monitoramento sazonal do muco do zoantÍdeo … · nossos desejos pessoais, conceitos e ao afeto...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA – CAV
CURSO DE GRADUAÇÃO EM LICENCIATURA EM CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS
MONITORAMENTO SAZONAL DO MUCO DO ZOANTÍDEO
Palythoa caribaeorum (BABA DE BOI) COLETADO NA PRAIA DE
PORTO DE GALINHAS.
VITÓRIA DE SANTO ANTÃO-PE/2010.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA – CAV
CURSO DE GRADUAÇÃO EM LICENCIATURA EM CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS
MONITORAMENTO SAZONAL DO MUCO DO ZOANTÍDEO
Palythoa caribaeorum (BABA DE BOI) COLETADO NA PRAIA DE
PORTO DE GALINHAS.
LEYLIANE GOMES DA MOTA SILVA
VITÓRIA DE SANTO ANTÃO-PE/2010
TCC apresentado ao Curso de Graduação em Licenciatura em Ciências Biológicas como requisito para incremento de Carga Horária de Atividades Complementares do Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas. Orientadora: Dr. Jeanne Claine de Albuquerque Modesto.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA – CAV
CURSO DE GRADUAÇÃO EM LICENCIATURA EM CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS
MONITORAMENTO SAZONAL DO MUCO DO ZOANTÍDEO
Palythoa caribaeorum (BABA DE BOI) COLETADO NA PRAIA DE
PORTO DE GALINHAS.
LEYLIANE GOMES DA MOTA SILVA
Trabalho de Conclusão de Curso aprovado por banca examinadora em
13 de Dezembro de 2010.
BANCA EXAMINADORA:
Dra. JEANNE CLAINE DE ALBUQUERQUE MODESTO (Orientadora) Centro Acadêmico de Vitória - UFPE Dr. CARLOS DANIEL PÉRES (1º Examinador) Centro Acadêmico de Vitória - UFPE Dra. ERIKA MARIA SILVA FREITAS (2º Examinadora) Centro Acadêmico de Vitória - UFPE
Vitória de Santo Antão
2010
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Dedico este trabalho aos meus exemplos de vida, a minha mãe Severina Gomes da Silva e a minha avó Irene Gomes Dias, a elas que são a minha razão e fonte inspiradora, agradeço por tanta confiança e apoio que dedicaram a mim, as que sempre me estimularam a dar este grande passo.
5
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar às mãos de quem me moldou, criou-me e orientou-me
durante meus passos até aqui: a Deus, que por graça, deu-me esta vida tão
bela. Por me amparar nos momentos difíceis, me dando força interior para
superar as dificuldades. Graças a ti hoje desfruto dessa valiosa conquista que
nada mais é do que a tua presença em minha vida, e junto com a minha Mãe
do Céu me protegeu nessa longa caminhada.
A minha orientadora e amiga Dr.ªJeanne Claine de Albuquerque
Modesto por acreditar em mim, me mostrando o caminho da ciência, fazendo
parte da minha vida nos momentos bons e ruins, por ser exemplo de
profissional e de mulher a qual sempre fará parte da minha vida. Obrigada por
ser esta profissional correta e competente fonte de inspiração, apoio e ensino
diário.
A minha família, a qual amo muito, pelo carinho, paciência e incentivo.
Que com muita sabedoria, discernimento, bom senso e dedicação estiveram ao
meu lado me encorajando nas horas difíceis e me aplaudindo nos momentos
de glória.
Aos meus amigos, pelos momentos que dividimos juntos, pelo carinho,
compreensão e apoio que me deram, sei que estão felizes por mais uma
conquista em minha vida. Em especial a turma 2007.1 do curso de Licenciatura
em Ciências Biológicas do CAV que tornaram pessoas inesquecíveis em minha
vida.
Aos professores do curso que tão sabiamente, transmitiram seus
conhecimentos, sendo exemplos de profissionais e de grande admiração.
À Coordenação do curso pela atenção e oportunidades oferecidas a nós
graduandos, durante esses quatro anos, nos proporcionando mais esta eletiva
para enriquecer ainda mais os nossos conhecimentos.
Aos funcionários do Centro Acadêmico de Vitória – CAV, pela
amabilidade e colaboração prestada sempre que solicitada.
6
À Universidade Federal de Pernambuco, Centro Acadêmico de vitória -
CAV, pela estrutura capaz de proporcionar a formação profissional e ser
Instituição de referência para várias áreas do conhecimento.
À banca examinadora pela disponibilidade de todos e para o
encaminhamento final do trabalho aqui proposto.
À FACEPE pelo auxílio financeiro.
A elaboração deste trabalho não teria sido possível sem a colaboração,
estímulo e empenho de diversas pessoas. Gostaria, por este fato, de expressar
toda a minha gratidão e apreço a todos aqueles que, direta ou indiretamente,
contribuíram para que esta tarefa se tornasse uma realidade. A todos quero
manifestar os meus sinceros AGRADECIMENTOS.
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“O ser humano vivencia a si mesmo, seus pensamentos como algo separado do resto do universo – numa espécie de ilusão de ótica de sua consciência. E essa ilusão é uma espécie de prisão que nos restringe a nossos desejos pessoais, conceitos e ao afeto por pessoas mais próximas. Nossa principal tarefa é a de nos livrarmos dessa prisão, ampliando o nosso círculo de compaixão, para que ele abranja todos os seres vivos e toda a natureza em sua beleza. Ninguém conseguirá alcançar completamente esse objetivo, mas lutar pela sua realização já é por si só parte de nossa liberação e o alicerce de nossa segurança interior” Albert Einstein
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RESUMO
Palythoa caribaeorum é um cnidário colonial muito abundante no litoral
pernambucano. Vulgarmente chamado de “Baba-de-boi”, essa espécie de
zoantídeo recebe esse nome em função da produção abundante de muco, que
hidrata seu tecido e evita que ressequem durante a maré baixa. Neste trabalho
foram exploradas possíveis alterações sazonais no conteúdo protéico e de
carboidratos de amostras de muco de P. caribaeorum coletadas em diferentes
meses na Praia de Porto de Galinhas, Pernambuco, Brasil. Além disso, foram
avaliadas uma possível variabilidade sazonal nas ações hemaglutinante e
coagulante destas amostras de muco. Amostras de muco foram coletadas
durante o inverno (julho/08 e agosto/08) e o verão (dezembro/08 e março/09),
durante a maré baixa, pela raspagem das colônias. As amostras foram
submetidas à centrifugações (1.000 g, por 30 minutos, 2X), seguidas pela
diálise dos sobrenadantes e de liofilização. As amostras foram então
submetidas a dosagens de carboidratos e proteínas pelos métodos de Fenol-
Ácido Sulfúrico e de Bradford, respectivamente. O perfil protéico das amostras
foi avaliado por SDS-PAGE 12% corada por Nitrato de Prata. As atividades
hemaglutinante e coagulante das amostras foram determinadas em hemácias
humanas glutarizadas dos tipos A, O e AB, e em plasma humano citratado,
respectivamente. Com relação ao conteúdo dos mucos, os resultados obtidos
demonstraram uma maior concentração protéica e de carboidratos no muco de
Março/09 e um perfil eletroforético bastante distinto também para as amostras
deste mês. No mês de Março/09 foi encontrado também o maior potencial
hemaglutinante sobre hemácias dos tipos A e O (Concentração Mínima
Hemaglutinante(CMH)=0,005 mg/ml) e ação sobre hemácias do tipo AB
(CMH=0,375mg/ml) não evidenciada em nenhuma outra amostra. Ao contrário
do esperado, nenhuma amostra foi capaz de induzir coagulação sanguinea.
Estes resultados indicam que a variabilidade na composição e nas ações
farmacológicas do muco de P. caribaeorum pode ser mensal e não apenas de
acordo com a estação do ano.
Palavras-chave: Palythoa caribaeorum, hemaglutinação, proteínas e carboidratos
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LISTA DAS FIGURAS
Figura 1. Foto do zoantídeo Palythoa caribaeorum da Praia de Porto de
Galinhas, litoral sul Pernambucano.................................................................. 20
Figura 2. Dosagens protéicas das amostras de muco de Palythoa caribaeorum
coletadas na praia de Porto de Galinhas nos meses de Julho/08, Agosto/08,
Dezembro/08 e Março/09................................................................................. 25
Figura 3. Dosagens de carboidratos das amostras de muco de Palythoa
caribaeorum coletadas na praia de Porto de Galinhas nos meses de Julho/08,
Agosto/08, Dezembro/08 e Março/09.............................................................. 25
.
Figura 4. Perfil eletroforético dos mucos de Palythoa caribaeorum. Eletroforese
processada em SDS-PAGE 12% e corada por Coomassie B. Blue............... 27
LISTA DAS TABELAS
Tabela 1. Concentrações Mínimas Hemaglutinantes das amostras de muco de
Palythoa caribaeorum coletadas na praia de Porto de Galinhas.......................28
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LISTA DE ABREVIATURAS
PTX Palitoxina
DRC Domínio Reconhecedor de Carboidratos
PRP Plasma Rico em Plaquetas
x g Unidade de Força Centrífuga Relativa
CMH Concentração Mínima Hemaglutinante
SDS Dodecil Sulfato de Sódio
PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
AgNO3 Nitrato de Prata
P. caribaeorum Palythoa caribaeorum
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SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO.............................................................................................12
2- OBJETIVOS DO PROJETO.........................................................................18
2.1- GERAL............................................................................................18
2.2- ESPECÍFICO...................................................................................18
3- METODOLOGIA............................................................................................19
3.1- ÁREA DE ESTUDO.........................................................................19
3.2- COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS........................19
3.3- DOSAGEM PROTÉICA DAS AMOSTRAS.....................................20
3.4- AVALIAÇÃO DO PERFIL PROTÉICO DAS AMOSTRAS POR
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE).........20
3.5- DOSAGENS DE CARBOIDRATOS DAS AMOSTRAS...................21
3.6- DETERMINAÇÃO DA AGLUTINAÇÃO DE HEMÁCEAS
HUMANAS..............................................................................................21
3.6.1- COLETA DE SANGUE E FIXAÇÃO DOS ERITRÓCITOS
EM GLUTARALDEÍDO................................................................21
3.6.2- ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE......................................22
3.7- ATIVIDADE COAGULANTE SOBRE O PLASMA HUMANO..........23
4-RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................24
4.1- DOSAGENS PROTÉICAS E DE CARBOIDRATOS.......................24
4.2- AVALIAÇÃO DO PERFIL PROTÉICO DAS AMOSTRAS POR
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)................26
4.3- ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE.....................................................27
4.4- ATIVIDADE COAGULANTE SOBRE O PLASMA HUMANO............29
5- CONCLUSÃO..............................................................................................30
6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................31
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1. INTRODUÇÃO
Cnidários são invertebrados aquáticos, coloniais ou solitários,
predominantemente marinhos e com poucas espécies de água doce. Seus
representantes incluem hidras, anêmonas-do-mar, corais pétreos, corais moles,
hidróides e águas-vivas (Ruppert et al., 2005).
Muitas espécies de cnidários adotam uma forma de crescimento
colonial, com as colônias consistindo em zoóides de pólipos, zoóides de
medusa, ou ambos. Estas espécies coloniais dominam vários dos principais
táxons, como corais, hidróides e sifonóforos (Ruppert et al., 2005). Os cnidários
apresentam duas formas corpóreas, a de pólipo e de medusa. Os pólipos se
assemelham a uma flor com o seu pedúnculo e são principalmente bentônicos,
sésseis e fixos. Já uma medusa tem a forma de um guarda-chuva e são
principalmente planctônicas e flutuam livremente (Ruppert et al. , 2005).
A parede do corpo de um cnidário é composta por três camadas de
tecidos a epiderme, gastroderme e mesogléia. Uma característica única e que
define os cnidários é a presença do cnidócito, encontrado tipicamente ao longo
da epiderme, porém, estão em densidades especialmente altas nos tentáculos,
sobre ou próximas à boca. Cnidócitos são células sensoriais e efetoras com o
papel central na captura de presas e na defesa. Cada cnidócito tem uma cnida,
uma cápsula membranosa preenchida por fluido que contém uma longa
invaginação tubular da parede da cápsula (Ruppert et al., 2005). E esta cnida
pode apresentar três formas: nemotocisto, espirocistos e pticocistos (Ruppert et
al., 2005). Os nematocistos armazenam proteínas tóxicas que podem ser
liberadas por estimulação direta (McClintock & Baker, 2001). Essa célula é
altamente especializada e localizada principalmente nos tentáculos, serve à
captura e paralisação de presas, proteção contra predadores e auxílio ao
assentamento de larvas ao substrato (McClintock & Baker, 2001).
Embora sejam variáveis em aparência, todos os cnidários possuem a
mesma estrutura básica e simples, como o corpo em forma de saco, com uma
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única abertura que funciona como boca e ânus, cavidade gastrovascular e
mesogléia (Ruppert et al., 2005).
Os cnidários conseguem seu alimento por várias vias como predação,
absorção direta de nutrientes dissolvidos ou através de simbiose com
microalgas (Sebens, 1987).
A diversidade de cnidários alcança seu zênite nos recifes de coral,
porém, os cnidários são difundidos e comuns mundialmente em mares rasos,
onde se prendem a objetos duros, escavam em sedimentos, ou vagueiam pelo
plâncton. Das aproximadamente 10.000 espécies conhecidas, apenas 20
ocorrem em água doce (Ruppert,et al., 2005).
O filo Cnidário abrange uma grande variedade de animais estritamente
aquáticos, sendo subdividido em cinco classes: Hydrozoa, Anthozoa
(organismos exclusivamente polipóides), Cubozoa e Scyphozoa (apresentando
as fases polipóide e medusóide, sendo esta última predominante) e Staurozoa
(recentemente proposta e representada por medusas bentônicas) (Marques e
Collins, 2004).
A classe Anthozoa está dividida nas subclasses Octocorallia (=
Alcyonaria) e Hexacorallia (= Zoantharia). Os Octocorallia possuem oito
tentáculos pinados e oito septos completos simples, uma sifonoglife ventral e
um endoesqueleto. Por outro lado, os pertencentes à subclasse Hexacorallia
são geralmente coloniais, possuem tentáculos simples de poucos a muitos
(nunca 8) e nunca ramificados, apresenta 2, 1 ou nenhuma sifonoglife e o
esqueleto, quando presente, é externo e não constituído por espículas (Ruppert
et al. , 2005).
Os Cnidários antozoários incluem organismos exclusivamente marinhos,
apresentam uma grande variedade de formas, tamanhos e cores, habitando
todos os mares do mundo, desde zonas costeiras até abissais. Os antozoários
criam e acentuam as paisagens marinhas dos recifes de coral, representando o
maior táxon dos cnidários, contendo mais de 6.000 espécies. Os antozoários
apresentam somente pólipos, sendo a fase da medusa ausente. Anthozoa é o
único táxon dentre os cnidários que tem todos os três tipos de cnida -
nematocistos, espirocistos e pticocistos (Ruppert et al., 2005).
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O gênero Palythoa pertence à família Zoanthidae, ordem Zoanthidea,
subclasse Hexacorallia (ou Zoantharia) e classe Anthozoa. Na espécie
Palythoa caribaeorum (Duchassaing & Michelotti, 1860) os pólipos estão
conectados por um espesso tecido chamado cenénquima, o qual também
agrega partículas em uma camada subepidérmica.
Vulgarmente chamado de “Baba-de-boi”, a espécie Palythoa
caribaeorum é muito comum no Brasil e recebe esse nome em função da
produção abundante de muco, que hidrata seu tecido e evita que resseque
durante a maré baixa. Apresenta ampla distribuição em toda costa Oeste do
Oceano Atlântico (Hetzel & Castro, 1994; Castro & Pires, 2001), habitando
ambientes normalmente rasos (Kemp et al., 2006) e revestindo rochas ou
formando grandes massas incrustantes. Palythoa caribaeorum é o mais
abundante zoantídeo do litoral Pernambucano, ocupando extensas regiões
sobre os recifes.
O gênero Palythoa ganhou grande repercussão mundial após a
descoberta da palitoxina em colônias de P. tuberculosa do litoral caribenho. A
palitoxina (PTX) é um composto letal, não protéico (Mr 2.681), de origem
bacteriana (Vibrio sp, Aeromonas sp, entre outras) e com forte potencial
citotóxico (Moore & Bartolini, 1981). O mecanismo de ação está relacionado ao
bloqueio da bomba Na+/K+-ATPase e formação de poros permeáveis a cátions
nas membranas plasmáticas, culminando com a lise celular (Frelin & Van
Renterghem, 1995). Todos os efeitos da PTX (contrações de músculos lisos,
constrições de vasos sangüíneos, despolarização celular, etc), incluindo a
letalidade, podem ser explicados por meio do efluxo de K+ e influxo de Na+
induzidos por essa toxina. Além disso, a palitoxina apresenta um forte potencial
carcinogênico (Fujiki et al., 1983; Wattenberg, 2007).
A palitoxina pode ser encontrada, principalmente, em algumas espécies
dos gêneros Palythoa, Protopalythoa e Zoanthus (Moore & Scheuer, 1971;
Gleibs et al., 1995; Gleibs & Mebs 1999) bem como em alguns dinoflagelados
(Ukena et al., 2001). Muitos animais marinhos em estreita associação com
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colônias de zoantídeos podem conter altas concentrações de palitoxina e obter
uma notável tolerância (Mebs 1998; Gleibs & Mebs 1999). Isso permite elevada
acumulação e seqüestro de palitoxina nas cadeias alimentares marinhas,
podendo causar, eventualmente, uma intoxicação humana após a ingestão de
frutos do mar, como crustáceos e peixes (Okano et al., 1998; Taniyama et al.,
2002; Aligizaki et al., 2008).
Os zoantídeos também são fontes de diferentes carboidratos e
proteínas, incluindo lectinas. Lectinas são proteínas que reconhecem e se
associam de forma reversível, com alta afinidade e especificidade, a
carboidratos sem, contudo, apresentarem atividade enzimática. As lectinas
podem induzir aglutinação de várias células, ligando-se a glicoconjugados na
superfície celular (Peumans & Van Damme, 1995; Gabius et al. , 2002; Loris,
2002). Os animais produzem uma variedade de lectinas, muitos das quais têm
sido implicadas nos fenômenos de reconhecimento celular. Elas constituem
moléculas naturais ubíquas, que interagem com os açúcares através de uma
região denominada domínio reconhecedor de carboidratos (DRC), que é
altamente conservada em cada tipo de lectina (Nl. et al., 1996). Muitas lectinas
pertencem a grupos distintos de proteínas, estas por sua vez, podem
apresentar semelhanças nas suas seqüências e características estruturais.
Embora tenha sido inicialmente detectadas em vegetais superiores, as
lectinas são encontradas em muitos outros organismos, desde vírus e bactérias
até animais invertebrados e vertebrados (Lis & Sharon, 1998; Loris, 2002). O
reconhecimento de carboidratos ocorre nos mais variados contextos biológicos
e por isso as lectinas consistem em um grupo de proteìnas altamente diversas
formada por um grande número de famílias.
Na ausência de imunoglobulinas, mediadoras da imunidade adquirida,
as lectinas presentes em tecidos de organismos invertebrados agem de
maneira semelhante aos anticorpos, fornecendo a primeira linha de defesa,
podendo desencadear um importante mecanismo efetor na eliminação
potencial de patógenos (Bayne et al., 1985; Kilpatrick, 2002).
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Devido ao fato das lectinas terem a habilidade de ligar-se a carboidratos
e promover a aglutinação de diferentes células, é razoável assumir que essas
moléculas possuem um considerável papel nas reações de reconhecimento do
não-próprio nos invertebrados. Assim como as imunoglobulinas dos
vertebrados, as lectinas dos invertebrados podem aglutinar microorganismos e
favorecer sua fagocitose, por mediar a ligação entre a superfície do hemócito e
o corpo estranho. Existem três diferentes rotas para o reconhecimento de
partículas estranhas, nas quais as lectinas podem interagir: a primeira é
através da interação da lectina da membrana dos invertebrados com o
carboidrato de membrana do microrganismo; a segunda ocorre pela ligação
entre a lectina da membrana do patógeno e o açúcar presente na membrana
das células dos invertebrados; e a terceira rota, ocorre através da ligação de
lectinas humorais com glicoconjugados presentes nos microrganismos,
formando um complexo que se une ao receptor de opsonina da célula de
defesa dos invertebrado( Renwrantz, 1983).
A associação entre corais e dinoflagelados unicelulares é predominante
no ambiente marinho e forma a base trófica e estrutural dos recifes de corais. A
interação lectina/glicano tem sido apontada como um mecanismo de
sinalização durante o início da simbiose entre cnidários e algas (Meints &
Pardy, 1980) e mais recentemente em antozoários (Jimbo, 2000; Lin et al.,
2000).
A presença de moléculas bioativas nos diferentes tipos de organismos
marinhos sofre forte flutuação tanto regional quanto sazonal. Sabe-se que
quanto mais preservado um ambiente, maior a biodiversidade ali encontrada,
tendo como consequência um aumento da competição por espaço entre os
organismos recifais. Neste processo podem ocorrer alterações na produção de
moléculas bioativas e toxicidade das mesmas. A variabilidade no conteúdo das
moléculas bioativas pode ocorrer também de acordo com as condições
ambientais, como variações climáticas, níveis de poluentes na água, radiação
ultravioleta, etc. Além disso, a produção de moléculas bioativas por parte dos
zoantídeos pode sofrer alterações durante a sua fase reprodutiva,
17
provavelmente como uma forma de proteção, como sugeriram Kimura et al.
(1972).
Em estudos realizados nos últimos anos pelo nosso grupo ECOTONE,
com as amostras de mucos normais e branqueados de P. caribaeorum,
coletados durante o verão, nas praias de Suape e Guadalupe localizados em
Pernambuco, mostraram a presença de proteínas e de carboidratos e ação
aglutinante de hemácias humanas do tipo A, B e O em todas as amostras
testadas. Além disso, foi observada uma ação coagulante tardia nas amostras
coletadas em Suape.
Dando continuidade ao estudo do muco da espécie Palythoa
caribaeorum, neste trabalho foram avaliadas variações sazonais no conteúdo
protéico e de carboidratos do muco de P. caribaeorum, bem como nas
atividades hemaglutinante e pró-coagulante sanguínea. A avaliação das
alterações sazonais realizadas neste trabalho foi de suma importância para dar
andamento aos projetos futuros de purificação de proteínas biologicamente
ativas, incluindo lectinas, do muco de P. caribaeorum.
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2. OBJETIVOS
2.1 GERAL
Avaliar as possíveis alterações de conteúdo protéico, de carboidratos e
de algumas atividades farmacológicas do muco coletado do zoantídeo P.
caribaeorum.
2.2. ESPECÍFICOS
1) Avaliar possíveis variações sazonais nas concentrações de proteínas e
carboidratos dos mucos analisados;
2) Realizar eletroforeses com as amostras coletadas e determinar possíveis
alterações sazonais no perfil protéico dos mucos;
3) Avaliar possíveis variações sazonais na ação aglutinante de hemácias
humanas das amostras e correlacionar os resultados com a presença de
lectinas no muco;
4) Avaliar a existência de uma ação coagulante sazonal dos mucos sobre o
plasma sanguíneo humano.
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3. METODOLOGIA
3.1. Área de Estudo
A praia de Porto de Galinhas localiza-se no litoral do Nordeste brasileiro,
a 70 quilômetros ao Sul de Recife-PE, no município de Ipojuca. O município de
Ipojuca está localizado ao sul da cidade do Recife e a sede dista 52 km da
capital. Limita-se ao norte com o município do Cabo de Santo Agostinho, ao sul
com o município de Sirinhaém, a leste com o Oceano Atlântico e a oeste com o
município de Escada, possuindo uma área de 507 km².
3.2. Coletas e Processamento das Amostras
Amostras de muco de P. caribaeorum foram coletadas nos meses de
inverno (Julho/08 e Agosto/08) e de verão (Dezembro/08 e Março/09) na praia
de Porto de Galinhas, durante a maré baixa, pela raspagem das colônias com o
auxílio de luvas. O muco coletado foi acondicionado em tubos plásticos e
transportado em gelo até o laboratório, onde as amostras foram submetidas à
forte agitação mecânica, seguida de duas centrifugações a 1.000 g, por 30
minutos. Para os testes, o sobrenadante obtido foi dialisado contra água
destilada (limite de exclusão da membrana de ~ 12000 Da) durante 24h. As
amostras foram, posteriormente, liofilizadas e mantidas a -20º C até o momento
do uso.
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Figura 1. Foto do zoantídeo Palythoa caribaeorum da Praia de Porto de Galinhas,
litoral sul pernambucano. Colônias expostas durante a maré baixa.
3.3. Dosagem Protéica das Amostras de Muco
A dosagem protéica das amostras foi avaliada segundo o método de
Bradford (1976), utilizando o reagente de Bradford (SIGMA ALDRICH). Para tal
teste, o muco liofilizado foi diluído em uma solução salina a uma concentração
de 1mg/ml. O teste foi realizado misturando-se 50µl de amostra com 1,5 ml do
reagente de Bradford. Após incubação por 50 minutos, as amostras foram lidas
a 590 nm. As concentrações protéicas das amostras foram estimadas através
de uma curva padrão de albumina de soro bovino (0,125 a 1mg/ml).
3.4. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida das Amostras de Muco
Para comparação do perfil protéico das amostras mensais de Porto de
Galinhas, as mesmas foram submetidas à eletroforese por SDS-PAGE 12%
(Laemmli, 1970), na presença e ausência de β-mercaptoetanol, A eletroforese
foi então processada a 20 mA por aproximadamente 2 horas e, em seguida e
os géis foram corados por Nitrato de Prata (AgNO3) como descrito a seguir.
Inicialmente, o gel foi mergulhado em uma solução fixadora contendo ácido
acético 10% e etanol 40% por 1 hora. Em seguida, o gel foi submetido a duas
lavagens com etanol 30%, por 20 minutos cada, e uma lavagem em água
destilada por 20 minutos. O gel foi então incubado por 1 minuto, no escuro,
21
com solução de Tiossulfato de sódio100%, sendo posteriormente lavados 3
vezes com água destilada, por 20 segundos cada. Para a coloração, o gel foi
incubado por 20 minutos com uma solução de Nitrato de Prata 99,98%
contendo Formol 0,02%. Após três lavagens com água destilada, o gel foi
revelado pela incubação, por aproximadamente 3 minutos, com uma solução
de Carbonato de sódio 90%, Tiossulfato de sódio 9,9% e Formol 0,08%. Após o
aparecimento das bandas protéicas, o gel foi rapidamente lavado com água
destilada, seguida de uma lavagem em solução de Glicina 100% por 5 minutos.
3.5. Dosagem de Carboidratos das Amostras de Muco
A dosagem de carboidratos das amostras foi realizada pelo método de
Fenol-Ácido Sulfúrico (Dubois, 1956). As amostras de muco liofilizado foram
diluídas em solução salina a uma concentração de 1mg/ml. Para os testes,
100µl de amostra foram misturados a 400µl de fenol (5%) e 2 ml de ácido
sulfúrico. Após 1 min de incubação, as absorbâncias a 490 nm foram
determinadas. O cálculo das concentrações foi realizado com base numa curva
padrão de D-Glucose (0,2 a 1,0 mg/ml).
3.6. Determinação da Aglutinação de Hemácias Humanas pelas
Amostras de Muco
3.6.1. Coleta de Sangue e Fixação das Hemácias em Glutaraldeído
As amostras de sangue humano dos tipos A, O e AB foram coletadas na
proporção de um volume de sangue para 1,6 volumes de solução de Alsever:
2,95 g de dextrose,1,2 g de citrato de sódio, 0,42 g de cloreto de sódio, 0,055 g
de ácido cítrico e água destilada para um volume final de 100 ml (Bukantz et
al., 1963). Para fixação das hemácias em glutaraldeído (Bing et al., 1967), o
22
sangue coletado em solução de Alsever foi centrifugado (1.300 x g, 15 min) e
os eritrócitos ressuspensos em NaCl 0,15 M. Três lavagens com NaCl 0,15 M
foram efetuadas. Uma incubação (4ºC, 30 min, com agitação branda a
intervalos de 5 min) das hemácias (1,5% v/v) foi feita em glutaraldeído 1% (v/v)
diluído em uma solução contendo um volume de tampão fosfato de sódio 0,15
M, pH 8,2, nove volumes de NaCl 0,15 M e cinco volumes de água. Em
seguida, uma nova centrifugação a 1.300 x g, por 10 min, foi realizada. As
hemácias “glutarizadas” foram ressuspensos a 2,5% (v/v), em NaCl 0,15 M e
armazenado a 4º C por até 3 meses.
3.6.2. Atividade Hemaglutinante dos Mucos
A atividade hemaglutinante foi realizada em microplacas de 96 poços,
utilizando hemácias humanas dos tipos A, O e AB de doadores normais,
tratadas com glutaraldeído como descrito no item 3.6.1.
Inicialmente, as quatro amostras de muco foram pesadas e diluídas para
uma concentração protéica de 6mg/ml. Para os testes, foram pipetadas 50 µl
de NaCl 0,15 M nos 18 primeiros poços da microplaca. Em seguida, foram
adicionados ao 2o poço 50 µl de amostra (300 µg de proteínas), sendo então
realizada uma diluição seriada (proporção de 1:2) até o 18o poço. No 1o poço
foram adicionados 50 µl de NaCl 0,15 M (controle negativo). Por fim, foram
adicionados em todos os poços 50 µl da solução de hemácias 2% e a placa
incubada por 1h, a temperatura ambiente, em superfície plana. Neste teste, o
resultado positivo é caracterizado pela formação de um véu de hemácias,
contrastando com o resultado negativo onde se evidencia a formação de botão
compacto no fundo da placa.
23
A Concentração Mínima Hemaglutinante (CMH) foi determinada como a
mínina concentração protéica capaz de permitir a visualização do véu de
hemácias.
3.7. Ação dos Mucos sobre a Coagulação do Plasma Humano
Para os testes de coagulação, amostras de sangue foram coletadas de
doadores normais que não haviam feito uso de antiflamatórios ou analgésicos
pelo menos 3 dias antes da coleta. Imediatamente após a coleta, o sangue foi
misturado a citrato de sódio (3,8%), na proporção de 1 ml do anticoagulante
para 9 ml de sangue, e em seguida centrifugado a 100 x g por 20 minutos. O
sobrenadante, correspondendo ao Plasma Rico em Plaquetas (PRP) foi
utilizado nos testes de coagulação.
A atividade coagulante foi realizada em microplacas de 96 poços.
Inicialmente, foram pipetados nos 12 primeiros poços 50 µl de NaCl 0,15 M, em
seguida, foram adicionados ao 2o poço 50µl de muco (300 µg de proteina),
quando então foi realizada uma diluição seriada, na proporção de 1:2, até o 12o
poço. No 1o poço foram adicionados 50 µl de NaCl 0,15 M (controle negativo).
Posteriormente, foram adicionados a todos os poços 50 µl do PRP e a placa
incubada a temperatura ambiente por 1h em superfície plana. Todos os testes
foram realizados em triplicata. O resultado é considerado positivo pela
visualização de um coágulo no poço.
24
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1. Dosagens de Proteínas e de Carboidratos
As dosagens protéicas e de carboidratos das amostras de mucos
coletadas em Porto de Galinhas nos meses de inverno (Julho/08 e Agosto/08)
e verão (Dezembro/08 e Março/09) podem ser observadas nas figuras 2 e 3,
respectivamente.
De acordo com os resultados, para os meses de Julho/08, Agosto/08 e
Dezembro/08 não houve mudança significativa na quantidade de proteínas
(0,569mg/ml ± 0,012, 0,536mg/ml ± 0,017 e 0,593mg/ml ± 0,029
respectivamente) e de carboidratos das amostras (16,771mg/ml ± 0,766,
19,380mg/ml ± 1,572 e 19,252mg/ml ± 1,225, respectivamente). Por outro lado,
um importante aumento em ambas as dosagens pode ser observado na
amostra de Março/09 (0,716mg/ml ± 0,040 e 35,295mg/ml ± 3,355, dosagens
protéicas e de carboidratos respectivamente). Este aumento bastante
significativo nos conteúdos protéico e, sobretudo, de carboidratos não parece
estar relacionado simplesmente à estação da coleta, já que a amostra de
Dezembro/08 também representa o período de verão. O que nos leva a sugerir
que as variações nas concentrações protéicas e de carboidratos entre os
mucos de P. caribaeorum podem sofrer flutuações mensais, e não apenas
sazonais.
A variação ocorrida no mês de Março/09 das dosagens protéicas e de
carboidratos pode ter sido influenciada por fatores abióticos, uma vez que este
mês apresentou um aumento no aquecimento das águas ao longo de todo o
Pacífico Equatorial.
25
Figura 2. Dosagens protéicas das amostras de muco do Palythoa caribaeorum.
Coletados na praia de Porto de Galinhas nos meses de Julho/08, Agosto/08, Dezembro/08 e
Março/09. As dosagens protéicas foram calculadas a partir da fórmula y= 0,77x + 0,0852,
R²=0,09968, obtida a partir de uma curva padrão de albumina de soro bovino (0,125 a 1mg/ml).
Os valores no gráfico expressam a MEDIA±DESVIO PADRÃO das amostras.
Figura 3. Dosagens de carboidratos das amostras de muco do Palythoa
caribaeorum. Coletados na praia de Porto de Galinhas nos meses de Julho/08, Agosto/08,
Dezembro/08 e Março/09. As dosagens de carboidratos foram calculadas a partir da fórmula
y= 0,0146x - 0,0587, R²=0,09968, obtida a partir de uma curva padrão de D-Glucose (0,2 a 1,0
mg/ml). Os valores no gráfico expressam a MEDIA±DESVIO PADRÃO das amostras.
26
4.2 Perfil Eletroforético das Proteínas dos Mucos
Diversas corridas eletroforéticas foram realizadas com as amostras de
muco coletadas em Porto de Galinhas. Em muitas corridas, o grande conteúdo
de carboidratos e a alta viscosidade das amostras prejudicaram a entrada das
proteínas no gel e/ou a coloração das bandas protéicas. A figura 4 mostra o
perfil protéico das quatro amostras de muco, na presença e ausência de agente
redutor.
Os perfis eletroforéticos das amostras de Julho/08, Agosto/08 e
Dezembro/08 foram bastante similares. Na ausência de agente redutor, estas
amostras apresentaram uma banda protéica majoritária de aproximadamente
20 KDa. Esta banda pode ser evidenciada também nas amostras tratadas com
o agente redutor, indicando tratar-se de uma proteína monomérica.
As amostras dos meses de Agosto/08 e Dezembro/08 apresentaram
além das bandas majoritárias, outras bandas protéicas de tamanhos diferentes,
na ausência e presença do agente redutor. A presença dessas bandas
demonstra a existência de mais proteínas presentes no muco. Os meses de
Agosto/08 e Dezembro/08 apresentaram bandas protéicas que variaram entre
tamanhos menores que 20 KDa à 97 KDa.
A alta concentração de carboidratos no muco de Março/09 impediu uma
corrida eletroforética satisfatória para esta amostra, além de interferir na
coloração das proteínas tanto por AgNO3 quanto por Coomassie briliant blue R-
250 (dados não mostrados). Desta forma, não foi possível avaliar a diversidade
protéica desta amostra, nem compará-la com os demais mucos.
27
kDa
97
66
45
30
20
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Figura 4. Perfil eletroforético dos mucos de P.caribaeorum. A eletroforese foi
processada em SDS-PAGE 12 %, a 20 mA por aproximadamente 2 horas. Após a corrida, os
géis foram corados por AgNO3. Poço 1- Padrão de peso molecular; Poços 2, 3, 4 e 5-
Amostras dos meses de Julho/08, Agosto/08, Dezembro/08 e Março/09 na ausência de β-
mercaptoetanol, respectivamente. Poços 6, 7, 8 e 9- Amostras dos meses de Julho/08,
Agosto/08, Dezembro/08 e Março/09 na presença de β-mercaptoetanol, respectivamente.
4.3. Atividade Hemaglutinante dos Mucos
As amostras dos mucos coletados em Porto de Galinhas nos meses de
Agosto/08, Dezembro/08 e Março/09 foram capazes de induzir a aglutinação de
hemácias humanas do tipo O e A. As concentrações Mínimas Hemaglutinantes
(CMH) das amostras para os diferentes tipos sanguíneos são apresentadas na
tabela 1.
28
Sangue O Sangue A Sangue AB
Julho/08 ____ ____ ____
Agosto/08 0,75 mg/mL 0,75 mg/mL ____
Dezembro/08 0,375 mg/mL 0,187 mg/mL ____
Março/09 0,005 mg/ml 0,005 mg/mL 0,375 mg/mL
Tabela 1. Concentrações Mínimas Hemaglutinantas das amostras de muco de Palythoa
caribaeorum coletadas na praia de Porto de Galinhas. Testes realizados em hemácias
humanas glutarizadas dos tipos O, A e AB.
Por outro lado, a amostra de Julho/08 não apresentou atividade
hemaglutinante sobre nenhum dos tipos sanguíneos testados. Uma análise
visual da amostra revelou falhas no processo de liofilização, que pode ter
ocasionado a perda da atividade de suas proteínas.
Comparando-se as CMH das demais amostras, pode-se observar uma
potente atividade hemaglutinante no muco de Março/09, sendo esta amostra a
única capaz de aglutinar as hemácias do grupo AB. Por outro lado, Agosto/08
mostrou a menor capacidade hemaglutinante (Tabela 1).
A presença de atividade hemaglutinante nas amostras testadas sugere a
presença de lectinas nos mucos. Segundo Sharon e Halina (2001), as lectinas
contêm sítios que se ligam a carboidratos presentes na superfície de hemácias,
resultando na ligação cruzada das células e sua precipitação, o que caracteriza
a hemaglutinação. De acordo com relatos recentes, esta classe protéica está
presente em antozoários e tem importante papel no reconhecimento e na
simbiose com dinoflagelados (Jimbo et al., 2005; Wood-Charlson et al., 2006).
É importante ressaltar que a amostra de Março/09, além de uma potente
ação hemaglutinante, apresentou concentração protéica mais elevada quando
comparada as demais amostras. Conjuntamente, estes dados sugerem uma
maior concentração de lectinas e/ou a presença de lectinas mais potentes na
amostra de Março/09.
29
Landstein e Raubischek, em 1908, foram os primeiros a trabalharem a
especificidade de lectinas. Eles observaram que vários extratos de lectinas
promoviam diferentes propriedades hemaglutinantes quando ensaiados com
eritrócitos de diferentes animais. Alguns desses extratos aglutinavam
fracamente ou mesmo não aglutinavam eritrócitos humanos (Kennedy & cols.,
1995). A atividade ligante das lectinas com especificidade pelos diferentes tipos
sanguíneos pode ser fortemente inibida pelos monossacarídeos determinantes
dos respectivos grupos sanguíneos; como por exemplo, 2-N-
acetilgalactosamina e L-fucose que inibem as lectinas específicas por
eritrócitos do tipo A e O, respectivamente.
4.4. Atividade coagulante sobre o Plasma Humano
Nosso resultado sobre uma possível ação coagulante presente nas
amostras de Julho/08, Agosto/08, Dezembro/08 e Março/09 mostrou que
nenhuma delas é capaz de induzir a formação de coágulo no plasma humano
citratado, mesmo após uma incubação de 1h. De fato, até o momento não há
descrição na literatura da presença de moléculas pró-coagulantes em
antozoários. Além disso, não foram encontradas relatos de lectinas com ação
pró-coagulantes.
Entretanto, em trabalho anterior do nosso grupo (dados não publicados),
havia sido evidenciada ação coagulante tardia, após 1h de incubação, em uma
amostra pontual coletada na praia de Suape, também no litoral sul
pernambucano. Isto pode sugerir que a presença de diferentes classes de
moléculas no muco de P. caribaaeorum pode sofrer influência não só sazonal,
mas também geográfica.
30
5. CONCLUSÕES Com o presente estudo pudemos observar que:
1) O muco do zoantídeo Palythoa caribaeorum coletado em Porto de Galinhas
no mês de Março/09 apresentou um aumento significativo tanto na sua
concentração protéica quanto na de carboidratos quando comparado com os
mucos coletados nos meses de Julho/08, Agosto/08 e Dezembro/08.
2) As amostras dos meses de Agosto/08, Dezembro/08 e Março/09
apresentaram atividade hemaglutinante para os sangues dos tipos O e A. Por
outro lado, apenas a amostra de Março/09 foi capaz de aglutinar hemácias do
tipo AB. A presença de atividade hemaglutinante nas amostras sugere a
presença de lectinas no muco produzido pelo zoantídeo Palythoa caribaeorum.
3) Os mucos de Palythoa caribaeorum coletados nos meses de Julho/08,
Agosto/08, Dezembro/08 e Março/09 não foram capazes de induzir coagulação
em plasma humano, mesmo após uma incubação prolongada. Estes resultados
sugerem a ausência de moléculas pró-coagulantes nas amostras testadas.
4) Conjuntamente, os nossos resultados mostram que o conteúdo e as ações
farmacológicas do muco de Palythoa caribaeorum sofrem variações mensais,
não estando apenas relacionadas a estação do ano (inverno ou verão). Os
resultados apresentados neste trabalho serão de grande importância para
darmos andamento ao processo de purificação e caracterização das proteínas
presentes no muco de Palythoa caribaeorum, orientando-nos nas novas
coletas.
31
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BAYNE C., BOSWELL C.A.,LOKER E. S., YUI M. A. Plasma Components
Which Mediate Cellular Defenses en the Gastropod Mollusk Biomphalaria-
Glabrata. Developmental and Comparative Immunology. V.9, n.3, p. 523-
530, 1985.
BECERRO M. A., TURON X., URIZ M. J. Multiple Functions for Secondary
Metabolites in encrusting marine invertebrates. Journal of Chemical Ecology.
V.23, n.6, p. 1527-1547,1997.
FRELIN, C., VAN RENTERGHEM, C. Palytoxin. Recent electrophysiological
and pharmacological evidence for several mechanisms of action. Gen.
Pharmacol., 26:33-37, 1995.
FUJIKI H, SUGANUMA M, TAHIRA T, YOSHIOKA A, NAKAYASU M, ENDO Y,
SHUDO K, TAKAYAMA S, MOORE RE, SUGIMURA T. Nakahara memorial
lecture. New classes of tumor promoters: teleocidin, aplysiatoxin, and
palytoxin. Princess Takamatsu Symp., 14:37–45, 1983.
GLEIBS S. & MEBS D., Distribution and Sequestration of Palytoxin in Coral
Reef Animals. Toxicon, 37, 1521-1527 (1999).
GABIUS, H. J.; ANDRE, S.; KALTNER, H.; SIEBERT, H. C. The Sugar Code:
Functional Lectinomics. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects, v.
1572, n. 2-3, p. 165-177,2002.
KENNEDY J. F., PALVA P.M.G., CORELLA M. T. S., CAVALCANTI M. S. M. &
COELHO L. C. B. B. (1995) Lectins, versatile proteins of recognition: a
review. Carbohydrate Polymers 26, 219-230.
32
KIMURA, S.; HASHIMOTO, Y.; YAMAZATO, K. Toxicity of the zoanthid
Palythoa tuberculosa. Toxicon, v.10, p.611-617, 1972.
KILPATRICK, D. C. Animal Lectins: A Historical Introduction and Overview.
Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects, v.1572, n.2-3, p.187-197,
2002.
LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature, 227:680-685, 1970.
LORIS R., Principles of Structures of Animal and plnt lectins. Biochimica Et
Biophysica Acta-General Subjects, v. 1572, n. 2-3, p. 198-208, 2002.
LIS, H.; SHARON, N. Lectins in Higher Plants. The Biochemistry of Plants, v.6,
p. 371-441, 1981.
MOORE, R.E., BARTOLINI G. Structure of palytoxin. J Am Chem Soc:
103:2491–94, 1981.
MOURA, R. M., QUEIROZ, A. F. S., FOOK, J. M.S.L.L., DIAS, A. S. F.,
MONTEIRO, N. K. V., RIBEIRO, J. K. C., MOURA, G. E. D. D., MACEDO, L.
L. P., SANTOS, E. A., SALES M. P. CvL, a lectin from the marine sponge
Cliona varians: Isolation, characterization and its effects on pathogenic
bacteria and Leishmania promastigotes. Comparative Biochemistry and
Physiology, Part A 145 (2006) 517–523.
MATSUBARA H., NAKAMURA- TSUTUTA S., HIRABAYASHI J., JIMBO M.,
KAMIYA H., OGAMA T., MURAMOTO K.. Diverse Sugar-Binding
Specificities of Marine Invertebrate C-Type Lectins. Bioci. Bitechnol.
Biochem., 71(2) 513-519,2007.
MARQUES A. C., COLLINS A. G., Cladistic analysis of Medusozoa and Cnidarian evolution. Invertebrate Biol, v. 43, pag. 9-16, 2004.
33
MCCLINTOCK, J. B. , BAKER, B. J., 2001. In: Marine chemical ecology. CRC
Press. New York. 610p.
MOORE R. E. & SCHEUDER P. J., Palytoxin: a new marine toxin from a
coelenterate. Science, 172, 495-498 (1971).
NL Y., TIZARD L. Lectin-carbohydrate interaction in the immune system.
Veterinary Immunology and Immunopathology, v.55, n. 1-3, p.205-223,1996.
PENEUMANS W. J., VAN DAMME E. J. M. Plant Lectins: Specific Tools for the
Identification, Isolation, and Characterization of O-linked Glycans. Cristical
Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, v.33, n.3, p.209-258,1998.
RUPPERT, EDWARD E.; FOX, RICRAD S.; BARNES, ROBERT D. Zoologoa
dos invertebrados: Uma abordagem funcional evolutiva. 7 ed. São Paulo:
Roca, 2005.
RUPPERT, E. E. & BARNES, R. D. 1994. In: Invertebrate Zoology. Saunders
College Publishing, 6a edition, New York, 1056pp.
RENWRANTZ, L. Involvament of Agglutinins (Lectins) in Invertebrate Defense
Reactions- The Immuno- Biological Importance of Carbohydrate-Specific
Binding-Molecules. Developmental and Comparative Immunology, v.7, n.4,
p.603-608, 1983.
SOARES, C.L.S, PÉREZ, C.D., MAIA, M.B.S. SILVA, R.S., MELO, L.F.A.
Avaliação da atividade antiinflamatória e analgésica do extrato bruto
hidroalcoólico do zoantídeo Palythoa caribaeorum (Duchassaing &
Michelotti, 1860). Revista Brasileira de Farmacognosia, 16 (4): 463-468,
2006.
34
SEEMANN P, GERNERT C, SCHMITT S, MEBS D, HENTSCHEL U. Detection
of hemolytic bacteria from Palythoa caribaeorum (Cnidaria, Zoantharia) using
a novel palytoxin-screening assay. 2009 Nov;96(4):405-11. Epub 2009 Jun 6.
SILVA C. M., CORRÊA D. A., SANTOS D. C., MARCOS A. C. F., CELESTE
MARIA PATTO DE ABREU P. M. C. Extraction of the Lectin of Cassava
Leaves(Manihot esculenta Crantz) and the Effect of Divalent Cations on the
Hemagglutinating Activity. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 30(Supl.1):
103-107, maio 2010.
SEBENS, K. P. The ecology of indeterminate growth in animals. Annu Rev Ecol
Syst., v. 18, p. 371–407, 1987.
UKENA T., SATAKE M., USAMI M., OSHIMA Y., NAOKI H., FUJITA T., KAN
Y., YASUMOTO T. Structure Elucidation of Ostreocin D, a Palytoxin Analog
Isolated from the Dinoflagellate Ostreopsis siamensis. Biosci. Biotechnol.
Biochem, 65(11), 2585-2588, 2001
WATTENBERG, E.V. Palytoxin: exploiting a novel skin tumor promoter to
explore signal transduction and carcinogenesis. Am. J. Physiol. Cell Physiol.,
292(1):C24-32, 2007.
.