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Novos Sistemas Terapêuticos
Vantagens dos novos sistemas terapêuticos
Vectorização do p.a. Diminuição da dose Diminuição dos efeitos secundários
Vectorização
Vectorização Passiva
Vectorização Activa
Vectores
Lipossomas
Nanopartículas
Nanoesferas
Nanocápsulas
Nanopartículas sensíveis a campos magnéticos
Outras partículas
Vectores virais
Vectores de DNA
Terapia génica do sonho à realidade
Terapia génica
Introdução de genes, em células de pacientes, de modo a permitir a modulação ou a correcção de uma doença.
Subs. de genes defeituosos
Gene defeituoso Gene inexistente
Gene viral (infecção)
Inibição RNA m RNA m
Proteínas virais Proteína Subs. proteína Inib. proteína
Tratamento sintomático Sintomas clínicos
Manifestações patológicas Novo virus
Cura da doença na sua origem, sem efeitos secundários
Evita as limitações do uso de proteínas na prática clínica (baixa biodisponibilidade, fraca farmacocinética, elevados custos de fabrico)
A promessa da terapia génica
1940 gene e DNA
1960 – descoberta da estrutura do DNA 1972 – 1º splicing de
DNA
1973 – 1º experiências de clonagem (Bayer & Cohen)
1975 – isolamento de DNA Humano
1989- marcação genética
1993- Estudos de Imunoterapia anti-HIV
Terapia Génica – Breve História
Estudo de substituição de gene ADA
14 Setembro 1990 Ashanto Desilva
4 anos Imunodeficiência severa combinada
Adenosina desaminase - função adequada do sistema autoimune Vulnerável a infecções
TERAPIA GÈNICA - NIH
Criança com vida normal - 15 anos
Realidade Transportador eficiente e selectivo para determinado tipo
celular Capacidade de armazenar uma elevada quantidade de
material genético Estável na corrente sanguínea Entrega eficiente do material genético às células
Mas
Necessário o conhecimento profundo das doenças
Descoberta do genoma humano - identificação de genes causadores de doenças
ESTRATÉGIA ADEQUADA
Estratégia utilizadas em terapia génica somática
O conceito original - substituição de genes defeituosos ou introdução de genes inexistentes
Limitada a doenças causadas por um só gene Patologia Gene defeituoso ou inexistente Tecido/célula alvo Fibrose quística - CFTR (gene regulador da condutância transmembranar) Tracto respiratório Anemia de Fanconi (Complementação do grupo C) Células hematopoiéticas SCID (Adenosino desamoinase - ADA) Linfócitos
Estratégias utilizadas em terapia génica somática
Uso de genes marcadores - inserção de genes não residentes - monitorização (linfócitos de infiltração tumoral, transplantes de medula ossea em doentes com
leucemia); evolução de uma patologia (monitorizar o desenvolvimento de metástases)
Utilização de genes “terapêuticos” Proteínas farmacológicas genes “suicidas”
Genes que codificam a expressão de proteínas farmacologicamente activas (citoquinas, hormonas ou enzimas deficitárias) IL-2 ou factor de necrose tumoral ⇒ resposta
imunológica a tumores Produção de insulina, factor de coagulação IX ..
em órgãos não fisiológicos Produção sistémica de moléculas solúveis de
CD4
Inserção de genes “suicidas”
Terapia antiviral e antitumoral Inserção do gene codificador da cadeia A da
toxina diftérica controlado pelo promotor do HIV-1
Timidina - quinase do vírus Herpes simplex (HSV-Tk) - permite a bifosfatação do ganciclovir com inibição da síntese do ADN
Citosino-desaminase. Permite a conversão do 5-fluorcitosina em 5-fluoruracilo
(activação dos genes suicidas depende de promotores específicos das células tumorais)
O uso de oligonucleótidos “antisense”
Formação de estruturas do tipo triplex
O uso de oligonucleótidos “antisense” Por bloqueamento da acção dos pliceossomas Por ligação complementar do oligonucleótido
“antisense” a uma fracção do ARNm
O uso de ribozimas
Condicionantes subjacentes à aplicação da terapia génica
Condicionantes genéticas Profundo conhecimento da doença Mecanismos de controlo da expressão génica Técnicas e processos que possibilitem o transporte e cedência intracelular de material genético
Moléculas de ARN capases de promover a clivagem específica de outras moléculas de ARN
Transporte e cedência intracelular de material genético Propriedades fisico-químicas do material
genético n Macromoléculas hidrofílicas n Elevado peso molecular n Carga superficial negativa
n Alteração da biodisponibilidade (nucleases) n Internalização e tráfego intracelular n Translocação para o núcleo
Modificações químicas
MAS
N
NH
O
H3C
OOO
P
XO
O
{O - FosfodiesterS - FosforotioatoCH3 - Metilfosfanato
X
Propriedades fosfodiester metilfosfonato fosforotioato
Estabilidade biológica -- +++ ++
Uptake celular + ++ +/-
Eficácia de hibridização +++ + ++
Activação da RNase H +++ -- +++
• Plasmídeos bacterianos
• Injecção intramuscular • Microinjecção directa • Introdução forçada de partículas • Electroporação • Coprecipitação de partículas
Vectores de tipo viral - aprender com a natureza
LTR LTRGene terapêutico
Vector retroviralLTR LTRgag pol env
psi-
gag
polenv
Vector construtor
4 Integração noADN hospedeiro
produto genético
3 Infecção das células alvo
2 Formação de partículas virais
Partículas virais recombinantes
1 Transdução do vector viral
Retrovírus: RNA ⇒ transcriptase reversa ⇒ DNA
Falta de especificidade Tradução impossível em células que não se dividem Possibilidade de assumir a forma infecciosa Genes de pequenas dimensões Integração ao acaso ⇒ pró-oncogenes
Adenovírus: ADN • Infectam todas as células • Mutagenese limitada e menor patogenicidade • Transporte de material genético de grandes
dimensões Expressão transiente Imunogenicidade - administração repetida limitada
O CASO DO PACIENTE 18 University of Pensylnani´s Institute for Human Gene Therapy
Jesse Gelsinger 18 anos Ensaio clínico fase 1
Morte Adenovirus ⇒ ornitina transcarbamilase
Metabolização deficiente do nitrogénio existente nos alimentos
Resposta do Sistema Imunitário ARDS - Síndrome de stress respiratório no adulto
Privação de oxigénio - morte por asfixia
Vectores do tipo não viral Polímeros catiónicos Nanopartículas Lipossomas
Porquê transportadores positivos?
Condensação do material genético por anulação das
cargas positivas
MAS
Necessária libertação para ser activo
In vivo
Administração de lipoplexos na veia da cauda
Cauda Coração
Sistema capilar do pulmão Coração
Sistema capilar do coração Figado
Orgão (tumores)
1ª Barreira - circulação sanguínea Transportador eficiente e selectivo para determinado tipo
celular Capacidade de armazenar uma elevada quantidade de
material genético Estável na corrente sanguínea Entrega eficiente do material genético às células
Distribuição dos lipoplexos na presença de PEG
Ligação específica
Terapia génica Estratégia terapêutica promissora para cura de
doenças