V. K. Chemical investigations on Spondias mangifera. Journal of the Institution of Chemists (India), v. 48, p.299, 1976. SOUSA, C. M. M.; SILVA, H. R.; VIEIRA-Jr, G. M.; AYRES, M. C. C.; COSTA, C. L. S.; ARAÚJO, D. S.; CAVALCANTE, L. C. D.; BARROS, E. D. S.; ARAÚJO, P. B. M.; BRANDÃO, M. S.; CHAVES, M. H. Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Química Nova, v. 30, n. 2, p. 351-355, 2007. SUBRAMANIAN, S. S.; NAIR, A. G. R. Angiospermae dicotyledonae Anacardiaceae polyphenols of Lannea coromandelica. Phytochemistry, v.10, p. 1939-1940, 1971. TAKAHASHI, M. FUCHINO, H.; SATAKE, M.; AGATSUMA, Y.; SEKITA, S. In Vitro screening of leishmanicidal activity in Myanmar timber extracts. Biological and Pharmaceutical Bulletin, v. 27, n. 26, p. 921-925, 2004. TALEB-CONTINI, S. H.; SALVADOR, M. J.; WATANABE, E.; ITO, I. Y.; OLIVEIRA, D. C. R. Antimicrobial activity of flavonoids and steroids isolated from two Chromolaena species. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 39, n. 4, p. 403-408., 2003. TANDON, S.; RASTOGI, R. P. Studies on the chemical constituents of Spondias pinnata. Planta médica, v. 29, n. 2, p. 190-192, 1976. TOMAZZONI, M. I.; NEGRELLE, R. R. B.; CENTA, M. L. Fitoterapia popular: a busca instrumental enquanto prática terapêutica. Texto Contexto Enferm, v. 15, n. 1, p. 115-121, 2006.


VALSARAJ, R.; PUSHPANGADAN, P.; SMITT, U. W.; ADSERSEN, A.; NYMAN, U. Antimicrobial screening of selected medicinal plants from India. Journal of Ethnopharmacology, v. 58, p. 75–83, 1997. VAN LOO, P.; DE BRUYN, A.; VERZELE, M. On the liquid chromatography and identification of the flavonoids, present in the "Sumach Tannic Acid" extracted from Rhus coriaria. Chromatographia, v. 25, n. 1, p. 15-20, 1988. VARGAS, A. C.; LOGUERCIO, A. P.; WITT, N. M.; COSTA, M. M.; SILVA, M. S.; VIANA, L. R. Atividade antimicrobiana “in vitro” de extrato alcóolico de própolis. Ciência Rural, v. 34, n. 1, p.159-163, 2004. VILA, F. C. Identificação dos flavonoides com atividade antioxidante da cana-de-açúcar (Sacharum officinarum L.). Dissertação (Mestrado em Química Analítica), Universidade de São Paulo, São Carlos-SP, 2006. WAGNER, H.; BLADT, S. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas. 2nd ed. New York: Springer, 1996. WANNES, W. A.; MHAMDI, B.; SRITI, J.; JEMIA, M. B.; OUCHIKH, O.; HAMDAOUI, G.; KCHOUK, M. E.; MARZOUK, B. Antioxidant activities of the essential oil and methanol extracts from myrtle (Myrtus communis var. italica L.) leaf, stem and flower. Food and Chemical Toxicology, v. 48, p. 1362-1370, 2010. WENIGER, B.; VONTHRON-SENECHEAU, C; ARANGO, G. J.; KAISER, M.; BRUN, R.; ANTON, R. A bioactive biflavonoid from Campnosperma panamense. Fitoterapia, v. 75, p. 764-767, 2004. WESTENBURG, H. E.; LEE, K.-J.; LEE, S. K.; FONG, H. H. S.; VAN BREEMEN, R. B.; PEZZUTO, J. M.; KINGHORN, A. D. Activity-guided isolation of antioxidative constituents of Cotinus coggygria. Journal of Natural Products, v. 63, p. 1696-1698, 2000. YAO, L. H.; JIANG, Y. M.; SHI, J.; TOMÁS-BARBERÁN, F. A.; DATTA, N.; SINGANUSONG, R.; CHEN, S. S. Flavonoids in food and their health benefits. Plant Foods for Human Nutrition, v. 59, p. 113–122, 2004. ZEMBOWER, D. E.; LIN, Y.; FLAVIN, M. T.; CHEN, F.; KORBA, B. E. Robustaflavone, a potential non-nucleoside anti-hepatitis B agent. Antiviral Research, v. 39, n. 2, p. 81-88, 1998.


ZHISHEN, J.; MENGCHENG, T.; JIANMING, W. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chemistry, v. 64, n. 4, p. 555-559, 1999.

APÊNDICE


UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO - UNIVASF

IV Simpósio de Plantas Medicinais do Vale do São Francisco – PLAMEVASF

18 a 21 de Setembro de 2013, Juazeiro-BA

QUANTIFICAÇÃO FENÓLICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE Spondias tuberosa.

AMANDA LEITE GUIMARÃES1; ANA PAULA DE OLIVEIRA1; RAIRA F. DOS SANTOS2; EDIGÊNIA C. DA C. ARAÚJO1; JACKSON R. G. DA S. ALMEIDA1. 1 Universidade Federal do Vale do São Francisco; 2 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão Pernambucano. Introdução: O gênero Spondias (Anacardiaceae) é constituído de 8-12 espécies distribuídas em todas as regiões tropicais do mundo. Spondias tuberosa Arr. Cam., conhecida como umbuzeiro, tem suas folhas utilizadas na medicina popular como anti-inflamatório, para combater a diarreia, disenteria e vermes. Objetivos: Determinar o teor de fenóis e flavonoides totais e avaliar o potencial antioxidante in vitro dos extratos das folhas de S. tuberosa. Métodos: As folhas foram secas, moídas e submetidas à extração com etanol (EtOH) seguida de fracionamento em sílica resultando nas fases Hex, CHCl3, AcOEt e MeOH. O conteúdo de fenóis totais foi determinado pelo método de Folin-Ciocalteu. O teor de flavonoides totais foi determinado através do método colorimétrico por complexação metálica. A atividade antioxidante dos extratos foi avaliada pelos modelos de sequestro do radical DPPH e da inibição da auto oxidação do β-caroteno. Os padrões usados foram ácido ascórbico, BHA e BHT e as análises foram feitas em triplicata. Resultados: O EtOH e a fase MeOH demonstraram excelente atividade antioxidante no método do DPPH, destacando-se a fase MeOH (IC50 27,83 ± 1,12 μg/mL) que demonstrou melhor atividade dentre as fases estudadas. No método da inibição da auto oxidação do β-caroteno, por ser um método de lipoperoxidação, a fase CHCl3 apresentou melhor atividade (64,95% ± 15,29). A quantificação de fenóis e de flavonoides totais confirma os resultados observados na atividade antioxidante através do modelo DPPH, pois os resultados mostram valores consideráveis tanto para o EtOH (100,53 ± 12,06 e 70,37 ± 1,40 mg/g, respectivamente) quanto para a fase MeOH (181,20 ± 10,58 e 64,33 ± 1,66 mg/g, respectivamente). Conclusões: O gênero spondias já é conhecido pela presença de compostos fenólicos e os testes realizados confirmam esta presença em S. tuberosa. Sugerimos que o uso popular pode estar relacionado com a presença destes metabólitos. Procedimentos químicos posteriores serão realizados a fim de isolar e determinar as micromoléculas responsáveis pela atividade. Palavras-chave: atividade antioxidante; fenóis; Spondias tuberosa.

Apoio Financeiro: CNPq/BNB/FACEPE


QUANTIFICAÇÃO FENÓLICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS TALOS DE Spondias tuberosa

Amanda Leite Guimarães1, Ana Paula de Oliveira1, Raira F. dos Santos2, Edigênia C. da C.

Araújo1 e Jackson R. G. da S. Almeida1

1 Programa de Pós Graduação em Recursos Naturais do Semiárido 2 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão Pernambucano, Campus Petrolina, BR

407 Km 08 Jardim São Paulo – Petrolina – PE

Introdução Nos últimos anos, uma quantidade substancial de evidências tem indicado o papel

chave dos radicais livres e outros oxidantes como grandes responsáveis pelo envelhecimento e pelas doenças degenerativas associadas ao envelhecimento, como câncer, doenças cardiovasculares, catarata, declínio do sistema imune e disfunções cerebrais (ATOUI et al., 2005; BARREIROS et al., 2006).

Muitos vegetais apresentam ação antioxidante, ou seja, são capazes de captar radicais livres. O excesso ou o acúmulo de radicais livres no organismo podem ser combatidos de forma bastante eficaz; os responsáveis por tal função são os agentes antioxidantes (BARREIROS,2006).

Sendo assim, a espécie selecionada como objeto de estudo foi Spondias tuberosa, conhecida popularmente como umbuzeiro, pertence ao gênero Spondias (Anacardiaceae) que é constituído de 8-12 espécies distribuídas em todas as regiões tropicais do mundo. O Umbuzeiro é uma árvore endêmica da Caatinga, conhecida localmente como "umbu" e utilizada para diversos fins, especialmente alimento e medicinal (Lins Neto et al., 2010).Estudos anteriores das espécies da família Anacardiaceae possibilitaram verificar a ocorrência flavonoides, terpenos, esteroides, xantonas e, principalmente, dos lipídios fenólicos e derivados. Destaca-se que entre os flavonoides, os biflavonóides são os mais frequentes (Correia et al., 2006). Neste trabalho, os talos de S. tuberosa foram avaliados quanto ao teor de fenóis e flavonoides totais e o potencial antioxidante in vitro. Materiais e Métodos

A planta foi coletada no campus de ciências agrárias da UNIVASF em janeiro de 2013, em seguida o material vegetal seco e pulverizado foi submetido a extração utilizando inicialmente o n- hexano a fim de retirar a graxa presente no material botânico e em seguida o material foi submetido à maceração exaustiva com etanol 95 %. As soluções extrativas, hexânica e alcoólica obtidas foram concentradas em evaporador rotatório sob pressão reduzida a uma temperatura média de 50 °C, obtendo-se o extrato hexânico (Hexano-1) e o extrato etanólico (EtOH). O EtOH foi particionado com solventes em ordem crescente de polaridade gerando a fases hexânica (HEX), clorofórmica (CHCl3), acetato de etila (AcOEt) e metanólica (MeOH).

O conteúdo de fenóis totais foi determinado pelo método de Folin-Ciocalteu. O teor de flavonoides totais foi determinado através do método colorimétrico por complexação metálica. A atividade antioxidante dos extratos foi avaliada pelos modelos de sequestro do radical DPPH e da inibição da auto-oxidação do β-caroteno, utilizando como padrões o ácido ascórbico, butil-hidroxi-anisol (BHA) e butil-hidroxi-tolueno (BHT).

Todas as análises foram realizadas em triplicata e seguindo a metodologia descrita por Oliveira-Jr et al. (2012). Resultados e Discussão

Os resultados da atividade antioxidante para o modelo de sequestro do radical DPPH foram expressos através de valores de CE50 e estão apresentados na Tabela 1. O EtOH e as fases AcOEt e MeOH demonstraram excelente atividade antioxidante no método do DPPH quando comparadas com os padrões, destacando-se a fase AcOEt (CE50 4,38 ± 0,21


µg/mL).No método da inibição da auto oxidação do β-caroteno, por ser um método de lipoperoxidação, a fase AcOEt também apresentou a melhor atividade (10,40% ± 0,58) quando comparada com as outras fases. A quantificação de fenóis e de flavonoides totais confirma os resultados observados na atividade antioxidante através do modelo DPPH, pois os resultados mostram valores consideráveis tanto para o EtOH quanto para as fases AcOEt e MeOH como pode ser observado na Tabela 1. Tabela 1 – Estimativa da atividade antioxidante e quantificação de fenois e flavonoides totais dos extratos e demais frações obtidos dos talos de Spondias tuberosa (Anacardiaceae)

Amostra DPPH

(CI50, µg/ml)

β-caroteno

(% AA)

Fenóis totais (mg EqAG/g)

Flavonoides totais

(mg EqC/g)

Hexano - 1 102,20 ± 1,60 nd 20,53 ± 2,31 33,25 ± 17,52 EtOH 4,85 ± 0,07 1,59 ± 3,30 459,20 ± 21,07 97,69 ± 1,92 Hex nd nd 33,20 ± 4,00 -

CHCl3 nd nd 17,20 ± 0,00 0,80 ± 3,46 AcOEt 4,38 ± 0,21 10,40 ± 0,58 314,50 ± 3,06 66,36 ± 3,42 MeOH 5,54 ± 0,12 - 445,90 ± 103,2 129,00 ± 4,91 Ácido

ascórbico 5,08 ± 1,03 7,56 ± 1,80 - -

BHA 5,55 ± 1,02 53,78 ± 14,38 - - BHT 9,56 ± 1,09 51,53 ± 4,19 - -

*nd: não determinado Conclusões

De acordo com os resultados obtidos dos testes realizados, pode-se perceber que as espécies possuem atividade antioxidante no método do DPPH, e que essa atividade pode estar relacionada com a presença de compostos fenólicos como, por exemplo, os flavonoides os quais são reconhecidos pela sua atividade antioxidante.

Assim, novos estudos serão realizados para o isolamento dos constituintes químicos responsáveis pela atividade antioxidante das fases. Agradecimentos

CNPq/BNB/FACEPE

Referências ATOUI, A. K., MANSOURI, A., BOSKOU, G.,KEFALAS, P., Food Chem. 89, p. 27,2005. BARREIROS, A. L. B. S.; David, J. M.; David, J. P., Estresse oxidativo: relação entre geração de espécies reativas e defesa do organismo. Quím. Nova., 29 (1), p. 113-123,2006. CORREIA, S. J., DAVID, L. P., DAVID J. M. Metabólitos secundários de espécies de Anacardiaceae. Quím. Nova., v. 29, n. 6, p. 1287-1300, 2006. LINS NETO E. M. F., PERONI N., ALBUQUERQUE U.P. Traditional knowledge and management of Umbu (Spondias tuberosa,Anacardiaceae): An endemic species from the semi–arid region of Northeastern Brazil. Econ Bot., 64, p. 11–21, 2010. OLIVEIRA-JR, R. G., ARAÚJO, C. S., SANTANA, C. R. R., SOUZA, G. R., LIMA-SARAIVA, S. R. G.,GUIMARÃES, A. L.,OLIVEIRA, A. P., FILHO, J. A. S., PACHECO, G. M., ALMEIDA, J. R. G. Phytochemical Screening, Antioxidant and Antibacterial Activity of Encholirium spectabile (Bromeliaceae). International Journal of Sciences, p. 1 – 19, 2012.


Antibacterial and antioxidant activities of flavonoid isolated from Spondias

tuberosa Arruda (Anacardiaceae)

A. L. Guimarãesa, G. S. Bezerraa, I. Sousaa, E. C. V. Nascimentoa, A. P.

Oliveiraa, A. G. M. Pachecob, J. R. G. S. Almeidaa, D. S. C. Anjosc, E. C. C.

Araújoa*

a Universidade Federal do Vale do São Francisco, Petrolina, Pernambuco, Brazil

b Laboratório de Fitoquímica, Departamento de Saúde, Universidade Estadual de Feira de

Santana, 44.036-900, Feira de Santana, Bahia, Brazil

c Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão Pernambucano, - Petrolina,

Brazil

* Corresponding author: Edigênia Cavalcante da Cruz Araújo, Universidade Federal do Vale do São

Francisco – UNIVASF Postal Code: 56.304-205 Petrolina, PE, Brazil, e-mail:

[email protected]/ [email protected]; Phone/Fax: +55-87-21016863.

mailto:[email protected]/

mailto:[email protected]


Antibacterial and antioxidant activities of Flavonoid isolated from Spondias

tuberosa Arruda (Anacardiaceae)

A. L. Guimarãesa, G. S. Bezerraa, I. Sousaa, E. C. V. Nascimentoa, A. P.

Oliveiraa, A. G. M. Pachecob, J. R. G. S. Almeidaa, D. S. C. Anjosc, E. C. C.

Araújoa*

a Universidade Federal do Vale do São Francisco, Petrolina, Pernambuco, Brazil

b Laboratório de Fitoquímica, Departamento de Saúde, Universidade Estadual de Feira de

Santana, 44.036-900, Feira de Santana, Bahia, Brazil

c Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão Pernambucano, - Petrolina,

Brazil

(Received Month Day, 201X; accepted Month Day, 201X)

The methanolic fraction, obtained from ethanol extract, was submitted to the

chromatography procedures which led to the isolation of the flavonoid Quercetin-3-

O-rutinoside (Rutin), which had the structures elucidated by spectroscopy analysis,

including RMN (1D and 2D) and comparison with literature data. Antioxidant and

antibacterial activity of flavonoid isolated as well as ethanol extract and fractions

were evaluated. Rutin showed both antioxidant activity and antibacterial. The

methanolic fraction exhibit the best antioxidant activity in the method the

scavenging of radical DPPH (IC50 27.83 ± 1.12 μg/ml), already by the co-oxidation

of β-carotene method stood out the ethyl acetate fraction (62.28 ± 9.51). The

ethanol extract and ethyl acetate fraction showed activity against bacteria

Enterococcus faecalis.

Keywords: Anacardiaceae, Spondias tuberosa, antioxidant, antibacterial,

flavonoid.

1. Introduction

The Anacardiaceae family belongs to the order Sapindales comprising about 81 genera

and 800 species, present in dry to moist environments, especially in lowlands in tropical and

subtropical regions around the world, extending to temperate regions (Luz, 2011). From the


chemical point of view, the most studied genera in this family are Mangifera, Rhus

(Toxicodendron), Anacardium, Spondias, Lannea, Semecarpus, Schinus, Pistacia, Lithraea,

Tapirira and Melanorrhoea. Mangifera, Rhus and Anacardium noteworthy for the number of

investigations concerning the chemical composition of species and their biological activities

of its extracts and metabolites. The studies of these species possible to verify the occurrence

of flavonoids, terpenes, steroids, xanthones, and especially of lipids and phenolic derivatives.

It is noteworthy that among flavonoids, the biflavonoids are the most frequent (Correia et al.

2006).

Among the species of this family is Spondias tuberosa Arr. Cam., popularly known as

“umbuzeiro”. The “umbuzeiro” is a species of great socioeconomic importance within the

family, as well as providing tasty and nutritious fruits, rich in water xylopodium (Nascimento-

Silva et al. 2008), represents an important source of income through the extraction to the

hinterland (Araújo and Neto, 2002). The leaves of S. tuberosa are popularly used as an

antiinflammatory, to combat diarrhea, dysentery and worms (Silva et al. 2012).

Phenolic compounds such as flavonoids, tannins, and anthocyanins are considered

important antioxidants and antimicrobial agents (Silva et al. 2012). Based on the information

that the class of metabolites frequently in the Anacardiaceae family are flavonoids, the

objectives of this study were to evaluate the antioxidant and antimicrobial activity of the

ethanol extract and fractions of Spondias tuberosa and isolate and identify the compound,

evaluating the possibility of the contribution of this substance in the investigated activities.

2. Results and Discussion

The substance 1 was isolated appearance of yellow powder, soluble in methanol,

showed melting point 185 - 187°C. In ultraviolet light at wavelengths of 254 and 366 nm

fluorescence substance showed and Rf: 0.58 in elution system ethyl acetate: methanol (75:25).

The UV spectrum of the substance 1 in methanol solution (0.05 mg / ml) was evaluated in the

range of 220-400 nm using a spectrophotometer model Nova 1600 UV, in this experiment we

observed two absorption bands one at 258 nm which is the absorption A ring and another

absorption at 358 nm corresponding ring B. The IR spectrum exhibited absorption bands

suggesting the presence of hydroxyl (3428 cm-1), chelated carbonyl (1654cm-1), carbon-

hydrogen bonds (2937 cm-1), carbon-oxygen bonds simple (1204 cm-1) and aromatic rings

(1598 and 1457 cm-1).

The flavonoid isolated from the methanolic fraction was identified by analysis of

spectra NMR of 1H and 13C, including the techniques DEPT, COSY, HMQC and HMBC and


comparing spectral data with those reported in the literature (Oliveira et al. 2013). The Table 1

makes comparisons of chemical shifts of the carbons of rutin with literature. This comparison

facilitated the assignment of the values of displacements of sugar units present in the

structure.

The analysis of the 1H NMR spectrum of the substance showed five signals for

aromatic hydrogens. The two doublets at δH (6.21, J = 1.95 Hz), and (6.39, J = 1.92 Hz)

hydrogens were assigned to H-6 and H-8 of A ring, respectively; the δH doublets in (7.67, J =

1.98 Hz), and (6.87, J = 8.43 Hz), and double doublet δH (7.61, J = 8.43 and 2.04 Hz)

corresponding to hydrogens H-2 ', H-5' and H-6 ', ring B, respectively. The presence of signals

that suggested the presence of two glycosidic units was observed, as presented multiple

signals in the range between δH 3.25 to 3.81 combined the two anomeric hydrogens at δH

5.10 and 4.52, the first unit was identified as glucose, by the presence of methylene hydrogens

in δH 3.81 and 3.40, the signal for methyl hydrogen δH 1.12 justifies the presence of

rhamnose. The 13C NMR spectrum showed signals 27 which fifteen correspond to carbons

methinic. The spectrum also showed distinctive signals to two carbons anomeric glycosidic

units (δC 104,88 e 102,57), there was also a sign of methyl carbon δC 18.02 (C-6 "') which

explains the presence of the glycoside unit rhamnose. In 2D NMR spectra (COSY-1Hx1H)

confirmed the couplings between the δH 6.87 (H-5'), with δH 7.61 (H-6'). In the HMQC

correlations between δH 5.10 (H-1'') with δC 104.88 (C-1''), and δH 4.52 (H-1''') with δC

102.57 (C-1''') the presence justified two glycosidic units. From the correlations shown in the

spectrum of HMBC between δH 5.10 (H-1'') with δC 135.77 (C-3) and δH 4.52 (H-1''') with

δC 68.72 (H-6'') it was possible to identify the position of the glycosidic units and other

groups such as δH 6.39 (H-8) with δC 158.68 (C-9) and δH 7.61 and 7.67 (H-6 'and H 2') with

δC 159.47 (C-2) the only values that were not consistent with the literature. The structure of

substance 1 (Figure 1) was elucidated by a combination of spectroscopic methods and by

comparison of their spectral data with that in the literature.

The results of the evaluation of antioxidant activity (Table 2) indicates that the

methanol fraction showed better antioxidant activity (27.83 ± 1.12) in the method of

scavenging of the DPPH, this result may be related to the flavonoid which was subsequently

isolated from this fraction, which showed significant activity (7.95 ± 0.83) of this method

compared with other fractions studied and the standards used, e.g. BHT (9.56 ± 1.09). The

rutin showed good antioxidant activity by DPPH method, but the method of co-oxidation of

system β-carotene/linoleic acid showed a lower percentage (17.35 ± 8.54%) compared to the

ethyl acetate fraction (62,28 ± 9,51%) and the standard BHA (75.27 ± 9.25%). The difference


in results of the two methods can be explained by the fact that flavonoids present phenolic

hydroxyls that act as a proton donor more easily, stabilizing the DPPH radical reducing it

hydrazine while the intermediate formed are relatively stable due to the resonance of the

aromatic ring present in such structures.

In the evaluation of the antibacterial activity results in Table 3 show that the ethanol

extract, fractions and the substance tested showed good activity in assays used against

bacteria Enterococcus faecalis, highlighting the ethanol extract (MIC 0.195 mg/ml; MBC 3.12

mg/ml ) and the ethyl acetate fraction (MIC 0.195 mg/ml; MBC 0.78 mg/ml ) with a value of

less than the standard Gentamicin inhibitory concentration (MIC 0.40 mg/ml; MBC 0.40

mg/ml). Enterococcus faecalis are microorganisms which can grow in a variety of media,

including soil, food, water and in many animals and cause disease when appropriate,

including endocarditis and urinary tract infections. More than 90% of human enterococcal

infections are caused by E. faecalis. (Silva 1999). The results showed that the ethanol extract,

fractions ethyl acetate and methanol were more effective against Gram-positive than Gram-

negative bacteria. The isolated flavonoid that it is a derivative of quercetin (rutin) was more

efficient against Gram-negative bacteria, e.g. against the Escherichia coli bacteria the MIC

result was equal to 1 mg/ml greater than the concentration found in the literature, with MIC

value equal to 0.064 mg/ml (Basile et al. 2000), however approached the MIC value of 0.5

mg/ml for quercetin (Taleb-Contini et al. 2003). The structure-activity relationship of

flavonoids was described in the literature (Taleb-Contini et al. 2003), in which it was

observed that were active flavonoids have in their structure a hydroxyl group at positions C7,

C3' and C4' and only quercetin which showed activity against Gram-negative bacteria have in

their structure one hydroxyl at position C3, this may explain the activity of rutin against Gran-

negative bacteria. However, it is necessary to make more specific study to better understand

the mechanism of action of the evaluated substance.

Through this research, it was possible to show the presence of a glycosylated

flavonoid leaves Spondias tuberosa Arruda, thus contributing to the phytochemical

knowledge of the “umbuzeiro” phytochemical, known primarily for its fruit plant in

northeastern Brazil. The isolation of rutin justified activities tested in this study, and popular

usage of the leaves as anti-inflammatory, to combat diarrhea, dysentery and worms. The

species S. tuberosa is a promising source of antioxidant phyto for future application in herbal

medicines that can fight free radicals and associated diseases.

Acknowledgments


The authors thanks to CRAD/HVASF by the botanical identification of the plant and the DS.c

Edilberto R. Silveira in the CENAUREMN that contributed with NMR analysis.

References

Araújo, F.P., Neto, M.T.C. 2002. The influence of physiological factors on grafting of umbú at

different time of the year. Rev. Bras. Frutic. 24: 752-755.

Basile, A., Sorboa, S., Giordanoa, S., Ricciardi, L., Ferrara, S., Montesano D., Cobianchia,

R.C., Vuotto, M.L., Ferrara, L. 2000. Antibacterial and allelopathic activity of extract

from Castanea sativa leaves. Fitoterapia. 71: S110-S116.

CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) 2003. Metodologia dos testes de sensibilidade

a agentes antimicrobianos por diluição para bactérias de crescimento aeróbico: norma

aprovada – 6ª ed., M7-A6, 23, 17.

Correia, S.J., David, J.P., David. J.M. 2006. Secundary metabolites from species of

anacardiaceae. Quim. Nova. 29: 1287-1300.

Luz, C.L.S. 2011. Anacardiaceae R. BR. in the phanerogamic flora of the São Paulo state. São

Paulo, 94 p. Dissertação de mestrado, Programa de Pós-Graduação em Botânica do

IBUSP, Universidade de São Paulo.

Silva, C.H.P.M. 1999. Bacteriologia ilustrada. 1ª edição. Editora Eventos.

Nascimento-Silva, O., Chinalia, L.A., Paiva, J.G.A. 2008. Caracterização histoquímica dos

folíolos de Spondias tuberosa Arruda (Anacardiaceae LINDL.). Rev Caatinga. 21: 62-

68.

Oliveira, D.M., Siqueira, E.P., Nunes, Y.R.F., Cota, B.B. 2013. Flavonoids from leaves of

Mauritia flexuosa. Braz. J. Pharmacogn. 23: 614-620.

Oliveira-Júnior, R.G., Araújo, C.S., Santana, C.R.R., Souza, G.R., Lima-Saraiva, S.R.G.,

Guimarães, A.L., Oliveira, A.P., Siqueira-Filho, J.A., Pacheco, A.G.M., Almeida,

J.R.G.S. 2012. Phytochemical screening, antioxidant and antibacterial activity of

extracts from the flowers of Neoglaziovia variegata (Bromeliaceae). J. Chem. Pharm.

Res. 4: 4489-4494.

Santana, C.R.R., Oliveira-Jr, R.G., Araújo, C.S., Souza, G.R., Lima-Saraiva, S.R.G.,

Guimarães, A. L., Oliveira, A.P., Filho, J.A.S., Pacheco, A.G.M., Almeida, J.R.G. 2012.

Phytochemical Screening, Antioxidant and Antibacterial Activity of Encholirium

spectabile (Bromeliaceae). Ij Science. 1: 1 – 19.

Silva, A.R.A., Morais, S.M., Marques, M.M.M., Oliveira, D.F., Barros, C.C., Almeida, R.R.,

Vieira, Í. G.P., Guedes, M.I.F. 2012. Chemical composition, antioxidant and


antibacterial activities of two Spondias species from Northeastern Brazil. Pharm Biol.

50: 740-746.

Taleb-Contini, S. H., Salvador, M.J., Watanabe, E., Ito, I.Y.,Oliveira, D.C.R. 2003.

Antimicrobial activity of flavonoids and steroids isolated from two Chromolaena

species. Braz. J. Pharm. Sci.. 39: 403-408.


OH

OH O

OH

OH

R1

O

R1 = O-rutinosyl

Figure 1. The structures of Quercetin-3-O-rutinoside (Rutin)


Table 1. Comparison of the 13C NMR data rutin with values described in the literature

(Oliveira et al. 2013).

C Rutin Rutin

(Literature)

2 159.47 158.69

3 135.77 136.72

4 179.54 179.61

5 163.11 162.17

6 100.19 100.10

7 166.40 167.19

8 95.08 95.01

9 158.68 159.51

10 105.73 106.06

1’ 123.29 123.30

2’ 117.85 117.84

3’ 145.99 146.02

4’ 149.96 150.45

5’ 116.22 116.22

6’ 123.71 123.70

1’’ 104.88 104.85

2’’ 75.88 75.90

3’’ 77.37 77.41

4’’ 71.56 71.57

5’’ 78.35 78.36

6’’ 68.72 68.72

1’’’ 102.57 102.58

2’’’ 72.25 72.27

3’’’ 72.41 72.41

4’’’ 74.10 74.10

5’’’ 69.86 70.59

6’’’ 18,02 18.03


Table 2. Antioxidant activity of ethanol extract, fractions methanol and ethyl acetate, rutin

and standards.

Notes: The IC50 values were obtained by interpolation from linear regression analysis with

95% of confidence level. IC50 is defined as the concentration sufficient to obtain 50% of a

maximum effect. Values are given as mean ± SD (n=3).

Sample DPPH

(IC50, µg/mL)

β-carotene

(% AA)

Ethanol extract 50.22 ± 0.78 52.52 ± 5.27

Ethyl acetate fraction 71.59 ± 3.51 62.28 ± 9.51

Methanol fraction 27.83 ± 1.12 14.88 ± 3.77

Rutin 7.95 ± 0.83 17.35 ± 8.54

Ascorbic acid 5.08 ± 1.02 10.61 ± 2.28

BHA 5.55 ± 1.02 75.27 ± 9.25

BHT 9.56 ± 1.09 70.68 ± 2.49


Table 3. Antibacterial activity of extracts of ethanol extract, fractions methanol and ethyl

acetate, rutin and standards.

Bacteria MIC (mg/ml) MBC (mg/ml)

EtOH AcOEt MeOH Ru Gen EtOH AcOEt MeOH Ru Gen

Gram-positive

Bacillus cereus 6,25 6,25 12,5 * 0,40 * 12,5 * * 0,40

Enterococcus

faecalis 0,195 0,195 6,25 1,0 0,40 3,12 0,78 * * 0,40

Staphylococcus

aureus 6,25 3,12 3,12 * 0,025 12,5 12,5 12,5 * 0,025

Gram-negative

Escherichia coli 0,195 0,78 6,25 1,0 * 6,25 0,78 * * 0,40

Klebsiella

pneumoniae 12,5 12,5 * * 0,05 12,5 * * * 0,05

Salmonela

choleraesuis 12,5 6,25 12,5 1,0 0,05 * 12,5 12,5 1,0 0,05

Serratia

marcescens 12,5 12,5 12,5 1,0 * * 12,5 * * 0,025

Shigella flexneri 12,5 12,5 12,5 1,0 * 12,5 12,5 12,5 1,0 0,025

Notes: MIC: minimal inhibitory concentration. MBC: minimum bactericidal concentration. (*)

absence of bacterial increase at all concentrations tested (n=3). EtOH= ethanolic extract; AcOEt= ethyl

acetate fraction; MeOH= methanol fraction;Ru= rutin; Gen= gentamicin.

§ão... · 2015. ficha catalográfica elaborada pelo sistema integrado de bibliotecas da univasf...

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