motilidade da associação entre uma diatomácea cêntrica e ... · sra zezinha e lisa por...

Yonara Garcia Borges Felipe

Motilidade da associação entre uma diatomácea cêntrica e um ciliado peritríquio

e suas possíveis consequências ecológicas

Dissertação apresentada ao Instituto

Oceanográfico da Universidade de São

Paulo, como parte dos requisitos para

obtenção do título de Mestre em Ciências,

Programa de Oceanografia, área de

Oceanografia Biológica.

Orientador: Prof. Dr. Rubens Mendes Lopes

São Paulo

Maio de 2018

ii

Universidade de São Paulo

Instituto Oceanográfico

Motilidade da associação entre uma diatomácea cêntrica e um ciliado peritríquio

e suas possíveis consequências ecológicas

Yonara Garcia Borges Felipe

Dissertação apresentada ao Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo,

como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências, área de

Oceanografia Biológica

VERSÃO CORRIGIDA

Julgada em ____/____/____

_____________________________________ _______________

Prof(a). Dr(a). Conceito

_____________________________________ _______________


_____________________________________ _______________


iii

Para minha família Dinalda, João Inacio,

Matheus, Catarina e Aécio,

com muito amor.

iv

Agradecimentos

Ao meu orientador Prof. Dr. Rubens Mendes Lopes pelo carinho, paciência,

conhecimento, conversas, conselhos e amizade. Obrigada por acreditar no meu trabalho

e me proporcionar um grande crescimento profissional e pessoal.

Ao Prof. Dr. J. Rudi Strickler pela disposição e paciência em compartilhar seu

conhecimento sobre sistemas ópticos, bem como suas contribuições intelectuais para o

desenvolvimento deste trabalho.

À Prof. Dra Sylvia Susini por ter disponibilizado parte de seu tempo para me

ajudar com as análises em Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Gostaria de

agradecer por ser esta pessoa linda, pela amizade e por todo carinho que recebi em

minhas visitas a Ilhéus que me proporcionaram além de conhecimento científico, muito

crescimento pessoal.

Aos amigos do LAPS (Maiá, Leandro, Catarina, Alessandra, Claudinha, Carol

Maciel, Bruno, Rafaella, Cássia, Damián, Felipe, Gelaysi, Josi, Luciana, Silvana, Yumi,

Carol Suwaki, Carol Lara, Adrian e Martinha) pela amizade, ajuda, conversas, risadas e

dias de descontração.

Às gordas da minha vida, meu love Alessandra, Claudinha e Carol Maciel por

me emprestarem suas famílias (mamis Angélica e Elidamar e papis Alexandre e

Onésimo), por não deixarem que eu me sentisse sozinha nesta nova vida, por sempre

estarem ao meu lado em momentos bons e ruins e pelos dias mais divertidos em

Ubatuba e São Paulo.

À Maiá por ser esta pessoa linda, calma, organizada e cheirosa que me ajudou a

dar os primeiros passos no sistema óptico.

Ao Leandro Ticlia pelo desenvolvimento dos softwares de filmagem (LCR) e

de aquisição das trajetórias (LPD). Também gostaria de agradecer pela grande amizade,

disposição, paciência e por toda ajuda que você me deu neste trabalho, parte do ponto

final que foi dado aqui eu devo a você.

À Martinha por toda paciência, ajuda, conversas, conselhos e colo que uma

típica mãe (mãe do LAPS) nos dá.

v

Ao Felipe e Damián pela paciência e apoio essencial nas análises finais do meu

trabalho.

Aos meus amigos do Laboratório de Aquicultura da base de Ubatuba (Ricardo,

Rafael e Júlio) pelas boas conversas e pelo café que salva o dia.

Ao Ricardo, meu grande irmão em Ubatuba. Obrigada pela amizade, risadas,

conselhos, reflexões e apoio que sempre recebo.

Aos funcionários da base de Ubatuba, obrigada pela amizade, conversas e

gentilezas de cada dia. Em especial gostaria de agradecer à Vânia, Dona Cida e Bete por

sempre me tratarem com tanto carinho.

À todos os amigos que fiz no Instituto Oceanográfico (IO-USP), obrigada pelas

companhias, conversas, risadas, cafés e todos os momentos compartilhados.

À secretaria da Pós-graduação, por sempre me atenderem muito bem e pela

amizade.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

pela concessão da bolsa de Mestrado.

Às meninas do Blog Bate-papo com Netuno que me permitiram fazer parte

desse lindo trabalho que leva a ciência para além da academia, além de ajudar a

combater preconceitos relacionados a gênero que ainda ocorrem na ciência. Obrigada

pela experiência, conhecimento e paciência em momentos que precisei estar ausente.

Aos meus amigos de Juiz de Fora e Argirita, em especial Michele, Pedro, Mari,

Jana, Leandro e Yuri, que apesar da distância sempre continuam em meu coração.

À minha família, meu porto seguro. À minha linda mãe Dinalda, ao meu pai

João Inacio e meu irmão Matheus, por sempre me apoiarem em minhas escolhas e

sempre estarem ao meu lado nos momentos bons e ruins. Aos meus avós Catarina e

Aécio que são meus amores, meus pais, meu bem maior. Aos meus anjinhos Meg, Gigi,

Sra Zezinha e Lisa por compartilhar comigo esse amor tão puro. Aos meus Bisavós

Lourdes e Geraldo que no início desta caminhada viraram estrelinhas, mas tenho certeza

que sempre estarão comigo me guiando. À minha tia Thida por sempre ser essa pessoa

linda e topar minhas ceias de última hora. E em especial, ao meu tio Nando que abriu as

vi

portas de sua casa pra me receber quando precisei me mudar para São Paulo, saiba que

sempre estarei ao seu lado e não desistirei de te ajudar nunca, pois eu te amo!

E à Deus, que sempre iluminou meu caminho e me ajudou a tomar as decisões

certas. E a todos que de certa forma tornaram a realização deste trabalho possível.

vii

Sumário

Introdução....................................................................................................1

Objetivos.......................................................................................................5

Materiais e Métodos....................................................................................6

Resultados..................................................................................................17

Discussão....................................................................................................36

Considerações finais e perspectivas.........................................................42

Referências bibliográficas.........................................................................43

viii

Índice de Figuras

Figura 1: Chaetoceros coarctatus em associação com o ciliado Vorticella oceanica. A)

Adaptado de Lee et al., 2014. B) Adapatado de Cupp, 1943............................................4

Figura 2: Localização das estações de coleta situada na plataforma interna ao largo de

Ubatuba, litoral norte do estado de São Paulo. A) Estação próxima à Praia do Flamengo;

B) Estação Boqueirão........................................................................................................6

Figura 3: Representação esquemática do sistema óptico 3D. Os LEDs representam a

fonte emissora de luz, que passa através de uma lente colimadora (tornando os feixes de

luz paralelos) atravessando o aquário e a lente focalizadora, produzindo a imagem. As

fontes emissoras de luz deste sistema são LEDs infravermelhos......................................9

Figura 4: Configuração do sistema óptico configurado em 3D. O sistema observacional

foi construído sobre a mesa óptica Smart Table Newport com controle de vibração e

suspensão pneumática......................................................................................................10

Figura 5: Interface do software LPD (LAPS Plankton Detector). A linha vermelha

representa um exemplo de trajetória realizada pela associação Chaetoceros-

Vorticella.........................................................................................................................11

Figura 6: No esquema acima, a posição P (x, y, z) de uma partícula em um instante de

tempo é construída a partir de duas imagens em 2D.......................................................12

Figura 7: Esquema do deslocamento do organismo. Os pontos representam a posição

XY e o tt representa o ângulo de rotação (Adaptado de Edgar et al.,

2014)................................................................................................................................14

Figura 8: Representação do cálculo do NGDR para cada ponto da trajetória. O ponto

vermelho (Pi) representa o ponto central do segmento analisado...................................15

Figura 9: Trajetórias da associação Chaetoceros-Vorticella obtidas pelo LPD e

processadas no MATLAB® R2013. Foram identificadas três principais categorias de

padrões de deslocamento realizados pela associação: retilíneo (A), helicoidal (B) e

curvado (C). O volume em que a trajetória ocorre (cubo com dimensões de 2 cm x 2 cm

x 2 cm) representa o campo focal localizado no centro do aquário.................................18

ix

Figura 10: Mediana da velocidade média da associação Chaetoceros-Vorticella. No

boxplot, as linhas superior e inferior em cada uma das categorias representam o primeiro

e o terceiro quartil (Q1 e Q3), respectivamente; a linha central representa a mediana. Os

pontos em cada uma das categorias representa a distribuição dos dados. Os pontos

acima e abaixo dos quartis Q1 e Q3 correspondem aos bigodes (whiskers) que mostram

a dispersão dos dados. O teste Shapiro-Wilk indicou que os dados não são normais

(p<0,05). Não houve diferença significativa entre as categorias de deslocamento de

acordo com o teste Kruskal-Wallis (p=0,06)...................................................................20

Figura 11: Variação da velocidade instantânea em cada uma das 75 trajetórias,

agrupadas por categoria de deslocamento. Cada trajetória é representada por um

boxplot. As linhas superior e inferior em cada caixa representam o primeiro e o terceiro

quartil (Q1 e Q3), respectivamente; a linha central representa a mediana. Os pontos


a dispersão dos dados. Os sinais vermelhos representam os outliers da velocidade

instantânea em cada trajetória .........................................................................................21

Figura 12: Porcentagem da velocidade instantânea de acordo com as categorias de

trajetórias.........................................................................................................................23

Figura 13: Mediana da dimensão fractal da associação Chaetoceros-Vorticella. No

boxplot, as linhas superior e inferior em cada uma das categorias representam o primeiro

e o terceiro quartil (Q1 e Q3), respectivamente; a linha central representa a mediana. Os

pontos em cada uma das categorias representa a distribuição dos dados. Os pontos


a dispersão dos dados. De acordo com o teste Shapiro-Wilk, os dados são paramétricos

(p>0,05). As categorias são significativamente diferentes de acordo com o teste

ANOVA (p<0,0001) e teste post-hoc de Tukey com p<0,05..........................................24

Figura 14: Trajetória retilínea. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma

projeção 2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em

todo o eixo do deslocamento. O gráfico da direita representa a variação dos parâmetros

quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade instantânea

para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 268 quadros. A

velocidade média da trajetória foi de 1,2484 mm/s. A dimensão fractal foi de 0,87 ±

0,22. O asterisco (*) indica o início da trajetória.............................................................25

x














0,52. O asterisco (*) indica o início da trajetória............................................................ 26

Figura 17: Trajetória helicoidal. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma













0,24. O asterisco (*) indica o início da trajetória............................................................ 27





xi



0,35. O retângulo vermelho destaca um período de maior variação na velocidade

instantânea com um NGDR próximo a 0, ou seja, onde houve maior tortuosidade no

movimento. O asterisco (*) indica o início da trajetória.................................................28

Figura 20: Trajetória curvada. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma













0,18 O asterisco (*) indica o início da trajetória..............................................................30







0,21 O asterisco (*) indica o início da trajetória..............................................................31

Figura 23: Representação diagramática da frústula do gênero Chaetoceros. (1) vista

pleural (cingular) larga; (2) vista pleural (cingular) estreita; (3) vista valvar. Eixos: A

distância da superfície da epiteca através da frústula até a superfície da hipoteca é o eixo

pervalvar (P), que equivale à altura da célula; T, eixo transapical; A, eixo apical.

Estruturas: superfície valvar (vs); manto valvar (mv); cinta ou cíngulo (c); seta (s); seta

terminal (st); base da seta (bs); forame (f). Adaptados de Cupp, 1943...........................32

xii

Figura 24: Chaetoceros coarctatus. Vista interna da valva intercalar em formato

elíptico.............................................................................................................................32

Figura 25: Chaetoceros coarctatus em associação com Vorticella oceanica. (B, C, D,

E, F). As cadeias representadas nestas imagens são provenientes de diferentes

organismos. Dentre as imagens representadas acima, a imagem E pertence a uma

amostra que não passou pelo método do ponto crítico. As setas indicam o ponto de

aderência do disco adesivo do ciliado no manto da diatomácea.....................................34

Figura 26: Vorticella oceanica. (A) Estrutura do zooide. CV = vacúolo contrátil; FV =

vacúolo alimentar; MA = acronúcleos. Barra de escala = 20 µm. (Adaptado de

Nagasawa & Warren, 1996). (B, C, D) Imagens de MEV. (B) Zooide (C) V. oceanica

distendida. As setas indicam o pedúnculo e o disco adesivo. (D) Base do disco

adesivo.............................................................................................................................35

Figura 27: Cadeia de C. coarctatus após V. oceanica abandonarem a cadeia. As setas

indicam o pedúnculo de alguns ciliados..........................................................................36

Índice de Tabelas

Tabela 1: Data, horário e local das coletas realizadas nos dias dos

experimentos......................................................................................................................7

Tabela 2: Número de quadros, número de trajetórias, números mínimo e máximo de

quadros por trajetória para cada categoria de deslocamento...........................................19

Tabela 3: A média da velocidade instantânea de deslocamento apresentou os seguintes

valores de mínimo e máximo para cada padrão comportamental. Os valores da

velocidade instantânea estão expressos em mm s-1

.........................................................22

xiii

Resumo

A associação simbiótica entre a diatomácea cêntrica Chaetoceros coarctatus e

o ciliado peritríquio Vorticella oceanica é amplamente conhecida e registrada em

diversos estudos, porém nunca havia sido analisada sob o ponto de vista de suas

implicações para o movimento destes organismos. A fim de contribuir com novos dados

acerca desta associação simbiótica, o presente trabalho analisou a relevância ecológica

da simbiose entre Chaetoceros e Vorticella, por meio de um estudo comportamental do

deslocamento destes organismos na coluna de água. As associações foram coletadas em

águas costeiras de Ubatuba, São Paulo, onde sua ocorrência foi observada em elevada

abundância, particularmente durante o verão. Utilizando técnicas de imagem de alta

frequência em um sistema óptico tridimensional foi possível descrever os padrões de

deslocamento desta associação e avaliar as implicações ecológicas deste

comportamento. De acordo com as análises realizadas neste trabalho, pode-se sugerir

que o comportamento de deslocamento realizado pela associação Chaetoceros-

Vorticella na coluna de água resulta em vantagens tanto para o epibionte quanto para o

hospedeiro. Em termos de submesoescala, este estudo sugere que o deslocamento

realizado pela associação Chaetoceros-Vorticella pode contribuir para a formação de

camadas finas, levando à formação de hotspots de atividade biogeoquímica e interações

tróficas no ecossistema pelágico.

Palavras-chave: Diatomáceas, Ciliados, Chaetoceros, Vorticella, Simbiose, Motilidade

xiv

Abstract

The symbiotic association between the centric diatom Chaetoceros coarctatus

and the peritrich ciliate Vorticella oceanica is widely known and reported in several

studies, but its implications for the movement of these organisms have never been

analyzed. In order to contribute with new data about this symbiotic association, the

present study investigated the ecological relevance of the Chaetoceros-Vorticella

association by recording displacement parameters of these organisms in the water

column. The associations were collected in coastal waters of Ubatuba, São Paulo, where

their occurrence was observed in high abundance, particularly during the summer.

Using high-resolution imaging techniques in a three dimensional optical system it was

possible to describe the displacement patterns of this association and to provide initial

insights about the ecological implications of this behavior. It is suggested that the

displacement behavior performed by the Chaetoceros-Vorticella association in the

water column is beneficial for both the epibiont and the host. In terms of submesoscale

processes, this study indicates that the displacement carried out by the Chaetoceros-

Vorticella association may contribute to the formation of thin layers, leading to the

formation of hotspots of biogeochemical activity and trophic interactions in the pelagic

ecosystem.

Keywords: Diatoms, Ciliates, Chaetoceros, Vorticella, Symbiosis, Motility

1

Introdução

O termo simbiose é geralmente definido como uma associação entre duas ou

mais diferentes espécies de organismos que vivem juntos (De Bary, 1879; Sapp, 2004).

Esta associação pode resultar em benefícios, prejuízos ou não afetar os organismos

envolvidos nesta relação (Douglas, 1994; Leung & Poulin, 2008). Estas relações podem

ser de curto ou longo prazo, desempenhando papéis ecológicos fundamentais nos

ecossistemas terrestre e aquático, além de poderem resultar em grandes consequências

evolutivas para as espécies envolvidas (Decelle et al., 2012; Leung & Poulin, 2008).

As associações simbióticas são comuns na natureza e encontradas em quase

todos os táxons, desde bactérias com raízes de plantas terrestres a gigantes vermes

tubulares com bactérias oxidantes de enxofre no mar profundo (Cavanaugh, 1994; van

Rhijn & Vanderleyden, 1995; Sassen et al., 1998; Paracer & Ahmadjian, 2000). Podem

ser divididas em três categorias principais: (i) mutualismo, onde ambos associados se

beneficiam, (ii) parasitismo, onde um dos associados se beneficia à custa do outro e (iii)

comensalismo, onde uma espécie se beneficia enquanto a outra não é afetada (Decelle et

al., 2012; Paracer & Ahmadjian, 2000; Anderson, 2014).

As relações epibióticas são normalmente definidas como relações de

comensalismo, mas estudos recentes têm demonstrado que de acordo com as condições

bióticas e abióticas do ambiente, estas relações podem resultar em vantagens,

desvantagens ou serem neutras (Wahl, 2009; Souissi et al., 2013; Cabral et al., 2016). O

termo epibiose se refere a uma associação facultativa e interespecífica entre dois

organismos: um organismo substrato (basionte) e um organismo durante a fase séssil de

seu ciclo de vida (epibionte), que se fixa na superfície do basionte (Cabral et al., 2016;

Wahl, 1989. Wahl 2009; Rajabunizal & Ramanibai, 2011; Fernandez-Leborans & Tato-

Porto, 2000).

Muitos estudos ainda consideram forese e inquilinismo como categorias de

simbiose, sendo estas relações facultativas e interespecíficas, nas quais um simbionte

(transportador ou hospedeiro) fornece abrigo, suporte ou transporte para o outro

simbionte, sem benefícios ou trocas metabólicas (Paracer & Ahmadjian, 2000; Ohtsuka

et al., 2009; Stampar et al., 2010).

A simbiose ainda pode ser classificada baseando-se em outras características,

como localização dos simbiontes e o nível de dependência entre eles. De acordo com a

localização dos simbiontes, pode-se classificar em: endossimbiose, definida como

2

qualquer relação simbiótica em que um dos simbiontes vive no espaço intracelular ou

intercelular do outro, e ectossimbiose, onde o simbionte habita a parte externa do

hospedeiro (Paracer & Ahmadjian, 2000; Rosati, 2001; Gast et al., 2009). Já com

relação ao nível de dependência, podem ser simbiontes obrigatórios, em que não podem

viver de forma independente, e simbiontes facultativos, em que são capazes de viver

independentes, na condição de vida livre (Vega et al., 2006). Embora existam diversas

classificações para descrever os tipos de simbiose, é importante ressaltar que a simbiose

não é necessariamente uma relação estática, visto que fatores ambientais ou endógenos

influenciam o tipo de relação simbionte-hospedeiro (Paracer & Ahmadjian, 2000).

Relações simbióticas são extremamente comuns no fitoplâncton marinho. As

microalgas planctônicas são responsáveis por cerca da metade da atividade

fotossintética do planeta (Field et al., 1998; Grimsley et al., 2012), constitui a base de

quase todas cadeias alimentares nos ecossistemas aquáticos (Lewis et al., 2012; Häder

& Gao, 2018) e está diretamente ligados aos ciclos biogeoquímicos da Terra (Falkowski

et al., 1998; Litchman, 2007). É um grupo muito diverso, com representantes de formas

procariontes e eucariontes, e variam em termos de tamanho desde picoplâncton (0,2 - 2

µm) a mesoplâncton (200 - 2000 µm) (Marañón et al., 2009; Not et al., 2012).

Dentre os grupos de fitoplâncton, as diatomáceas constituem um dos mais

abundantes e ecologicamente importantes, com mais de 250 gêneros (Hoek et al.,1995;

Mann & Droop, 1996; Norton et al., 1996; Li et al, 2017). São eucariontes

fotossintéticos unicelulares (1 - 1000 µm), sendo responsáveis por aproximadamente

40% da produtividade primária marinha (Nelson et al., 1995; Falkowski et al., 1998;

Scala & Bowler, 2001).

Pertencentes à classe Bacillariophyceae, as espécies deste grupo possuem

frústula, constituída por sílica e composta por duas valvas (tecas), o que faz com que

elas exerçam um importante papel no ciclo biogeoquímico global da sílica, já que

utilizam este componente para a biogênese de sua parede celular (Hopkins & Drum,

1966; Kadono et al., 2015). Em termos morfológicos, as diatomáceas são

tradicionalmente divididas em penadas e cêntricas, sendo distinguidas por meio por

meio das ornamentações das estruturas na parede celular (Hendey, 1964; Lee, 2008).

Diatomáceas penadas possuem ornamentação dos poróides na valva disposta

simetricamente em ambos os lados de uma linha central (rafe ou pseudorafe), sendo

bilateralmente simétricos (face valvar). São representadas principalmente pelas formas

bentônicas, mas existem representantes planctônicos, como as pertencentes ao gênero

3

Nitzschia (Hendey, 1964; Raven et al., 1996; Lee, 2008). Diatomáceas cêntricas

possuem a ornamentação dos poróides na valva e estrias radiais arranjadas de acordo

com um ponto central. São mais comuns no plâncton, representadas por gêneros como

Chaetoceros, Coscinodiscus, Skeletonema e Thalassiosira (Hendey, 1964; Raven et

al., 1996; Lee, 2008). Em ambas as formas, a frústula silicosa possui padrões de

ornamentação específicos para cada espécie que, juntamente com características

estruturais, possibilitam a classificação e identificação taxonômica dos indivíduos

(Scala & Bowler, 2001).

Chaetoceros é um dos gêneros de diatomáceas mais comuns e diversos do

fitoplâncton marinho, possuindo uma ampla distribuição geográfica e muitas espécies

cosmopolitas (Hernández-Becerril, 1991; Assmy et al, 2008; Bosak & Sarno, 2017).

Foi inicialmente descrita por Ehrenberg, em 1844, no oceano Antártico (Rines, 1999;

Lee et al., 2014). De acordo com Guiry & Guiry (2017), o gênero compreende 534

espécies já descritas, das quais 210 são aceitas atualmente.

Chaetoceros é caracterizada principalmente pela presença de setas e por suas

células formarem cadeias (Antolí et al, 2004). As setas são extensões vazias e

alongadas presentes nas extremidades da valva e, geralmente, são de dois tipos:

intercalares e terminais (Lee & Lee, 2011; Lee et al., 2014). Algumas espécies

possuem setas intercalares especiais, que são estruturas mais grossas e silicificadas

que as demais (Lee & Lee, 2011). Embora a maioria das espécies deste gênero

formem cadeias de células, alguns representantes do grupo possuem a forma solitária,

como no caso de C. pendulus Karsten e C. gracilis Schutt (Takano, 1960; Sunesen et

al., 2008).

Entre as espécies de Chaetoceros, C. coarctatus Lauder, 1864, é encontrada

em ambientes marinhos tropicais e subtropicais. Formam cadeias robustas, geralmente

longas, com cerca de 25 - 30 células, podendo existir exemplares com 35 - 40 células

(Gómez et al., 2018). Possuem setas intercalares especiais, setas intercalares e seta

terminais. A seta terminal posterior é mais grossa do que a anterior, levemente curva,

com muitos espinhos e mais curta que as demais. As setas intercalares são comuns e

suavemente curvas (em torno de 45° do eixo apical, em direção à extremidade

posterior - Cupp, 1943; Hernández-Becerril, 1991; Lee & Lee, 2011). Esta espécie de

diatomácea planctônica é comumente encontrada em associação com o peritríqueo

ciliado Vorticella oceanica (Sahu et al., 2017; Gómez et al., 2018).

4

Os ciliados peritríqueos ocorrem, como epibiontes, em uma ampla variedade

de substratos, como plantas aquáticas, animais e detritos orgânicos, em água doce,

salobra e salgada. Alguns representantes são planctônicos, se aderindo sobre

microalgas ou nadando livremente por meio de seus cílios orais. São suspensívoros,

ingerindo bactérias, fitoplâncton e detritos orgânicos (Ryu et al., 2016).

Representantes do gênero Vorticella podem ser encontrados na forma de vida

livre ou séssil. Vorticella séssil consiste de um zooide e um pedúnculo. O zooide

possui, geralmente, formato de sino invertido, podendo ser encontrado na forma

cilíndrica ou de "barril" em algumas espécies, com, aproximadamente, 25 µm de

diâmetro e 50 µm de comprimento (Pepper et al., 2009; Nagai et al., 2009; Zhou et al.,

2017). Já o pedúnculo é formado por uma bainha que contém um líquido e um

filamento contrátil em forma espiral com, aproximadamente, 3 a 4 µm de diâmetro e

100 µm de comprimento (Ryu et al., 2016). Embora sejam frequentemente

encontrados em grupo, cada pedúnculo é fixado independentemente no substrato.

Descrito por Zacharias (1906), o ciliado Vorticella oceanica possui corpo

entre a forma cônica e de sino, com extensão do zooide de 28 µm de comprimento e

22 µm de diâmetro, disco peristomial plano e pedúnculo com extensão de 80 µm, que

se fixa ao substrato por meio de um disco adesivo que possui de 3 a 5 µm de diâmetro

(Cupp, 1943; Nagasawa & Warren, 1996; Sahu et al., 2017).

Figura 1: Chaetoceros coarctatus em associação com o ciliado Vorticella oceanica. A)

Adaptado de Lee et al., 2014. B) Adaptado de Cupp, 1943

A motilidade é um elemento chave para responder diversas questões ecológicas

sobre muitos organismos. O deslocamento de um organismo é definido como a

5

mudança de sua posição espacial em um intervalo de tempo (Schmitt & Seuront, 2001;

Nathan, 2008). A capacidade de movimento é um fenômeno que influencia as interações

entre os indivíduos, incluindo a probabilidade de acasalamento, a interação presa-

predador, assim como amplia a probabilidade de os organismos encontrarem condições

adequadas, como alimento, temperatura e luminosidade (Crenshaw, 1996, Nathan,

2008, Bianco et al., 2014).

A motilidade em microrganismos planctônicos está ligada a diversos

fenômenos importantes, como por exemplo, a migração vertical. Para o fitoplâncton a

motilidade permite que as células se desloquem para regiões mais profundas durante a

noite, onde os nutrientes limitantes são abundantes e há menor risco de predação e,

durante o dia, permaneçam em águas superficiais com disponibilidade de luz (Ryan et

al., 2010; Sullivan et al., 2010; Bollens et al., 2010).

A associação Chaetoceros-Vorticella ocorre com alta frequência em águas

costeiras de Ubatuba, São Paulo, Brasil, principalmente durante o verão (Gómez et al.,

2018). A fim de avaliar a relevância ecológica desta associação, este trabalho analisou

o comportamento natatório de Chaetoceros-Vorticella na coluna de água, por meio de

técnicas de imageamento utilizando sistemas ópticos implementados especialmente

para essa finalidade.

Objetivos

Objetivo geral

Avaliar a relevância ecológica do comportamento de deslocamento da

associação entre a diatomácea planctônica Chaetoceros coarctatus e o ciliado

peritríquio Vorticella oceanica, por meio técnicas de imageamento.

Objetivos específicos

(i) Descrever as características do deslocamento da associação da

diatomácea Chaetoceros coarctatus com o ciliado Vorticella oceanica,

por meio de análises tridimensionais das trajetórias.

(ii) Analisar as implicações ecológicas do comportamento de

deslocamento, a partir de análises qualitativas do movimento e da

extração dos parâmetros de locomoção, como velocidade média,

6

velocidade instantânea, ângulo de rotação, NGDR (Net-to-gross

displacement ratio), dimensão fractal, entre outros.

(iii) Observar as características morfológicas dos pontos de fixação do

ciliado sobre a diatomácea, através de Microscopia Eletrônica de

Varredura (MEV), e interpretar os resultados em relação ao

comportamento de deslocamento.

Materiais e Métodos

Área de estudo

A área amostrada compreende uma estação fixa localizada no canal do

Boqueirão (23º 31’ 27’’ S e 45º 04’ 54’’ O), nas proximidades da Base Norte de

pesquisa Clarimundo de Jesus, do Instituto Oceanográfico da Universidade de São

Paulo, no município de Ubatuba, litoral norte do estado de São Paulo, Brasil (Figura 2).

Além desta estação principal, ocasionalmente houve necessidade de realizar coletas em

uma estação mais abrigada, próxima à Praia do Flamengo (23º 30’ 57,1’’ S e 45º 06’

17,7’’ O), devido a fatores externos, como mau tempo.

Figura 2: Localização das estações de coleta situada na plataforma interna ao largo de Ubatuba,

litoral norte do estado de São Paulo. A) Estação próxima à Praia do Flamengo; B) Estação

Boqueirão.

7

Obtenção das amostras de plâncton marinho

As coletas foram realizadas no período de Maio de 2017 a Janeiro de 2018. As

colônias de Chaetoceros coarctatus em associação com Vorticella oceanica foram

coletadas com rede de abertura de malha de 200 µm, a bordo de uma embarcação de

alumínio com motor de popa. Os experimentos foram realizados de acordo com a

disponibilidade dos organismos no ambiente. A tabela 1 indica os dias em que os

experimentos foram realizados, bem como o horário das coletas.

Tabela 1: Data, horário e local das coletas realizadas nos dias dos experimentos.

Local da coleta Data Horário (h)

Canal do Boqueirão 17/07/17 9:30




O material foi obtido por meio de arrastos oblíquos curtos, com a embarcação à

deriva ou em uma velocidade mínima. Após os arrastos, a amostra foi transferida

cuidadosamente para garrafas plásticas de 1 L, contendo água do mar proveniente do

local da coleta. O número de amostras coletadas foi determinado de acordo com a

concentração aparente dos organismos, obtida pela inspeção visual das amostras no

copo coletor. Além disso, a temperatura da superfície da água foi verificada com

termômetro manual e foi coletada água do mar da superfície, armazenando-a em

garrafas de 2 L, que foi utilizada para triagem, manipulação e incubação dos

organismos. O material coletado foi transferido imediatamente para o Laboratório

Integrado de Processos Oceanográficos (LIPO), em no máximo 30 minutos e mantido

em uma sala com temperatura controlada, coincidente com a temperatura da água no

momento da amostragem. O procedimento de obtenção das amostras era realizado,

preferencialmente, no período da manhã.

Triagem e isolamento da associação de Chaetoceros - Vorticella

As associações Chaetoceros-Vorticella foram triadas, cuidadosamente, com o

auxílio de pipetas, sob estereomicroscópio binocular (Nikon® - SMZ800) e luz de baixa

8

intensidade, e mantidos em recipientes de vidro (béqueres ou aquários) para que fossem

aclimatados (sob temperatura controlada e baixa luminosidade) antes das filmagens. Os

recipientes continham alíquotas de água do mar filtrada em filtros GF/F (ø 47 mm e

porosidade de 0,7 µm). Com a finalidade de manter a integridade dos organismos a

serem estudados, foram avaliadas as condições morfológicas dos mesmos, para evitar a

utilização de colônias com estruturas danificadas nos experimentos.

Experimentos de descrição do comportamento natatório da associação

Chaetoceros-Vorticella

Para descrever os caracterizar o deslocamento da associação Chaetoceros-

Vorticella, os organismos selecionados foram colocados em aquários cúbicos de vidro

com dimensões de 8 cm de largura e profundidade e 10 cm de altura. Estes recipientes

eram preenchidos com um volume de 512 mL de água do mar filtrada (GF/F) com

salinidade coincidente com o local da coleta. Para cada conjunto de filmagem, 10

associações foram introduzidas no aquário, cuidadosamente, por meio de pipetas, uma

por vez. Os organismos foram aclimatados no recipiente por um período de 30 minutos

antes das filmagens. Cada experimento foi realizado sem estímulos externos (por

exemplo, sem fontes luminosas, com temperatura constante e sem adição de alimento).

Método de observação do comportamento

Configuração do sistema óptico

Para realizar o estudo do comportamento de deslocamento da associação

Chaetoceros-Vorticella, foi desenvolvido um sistema óptico horizontal 3D,

confeccionado com base em sistemas descritos por Strickler (1998); Yen et al. (2008) e

Bianco et al. (2013).

O sistema observacional 3D foi constituído de: (i) duas fontes luminosas

(LEDs - Light Emmiting Diode), (ii) duas lentes colimadoras (150 mm - usadas para

tornar o feixe de luz paralelo), (iii) duas lentes focalizadoras (150 mm) e (iv) duas

câmeras Ethernet (Basler acA2040-25gm GigE) com o sensor CMV4000 CMOS, que

fornece uma taxa de aquisição de 25 quadros por segundo e resolução máxima de 2048

x 2048 pixels (Figura 3). Para a montagem deste sistema, foram construídos dois

sistemas 2D in line, dispostos de forma ortogonal, de modo que o volume de interesse

ficasse no ponto focal de ambos sistemas simultaneamente (Figura 4).

9

O aumento utilizado no presente sistema observacional foi de 0,5 X. As

distâncias entre objeto - lente e lente - câmera foram calculadas por meio da Equação

de Gauss, a saber:

(1)

Onde:

f = distância focal da lente usada;

p = distância focal do objeto;

p' = distância focal da imagem.

Figura 3: Representação esquemática do sistema óptico 3D. Os LEDs representam a fonte

emissora de luz, que passa através de uma lente colimadora (tornando os feixes de luz paralelos)

atravessando o aquário e a lente focalizadora, produzindo a imagem. As fontes emissoras de luz

deste sistema são LEDs infravermelhos.

10

Figura 4: Configuração do sistema óptico configurado em 3D. O sistema observacional foi

construído sobre a mesa óptica Smart Table Newport com controle de vibração e suspensão

pneumática.

Obtenção das imagens

As filmagens foram realizadas utilizando o software LCR (LAPS Camera

Recorder), desenvolvido pelo LAPS/IOUSP. No sistema de filmagem, cada câmera foi

conectada a um computador. Para garantir a simultaneidade das gravações, um

microcontrolador foi conectado em cada sistema 2D, de forma que ao dar o comando

para iniciar as gravações, elas começavam ao mesmo tempo nas duas câmeras. Esta

ferramenta garantiu a obtenção das coordenadas de ambos sistemas (XY e ZY) de forma

precisa, visto que os vídeos possuíam o mesmo número de quadros captados no mesmo

instante.

As filmagens foram realizadas em uma sala óptica sem interferência da

luminosidade natural e com temperatura controlada, a uma taxa de 20 fps (frames per

second). As gravações eram iniciadas quando os organismos apareciam no campo focal

dos dois sistemas ao mesmo tempo, com tempo de duração variando de acordo com a

permanência dos indivíduos neste volume. O campo de focal possuía dimensões de 2

cm de altura e 2 cm de largura em cada câmera do sistema, localizado no centro do

aquário para que não houvesse efeito da borda sobre o comportamento dos organismos.

Aquisição das trajetórias

Após as filmagens, os vídeos foram processados utilizando o software LPD

(LAPS Plankton Detector). Esse programa possui uma interface de fácil utilização, que

possibilita a identificação e a análise das trajetórias dos organismos (Figura 5). O

11

procedimento geral para extração das trajetórias consistiu, basicamente, em quatro fases

principais: (i) geração do vídeo a partir das imagens quadro a quadro, (ii) detecção dos

organismos nos quadros do vídeo, (iii) cálculo do centroide em cada associação

Chaetoceros-Vorticella identificada e (iv) formação da trajetória a partir dos centroides

mais próximos e sequenciais gerados na terceira etapa. A partir da extração das

trajetórias, foi formado um arquivo com as informações das abcissas e ordenadas

(posicionamento da colônia ao longo do tempo), além de outras informações

importantes como área da partícula, ângulo, intensidade média, entre outros.

Figura 5: Interface do software LPD ( LAPS Plankton Detector). A linha vernelha representa

um exemplo de trajetória realizada pela associação Chaetoceros-Vorticella.

Os dados de abcissa e ordenada das trajetórias extraídos de cada sistema 2D

foram combinados para a formação das trajetórias em 3D. No esquema da Figura 6, a

vista frontal é dada pelas imagens adquiridas pela câmera 1, enquanto que a

profundidade é gerada pela vista lateral, dada pelas imagens da câmera 2. A

reconstrução da trajetória é feita extraindo as posições tridimensionais para cada par de

quadros Ft1

e Ft2, correspondentes às imagens das câmeras 1 e 2 em um mesmo instante

de tempo.

12

Figura 6: Esquema mostrando que a posição P (x, y, z) de uma partícula em um instante de

tempo é construída a partir de duas imagens em 2D.

Assim, 'P' aparecerá em ambos os quadros, dado que a partícula está sendo

filmada por ambas as câmeras ao mesmo tempo. Desta forma, denotamos como (x1, y1)

a posição de 'P' na perspectiva da câmera 1 e denotamos como (x2, y2) a posição 'P'

segundo a perspectiva da câmera 2. Assim, a partir de (x1, y1) e (x2, y2), calcula-se a

posição 3D de 'P', isto é: (x1, y1) (x2, y2) → (x, y, z). O procedimento para calcular e

construir as coordenadas tridimensionais foram realizadas por meio do software

MATLAB® R2013.

Análise dos dados: quantificando o comportamento de deslocamento da

associação Chaetoceros-Vorticella

A partir da análise das trajetórias podemos obter uma variedade de métricas

quantitativas importantes para a compreensão do comportamento de deslocamento da

associação Chaetoceros-Vorticella. Para este estudo foram calculadas a distância

percorrida, deslocamento total, velocidade instantânea do deslocamento, velocidade

média, ângulo de rotação, NGDR e dimensão fractal. Também foram realizadas análises

qualitativas do movimento estimando a frequência de estados de deslocamento. A

seguir são descritas cada uma das métricas utilizadas neste trabalho.

a) A distância percorrida d (mm) foi calculada a partir das coordenadas x, y e z,

em uma trajetória tridimensional, por meio da seguinte fórmula:

(2)

13

onde (xt, yt, zt) e (xt+1, yt+1, zt+1) representam as posições das coordenadas

no instante t e t + 1, respectivamente.

b) O deslocamento foi calculado por meio da diferença entre o primeiro e o

último ponto da trajetória (deslocamento bruto).

c) A velocidade instantânea de natação Vi (mm s-1

) entre dois pontos

consecutivos foi calculada de acordo com a seguinte fórmula:

(3)

onde dS é a distância entre dois pontos consecutivos e dt é o tempo que a

associação levou de um ponto para o outro. Além da velocidade instantânea,

também foi calculada a velocidade média da trajetória através da seguinte

fórmula:

(4)

onde ∆S é a variação espacial da trajetória e ∆t é a variação temporal da

trajetória.

d) O ângulo de rotação, ou turning angle, foi calculado a partir da diferença na

direção entre dois movimentos consecutivos (Figura 7 - Dodson, et al., 1997;

Schmitt & Seuront, 2001; Edgar et al., 2014). Esta métrica expressa a

mudança de direção da partícula ao se deslocar.

14

Figura 7: Esquema do deslocamento do organismo. Os pontos representam a posição XY e o tt

representa o ângulo de rotação (Adaptado de Edgar et al., 2014).

e) O NGDR (Net-to-gross displacement ratio – Buskey, 1984), é uma medida

do grau de linearidade da trajetória do organismo (quanto menor o NGDR,

maior é o grau de tortuosidade da trajetória do organismo). Esta métrica foi

calculada por meio da fórmula que se segue:

(5)

Onde:

ND é o deslocamento líquido (adição das distâncias Euclidianas totais

percorridas pelo organismo);

GD é o deslocamento bruto (deslocamento entre o ponto final e o ponto inicial).

Para tornar a medida invariante ao tempo de filmagem e ter um valor de NGDR

contínuo, o cálculo deste índice foi feito para cada ponto da trajetória Pi, de

forma que o valor do NGDR para Pi era o valor do NGDR do segmento definido

15

pelos pontos Pi-r e Pi+r. Neste trabalho, os resultados gerados foram feitos

considerando r=8 (figura 8).

Figura 8: Representação do cálculo do NGDR para cada ponto da trajetória. O ponto vermelho

(Pi) representa o ponto central do segmento analisado.

f) A dimensão fractal é utilizada para caracterizar o grau de complexidade das

trajetórias dos organismos (Dicke & Burrough, 1988). Contudo, ao contrário

do NGDR, esta métrica é independente de escala e fornece uma estimativa

mais consistente (Coughlin et al., 1992; Seuront et al., 2004; Uttieri et al.,

2005; Uttieri et al., 2008).

A dimensão fractal D foi estimada para as trajetórias de deslocamento da

associação Chaetoceros-Vorticella, baseada no método de contagem de

caixas (Box-Counting Method), proposta por Uttieri et al. (2005). Neste

método, basicamente, cada imagem é coberta por um conjunto de quadrados

não sobrepostos de comprimento l e o número de quadrados interceptados

pela trajetória realizada N(l) é contabilizado. Esse processo é repetido por

uma série de valores descendentes l, obtendo novos valores de N

correspondentes. Assim, com os números de quadrados e suas dimensões, o

valor de log N(l) é plotado em função de log (1/l), e a inclinação da

regressão D indica o grau de complexidade da trajetória.

Existem vários estudos que utilizam esta métrica como critério importante

para a caracterização de trajetórias e pode ser aplicada em N-dimensões.

Neste trabalho foi aplicado o método box-counting tridimensional. Para isso,

16

ao invés da grade quadrada, foi utilizada uma grade com elementos cúbicos

(Fielding, 1992; Seuront et al., 2004; Uttieri et al, 2005).

Além das métricas quantitativas, as trajetórias foram avaliadas

qualitativamente a fim de categorizar os movimentos que a associação realizou na

coluna de água. Para isso, foram analisadas as variações dos ângulos de rotação nos

planos XY e ZY no decorrer de cada trajetória.

Análises estatísticas

Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o programa R (R

Development Core Team, 2011). Para analisar a normalidade dos dados, foram feitos

testes de normalidades (teste Shapiro-Wilk). Nos dados que apresentaram distribuição

normal foi aplicado o teste ANOVA. Nos casos em que houve rejeição da hipótese nula

foi realizado um teste post-hoc de Tukey (teste de comparações múltiplas). Nos dados

não-paramétricos foi aplicado o teste Kruskal-Wallis.

Preparo das amostras para análise de Microscopia Eletrônica de Varredura

(MEV)

As análises de MEV foram realizadas na Universidade Estadual de Santa Cruz

- UESC, Ilhéus - BA. Após os experimentos de análises comportamentais, os

organismos foram fixados com Bouin 10%. As amostras fixadas foram submetidas à

metodologia de filtração com desidratação e passagem pelo ponto crítico (CO2 líquido)

e ao método de simples filtração, para observação sob o MEV.

a) Filtração com desidratação e passagem pelo ponto crítico (CO2

líquido): as amostras fixadas foram concentradas em um suporte de

filtração, sobre o filtro Nuclepore (ø 13 mm e porosidade de 0,8 µm). O

excesso de líquido foi eliminado, tendo cuidado para não deixar o filtro

secar e, em seguida, foi iniciada uma série de passagens em soluções de

álcool em concentrações crescentes (10, 30, 50, 70, 90%) e 3 vezes em

álcool absoluto durante 10 minutos em cada passo. Após esse processo

17

de desidratação, a amostra foi transferida para a câmara do equipamento

de secagem ao ponto crítico, onde o álcool foi substituído pelo CO2

líquido e, em seguida, evaporado sob pressão. Os filtros foram então

montados em suportes metálicos e metalizados para serem observados no

microscópio eletrônico de varredura.

b) Simples filtração: as amostras fixadas foram filtradas lentamente em

filtros Nuclepore (ø 13 mm e porosidade de 3 µm). Em seguida, os filtros

foram lavados em água destilada e secos ao ar. Os filtros, então, foram

montados sobre suportes de alumínio, recobertos com ouro, pela técnica

de sputtering (evaporação por pulverização catódica) e analisados no

microscópio eletrônico de varredura.

Resultados

A partir dos dados gerados pelo o software LPD, a quantificação e análise das

trajetórias de deslocamento da associação Chaetoceros-Vorticella foram realizadas por

meio de rotinas confeccionadas no software MATLAB® R2013 e por meio do programa R

(R Development Core Team, 2011).

Descrição dos padrões de deslocamento

Após a extração das trajetórias, foi obtido um total de 343 trajetórias,

considerando cada sistema em 2D. Porém, apenas 75 pares de trajetórias foram

utilizados para realizar a reconstrução tridimensional do deslocamento dos organismos,

pois estas trajetórias foram detectadas em ambos os sistemas observacionais ao mesmo

tempo.

A partir da análise das trajetórias, os padrões de deslocamento da associação

foram caracterizados. A identificação dos padrões natatórios foi feita por meio de

análises visuais das trajetórias, sendo agrupados em três principais categorias: retilíneo,

helicoidal e curvado. A figura 9 resume movimentos típicos identificados a partir da

reconstrução tridimensional das trajetórias. Além do ângulo de rotação, foram

consideradas as características, a saber:

18

1. Trajetória Retilínea: Uma trajetória foi considerada do tipo retilíneo quando a

forma dela era semelhante à forma de uma reta. Isto é, na maioria dos casos, a

partícula se dirigia em uma única direção.

2. Trajetória Helicoidal: Uma trajetória foi considerada helicoidal quando os

organismos se deslocavam em uma direção determinada fazendo rotações ao

redor de um eixo imaginário.

3. Trajetória Curvada: Uma trajetória foi considerada do tipo curvada a todas

aquelas trajetórias que não foram categorizadas como retilíneas nem como

helicoidais.

Figura 9: Trajetórias da associação Chaetoceros-Vorticella obtidas pelo LPD e processadas no

MATLAB® R2013. Foram identificadas três principais categorias de padrões de deslocamento

realizados pela associação: retilíneo (A), helicoidal (B) e curvado (C). O volume em que a

trajetória ocorre (cubo com dimensões de 2 cm x 2 cm x 2 cm) representa o campo focal

localizado no centro do aquário.

19

De todas as trajetórias tridimensionais obtidas, observou-se que o tempo de

duração delas variaram de 4 s a 4 min. Este tempo é relativo a trajetória realizada no

campo de filmagem de ambas câmeras.

A tabela 2 resume o número de quadros, bem como os números mínimo e

máximo de quadros por categoria de deslocamento. Pode-se observar que o número

total de quadros não é necessariamente proporcional em cada uma das trajetórias. Além

disso, o número de trajetórias classificadas como retilínea e helicoidal foram próximos,

embora as trajetórias helicoidais tiveram um número de quadros consideravelmente

maior que as trajetórias retilíneas. Em geral, o deslocamento em trajetórias helicoidais

foi menor do que em trajetórias retilíneas, para um mesmo intervalo de tempo. Assim,

quando os organismos realizaram trajetórias helicoidais, eles permaneceram por mais

tempo em um mesmo local, apresentando uma maior área de ocupação e, desta forma,

um maior número de quadros.

Tabela 2: Número de quadros, número de trajetórias, números mínimo e máximo de

quadros por trajetória para cada categoria de deslocamento.

Tipo de

trajetória

Nº de

quadros

Nº de

trajetórias

Nº mínimo de quadros

por trajetórias

Nº máximo de quadros

por trajetórias

Retilíneo 3252

16 80 368

Helicoidal 33772

17 475 4342

Curvado 35719 42 112 4293

Além disso, o tempo de duração de algumas filmagens foi bastante diferente de

uma trajetória para outra. Isto porque a velocidade em cada trajetória foi variável e

juntamente com o padrão e direção de deslocamento realizado, refletiu no tempo que a

associação permaneceu no campo de filmagem e consequentemente, no número de

quadros adquiridos por trajetória.

20

Medidas quantitativas do comportamento de deslocamento da associação

a) Velocidade Média

A velocidade média de deslocamento da associação teve distribuição não-

paramétrica (p<0,05) e, de acordo com o teste Kruskal-Wallis, não houve diferença

significativa entre as categorias de deslocamento (p=0,06). Porém, é possível observar

que os valores para o deslocamento retilíneo foram mais variáveis (Figura 10) e que os

maiores valores de velocidade foram observados nesta categoria.

Os valores de velocidade média mínima e máxima para cada padrão de

deslocamento foram, respectivamente, para o movimento retilíneo 0,1530 e 1,9986 mm

s-1

; helicoidal 0,1920 e 0,7873 mm s-1

e curvado 0,2511 e 1,0825 mm s-1

.

Figura 10: Mediana da velocidade média da associação Chaetoceros-Vorticella. No boxplot, as

linhas superior e inferior em cada uma das categorias representam o primeiro e o terceiro quartil

(Q1 e Q3), respectivamente; a linha central representa a mediana. Os pontos em cada uma das

categorias representa a distribuição dos dados. Os pontos acima e abaixo dos quartis Q1 e Q3

correspondem aos bigodes (whiskers) que mostram a dispersão dos dados. O teste Shapiro-Wilk

indicou que os dados não são normais (p<0,05). Não houve diferença significativa entre as

categorias de deslocamento de acordo com o teste Kruskal-Wallis (p=0,06).

21

b) Velocidade instantânea de deslocamento

Na figura 11 é possível observar que os movimentos mais tortuosos (helicoidal

e curvado) tiveram mais valores outliers de velocidade instantânea quando comparados

ao retilíneo. Isto indica que essas categorias de movimento possuíram maior variação da

velocidade instantânea em cada uma das trajetórias.

Figura 11: Variação da velocidade instantânea em cada uma das 75 trajetórias, agrupadas por

categoria de deslocamento. Cada trajetória é representada por um boxplot. As linhas superior e

inferior em cada caixa representam o primeiro e o terceiro quartil (Q1 e Q3), respectivamente; a

linha central representa a mediana. Os pontos acima e abaixo dos quartis Q1 e Q3 correspondem

aos bigodes (whiskers) que mostram a dispersão dos dados. Os sinais vermelhos representam os

outliers da velocidade instantânea em cada trajetória.

A média da velocidade instantânea em todas as trajetórias analisadas variou de

0,0013 ± 0,0014 a 2,9192 ± 0,6896 mm s-1

. A tabela 3 indica os valores mínimo e

máximo da média da velocidade instantânea para cada categoria de deslocamento.

22

Tabela 3: Média mínima e máxima da velocidade instantânea de deslocamento para

cada padrão comportamental. Os valores estão expressos em mm s-1

.

Tipo de

trajetória

Velocidade

Instantânea

Mínima

Velocidade

Instantânea

Máxima

Retilíneo 0,0013 ± 0,0014 2,9192 ± 0,6896

Helicoidal 0,3270 ± 0,1467 1,2035 ± 0,4941

Curvado 0,3448 ± 0,1900 1,7550 ± 0,4654

De modo geral, o movimento retilíneo teve os maiores valores de velocidade

no decorrer do tempo, com 22% das trajetórias acima de 2 mm s-1

. Porém, como pode

ser observado na figura 12, houve grande variação de velocidade neste padrão de

deslocamento, que teve as maiores e menores velocidades quando comparado as demais

categorias (tabela 3).

Em contrapartida, o movimento helicoidal teve a maior concentração de

trajetórias em velocidades menores, com cerca de 90% delas menores que 1 mm s-1

,

sendo a maior concentração em velocidades abaixo de 0,5 mm s-1

(54%). As trajetórias

curvadas também tiveram maior frequência de ocorrência em velocidades abaixo de 1

mm s-1

(cerca de 80% das trajetórias), embora a maioria tenha sido observada em

velocidades entre 0,5 e 1,0 mm s-1

(44%).

23

Figura 12: Porcentagem da velocidade instantânea de acordo com as categorias de trajetórias.

c) NGDR e Dimensão Fractal

Para as trajetórias analisadas no presente trabalho o NGDR variou de 0,037 a

0,996, com média de 0,572 ± 0,293. A variação dos valores do NGDR no decorrer do

tempo está expressa nos gráficos de comparação das medidas quantitativas (Figura 14 a

22).

A dimensão fractal variou de 0,49 ± 0,45 a 1,22 ± 0,54. Os maiores valores de

dimensão fractal estiveram associados com os maiores índices de tortuosidade e com o

grau de ocupação espacial. Em nosso contexto esperava-se que os movimentos

helicoidais possuíssem os maiores valores de dimensão fractal do que os demais

padrões. A partir de análises estatísticas, foi observado de fato que a dimensão fractal

para movimentos helicoidais foi significativamente maior que as demais categorias de

movimento (teste ANOVA, p<0,0001), mesmo quando comparada a cada categoria

(teste post-hoc de Tukey). Assim, a figura 13 corrobora com o resultado esperado,

apresentando maiores valores para movimentos mais tortuosos.

24

Figura 13: Mediana da dimensão fractal da associação Chaetoceros-Vorticella. No boxplot, as

linhas superior e inferior em cada uma das categorias representam o primeiro e o terceiro quartil

(Q1 e Q3), respectivamente; a linha central representa a mediana. Os pontos em cada uma das

categorias representa a distribuição dos dados. Os pontos acima e abaixo dos quartis Q1 e Q3

correspondem aos bigodes (whiskers) que mostram a dispersão dos dados. De acordo com o

teste Shapiro-Wilk, os dados são paramétricos (p>0,05). As categorias são significativamente

diferentes de acordo com o teste ANOVA (p<0,0001) e teste post-hoc de Tukey com p<0,05.

Comparação das medidas quantitativas

Os gráficos abaixo expressam as trajetórias dos organismos em relação aos

parâmetros calculados. As figuras 14, 15 e 16 representam exemplos de padrões

retilíneos de deslocamento realizados pela associação. O NGDR se manteve próximo a

1 em toda trajetória, bem como uma menor variação do ângulo de rotação em ambos

planos (XY e ZY), o que é esperado para este tipo de deslocamento. Nesta categoria de

deslocamento a velocidade instantânea não expressou, necessariamente, sempre os

maiores valores. Por exemplo, as figuras 14 e 15 indicam movimentos retilíneos

descendentes, sendo que a trajetória da figura 15 expressa uma velocidade instantânea

menor na maior parte do percurso quando comparada à figura 14 (média da velocidade

instantânea para as trajetórias da figura 14 e 15, respectivamente: 2,0957 ± 0,3947 mm

s-1

e 1,1801 ± 0,2121 mm s-1

). Já a trajetória da figura 16 mostra um movimento

retilíneo ascendente, com uma velocidade instantânea menor (0,4210 ± 0,1119 mm s-1

)

quando comparado a outras trajetórias desta mesma categoria. Esta variação de

velocidade para esta categoria de movimento pode ser observada na figura 10.

25

Figura 14: Trajetória retilínea. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma projeção

2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em todo o eixo do

deslocamento. A velocidade está em mm s-1

. O gráfico da direita representa a variação dos

parâmetros quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade

instantânea para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 268 quadros.

A velocidade média da trajetória foi de 1,2484 mm/s. A dimensão fractal foi de 0,87 ± 0,22. O

asterisco (*) indica o início da trajetória.









26









Os movimentos helicoidais estão representados nas figuras 17, 18 e 19. Nestas

categorias houve maior variação do ângulo de rotação nos planos XY e ZY e do NGDR

ao longo da trajetória. A variação do ângulo de rotação está ligada à característica do

próprio movimento helicoidal. Já a variação do NGDR pode ser explicada pela forma

com que esse índice foi calculado (item e - figura 8). Como esta categoria de

movimento possuiu, no geral, uma velocidade menor durante o deslocamento, há mais

pontos em uma mesma distância quando comparado ao movimento retilíneo. Como

consequência a essas circunstâncias é possível observar intervalos na trajetória onde o

valor de NGDR é próximo a 1.

27

Figura 17: Trajetória helicoidal. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma projeção





instantânea para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 4342

quadros. A velocidade média da trajetória foi de 0,2561 mm/s. A dimensão fractal foi de 1,19 ±

0,34. O asterisco (*) indica o início da trajetória.









28

A trajetória da figura 19 foi categorizada como helicoidal com base na variação

do ângulo de rotação, tanto no plano XY quanto no plano ZY, em todo o deslocamento,

apesar de o NGDR ter indicado uma menor tortuosidade durante a maior parte do

percurso. A partir da análise do vídeo, foi possível observar que em toda a trajetória

houve movimento de rotação da associação em torno de seu próprio eixo, além do

movimento de deslocamento que os organismos desempenhavam na coluna de água.

Isso fez com que houvesse maior variação na detecção do centroide de

Chaetoceros/Vorticella pelo programa. Desta forma, o movimento helicoidal foi mais

sutil, fazendo com que, quando plotado, indicasse um movimento mais curvilíneo. O

intervalo em destaque no gráfico ressalta um período em que a associação teve um

menor deslocamento, mas rápidas atividades rotacionais, refletindo, desta forma, nos

picos de velocidades instantâneas, bem como no declínio do NGDR, indicando uma

maior tortuosidade.








0,35. O retângulo vermelho destaca um período de maior variação na velocidade instantânea

com um NGDR próximo a 0, ou seja, onde houve maior tortuosidade no movimento. O


29

As trajetórias curvadas estão representadas pelas figuras 20, 21 e 22. A figura

20 destaca o ponto de mudança de direção no deslocamento da associação, onde se

observa um decréscimo no valor do NGDR, indicando maior tortuosidade no

movimento, e uma maior variação nos valores dos ângulos de rotação nos dois planos

(plano XY e plano ZY). Neste mesmo ponto também é possível observar um consequente

decréscimo, seguido de um aumento na velocidade instantânea. Esta variação dos

parâmetros está ligada ao momento em que há uma brusca mudança na direção da

trajetória, neste caso, em que a trajetória passou de um movimento descendente para

ascendente.

Figura 20: Trajetória curvada. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma projeção








Na trajetória da figura 21, o NGDR indicou uma menor tortuosidade em todo o

deslocamento, possuindo valores acima de 0,9 associados às menores variações nos

ângulos de rotação em ambos os planos, bem como maiores valores de velocidade

instantânea. Esta maior velocidade fez com que nesta trajetória houvesse maior

deslocamento no eixo Y e a menor tortuosidade resultou em um menor deslocamento

nos eixos X e Z, quando comparada às outras trajetórias classificadas como curvadas ou

helicoidais, como, por exemplo, a trajetória curvada da figura 22. Esta trajetória teve um

total de 1294 quadros, um deslocamento de 16,96 mm e uma distância percorrida de

30

23,76 mm. Já a trajetória da figura 21 resultou em 748 quadros, um deslocamento de

20,48 mm e uma distância percorrida de 24,56 mm. Ou seja, apesar de ambas possuírem

valores deslocamento muito próximos, a distância percorrida na trajetória da figura 21

foi menor, o que indica um movimento menos tortuoso (corroborado pelos valores de

dimensão fractal), além de uma velocidade média maior.







A velocidade média da trajetória foi de 0,6568 mm/s. A dimensão fractal foi de 0,99 ± 0,18 O


31








0,21 O asterisco (*) indica o início da trajetória.

Observações morfológicas da associação Chaetoceros-Vorticella

A diatomácea cêntrica Chaetoceros coarctatus é frequentemente observada

com numerosos ciliados da espécie Vorticella oceanica aderidos ao longo de toda

extensão de sua cadeia em águas costeiras de Ubatuba, litoral norte de São Paulo

(Gómez et al., 2018).

De acordo com estudos morfológicos, os ciliados se fixam na frústula (célula

individual da diatomácea) da diatomácea. A frústula é uma estrutura silicosa, composta

por duas estruturas principais: epiteca (oriunda da célula mãe) e hipoteca (a teca menor),

que são opostas e se encaixam. Cada uma das tecas é composta pela valva (epivalva e

hipovalva) associada ao cíngulo, formado por uma ou mais bandas (chamados de

epicíngulo e hipocíngulo). A região superior da valva é frequentemente chamada de

face valvar e, disposto perpendicularmente ao longo de todo o perímetro da face valvar,

está localizado o manto valvar. O limite entre manto e cíngulo é marcado por uma

sutura mais ou menos profunda (Cupp, 1943; Hernández-Becerril, 1991). A

representação diagramática da frústula está na figura 23.

32

Figura 23: Representação diagramática da frústula do gênero Chaetoceros. (1) vista pleural

(cingular) larga; (2) vista pleural (cingular) estreita; (3) vista valvar. Eixos: A distância da

superfície da epiteca através da frústula até a superfície da hipoteca é o eixo pervalvar (P), que

equivale à altura da célula; T, eixo transapical; A, eixo apical. Estruturas: superfície valvar (vs);

manto valvar (mv); cinta ou cíngulo (c); seta (s); seta terminal (st); base da seta (bs); forame (f). Adaptados de Cupp, 1943.

As frústulas em C. coarctatus apresentam formato cilíndrico e elíptico em vista

valvar, com um eixo apical de 25 a 35 µm (Cupp, 1943; Lee et al., 2014 – Figura 24).

Figura 24: Chaetoceros coarctatus. Vista interna da valva intercalar em formato elíptico.

33

A partir das observações morfológicas sob o MEV foi possível observar a

aderência dos ciliados V. oceanica na frústula da diatomácea C. coarctatus. Nestas

análises, o disco adesivo foi visto mais frequentemente localizado na região do manto

da valva da diatomácea (figura 25), sugerindo uma preferência do ponto de fixação.

Também foram realizadas análises morfológicas em MEV de V. oceanica. Na

figura 26B, pode-se observar o zooide cônico, em formato de sino invertido e a coroa de

cílios orais na região peristomial. O tamanho do zooide varia de 18 a 34 µm de

comprimento por 22 a 44 µm de diâmetro e cílios orais com cerca de 12 µm de

comprimento (Nagasawa & Warren, 1996; Sahu et al., 2017). Na figura 26C é possível

observar o pedúnculo estendido, com tamanho variando de 80 a 200 µm de

comprimento, e na base o disco adesivo (3 a 5 µm de diâmetro), usado para fixação no

substrato (Gómez et al., 2018).

34

Figura 25: Chaetoceros coarctatus em associação com Vorticella oceanica. As cadeias

representadas nestas imagens são provenientes de diferentes organismos. Dentre as imagens

representadas acima, a imagem E pertence a uma amostra que não passou pelo método do ponto

crítico. As setas indicam o ponto de aderência do disco adesivo do ciliado no manto da

diatomácea.

35

Figura 26: Vorticella oceanica. (A) Estrutura do zooide. CV = vacúolo contrátil; FV = vacúolo

alimentar; MA = acronúcleos. Barra de escala = 20 µm. (Adaptado de Nagasawa & Warren,

1996). (B, C, D) Imagens de MEV. (B) Zooide (C) V. oceanica distendida. As setas indicam o

pedúnculo e o disco adesivo. (D) Base do disco adesivo.

A partir de análises da associação sob o microscópio invertido (Olympus

IX73), foi verificado que em situações de estresse, como exposição a altas intensidades

de luz, os ciliados abandonavam a cadeia de diatomáceas, deixando muitas vezes o

pedúnculo nela fixado. Além disso, quando as associações foram colocadas em placas

de cultura de células com água do mar filtrada ou em meio de cultura f/2 e mantidas em

câmaras de germinação com temperatura próxima à verificada em campo e fotoperíodo

de 12:12 horas, os ciliados também abandonaram a cadeia de Chaetoceros após um

período de 24 horas nestas condições (figura 27).

36

Figura 27: Cadeia de C. coarctatus após V. oceanica abandonarem a cadeia. As setas indicam o

pedúnculo de alguns ciliados.

Discussão

A associação simbiótica entre a diatomácea cêntrica Chaetoceros coarctatus e o

ciliado peritríquio Vorticella oceanica é amplamente conhecida e registrada em diversos

estudos, porém nunca havia sido analisada sob o ponto de vista de suas implicações para

o movimento destes organismos. O epibionte ciliado V. oceanica foi inicialmente

descrito por intermédio de amostras coletadas no Mar do Sargaços, onde foi encontrado

em associação com a diatomácea C. coarctatus (Zacharias 1906). Cupp (1943)

examinou amostras da costa do Pacífico da América do Norte e detectou grande número

de V. oceanica aderidas a C. coarctatus. Nagasawa & Warren (1996) realizou um

estudo da distribuição vertical das diatomáceas do gênero Chaetoceros durante três anos

em Otsuchi Bay, Japão, onde verificaram uma grande abundância de C. coarctatus

associados a V. oceanica. Sahu et al. (2017) registrou uma diversidade de espécies de

diatomáceas do gênero Chaetoceros em águas costeiras da Índia, bem como em regiões

do Oceano Índico, e entre estas espécies, cadeias de C. coarctatus foram encontradas

em associação com o peritríqueo V. oceanica. Gómez et al. (2018) reportou a associação

37

C. coarctatus-V. oceanica no Atlântico Sul, indicando sua ampla distribuição em águas

tropicais. A fim de contribuir com novos dados acerca desta associação simbiótica, o

presente trabalho analisou a relevância ecológica da simbiose entre Chaetoceros e

Vorticella, por meio de um estudo comportamental do deslocamento destes organismos

na coluna de água.

Diatomáceas planctônicas são comuns em águas eutróficas e bem misturadas,

incluindo áreas polares, regiões costeiras temperadas e tropicais, além de ressurgências

(Malviya et al., 2016). Contudo, estes organismos também são frequentes e diversos em

águas oligotróficas e estratificadas. Para serem capazes de sobreviver sob limitação

nutricional, alguns grupos desenvolveram certas adaptações. Entre estas estratégias, a

migração vertical e as associações simbióticas podem explicar o sucesso de muitas

espécies nestes locais (Scala & Bowler, 2001; Gómez, 2007; Vincent et al., 2018).

Diversos trabalhos têm registrado um amplo espectro de interações simbióticas

entre diatomáceas planctônicas e outros organismos do plâncton, como é o caso da

associação epibiótica entre a diatomácea penada Fragillariopsis doliolus e o ciliado

tintinídeo Salpingella sp. Vincent et al. (2018) sugeriram que esta é uma relação

simbiótica mutualística, onde as diatomáceas adquirem maior motilidade e, em

contrapartida, os tintinídeos se beneficiam de maior proteção e maior eficiência na

produção da corrente alimentar. Gómez (2007) registrou a distribuição espacial e

vertical da associação Eutintinnus–Chaetoceros em águas do Oceano Pacífico. De

acordo com suas análises, foi sugerido que esta associação é fundamental para o sucesso

da diatomácea em águas com baixa disponibilidade de nutrientes e torna o tintinídeo

mais competitivo em relação às espécies congêneres. Outra associação bem conhecida é

da diatomácea do gênero Rhizosolenia com a cianobactéria diazotrófica Richelia

intracellularis, para a qual foi sugerido que florações de fitoplâncton em certas regiões

oligotróficas do oceano poderiam estar ligadas a disponibilidade de nutrientes

resultantes da fixação do nitrogênio por parte destas cianobactérias (Venrick, 1974).

Não há registros da diatomácea C. coarctatus sem a presença dos ciliados

aderidos (Cupp, 1943; Kimor et al., 1992). De acordo com estudos anteriores, a relação

entre V. oceanica e C. coarctatus pode ser uma relação de epibiose ou de foresia. Para

Lincoln et al. (1982) epibiose é uma relação simbiótica em que um organismo vive

sobre a superfície externa do outro. Já foresia foi definida por Kinne (1980) como uma

relação em que um organismo fornece abrigo, transporte ou algum tipo de suporte ao

outro indivíduo, sem qualquer exploração ou troca na atividade metabólica. Taylor

38

(1982) considerou a associação Chaetoceros-Vorticella uma relação de epibiose, onde o

ciliado é o epibionte e a diatomácea o hospedeiro.

A motilidade da associação ocorre, basicamente, em função da produção da

corrente alimentar pelos ciliados aderidos à cadeia de C. coarctatus. Para os ciliados de

vida livre, a motilidade é considerada aleatória, para aumentar a probabilidade de

detecção de presas. Ao detectarem uma fonte alimentar por um estímulo mecânico ou

químico, por exemplo, os ciliados têm a capacidade de modificar seu movimento,

alterando a velocidade de natação e a direção do movimento (Fenchel, 1987).

A disponibilidade e distribuição de fontes alimentares é uma importante

questão que afeta o padrão de movimento de forrageamento dos organismos (Bell,

1991; Cianelli et al., 2009). Para Fenchel (1987) “há aparentemente duas razões para a

motilidade dos protozoários: para capturar partículas alimentares ou para se deslocar

para uma nova locação”. Assim, a locomoção em ciliados ocorre em resposta a uma

combinação de estímulos abióticos e bióticos (como intensidade de luz e

disponibilidade de alimento) que proporciona maior acesso a regiões com condições

mais adequadas de sobrevivência.

Em laboratório, a partir de nossos experimentos, foi observado que a

associação desempenhou movimentos classificados em três categorias de deslocamento:

retilíneo, helicoidal e curvado. Os experimentos foram analisados em um ambiente

homogêneo, sem estímulos adicionais para os ciliados. Os movimentos realizados pela

associação podem ser vistos como randômicos. Como os organismos estavam inseridos

em um ambiente sem estímulos alimentares, a associação se deslocava ativamente,

possuindo velocidades médias variáveis (velocidade média mínima e máxima,

respectivamente: 0,15 mm s-1

e 2,0 mm s-1

). Apesar de não haver diferença significativa

da velocidade média entre as categorias de movimento, foi possível observar que houve

grande variação de velocidade entre as trajetórias retilíneas. De modo geral, a distância

percorrida foi maior em menor tempo nesta categoria de trajetória. Isto sugere que ao

detectar que em certo local do aquário não havia partículas alimentares, a associação

realizava uma espécie de "salto" (movimento retilíneo associado a uma velocidade mais

constante) se alocando em uma nova região e realizando novamente movimentos

curvilíneos e helicoidais, na tentativa de encontrar fontes alimentares.

O movimento helicoidal é um movimento típico identificado em

microrganismos (Buskey et al., 1993). Este movimento está ligado à distribuição e

agregação dos organismos, taxa de encontro de presas e outros processos ecológicos

39

fundamentais (Gurarie et al., 2011). Por exemplo, é o caso de movimentos individuais

que influenciam fenômenos ecológicos como florações de algas nocivas (FANs -

Bearon et al., 2006). Este fenômeno é caracterizado por um rápido e localizado acúmulo

de células produtoras de toxinas em altas densidades populacionais (Bearon &

Grünbaum 2008). As características do comportamento natatório têm sido apontadas

como um dos aspectos que influenciam a ocorrência destas altas concentrações

celulares, como no caso de Heterosigma akashiwo, que executa trajetórias helicoidais

orientadas verticalmente. Para Jennings (1901), a trajetória helicoidal permite com que

um organismo se desloque de um modo assimétrico ao longo de uma trajetória

resultante quase reta. Este movimento é benéfico para os organismos, como em

microalgas com motilidade, que necessitam estar na camada eufótica para realizar

fotossíntese em um ambiente onde a turbulência pode influenciar a sua taxa de

afundamento na coluna de água (Kessler 1985; Gurarie et al., 2011).

Buskey & Stoecker (1989) fizeram um estudo do comportamento natatório de

Favella sp. a fim de quantificar suas respostas comportamentais na presença de

diferentes espécies de fitoplâncton e analisar seus estímulos mecânicos e químicos.

Neste estudo foi verificado que os tintinídeos diminuíam a velocidade quando expostos

a altas concentrações de alimento. Desta forma, de acordo com a literatura e a partir dos

experimentos, pode-se sugerir que ao encontrar regiões com alta concentração de

partículas alimentares a associação Chaetoceros-Vorticella tende a diminuir a

velocidade de natação e deixar de alterar sucessivamente a orientação do deslocamento.

Este deslocamento dos ciliados para as regiões onde estão suas fontes alimentares faz

com que as diatomáceas provavelmente também se beneficiem de áreas com maior

disponibilidade de nutrientes inorgânicos.

Os ciliados desempenham um importante papel em ecossistemas aquáticos. São

consumidores de pico e nano produtores primários, sendo considerados membros chave

na alça microbiana (Azam et al., 1983; Pierce & Turner 1992). Predadores de topo na

cadeia alimentar microbiana, os ciliados são vistos como mediadores na transferência de

carbono microbiano para níveis tróficos superiores, já que são fontes de alimento de

metazoários zooplanctônicos e larvas de peixes (Gemmell et al., 2015). Além disso,

devido a seus hábitos nutricionais e seu metabolismo, os ciliados têm sido reconhecidos

como envolvidos na ciclagem de nutrientes (Lamersdorf & Meyer, 1993; Buhse et al.,

2001).

40

Estes membros do microzooplâncton são reconhecidos como importantes

regeneradores de nutrientes (nitrogênio, fósforo e elementos traços), principalmente

como fontes de NH4+ (Pettigrosso & Popovich, 2009; Echevarria et al., 2014). No

oceano o nitrogênio é considerado um nutriente limitante para produtividade primária

(Carpenter & Capone, 1983). Assim, a excreção dos ciliados é considerada uma fonte de

nutrientes para os organismos autotróficos. No caso de associações simbióticas, esta

excreção pode ser vista como um benefício para a alga, onde ela possuiria seu próprio

suprimento de nutrientes em águas oligotróficas.

Entre os benefícios observados nesta associação podemos citar maior proteção

dos ciliados contra a predação, já que se alocam entre as setas e são capazes de se

contrair na direção da cadeia quando detectam alguma ameaça ou partículas maiores.

Outra característica estrutural é a presença de cloroplastos nas setas (Hernández-

Becerril, 1991). Esta característica faz com que a atividade fotossintética não seja tão

prejudicada devido à presença dos epibiontes sobre a cadeia.

Além de possuírem maior sucesso no deslocamento quando estão em

associação, pode-se sugerir que quando aderidos à cadeia de diatomáceas, os ciliados

podem aumentar o fluxo da corrente alimentar, o que aumentaria tanto a captura de

alimento para os ciliados quanto o fluxo de nutrientes para a cadeia de diatomáceas.

Jonsson et al. (2004) verificou que tintinídeos da espécie Eutintinnus inquilinus, quando

fixados em agregados, possuíam uma taxa alimentar 80% maior do que quando estavam

em vida livre.

A orientação das setas de C. coarctatus também pode ser vista como uma

adaptação da diatomácea à simbiose, pois possivelmente contribui para um

deslocamento mais eficiente, em termos hidrodinâmicos, de toda a colônia. Alterações

morfológicas para hospedar os ciliados também foram identificadas em outras

diatomáceas, como em Chaetoceros tetrastichon Cleve e Chaetoceros dadayi Pavillard,

que são frequentemente encontradas associadas com o tintinídeo Eutintinnus inquilinus

(Gómez, 2007).

Por meio de análises morfológicas em microscopia eletrônica de varredura foi

possível analisar os locais de adesão dos epibiontes à cadeia de diatomáceas. Os discos

adesivos de V. oceanica se encontraram aderidos com maior frequência na região do

manto da frústula da célula individual da diatomácea. Isso pode ser visto como uma

estratégia para permanecerem aderidos na diatomácea mesmo após a cadeia se dividir.

41

Outra característica comportamental observada em condições laboratoriais foi

que quando em situações de estresse como aumento da temperatura ou meio sem

alimento para os ciliados, as Vorticella abandonavam a cadeia de Chaetoceros,

destacando o zooide e passando a nadar livremente. Embora não haja registros destes

organismos no ambiente sem estarem em simbiose, este comportamento pode sugerir

que os ciliados saem em busca de condições mais adequadas.

O comportamento natatório da associação Chaetoceros-Vorticella pode ter

consequências para a agregação dos organismos no ambiente marinho, por intermédio

da formação de camadas finas. Este fenômeno é comum em oceanos costeiros

estratificados (Donaghay et al., 1992). Em resposta a processos biológicos ou físicos, a

camada é formada por aglomeração do fitoplâncton em manchas discretas na coluna de

água com espessura variando de alguns centímetros a poucos metros, extensão

horizontal de vários quilômetros e pode persistir por dias (McManus et al., 2003). Estas

camadas possuem uma grande importância ecológica, já que podem representar um

“hotspot” de interações biológicas, estando frequentemente associadas com alta

abundância de bactérias, zooplâncton e peixes (Benoit-Bird et al., 2009; Durham et al.,

2009). Contudo, algumas camadas são formadas por espécies de fitoplâncton tóxicas,

refletindo em menores concentrações de zooplâncton quando relacionada as camadas

adjacentes (Benoit-Bird et al. 2009). Neste caso a camada pode fornecer uma vantagem

seletiva para estas espécies de algas, fazendo com que a camada seja vista como um

refúgio contra a predação (Durham & Stocker, 2011).

Muitas camadas finas são compostas por células de fitoplâncton móveis,

embora existam camadas finas formadas com espécies não móveis, como certas

diatomáceas (Alldredge et al., 2002; Sullivan et al., 2010). A motilidade dos

organismos, juntamente com o deslocamento do fluido, pode resultar em um fenômeno

complexo e ecologicamente importante nestas regiões. Quando as células migram

verticalmente e atingem uma zona de cisalhamento, onde a direção do fluxo horizontal

muda rapidamente ao longo de uma faixa vertical curta, as forçantes gravitacionais e

viscosas aplicam um torque sobre elas, fazendo com que girem e saiam de sua

orientação no eixo vertical. Quando o cisalhamento excede um limiar crítico, o giro

impede que o fitoplâncton continue se deslocando para cima e, assim, fique preso nesta

faixa. Este processo é chamado de aprisionamento girotático, que contribui para a

formação de camadas finas (Durham & Stocker, 2011).

42

Devido a esse “aprisionamento” de presas em um pequeno intervalo, as

camadas finas são capazes de atrair predadores e aumentar significativamente a

transferência de energia desde os produtores primários aos níveis tróficos superiores,

quando comparadas a regiões onde o plâncton está distribuído de forma mais

homogênea (Durham & Stocker, 2011).

Os ciliados possuem um comportamento natatório que lhes permite explorar a

coluna de água e provavelmente aumentar a chance de encontrar regiões com maior

disponibilidade de alimento. Por outro lado, a maioria das diatomáceas não possui

motilidade. Neste caso elas possuem recursos que auxiliam no controle de sua posição

vertical na coluna de água, regulando sua flutuabilidade. Para esse controle na coluna de

água o fitoplâncton utiliza mecanismos que permitem que sua densidade seja diferente

do meio. Entre esses mecanismos estão a regulação pelos vacúolos de gás (Walsby,

1972), controle de íons (Gross & Zeuthen, 1948), entre outros (vide Gemmell et al.,

2016).

A associação Chaetoceros-Vorticella permite a esta diatomácea cêntrica uma

motilidade ativa na coluna de água, bem como um maior deslocamento para todos os

organismos envolvidos nesta simbiose. De acordo com os cálculos realizados neste

estudo, se considerarmos a velocidade média máxima que a associação desempenhou

em nossos experimentos, uma cadeia de Chaetoceros-Vorticella poderia se deslocar

cerca de 170 metros por dia. Esse não é um valor necessariamente realista, pois não leva

em conta forçantes do meio, como turbulência, mas dá uma medida da significância do

deslocamento da associação Chaetoceros-Vorticella e de suas possíveis consequências

ecológicas.

Considerações finais e perspectivas

Com base em investigações empíricas realizadas neste trabalho, bem como em

outros estudos comportamentais de organismos planctônicos, podemos sugerir que o

comportamento de deslocamento realizado pela associação Chaetoceros-Vorticella na

coluna de água resulta em um baixo custo-benefício tanto para o epibionte quanto para o

hospedeiro. Em regiões oligotróficas, epipelágicas e estratificadas, a associação com

Vorticella pode ser um dos fatores que garante o sucesso desta diatomácea sob

condições ambientais que seriam de outra forma adversas para espécies do

microfitoplâncton. A motilidade possibilitaria à diatomácea atingir regiões com maior

43

disponibilidade de nutrientes e, em contrapartida, os ciliados teriam uma maior

probabilidade de detectar partículas alimentares em maior concentração e ainda obter

proteção contra a predação.

Em termos de submesoescala, este estudo sugere que o deslocamento realizado

pela associação Chaetoceros-Vorticella pode contribuir para a formação de camadas

finas, levando à formação de hotspots de atividade biogeoquímica e de interações

tróficas. No entanto, esta hipótese necessita de validação experimental e, idealmente, de

observações de campo.

O presente estudo forneceu dados iniciais sobre o comportamento de

deslocamento da associação Chaetoceros-Vorticella, e deve ser considerado como um

ponto de partida para elucidar diversas questões ecológicas relevantes. Ainda é

necessário investir em estudos comportamentais para verificar, por exemplo, como os

organismos reagem a estímulos bióticos e abióticos incluindo intensidade de luz,

turbulência, disponibilidade de fontes alimentares, entre outros fatores. Análises

adicionais também são sugeridas na tentativa de entender os mecanismos que levam V.

oceanica a se aderir especificamente a C. coarctatus, assim como para avaliar o destino

dos indivíduos de V. oceanica que se destacam da cadeia de diatomáceas diante de

condições de estresse. Se na natureza eles desempenharem tal comportamento, seriam

eles capazes de encontrar uma nova cadeia de Chaetoceros para se aderir? Nestas

condições adversas, quando sozinhos, os ciliados possuiriam maiores chances de

sobreviver do que com a proteção da diatomácea? Para responder estas questões

também são necessários novos experimentos.

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