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Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2

1 placa - 96 72561

5 placas - 480 72562

KIT DE RASTREIO COMBINADO PARA ANTICORPOS ANTI-HCV E O ANTIGÉNIO DO VÍRUS DA HEPATITE C EM SORO OU PLASMA HUMANO USANDO UMA TÉCNICA DE IMUNOENSAIO ENZIMÁTICO.

862224 – 2014/09

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ÍNDICE

1. UTILIZAÇÃO PREVISTA .................................................................................. 3 2. RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE ............................................................. 3 3. PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO ................................................................. 3 4. REAGENTES .................................................................................................. 4 5. AVISOS E PRECAUÇÕES ............................................................................... 5 6. AMOSTRAS .................................................................................................... 7 7. PROCEDIMENTO ........................................................................................... 7 8. LIMITAÇÃO DO TESTE ................................................................................. 10 9. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO ....................................................... 11 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 13

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1. UTILIZAÇÃO PREVISTA

O Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 é um imunoensaio enzimático qualitativo para a deteção da infeção com o vírus da hepatite C (HCV) com base na deteção de anticorpos anti-HCV e de antigénio da cápside soro ou plasma humano. Este teste de rastreio para a Hepatite C pode ser usado por laboratórios de diagnóstico e por bancos de sangue.

2. RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE

O vírus da Hepatite C (HCV) é um vírus de invólucro de ARN de polaridade positiva (9,5 kb) que pertence à família dos Flaviviridae, do qual foram identificados seis genótipos. O HCV é reconhecido como sendo a principal causa de hepatite viral não-A e não-B. A infeção HCV é caracterizada por uma forma aguda e crónica que poderá dar origem a cirrose e a carcinoma hepatocelular. É possível obter provas serológicas de infeção HCV através de análises sanguíneas para rastrear quanto a antigénios HCV e/ou anticorpos e/ou ARN. Comparativamente a um teste para rastrear somente anticorpos anti-HCV, a utilização de um teste de rastreio combinado para anticorpos anti-HCV e antigénio da cápside pode reduzir o período da janela serológica e melhorar a deteção da infeção.

3. PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO

O Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 é baseado na utilização de uma fase sólida preparada com antigénios purificados: duas proteínas recombinantes da região não-estrutural (NS3 e NS4) e um péptido da região estrutural (cápside) do vírus da hepatite C, e um anticorpo monoclonal contra a cápside da hepatite C. A fase líquida é composta por dois conjugados. O primeiro conjugado (R6) é composto por um anticorpo monoclonal biotinilado de rato contra a cápside da hepatite C. Este anticorpo monoclonal não reage contra o péptido da cápside usado na fase sólida. O segundo conjugado (R7) é uma mistura de anticorpos IgG anti-humanos de rato etiquetados com peroxidase e estreptavidina etiquetada com peroxidase. O procedimento da análise inclui os seguintes passos de reação: O conjugado 1 e as amostras a testar e os soros de controlo são distribuídos pelas cavidades da microplaca. Caso existam anticorpos para HCV, estes irão ligar os antigénios fixos na fase sólida. Se o antigénio da cápside da hepatite C estiver presente, este antigénio será ligado pelos anticorpos monoclonais revestidos na fase sólida e os anticorpos monoclonais biotinilados contra o antigénio da cápside da hepatite C (conjugado 1). Após a incubação a 37 °C durante 90 minutos e uma fase de lavagem, o conjugado 2 que contém anticorpos IgG anti-humanos etiquetados com peroxidase e estreptavidina etiquetada com peroxidase são adicionados a cada cavidade da microplaca. Caso exista presença de IgG humano, tendo reagido com a fase sólida, o conjugado IgG anti-humano liga-se aos anticorpos humanos. A peroxidase/estreptavidina conjugada liga-se à biotina do conjugado 1 se um antigénio da cápside de HCV estiver presente na amostra.

1) Após 30 minutos de incubação a 37 °C o conjugado enzimático não ligado é removido através da fase de lavagem e a presença de complexos antigénio-anticorpo-peroxidase for revelada através da adição de substrato.

Após 30 minutos de incubação à temperatura de laboratório (18 - 30 °C) e uma vez que a reação tenha parado, a leitura do espectrofotómetro é tirada a 450/620-700 nm. A absorvância medida de uma amostra permite detetar a presença ou ausência de anticorpos HCV e/ou de antigénios do capsídeo da hepatite C na amostra. A intensidade da cor é proporcional à quantidade de anticorpos HCV e/ou de antigénios da cápside da hepatite C ligados na fase sólida.

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4. REAGENTES

4.1. Descrição

Identificação no rótulo Descrição Apresentação

Preparação 72561

Apresentação Preparação

72562

R1 Microplate

Microplaca 12 tiras de 8 cavidades cada, revestidas com anticorpo anti-cápside monoclonal dos antigénios purificados recombinantes VHC da hepatite C (NS3, NS4) e um péptido da cápside do HCV. Número ID específico = 93

1 placa Pronto a ser

utilizado

5 placas Pronto a ser

utilizado

R2 Concentrated washing solution (20X)

Solução de Lavagem concentrada (20x) Tampão Tris NaCl pH 7,4 Conservante: ProClin™ 300 (0,04%)

1 frasco 70 ml

Para diluição

1 frasco 235 ml

Para diluição

R3 Negative control

Controlo negativo Tampão Tris HCI, contendo BSA (Albumina de Soro Bovino); Conservante: ProClin™ 300 (0,1%)

1 frasco 1 ml

Pronto a ser utilizado

1 frasco 1 ml

Pronto a ser utilizado

R4 Positive control

Controlo positivo Soro humano contendo anticorpos para HCV negativo para antigénio HBs e para anticorpos anti HIV-1 e anti HIV-2 diluídos num tampão Tris HCI contendo BSA, fotoquimicamente inativado. Conservante: ProClin™ 300 (0,1%)

1 frasco 1,5 ml

Pronto a ser utilizado

1 frasco 3 ml

Pronto a ser utilizado

R5a Antigen positive control

Controlo antigénio positivo Controlo antigénio positivo sintético contendo um péptido da cápside liofilizado.

1 frasco q.s. ad

1 ml Para

reconstituição

1 frasco q.s. ad

1 ml Para

reconstituição

R5b Antigen diluent Diluente de R5a Água destilada contendo um conservante: ProClin™ 300 (0,5 %)

1 frasco 1 ml Para

reconstituição

1 frasco 1 ml Para

reconstituição

R6 Conjugate 1

Conjugado 1 Anticorpo monoclonal biotinilado de rato contra antigénio da cápside do HCV. Coloração púrpura Conservante: Azida de sódio (< 0,1%), Cosmocil

® CQ (0,025%)

1 frasco 15 ml

Pronto a ser utilizado

2 frascos 2 x 30 ml

Pronto a ser utilizado

R7 Conjugate 2

Conjugado 2 Anticorpos de rato dirigidos contra IgG/peroxidase humana e estreptavidina/peroxidase. Coloração verde Conservante: ProClin™ 300 (0.5 %)

1 frasco 15 ml

Pronto a ser utilizado

2 frascos 2 x 30 ml

Pronto a ser utilizado

R8 Substrate buffer

Substrato Solução de ácido cítrico e acetato de sódio, pH 4,0, contendo H2O2 (0,015%) e dimetilsulfóxido (DMSO) 4%

1 frasco 60 ml Para

reconstituição

2 frascos 2 x 60 ml

Para reconstituição

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R9 Chromogen: TMB solution (11X)

Cromogénio: Solução TMB Solução contendo 3,3’, 5,5’ tetrametilobenzeno (TMB)

1 frasco 5 ml

Para diluição

2 frascos 2 x 5 ml

Para diluição

R10 Stopping solution

Solução de paragem

Solução de ácido Sulfúrico (H2SO4 1N)

1 frasco 28 ml

Pronto a ser utilizado

3 frascos 3 x 28 ml

Pronto a ser utilizado

4.2. Condições de conservação e manuseamento

O kit deve ser armazenado a pelo menos +2-8 °C. Cada item do kit preservado a +2-8°C pode ser usado até à data de validade indicada na embalagem (salvo indicação em contrário). Após a abertura e na ausência de contaminação, os reagentes R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 e R10 conservados a 2-8 °C podem ser usados até a data de validade indicada na etiqueta.

Identificação Conservação

R1 Após a abertura do saco selado a vácuo, as tiras da microplaca armazenadas a +2-8 °C podem ser usadas durante 1 mês no respetivo saco original selado novamente com cuidado com fita adesiva.

R2 A solução de lavagem diluída pode ser armazenada a +2-30 °C durante 2 semanas. A solução de lavagem concentrada (R2) pode ser armazenada a +2-30 °C.

R5a + R5b Após a reconstituição, a solução funcional de controlo antigénio positivo (R5) pode ser armazenada durante 1 mês a +2-8 °C e 2 meses a -20 °C (até 5 ciclos de congelamento/descongelamento após o congelamento a -20 °C).

R8 + R9 Após a reconstituição, os reagentes armazenados no escuro podem ser utilizados durante 6 horas à temperatura ambiente (18-30 °C).

5. AVISOS E PRECAUÇÕES

Para fins de diagnóstico in vitro por um profissional de saúde.

5.1. Precauções de Saúde e Segurança

• Este kit de teste apenas deve ser manuseado por pessoal qualificado com formação em procedimentos laboratoriais e familiarizado com os respetivos potenciais perigos. Utilize vestuário de proteção adequado, luvas, proteção ocular/facial e manuseie de forma adequada de acordo com as Boas Práticas Laboratoriais exigidas.

• O kit de teste contém componentes de sangue humano. O material de origem humana usado na

preparação do reagente R4 (Controlo Positivo) foi testado e considerado não reativo para o antigénio de superfície da hepatite B (HBs Ag) e anticorpos para Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-1 e HIV-2 Ab) e positivo para anticorpos anti-HCV. O R4 de controlo positivo é tornado inativo com o aquecimento. Nenhum método de teste conhecido pode oferecer total garantia da ausência de agentes infeciosos. Por conseguinte, todos os derivados de sangue humano, reagentes e amostras humanas devem ser manuseados como meios capazes de transmissão de doença infeciosa, cumprindo as Precauções Universais recomendadas para agentes patogénicos transmissíveis pelo sangue, conforme definido pelos regulamentos locais, regionais e nacionais.

• Salpicos biológicos: Os salpicos de material de origem humana devem ser tratados com

potencialmente infeciosos. Os salpicos que não contenham ácido devem ser imediatamente descontaminados, incluindo a área, materiais e quaisquer superfícies ou equipamento contaminados com salpicos, com um desinfetante químico apropriado eficaz para resíduos biológicos potencialmente perigosos das amostras envolvidas (normalmente, uma diluição de 1:10 de lixívia de uso doméstico, 70-80% de etanol ou isopropanol e iodofor como Wescodyne™ Plus a 0,5% etc.), devendo ser secos com um pano. Salpicos que contenham ácido devem ser absorvidos adequadamente (limpos com um pano) ou neutralizados e a área deve ser enxaguada e limpa com um pano até ficar seca; poderá ser

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necessário eliminar os materiais utilizados para limpar os salpicos como resíduos biologicamente perigosos. Em seguida, a área deverá ser descontaminada com um dos desinfetantes químicos.

NOTA: Não coloque soluções que contenham lixívia na autoclave!

• Elimine todas as amostras e materiais utilizados para realizar o teste como se estes contivessem um agente infecioso. Os resíduos laboratoriais, químicos e biológicos perigosos devem ser manuseados e eliminados em conformidade com todos os regulamentos locais, regionais e nacionais.

• Para obter recomendações relativas a perigos e precauções relacionadas com alguns componentes

químicos neste kit de teste, consulte as ilustrações indicadas nos rótulos e as informações fornecidas no final das instruções de utilização. A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível em www.bio-rad.com.

5.2. Precauções relacionadas com o protocolo

5.2.1. Preparação

A fiabilidade dos resultados depende da implementação correta das Boas Práticas Laboratoriais que se seguem:

• Não utilize reagentes expirados. • Não misture nem associe reagentes de diferentes lotes num único teste. • Antes da utilização, aguarde 30 minutos até que os reagentes estabilizem à temperatura ambiente

(18-30 °C). • O nome do teste bem como um número de identificação específico para o teste são escritos na

estrutura de cada microplaca. O número de identificação específico é indicado também em cada tira.

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2: Número ID específico = 93 Verifique o número de identificação específico antes da utilização. Se o número de identificação estiver em falta ou for diferente do número indicado correspondente à análise a testar, a tira não deve ser usada.

OBSERVAÇÃO: Para a solução de lavagem (R2, identificação da etiqueta: 20X coloração verde), tampão de substrato peroxidase (R8, identificação da etiqueta: tampão TMB, coloração azul), cromogénio (R9, identificação da etiqueta: TMB 11X, coloração púrpura) e solução de paragem (R10, identificação da etiqueta: 1N coloração vermelha), é possível usar outros lotes para além daqueles incluídos no kit, desde que o mesmo lote seja usado na execução de um determinado teste. Estes reagentes podem ser usados com alguns dos outros produtos da nossa empresa. Contacte a nosso serviço técnico para informação detalhada.

• Reconstitua cuidadosamente os reagentes, evitando qualquer contaminação. • Use vidros de laboratório minuciosamente lavados e enxaguados com água desionizada ou, de

preferência, material descartável. • Não deixe que a microplaca seque entre o final da operação de lavagem e a distribuição de

reagente. • A reação enzimática é muito sensível ao metal ou a iões metálicos. Por conseguinte, não permita

que qualquer elemento metálico entre em contacto com as várias soluções de conjugado ou de substrato.

• A solução de desenvolvimento (tampão de substrato + cromogénio) deve ter coloração cor-de-rosa. A modificação desta coloração cor-de-rosa no intervalo de alguns minutos após a reconstituição indica que o reagente não pode ser usado e deve ser substituído. A preparação da solução de desenvolvimento pode ser realizada numa bandeja de plástico limpa, descartável e de utilização única ou num recipiente de vidro que primeiramente tenha sido pré-lavado com 1N HCl, enxaguado minuciosamente com água destilada e seco. Este reagente deve ser armazenado no escuro.

• Nunca utilize o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de desenvolvimento.

5.2.2. Processamento

• Não altere o procedimento de teste. • Não realize o teste na presença de vapores reativos (vapores ácidos, alcalinos ou aldeídicos) ou de

poeira que possam alterar a atividade enzimática do conjugado. • Utilize uma ponta de distribuição nova para cada amostra.

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• A lavagem da cavidade é um passo crítico neste procedimento: respeite o número de ciclos de lavagem recomendado, certificando-se de que todas as cavidades são completamente cheias e completamente esvaziadas em seguida. Uma lavagem incorreta pode levar a um resultado incorreto.

• Siga cuidadosamente os procedimentos de lavagem descritos de modo a obter o máximo desempenho do teste. Com alguns instrumentos, poderá ser necessário otimizar o procedimento de lavagem (aumentar o número do ciclo da fase de lavagem e/ou o volume do tampão de lavagem para cada ciclo) para obter um nível aceitável de fundo OD para a amostra com resultado negativo.

• Contacte a sua empresa relativamente a adaptações e a procedimentos especiais.

6. AMOSTRAS

Recolha as amostras de sangue de acordo com as práticas correntes. Os testes devem ser realizados em soro não diluído ou plasma (recolhido em EDTA, citrato de sódio ou ACD). O uso de uma amostra retirada dos tubos contendo heparinato de lítio não é recomendado. Foi observado um sinal inferior nas amostras que testaram positivo para o antigénio HCV. As amostras que contêm agregados têm de ser clarificadas por centrifugação antes do teste. As partículas suspensas de fibrina ou agregados podem produzir falsos resultados positivos. As amostras devem ser armazenadas a +2-8 °C se o teste for realizado no espaço de 7 dias ou podem ser congeladas a -20 °C. Não repita mais de 3 ciclos de congelamento-descongelamento. As amostras devem ser descongeladas à temperatura ambiente (18-30 °C). É recomendável homogeneizar as mesmas através de inversão antes da utilização. As amostras que contenham até 120 g/l de albumina, 50 µg/l de biotina, e 200 mg/l de bilirrubina, amostras que contenham até 33 g/l de trioleína e amostras que contenham até 2 g/l de hemoglobina não afetam os resultados. Contudo não é recomendável o uso de amostras contaminadas hiperlipémicas ou hiper-hemolizadas. Não é recomendável o aquecimento das amostras, esse procedimento poderá reduzir significativamente a deteção do antigénio HCV. Se as amostras se destinam a ser transportadas, devem ser acondicionadas em conformidade com as regulamentações em vigor relativamente ao transporte de agentes etiológicos e de preferência transportadas congeladas.

7. PROCEDIMENTO

7.1. Materiais necessários mas não fornecidos

• Água destilada. • Hipoclorito de sódio (lixívia de uso doméstico) e bicarbonato de sódio. • Papel absorvente. • Fita adesiva. • Luvas descartáveis. • Óculos de segurança. • Tubos descartáveis. • Pipetas ou multi-pipetas ajustáveis ou predefinidas, automáticas ou semiautomáticas, para medir e

dispensar 50 μl, 80 μl, 100 μl, 200 μl e 1 ml. • Cilindros graduados de 10 ml, 200 ml e 1000 ml. Misturador Vortex. • Sistema de lavagem de microplacas automático, semiautomático ou manual. • Banho de água, ou incubadora de microplacas equivalente, com termóstato ajustado para 37 °C ±

1 °C (*). • Recipiente para resíduos biologicamente perigosos. • Leitor de microplacas equipado com filtros de 450, 490 nm e 620-700 nm (*).

(*) Contacte-nos para informação detalhada sobre o equipamento recomendado pelo nosso departamento técnico.

7.2. Preparação dos reagentes

7.2.1. Reagentes prontos a utilizar

Reagente 1 (R1): Microplaca Cada estrutura de apoio contendo 12 tiras é envolta numa bolsa de alumínio selada. Corte a bolsa usando uma tesoura ou um bisturi 0,5 a 1 cm acima do selo. Abra a bolsa e retire a estrutura. Coloque as tiras não utilizadas na bolsa. Feche a bolsa cuidadosamente e volte a armazená-la a +2-8 °C com fita adesiva.

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Reagente 6 (R6): Conjugado 1 Homogeneíze invertendo antes da utilização. Reagente 7 (R7): Conjugado 2 Homogeneíze invertendo antes da utilização.

7.2.2. Reagentes para reconstituir

Reagente 2 (R2): Solução de Lavagem concentrada (20x) Dilua 1:20 em água destilada para obter a solução de lavagem pronta a utilizar. Prepare 800 ml para uma placa de 12 tiras. Reagente 8 (R8) + Reagente 9 (R9): Solução de desenvolvimento de enzimas Dilua 1:11 o cromogénio (R9) no Tampão de Substrato (por ex.: 1 ml de reagente R9 + 10 ml de reagente R8) visto que 10 ml são a quantidade necessária e suficiente para tratar 12 tiras. Homogeneíze. Reagente 5a (R5a) + Reagente 5b (R5b): Solução de trabalho (R5) Verta o conteúdo do diluente de R5b no frasco de Ag R5 liofilizado. Volte a tapar o frasco e deixe repousar durante 10 minutos à temperatura ambiente (18-30 °C), agitando e invertendo o frasco ocasionalmente para facilitar a dissolução.

7.3. Procedimento da análise Siga rigorosamente o procedimento. Use soros de controlo negativos e positivos para cada teste de modo a validar a qualidade do teste. Siga as Boas Práticas Laboratoriais que se seguem:

1) Estabeleça cuidadosamente o plano de identificação e distribuição de amostras. 2) Prepare a solução de lavagem diluída R2 e a solução funcional de controlo antigénio positivo

(R5a + R5b). (consulte § 7.2) 3) Retire a estrutura de apoio da embalagem de proteção e o número necessário de tiras (R1).

Volte a colocar as tiras não utilizadas na embalagem. Feche a embalagem e volte a colocá-la a +2-8 °C.

4) Distribua na cavidade pela seguinte ordem (distribuição de placa recomendável): • 100 μl de conjugado 1 (R6) em cada cavidade, em seguida • 50 μl de controlo negativo (R3) na cavidade A1, • 50 μl de controlo positivo (R4) nas cavidades B1, C1, D1, • 50 μl da solução funcional de controlo antigénio positivo (R5a + R5b) na cavidade E1, • 50 μl da primeira amostra na cavidade F1, • 50 μl da segunda amostra na cavidade G1, etc.

Homogeneíze a mistura com pelo menos 3 aspirações ou com um agitador de microplacas durante 5 segundos. Se a distribuição das amostras demorar mais de 10 minutos, é recomendável distribuir os controlos negativos e positivos após as amostras a testar. Dependendo do sistema usado, é possível mudar a posição dos controlos ou a ordem de distribuição.

OBSERVAÇÃO: Após a distribuição das amostras, a cavidade que contém amostras (ou controlos) passa de púrpura a azul. É possível verificar a presença de (amostra + conjugado 1) nas cavidades através da leitura do espectrofotómetro a 620 nm (consulte § 7.7). 5) Quando possível, cubra a placa com fita adesiva nova. 6) Incube a microplaca durante 90 minutos (± 5 min.) a 37 °C ± 1 °C. 7) Se necessário, retire a fita adesiva. Aspire o conteúdo de todas as cavidades para um recipiente

de líquido evacuado e adicione pelo menos 370 µl de solução de lavagem a cada cavidade. Aspire novamente e repita a lavagem pelo menos 5 vezes. O volume residual deve ser inferior a 10 μl (se necessário, seque as tiras virando-as ao contrário em papel absorvente). Caso tenha um lavador automático, siga o mesmo ciclo operacional.

8) Distribua rapidamente 100 μl da solução de conjugado 2 (R7) em cada cavidade no interior da placa. O conjugado deve ser agitado suavemente antes da utilização. Cubra se possível, com fita adesiva nova e incube durante 30 minutos (± 5 min.) a 37 °C ± 1 °C.

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OBSERVAÇÃO: O conjugado tem coloração verde. É possível verificar a presença de conjugado nas cavidades através da leitura do espectrofotómetro a 620 nm (consulte § 7.7).

9) Retire a fita adesiva, esvazie todas as cavidades por aspiração e lave pelo menos 5 vezes tal como descrito acima.

10) Prepare solução de desenvolvimento de enzimas (reagente R8 + R9). 11) Distribua rapidamente 80 μl de solução de desenvolvimento de enzimas (R8 + R9) em todas as

cavidades. Deixe a reação desenvolver-se no escuro durante 30 minutos (± 5 min) à temperatura ambiente (18 - 30 °C). Não aplique fita adesiva durante esta incubação.

OBSERVAÇÃO: A distribuição da solução de desenvolvimento, com coloração cor-de-rosa, pode ser controlada visualmente nesta fase da manipulação. Existe uma clara diferença de coloração entre uma cavidade vazia e uma cavidade que contém a solução de substrato cor-de-rosa. (Consulte § 7.7) 12) Adicione 100 μl da solução de paragem (R10) usando a mesma sequência e a mesma razão de

distribuição usada para a solução de desenvolvimento.

OBSERVAÇÃO: A distribuição da solução de paragem incolor pode ser controlada visualmente nesta fase de manuseamento. A cor do substrato, cor-de-rosa (para amostras negativas) ou azul (para amostras positivas), desvanece das cavidades, que se tornam incolores (para amostras negativas) ou amarelas (para amostras positivas) após a adição da solução de paragem. 13) Limpe cuidadosamente o fundo de cada placa. Aguarde pelo menos 4 minutos após a adição da

solução de paragem e no espaço de 30 após a paragem da reação, leia a densidade ótica a 450/620-700 nm usando um leitor de placas.

14) Confirme a conformidade entre a leitura do espectrofotómetro e a leitura visual e compare com distribuição da placa e da amostra e o plano de identificação.

7.4. Controlo de qualidade Utilize controlos de qualidade (R4 e R5) e o controlo negativo (R3) em cada execução do teste para validar a análise. (Consulte §7.5)

7.5. Critérios de validação do teste Este teste é validado se as condições abaixo forem respeitadas:

1) Para o controlo negativo R3: O valor de absorvância medido deve ser inferior a 60% do corte: O.D. < corte x 0,6

2) Para o controlo positivo de anticorpos R4: 0,800 ≤ Média O.D. R4 ≤ 2,700 Se um dos valores individuais R4 de controlo positivo diferir em mais de 30% do valor médio, ignore o valor e execute o cálculo novamente com os dois valores de controlo positivo restantes.

3) Para a solução de trabalho R5:

O.D. > 0,500

7.6. Cálculo/Interpretação dos resultados O corte é determinado com o controlo positivo R4: Calcule o valor de absorvância médio medido para o controlo positivo R4. Calcular o valor de corte:

OD média R4 CO = --------------------- 5

A presença ou ausência de anticorpos anti-HCV e/ou antigénio da cápside de HCV é determinada através da comparação da absorvância registada com o valor de corte calculado para cada amostra. A razão seguinte é calculada para cada amostra:

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Razão = OD da amostra / Valor CO (Corte) As amostras com uma densidade ótica (OD) inferior ao valor de corte são consideradas negativas (razão < 1) pelo Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. Os resultados imediatamente abaixo do valor de corte (CO-10 % < O.D. < CO, razão entre 0,9 e 1) devem contudo, ser interpretados com cautela. É recomendável voltar a testar em duplicado as amostras correspondentes quando os sistemas e os procedimentos laboratoriais o permitirem. As amostras com uma densidade ótica superior ou igual ao corte (razão ≥ 1) são consideradas inicialmente positivas pelo Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. Devem ser testadas novamente em duplicado antes da interpretação final. Se após a repetição do teste o valor da razão de pelo menos um dos 2 duplicados for igual a ou superior a 1, o resultado inicial é repetível e a amostra é declarada positiva com o Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. Os valores da razão dos 2 duplicados são inferiores a 1, o resultado inicial não é repetível e a amostra é declarada negativa. As amostras cujos testes foram repetidos duas vezes e foram declaradas negativas com o Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2, mas com um valor próximo do valor de corte (razão entre 0,9 e 1) devem ser consideradas cuidadosamente. É recomendável repetir o teste do paciente com outro método ou noutra amostra. Em caso de densidade ótica muito reduzida para amostras testadas (OD negativa) e quando a presença de amostras bem como a de reagentes é controlada, os resultados podem ser interpretados como negativos. É recomendável confirmar as amostras positivas seguindo as recomendações e algoritmos nacionais correntes.

7.7. Verificação espetrofotométrica da amostra e pipetagem do conjugado (opcional)

Verificação da pipetagem da Amostra e do Conjugado 1 (R6) É possível verificar a presença de conjugado 1 (R6) + amostra na cavidade através de leitura automática a 620 nm. Cada cavidade contendo amostra e conjugado 1 (R6) deve ter uma OD superior a 0,800. OBSERVAÇÃO: Após a adição da amostra, o conjugado 1 (R6) passa de púrpura a azul. Verificação da pipetagem do conjugado 2 (R7) O conjugado 2 (R7) tem coloração verde. A presença de conjugado 2 (R7) nas cavidades pode ser controlada através de leitura automática a 620 nm: O valor OD de cada cavidade deve ser superior a 0,300 (um valor inferior a este indica normalmente uma dispensa insuficiente do conjugado). Verificação da pipetagem da solução de desenvolvimento É possível verificar a presença de solução de desenvolvimento cor-de-rosa na cavidade através de leitura automática a 490 nm. Uma cavidade com solução de desenvolvimento tem de ter uma densidade ótica superior a 0,100 (uma OD inferior indica uma dispensa insuficiente da solução de desenvolvimento). Ocorre uma alteração significativa da coloração das cavidades vazias de incolor para cor-de-rosa após a adição da solução de substrato de cromogénio.

8. LIMITAÇÃO DO TESTE

Devido às diversas respostas imunológicas dos pacientes infetados pelo vírus da hepatite C (especialmente durante as seroconversões), algumas diferenças de deteção podem ser observadas entre os testes, dependendo do tipo de proteínas antigénicas usadas. Um resultado negativo durante um teste de rastreio não exclui portanto a possibilidade de exposição ou infeção pelo vírus da hepatite C. De acordo com a literatura, os portadores de HCV submetidos a tratamento de imunossupressão ou co-infetados com HIV-HCV podem ter níveis particularmente baixos de anticorpos, abaixo do limite de deteção dos testes HCV . Qualquer técnica ELISA pode produzir falsas reações positivas. É recomendável verificar a especificidade da reação de qualquer amostra que se considere um positivo repetível, de acordo com os critérios de interpretação do kit Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2, usando um método adequado: usando um teste de rastreio de anticorpos anti-HCV ELISA isoladamente ou com um teste immunoblot de deteção de anticorpos

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anti-HCV para provar a presença de anticorpos anti-HCV. Se necessário, utilize um teste de biologia molecular para rastrear o genoma HCV. O método colorimétrico para verificar a deposição de amostras e/ou de conjugados e/ou de solução de desenvolvimento não permite verificar a precisão dos volumes distribuídos e apenas revela a presença da amostra e/ou dos conjugados e/ou da solução de desenvolvimento. A taxa de respostas erradas com este método está intimamente relacionada com a precisão do sistema utilizado (o coeficiente acumulado de variação de dispensa e a leitura acima de 10% reduz significativamente a qualidade da verificação). A utilização do teste Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 não está aprovada para conjuntos de amostras ou amostras diluídas. Excecionalmente, finas partículas poderão ser vistas no Conjugado 1 (R6), sendo que a presença das mesmas não altera em caso algum a qualidade do reagente.

9. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO

9.1. Medição Precisa

A reprodutibilidade e precisão intermédia foram determinadas utilizando amostras com diferentes concentrações de anticorpos anti-HCV e antigénios HCV. As amostras foram testadas 30 vezes durante a mesma série de testes para determinar a repetibilidade. A precisão intermédia foi avaliada através do teste das amostras em duplicado durante 20 dias em 2 execuções independentes em cada dia. A razão significa que os desvios padrão e os coeficientes de variação (CV) foram calculados.

9.1.1. Repetibilidade

Amostras N Média de

razões Desvio padrão

CV%

Negativo S1 30 0,23 0,024 10,4

Antigénio HCV

Positivo

S2 30 1,21 0,048 4,0

S3 30 1,43 0,053 3,7

S6 30 7,18 0,166 2,3

Anticorpos Anti-HCV Positivo

S4 30 1,42 0,046 3,2

S5 30 1,35 0,083 6,1

S7 30 6,73 0,153 2,3

Os CV obtidos em 6 amostras positivas são <10%.

12 [PT]

9.1.2. Precisão intermédia

Amostras N

Média de

razões

Intra-análise

Interanálise/operador

Interdia Reprodutibilida

de total

DP CV%

DP CV% DP CV%

DP CV%

Negativo S1 80

0,22 0,01

7 7,5 0,028 12,5

0,029

12,7 0,043 19,4

Antigénio HCV

Positivo

S2bis

80

2,80 0,14

3 5,1 0,277 9,9

0,283

10,1 0,421 15,0

S3 80

1,56 0,12

4 7,9 0,129 8,2

0,083

5,3 0,197 12,6

S6 68

6,69 0,50

0 7,5 0,621 9,3

0,557

8,3 0,973 14,5

Anticorpos Anti-HCV

Positivo

S4 80

1,57 0,06

2 3,9 0,125 8,0 0* N/D 0,140 8,9

S5 80

1,75 0,07

5 4,3 0,164 9,3 0* N/D 0,181 10,3

S7 80

7,69 0,28

5 3,7 0,531 6,9 0* N/D 0,603 7,8

*: O valor negativo de variação é estimado em 0.

Os CV obtidos em 6 amostras positivas não são mais do que 15%.

9.2. Desempenho clínico

O desempenho do Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 foi determinado através de amostras provenientes de dadores de sangue, pacientes hospitalizados, pacientes com infeções agudas e crónicas do vírus da hepatite C e de pacientes com sinais clínicos não relacionados com a infeção do vírus da hepatite C, todos eles aleatórios. Os estudos foram realizados em 2 bancos de sangue, num hospital e na Bio-Rad.

9.2.1. Especificidade do Diagnóstico

O estudo foi realizado em amostras de soro e plasma EDTA colhidas em 2 centros de dádiva a doadores aleatórios. Também foi realizado um estudo de especificidade em amostras provenientes de pacientes hospitalizados. Todas as amostras foram testadas com um teste anti-HCV com a marca CE.

População Local Tipo de amostra

Número Amostras reativas

repetidas (RR)

Especificidade (%)

Intervalo de confiança 95%

Dadores de sangue

#1 soro 537 1 536/537

plasma 2002 0 2002/2002

#2 soro 2638 2 2636/2638

#1 + #2 5177 3 99,94%

5174/5177 99,83% – 99,99%

Pacientes hospitalizados

#3 soro 502 1 99,80% 501/502

98,92% - 100,00%

*: 3 doadores considerados indeterminados com o teste de referência foram removidos dos cálculos

9.2.2. Sensibilidade do diagnóstico

A sensibilidade do diagnóstico foi estudada em 575 amostras provenientes de pacientes infetados pelo vírus da hepatite C. Entre estas amostras, 25 vieram de pacientes testados nas 24 horas anteriores à análise. Foram testadas 481 amostras genotipadas diferentes (1; 2; 3; 4; 5; 6).

Tabela 1: Genótipos testados

Genótipos 1 2 3 4 5 6

Total (1, 1a, 1b, 1a/b)

(2 2a/c, 2a, 2b, 2b/3

(3, 3a, 3b, 3c) (4, 4a, 4a/c, 4a/c/d, 4c, 4e, 4h, 4n, 4r)

(5, 5a) (6, 6a, 6a/b, 6n)

N 241 56 107 63 8 6 481

13 [PT]

A sensibilidade do diagnóstico sobre todas as amostras testadas é de 100% (575/575) com um intervalo de confiança de 95% de [99,4-100,0].

Amostras provenientes de pacientes com uma infeção aguda: 39 painéis de seroconversão (10 perfis da cápside, 10 perfis NS3 e 19 perfis múltiplos) foram testados com o teste Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 e comparados com um teste combinado antigénio/anticorpo e com um teste anticorpo anti-HCV, ambos com a marca CE. A precocidade da deteção foi medida para todos os painéis. Destes 39 painéis, um painel não foi detetado pelo Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 e três não foram detectados pelo teste combinado Ag-Ab usado para comparação. Nos 38 painéis detetados pelo Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2, 5 tiveram uma deteção anterior, 27 tiveram uma deteção equivalente e 6 tiveram uma deteção posterior em comparação com o teste combinado Ag-Ab. Em comparação com um teste anticorpo anti-HCV, 28 painéis tiveram uma deteção anterior, 9 tiveram uma deteção equivalente e 1 teve uma deteção posterior.

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 versus teste combinado HCV Ag-

Ab

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 versus teste Anti-HCV

Número de painéis 38 38

Deteção anterior 5 28

Deteção equivalente 27 9

Deteção posterior 6 1

9.3. Estudo da especificidade analítica / reatividade cruzada

365 amostras potencialmente interferentes, contendo anticorpos contra agentes patogénicos que poderiam levar a doenças infeciosas (Citomegalovírus, vírus de Epstein-Barr , VZV, vírus do sarampo, vírus da rubéola, vírus da papeira, vírus do herpes, vírus da gripe, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, HIV 1/2, HTLV 1/2, sífilis, Toxoplasma gondii, Dengue, doença de Chagas), amostras do grupo de risco (pacientes de diálise, vítimas de cirrose não-hepática, mulheres grávidas, mulheres multíparas) ou amostras provenientes de pacientes com distúrbios do sistema imunitário (auto-anticorpos, fatores reumatoides, anticorpos anti-rato e mielomas) foram testadas com o teste Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. Foram encontradas duas amostras repetidamente positivas com o teste Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. A especificidade observada nesta população alvo, de 99,45% (363/365), foi similar à especificidade de amostras clínicas.

9.4. Efeito "hook"

A existência de um possível efeito "hook" foi estudada através do teste a 5 amostras com elevadas titulações em diferentes diluições. A equivalência de resultados observada entre amostras não diluídas e amostras diluídas indica a ausência do efeito "hook".

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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