POTENCIAL ANTIOXIDANTE DA N-ACETIL-L-CISTEÍNA SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO NA ESQUISTOSSOMOSE EXPERIMENTAL

CRÔNICA

Renan Andrade Fernandes de Souza ; André de Lima Aires2

1Estudante do Curso de Biomedicina- CCB – UFPE; E-mail: renan.andrade.fernandes@hotmail.com, 2Docente/pesquisador do Depto de Medicina Tropical – CCS – UFPE. E-mail: andrelima26@gmail.com.

Sumário: A esquistossomose mansoni é uma helmintíase acarretada pelo Schistosoma mansoni, típica de regiões tropicais e subtropicais e que pode levar ao óbito. O tratamento realizado pelo fármaco praziquantel não garante prevenção de infecções futuras, nem a redução da inflamação causada pelos ovos do verme. As reações inflamatórias acarretam na liberação de radiais livres, que devem ser neutralizados pelos mecanismos naturais de homeostase orgânica. Porém quando essa carga de radicais livres é maior do que a capacidade de neutralização do organismo, o indivíduo entra num estado denominado estresse oxidativo. Estudos indicam a N-acetil-L-cisteína (NAC) como um agente direto ou indireto antioxidante, devido a seu grupamento sulfidrila, que vai interagir com esses radicais, neutralizando-os. A NAC apresentou capacidade suficiente para a redução notável desses radicais livres, refletindo na diminuição direta dos marcadores orgânicos dessa condição oxidativa, podendo ser considerada como uma droga eficaz e segura.Palavras–chave: Esquistossomose; NAC; Estresse; Oxidativo

INTRODUÇÃO A esquistossomose é uma helmintíase crônica, causada pelo platelminto Schistosoma mansoni. A infecção é prevalente em países tropical e subtropical, sobretudo na África e América do Sul. Estima-se que uma a cada trinta pessoas, no mundo, seja portadora de esquistossomose, que mais de 700 milhões indivíduos estão em risco constante de infecção e que cerca de 500 mil infectados evolem ao óbito todos os anos. Atualmente, o tratamento é realizado com Praziquantel (PZQ), que apresenta alta eficácia contra vermes adultos e baixos efeitos colaterais, no entanto não modula sobre as lesões granulomatosas já instaladas que podem causar sequelas irreversíveis. O principal elemento patogênico da infecção são os ovos arrastados via correte sanguínea e depositados no fígado, principal sitio das alterações patológicas. Ao redor dos ovos inicia-se a formação inflamatória granulomatosa, culminando em uma cicatriz fibrótica, que pode leva a uma cirrose irreversível, impedindo que o fígado exerça suas funções biológicas.A inflamação causada pela esquistossomose possui um grau elevado de comprometimento do tecido, devido à liberação de espécies reativas de oxigênio, causando um estresse oxidativo. O organismo possui um sistema complexo natural para combate desse estresse, através da inativação dessas espécies reativas de oxigênio, dentre as quais podemos citar as enzimas desintoxicantes (superóxido dismutase, catalase, e peroxidases), além do mecanismo natural de reparo do DNA contra o ataque desses radicais. O problema se agrava quando a situação está fora do controle destes mecanismos, por exemplo, quando esses radicais livres estão além da capacidade de defesa natural orgânica.O estado patológico do indivíduo é agravado quando os níveis de Glutationa estão reduzidos, pois esta tem papel fundamental no metabolismo de xenobióticos, realizando uma espécie de neutralização dos radicais de oxigênio produzidos nos locais da inflamação. A prevenção do estresse oxidativo causado pela doença, inclui o aumento dos níveis plasmáticos desta glutationa, ou a indução de sua produção pelo organismo. A glutationa possui como precursor comum a N-acetil-L-cisteína (NAC), um composto que possui atividade antioxidante e

citoprotetora. Sua molécula contém grupos sulfidrilo livres, de modo que pode reagir diretamente com os radicais livres (Cuzzocrea et al., 2000).

MATERIAIS E MÉTODOS

Após aprovação pela comissão de Ética em Experimentação Animal do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco (CEEA/UFPE) (processo numero 23076.021878/2008-66), camundongos (n=48), fêmea Swiss webster, com 30 dias de idade, pesando 28±2 g, foram obtidos e mantidos no biotério do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami - LIKA da UFPE. Para a infecção dos camundongos utilizamos a cepa de S. mansoni, Belo Horizonte-MG (BH), mantida no LIKA no setor de Doenças Parasitárias e de Esquistossomose Experimental, através de passagens sucessivas da cepa em caramujos Biomphalaria glabrata e camundongos Swiss. Após obtenção de uma suspensão cercariana, trinta e dois camundongos foram infectados via percutânea com 50 cercárias (Olivier; Stirewalt, 1952). O restante dos animais foi mantido nas mesmas condições, mas livre de exposição cercariana. Os animais foram divididos de acordo com a exposição cercariana e esquema de intervenção terapêutica empregado. Os animais livres de infecção foram divididos aleatoriamente em dois grupos (G1 e G2) com 8 animais cada. Os animais infectados foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (G3 – G6) com 8 animas cada, de acordo com o esquema: Grupo 1 (G1): Não infectados controle com salina; Grupo 2 (G2): Não infectados tratados com NAC; Grupo 3 (G3): Infectados controle com salina; Grupo 4 (G4): Infectados tratados com NAC; Grupo 5 (G5): Infectados tratados com PZQ; Grupo 6 (G6): Infectados tratados com NAC e PZQ.NAC (Sigma Chemical, St. Louis, MO, EUA) foi diluída em solução salina na dose de 200mg/Kg/dia, de acordo com estudos anteriores (Jones et al., 1994; FAN et al., 2007; Aires et al., 2012), e administrada via oral (sonda gástrica) a partir do 45° dia após a infecção e foi mantida diariamente até o 180° dias após infecção. Todos os animais submetidos ao tratamento com PZQ receberam a dose curativa de 100mg/Kg/dia, por cinco dias consecutivos a partir do 45° dia após a infecção (Aires et al., 2012).. PZQ foi suspendido em Cremophor EL a 2% e administrado por via oral. Os grupos não expostos a nenhuma a intervenção terapêutica (livre de NAC e/ou PZQ), receberam a mesma quantidade do veículo de diluição e foram submetidos às mesmas condições que os grupos experimentais. Vinte e quatro horas após a última dose de NAC, no181ᵒ após a infecção, todos os camundongos foram submetidos à eutanásia sob anestesia. O sangue foi coletado por punção cardíaca e o soro separado por centrifugação. Os níveis sorológicos da aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (FA), e albumina (ALB) foram medidos em aparelho de Precisão TARGA (Análise de Tecnologia Avançada aleatória Generation). Posteriormente a coleta de sangue, os animais foram perfundidos e o fígado coletado para análise do estresse oxidativo. Ânion superóxido foi medido como previamente descrito (Poderoso et al., 1996) e expresso em nmol/mg/proteína. Superóxido será calculado com base na taxa de oxidação de adrenalina determinado pela absorvância a 780 nm. Espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi medida como um marcador de peroxidação lipídica por espectrofotometria a 532 nm (Draper et al., 1990). Os resultados foram expressos como TBARS nmol/mg de proteína. O teor de carbonila será determinado por espectrofotometria a 370 nm, utilizando um coeficiente de absorção molar de 22000 M-1 cm-1 (Levine, et al., 1990). O teor total de proteína foi medida de acordo com o conteúdo de Proteína Lowry (Michael et. al., 1987). O ensaio foi realizado utilizando albumina de soro bovino como padrão. Um reagente de Folin fenol (reagente fosfomolíbdico-fosfotúngstico) foi adicionado para se ligar à proteína. Os dados foram analisados utilizando-se análise de variância – ANOVA pelo Programa Prism (software GraphPad Prism versão 3.02). Os dados serão considerados significantes se p<0.05.

RESULTADOS

Durante a coleta e centrifugação do sangue para obtenção de soro, não conseguimos amostras suficientes para fazer uma análise estatística confiável. Este fato ocorreu por falha na coleta que causou hemólise.

Figura 1 Efeito do tratamento com NAC (200mg/kg /dia) e/ou do PZQ (100mg/kg /dia) em camundongos, não infectados e infectados com S. mansoni, sobre os níveis de (A) ânion superóxido, (B) peroxidação lipídica, (C) carbonilação de proteínas e (D) grupos sulfidrila no tecido hepático. Os resultados estão expressos em média de 8 animais por grupo ± DP. *P < 0.01 diferença entre controle infectado e NAC, PZQ e NAC+PZQ infectados; a P < 0.001 diferença entre controle não infectado e controle infectado e **P < 0.001 diferença entre controle infectado e NAC, PZQ e NAC+PZQ infectados.

DISCUSSÃO Em nosso estudo, o esquema terapêutico com PZQ reduziu em 100% a carga parasitária, uma vez que nenhum verme foi recuperado do sistema porta-hepático (dados não mostrados). Deste modo, reduzimos os danos causados pelo parasitismo e padronizamos um modelo fisiopatológico da inflamação granulomatosa já instalada e assim medimos com precisão a ação da NAC como uma droga adjuvante a terapia antischistosoma. Nos grupos sem intervenção com PZQ, a carga parasitária foi mantida e uniforme (dados não mostrados), assim a inflamação evoluiu, resultando em complicações patológicas, incluindo o dano oxidativo hepático.Nossos resultados corroboram com os estudos de Sei fel-Din e colaboradores (2006) e Seif el-Din, Al-Hroob, Ebeid (2011), onde mostram que a infecção pelo S. mansoni reduz as defesas antioxidantes, uma vez que houve níveis elevados, no tecido hepático, de ânion superóxido, peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas e redução de grupos sulfidrila. Ademais, durante a infecção a atividade das enzimas catalase e glutationa peroxidase é drasticamente reduzida, juntamente com os níveis intracelulares de glutationa no fígado. O sistema oxidante tem importante papel na defesa natural do ser humano, por um equilíbrio natural entre pró-oxidantes e antioxidantes (Vertuani, 2004). Nessas condições, a reposição exógena de antioxidantes é essencial para eliminar os produtos de reações oxidativas e manter as operações imunológicas capazes de neutralizar os antígenos de ovos de S. mansoni e assim restaurar as funções hepáticas (Sei fel-Din el. al., 2006, Seif el-Din, Al-Hroob, Ebeid, 2011). Assim, o tratamento com a NAC reduz os níveis hepáticos de ânion superóxido, peroxidação

lipídica e carbonilação de proteínas e aumenta os níveis de grupos sulfidrila no mesmo tecido, quando comparados grupo controle infectado. Esses achados também são observados nos grupos tratados com PZQ. Os animais tratados com a NAC sofreram redução nos níveis de oxidantes devido a sua atuação direta ou indiretamente como antioxidante, pela neutralização de radicais e reações redox (cisteína-cistina) e síntese de glutationa (TUMUR, 2010). Nos resultados mostra que o tratamento com NAC, em camundongos não infectados, não alterou os níveis dos marcadores do estresse oxidativo e bioquímicos de danos hepático. De fato, a NAC é uma droga biossegura que já vem sendo empregada no tratamento e controle de algumas patologias e mostra-se segura para o uso em humanos.

CONCLUSÕESA NAC possui efeito eficaz na redução significante do estresse oxidativo da esquistossomose. Seu terminal sulfidrila reage com radicais livres, impedindo que essas espécies reativas de oxigênio intensifiquem os danos causados pelos ovos do Schistosoma mansoni. A NAC vai agir como um auxiliar, do sistema antioxidante natural do organismo. Muito ainda precisa ser estudado a respeito, no entanto, a certeza de que a NAC, atenua os danos severos e irreversíveis da doença, é incontestável. Sua associação com um fármaco que elimine o parasito, traz perspectivas muito positivas para o controle desta parasitose, embora que ainda se esteja longe do esperado.

AGRADECIMENTOSAgradeço ao meu orientador, pelo fomento necessário e paciência, à Dra. Mônica Pessôa pela participação fundamental junto com toda a equipe do laboratório. Ao LIKA, pela estrutura, à UFPE, bem como a ProExt e ao CNPq pela credibilidade e bolsa cedida. A todos envolvidos direta ou indiretamente, nosso muito obrigado!

REFERÊNCIASDraper HH, Hadley M. Malondialdehyde determination as index of lipid peroxidation. Methods Enzymol 1990;186:421-31.

Levine RL, Garland D, Oliver CN, Amici A, Climent I, Lenz AG, et al. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Methods Enzymol 1990;186:464-78.

Michael G. Fiftyfold amplification of the Lowry protein assay. Analytical Biochemistry 1987 Jun;163(2):476-81.

Bulaj G, Kortemme T, Goldenberg DP. Ionization-reactivity relationships for cysteine thiols in polypeptides. Biochemistry 1998 Jun 23;37(25):8965-72.

TUMUR, Z.; SHIMIZU, H.; ENOMOTO, A.; MIYAZAKI, H.; NIWA, T. Indoxyl sulfate upregulates expression of ICAM-1 and MCP-1 by oxidative stress-induced NFkappaB activation. American Journal Nephrology, v.31, n. 5, p. 435-41, 2010.

Vertuani S, Angusti A, Manfredini S. The antioxidants and pro-antioxidants network: an overview. Curr Pharm Des. 2004;10(14):1677-94.