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INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER

Pós-Graduação em Oncologia

TATIANA PEREIRA PENA DUTRA

MODULAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE LINFÓCITOS T CD8 E

CÉLULAS NK POR CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS

Orientador: Eliana Saul Furquin Werneck Abdelhay

RIO DE JANEIRO

2014

Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação

ii




Modulação da atividade antitumoral de linfócitos TCD8 e células NK por células-tronco

mesenquimais

Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Câncer

como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre

em Oncologia.

Orientador: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay

RIO DE JANEIRO

2014


iii

D978m DUTRA, Tatiana Pereira Pena. Modulação da atividade antitumoral de linfócitos TCD8 e células NK por células-tronco mesenquimais. / Tatiana Pereira Pena Dutra. – Rio de Janeiro, 2014. xiv, 47 f.: il. color. Dissertação (Mestrado em Oncologia) - Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva, 2014. Orientador: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay. 1. Células Tronco Mesenquimais. 2. Células Citotóxicas. 3. Células Mesenquimais Estromais. I. Abdelhay, Eliana. (orient). II. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva. III. Título.

CDD 616.41

iv




MODULAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE LINFÓCITOS T CD8 E

CÉLULAS NK POR CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS

ORIENTADOR : Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay


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Aprovada em: 05 de Junho de 2014

EXAMINADORES:

Prof. Dr. Martin Hernan Bonamino

Prof. Dra. Mariana Emerenciano Cavalcanti de Sá

Prof. Dr Robson de Queiroz Monteiro

Prof. Dra. Ilana Zalcberg Renault

Prof. Dra. Morgana Teixeira Lima Castelo Branco

RIO DE JANEIRO

2014

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Aos meus amigos queridos.

Aos meus pais, por todo carinho e apoio.

E por não me deixarem desistir.

Ao meu filho, simplesmente por ele existir.

AGRADECIMENTOS

À minha família, meus pais, à minha tia Vera Lúcia, à Tânia Flor e à tia Marília, pelo apoio e

carinho incondicionais durante todo esse período. À minha prima querida Patrícia, pelas

conversas infinitas.

Ao meu filho querido que só com um sorriso e suas histórias me inspirou bastante.

Aos amigos, Moisés Rocha, Gabriela de Bonis Eliane Rodrigues, Daiane Correa, Elizete

Nogueira, Luize Otero, Haline, pelos cafés descontraídos e pelas palavras de incentivo.

Às amigas, Mayara, Mércia, Karen e Cláudia Diniz, que também fizeram meus dias acolhedores

e divertidos.

Ao Domingos, Luiz Braga, Luiz, Mauricéia e Jose, por todo apoio e carinho.

Um agradecimento especial às amigas Luize Lima, Patrícia Redondo e Raquel Barbosa. Não

tenho palavras para descrever a minha gratidão e carinho por vocês. Obrigada, pelas horas de

discussão, pelas sugestões e incentivo.

Aos companheiros de laboratório Bruno Pires, Gerson Ferreira Gabriela Lemos, Stephany

Correa, Nathalia Correa, Lílian Ayres, Renata Binato e Luciana Pizzati. Especial à Lydiane

Schimidt e Thaís Basili, pela amizade incondicional.

À Bárbara Du Rocher, que ajudou a construir esse projeto.

À minha orientadora Eliana Abdelhay, pela oportunidade de desenvolver esse trabalho.

vii


MODULAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE LINFÓCITOS T CD8 E CÉLULAS NK POR CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS

RESUMO

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Tatiana Pereira Pena Dutra

As células-tronco mesenquimais (CTMs) constituem uma população rara e heterogênea, presente no estroma da medula óssea. Por conta de suas características imunossupressoras, estas células ganharam atenção com a possibilidade de seu uso em terapia celular no contexto do transplante de células tronco hematopoiéticas (TCTH), especialmente para o controle da Doença enxerto-contra-hospedeiro (DECH). Entretanto, suas propriedades imunossupressoras também podem afetar o efeito enxerto contra leucemia (ECL), aumentando a recaída da doença de base, que continua sendo a principal causa de morte pós-transplante, segundo dados do Centro internacional de pesquisa em transplante de medula óssea (CIBMTR). Alguns trabalhos de fato, sugerem que a utilização de CTMs para contenção da DECH pode aumentar a recaída na doença de base, por outro lado outros autores não observaram tal correlação. Sabe-se que os linfócitos T citotóxicos e as células NK medeiam tanto o ECL, quanto a DECH, através da citotoxicidade. As CTMs são capazes de inibir a proliferação de linfócitos, porém os dados existentes na


viii

literatura em relação a citotoxicidade ainda são controversos. Para a utilização destas células para terapia no contexto do TCTH, torna-se fundamental avaliar sua ação sobre os linfócitos T citotóxicos, bem como o mecanismo envolvido na inibição da citotoxicidade. Para avaliar se as CTMs interferem na capacidade citotóxica de linfócitos T e NK em matar células leucêmicas, co-cultivamos células mononucleares (CMNs) com células da linhagem de leucemia mielóide crônica K562, na presença ou ausência de CTMs. As CTMs foram capazes de reduzir a morte de células K562 induzidas na presença de CMNs. Para nos certificarmos de que este efeito não se deu em decorrência da privação de nutrientes, afetando a função de células citotóxicas, nós co-cultivamos CMNs com a linhagem K562 na presença de células HT29, uma linhagem tumoral de cólon altamente proliferativa, capaz de consumir rapidamente os nutrientes da cultura. Neste caso, não observamos uma inibição significativa da atividade citotóxica de CMNs, sugerindo um envolvimento específico ads CTMs . Para investigar os mecanismos envolvidos na inibição da citotoxicidade mediada pelas CTMs, analisamos a produção de moléculas usualmente envolvidas em processos de morte celular induzidas por células T efetoras e células NK como perforina, granzima, TNF-α, INFγ e FasL. Em relação as células TCD8, nossos resultados mostram um aumento na secreção de TNFα e nenhuma diferença foi observada em relação a secreção de INFγ. Em relação as células NK, observamos uma diminuição na secreção de TNFα e INFγ. Os níveis de FasL mostraram-se diminuídos na presença de CTMs nas células NK e nas células TCD8. No entanto, estas diferenças não atingiram significância estatística. Desta forma, o efeito inibitório promovido pelas CTMs não parece estar associado a modulação de nenhuma via citotóxica estudada até o momento. Palavras chave: Células Tronco Mesenquimais, células citotóxicas.


MODULAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE LINFÓCITOS T CD8 E CÉLULAS NK POR CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS

ABSTRACT

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Tatiana Pereira Pena Dutra

The mesenchymal stem cells (MSCs) are a rare and heterogeneous population present in the bone marrow stroma. Because of its immunosuppressive characteristics, these cells have gained attention with the possibility of their use in cell therapy in context of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), especially for the control of Graft-versus-host disease (GVHD). However, their immunosuppressive properties may also affect the graft versus leukemia effect (GVL), increasing the relapse of the underlying disease, which remains the leading cause of post-transplant death, according to the International Center for Research on bone marrow transplantation ( CIBMTR ). Some studies actually suggest that the use of MSCs for containment of GVHD may increase relapse in the underlying disease, on the other hand other authors found no such correlation. It is known that the cytotoxic T lymphocytes and NK cells mediate both the GVL as GVHD through cytotoxicity. MSCs are capable of inhibiting the proliferation of lymphocytes, but the existing data in the literature regarding the cytotoxicity are still controversial. For the use of these cells for therapy in the context of HSCT, it is essential to assess its effect on cytotoxic T


ix

lymphocytes, as well as the mechanism involved in the inhibition of cytotoxicity. To assess whether MSCs interfere with the cytotoxic potential of T and NK lymphocytes in killing leukemic cells co-cultivated mononuclear cells ( MNCs ) with the lineage leukemia K562 chronic myeloid cells in the presence or absence of MSCs. MSCs were able to reduce death induced MNCs in the presence of K562 cells. To make sure that this effect did not occur as a result of nutrient deprivation, affecting the function of cytotoxic cells, we co - cultivated with MNCs K562 cells in the presence of HT29 cells, a highly proliferative tumor cell line of colon able to consume quickly crop nutrients. In this case, we observed a significant inhibition of the cytotoxic activity of MNCs, suggesting a specific involvement ads MSCs. To investigate the mechanisms involved in inhibition of cytotoxicity mediated by MSCs, we analyzed the production of molecules usually involved in cell death processes induced by effector T cells and NK cells as perforin, granzyme, TNF - α, INFγ and FasL. Regarding the CD8 T cells , our results show an increase in the secretion of TNF and no difference was observed for the secretion of INFγ. Regarding NK cells, we observed a reduction in the secretion of TNF and INFγ. FasL levels were shown to be decreased in the presence of MSCs in NK cells and CD8 + T cells. However, these differences did not reach statistical significance. Thus, the inhibitory effect caused by MSC does not appear to be associated with any cytotoxic via modulation studied so far .Keywords: Mesenchymal stromal cells, cytotoxic cells.

LISTA DE ABREVIATURAS

AP1 Proteína de ativação 1, do inglês Activating protein-1.

APCs Células apresentadoras de antígeno, do inglês Antigen presenting cells.

Apaf-1 Fator de ativação da apoptose 1, do inglês Apoptotic protease activating

factor 1.

Ape1 Enzima ligada ao reparo do DNA, do inglês Apurinic\apirimidinic

endonuclease 1.

BCR Receptor de células B, do inglês B cell receptor.

Bak Proteína pró-apoptótica, do inglês Bcl-2 homologous antagonist/killer.

Bax Proteína pró-apoptótica, do inglês Bcl-2 associated X protein.

Bcl-2 Proteína pró-apoptótica, do inglês B-cell lymphoma 2.

BID Membro pró-apoptótico da família Bcl2, do inglês BH3 interacting-domain

death agonist.

CAD

Fas

Fas-L

Dnase ativada por caspase, do inglês Caspase-active Dnase.

Receptor da família TNF ligado à apoptose.

Proteína da família TNF ligada à apopstose

c- FLIP Proteína antiapoptótica, do inglês Celular inhibitory FLICE domain.

CFSE Rastreador celular, do inglês Carboxyfluorescein succinimidyl ester.

CTH Células-tronco hematopoiéticas

x

CTLA-4 Proteína inibidora da ativação de linfócitos T, do inglês CTL associated

antigen- 4.

CTM Células-tronco mesenquimais.

CXCR-4 Receptor de quimiocinas 4 com motivo CXC, do inglês CXC Chemokine

receptor-4.

CXCL-12 Quimiocina com motivo CXC, do inglês CXC motif chemokine 12.

DAP-10/12

DECH

Moléculas associadas à receptores da imunidade inata

Doença enxerto contra o hospedeiro.

DISC Complexo formado após ligação Fas-FasL, do inglês Death Inducing

Signaling Domain.

ECL Enxerto contra leucemia.

ECT Enxerto contra tumor.

FADD Proteína do complexo DISC, do inglês Fas-Associated Death Domain.

G-CSF Fator estimulador de colônias de granulócitos, do inglês Granulocyte colony

Stimulating Factor.

HLA Antígeno leucocitário humano, do inglês Human antigen leukocyte.

HMG-2 Proteína do grupo de alta mobilidade 2, do inglês High mobility group G-2.

ICAD Inibidor de Dnase ativada por caspase, do inglês Inhibitor of caspase-active

Dnase.

ITAM Motivo de ativação ligado aos imunoreceptores, do inglês Immunoreceptor

Tyrosine-based Activator Motifis.

ITIMs Motivo de inibição ligado aos imunoreceptores, do ingês Immunoreceptor

tyrosine-based inhibitory motifis.

INFγ Interferon gama.

IL-1β Interleucina 1-β.

IL-2 Interleucina 2.






xi


JNK Quinase c-jun n-terminal, do inglês c-Jun N-terminal kinases.

KIR Receptor como imunoglobulina de células exterminadoras naturais, do inglês

Killer-cell immunoglobulin-like.

LIF Fator inibitório de Leucemia, do inglês Leukemia inhibitoty factor.

LT-α Linfotoxina α, do inglês Limphotoxin α.

LTC Linfócitos T citotóxicos.

M-CSF Fator estimulador de colônias de macrófagos, do inglês Macrophage colony

stimulating factor.

NK Células exterminadoras naturais, do inglês Natural Killer.

NFkB Fator de transcrição nuclear kB, do inglês Nuclear factor kB.

NM23_H1 Proteína supressora de tumor ligada ao complexo SET, do inglês Non

metastatic, protein 23homologue 1.

PD- 1 Receptor de morte celular 1, do inglês Programmed cell death-1.

PDL-1 Ligante de morte celular 1, do inglês Programmed cell death ligand-1.

PDL-2 Ligante de morte celular 2, do inglês Programmed cell death ligand-2.

pp32 Fosfoproteína 32, do inglês Phophoprotein 32.

PI3K Fosfatidilinositol 3 quinase, do inglês Phosphatidil inositol 3 kinase.

RIP Receptor de interação proteica.

ROS Espécies reativas de oxigênio, do inglês Reactive oxygen species.

SDF-1 Fator derivado de células do estroma, do inglês Stromal cell-derived factor 1.

SET Complexo associado ao retículo endoplasmático

SHP Proteína de transdução de sinal intracelular com domínio SH2 contendo

fosfatase, do inglês SH2 containing phosphatase.

SHIP Proteína de transdução de sinal intracelular com domínio SH2 contendo

fosfatase, do inglês SH2 containing inositol phosphatase SH2 containing

inositol phosphatase.

SH2 Proteína de transdução de sinal intracelular com domínio SH2, do inglês Src

Homology 2.

TAP Proteína transportadora associada à apresentação de antígenos, do inglês

Transporter associated with antigen processing.

TCR Receptor de células T, do inglês T cell receptor.

xii

TCTH Transplante de células tronco hematopoiéticas

TNF-α Fator de necrose tumoralα, do inglês Tumor Necrosis Factor α.

TNFR Receptor para Fator de necrose tumoral, do inglês Tumor necrosis factor

receptor.

TRADD Proteína de ativação da apoptose, do inglês TNF receptor-associated death

domain.

TRAF-2 Fator 2 associado ao TNF, do inglês TNF associated factor 2.

XIAPs Proteína anti-apoptótica da família IAP, do inglês X linked inhibitor apoptosis

protein.

ZAP 70 Proteína citoplasmática associada à cadeia zeta com atividade tirosino

quinase, do inglês Zeta-chain-associated protein kinase 70.

7AAD Marcador para apoptosis, do inglés 7-Aminoactinomycin_D.

LISTA DE FIGURAS

xiii

TABELAS

Figuras Legendas Paginas

Figura 1 Nicho hematopoiético 1

Figura 2 Células tronco mesnquimais 2

Figura 3 Visão geral do transplante de células tronco

hematopoiéticas

5

Figura 4 Complexo gênico para o HLA 7

Figura 5 MHC de classe I e II 8

Figura 6 Patofisiologia da DECH aguda 10

Figura 7 Processamento de antídenos pelo MHCI 12

Figura 8 Esquema das vias intrínsecas e extríncecas

da apoptose

13

Figura 9 Interação de células NK com células Alvo 15

Figura 10 Mecanismo de citotoxicidade pela atividade

de granulos citotoxicos

18

Figura 11 Mecanismo de citotoxicidade através da

interação Fas-FasL

19

Figura 12 Ativação dos linfócitos T 21

Figura 13 Estratégia de análise da citotoxicidade 25

Figura 14 Estratégia de análise dos mediadores da

citotoxicidade

28

Figura 15 As CTMs inibem a atividade citotóxica de

CMNs contra células leucêmicas

30

Figura 16 O potencial inibidor da citotoxicidade é

inerente às CTMs

31

Figura 17 A inibição da citotoxicidade pelas CTMs

não envolve a modulação de grânulos

citotóxicos

32

Figura 18 As CTMs não inibem a secreção de

citocinas pelas células citotóxicas

33

Figura 19 As CTMs podem inibir a citotoxicidade de

CMNs através da regulaão da via Fas Fas-L

34

xiv

Quadro 1. Receptores das células NK 16

Quadro 2. Painel de marcação das células citotóxicas e citocinas INFγ e TNFα 26

Quadro 3. Painel de marcação das células citotóxicas moléculas citototóxicas Granzima

A e Perforina

26

Quadro 4. Painel de marcação das células citotóxicas e molécula citotóxica FasL 27

xv

SUMÁRIO

1. Introdução 1

1.1. Células estromais da medula óssea 1

1.2. Transplante de células-tronco hematopoiéticas 4

1.3. Doença enxerto contra o hospedeiro versus Enxerto contra leucemia 8

1.4. Citotoxicidade mediada por células 11

1.4.1. Citotoxicidade mediada por células NK 13

1.4.2. Citotoxicidade mediada por Linfócitos T 19

2. Objetivos 22

3. Materiais e métodos 23

3.1. Cultura primária de CTMs obtidas de aspirado de medula óssea 23

3.2. Cultura das linhagens tumorais K562 e HT29 23

3.3. Obtenção de células mononucleares humanas a partir de sangue periférico 24

3.4. Ensaio de citotoxicidade 24

3.5 Análise de citocinas, FasL, perforina e Granzima 25

3.6. Estatística 29

4. Resultados 30

4.1. As CTMs inibem a atividade citotóxica de CMNs contra células

leucêmicas

30

4.2. O potencial inibidor da citotoxicidade é inerente às CTMs 31

4.3. A inibição da citotoxicidade pelas CTMs não envolve a modulação de

grânulos citotóxicos

31

4.4. As CTMs não inibem a secreção de citocinas pelas células citotóxicas 33

4.5. As CTMs podem inibir a citotoxicidade de CMNs através da regulação da

via Fas Fas-L

34

5. Discussão 35

6. Conclusão 38

7. Bibliografia 39

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Células estromais da medula óssea

As células-tronco mesenquimais (CTMs) foram descritas pela primeira vez em 1966, por

Friendstein et al., como células aderentes com capacidade de gerar unidades formadoras de

colônias (Friendstein et al., 1966). Já o nicho hematopoiético foi primeiramente descrito por

Owen em 1985, o qual propôs três sistemas celulares básicos na medula óssea: hematopoiético,

endotelial e estromal (Figura 1). Segundo Owen, o sistema estromal é composto por células

tronco residentes na medula, capazes de se diferenciar em diversos tecidos de linhagens

conectivas, (inclusive em osteócitos), bem como por células estromais (Friedstein et al., 1980;

Owen et al.,1988).

Figura1: Nicho hematopoiético. Componentes da zona trabecular: (1) Trabécula óssea, presente por toda a zona trabecular, (2) endósteo, interface entre o osso e a medula óssea, (3) sinusóides, vênulas especializadas que permitem a passagem de células. A- Progenitores hematopoiéticos maduros residem em meio a medula óssea.. B: Visão em maior aumento de A. Sinusóides estão representados em vermelho, tecido ósseo em cinza e áreas hematopoiéticas em rosa. Sinusóides estão associados com os megacariócitos em roxo, células reticulares produtoras da quimiocina CXCL-12 em verde e progenitores mesenquimais CTMs, em branco. A superfície óssea é coberta por osteoclastos e osteoblastos, responsáveis pela reabsorção e diferenciação óssea respectivamente. Progenitores hematopoiéticos PH, em azul estão adjacentes aos vasos sinusoidais (setas). Osteoclastos e osteoblastos produzem fatores que regulam a manutenção e localização dos progenitores hematopoiéticos. Propõe-se que células reticulares perivasculares e mesenquimais também produzem fatores que regulam a sua manutenção. Adaptado de Sugiyama et al., 2006

2

Estudos posteriores mostraram que CTMs são células capazes de se diferenciar em tipos

celulares presentes em tecidos de origem mesenquimal, tais como: adipócitos, osteócitos,

condrócitos e mioblastos (Owen e Friedenstein, 1988; Wakitani et al., 1995, Pittenger et al.,

1999). Devido ao fato de elas não possuírem marcadores exclusivos, a Sociedade Internacional de

Terapia Celular propôs três critérios mínimos para definir as CTMs humanas. Estes critérios são:

I - aderência ao plástico; II – capacidade de diferenciação in vitro em osteoblastos, condroblastos

e adipócitos (Figura 2) e III - expressão de CD105, CD73 e CD90, paralelamente à ausência de

expressão de CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 e HLA-DR (Dominici et al.,

2006).

B C DA B C DA

Figura 2: Células-tronco mesenquimais. De acordo com a Sociedade de Terapia Celular as células-tronco mesenquimais (A) devem ser capazes de se diferenciar em (B) adipócitos, (C) condroblastos, (D) osteoblastos. Adaptado de Pittenger et al., 1999

A fonte de CTMs utilizada majoritariamente é a medula óssea, porém estas células

também podem ser isoladas a partir de outros tecidos, como tecido adiposo, líquido amniótico,

tecidos fetais, sangue periférico, sangue de cordão umbilical, além do próprio cordão (Barry

2002; Tolar et al., 2011).

Uma vez que as CTMs estão presentes no nicho hematopoiético, e considerando suas

características citadas acima, podemos supor que estas células tenham um papel na manutenção

desse nicho. De fato, estudos mostram a interação de CTMs com células hematopoiéticas,

auxiliando a formação de plaquetas por megacariócitos (Cheng et al., 2000), a diferenciação de

linfócitos B (Kierney e Dorshkind, 1987) e a linfopoiese de células T (Barda-Saad et al., 1996).

Acredita-se que parte dessa interação ocorra através da secreção de moléculas que dão suporte à

hematopoiese, como fibronectina, osteopontina, trombospondina e a quimiocina CXCL12

3

(também conhecida como SDF-1) (Pedemonte et al., 2007), além de citocinas promotoras da

hematopoese como IL-6, -7, -11, -14, -15, M-CSF e LIF (Deans et al., 2000).

As CTMs têm sido estudadas para diversos propósitos, desde o conhecimento da biologia

dos microambientes teciduais, ate aplicações médicas para fins terapêuticos. Estudos mostraram

que as CTMs possuem tropismo para sítios de injúria ou inflamatórios, auxiliando no reparo de

tecidos lesionados, o que já foi observado em modelos como fígado, pulmão, pâncreas e pele.

(Shinagawa et al., 2010; Tolar et al., 2011). Prockop et al. mostraram que, em resposta à injúria

tecidual, as CTMs secretam uma série de fatores, habilitando o reparo tecidual e limitando a

resposta ao estresse e à apoptose, através do recrutamento de células do sistema imune (Prockop

et al., 2009). Corroborando esses estudos, outros autores mostraram que CTMs também migram

em direção a tumores, os quais podem estar relacionados ao estabelecimento de sítios de injúria

ou inflamatórios. Deste modo, ao migrar para o sítio tumoral estas células se diferenciam e

adquirem perfil pró-tumoral, sendo agora chamadas de fibrobastos associados ao câncer (CAFs)

(Kloop et al., 2011). Os CAFs têm sido alvo de estudos frequentes para a sua utilização como

terapia antitumoral (Gonda et al., 2010).

Dois estudos pioneiros mostraram a capacidade das CTMs de modular o sistema imune.

Utilizando um modelo de enxerto e pele em babuínos e cultura mista de linfócitos (CML),

Bartolomew et al. mostraram que CTMs autólogas ou alogeneicas foram capazes de inibir a

proliferação de linfócitos e promoveram a sobrevivência prolongada do enxerto de pele. Di

Nicola, utilizando um modelo de CML, também mostrou a capacidade das CTMs de inibir a

proliferação de linfócitos. Além disso, utilizando um modelo de transwell, mostrou o

envolvimento de dois fatores solúveis neste fenômeno (Bartholomew et al., 2002; Di Nicola et

al., 2002).

Tal potencial imunossupressor indicou a possibilidade de sua utilização terapêutica em

diversas situações patológicas nas quais existe o envolvimento do sistema imune. Embora o

mecanismo pelo qual as CTMs diminuem a resposta imunológica ainda seja controverso, seu

potencial imunomodulatório já tem sido explorado em diferentes ensaios clínicos. Dentre os

diversos estudos em andamento, aqueles voltados para o tratamento de doenças autoimunes

(Zappia et al., 2005) e da Doença enxerto contra o hospedeiro (DECH) se destacam (Le Blanc et

al., 2004).

No contexto do transplante de células tronco hematopoiética (TCTH), essas células têm

sido apontadas como promissoras, por atuarem em três frentes: no tratamento da DECH, por

4

suprimirem o sistema imune (Le Blanc et al., 2004); na diminuição do período de aplasia pós

TCTH, por auxiliarem a hematopoiese (Muller et al., 2008); e na regeneração tecidos lesionados

(Horwitz et al., 2005).

Vale ressaltar que, com relação ao seu efeito imunossupressor, diversos trabalhos têm

demonstrado uma inibição global, não seletiva, sobre as células do sistema imune. Desta forma, é

possível que este efeito inespecífico seja capaz de inibir não só linfócitos do doador que reagem

contra células saudáveis do hospedeiro, como também linfócitos do doador que atuam eliminando

eventuais células leucêmicas que sobreviveram ao regime de condicionamento pré-TCTH, efeito

conhecido na clínica como enxerto contra leucemia (ECL). Neste sentido Ning et al utilizando

um estudo clínico randomizado utilizando 35 pacientes relataram que a infusão de CTMs para

contenção da DECH resultou no aumento da recaída da doença de base pós TCTH (Ning et al.,

2008), no entanto, em um estudo randômico utilizando 55 pacientes Liu et al. não observararam

tal efeito (Liu et al., 2011). Esta discrepância também é observada em modelos in vitro,

utilizando um modelo de citotoxicidade de células NK estímuladas contra linhagens celulares

leucêmicas ou provenientes de melanoma (Sotiropoulou et al., 2006; Spaggiari et al., 2008).

Diante de tais efeitos controversos, o papel das CTMs na citotoxicidade mediada por linfócitos

ainda precisa ser melhor elucidado.

1.2. Transplante de células tronco hematopoiéticas

Durante a última metade do século XX, o TCTH tornou-se uma modalidade terapêutica

bem estabelecida, utilizada para tratar milhares de indivíduos anualmente. Esta consiste na

substituição de um sistema hematopoiético anormal por outro competente. Inicialmente, o TCTH

foi desenvolvido para atender a três propósitos: tratar anemias herdadas e imunodeficiências, bem

como permitir a administração de altas doses de quimioterapia e radioterapia a pacientes com

câncer, visando depletar a maioria das células malignas existentes (Jenq et al., 2010). A

administração de altas doses de quimioterapia e radioterapia com este fim chama-se regime de

condicionamento (ou tratamento) mieloablativo. Após esse período, que pode durar até oito dias,

o paciente se submeterá à infusão de células tronco hematopoiéticas. A partir da infusão, essas

células migrarão para o microambiente medular, onde se estabelecerão e darão início à

reconstituição hematopoiética. No período entre o dia da infusão (D1), vinte e um dias após o

transplante (D21), o paciente estará em aplasia medular, ou seja, com produção insuficiente de

células e portanto, sem resposta imune. Clinicamente, considera-se pega medular quando, por três

5

dias consecutivos, o número de neutrófilos do paciente é constante, o que ocorre por volta do dia

D21 (Figura 3) (Voltarelli et al., 2009).

Figura 3: Visão geral do TCTH. Período de D8 ao D0: regime de condicionamento. Durante esse período, o paciente é tratado com altas doses de quimioterapia e/ou radioterapia. Período de D1 ao D21: período de aplasia medular pós TCTH. Período D21 em diante: período de recuperação da medula e reconstituição da hematopoiese. Adaptado de Bárbara Du Rocher, 2010.

Para a realização do TCTH, podem ser utilizadas três fontes de células-tronco

hematopoiéticas (CTH): a medula óssea, o sangue periférico mobilizado e o sangue de cordão

umbilical. Quando a fonte de CTH é a medula óssea, esta é extraída de um doador saudável,

através de punções feitas em suas cristas ilíacas, a fim de se obter aproximadamente 3x108

células nucleadas por quilo do paciente (Kumar et al., 2007).

Já no caso do sangue periférico mobilizado, são coletadas CTHs circulantes. Sendo assim,

faz-se necessário o aumento do número destas células na periferia, uma vez que sua concentração

sistêmica é de aproximadamente 0,02%. (Kumar et al., 2007). Em 1988, foi descoberto que a

molécula de membrana CD34 era um marcador de células precursoras hematopoiéticas. Logo

após, em 1990, observou-se que o fator de crescimento G-CSF aumentava a mobilização de

células CD34+ da medula óssea para o sangue periférico (Berenson, et al., 1988; Molineux, et al.,

1990). Com isso, foi possível aumentar a quantidade destas células na circulação para posterior

coleta e infusão em pacientes. Além disso, recentemente, o receptor CXCR4 e seu ligante

6

CXCL12 foram apontados como mediadores da migração de CTHs para o nicho medular. A

partir desse novo conhecimento, foi desenvolvido o medicamento plerixafor, antagonista de

CXCR4, que, quando administrado em conjunto com o G-CSF, aumenta a mobilização de células

CD34+ para o sangue periférico (Burger et al.,2009; DiPersio et al., 2009).

Outra fonte de CTHs é o sangue de cordão umbilical. Dentre as vantagens da utilização

desta fonte, está o fato de a mesma estar relacionada com o desenvolvimento de DECH mais

branda. O motivo ainda não está claro, porém estudos mostram que o sangue de cordão umbilical

apresenta células T predominantemente imaturas, portanto menos reativas, além de ser rico em

células T regulatórias, que também contribuem para supressão da resposta imune (Knudtzon et

al., 1974; Han et al., 1995, Godfrey et al., 2005). Para utilização clínica, recomendam-se doses

maiores que 2-5x107 células nucleadas ou 2-5x105 células CD34+ por quilo do paciente.

Finalmente, o TCTH pode ser classificado em: autólogo, quando o paciente é o próprio

doador; singeneico, entre irmãos gêmeos; ou alogeneico, entre indivíduos geneticamente

diferentes aparentados ou não. No que diz respeito aos pacientes submetidos ao TCTH

alogeneico, deve-se determinar o grau de compatibilidade entre doador e paciente, a fim de evitar

a rejeição do enxerto pelo paciente. Ou ainda evitar a doença enxerto contra o hospedeiro. Isso se

dá através da avaliação do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) denominado

antígeno leucocitário humano (HLA) em humanos. Os genes que compõem este complexo estão

localizados no braço curto do cromossomo 6 (Figura 4) e são altamente polimórficos, o que

determina uma grande variação entre os indivíduos. Desta forma, o processo de reconhecimento

dos antígenos do paciente pelo enxerto e, vice-versa, é um fenômeno imunológico disparado pela

diferença entre as moléculas de HLA. (Menhra et al.,2003)

7

Figura 4: Complexo gênico para o HLA localizado no braço curto do cromossomo 6. Aumento na região do HLA mostrando a localização específica de cada loci. Loci classe I (A, B e C) e classe II (DR, DP e DQ). Adaptado de: http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/childHCT/HealthProfessional/page3

Existem dois tipos principais de produtos codificados pelos genes do MHC, chamados de

moléculas de classe I e moléculas de classe II. Estas apresentam tipos diferentes de antígenos,

que podem ser citosólicos (sintetizados endogenamente) ou exógenos (endocitados em vesículas).

As moléculas de MHC de classe I estão presentes em todas as células nucleadas e apresentam

peptídeos intracelulares para os linfócitos T citotóxicos. Estas moléculas são especialmente úteis

na vigilância imunológica, pois quaisquer alterações intracitoplasmáticas que gerem proteínas

alteradas, como mutações e/ou infecções virais, podem ser detectadas, já que estas proteínas

poderão ser degradadas e apresentadas via MHC de classe I. Já as moléculas de classe II estão

presentes nas células apresentadoras de antígenos (APCs), como células dendríticas, macrófagos,

monócitos e linfócitos B. Estas são células fagocíticas que, uma vez tendo digerido o peptídeo, o

apresentam aos linfócitos T auxiliares via MHC de classe II (Figura 5).

As moléculas de classe I são codificadas por diversos loci, entre eles: HLA-A, HLA-B,

HLA-C, HLA-E, HLA-F e HLA-G. As moléculas de classe II são codificadas por 4 loci

diferentes, HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DM. Existe ainda uma terceira região, classe

III, que codifica componentes do sistema complemento, citocinas (fator de necrose tumoral,

linfotoxina e linfotoxina – β) e algumas proteínas do choque térmico.

8

Sítio de ligação

do peptídeo

MHC I MHC II

Sítio de ligação

do peptídeo

Membrana celular

Figura 5: O MHC de classe I encontra-se expresso em todas as células nucleadas e é fundamental para a imunidade antiviral. MHC de classe II, pelo contrário encontra-se expresso em um pequeno número de células especializadas designadas como células apresentadoras de antígenos (APCs). As células apresentadoras de antígenos incluem macrófagos, linfócitos B, linfócitos T citotóxicos entre outros. Adaptado de: http://doctor-jones.co.uk/Immunology/Tutorial/The%20Major%20Histocompatibility%20Complex.htm

1.3. Doença enxerto contra o hospedeiro versus Efeito Enxerto contra leucemia

A reação enxerto contra hospedeiro é disparada por células T maduras, contidas no

enxerto, contra células saudáveis do paciente (Shlomchik et al., 2007). Igualmente, são essas

mesmas células que irão reagir contra células residuais do tumor.

A DECH pode apresentar-se clinicamente de duas formas: aguda e crônica. Em sua forma

aguda, é caracterizada pelo envolvimento de pele, fígado e trato gastrointestinal como principais

órgãos alvos e, em menor grau, timo, medula óssea e outros sítios. Usualmente, aparece dentro de

algumas semanas pós TCTH (Shlomchik et al., 2007). A patofisiologia da doença envolve uma

complexa cascata de interações entre células do doador e hospedeiro (Jenq et al., 2010).

Bilingham et al. descreveram a doença e dividiram-na em três fases (Figura 6):

• Fase 1: O regime de condicionamento ao qual o paciente é exposto, leva a inflamação

e injúria tecidual. No caso da injúria ao trato gastrointestinal, a exposição a padrões

moleculares presentes na superfície de patógenos, como o LPS em bactérias GRAM

negativas, induz as células do sistema imune inato a reagirem (Lee et al., 2009) e a

produzirem diversas citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, como IL-1β e TNF-α.

Estas citocinas irão aumentar o reconhecimento de antígenos do paciente pelas células

T do doador, através do aumento de moléculas de adesão e moléculas co-

9

estimulatórias, que ativarão APCs residuais, bem células APCs do doador (Socié et

al., 2009; Jenq et al., 2010).

• Fase 2: Nesta fase, os linfócitos T do doador irão se ativar e proliferar em resposta às

APCs do hospedeiro. Esta apresentação pode ocorrer de forma direta, onde a

similaridade entre as moléculas de MHC do doador e do hospedeiro possibilita a

interação direta das APCs do hospedeiro com linfócitos T do doador. Outra forma de

apresentação de antígenos é indireta, ou seja, células e/ou restos celulares do paciente

são fagocitados tanto pelas APCs do paciente quanto pelas APCs do doador, e alguns

fragmentos de peptídeos resultantes desta degradação são apresentados via MHC

classe II aos linfócitos T auxiliares, ou via apresentação cruzada aos linfócitos T

citotóxicos (Lechler et al., 1991). Como consequência desse processo, mais citocinas

são produzidas, como IL-2 e INF-γ, levando à expansão e ativação de novos clones,

bem como à atividade efetora destes linfócitos.

• Fase 3: É a fase efetora da doença. Nesta fase, diversos mecanismos efetores são

acionados, dentre eles: a citotoxicidade mediada pelos linfócitos T citotóxicos, através

da liberação de grânulos de perforina e granzima; e a ativação de apoptose via

receptores de morte da família de receptores de TNF, que inclui os receptor Fas.

Manifestações clínicas da doença incluem rash e erupções cutâneas, perda de peso,

hemorragias gastrointestinais, inflamações na mucosa, causando dor e diarréia,

alterações metabólicas do fígado e outros problemas (Jaksch e Mattsson, 2005).

10

Figura 6: Patofisiologia da DECH aguda. No esquema, estão detalhadas as três fases sequenciais da DECH (Hill e Ferrara-Sociedade Americana de Hematologia). Adaptado de Hill et al., 2000.

Durante muito tempo, acreditou-se que o grande vilão da DECH seria o linfócito T, e que

sua retirada poderia ser útil para diminuir a incidência da doença. De fato, a incidência de DECH

diminuiu quando pacientes foram transplantados com medulas depletadas de linfócitos T, porém

a recaída na doença de base e a rejeição ao enxerto aumentaram. Dessa forma, ficou claro que,

embora os linfócitos fossem os grandes responsáveis pela DECH, estes também constituíam um

importante componente que não poderia ser eliminado (Wagner et al., 2005).

Os linfócitos T presentes no enxerto eliminam linfócitos do paciente, evitando a rejeição do

enxerto, bem como a eliminam de eventuais clones tumorais, evitando a recaída da doença. Este é

conhecido como efeito enxerto contra tumor (ECT) ou efeito enxerto contra leucemia (ECL).

Uma vez que esses linfócitos possuem um papel importante para a biologia do transplante, o

grande desafio é conseguir conter a DECH, mas sem permitir a recaída da doença (Figura 6).

Ainda assim, o tratamento de rotina para DECH continua sendo a utilização de

imunossupressores de amplo espectro, como metotrexato e ciclosporina. Imunoterapias atuais

ainda em fase de estudo envolvem estratégias menos tóxicas e mais direcionadas como depleção

1-Regime de condicionamento

Dano tecidual

Tecido paciente

IL-6 IL-1

TNFα

2-Ativação células T doador

IL-2

INFγ

IL-2

Perforina

FasL TNFα

3- Resposta celular

Morte célula alvo

IL-1

TNFα

Intestino

LPS

APC paciente

Célula TDoador

Th1

NK

LTC

Mφ

11

seletiva de células T virgens, inserção de genes suicidas em linfócitos, uso de células NK

alorreativas, transfusão de células T (Hill et al., 2000).

1.4. Citotoxicidade mediada por células

A atividade citotóxica constitui uma parte importante da resposta imune mediada por

células, uma vez que esta é uma das funções do sistema imune. Este processo consiste na indução

da morte celular das células alvo através das células citotóxicas efetoras. As principais células

efetoras são NK e os linfócitos T citotóxicos (LTC) (Galán et al., 2009).

As células T virgens se diferenciam em células T citotóxicas CD8+ através da ativação por

células dendríticas maduras. Após ativado o linfócito é capaz de produzir IL-2, citocina que irá

dirigir sua diferenciação e proliferação (Janeway, 2010). As células T CD8 reconhecem a

molécula de MHC classe I presentes nas células dendríticas. Para ser corretamente ativado o

linfócito precisará de três sinais: o primeiro consiste na ligação do TCR a molécula de MHC de

classe I, o segundo ,está na ação das moléculas co-estimulatórias e o terceiro dependerá do

microambiente de ativação desta célula.

No que diz respeito as células NK, estas não possuem a especificidade de um lifócito. Sua ação

irá depender do balanço entre a gama de seus receptores ativadores e inibidores. Desta

sinalização irá depender a sua ativação, proliferação e função efetora (Lanier et al., 2005).

A molécula de MHC de classe I é expressa por todas as células nucleadas e sua função é

processar e apresentar peptídeos intracelulares. Os peptídeos são processados pelo proteassoma e

transportados através do transportador associado com processamento de antígeno proteína (TAP)

contida no retículo endoplasmático. O MHC recém-formado é estabilizado através da calnexina

até a ligação da β2 microglobulina, quando então se liga ao complexo TAP–peptídeo e é

posteriormente endereçado ao complexo de Golgi (Figura 7) (Galán et al., 2009).

O reconhecimento de uma célula alterada pode ocorrer através da apresentação cruzada,

neste caso os peptídeos processados são oriundos de células endocitadas. Já a atividade citotóxica

das células NK é disparada pela ligação de receptores ativadores à molécula de MHC de classe I

alterada ou inibida pelo reconhecimento da molécula de MHC de classe I própria. (de Saint

Basile et al., 2010)

A apoptose é um processo fundamental para o equilíbrio de um organismo, no qual

células senescentes ou infectadas são induzidas à morte. Este mecanismo pode ser disparado de

forma intrínseca ou extrínseca.

12

A via extrínseca é iniciada pela ativação de receptores de morte celular, receptores da

família TNFR. Dentre estes, os mais compreendidos são Fas e TNFRI. Estes receptores possuem

um domínio de morte, cujo papel é importante na transdução do sinal de apoptose. A interação

receptor-ligante leva a formação do complexo de indução de morte DISC. Este complexo é

composto por receptores oligomerizados FADD, pró-caspase 8 (FLICE), pró-caspase 10 e c-

FLIP. Uma vez formado, este complexo ativa as pró-caspases 8 e 10, que levam a ativação das

pró-caspases 3, 6 e 7 (Figura 8). Estas caspases efetoras ativam enzimas que promovem a morte

celular, bem como uma série de proteínas críticas à sua integridade. A regulação desse processo

pode ser através das proteínas XIAPs (Lavrik et al., 2010).

Figura 7: Processamento do MHC de classe I. Geralmente os peptídeos apresentados pelo MHC de classe I são derivados de proteínas intracelulares. Ela é degradada pelo proteassoma e transportada através do TAP no retículo endoplasmático. Por outro lado, o MHC recém-sintetizado é estabilizado pela calnexina até que β2 microglobulina se ligue ao complexo. O MHC de classe I parcialmente formado se liga ao complexo TAP. Após a ligação do peptídeo, o MHC de classe I é transportado através do aparelho de Golgi para a superfície da célula. Adaptado de Andersen et al., 2006.

13

Figura 8: Esquema das vias intrínsecas e extrínsecas da apoptose. Na via extrínseca da apoptose o estímulo de um “ligante de morte” ao se receptor cognato leva a formação do DISC (Death inducing signaling complex), que ativa as pró-caspases 8 e 10. As agora caspases 8 e 10 clivam e ativam outras caspases efetoras. A ativação da pró-caspase 8 pode ser bloqueada pela proteína c-FLIP e a ativação das caspases efetoras (3,7 e 9), no citosol, pode ser bloqueada pelas proteínas XIAPs. A ativação das XIAPs pode ser bloqueada pela proteína SMAC/ DIABLO. A via intrínseca começa com a liberação do citocromo C, seguida da formação do apoptossomo, ativação e clivagem de substratos das caspases que levam a destruição da célula. Adaptado de Lavrik, 2010. 1.4.1. Citotoxicidade mediada por células NK

As células NK são componentes linfóides da imunidade inata reconhecidas por sua

capacidade de destruir células infectadas por patógenos intracelulares ou células transformadas.

Estas células possuem muitas características semelhantes aos linfócitos, bem como o mesmo

progenitor e em particular o mesmo mecanismo de destruição dos linfócitos T citotóxicos, porém

as células NK não podem produzir IL-2 (Moretta et al., 2002; Lanier et al., 2005).

O processo de reconhecimento de uma célula alterada ou infectada pela célula NK, é

muito complexo e envolve a interação de sinais provenientes de seus receptores. Isso implica na

ligação da célula NK com a célula alvo, interação entre os sinais inibidores e ativadores com os

Ligantes de morte Ativadores da via extrinseca

Ligante de morte Receptor de morte

Ativadores da via extrinseca: Irradiação, dano DNA, etc

Apoptossomo

Apoptose

14

ligantes disponíveis na superfície da célula alvo, que irá determinar se a célula NK se desprende

da célula alvo ou se continua aderida e responde (Lanier et al., 2005).

As células NK respondem à expressão alterada ou à ausência da expressão de moléculas

MHC de classe I clássicas ou não clássicas (“missing self”). Também respondem a sinais de

estresse celular, através do reconhecimento das moléculas de MHCI não clássicas MIC A e B

(“Inducing self”) (Poggi et al., 2007; Chavez et al., 2009).

Ao contrário dos linfócitos T e B, as células NK não possuem especificidade, mas

expressam uma série de receptores ativadores e inibidores, através do balanço entre as vias de

sinalização desencadeadas por esses receptores, as células NK serão ativadas ou inibidas (Pegram

et al., 2010) (Figura 9).

Estas células utilizam dois mecanismos principais para exercer sua função, ambos

dependentes de contato. O primeiro mecanismo consiste na a atividade de grânulos citotóxicos,

como a perforina, responsável principalmente pela formação de poros na membrana celular, e a

granzima, uma serina protease com especificidade para inúmeros substratos. Juntos, granzima e

perforina induzem a apoptose da célula alvo. Essa via ativa mecanismos de morte que operam

através da ativação de caspases, porém também podem induzir a morte celular na ausência das

mesmas (Figura 9). O segundo mecanismo envolve o receptor de morte Fas, expresso pelas

células alvo e seu ligante cognato FasL, expresso pelas células NK. A conexão receptor-ligante

resulta na morte celular através da ativação de caspases (Figuras 10 e 11).

Para contribuir com a primeira linha de defesa, as células NK estão sempre prontas para

atacar células infectadas ou malignas. Essa característica requer um controle fino, pois essas

células podem ser prejudiciais às células normais, quando ativadas inapropriadamente (Pegram et

al., 2010).

15

Figura 9: Interação de células NK com células alvo. Células normais são protegidas da morte pelas células NK quando os sinais inibitórios e estimulatórios estão balanceados no momento do reconhecimento da molécula de MHCI. No entanto, se a célula alvo perde a expressão dessa molécula, resultado de uma infecção ou transformação, os sinais derivados da célula alvo não sofrem inibição, pois, sem a expressão do MHC de classe I, não existe o sinal inibitório, resultando na lise da célula alvo (“missing – self”). A infecção e a transformação podem induzir um estímulo mais forte do que a inibição oferecida pelos receptores inibitórios, levando a morte da célula alvo (“inducing – self”). É possível que em muitas situações ambos os sinais “inducing” e “missing self” atuem simultaneamente, aumentando a capacidade dessas células de discriminar entre células normais ou células alteradas ou infectadas. Adaptado de Raulet, 2006.

Os receptores ativadores contêm o motivo ITAM em sua cauda citoplasmática. Quando

fosforilados, esses receptores recrutam proteínas sinalizadoras que contêm um domínio Src

associados. Os domínios SH2 são encontrados em diversas proteínas sinalizadoras intracelulares,

onde estão associados a diferentes tipos de domínios enzimáticos ou outros domínios. No caso

dos ITAMs, o domínio quinase Src, Syk ou ZAP 70, é responsável pela cascata de sinalização

que levará a degranulação e transcrição de genes de citocinas e quimiocinas.

Alguns receptores de ativação utilizam mecanismos alternativos, utilizando as proteínas

DAP-10 ou 12, cuja via de sinalização difere de uma para outra. DAP-10 se liga a outras

proteínas, ativando a cascata de sinalização pela via de PI3K, e a DAP-12 sinaliza através do

ITAM. A sinalização através de DAP-10 resulta na citotoxicidade, porém a sinalização através de

DAP-12 resulta em produção de citocinas e citotoxicidade (Pegram et al., 2010).

Céllula

NK

Céllula Normal

Céllula Alvo

Céllula Alvo

Reconhecimento “missing – self”

Reconhecimento “induced – self”

Proteção

Receptor

inibitório

MHC I

Receptor estimulatório

Iigante estímulório

Transformação

infecção Transformação

infecção MORTE MORTE

SEM MORTE

16

Por outro lado, os receptores inibidores contêm o motivo ITIM, em sua cauda

citoplasmática. Quando fosforilados, esses receptores recrutam proteínas sinalizadoras do tipo

fosfatase (Quadro1).

Quadro 1. Receptores ativadores e inibidores de células NK (Pegram et al., 2010)

Em células normais, o MHC de classe I é reconhecido por receptores inibidores, que

inibem os sinais dos receptores ativadores. Quando o MHC de classe I está alterado ou não pode

ser reconhecido, este estimula a ativação das células NK através de seus receptores ativadores.

A ativação das células NK leva à degranulação de perforina e granzima. A perforina tem a

função de formar poros na membrana celular, possibilitando a entrada das granzimas. Sua porção

C terminal é ativada através de íons cálcio; então, a perforina se ancora na membrana e, uma vez

ancorada esta começa a polimerizar, formando poros, e possibilitando a entrada de granzimas

(Figura 9).

As granzimas são divididas em: granzima A, B, C, K e M. A Granzima A foi descoberta

no ano de 1986, pelo grupo do pesquisador Jürg Tschopp (Jenne et al., 1988). Esta triptase possui

50 kD e tem atividade serina protease. Ainda não está claro como a Granzima A é transferida

para a célula alvo, porém a hipótese é de que esta se ligue a serglicina, um proteoglicano, para se

proteger da inativação por proteínas como a trombina III e a α2 microglobulina na célula alvo, o

que possibilita a sua entrada.

Além de induzir a apoptose, esta proteína também possui efeito pró-inflamatório e atua

interferindo na coagulação (Zohu et al., 2010)..

O efeito Dnase da Granzima A é devido a NM23H1, que tem como inibidor o complexo

SET. Quando NM23H1 é ativada pela Granzima A, medeia a clivagem de SET através da

ativação retrógrada da Dnase, por sua vez ativada por caspase através da clivagem de seu inibidor

ICAD. Após o carregamento com Granzima A, SET e NM23H1 são transferidas para o núcleo.

SET é degradada e NM23H1 é direcionado ao DNA. Estudos mostraram que o silenciamento de

Receptor Função Reconhecimento Domínio

KIR Ativador/inibidor HLA-clássico (A, B e C). DAP-12/ITAM/ITIM

CD-94/NKG2 Ativador/Inibidor HLA-não clássico (C e E) DAP-12/ITIM

NKG2D Ativador MIC-A e B DAP-10/ITAM

NCKs Ativador Vírus

17

NM23H1 leva a resistência a apoptose, enquanto o silenciamento de SET e APE1 atribui maior

sensibilidade à indução de apoptose da célula alvo (Zhou et al., 2010).

A Granzima B ativa diretamente a caspase 3, promovendo a fragmentação do DNA. Além

disso, ela também pode ativar BID, levando à liberação do citocromo c e, ativando a via

intrínseca da apoptose (Zhou et al., 2010).

Figura 10: Mecanismo de citotoxicidade mediada pela atividade de grânulos citotóxicos. Uma vez no interior da célula alvo, granzima-A ativa um complexo associado ao retículo endoplasmático, formado pela fosfoproteína 32 (pp32), proteína não metastática 23 homóloga 1 (NM23_H1), oncoproteína SET, grupo de alta mobilidade 2 (HMG-2) e a enzima endonuclease apurinica 1 (Ape1). O aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a queda no potencial de membrana levam à translocação do complexo SET/NM23_H1 para o núcleo celular. Assim, a granzima-A cliva SET, que ativa NM23_H1, uma endonuclease que fragmenta o DNA. Em conjunto, Granzima-B cliva BID, ou ativa caspase 3 diretamente, degradando o DNA. A proteína BID truncada causa permeabilidade da membrana externa da mitocôndria e a liberação do citocromo- C diminuindo a função mitocondrial. O citocromo C, induz a ativação da caspase 9, que aumenta o processo de apoptose pela ativação da caspase 3. Adaptado de Galán, 2009.

Célula Alvo

NucleoClivagem

Citocromo

Função mitocondrial

SET

RE

18

Figura 11: Mecanismo de citotoxicidade através da interação Fas-FasL. Algumas células NK expressam Fas e FasL. A ligação ao seu respectivo receptor dispara a cascata de ativação levando a célula alvo a apoptose. Adaptado de Smyth, 2002.

1.4.2. Citotoxicidade mediada por Linfócitos T

Os linfócitos T e B são componentes da resposta imune adaptativa. Diferentemente da

imunidade inata, a imunidade adaptativa apresenta grande especificidade pelo antígeno. Isso é

possível porque tanto as células T, quanto as células B, possuem receptores antígeno específicos,

o TCR e o BCR, respectivamente. Através do rearranjo gênico, esses receptores são capazes de

reconhecer uma enorme diversidade de antígenos.

Nas células T, o TCR compreende duas cadeias polipeptídicas denominadas cadeias de

receptor de células T α (TCR α) e cadeias β (TCR β). Esses heterodímeros tem sua estrutura

semelhante ao fragmento Fab da molécula de imunoglobulina e são responsáveis pelo

reconhecimento de antígenos pela maioria das células T. Existe também uma minoria de células

T que expressa em sua superfície as cadeias polipeptídicas γ (TCR γ) e δ (TCR δ), cujas

propriedades de reconhecimento de antígenos e função diferem das células expressando as

cadeias α e β (Janeway, 2010).

A maioria das células T reconhece os complexos MHC de classe I ou II ligados a

peptídeos intracelulares ou extracelulares, respectivamente. As células TCD4 reconhecem o

MHC de classe II, e as células TCD8 reconhecem o MHC de classe I. As células TCD4 estão

ligadas à resposta celular auxiliar, e podem polarizar para vários subtipos, o que irá depender do

seu estímulo preliminar. Já os linfócitos TCD8, têm a função de monitorar todas as células do

organismo,e estão preparados para destruir qualquer ameaça à integridade do hospedeiro. Desta

19

forma, protegem o organismo de células infectadas por vírus ou células malignas (Andersen et

al., 2006).

Os linfócitos T citotóxicos expressam a molécula CD8 em sua membrana, que não só é

responsável pelo reconhecimento antigênico, mas também pela iniciação da transdução do sinal

de ativação do linfócito. O peptídeo reconhecido através do TCR pode ter atividade agonista,

antagonista ou agonista parcial. Ligantes agonistas são complexos MCH- peptídeos que induzem

a transdução completa do sinal de ativação pelo TCR. Ao contrário, o efeito do antagonista é de

inibir a transdução do sinal via TCR. Quando o ligante é um agonista parcial, a resposta é

qualitativamente diferente da resposta ao agonista.

A ativação dos LTCs pode ser dividida em duas fases: a primeira fase ativa os linfócitos T

naive e os diferencia em células efetoras; na segunda fase, a célula efetora reconhece antígenos

presentes nas células alvo e desencadeia o processo de morte celular da mesma.

Essa diferenciação de células T efetoras requer ao menos três sinais sequenciais: 1- a

ligação ao TCR, 2- co-estímulo e 3- sinalização mediada pela IL-2. A expressão do receptor de

IL-2 só é possível mediante ao co-estímulo, o qual pode ser a interação entre as moléculas B7-1

(CD80) ou -2 (CD86) ou CTLA-4 com a molécula CD28. A ligação B7-CD28 resulta na ativação

do linfócito T, porém a ligação com CTLA-4 resulta na inibição desse linfócito (Andersen et al.,

2006).

O CD28 é constitutivamente expresso na superfície de células T; ao contrário, o CTLA-4

é regulado positivamente após a sua ativação. É importante ressaltar que o CTLA-4 tem maior

afinidade com a molécula CD28 do que o B7-1 ou -2. Outra molécula da família do CD28, o

ICOS, também pode ser induzida pela ativação de células T, e tem um papel importante na

regulação de células T ativadas (Andersen et al., 2006).

A alta variabilidade do TCR α:β não é suficiente para criar um receptor de superfície

completo, outras moléculas são necessárias para sua expressão na superfície celular. Estas são

proteínas de cadeias CD3γ, CD3δ e CD3, que juntas formam o complexo CD3. A reunião do

complexo CD3 com o heterodímero α:β o estabiliza, permitindo que o complexo seja transferido

para a membrana. A sinalização a partir do complexo se dá devido à presença do complexo CD3

e de um motivo de ativação semelhante ao ITAM. Quando o linfócito T CD8 é ativado, através

da ligação do ligante ao Fas, TNFR ou receptores de INF, a cascata de sinalização dispara a

ativação da apoptose através de ambas as vias de apoptose (Figura 11).

20

Figura 12: Ativação dos linfócitos T. A ligação de peptídeos imunogênicos ao TCR leva a fosforilação (círculos em preto e vermelho) de todos os ITAMS presentes no complexo CD3, recrutamento e/ou ativação de src quinases e finalmente a sua ativação completa. Adaptado de Andersen, 2006.

Embora haja um grande interesse na utilização das CTMs no TCTH, deve-se ter muita

cautela já que as CTMs tem o potencial não só de inibir a proliferação de linfócitos que reagem

contra os antígenos do hospedeiro como também de clones anti-tumorais, aumentando a chance

de recaída do paciente. Além disso, existem indícios de que as CTMs também inibem a atividade

citotóxica dos linfócitos, o que pode aumentar ainda mais os índices de recaída. Logo, avaliar as

moléculas produzidas pelas CTMs que induzem imunossupressão bem como avaliar se as CTMs

interferem na citotoxicidade torna-se fundamental para o uso mais apropriado desta terapia

celular no contexto do TCTH. Além disso, a divisão de laboratórios do CEMO já desenvolve uma

linha de pesquisa com CTMs, possui a infraestrutura necessária à realização deste trabalho e tem

um grande intercâmbio com a unidade clínica, sendo as amostras de MO e de sangue periférico

facilmente adquiridas.

21

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Investigar o potencial imunomodulador das CTMs provenientes de medula óssea sobre

células mononucleares citotóxicas contra células leucêmicas, bem como os mecanismos

envolvidos nesta possível inibição.

2.2. Objetivos Específicos

Avaliar se CTMs obtidas a partir da medula óssea de doadores saudáveis:

- Alteram a atividade citotóxica de células mononucleares de sangue periférico frente a células

leucêmicas da linhagem K562;

- Alteram a secreção/expressão de Fas L, bem como, a produção de IFNy e TNFα pelas células

citotóxicas;

- Alteram a degranulação de perforina e granzima pelas células citotóxicas;

22

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Amostra biológica: Serão utilizadas amostras de medula óssea e de sangue periférico de

doadores saudáveis do CEMO e do banco de sangue do Instituto Nacional de Câncer – RJ. Este

projeto foi aprovado pelo comitê de ética do INCA (Registro CEP n°034/06)

3.2. Cultura primária de CTMs obtidas de aspirado de medula óssea

Aspirados de medula óssea foram obtidos de indivíduos que se submeteram à doação de

medula óssea no Centro de Transplante de Medula Óssea do Instituto Nacional de Câncer – Rio

de Janeiro. Células mononucleares foram separadas por gradiente de centrifugação Histopaque®

1077 (Sigma) e plaqueadas na concentração de 2,0 x 105 células/cm2. As células foram cultivadas

a 37°C em atmosfera com 5% de CO2, em meio completo - DMEM baixa glicose (Gibco -

Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (HyClone), 2mM de L-

glutamina (Invitrogen), 50 unidades/ml de penicilina e 50 µg/ml de estreptomicina (Invitrogen).

Após 48 horas, células não aderentes foram retiradas e as células aderidas foram mantidas em

cultura até atingirem confluência de aproximadamente 80%. Atingida a confluência, as CTMs

foram tripsinizadas com tripsina 0,05% (Gibco – Invitrogen) e plaqueadas na concentração de

4x103 células/cm2. As CTMs foram mantidas em cultura trocando-se metade do volume de meio,

duas vezes por semana, até atingirem a passagem 3. Neste momento, as CTMs foram utilizadas

nos experimentos.

3.3. Cultura das linhagens tumorais K562 e HT29

As células da linhagem leucêmica K562 e de adenocarcinoma colorretal HT29, foram

cultivadas nas concentrações de 3x104/ml e 5x104/cm2, respectivamente, a 37°C em atmosfera

com 5% de CO2. As linhagens celulares foram cultivadas em RPMI 1640 (Sigma) suplementado

com 10% de soro fetal bovino inativado, 2mM de L-glutamina, 50 unidades/ml de penicilina e 50

µg/ml de estreptomicina. Após 48h, as células estavam prontas para utilização como células alvo

nos ensaios de citotoxicidade.

23

3.4. Obtenção de células mononucleares humanas a partir de sangue periférico

Foram colhidos 20 ml de sangue periférico de doadores saudáveis e após separação por gradiente

de centrifugação Histopaque® 1077, células mononucleares (células efetoras) foram

ressuspendidas na concentração de 5x106 células/ml em meio RPMI 1640 (Sigma) suplementado

com 10% de soro fetal bovino inativado, 2mM de L-glutamina, 50 unidades/ml de penicilina e 50

µg/ml de estreptomicina

3.5. Ensaio de citotoxicidade

CTMs provenientes de medula óssea ou células da linhagem de carcinoma de colón HT29

foram plaqueadas na concentração de 5x104 por poço em placas de 96 poços, 24 horas antes do

plaqueamento da co-cultura.. Células alvo K562 (106 células/ml) foram marcadas com CFSE

(3uM) e posteriormente ajustadas para a concentração de 2x105 células/ml. Células K562 (2x104)

foram plaqueadas na presença ou ausência de CTMs ou células HT29 em placas de 96 poços

junto com diferentes concentrações de células efetoras (razões alvo e efetor, 1:25, 1:12, 5 e

1:6,25) em um volume final de 200 µl, e incubadas por 24 horas. Após a incubação, as células em

suspenssão foram transferidas para tubos de citometria, marcadas com 3 µl de 7AAD (BD)

segundo instruções do fabricante, e imediatamente analisadas no citômetro de fluxo. As amostras

foram adquiridos no citômetro FACScan® (BD) e as análises foram feitas utilizando-se o

software CellQuest® (BD Biosciences). Em todas as amostras foram adquiridos 5.000 eventos

CFSE+, e o percentual de células viáveis, 7AAD -, foi observado (figura 13).

24

Figura 13: Estratégia de análise da citotoxicidade. (A) região contendo somente eventos CFSE+ foi selecionada. (B) Análise do perfil de células CFSE+no dot plot FSC x SSC. (C) Região contendo somente eventos 7AAD+ foi selecionada a partir do total de células contidas em R1 E R2.

3.6 Análise de citocinas, FasL, perforina e Granzima

CTMs provenientes de medula óssea ou células da linhagem de carcinoma de colón HT29

foram plaqueadas na razão de 5x104 por poço em placas de 96 poços, 24 horas antes do

plaqueamento da co-cultura. Foram plaqueadas 2x104 células alvo K562 na presença ou ausência

de CTMs em placas de 24 poços na razão de 1:25 células alvo : efetor, em um volume final de

1200 µL, e incubadas por 24 horas

Após o período de incubação foram adicionados 3 µl (1 µl /106 células) de brefeldina à

co-cultura, que permaneceu incubada por quatro horas. Em seguida, as células em suspensão

(alvo e efetoras) foram retiradas e distribuídas em tubos para citometria de fluxo na concentração

de 5x105 células totais/ml no volume final de 200 µl. A esta suspensão, foram adicionados 500 µl

de PBS e as células foram centrifugadas a 1.500 rpm durante 5 minutos. Ao término da

centrifugação, descartou-se o sobrenadante, e ao pellet de células foram adicionados 2,5 µl dos

anticorpos monoclonais anti-CD4 conjugado a isotiocianato de fluoresceina (FITC), anti-CD8

conjugado a ficoeritrina (PE), anti-CD3 conjugado à proteína peridinina-clorofila (PerCP) e anti-

(A) Células Totais

(B) R1 Células CFSE +(C) R1 e R2 (Células CFSE + na região R2 do dot plot de FSC X SSC)

25

CD56 conjugado a FITC e PE. Após 20 minutos à temperatura ambiente, as células foram fixadas

com formaldeído 1%.

Para análise de produção de citotcinas, as células foram permeabilizadas com tween 0,5%

para posterior marcação com os anticorpos anti-TNF-α (PE) e anti-INFγ (FITC), ou com seus

respectivos isotipos (vide quadro 2). Após incubação por 20 minutos, as células foram lavadas e

ressuspendidas em formaldeído 1%.

Quadro 2. Painel de marcação das células citotóxicas e citocinas INFγ e TNFα:

Para análise da produção de granulos de células TCD8+ e NK, células foram

permeabilizadas com tween 0,5% para posterior marcação com os anticorpos anti-Granzima-A

PE e anti-Perforina FITC, ou com seus respectivos isotipos (Quadro 3). Após incubação durante

20 minutos, as células foram fixadas com formaldeído 1%.

Quadro 3. Painel de marcação das células citotóxicas moléculas citototóxicas Granzima A e

Perforina:

Para análise da secreção de FasL pelas células citotóxicas, células foram permeabilizadas

com tween 0,5% para posterior marcação com os anticorpos antiFasL PE e com o respectivo

isotipo (Quadro 4). Após incubação durante 20 minutos, as células foram fixadas com

formaldeído 1%.

26

Quadro 4. Painel de marcação das células citotóxicas e molécula citotóxica FasL:

As amostras foram analisadas no citômetro FACScan BD (10.000 eventos totais) e

analisadas através do programa Summit versão 4.3 (Dako, EUA).

Para analisar o perfil de secreção de citocinas, expressão de receptores e liberação de

grânulos citotóxicos apenas em células TCD8+ e NK, foi utilizada a seguinte estratégia de

análise. A região de células mononucleares R1, excluindo debris e células inerentes ao processo

como K562 e granulócitos, que não eram os alvos do estudo. Após o estabelecimento dessa

região, outras regiões contendo células CD8+/CD3+ (A2); CD56+CD3+ (B2); CD4- CD3+ (C2)

foram selecionadas. Nestas, foram analisadas a interseção dessas células com os marcadores de

interesse (A3, B3, C3).

27

Figura 14: Estratégia de análise dos mediadores da citotoxicidade. A1 B1 C1: células totais. A2 linfócitos TCD8+CD3+, B2 CD56+CD3-, C2 TCD4-CD3+. A3 Linfócitos TCD8 positivos para INF ϒ, B3 células CD56+ positivas para TNFα, C3 células TCD4- positivas para TNFα.

SS

C

FSC

CD

3

CD4C

D4

TNF

SS

C

FSCC

D3

CD8

INF

CD8

SS

C

FSC

CD

3

CD56

CD

56

TNF

SS

C

FSC

CD

3

CD4C

D4

TNF

SS

C

FSC

CD

3

CD4C

D4

TNF

SS

C

FSCC

D3

CD8

INF

CD8

SS

C

FSCC

D3

CD8

INF

CD8

SS

C

FSC

CD

3

CD56

CD

56

TNF

SS

C

FSC

CD

3

CD56

CD

56

TNF

28

3.7. Anticorpos

Os anticorpos utilizados para caracterização fenotípicas das células citotóxicas e moléculas

envolvidas na citotoxicidade estão listados nas tabelas abaixo (1-3).

Tabela 1: Anticorpos conjugados a fluorocromos: Antígeno Clone Fabricante Fluorocromo

Perforina DG9 BD FITC

Granzima eBioGrB BD PE

INF Mab 11 BD FITC

TNF 4S.B3 BD PE

CD56 NCAM 16.2 BD PE/FITIC

CD8 SK715-18 BD PE

CD3 SK3 BD PERCP

CD4 Leu 14 2a BD FITC

Tabela 2: Anticorpo primário: Antígeno Fabricante Hospedeiro

FasL Biolegend Jumento

Tabela 3: Anticorpo secundário: Descrição Fabricante Fluorocromo

Jumento anti camundongo Biolegend PE

FasL MFL-3 Biolegend

3.7. Estatística

Foram utilizados teste t de Student, One-way ANOVA ou Two-way ANOVA. Foram

considerados estatisticamente significativos experimentos cujo P Value foi menor que 0.05 após a

análise de, no mínimo, três experimentos independentes.

29

4. RESULTADOS

4.1. As CTMs inibem a atividade citotóxica de CMNs contra células leucêmicas

Com o objetivo de esclarecer se as CTMs interferem com a atividade citotóxica mediada

por linfócitos, CMNs foram co-cultivadas com células da linhagem K562 na presença e na

ausência de CTMs. Após 24h de incubação, foi observado um aumento na viabilidade das células

K562 na presença das CTMs (Figura 15).

Figura 15: Células CMNs foram co-cultivadas com células da linhagem K562 (2x10 4), previamente marcadas com CFSE, na presença ou ausência de CTMs. Após o período de 24h de incubação, as células foram recuperadas, marcadas com 7AAD e a citotoxicidade avaliada através da citometria de fluxo. Os resultados estão expressos na forma de média ± desvio padrão do percentual de células CFSE+ 7AAD+, para 5 experimentos independentes. *p<0,05, **p<0,01.

Citotoxicidade

0

25

50

75

100

CTL 1:6,25 1:12,5 1:25

Alvo:Efetor

C/CTM

S/CTM

**

*

% d

e cé

lula

s vi

ávei

s

30

4.2. O potencial inibidor da citotoxicidade é inerente às CTMs

Para nos certificarmos de que a inibição da citotoxicidade é devido a um mecanismo

inerente às CTMs, substituímos as mesmas pelas células da linhagem tumoral HT29. Estas

possuem alta atividade metabólica e poderiam diminuir a citotoxicidade de CMNs através da

indução de um estado de privação de nutrientes, de forma inespecífica

O efeito inibitório só pode ser observado na presença de CTMs, enquanto que na presença

das células da linhagem tumoral HT29 não houve redução significativa (Figura 16).

Estes resultados mostram que as CTMs inibem, de fato, a citotoxicidade mediada pelas

CMNs.

Figura 16: Células CMNs (5x105 ) foram co-cultivadas com células da linhagem K562 (2x10 4), previamente marcadas com CFSE, na presença ou ausência de CTMs ou HT29. Após o período de 24h de incubação as células foram recuperadas marcadas com 7AAD, e a citotoxicidade avaliada através da citometria de fluxo. Os resultados estão expressos na forma de média ± desvio padrão do percentual de células CFSE+ 7AAD+, para 4 experimentos independentes. **p < 0,01.

K562

Co-cultu

ra

+CTM

+HT29

0

50

100

150

**ns

Cél

ulas

viá

veis

(%

)

31

4.3. A inibição da citotoxicidade pelas CTMs não envolve a modulação de grânulos

citotóxicos

Para melhor compreender o processo de inibição da citotoxicidade mediada por CMNs,

pelas CTMs, diferentes mecanismos mediados por células citotóxicas, foram avaliados.

A perforina é exclusivamente encontrada nos grânulos citoplasmáticos de células

citotóxicas, e é responsável pela formação de poros na superfície celular. Isso permite a entrada

da Granzima na célula alvo, o que levará a apoptose.

Para avaliar a secreção de grânulos citotóxicos como Granzima e Perforina, CMNs foram

co-cultivadas com células da linhagem K562 na presença ou ausência de CTMs. Após incubação

de 24h, as células foram marcadas com os anticorpos monoclonais anti-CD3, anti-CD56, anti-

CD8, anti-Granzima A, anti-Perforina (Figura 17).

A atuação supressora das CTMs pareceu não afetar o mecanismo de citotoxicidade

envolvendo grânulos citotóxicos. Estes resultados sugerem que as CTMs não inibem tal

mecanismo, uma vez que não houve diferença entre as co-culturas tratadas ou não tratadas com

CTMs.

A

B

32

Figura 17: A inibição da citotoxicidade pelas CTMs não envolve a modulação dos grânulos citotóxicos. Células da linhagem K562 (2x10 4), foram co-cultivadas com células mononucleares (5x105 ) na ausência ou presença de CTMs durante 24h. Após o período de incubação, as células foram marcadas com anticorpos monoclonais anti-CD3, anti- CD8, anti- CD56, anti-Granzima A, anti-Perforina, e analisadas no citômetro de fluxo. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão para cinco experimentos independentes. A e B: secreção de perforina e granzima por células CD56+ CD3- (p=0,2 e 0,1). C e D: secreção de perforina e granzima por células CD8+ CD3+ (p= 0,9). ∆MFI: variação da média de intensidade de fluorescência

C

D

Legenda histograma Ctrl isotipo (Co-cult.) Ctrl isotipo (+CTMs) mAb especiífico (Co-cult.) mAb especifico (+CTMs)

33

4.4. As CTMs não inibem a secreção de citocinas pelas células citotóxicas

A citocina INFγ desempenha vários papéis no sistema imune. Uma de suas funções é

aumentar a expressão da molécula de MHC classe I pelas células alvo, facilitando seu

reconhecimento pelas células efetoras. Já o TNFα pode desencadear o processo de apoptose via

caspases através da ligação ao seu receptor TNFR

O mecanismo de citotoxicidade é mediado, dentre outros fatores, pelo aumento da

secreção destas citocinas. Portanto, a possibilidade da secreção de INFγ e TNFα estar diminuída

na presença das CTMs foi investigada.

Foi observada uma diminuição sutil na secreção de TNFα e INF γ pelas células NK

(CD56+ CD3-). Por outro lado, um aumento sutil da secreção de TNFα pelas células T CD8

(CD8+ CD3+) foi visto. A secreção de INFγ nas células TCD8 não apresentou diferença na

presença de CTMs (Figura 18).

4

A

B

34

Figura 18: As CTMs não inibem de forma significativa a secreção de citocinas pelas células citotóxicas. Células da linhagem K562 (2x104) foram co-cultivadas com células mononucleares (5x105 ) na ausência ou presença de CTMs durante 24h. Após o período de incubação, as células foram marcadas com anticorpos monoclonais anti-CD3, anti- CD56 (A e B), anti- CD8 (C e D), anti-INFу (B e D), anti-TNFα (A e C) e analisados no citômetro de fluxo. A e B: secreção de TNF α e INF γ por células CD56+ CD3- (p=0,3). C e D: secreção de TNF α e INF γ por células CD8+ CD3+ (p= 0,6 e 0,2). Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão para cinco experimentos independentes. ∆MFI: variação da média de intensidade de fluorescência

C

D

Legenda histograma Ctrl isotipo (Co-cult.) Ctrl isotipo (+CTMs) mAb especiífico (Co-cult.)

mAb especifico (+CTMs)

35

4.5. As CTMs podem inibir a citotoxicidade de CMNs através da regulação da via Fas Fas-

L

Dentre os diversos mecanismos que envolvem a citotoxicidade está a via Faz-FasL, para avaliar

possibilidade de as CTMs serem capazes de interferir nesta via, availiamos a secreção de FasL

pelas células efetoras, na presença ou ausência das CTMs. Observou-se que a secreção de FasL

foi diminuída na presença de CTMs, em ambos os tipos celulares NK ou TCD8. Embora a

inibição não tenha sido estatisticamente significativa, este resultado sugere a via de Fas Fas-L

como um dos alvos do mecanismo de inibição da citotoxicidade de CMNs pelas CTMs (Figura

19).

Figura 19: As CTMs podem inibir a citotoxicidade através da via Fas/Fas-L: Células da linhagem K562 (2x104 ) foram co-cultivadas com células mononucleares (5x105 ) na ausência ou presença de CTMs durante 24h. Após o período de incubação, as células foram marcadas com anticorpos monoclonais anti-CD3, anti- CD8, anti- CD56, anti-FasL, e analisadas no citômetro de fluxo. A : secreção de FasL por células CD56+ CD3- (p=0,1). C e D: secreção de FasL por células CD8+ CD3+ (p= 0,3). Os resultados estão expressos na forma de média ± desvio padrão para cinco experimentos independentes. ∆MFI: variação da média de intensidade de fluorescência

A

B

Legenda histograma Ctrl isotipo (Co-cult.) Ctrl isotipo (+CTMs) mAb especiífico (Co-cult.) mAb especifico (+CTMs)

36

5. DISCUSSÃO

As CTMs são células multipotentes que atraíram o interesse da comunidade científica não só

pelas características inerentes as células tronco adultas, como a capacidade de auto renovação e

diferenciação em diversos tecidos (Giordano et al., 2007), mas também pelo fato de possuírem

baixa capacidade de estimular respostas imunes (Le Blanc et al., 2003). Além disso, as CTMs

podem ser isoladas de diversos tecidos (Murphy et al., 2004; Tolar et al., 2010), e são de fácil

cultivo e expansão. Em conjunto, essas características apontam essas células como promissoras

no tratamento de diversas doenças.

Diversos trabalhos têm demonstrado uma inibição global das CTMs, não seletiva, sobre as

células do sistema imune. No contexto do TCTH, é possível que este efeito inespecífico seja

capaz de inibir não só linfócitos do doador que reagem contra células do hospedeiro saudáveis,

causando DECH, como também linfócitos do doador que atuam eliminando eventuais células

leucêmicas que sobreviveram ao regime de condicionamento pré TCTH, efeito conhecido na

clínica como enxerto contra leucemia (ECL).

Neste sentido, Ning et al., com o objetivo de avaliar o potenncial terapeutico das CTMs,

conduziu um estudo clínico utilizando dois grupos de pacientes tratados ou não com CTMs,

intravenoso. O grupo relatou que a infusão de CTMs para contenção da DECH resultou no

aumento da recaída da doença de base pós TCTH. Embora o tratamento adicional com CTMs

tenha diminuído a incidência de DECH aguda, cerca de 60% dos pacientes tratados com CTMs

recaíram contra 20% do grupo controle.(Ning et al., 2008).

No entanto, Liu et al. não observaram o mesmo efeito (Liu et al., 2011). Com um estudo

clínico abrangendo dois grupos distintos de pacientes, tratados ou não com CTMs. Neste estudo,

Liu teve como objetivo determinar se o tratamento com CTMs era seguro, se melhora a pega

medular, se diminui a incidência de DECH e se pacientes tratados com CTMs recaíam da doença.

Eles não observaram variaçoes entre os dois grupos, porém foi utilizada um concentração muito

baixa de CTMs neste estudo, o que pode ter impactado nos seus resultados.

Esta discrepância também é observada em modelos in vitro.

Karlson et al., objetivou avaliar se as CTMs possuem especificidade em seu efeito

imunossupressor, uma vez que as infecções são uma das maiores causas de co-morbidade pós

TCTH alogenico, particularmente pelo tratamento para GVHD que requer altas doses de

imunossupressores. Dois importantes agentes patogênicos são o citomegalovírus (CMV) e o

37

Epstein-Barr vírus (EBV). Entre 40% e 70% dos pacientes submetidos ao TCTH são CMV-soro

positivos ou o doador é CMV-soro positivo. A reativação do vírus pode levar ao desenvolvimento

de doenças linfoproliferativas, ocorrendo em torno de 11 a 26 % dos pacientes submetidos ao

TCTH depletados de células T. Neste estudo, utilizando um ensaio de citotoxicidade utilizando 51Cr e co-cultivo de lifócitos específicos e linfócitos pulsados com alo antígenos e antígenos

CMV na presença ou ausência de 10% de CTMs, observaram que as CTMs não foram capazer de

inibir a atividade citotóxica de linfócitos antígeno específicos. (Karlson et al., 2008)

Spaggiari et al., com a finalidade de avaliar o efeito das CTMs sobre as células NK,

mostrou que as CTMs inibem a sua atividade citotóxica contra diversas linhagens de células

tumorais. Utilizando o ensaio de citotoxicidade com 51Cr e o co-cultivo de células NK

purificadas, na presença ou ausência de 10% de CTMs. (Spaggiari et al., 2007)

Devido aos diferentes resultados obtidos por diferentres grupos, o papel das CTMs na

citotoxicidade mediada por linfócitos, bem como sua atuação, ainda precisam ser elucidados.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel das CTMs na citotoxicidade mediada por

linfócitos e células NK, bem como os mecanismos por trás dessa interação. Diversos estudos

foram conduzidos nesse sentido, mas os resultados obtidos por esses grupos foram controversos.

Pontian et al., observaram que as CTMs inibiram a citotoxicidade mediada por células NK e

linfócitos T, utilizando um modelo de CML (cultura mista de linfócitos), assim como Rasmusson

et al., (Pontian et al., 2003; Rasmusson et al., 2003). Outros grupos utilizaram um modelo de

citotoxicidade de células NK estimuladas contra linhagens celulares leucêmicas ou provenientes

de melanoma e obtiveram resultados controversos (Sotiropoulou et al., 2006; Spaggiari et al.,

2007). Finalmente Karlson et al. utilizaram células infectadas com peptídeos virais, e não

observaram inibição da citotoxicidade (Karlson et al., 2008; Ramassamy et al., 2008). Vale

ressaltar que nenhum dos grupos acima citados se propôs a desvendar o mecanismo de inibição

exercida pelas CTMs.

Em nosso estudo, utilizamos células da linhagem leucêmica K562. Escolhemos essa

linhagem, uma vez que nosso objetivo foi elucidar o mecanismo inibitório da citotoxicidade

contra células leucêmicas pelas CTMs. Além disso, essa linhagem foi utilizada em alguns

estudos. (Sotiropoulou et al., 2006)

Cultivamos as células da linhagem K562 com CMNs de doadores saudáveis, na presença

ou ausência de CTMs, e avaliamos a sua viabilidade. Dessa forma, mostramos que na presença

38

das CTMs houve um aumento na viabilidade das células K562 entre 25 e 50%. Para

confirmarmos que o efeito inibitório não se deu em decorrência da privação de nutrientes,

possivelmente ocasionada pela presença de CTMs, conduzimos um ensaio de citotoxicidade

substituindo as CTMs pela linhagem celular HT29 de câncer de colón retal, altamente

metabólicas. Pudemos observar que o efeito inibitório é de fato devido a um mecanismo inerente

as CTMs, uma vez que na presença das células da linhagem tumoral HT29 não houve inibição

significativa. As CTMs não interferem com o mecanismo de citotoxicidade envolvendo grânulos

produzidos pelas células citotóxicas T CD8 e NK, uma vez que não houve diferença na produção

de Granzima e Perforina entre o grupo controle e o grupo cultivado na presença de CTM.

Ribeiro et al observaram em um estudo de comparação da atividade de imunossupressão

utilizando CTMs oriundas de diferentes tecidos, que as CTMs diminuíram além de perforina a

secreção de TNFα em células NK. A secreção de TNFα e INFγ também estão relacionadas com a

citotoxicidade uma vez que TNF α pode induzir a morte celular diretamente através, da ligação

com seu receptor cognato e INFγ induz o aumento da expressão da molécula de MHC de classe I

pelas células alvo, aumentando a sua chance de reconhecimento pelas células citotóxicas. Em

relação às células TCD8, nossos resultados mostram um aumento na secreção de TNFα, porém

nenhuma diferença foi observada em relação a secreção de INFγ. Em relação as células NK,

observamos uma diminuição na secreção de TNFα e INFγ. Entretanto, cabe notar, que estes

dados não tiveram significância estatística. A diminuição da secreção de TNFα e INFγ pelas

células NK na presença das CTMs, sugere que este seja um possível alvo da inibição exercida

pelas CTMs.

Finalmente, o receptor de morte Fas é um membro da família de receptores TNF, sendo

um importante mediador na citotoxicidade, pois sua ativação leva a apoptose. Em nosso estudo

pudemos observar que a secreção de FasL foi inibida em ambos os tipos celulares NK ou TCD8,

embora não tenha sido estatisticamente significativa essa inibição. Estes dados sugerem que esta

via esteja envolvida no mecanismo de inibição da citotoxicidade pelas CTMs. Embora nossa

hipótese tenha sido avaliar a interferência das CTMs na secreção desta molécula pelas células

citotóxicas, alguns grupos vêm relatando a capacidade das CTMs em induzir a apoptose de

linfócitos através da ligação do FasL (CTMs) ao Fas expresso nos linfócitos T (Akyiama et al.,

2012; Murphy et al., 2012).

Em resumo, nossos dados revelaram que as CTMs protegem as células da linhagem

leucêmica K562 da citotoxicidade, uma vez que observamos um aumento na viabilidade das

39

mesmas, quando co – cultivadas com CMNs na presença de CTMs. Esse resultado nos mostrou

que a utilização dessas células para fins terapêuticos requer mais estudos, não somente na área do

TCTH, mas também no que concerne tratamentos de imunossupressão envolvendo doenças

tumorais, pois ainda não está claro se estas células auxiliam na progressão tumoral ou no seu

cerceamento (Sasser et al., 2007; Atsuta et al., 2013).

No que diz respeito ao TCTH, ainda que a DECH seja a co-morbidade mais desenvolvida

por pacientes que se submetem a esse procedimento, a maior taxa de óbitos ainda é a recaída da

doença. Assim, entender como funcionam os mecanismos de imunossupressão exercidos pelas

CTMs se torna fundamental.

40

6. CONCLUSÃO

Com base nos resultados mostrados nesse trabalho, concluímos:

� As CTMs inibem a citotoxicidade mediada pelas células por células mononucleares de

sangue periférico contra células da linhagem leucêmica K562.

� A inibição da citotoxicidade não parece ocorrer através da modulação de grânulos

citotóxicos, Granzima A e Perforina.

� As CTMs diminuíram a secreção da citocina pró-inflamatória TNFα, por células NK e

TCD8 +.

� As CTM diminuíram a secreção da citocina pró-inflamatória INF γ somente em células

NK.

� As CTMs diminuíram a secreção de FasL por ambas células citotóxicas estudadas.

41

7. BIBLIOGRAFIA

Andersen M. H., Schrama D. Cytotoxic T Cells. Journal of investigative Dermatology. 2006, 126: 32-41.

Akiyama K., Chen C., Wang D., Xu X., Qu C., Yamaza T., Cai T., Chen W., Sun L., Shi S. Mesenchymal-Stem-Cell-Induced Immunoregulation Involves FAS-Ligand-/FAS-Mediated T Cell Apoptosis. Cell press. 2012; 10: 544–555.

Alderson M., Lynch H. Fas Ligand Mediates Activation-induced Cell Death in Human T Lymphocytes. J. Exp. Med. 1995; 181: 71-77.

Atsuta I. Mesenchymal stem cells inhibit multiple myeloma cells via the Fas/Fas ligand pathway. Stem cell research & therapy. 2013; 4: 111.

Bacigalupo A. Management Of Acute Graft-Versus-Host Disease. Br. J. Haematol. 2007; 137: 87-98.

Barda-Saad M, Rozenszajn LA, Globerson A. Selective Adhesion Of Immature Thymocytes To Bone Marrow Stromal Cells: Relevance To T Cell Lymphopoiesis. Exp. Hematol. 1996; 24: 386-91.

Bartholomew A, Sturgeon C, Siatskas M. Mesenchymal Stem Cells Suppress Lymphocyte Proliferation In Vitro And Prolong Skin Graft Survival In Vivo. Exp. Hematol. 2002; 30:42-8.

Barry M, Bleackley C. Cytotoxic T lymphocytes:all roads lead to death. Nature. 2002; 2: 401-409.

Berenson J., Andrews G., Bensinger I., Kalamasz D., Knitter G., Buckner D., Bernstein D. Antigen CD34+ marrow cells engraft lethally irradiated baboons. The Journal of clinical investigation. 1988; 81: 951-955.

Burger J A., Peled A. CXCR4 antagonists: targeting the microenvironment in leukemia and other cancers. Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K. 2009, 23: 43-52.

Chávez-Galán L1, Arenas-Del Angel MC1, Zenteno E2, Chávez R2 and Lascurain R Cell Death Mechanisms Induced by Cytotoxic Lymphocytes. Cellular & Molecular Immunology. 2009; 6: 15-25.

Cheng L, Qasba P, Vanguri P. Human Mesenchymal Stem Cells Support Megakaryocyte And Pro-Platelet Formation From Cd34(+) Hematopoietic Progenitor Cells. J. Cell Physiol. 2000; 184: 58-69.

Deans RJ, Moseley AB. Mesenchymal Stem Cells: Biology And Potential Clinical Uses. Exp. Hematol. 2000; 28: 875-84.

42

Jenne D. E., Tschopp J. Granzymes, a Family of Serine Proteases Released from Granules of Cytolytic T Lymphocytes upon T Cell Receptor Stimulation. Immunological Reviews. 1988; 103: 53-71.

Di Nicola M, Carlo-Stella C, Magni M. Human Bone Marrow Stromal Cells Suppress T-Lymphocyte Proliferation Induced By Cellular Or Nonspecific Mitogenic Stimuli. Blood. 2002; 99: 3838-43.

DiPersio J., Stadtmauer E., Nademanee A., Micallef I., Stiff P., Kaufman J., Maziarz R., Hosing C. Fr??ehauf S., Horwitz M., Cooper D., Bridger G., Calandra G. Plerixafor and G-CSF versus placebo and G-CSF to mobilize hematopoietic stem cells for autologous stem cell transplantation in patients with multiple myeloma. Blood. 2009; 113: 5720-5726.

Dominici M, Le Blanc K, Mueller I. Minimal Criteria For Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society For Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 2006; 8: 315-7.

Doctor Jones UK on line, immunology tutorial. The Major Histocompatibility Complex. Disponível em: http://doctor-jones.co.uk/Immunology/Tutorial/The%20Major%20Histocompatibility%20Complex.htm. Acesso em Dezembro 2013.

Du Rocher, B. Propriedade Imunomodulatória das células estromais de medula óssea: Envolvimento de monócitos e fatores solúveis. 126 f. Tese de doutotado (Em oncologia) – INCa. Rio de janeiro, 2013.

Fan Z., Beresford P., Zhang D., Xu1 Z., Novina C.,Yoshida A., Pommier Y., Lieberman J. Cleaving the oxidative repair protein Ape1 enhances cell death mediated by granzyme A. Nature Immunology. 2003; 4: 145-153.

Friedenstein AJ, Piatetzky-Shapiro II, Petrakova KV. Osteogenesis In Transplants Of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 1966; 16: 381-90.

Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI. Heterotopic Of Bone Marrow.Analysis Of Precursor Cells For Osteogenic And Hematopoietic Tissues. Transplantation. 1968; 6: 230-47.

de Saint Basile G., Ménasché G. Fischer A. Molecular mechanisms of biogenesis and exocytosis of cytotoxic granules. Nature reviews. Immunology. 2010, 10: 568-79

Giordano A., Galderisi U., Marino I. From the Laboratory Bench to the Patient’s Bedside: An Update on Clinical Trials With Mesenchymal Stem Cells. J. Cell. Physiol. 2007, 211: 27–35.

Green D. Fas Bim Boom! Immunity preview. 2008

43

Gnecchi M, He H, Liang OD. Paracrine Action Accounts For Marked Protection Of Ischemic Heart By Akt-Modified Mesenchymal Stem Cells. Nat Med. 2005; 11: 367-8.

Godfrey W., Spoden D., Ge Y., Baker S., Liu B., Levine B., June C., Blazar B., Porter S. Cord blood CD4CD25-derived T regulatory cell lines express FoxP3 proteinand manifest potent suppressor function. Blood. 2005 105: 750-758.

Gonda T.,Varro A.,Wang C.,Tycko B. Molecular biology of cancer-associated fibroblasts: can these cells be targeted in anti-cancer therapy? Seminars in cell & developmental biology. 2010 21: 2-10.

Han P., Hodge G., Story C., Xu X. Phenotypic analysis of functional T-lymphocyte subtypes and natural killer cells in human cord blood: relevance to umbilical cord blood transplantation. Br J Haematol. 1995; 89: 733-740.

Hill GR, Ferrara JL. The primacy of the gastrointestinal tract as a target organ of acute graft-versus-host disease: rationale for the use of cytokine shields in allogeneic bone marrow transplantation. Blood 2000; 95: 2754–2759.

Horwitz EM, Le Blanc K, Dominici M. The International Society For Cellular Therapy. Clarification Of The Nomenclature For Msc: The International Society For Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 2005; 7: 393-5.

Jaksch M, Mattsson J. The Pathophysiology Of Acute Graft-Versus-Host Disease. Scand J Immunol. 2005; 61: 398-409.

Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik M. Immunobiology 6a Edição.

Javazon EH, Beggs KJ, Flake AW. Mesenchymal Stem Cells: Paradoxes Of Passaging. Exp Hematol. 2004; 32: 414-25.

Jenq R. R., van den Brink M. R M. Allogeneic haematopoietic stem cell transplantation: individualized stem cell and immune therapy of cancer. Nature reviews. Cancer. 2010, 10: 213-21.

Karlson H., Samarasinghe S., Ball L., Sundberg B.,Lankerster A., Dazzi F., Uzel M., Rao K., Veys Paul, Le Banc K., Ringdén O., Amrolia J. Mesenchymal stem cells xert differential effects on alloantigen and virus-spesific T cell responses. 2008, 112: 532-541.

Kierney P.C., Dorshkind K. B Lymphocytes precursors and myeloid projenitor survive in diffusion chamber cultures but B cell diferenciation requires close association with stromal cells 1987 70: 1418-1424.

Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS. Local Delivery Of Marrow-Derived Stromal Cells Augments Collateral Perfusion Through Paracrine Mechanisms. Circulation. 2004; 109: 1543-9.

44

Kopen GC, Prockop DJ, Phinney DG. Marrow Stromal Cells Migrate Throughout Forebrain And Cerebellum, And They Differentiate Into Astrocytes After Injection Into Neonatal Mouse Brains. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96: 10711-6.

klopp A., Gupta A., Spaeth E., Andreeff M., Marini F. Concise Review: Dissecting a Discrepancy in the Literature: Do Mesenchymal Stem Cells Support or Suppress Tumor Growth? Stem Cells 2011; 29: 11–19.

Korakaya H. Breast cancer stem cells, cytokine networks,and the tumor microenvironment. J Clin Invest. 2011; 121: 3804–3809.

Knudtzon S. In vitro growth of granulocytic colonies from circulating cells in human cord blood. Blood. 1974; 43: 357-361

Kumar L. Haematopoietic Stem Cell Transplantation: Current Status. Natl Med J India. 2007; 20: 128-37.

Lanier L. NK cell recognition. Annual review of immunology. 2005; 23: 225-74.

Lavrik I. N. Systems biology of apoptosis signaling networks. Current opinion in biotechnology.

2010; 21: 551-5.

Lechler R, Batchelor R, Lombardi G. The Relationship Between Mhc Restricted And Allospecific T Cell Recognition. Immunol. Lett. 1991; 29: 41-50.

Lee ST, Jang JH, Cheong JW. Treatment of high-risk acute myelogenous leukaemia by myeloablative chemoradiotherapy followed by co-infusion of T cell-depleted haematopoietic stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells from a related donor with one fully mismatched human leucocyte antigen haplotype. Br. J. Haematol. 2002; 118: 1128-31.

Le Blanc K.; Tammik L.; Sundberg B.; Haynesworth E.; Ringdén O. Mesenchymal Stem Cell inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major Histocompatibility complex. Scandinavian Journal of Immunology 2003; 57: 11-20.

Le Blanc K., Rasmusson I., Sundberg B., Götherström C., Hassan M., Uzunel M., Ringdé O. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Research letters 2004; 363: 1439-1441.

Liu K, Chen Y, Zeng Y, Xu L, Liu D, Chen H, Zhang X, Han W, Wang Y, Zhao T, Wang J, Wang J, Han Q, Zhao C, Huang X. Coinfusion of Mesenchymal Stromal Cells Facilitates Platelet Recovery Without Increasing Leukemia Recurrence in Haploidentical Hematopoietic Stem Cell Transplantation: A Randomized, Controlled Clinical Study. Stem cell 2011; 10: 1679-85.

Mehra NK e Kaur G. MHC-Based Vaccination Approaches: Progress AndPerspectives. Expert Rev Mol Med. 2003;5:1-17.

45

Moretta L., Biassoni R., Bottino C., Cantoni C., Pende D., Mingari M. C., Moretta A. Human NK cells and their receptors. Microbes and infection / Institut Pasteur. 2002, 4: 1539-44.

Molineux G., Pojda Z., Hampson N., Lord I., Dexter M. Transplantation potential of peripheral blood stem cells induced by granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 1990; 76: 2153-2158.

Murphy W., Nolta J. Autoimmune T Cells Lured to a FASLWeb of Death by MSCs. Stem cell. 2012; 10: 485-487.

National Institute of Cancer (NCI), childhood hematopoiétic cell transpalntation. HLA Matching and Hematopoietic Stem Cell Sources. Disponível em: http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/childHCT/HealthProfessional/page3. Acesso em Dezembro 2013.

Ning H, Yang F, Jiang M, Hu L, Feng K, Zhang J, Yu Z, Li B, Xu C, Li Y, Wang J, Hu J, Lou X and Chen H. The correlation between cotransplantation of mesenchymal stem cells and higher recurrence rate in hematologic malignancy patients: outcome of a pilot clinical study. Leukemia. 2008; 22: 593–599

Owen M., Friendstein J. A. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Foundation symposium. 1988, 136: 42-60.

Prockop D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms 2009; 17: 939–946.

Panagota A., Perez S., Gritzapis A., Constantin N. Interaction Between Human Mesenchymal Stem Cells and Natural Killer cells. Stem cells 2006; 24: 74-85.

Pedemonte E, Benvenuto F, Casazza S. The Molecular Signature Of Therapeutic Mesenchymal Stem Cells Exposes The Architecture Of The Hematopoietic Stem Cell Niche Synapse. Bmc Genomics. 2007; 8:65.

Pegram H. J, Andrews D.M., Smyth M.J., Darcy P.K., Kershaw M. H. Activating and inhibitory receptors of natural killer cells. Immunology and cell biology. 2010; 1-9.

Petersdorf EW, Gooley TA, Anasetti C. Optimizing Outcome After Unrelated Marrow Transplantation By Comprehensive Matching Of Hla Class I And Ii Alleles In The Donor And Recipient. Blood 1998; 92: 3515-3520.

Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC. Multilineage Potential Of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 1999; 284: 143-7.

Poggi A., Prevosto C., Zancolli M., Canevali P., Musso A., Zocchi M. NKG2D and Natural Cytotoxicity Receptors Are Involved in Natural Killer Cell Interaction with Self-Antigen

Presenting Cells and Stromal Cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007, 1109: 47–57.

46

Pointian J., Aviv H., Ponzio N., Harrison J., Rameshwar P. Veto Like activity of mesenchymal stem cells: Functional discrimination between cellular responses to alloantigens and recall antigens. The Journal of Immunology 2003; 171: 3426-3424.

Ramassamy R., Tong C., Seow H., Vidyadaran S., Dazzi F. The immunossupresive effecs of human bone marrow-derived mesenchymal stem cell target cell proliferation but not its effectors funcion. Cellular Immunology 2008; 251: 131-136

Rasmusson I., Ringdén O., Sundeberg B., Le Blanc L. Mesenchymal stem cells inhibit the formation of cytotoxic T lymphocytes or Natural Killer cells. Transplantation 2003; 76: 1208-1213.

Raulet D. H., Vance R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nature reviews. Immunology. 2006; 6: 520-531.

Ribeiro A., Laranjeira P., Mendes S., Velada I., Leite C., Andrade3 P., Santos F., Henriques A.,

Grãos M.,. Cardoso C. M. P, Martinho A.,. Pais M.L, Silva C. L., Cabral J., Trindade H., Paiva

A. Mesenchymal stem cells from umbilical cord matrix, adipose tissue and bone marrow exhibit

different capability to suppress peripheral blood B, natural killer and T cells. 2013, 4:125

Socié G, Blazar BR. Acute Graft-Versus-Host Disease: From The Bench To The Bedside. Blood. 2009; 114:4327-4335.

Sotiropoulou P., Perez S., Gritzapis A. D., Baxevanis C. N., Papamichail M. Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells. Stem cells (Dayton, Ohio). 2006, 24: 74-85.

Shlomchik W. Graft-versus-host disease. Nature reviews immunology 2007; 7: 340-352.

Shinagawa K., Kitadai Y., Tanaka M., Sumida T., Kodama M., Higashi Y., Tanaka S., Yasui W.,

Chayama K. Mesenchymal stem cells enhance growth and metastasis of colon cancer. Int. J.

Cancer: 2010; 127: 2323–2333

Smyth M ,Hayakawa Y. ,Takeda K., Yagita H. New aspects of natural-killercell surveillance and therapy of cancer. Nature. 2002; 2: 850-861.

Spaggiari G., Capobianco A., Adbelrazik H., Becchetti F., Mingari M., Morreta L. Mesenchymal

stem cell inhibit natural killer-cell proliferation, cytotoxicity, and cytoine production: role of

idoleamine 2,3-dioxigenase and prostagladin E2. Blood 2008; 111: 1327-1333.

47

Sasser A. K, Mundy B., Smith K., Studebaker A., Axel A., Haidet A., Fernandez S., Hall B. Human bone marrow stromal cells enhance breast cancer cell growth rates in a cell line-dependent manner when evaluated in 3D tumor environments. Cancer letters 2007; 254: 255-264.

Stanietsky N., Mandelboim O., Paired NK cell receptors controlling NK cytotoxicity. FEBS Letters 2010; 584: 4895-4900.

Tolar J, Villeneuve P e Keating A. Mesenchymal stromal cells for graft-versus-host disease. Human Gene Therapy. 2011; 22: 1-6.

Voltarelli JC, Pasquini R, Ortega ETT. Transplante de células-tronco hematopoéticas 1ª edição.

Wagner JE, Thompson JS, Carter Sl. Effect Of Graft-Versus-Host Disease Prophylaxis On 3-Year Disease-Free Survival In Recipients Of Unrelated Donor Bone Marrow (T-Cell Depletion Trial): A Multi-Centre, Randomised Phase Ii-Iii Trial. Lancet 2005: 366: 733-41.

Wakitani S, Saito T, Caplan AI. Myogenic Cells Derived From Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Exposed To 5-Azacytidine. Muscle Nerve. 1995; 18:1417-26.

Wanko SO, Chao NJ. Non-Pharmacologic Approaches To Graft-Versus-Host Prevention. Blood Rev. 2005; 19:203-11.

Zappia E, Casazza S, Pedemonte E. Mesenchymal Stem Cells Ameliorate Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Inducing T-Cell Anergy. Blood. 2005; 106:1755-61.

Zhou F Expression of Multiple Granzymes by Cytotoxic T Lymphocyte Implies that They Activate Diverse Apoptotic Pathways in Target Cells. International Reviews of Immunology, 2010; 29:38–55.

Zhou F Perforin: More than Just a Pore-Forming Protein. International Reviews of Immunology, 2010; 29:56–76.

ministério da saúde instituto nacional de câncer … · instituto nacional de cÂncer...

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