Referências[1] Schuller, D. et al., 2005. FEMS Microbiol Ecol 51, 167-177.[2] Valero, DE. Et al., 2005. FEMS Yeast Res. 5, 959-969.[3] López V., et al., 2001. Int J Food Microbiol 68:75-81.[4] Legras, J. L., et al., 2005. Int. J. Food Microbiol. 102, 73-83.[5] Pérez, M.A., et al., 2001. Lett. Appl. Microbiol. 33, 461-466.[6] Aires-de-Sousa and Aires-de-Sousa, 2003, Bioinformatics. 19(1):30-6.[7] Demsar J, Zupan B, Leban G (2004) Orange: From Experimental Machine Learning to Interactive

Data Mining. White Paper, Faculty of Computer and Information Science, University of Ljubljana[8] Barnett, J.A., Payne, R.W. and Yarrow, D. 2000. Yeasts: Characteristics and Identification. 3rd Ed.,

Cambridge University Press, Cambridge, UK,

Os resultados estão, de um modo geral, de

acordo com os dados taxonómicos. No

entanto, foram encontradas estirpes com

fenótipos raros, com capacidade de consumir

arabinose ou ribose (D.O. ≥ 0.4)

A variação fenotípica foi mais evidente para

os testes relacionados com a selecção de

estirpes vínicas, como por exemplo a

tolerância ao etanol

INTRODUÇÃO

A análise de 11 microsatélites revelou um elevado grau de variabilidade genética (171 alelos); 54 alelos estavam presentes em pelo menos 5estirpes e foram usados para posteriores abordagens computacionais

ConclusõesAs estirpes apresentam uma elevada variabilidade genética, demonstrado pelogrande número (171) de alelos de microsatélites, entre as 103 estirpes. Estavariabilidade foi também observada no caso dos testes fenotípicos.

O classificador Bayesiano pode atribuir, com uma elevada probabilidade, umaestirpe à quinta de onde foi originalmente isolada.

Métodos hierárquicos mostraram que grupos de estirpes que partilham padrõesde crescimento para alguns meios de cultura podem também ser agrupados combase nas suas semelhanças alélicas.

O nosso estudo mostra o potencial de abordagens bioinformáticas para obterindícios sobre as características de uma estirpe a partir dos seus dados alélicosde microsatélites.

CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E FENOTÍPICA DE UMA COLECÇÃO DE LEVEDURAS VÍNICAS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE POR

ABORDAGENS COMPUTACIONAIS

R

E

S

U

L

T

A

D

O

S

A biologia celular e molecular da levedura Saccharomyces cerevisiae foi obtida a partir de um número muito limitado de estirpes de referência de laboratório. No entanto, a compreensão dos factores

ecológicos e evolutivos que moldaram as características genéticas de populações desta espécie são ainda desconhecidos. Nos anos após a sequenciação do genoma de S. cerevisiae, os investigadores

interessaram-se pela variabilidade genómica entre estirpes de leveduras selvagens de diferentes nichos ecológicos ou entre estirpes que são utilizados para diferentes aplicações tecnológicas. A variação

fenotípica entre estirpes de leveduras vínicas é bem conhecida tanto por geneticistas como pelos produtores de vinhos. No sentido de caracterizar a variabilidade genética desta espécie, foi constituída uma

colecção de estirpes vínicas de S. cerevisiae (350 estirpes, provenientes de ambientes vitivinícolas em Portugal) para a conservação da biodiversidade, desenvolvimento sustentável dos recursos genéticos e

partilha equitativa dos dados fenotípicos e genotípicos.

O objectivo do estudo consistiu na utilização de um conjunto de técnicas computacionais (baseado em técnicas de aprendizagem automática e algoritmos de minagem de dados (Orange Software)) para

encontrar associações entre dados genéticos (informação alélica de microsatélites) e fenotípicos em estirpes autóctones de S. cerevisiae que pertencem à colecção de estirpes acima mencionada.

previsão

real

A C PA 23 4 6C 3 14 8P 11 6 28

A tabela mostra a previsão da localização geográfica (quintas A, C e P), com base nos dadosgenéticos (microsatélites). Uma correcta atribuição de uma estirpe à respectiva quinta foi obtidapara 68%, 56% e 62% das estirpes para as quintas A, C e P respectivamente

AUC = 0.805“Classification

accuracy”= 0.633

Análise fenotípica

Cada fenótipo foi analisado pelo software Orange [7]. Os subgrupos resultantes foram analisados de acordo com “clustering” hierárquico e foi

determinado o valor de AUC. Na tabela seguinte estão resumidos os subgrupos com AUC superior a 0.75, que possuem a mesma taxa de crescimento e

perfis alélicos de microsatélites semelhantes.

Análise computacional

Todas as análises computacionais foram realizadas com o software Orange [7]. O rigor de previsão (predictive accuracy) foi medido para cada teste efectuado, usando um parâmetro

estatístico denominado area under receiver operating characteristics score (AUC), que estima a probabilidade que o modelo preditivo possa correctamente distinguir duas diferentes

localizações ou dois grupos de estirpes para um fenótipo específico.

Testes fenotípicos

A fenotipagem incluiu a avaliação de 24 testes usados na taxonomia de leveduras [7] ou na selecção de estirpes de leveduras vínicas. Células de leveduras foram retiradas de aliquotas

congeladas e pré-inoculadas em 10mL do meio de cultura a ser usado. Desta suspensão, 15 µL foram inoculados em 4 ou 8 réplicas em microplacas de 96 poços, contendo 135 µL de meio

de cultura, de modo a que a densidade celular final fosse 0.1. Mediu-se a A640 final, ao fim de 22h de crescimento. Foram testados diversos meios de cultura tais como meio MS (que

simula parcialmente a composição do vinho) ou meio contendo diferentes fontes de carbono (glucose, ribose, arabinose, sacarose, galactose, rafinose, maltose, glicerol, acetato de

potássio), diferentes fontes de azoto (peptona, sulfato de amónia, imidazole, ureia), e meio com etanol. O crescimento em meio MS foi avaliado a diferentes temperaturas (4ºC, 18ºC,

30ºC, 37ºC e 42ºC). A resistência ao stress osmótico foi testada em meio MS com KCl (1M). A produção de H2S foi avaliada em meio BIGGY. O potencial para produzir compostos

aromáticos foi avaliada em meio suplementado com cerulenina e trifluoroleucina.

Selecção de estirpes

Devido ao elevado número de estirpes, redes neuronais (Kohonen self-organizing maps) foram usadas, através do software JATOON [6] para seleccionar um subgrupo de 103 estirpes

geneticamente distintas, com base nos dados de microsatélites. Este subgrupo foi usado para caracterização fenotípica e análise de dados.

Colecção de estirpes

As estirpes usadas neste estudo foram obtidas em ambientes vitivinícolas na Região de Vinhos Verdes em Portugal, em estudos anteriores relacionados com a ecologia e biodiversidade de

Saccharomyces cerevisiae. [1, 2].

Identificação molecular

As estirpes isoladas foram analisadas por padrões de restrição de DNA mitocondrial (mtDNA RFLP) [3]. Estirpes com perfis idênticos de mtDNA RFLP foram agrupados, e uma estirpe

representativa foi posteriormente caracterizada analisando 11 microsatélites específicos de S. cerevisiae [4,5].

Caracterização genética através de um conjunto de microsatélites altamente polimórficos

0,00

0,50

1,00

4 5 12 13 14 17 13 15 16 24 25 26 27 20 21 22 23 24 25 52 55 66 67 68 71 69 70 71 72 76 17 27 28 7 11 13 14 15 16 17 20 21 22 23 24 20 24 14 15 16 17 15 16 17

C5 C11 C4 ScYOR267 YPL009 ScAAT1 ScAAT2 ScAA3 ScAA4 ScAAT5 ScAAT6

Alelos (Nº de repetições)

Frequência dos microsatélites mais representativos

AgradecimentosEste trabalho foi financiado pelos programas POCI 2010 (FEDER /FCT,POCTI/AGR/56102/2004), PTDC (AGR-ALI/103392/2008) e o Sétimo ProgramaQuadro da Comunidade Europeia (7PQ / 2007-2013) sob o contrato n º 232454. Osautores agradecem a João Aires-de-Sousa pelo apior com as redes neuronais e osoftware JATOON.Agradece-se também a Magda Silva Graça pelo apoio com o sequenciador.

Caracterização fenotípica

Estir

pe/ t

este

feno

tíico 4

ºC

4 ºC

18o C

30o C

30o C

45o C

45o C

YNB

+

gala

ctos

e

YNB

+

gala

ctos

e

YNB

+

mal

tose

YNB

+

mal

tose

YNB

+

rafin

ose

YNB

+

rafin

ose

YNB

+

sulfa

tode

am

ónia

YNB

+

urei

a

YNB

+

urei

a

etan

ol6%

Pro

duçã

ode

H2S

A64

0=0.

1

A64

0=0.

1

A64

0=1.

4

A64

0 <

1.0

A64

0 ≥

1.0

A64

0 ≤

0.2

A64

0 =

0.1

A64

0 =

0.1

A64

0 =

1.1

A64

0 =

0.8

A64

0 ≥

1.

2

0.5

≤ A

640 ≥

0.6

A64

0 =

1.0

A64

0 =

1.3

A64

0 =

1.1

A64

0 =

1.4

A64

0 ≤

0.6

clas

ses

1, 2

e 3

Técnica de modelação linear linear kNN tree kNN linear linear linear linear linear tree kNN linear linear linear linear linear tree

AUC 0.83 0.77 0.80 0.77 0.76 0.77 0.75 0.77 0.76 0.90 0.77 0.75 0.77 0.85 0.80 0.79 0.77 0.83Percentage m

(%)8.2 8.2 30.0 100 22.3 6.9 7.3 100 30.0 50.0 61.8 23.1 100 90.9 100 79,3 100 21.4

A contribuição de cada alelo para a formação dos grupos é quantificada de acordo como Relief F score

O gráfico mostra os 5 alelos que mais contribuiram para a formação dos grupos nosquais a percentagem foi 100% na análise anterior

O microsatélites ScAAT3 é o mais representado, contribuindo com 5 alelos para aformação dos grupos

O objectivo do estudo consistiu na utilização de um conjunto de técnicas computacionais para encontrar associações entre dados genéticos (informação alélica de microsatélites) e fenotípicos em estirpes autóctones de

Saccharomyces cerevisiae. Uma colecção de 300 estirpes de S. cerevisiae foi obtida em ambientes vitivinícolas de Portugal durante os últimos anos. Recorrendo a redes neuronais foi constituído um subconjunto de 103 estirpes e

caracterizado posteriormente quanto à sua combinação alélica de 11 microsatélites polimórficos específicos de S. cerevisiae. Os fenótipos foram avaliados através de critérios taxonómicos (testes de assimilação de carbono e azoto,

crescimento a diferentes temperaturas) e testes com relevância biotecnológica (resistência ao etanol, formação de H2S ou precursores aromáticos). De um modo geral, os resultados fenotípicos expressos como densidade óptica

(A640) após 22 horas de crescimento estão de acordo com dados taxonómicos, embora com algumas excepções uma vez que algumas estirpes foram capazes de consumir arabinose e ribose. Apesar da sua proveniência de regiões

vitivinícolas próximas (50-100 km), foi obtido um perfil fenotípico único para cada estirpe, o que demonstra a sua elevada variabilidade. A partir da informação alélica dos microsatélites, foi treinado um classificador Bayesiano que

conseguiu atribuir a maioria das estirpes à quinta a partir da qual foram isoladas (AUC=0.81, p<10-8). Identificamos também subgrupos de estirpes que partilham semelhanças entre padrões alélicos de microsatélites e perfis

fenotípicos (AUC>0.75). Estes subgrupos foram encontrados para todas as estirpes com baixa resistência ao etanol (A640<0.6), crescimento em diferentes meios (meio MS a 30°C, meio YNB com galactose e rafinose como fonte de

carbono ou ureia como fonte de azoto). Este estudo demonstra que as referidas abordagens computacionais podem ser usadas para estabelecer relações genótipo-fenótipo e para prever o potencial biotecnológico de uma estirpe,

como por exemplo a sua resistência ao etanol.

RESUMO

MATERIAIS

E

MÉTODOS

Colecção de estirpes de Saccharomyces cerevisiae A partir da fase final da fermentação realizada com

174 amostras de uvas colhidas entre 2001 e 2003

foram obtidos 2520 isolados de S. cerevisiae

350 estirpes de S. cerevisiae foram obtidas, com

base no perfil de restrição do DNA mitocondrial

Quinta CQuinta A

Quinta P

Abordagens computacionais

Minho Total2001 2002 2003 2006Nº de amostras recolhidas 36 18 36 84 174Nº de fermentações espontâneas 19 12 23 30 84Nº de isolados 570 360 690 900 2520Nº de estirpes de S. cerevisiae 110 56 137 47 350Percentagem de S. cerevisiae entre a florafermentativa total 100% 100% 100% 100%

RESULTADOS

Previsão da localização geográfica

Densidade optica (A640) Classes

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 0 1 2 3

Temperaturas

4oC 73 28 245oC 96 5 218oC 1 3 5 14 13 10 17 20 2030oC 2 4 7 14 11 39 20 5 137oC 4 14 28 12 9 17 11 7 1

Fontes de Carbono

Glucose 1 1 4 15 15 9 8 28 22Sacarose 2 5 1 3 6 21 15 19 16 9 6Galactose 14 3 3 1 1 2 9 20 15 20 14 1Rafinose 4 3 1 18 21 19 19 5 6 4 3Maltose 1 1 2 3 11 12 6 18 15 19 11 4Glicerol 58 32 8 5

Acetato de Potássio 81 18 2 2Ribose 61 23 9 7 2 1

Arabinose 67 33 2 1

Fontes de Azoto

Peptona 1 2 1 2 2 16 30 49Sulfato de Amónia 2 8 8 12 9 9 7 5 22 21

Imidazole 8 26 14 9 5 3 3 8 9 13 5Ureia 1 1 5 10 3 4 9 8 7 26 29

Condições de Stress

KCl 7 8 16 18 13 13 12 5 9 2Etanol 6% 2 2 1 1 6 4 8 15 14 23 19 6 2

Vinhos 92 8 2 1Produção de H2S 5 20 48 30

Cerulenina 3 100TFL 26 77

Ricardo Franco-Duarte1, Lan Umek 2, Blaz Zupan 2,3, Dorit Schuller1 *

1 Centro de Biologia Molecular e Ambiental (CBMA), Universidade do Minho, Braga, Portugal2 Faculty of Computer and Information Science, University of Ljubljana, Slovenia

3 Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA*e-mail: dschuller@bio.uminho.pt