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Método de confirmação de análise qualitativa de um metabolito específico

da heroína por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrofotometria de

Massa

Ana Pacheco 1, Tenente Nuno Mendes Flores 2, Ana Jaleco

1

1. Universidade Atlântica, Barcarena/Oeiras;

2. Laboratórtio de Análises Farmaco-Toxicologicas da Marinha Portuguesa, Lisboa

Resumo

Os opiáceos são moléculas de origem natural ou sintética, cujos efeitos a nível da célula

são transmitidos por recetores específicos, tanto a nível do sistema nervoso central,

como do sistema nervoso periférico. As principais vias de administração de opiáceos

incluem a via oral e intravenosa, embora os opióides possam também ser inalados ou

fumados. A heroína é o opióide mais comumente vendido no mercado ilegal de drogas,

sendo rapidamente metabolizada por desacetilação em monoacetilmorfina (6-MAM) e

depois em morfina. Neste estudo realizou-se a validação de um método de confirmação

de análise qualitativa do metabolito 6-MAM por cromatografia gasosa acoplada a

espectrofotometria de massa, em urina humana. Para a validação da técnica recorreu-se

a cinco parâmetros de validação, tendo-se obtido resultados aceitáveis. Concluiu-se que

a técnica utilizada é altamente precisa e sensivel. O presente estudo irá permitir efectuar

com rapidez e fiabilidade, as análises rotineiras dos colaboradores da Marinha.

Abstract

Opioids they are molecules of natural or synthetic origin whose effects on the cell are

transmitted by specific receptors at both of the central nervous system as the peripheral

nervous system. The major routes of administration of opioids include oral and

intravenous administration. Although opioids can also be inhaled or smoked. Heroin is

an opioid most common sold on the illegal drug market, being rapidly metabolized

bydeacetylation in monoacetilmorfina , then morphine.This study was performed to

confirm that method of qualitative analysis of the metabolite 6-MAM by gas

chromatography coupled to mass spectrometry in human urine. To validate the

technique we appealed up to five parameters, Having obtained acceptable results. It was

concluded that the technique is highly accurate and sensitive. This study will allow

quickly and reliably perform the routine analysis of employees of the Navy.

Palavras-Chave: Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrofotometria de Massa (CG-

MS), Heroína, 6-monoacetilmorfina (6-MAM), Análise qualitativa

1

Introdução

As drogas são substâncias psicoativas que, quando ingeridas, bebidas, injetadas,

fumadas ou inaladas, afetam o sistema nervoso central. (1)

Segundo o Relatório Europeu sobre drogas - Tendências e Evoluções (2013), existem

diversas drogas, entre as quais anfetaminas, cocaína, cannabis, ecstasy e drogas

opiáceas, entre as quais se encontram a morfina e a heroína. A cocaína, as anfetaminas e

o ecstasy são os estimulantes ilícitos mais consumidos na Europa. (2)

O consumo de droga encontra-se associado, directa ou indirectamente, a diversas

consequências negativas a nível social e da saúde. Nomeadamente, e

independentemente da substância consumida, o consumo de droga injectável continua a

ser um mecanismo de transmissão de doenças infectocontagiosas, incluindo o

HIV/SIDA e a hepatite C. (2)

O consumo de droga injectada, nos países Europeus, está normalmente associado aos

opiáceos, embora também possa estar associado às anfetaminas, constituindo um

problema grave. (2)

O ópio é obtido através da incisão nas folhas da planta Papaver somniferum, e

apresenta-se com um aspecto leitoso que solidifica rapidamente adquirindo um tom

acastanhados quando em contacto com o ar. (3)

Os opiáceos são moléculas de origem natural ou sintética, cujos efeitos a nível da célula

sao transmitidos por recetores específicos (recetores opiáceos), tanto a nível do sistema

nervso central, como do sistema nervoso periférico. (4)

A família de receptores opiáceos

é constituído por três membros, a μ, . (4)

A heroína, a codeida, a metadona e a

morfina, entre outras substâncias pertencem a este grupo. (4) (5)

As principais vias de administração de opiáceos incluem a via oral e intravenosa,

embora os opióides possam também ser inalados ou fumados. (6)

Na maioria dos países

Europeus, o consumo por via endovenosa está normalmente associado aos opiáceos,

embora em alguns países esteja associado às anfetaminas. (7)

A administração através de

inalação (via pulmonar) é a mais utilizada, seguindo-se a administração por via

endovenosa e por fim a administração por via gastrointestinal (ingestão). (7)

O consumo de opiáceos continua a ser responsável por uma percentagem

desproporcionadamente elevada da mortalidade e da morbilidade resultantes do

consumo de droga na Europa. O opiáceo mais consumido é a heroína, que pode ser

2

fumada, inalada ou injetada sendo que no mercado ilícito também estão disponíveis

vários outros opiáceos sintéticos, como a buprenorfina, a metadona e o fentanil. (2)

A heroína (3,6-o-diacetilmorfina, diamorfina, DAM) é o opióide mais comummente

vendido no mercado ilegal de drogas.(8)

O consumo de heroína, quando por via

intravenosa, tem efeitos mais violentos. (7) (9)

A heroína é rapidamente metabolizada, tem uma semi-vida de aproximadamente 5

minutos, no organismo, é rapidamente metabolizada por desacetilação em

monoacetilmorfina (6-MAM) e depois em morfina. (5) (8) (10) (11)

A presença de 6- monoacetilmorfina na urina é considerada como um marcador

específico para o uso ilegal de heroína. (8) (11)

As técnicas forenses para a detecção de drogas, como os opiáceos na urina, envolvem a

detecção de morfina ou de codeína, ou de ambas. Normalmente, apenas a morfina total

ou a codeína total é determinada, o que torna difícil determinar a origem dos opiáceos

detetados na urina. (8)

Tanto a cromatografia líquida acoplada à espectrofotometria de massa (LC-MS) como a

cromatografia gasosa acoplada à espectrofotometria de massa (GC-MS) fornecem

resultados precisos, específicos e sem interferência de substâncias semelhantes às

analisadas, sendo também reprodutíveis em amostras de urina. (12)

A GC-MS fornece um processo mais sensível para a quantificação de opiáceos comuns,

utilizando uma pequena quantidade de amostra. É considerado um método sensível e

confiável para a análise de diversas substâncias em simultâneo, incluindo o metabolito

6-MAM, mostrando também ser preciso e exacto. (13)

Segundo Guillot, Lefebvre e Weber, a cromatografia gasosa acoplada à

espectrofotometria de massa (GC-MS) parece ser o método mais adequado para análises

forenses, pois dá-nos uma indicação conclusiva quanto à droga presente na amostra. (14)

Com vista a validar esta mesma técnica e no contexto das análises de rotina realizadas

em urina de colaboradores da marinha portuguesa, propusemo-nos realizar a avaliação

de cinco parâmetros, sendo estes, a especificidade/seletividade, capacidade de

identificação, limite de detecção, arrastamento e repetibilidade, de modo a permitir a

validação de um método de confirmação do consumo de heroína através da detecção do

seu metabolito (6-MAM), com o intuito de permitir futuramente análises mais rápidas,

com elevada fiabilidade e de menor custo com a utilização de um pequeno volume de

amostra permitindo assim a optimização do método.

3

Metodologia

Parâmetros de validação

Para validar o método no equipamento HP GC 6890/MSD 6890, com introdução de

Padrão Interno deuterado e extracção sólido-líquido, foram efectuados os estudos de

validação.

Para a realização desta técnica é sempre necessário um deuterado do

opiáceo, usado como padrão interno. (15)

Esta técnica fornece um processo mais sensível

para a identificação da presença de opiáceos comuns, utilizando uma pequena quantidade

de amostra. (15)

É considerado um método sensível e confiável para a análise de diversas

substâncias em simultâneo, incluindo o metabolito 6-MAM, mostrando também ser

preciso e exacto. (6)

De acordo com o método de Cromatografia utilizado temos de ter em conta alguns

fatores:

Rampa de temperatura do aparelho (etapa importante no processamento da amostra no

cromatografo):

Esta rampa de temperatura foi definida, após várias tentativas, anteriormente:

Temp. inicial é de 170ºC durante 0.30 minutos

A temp aumenta 10 ºC por mint até atingir os 290ºC e fica nesta temperatura

durante 2.00 minutos

(Este processo de tempo demora no total 14.30 min)

Iões a pesquisar, na pesquisa do metabolito 6-MAM:

399.0( ião principal, o mais abundante)

340.0

287.0

402.0 ( ião da 6-MAM-D3 )- Padrão interno

Para a realização desta técnica é sempre necessário um deuterado do opiáceo, usado

como padrão interno. (15)

Amostras

4

As urinas utilizadas para a avaliação dos vários parâmetros de validação correspondem a

amostras negativas de urina, oriundas de controlo negativo da Thermo SCIENTIFIC

Level 1 Negative com certificado nº XS12051.

Procedimento geral

Para o pesquisa do metabolito 6-MAM de heroína por GC-MS guiamo nos pelo seguinte

procedimento:

A extracção de do metabolito 6-MAM da heroina realiza se a partir de 2,5 mL de

urina.Utiliza se um Toxitube A (Tubo especifico para extracções de drogas básicas).

Adiciona se 2,5 mL de urina (A bula recomenda 3 mL de urina , mas estamos a tentar

optimizar o método). Adicionar em todas as amostras 50 µl de 6 MAM – D3 a 10 ppm (

Deuterado)- Padrão Interno. Coloca se a rodar (Roda SELECTA) durante 10 minutos.

Centrifuga se a 3000 rpm durante 10 minutos. Separação da fase orgânica por decantação.

Evaporação com azoto e em banho-maria a 50ºC. Reconstituir a amostra com 50 µl de

acetato de etilo (Esterilizar reação de derivação) e 50 µl BSTFA/ TCMS (99:1) –

Reagente de Derivação (Marcar a molécula para melhorar a sua visualização no

ionograma). Aquecer 30 minutos a 60º C num banho seco (otimizar a reação). Transferir

para vials devidamente identificados. Injetar (retirar do vial para o equipamento através

da seringa ejetora) no equipamento, Agilent 6890 Cromatografo / Espectofetometro de

massa. Registar resultados ( programa GS-MS Instrument).

Neste método detecta-se o consumo de opiáceos, nomeadamente o metabolito da heroina

(6-MAM).

As urinas são submetidas a uma hidrólise ácida e após extracção e derivatização são

analisadas por GC/MS. A confirmação qualitativa é realizada por comparação directa dos

tempo de retenção relativo (TRR) e das abundâncias relativas dos iões de diagnóstico da

amostra suspeita e de uma urina controlo.

Para a validação do método de confirmação qualitativa do metabolito da heroína (6-

MAM) por cromatografia gasosa acoplada à espectrofotometria de massa (GC-MS),

foram avaliados cinco parâmetros: especificidade/selectividade, capacidade de

identificação, limite de detecção, arrastamento e repetibilidade.

5

1. Especificidade / selectividade

A especificidade/selectividade foi efectuada da seguinte forma:

Preparou-se 10 amostras de controlo negativo (alíquotas de 2.5 mL), utilizando o

controlo acima descrito.

Preparou-se 10 amostras de controlo positivas (alíquotas de 2.5 mL), utilizando o

controlo negativo acima descrito fortificando com o analito de 6- Mam.(200ul)

- Em todas as amostras fortificou se com 200µl de padrão interno 6-MAM D3

(Deuterado).

2. Capacidade de identificação

No estudo de especificidade, foi fortificada uma amostra a uma concentração

correspondente a 200 ng/mL do metabolito pelo que esta mesma amostra foi utilizada

para determinar a capacidade de identificação.

O estudo da capacidade de identificação foi efectuado da seguinte forma:

Prepararam-se 10 amostras de controlo negativo (alíquotas de 2.5 mL), utilizando

o controlo acima descrito.

Prepararam-se 10 amostras de controlo positivas (alíquotas de 2.5 mL), utilizando

o controlo negativo acima descrito fortificando o com 200 µl o analito de 6-

MAM.

- Todas as amostras foram fortificadas com 200ul de padrão interno 6-MAM D3

(Deuterado).

Comparação das abundâncias relativas dos iões

Na tabela 1 e 2 apresentam-se os iões diagnóstico seleccionados para cumprimento das

relações iónicas da 6-Mam.

Tabela 1- Iões diagnóstico seleccionados - 6-MAM

Valores m/z dos iões

399

340

287

Tabela 2- Iões diagnóstico seleccionados - 6-MAM D3


402

6

3. Limite de detecção

Foi preparada uma curva de calibração com 10 pontos para a 6-MAM. A fortificação das

urinas foi feita utilizando soluções metanólicas do metabolito 6- MAM. As concentrações

escolhidas para os pontos das curvas de calibração e os respectivos volumes utilizados

das soluções metanólicas apresentam-se na tabela 3. O volume de urina utilizado foi de

2.5 mL, tal como descrito nos parâmetros de validação de confirmação qualitativa da 6-

Mam.

Foram usados como padrões internos uma solução metanólica de 6- MAM-D3,

preparadas a partir de diluições da solução-mãe. O volume utilizado de padrão interno foi

60 L.

Tabela 3

Preparação da curva de calibração do estudo do limite de detecção e quantificação 6-Mam

Concentracção (ng/mL) Volume (L)

1 50 15

2 60 18

3 70 21

4 80 24

5 90 27

6 100 30

7 110 33

8 120 36

9 130 39

10 140 42

11 150 45

12 160 48

13 170 51

14 180 54

15 190 57

16 200 60

Quando o coeficiente de correlação é superior a 0,95, utilizou-se a equação seguinte:

LD = (3.3 Sy/x)/b

onde: Sy/x é o desvio padrão residual da curva de calibração

b é o declive da recta

7

4. Avaliação do arrastamento

O estudo do arrastamento foi efectuado injectando intercaladamente com cinco amostras

de concentração de gama alta (controlos da repetibilidade de 1000ng) com cinco vails

contento metanol (branco).

5. Repetibilidade

O estudo da repetibilidade foi efectuado utilizando cinco alíquotas contaminadas com 6-

Mam numa concentração de 200 ng/mL e 1000 ng/mL foram extraídas e injectadas.

Foi ainda adicionado a cada alíquota padrão interno -6-MAM D3 numa concentração 200

ng/mL

Resultados/ Discussão

1. Especificidade/ Seletividade

A especificidade ou seletividade é a capacidade de um método discriminar um analíto em

partiular numa mistura complexa, sem interferências significativas dos outros

componentes dessa mistura (ex: componentes de matriz, metabolitos, impurezas,

produtos de degradação ou outros). (16) (17) (18)

A tabela abaixo traduz nos os resultados referentes ao estudo da especificidade e

selectividade.

Tabela 4- Resultados e tratamento dos resultados da especificidade e selectividade.

Parte I

Código da Urina branca Resultado Interferências Observações

Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar










8

PERCENTAGEM DE FALSOS POSITIVOS

0 % Parte II

Código da Urina Positiva Resultado Interferências Observações

Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar










PERCENTAGEM DE FALSOS NEGATIVOS

0 %

Alguns autores consideram os resultados obtidos através de GC-MS como sendo

específicos e sem interferência de substâncias semelhantes (12)

, tal como podemos

observar nos resultados obtidos na avaliação da especificidade / selectividade, podendo

assim considerar o nosso método bastante específico e selectivo para a confirmação da

presença do metabolito 6-MAM em urina.

A percentagem de falsos positivos deve ser de 0% e a percentagem de falsos negativos

deve ser inferior a 10%. (19)

O método não apresenta interferências significativas, pois as

percentagens estimadas de falsos negativos e falsos positivos foram de 0% nos dois

casos.

Assim sendo, o parâmetro avaliado cumpre os critérios de validação impostos, visto ter-

se obtido percentagens estimadas de falsos positivos e de falsos negativos, de 0%.

2. Capacidade de identificação

Para avaliar a capacidade de identificação do método, o analista deverá testar o método

em amostras positivas em condições normais de funcionamento do equipamento. (17) (18)

A abundância relativa dos 3 iões, 399,340 e 287 deve ser superior a 5%. (19) A diferença

das abundâncias relativas correspondentes à amostra suspeita e à urina controlo de cada

um dos iões seleccionados não pode ser superior aos valores apresentados na tabela 5.

9

Tabela 5- Valores de tolerância máxima para as abundâncias relativas dos iões

Gama Tolerância máxima para as abundâncias relativas (GC/MS)

> 50% 10%

25 - 50% 20%

< 25% 5%

As tabelas abaixo indicam nos os resultados da capacidade de identificação.

Tabela 6- Tratamento dos resultados da capacidade de identificação de 6-MAM

Valores m/z

dos iões diagnósticos

Controlo (positivo10) Diferença máxima

admissivel

T.R.R

Abundância

absoluta

Abundância

relativa

Sinal/ruido

Diferença absoluta

Diferença relativa

< 1%

399

2098

100,0%

- -

340

1975

94,1%

- 84.1-104.1

287

1196

57,0%

- 47.0-67.0


diagnósticos

Positivo 1 Diferença máxima

admissivel

T.R.R

Abundância absoluta

Abundância relativa (%)

Sinal/ruido Diferença absoluta

Diferença relativa

< 1%

399

1462

100,0% - -

340

1503

88,8% - 84.1-104.1

287

884

57,7% - 47.0-67.0


diagnósticos


admissivel

T.R.R




Diferença relativa

< 1%

399

1839

100,0% - -

340

1620

88,8% - 84.1-104.1

287

1043

57,7% - 47.0-67.0

10


diagnósticos


admissivel

T.R.R




Diferença relativa

< 1% 399 2447 100,0%

- -

340 2339 88,8%

- 84.1-104.1

287 1406 57,7%

- 47.0-67.0


diagnósticos


admissivel

T.R.R




Diferença relativa

< 1%

399 1856 100,0%

- -

340 1743 88,8%

- 84.1-104.1

287 1044 57,7%

- 47.0-67.0


diagnósticos


admissivel

T.R.R




Diferença relativa

< 1% 399 1918 100,0%

- -

340 1706 88,8%

- 84.1-104.1

287 1100 57,7%

- 47.0-67.0


diagnósticos


admissivel

T.R.R




Diferença relativa

< 1% 399 2094 100,0%

- -

340 1842 88,8%

- 84.1-104.1

287 1194 57,7%

- 47.0-67.0


diagnósticos


admissivel

T.R.R




Diferença relativa

< 1%

399 2123 100,0%

- -

340 2067 88,8%

- 84.1-104.1

287 1241 57,7%

- 47.0-67.0

11

Para considerar uma amostra como positiva é necessário que o ião principal,o ião 399,

esteja presente e seja o mais abundante na amostra, correspondendo a uma abundância

relativa de 100%. A abundância relativa dos iões diagnóstico 340 e 287 são obtidos

através da abundância absoluta dos mesmo, quando comparados com a abundância

absoluta e abundância relativa obtidas para o ião 399. Para as amostras serem

consideradas positivas, para além da presença do ião 399, os valores da abundância

relativa dos iões 340 e 287 têm obrigatoriamente que respeitar os critérios de

conformidade baseados nos valores de tolerância máxima para as abundâncias relativas

dos iões admitidos para GC-MS (tabela 5).

Como para todas as amostras testadas os valores da abundância relativa dos iões 340 e

287 respeitam os valores de tolerância máxima admíssivel para GC-MS, valores entre

84.1 e 104.1 para o ião 340 e entre 47.0 e 67.0 para o ião 287, podemos considerar todas

as amostras como positivas. Para a validação do método é necessário que a percentagem

referente aos falsos negativos seja igual ou inferior a 10%.

Com base nestes resultados e nos dados obtidos no parâmetro anterior (especificidade /

selectividade) relativamente à percentagem de falsos negativos, neste caso 0% de falsos

negativos, podemos considerar o método válido.


diagnósticos


admissivel

T.R.R




Diferença relativa

< 1%

399 1689 100,0%

- -

340 1621 88,8%

- 84.1-104.1

287 951 57,7%

- 47.0-67.0


diagnósticos


admissivel

T.R.R




Diferença relativa

< 1%

399 2291 100,0%

- -

340 2035 88,8%

- 84.1-104.1

287 1321 57,7%

- 47.0-67.0

12

Perante estes resultados concluisse que o método de confirmação qualitativa da 6-Mam

em urina humana por GC/MS possui uma capacidade de identificação conforme com os

resultados acima descritos, pois a percentagem de falsos negativos é inferior a 10%.

3. Limite de Detecção

Quantidade mínima de analito que pode ser detectada por um método mas não

necessariamente quantificada. (17)

Tabela 7- Resultados e tratamento dos resultados do estudo do limite de detecção da 6-MAM

Concentração (ng/mL)

Área Absoluta

Área Absoluta

Área Absoluta do PI bsoluta do PI

ÁÁrea Relativa tiva

50 599 2632 0,2276

60 734 2603 0,2820

70 917 2685 0,3415

80 968 2568 0,3769

90 1154 2674 0,4316

100 1359 2733 0,4973

110 1395 2597 0,5372

120 1567 2607 0,6011

130 1595 2504 0,6370

140 1740 2606 0,6677

150 1793 2336 0,7676

160 1966 2385 0,8243

170 2198 2501 0,8788

180 2286 2384 0,9589

190 2312 2372 0,9747

200 2431 2493 0,9751

Gráfico 1- Curva de quantificação do estudo do limite de detecção da 6-MAM

LD =13,3631057

13

Obteve se o seguinte resultado:

Limite de detecção para o 6-MAM: 13,4 ng/mL.

Alguns autores consideram esta técnica simples e reprodutível, uma vez que proporciona

um baixo limite de detecção (14)

, tal como é possível observar pelo resultado obtido para a

avaliação do limite de detecção, cujo resultado é menor que o valor mínimo de detecção.

O método de confirmação qualitativa da 6-MAM em urina humana por GC/MS possui o

limite inferior de detecção de 13,4 ng/mL no equipamento HP GC 6890/MSD 6890

(GCMS01).

Para a validação deste parâmetro é necessário que o limite de detecção obtido seja menor

que o valor mínimo de detecção, sendo que o valor aplicado para o 6-MAM é de 100

ng/mL.

O método cumpre os requisitos definidos para os limites de detecção, atendendo a que o

resultado obtido foi de 13,4 ng/mL pode constatar-se o cumprimento dos requisitos para

os limites de detecção.

4. Avaliação do Arrastamento

O estudo de possíveis fenómenos de arrastamento pode ser efectuado em conjunto com

qualquer dos protocolos descritos anteriormente (Especificidade/selectividade,

capacidade de identificação, limite de detecção e quantificação). O estudo deve ser

executado com gama média ou alta. (17) (18)

Tabela 8- Resultados do estudo do arrastamento

Critério de conformidade

CONTROLO POS ID Abundância Abund. relativa Lim. inferior Lim. superior

Pico base 399 3686 100,0% N/A

Ião Diagnóstico 1 340 3404 92,3% 82,3% 102,3%

Ião Diagnóstico 2 287 2020 54,8% 44,8% 64,8%

TR 6MAM 7,943

7,743 8,143

PI 7,926 ou

TRR 1,002 0,992 1,012

14

ARRAST-NEG1 ID Abundância Abund. relativa Conformidade

Pico base 399 130 100,0% N/A

Ião Diagnóstico 1 340 60 46,2% Não Conforme


Ião Diagnóstico 3 -----




TR 6MAM

7,934 Conforme

PI 7,921 1 Cumpre TR

TRR 1,002 1 Cumpre TRR


Pico base 399 130 100,0% N/A







TR 6MAM 7,934 Conforme




Pico base 399 173 100,0% N/A


Ião Diagnóstico 2 287 79 45,7% Conforme









Pico base 399 130 100,0% N/A










15

Nenhum dos cromatogramas correspondentes aos brancos de metanol evidenciou sinais

da presença de analitos das amostras a concentração de gama alta. Deste modo, pode-se

constatar que não se verifica arrastamento na gama testada. Para que fosse evidenciado o

fenómeno de arrastamento nas amostras testadas (amostras de concentração de gama

alta), as abundâncias relativas dos iões diagnóstico 340 e 287 teriam que ser concordantes

com o intervalo do critério de conformidade respectivo, sendo que o intervalo varia de

82.3% a 102.3% para o ião 340 e de 44.8% a 64.8% para o ião 287.

Visto não haver conformidade entre as abundâncias relativas dos iões diagnóstico e os

intervalos do critério de conformidade, pode-se constatar que não se verifica a existência

de arrastamento na gama testada. Em caso de existência de arrastamento, devem ser

tomadas as medidas de controlo da qualidade consideradas adequadas para eliminar a

possibilidade de arrastamento durante os métodos de confirmação.

5. Repetibilidade

A repetibilidade consiste na aproximação entre os resultados de medições sucessivas da

mesma mensuranda efectuadas nas mesmas condições de medição: mesmo procedimento

de medição, mesmo observador, mesma instrumentação, no mesmo laboratório e num

curto período de tempo. (19) (18)

A repetibilidade deve ser calculada sobre os tempos de retenção e áreas de picos e se

possivel em vários pontos da gama de trabalho.

Os resultados do tratamento do estudo da repetibilidade estão resumidos nas tabela 9 e

tabela 10.


Pico base 399 130 100,0% N/A










16

Tabela 9- Tratamento dos resultados do estudo da repetibilidade com gama alta

Tabela 10- Tratamento dos resultados do estudo de repetibilidade com gama baixa

A cromatografia gasosa acoplada à espectrofotometria de massa é considerada por alguns

autores como sendo um método preciso. (12)

Como este parâmetro avalia a precisão do método, e tendo os resultados obtidos sido

concordantes com os critérios de aceitação definidos pelo LAFTM, podemos considerar o

método de confirmação qualitativa de 6-MAM preciso.

O método de confirmação da 6-Mam pelo equipamento HP GC 6890/MSD 6890

(GCMS01) apresenta coeficientes de variância de 3,35% para gamas altas e 9,0 % para as

gamas baixa. Este valor cumpre os critérios de aceitação de repetibilidade definidos pelo

LAFTM (< 10%). Observou se que a variação entre as amostras não variam 10% entre si.

(16)

Os resultados obtidos nos diversos parametros encontram-se compilados na tabela 11.

Tabela 11- Resumo dos resultados

Parâmetro Resultado

Especificidade/selectividade Sem interferências significativas

Capacidade de identificação 0 % de falsos negativos e 0% de falsos positivos

Limite de detecção - Codeina 13,4 ng/mL

Arrastamento Não se verificou fenómenos de arrastamento

Repetibilidade – 6- MAM 9 % a 200 ng/mL e 3,35 % a 1000 ng/mL

Área

6-mam 6MamD3 Arel

CTR 200 313 464 0,674569

CTR 200 348 543 0,640884

CTR 200 399 485 0,82268

CTR 200 338 496 0,681452

CTR 200 324 480 0,675

media 0,698917

s 0,06349

cv(%) 9,0841

Área

6-mam 6MamD3 Arel

CTR 1000 2252 598 3,765886

CTR 1000 1922 512 3,753906

CTR 1000 1530 401 3,815461

CTR 1000 998 288 3,465278

CTR 1000 1458 398 3,663317

media 3,700133

s 0,123937

cv(%) 3,349535

17

O facto de se utilizar 2,5 mL de amostra, leva a que se possa considerar o método como

destrutivo, pois o ideal seria utilizar um menor volume de amostra para cada análise, o

que permitiria realizar uma possível repetição da análise ou até mesmo a realização de

uma contra-prova se assim fosse solicitado, embora a utilização de volumes menores não

proporcione uma capacidade de identificação tão aceitável como a proporcionada pelo

volume utilizado.

Conclusão

Na validação do método em estudo, concluiu-se que este é, sensível, preciso, e confiável

para análise qualitativa do metabolito 6-MAM por cromatografia gasosa acopolada á

espectofotometria de massa, em amostras de urina humana. Nos cinco parâmetros

realizados, obtivémos resultados aceitáveis, sem que houvesse interferências

significativas. Os objetivos inicialmete propostos, sendo estes, a detecção e confirmação

do consumo de heroína, a utilização de um volume de amostra reduzido, e a

possibilidade de diferenciar o doseamento de morfina vs heroína, foram atingidos com

sucesso. Após a validação desta técnica, passará a ser possivel assegurar com precisão a

detecção do metabolito 6- MAM, na urina dos colaboradores da marinha, atraves

darealização de análises rotineiras, mais rápidas, com elevada fiabilidade, e com baixo

custo.

Com base nos conhecimentos já adquiridos relativos à análise qualitativa, seria pertinente

futuramente validar este método, quanto à deteção quantitativa do metabolito 6-MAM,

recorrendo, a um acréscimo de seis parâmetros de validação.

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