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DEFICIÊNCIA DE ALFA-1 ANTITRIPSINADEFICIENCY OF ALPHA-1 ANTITRYPSIN

AUTOR: MIRTIS NUNES DA SILVAAFILIAÇÃO INSTITUCIONAL: Faculdade de

ciências da saúde de São Paulo. Rua D. Inácia Uchôa, 399/411

Vila Mariana, SP - CEP: 04110-021*AUTOR CORRESPONDENTE:mirtisnues@gmail.com

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SÃO PAULO2017

RESUMO

A deficiência da alfa-1 antitripsina (A1AT) caracteriza uma doença genética de herança autossômica codominante que afeta especialmente o pulmão e o fígado. Mundialmente distribuída atinge de 1:5000 a 1:2000 pessoas de todos os grupos étnicos, mais prevalentemente os caucasianos. Devido à falta de programas de rastreio neonatal e incentivo à pesquisa genética ainda é uma doença sub diagnosticada, inclusive pela dificuldade da classe médica em associar as manifestações da doença pulmonar obstrutiva crônica com a deficiência de alfa-1-antitripsina. O objetivo deste presente trabalho é fazer uma revisão de literatura a respeito dos aspectos genéticos e das implicações da deficiência de alfa-1- antitripsina em seres humanos. Foi realizado um estudo de revisão bibliográfica efetuado na base de dados PubMed, Lilacs, Bireme e Scielo no período de 2000 a março de 2017. Os trabalhos considerados mais relevantes conforme pertinência foram referidos no texto. A A1AT é uma das proteinas plasmáticas de manutenção de diversas funções. Entre suas funções estão os reagentes de fase aguda (RFA), anti-inflamatórias, infecciosos e imunes de forma inespecífica, além da atividade antiprotease. Existem alelos responsáveis pela deficiência no lócus dos inibidores de protease (Pi), que se situa no braço longo do cromossomo 14. O gene Serpina1 se posiciona no cromossomo 14q32.13, em regiões não codificantes que abrange 3 Éxons (IA, IB e IC), transcrito nos monócitos, macrófagos, e nos hepatócitos. O produto final do gene consiste numa glicoproteína circulante, chamada de AAT ou alfa-1-antitripsina. O Serpina1 apresenta expressão em 16 tecidos, e em quantidade diversas, com maior expressão nos leucócitos e tecido pulmonar conferindo, portanto, aumento do risco de desenvolvimento de doenças pulmonares e hepatopatias normalmente não detectáveis precocemente. Apresenta o tipo de variação de heterogeneidade alélica, pela presença de alelos múltiplos. Os fenótipos que conferem um sério aumento do risco de desenvolvimento de doença pulmonar e hepatopatias são aqueles em que há combinação de alelos deficientes (S e Z) ou nulos.

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Assim, faz-se necessário a criação de programas de rastreio neonatal em todos os países desenvolvidos que possuem populações caucasianas, além dos que apresentam miscigenação que sugerem prevalência elevada dos alelos que promovem a deficiência, como é o caso do Brasil. Esses programas diminuiriam a morbidade e a mortalidade destas doenças melhorando a saúde pública brasileira.

PALAVRAS-CHAVE: Antitripsina. 1-Antitripsina alfa. Deficiência de 1-Antitripsina alfa. Inibidores de proteases. Inibidores de serino proteinase.

ABSTRACT

Introduction- Alpha-1 antitrypsin is a disease of genetic origin, of co-dominant autosomal inheritance, which especially affects lung and liver. Presents a prevalence of 1: 5000 to 1: 2000, it is found all over the world. It is more prevalent in the Caucasian population, but it affects individuals in all racial subgroups.

Due to the lack of neonatal screening programs and the encouragement of genetic research, it is still an undiagnosed disease, including the difficulty of the medical profession to associate the manifestations of chronic obstructive pulmonary disease with alpha-1-antitrypsin deficiency. The objective of this present work is to review the literature on the genetic aspects and implications of alpha-1-antitrypsin deficiency in humans. A bibliographic review study was carried out in the PubMed, Lilacs, Bireme and Scielo database from 2000 to March 2017. The works considered more relevant as pertinence were mentioned in the text. A1AT is one of several maintenance plasma proteins of various functions. Among its functions are the acute phase reagents (RFA), anti-inflammatory, infectious and immune in a non-specific way, besides the antiprotease activity. There are alleles responsible for deficiency in the locus of protease inhibitors (PI), located on the long arm of chromosome 14. The Serpina1 gene is positioned on chromosome 14q32.13, in non-coding regions covering 3 exons (IA, IB and IC), transcribed in monocytes, macrophages, and hepatocytes. The end product of the gene consists of a circulating glycoprotein, called AAT or alpha-1-antitrypsin. Serpine 1 has expression in 16 different tissues, with greater expression in leukocytes and pulmonary tissue, thus conferring an increased risk of development of pulmonary diseases and hepatopathies not usually detectable early. It presents the type of variation of allelic heterogeneity, by the presence of multiple alleles. Phenotypes that confer a serious increased risk of developing lung disease and liver disease are those with a combination of deficient alleles (S and Z) or null.

Thus, it is necessary to create neonatal screening programs in all developed countries that have Caucasian populations, in addition to those with miscegenation that suggest a high prevalence of the alleles that promote the deficiency, as is the case in Brazil. These programs would reduce the morbidity and mortality of these diseases by improving Brazilian public health.

KEY WORDS: Antitrypsin. 1-Antitrypsin alpha. Alpha 1-Antitrypsin alpha

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deficiency. Inhibitors of proteases. Inhibitors of serine proteinase.

INTRODUÇÃOA deficiência de alfa-1-antitripsina é uma doença de origem genética, de herança

autossômica co-dominante, que têm diversas implicações quanto ao aumento do risco de desenvolvimento de uma variedade de patologias que afeta especialmente pulmão e fígado (SANDHAUS, 2004; CAMELIER et al, 2008). É uma das alterações genéticas hereditárias mais prevalentes na população caucasiana, variando de 1:5000 a 1:2000 indivíduos na Europa do Norte, Ocidental e Central (RUSSO et al, 2016).

A molécula de alfa antitripsina (AAT) é produzida principalmente no fígado, e em menor quantidade, nos macrófagos e no epitélio brônquico. Mais de 80% de AAT é sintetizado e secretado por hepatócitos, e em quantidades adicionais por monócitos, macrófagos, pâncreas, células alveolares pulmonares, enterócitos, endotélio e alguns canceres (CAMELIER et al,2008). É uma das proteinas plasmáticas, que apresenta um aumento de até 4 vezes o seu nível durante a fase aguda (processo inflamatório). Denominadas assim PFA ou RFA, que inibem a continuidade do dano tecidual (SERRES e BLANCO,2014).

A alfa-1-antitripsina é um membro da família dos inibidores de proteases séricas ou família das serpinas que também inclui a alfa-1-antiquimotripsina, alfa-2-antiplasmina, ativador de plasminogênio1, globulina ligadora de tiroxina, globulina ligadora de cortisol, angiotensinogénio e o inibidor de leucócitos. Os membros dessa família têm mais de 30% de sequências homólogas e possuem uma arquitetura molecular semelhante, particularmente nas regiões móveis de sua molécula. Eles diferem das outras famílias de inibidores de protease por terem um mecanismo de ação complexo, que envolve a capacidade de mudar a sua conformação (LÉSM NETO et al,2004). As proteinas envolvidas em distúrbios genéticos moleculares podem ser proteinas de manutenção (housekeeping), por estarem presentes em todas as células de um organismo.Com papeis fundamentais na manutenção da estrutura e da função celular. Dos genes expressos numa célula eucariota 90% são de manutenção, e os 10% restantes codificam proteinas especificas do tecido (NUSSBAUM et al,2007).

Existem alelos de deficiência no lócus dos inibidores de protease (Pi), que se situam no braço longo do cromossomo 14. O gene da serpina1 se posiciona no cromossomo 14q32.13, em regiões não codificantes que abrange 3 Éxons IA, IB transcrito nos monócitos e macrófagos, e éxon IC transcrito nos hepatócitos. O produto final do gene consiste em uma glicoproteína circulante, difusa, solúvel em água de 52 kDa, chamada de AAT ou alfa-1 antitripsina (LÈSM NETO et al,2004; LEE & BRANTLY,2000).

Os níveis de expressão de diferentes transcritos da SERPINA1 foram medidos num painel de vários tecidos humanos (MATAMALA et al,2015). Dos 27 tecidos humanos a Serpina1 apresenta expressão em 16 tecidos, e em quantidades diversas. Com maior expressão nos leucócitos e tecido pulmonar. Apresenta o tipo de variação de heterogeneidade alélica, pela presença de alelos múltiplos em um lócus. O alelo de deficiência mais comum é o denominado PI*Z seguido do PI*S, caracterizados pelos níveis séricos da proteína reduzidos para menos de um terço dos valores normais, por

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isso classificados como deficientes. Os nulos (Q0), tem níveis indetectáveis no sangue, ou até mesmo nenhuma proteína (MATAMALA N et al,2015; CAMELIER et al ,2008).

Os indivíduos portadores heterozigotos (MZ) podem ser assintomáticos ou apresentarem um possível aumento de risco de enfisema, e leve aumento de risco hepatopatias. Os portadores homozigotos ZZ apresentam alto risco de enfisema e hepatopatias. Já os homozigotos SS não apresentam risco de enfisema e hepatopatias, se apresentarem nível de proteína acima do limiar de risco. E os portadores dos alelos nulos (Q0), por não produzirem a proteína ou níveis menores de 1%, indetectáveis no sangue, podem apresentar um alto risco de enfisema sem aumento de hepatopatias.

Explica-se o alto risco de hepatopatias, relacionadas com o alelo Z em homozigose ou heterozigose pelo acumulo de polímeros da AAT, no interior dos hepatócitos. Não conseguindo chegar em quantidades suficientes nas paredes alveolares, para proteção contra a ação da enzima elastase neutrofílica, que pode danificar o tecido do pulmão se não for adequadamente controlada (CAMELIER et al,2008; NUSSBAUM et al,2007).

Um estudo realizado em 2016 mostra que a prevalência da deficiência de alfa-1- antitripsina e a frequência alélica em uma população de pacientes com DPOC no Brasil (2,8%) e do alelo Z (0,8%) foi semelhante à encontrada em outros países (RUSSO et al, 2016).

Segundo Serres (2002) há pelo menos 116 milhões de portadores com fenótipo Pi MS ou Pi MZ, e 3,4 milhões de combinações de alelos deficientes (Pi SS, Pi SZ e Pi ZZ). Este estudo revela ainda que a deficiência de A1AT é encontrada em várias populações de negros africanos, árabes e judeus do médio oriente, caucasianos da Austrália/Nova Zelândia, Europa e América do Norte, e asiáticos. A deficiência de A1AT não é apenas uma alteração genética que afeta normalmente caucasianos europeus, mas afeta indivíduos de todos os subgrupos raciais (CARDOSO, 2009).

A deficiência da alfa-1-antitripsina ainda é pouco diagnosticada, e várias estratégias terapêuticas têm sido empregadas no seu tratamento. Uma das razões para esse sub- diagnóstico constitui a dificuldade da classe médica em associar as manifestações de DPOC com a deficiência de alfa-1-antitripsina. Ocorre um atraso médio estimado de 7,2 anos entre os primeiros sintomas e o diagnóstico da condição (LÉSM N et al,2004).

O vício de fumar é o maior fator de risco para o desenvolvimento do enfisema pulmonar que aparece precocemente, em torno da terceira década de vida, ao contrário dos portadores de enfisema pulmonar que não apresentam essa deficiência (LÈSM et al,2004).

OBJETIVOO objetivo deste presente trabalho é fazer uma revisão de literatura a respeito dos

aspectos genéticos e das implicações da deficiência de alfa-1-antitripsina em seres humanos.

METODOLOGIAFoi realizado um estudo de revisão bibliográfica efetuado na base de dados

PubMed, Lilacs, Bireme e Scielo no período de 2000 a março de 2017 com coleta de publicações utilizando os descritores: “antitripsina,1-Antitripsina alfa”, “deficiência de 1-Antitripsina alfa”, “inibidores de proteases”, e “inibidores de serino proteinase”.

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Também foi realizada pesquisa em literatura pertinente ao tema. Os trabalhos considerados mais relevantes foram referidos no texto.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

ASPECTOS HISTÓRICOS

A capacidade inibitória das proteases do plasma humano foi descoberta pela primeira vez em 1894 (FERMI e PERNOSI,1894). No entanto, devido à capacidade das técnicas de laboratório da época, não foi possível identificar o agente responsável pela inibição até 1955, quando a proteína responsável pela atividade antiprotease do sangue (denominada α1- antitripsina devido à sua localização na Α1-globulinas) e sua capacidade de inibir a tripsina pancreática foi revelada (SCHULTZE et al,1995).

O primeiro caso descrito de um ser humano com a deficiência foi provavelmente o de uma mulher no Alasca há cerca de 800 anos; pode também ter contribuído para a morte prematura de Frédéric Chopin em 1849 (KUZEMKO, 1994; KUBBAE YOUNG,1997). O primeiro relato formal da doença ocorreu há cerca de 54 anos, quando Laurell, ao revisar exames em seu laboratório, notou a ausência da banda alfa-1 nos proteinogramas de soro de cinco pacientes. O jovem residente médico de Laurell, Sten Eriksson, descobriu que três destes pacientes tinham enfisema e uma extensa história de doenças respiratórias. Além disso, um dos pacientes pertencia a uma família com excesso de casos de enfisema. Os dois pacientes restantes não apresentaram patologia notável (LAURELL e ERICKSSON,1963; NETO et al,2004). Pensava-se que a banda de alfa-1-globulina representava o inibidor de proteína da tripsina, e esta nova "disproteinemia" foi designada deficiência de AAT (LAURELL e ERIKSSON,1963). Em 1964, Eriksson detectou dois irmãos homozigotos com enfisema grave, cujos filhos tinham deficiência parcial de AAT (ERIKSSON,1964). Em 1965, Laurell e Eriksson coletaram 33 casos com padrões eletroforéticos semelhantes, alguns com enfisema. Levando em conta todos esses dados, suspeitaram que haviam descoberto uma nova doença hereditária, transmitida dos pais aos seus filhos por simples herança mendeliana (LAURELL e ERIKSSON ,1965).

Fagerhol e Laurell (1967) propuseram o nome de inibidor de protease (PI) para o conjunto de variantes eletroforéticas do gene. Inicialmente, designaram essas variantes com letras do alfabeto, para indicar sua velocidade de migração eletroforética utilizaram a letra M (do inglês, medium) para as variantes de mobilidade média, F (do inglês, fast) e letras iniciais do alfabeto para as variantes de mobilidade rápida, e S (do inglês, slow) e as últimas letras do alfabeto para as variantes com migração lenta (FAGERHOL, 1968).

As variantes alélicas normais e/ou fenótipo mais frequente, pertencem à família “M” (MM - medium mobility), as quais tiveram sua origem a partir do gene M1 (Ala²¹³) com subsequentes mutações que originaram os outros alelos mais comuns do sistema PI, tais como o M1(Val ²¹³), o M2 e o M3 conforme a Figura 1 (COX et al, 1985; NUKIWA e COL, 1987).

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Figura 1. Árvore filogenética do gene da A1AT. Fonte: (Luisetti & SeersHolm, 2004).Os alelos PI*M estão presentes em 94 a 96% de caucasianos (SERRA e BANHA,

2008). As frequências das variantes normais PI*M, variam, na população mundial, sendo PI*M1 mais frequente em todas as populações, seguido de PI*M2 e PI*M3, nas populações Européias. O alelo PI*M4 é relativamente raro (BARKER et al, 1997).

A associação da deficiência de AAT com a cirrose hepática foi documentada por Sharp et al (1969) em 10 crianças. Os mesmos autores detectaram pela primeira vez reações de Schiff positivas em fígado cirrótico de pacientes com deficiência de AAT. No mesmo ano, o desenvolvimento de enfisema pulmonar foi relacionado à elastase de neutrófilos (TURINO et al,1969; JANOFF e SCHERER,1968). A associação da deficiência de AAT com cirrose hepática em adultos foi relatada por BERG e ERIKSSO (1972).

A estreita relação entre enfisema pulmonar e tabagismo em pacientes com deficiência de AAT foi observada por LARSSON et al (1977) e LARSSON (1978). Uma nova nomenclatura para o sistema Pi, designando variantes de migração lenta como L-Z e variantes de migração rápida como A- M foi proposta por COX (1978) e COX et al (1980).

Na década de 1980, a AAT humana foi sintetizada, seu gene foi sequenciado, clonado, e foi localizado no braço longo do cromossomo 14 (LONGO et al,1984; PERLINO et al,1987).

Na década de 1990, com a disseminação de sofisticadas técnicas de amplificação do DNA e sequenciamento de genes (reação em cadeia da polimerase), o número de variantes foi aumentado para 125, incluindo mais de 40 alelos raros e nulos (AMJ RESPIR,2003; BORNHORST et al, 2013).

Variantes raras e nulas foram nomeadas com um sufixo com o nome da cidade,

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região ou país do primeiro paciente detectado. Quando se faz referência a genótipos específicos, a nomenclatura padrão de Pi * seguida pelos dois nomes de alelos foi recentemente proposta (AM J RESPIR,2003; STOLLER e ABOUSSOUAN,2012).

Em 1991, descobriram que o mutante Z AAT polimeriza, formando polímeros estáveis intra-hepáticos. Estes acumulam-se nos hepatócitos e causam danos no fígado, bem como uma deficiência circulatória de AAT, que resulta na destruição do pulmão, de elastase de neutrófilos, e enfisema (LOMAS et al,1992; EKEOWA et al,2010). A paniculite recidivante e vasculite sistêmica foram adicionados à lista crescente de doenças associadas à deficiência de AAT (AM J RESPIR,2003; STOLLER e ABOUSSOUAN,2005).

Na década de 1990, foi criado o Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue de pacientes com Deficiência Grave de Alfa-1-Antitripsina (TURINO et al,1996; MCELVANEY et al,1997). Juntamente com a Alpha One Foundation e a AlphaNet, um sistema de gestão da saúde que acolhe os indivíduos afetados, bem como suas famílias (WALSH et al,2006; WALSH,2013).

Em 1997, o Alpha One International Registry (AIR) foi criado em Malmo, Suécia (STOCKLEY et al,2007; STOCKLEY e DIRKSEN,2013). Além disso, em muitos países foram publicadas orientações eficazes para o diagnóstico e a gestão da deficiência de AAT (AM J RESPIR,2003; LARA B et al, 2007). Em anos mais recentes, para medir a densidade pulmonar, a tomografia computadorizada de alta resolução foi incorporada como uma técnica altamente sensível aos métodos mais clássicos de avaliação do enfisema (STOCKLEY e DIRKSEN,2013).

Em janeiro de 2006 foi aberto um canal Brasileiro ABRADAT, para orientação sobre a deficiência de alfa-1 antitripsina, por algumas pessoas interessadas na veiculação do conhecimento sobre a deficiência no Brasil (http://alfa1.org.br).

EPIDEMIOLOGIA MUNDIAL

A deficiência de A1AT é uma das alterações genéticas hereditárias mais prevalentes na população caucasiana. O estudo indica que, numa população mundial estimada de 5,2 a 4,4 bilhões, de habitantes dentre os 58 países incluídos na pesquisa realizada, há pelo menos 116 milhões de portadores com fenótipo Pi MS ou Pi MZ, e 3,4 milhões de combinações de alelos deficientes (Pi SS, Pi SZ e Pi ZZ) (SERRES,2002). Este estudo revela ainda que a deficiência de A1AT é encontrada em várias populações de negros africanos, árabes e judeus do médio oriente, caucasianos da Austrália/Nova Zelândia, Europa e América do Norte, e asiáticos. A deficiência de A1AT não é apenas uma alteração genética que afeta normalmente caucasianos europeus, mas que afeta indivíduos em todos os subgrupos raciais (CARDOSO,2009).

Pode haver pelo menos 181 894 pessoas Pi * ZZ em alto risco de desenvolvimento de doenças relacionadas à deficiência de AAT, a maioria dos caucasianos, e tem sua maior prevalência de 1: 5000 a 1: 2000 indivíduos na Europa do Norte, Ocidental e Central, (74 000, 41% o total), 20% nos EUA (34.000) e 16% na América do Sul conforme a tabela 1. Além disso, pode haver 1 269 054 Pi * SZ, 4 017 900 Pi * SS e 42 564 136 Pi * MZ indivíduos, com um risco potencial de desenvolver doenças relacionadas à deficiência AAT, com 615 193 Pi * SZ vivendo na Europa (74%, 458 074 Espanhol, português, francês e britânico), 252 599 no norte e América Central (60% americanos), 202 575 na América do Sul (55% brasileiros) e 29 687 na Austrália e Nova

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Zelândia (SERRES e BLANCO,2012).

Estima-se que na Europa existem quase 80 000 indivíduos ZZ, a maioria na Península Ibérica, nas Ilhas Britânicas, na França, na Alemanha, na Dinamarca, na Letónia, na Itália, na Bélgica, na Roménia, nos Países Baixos, na Suécia e na Rússia europeia (SERRES e BLANCO,2012).

Na América do Norte, América Central, América do Sul e Ilhas do Caribe existem 61 157 Pi * ZZ genótipos, principalmente nos EUA com 34 395 (58%), sendo 92% caucasianos, 7, 5% hispânicos, 0, 5% afro-americanos E 0% asiáticos. Arredondando os números, haveria 5500 Pi * ZZ no Canadá, 4000 no México e 6500 no Brasil. Na Austrália e Nova Zelândia, há aproximadamente 6000 ZZ, na maior parte descendentes do povo Anglo-Saxon (SERRES e BLANCO,2012).

Estima-se que existam apenas cerca de 5000 ZZ entre mais de 1 bilhão de pessoas na África, distribuídas por toda a Nigéria, Mali, Marrocos e Somália. Na Ásia, com mais de 4 bilhões de pessoas, há 40 818 Pi * ZZ indivíduos, principalmente no Paquistão, Tailândia e Arábia Saudita (SERRES e BLANCO,2012).

As tabelas 1, 2 e 3 abaixo mostram a frequência estimada dos alelos deficientes PI*S e PI*Z em todos os continentes do Mundo.

Tabela 1. Frequência estimada dos alelos PI*S e PI*Z nas regiões da África e Europa Fonte: (SERRES e BLANCO, 2012).

Norte da África África Central e Sul Norte da Europa Europa oriental Europa central e Sul

Nigéria PI*S:63.8 PI*Z:3.6

Angola PI*S:188.0 PI*Z: 0.0

Lativa PI*S:31.3 PI*Z:45.1

Austria PI*S:22.5 PI*Z:13.3

Portugal PI*S:185.1 PI*Z:29.7

Egypt PI*S:57.1 PI*Z:28.6

Namíbia PI*S:146.5 PI*Z:0.0

Denmark PI*S:27.9 PI*Z:27.0

Greece PI*S:21.9 PI*Z:2.0

Espanha PI*S:104.1 PI*Z:17.3

Cape PI*S:32.2 Botswana PI*S:45.5 Norway PI*S:24.7 Macedonia PI*S: França PI*S:76.2

verde Islands Somália

PI*Z:2.5

PI*S:17.3 South África

PI*Z:0.0

PI*S:32.6 Iceland

PI*Z:18.5

PI*S:21.3 Hungary

12.9PI*Z:8.2 PI*S:10.2

Belgium

PI*Z:12.4

PI*S:54.3PI*Z:11.5 PI*Z:0.0 PI*Z:0.0 PI*Z:2.9 PI*Z:16.7

Tunísia PI*S:7.9 Republic of PI*S:8.4 Lithuania PI*S:16.8 Serbia PI*S:6.6 Scotland PI*S:47.0

PI*Z:0.0 Congo PI*Z:0.0 PI*Z:15.0 PI*Z:12.7 PI*Z:8.1

Cameroon PI*S:5.6 PI*Z:0.0

Mozambique PI*S:1.8 PI*Z:0.0

Sweden PI*S:15.8 PI*Z:15.1

Romania PI*S:5.6 PI*Z:11.1

England PI*S:45.7 PI*Z:14.7

Morocco PI*S:4.6 Democratic PI*S:0.0 Poland PI*S:14.8 Albania PI*S:0.0 Ireland PI*S:40.0

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PI*Z:4.6 Republic of PI*Z:0.0 PI*Z:4.1 PI*Z:0.0 PI*Z:8.0

Mali PI*S:0.0Congo

Estonia PI*S:12.8 Bósnia- PI*S:0.0 Switzerland PI*S:38.4

GambiaPIZ:9.8 PI*S:0.0 European

PI*Z:24.5 PI*S:8.5

Herzegovina PI*Z:4.9Netherlands

PI*Z:7.3 PI*S:31.9

PI*Z:0.0 Russia Finland

PI*Z:4.7 PI*S:7.3 PI*Z:4.7

ItalyPI*Z:11.9 PI*S:30.8 PI*Z:7.7

Germany PI*S:21.3 PI*Z:9.8

Northern Ireland

PI*S:18.6 PI*Z:8.9

Tabela 2. Frequência estimada dos alelos PI*S e PI*Z na América, território Asiático e região geográfica do Caribe

Fonte: (SERRES e BLANCO, 2012).

Norte e Ásia central Sudeste asiático Norte e América central Caribe

Saudi Arábia PI*S:31.2 PI*Z:15.0

Austrália PI*S:42.7 PI*Z:12.2

Costa Rica PI*S:45.3 PI*Z:7.7

Puerto Rico PI*S:45.5 PI*Z:7.7

Pakistan PI*S:11.2 PI*Z:9.3

New Zealand PI*S:33.0 PI*Z:26.0

El Salvador PI*S:39.7 PI*Z:6.7

Cuba PI*S:41.5 PI*Z:7.0

Israel Jordan Iran

PI*S:9.2 PI*Z:0.6 PI*S:8.3 PI*Z:0.0 PI*S:8.3 PI*Z:6.9

Malayzia Thailand Philippines

PI*S:24.1 PI*Z:1.3 PI*S:22.6 PI*Z:13.2 PI*S:4.1 PI*Z:0.0

Canada Nicarágua Honduras

PI*S:39.1 PI*Z:12.9 PI*S:37.2 PI*Z:6.3 PI*S:37.0 PI*Z:6.3

Dominican Republic Tobago Trinidad Jamaica

PI*S:37.0 PI*Z:6.3 PI*S:8.8 PI*Z:1.7 PI*S:7.5 PI*Z:1.5

Afghanisn PI*S:7.7 PI*Z:9.0

Singapore PI*S:4.6 PI*Z:0.0

México PI*S:35.5 PI*Z:6.0

Haiti PI*S:7.2 PI*Z:1.5

Asian Russia Tajikistan

PI*S:3.9 PI*Z:1.6 PI*S:3.8 PI*Z:15.3

Papua New Guinea South Korea

PI*S: 3.9 PI*Z:0.0 PI*S:1.8 PI*Z:5.5

Panama Guatemala

PI*S:34.7 PI*Z:6.0 PI*S:33.0 PI*Z:5.7

India Kazakhsn

PI*S:1.5 PI*Z:0.4 PI*S:0.0 PI*Z:2.4

China Japan PI*S:1.0 PI*Z:0.0 PI*S:0.3 PI*Z:0.2

United States of América

PI*S:23.2 PI*Z:10.5

Nepal PI*S:0.0 PI*Z:0.0

Mongólia PI*S:0.0 PI*Z:0.0

Indonésia PI*S:0.0 PI*Z:0.0

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Tabela 3. Frequência estimada dos alelos PI*S e PI*Z na América do Sul Fonte: (SERRES e BLANCO, 2012).América do SulVen

ezuela PI*

S:51.8

 PI*

Z:7.8Para

guai PI*

S:39.2

 PI*

Z:6.7Colu

mbia PI*

S:38.0

 PI*

Z:6.5Chil

e PI*

S:36.8

 PI*

Z:6.3Equ

ador PI*

S:35.2

 PI*

Z:6.0Arg

entina PI*

S:33.5

 PI*

Z:6.2Uru

guai PI*

S:32.8

 PI*

Z:6.0Bolí

via PI*

S:15.7

 PI*

Z:2.7Suri

name PI*

S:11.3

 PI*

Z:2.0Guia

na PI*

S:10.8

 PI*

Z:6.7Bras

il PI*

S:48.5

 PI*

Z:5.7

Peru PI*

S:33.3

18

 PI*

Z:5.8

Ainda, de acordo com BLANCO e SERRES (2012) pode ser usado, como método de rastreio eficaz, a interpolação multivariada de ponderação inversa de distância (IDW) que consiste na criação de novos pontos de valores a partir de dados conhecidos, usando logaritmo simples, baseado na distância entre eles, é utilizado na cartografia, topografia, meteorologia entre outros. Por esse método gera-se um mapa (ArcMap informática) que, através das cores qualitativas convertidas em dados quantitativos para os dois alelos mais frequentes da AAT, permite o rastreio alélico em todas as partes do Mundo. Tal mapa permitiu aos autores concluírem que a DA1AT não é apenas uma doença dos caucasianos do Norte da Europa, mas sim prevalente em raças diversas e em vários países.

As manchas pretas nesses mapas indicam os locais onde os estudos foram conduzidos, e onde os dados numéricos foram obtidos. Em geral, as frequências máximas de PI* Z ocorrem em regiões costeiras europeias perto do oceano atlântico e dos seus mares, e diminuem gradualmente para o oeste deste continente. Outros dados estão escassos ou dispersos em outras áreas geográficas. As frequências máximas de PI*S foram encontradas na África e na Europa, seguida pela Península ibérica e no sul da França. Os valores diminuem para o norte e o leste do continente europeu (BLANCO e SERRES,2012).

Serres et al (2003) concluem que a deficiência de AAT não é uma doença rara, mas raramente diagnosticada.

DPOC ASSOCIADA À DEFICIÊNCIA DE ALFA 1-AT

Segundo a Deficiência pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é a desordem clínica mais prevalentemente associada à deficiência de alfa-1-antitripsina. Cerca de 95% dos pacientes com deficiência grave têm fenótipo PI*ZZ. Outros fenótipos associados ao DPOC incluem as variantes nulas a alguns indivíduos PI*SZ. O papel da deficiência intermediária (PI*MZ e PI*SZ) no desenvolvimento da doença permanece incerto, ao contrário dos indivíduos portadores do fenótipo PI*ZZ, os quais apresentam DPOC em 74,8% dos casos.

Dentro do grupo das DPOC, porém, ao contrário do enfisema, apenas 20 a 34% dos pacientes desenvolvem bronquite crônica. Porém, também apresenta como maior fator de risco a associação ao tabagismo. Alguns estudos encontraram uma frequência elevada de asma em pacientes com DPOC e deficiência de alfa 1-AT, quando comparado com outros pacientes DPOC, sugerindo que a falta de antiprotease nas vias aéreas pode aumentar a propensão para o desenvolvimento de asma LÉSM NETO et al. (2004)

A prevalência de bronquiectasias em pacientes com deficiência grave de alfa 1- AT varia de 5 a 10%. O tipo de bronquiectasias mais frequente nesses pacientes, a cilíndrica, pode ocorrer como resultado da patologia pulmonar na DPOC usual. Portanto, as bronquiectasias podem ser uma consequência do enfisema pulmonar nos pacientes com fenótipo PI*ZZ. LÉSM NETO et al. (2004). Ainda, segundo esses autores as

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crianças e adolescentes com deficiência de alfa 1-AT pareciam não apresentar anormalidades significativas da função pulmonar.

No estudo epidemiológico denominado PLATINO (Projeto Latino-Americano de Investigação em Obstrução Pulmonar), delineado para o rastreamento da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e conduzido na cidade de São Paulo, descobriu-se que 15,8% dos indivíduos com 40 anos ou mais eram portadores de DPOC e que 12,5% desses indivíduos nunca haviam sido expostos ao tabaco. A partir desses dados, infere-se que outros fatores de risco para a DPOC, além do tabagismo, sejam importantes no Brasil, dentre eles a deficiência de AAT. Um estudo em portadores de DPOC encontrou deficiência grave de AAT em 2-3% dos pacientes (CAMELIER et al,2008).

Ainda, segundo o estudo PLATINO estima-se que haja de 5 a 7 milhões de portadores de DPOC no Brasil. Um estudo realizado no Brasil encontrou 12,8% de heterozigotos para os alelos S ou Z ou o heterozigoto composto; contudo, a amostra não é representativa da população brasileira, uma vez que incluiu apenas portadores de fibrose cística (Russo, 2016). Ainda, segundo esses autores, a prevalência da deficiência de AAT (2,8%) e do alelo Z (0,8%) na população de pacientes com DPOC no Brasil foi semelhante à encontrada em outros países. Segundo o autor, os profissionais de saúde que prestam cuidados a pacientes com DPOC devem ter em mente que 2,8% dos pacientes com DPOC têm algum grau de deficiência de AAT.

Um estudo realizado no Brasil entre fevereiro de 2005 e maio de 2010 testou amostras de sangue de 106 pacientes com DPOC de 16 estados diferentes com relação à concentração de alfa 1 antitripsina inferior a 80 mg/dl (abaixo dos valores normais). Oitenta e oito casos com fenótipos não PI*MM foram encontrados: 47 PI*ZZ (53,4%), 27 PI*MZ (30,7%), 10 PI*SZ (11,4%) e 4 PI*MS (4,5%). Ainda segundo o estudo, há uma consideração a respeito da predominância do alelo PI*S em Portugal, o que permitiu estimar uma prevalência de PI * S em torno de 46,3 e de PI * Z em torno de 5,7 no Brasil. Na composição étnica brasileira há 53,4% de caucasianos e, embora a maioria dos brasileiros sejam descendentes de imigrantes de Portugal, há também descendentes de imigrantes da Alemanha, Itália e outros países europeus, então talvez a prevalência de fenótipos PI seja diferente (Russo, 2016).

A frequência do alelo mutante PI*Z e de outros alelos relacionados com a deficiência de AAT em todos os estudos pode ser explicada pelo grande número de imigrantes da Europa, principalmente de países onde a prevalência da deficiência de AAT é alta, como Portugal e Itália (Russo, 2016).

Considerando que um diagnóstico de deficiência de AAT pode ter grande impacto na prevenção da DPOC, especialmente em jovens fumantes, e reforçando a recomendação de 1999 da Organização Mundial da Saúde de que todos os pacientes com DPOC devem ser avaliados quanto à deficiência de AAT por meio de um teste quantitativo, pacientes cuja avaliação apresentar resultados anormais devem ser submetidos a fenotipagem de PI. A dosagem de AAT em pacientes com DPOC também foi recomendada pela American Thoracic Society/European Respiratory Society, e mais recentemente, pela Canadian Thoracic Society (RUSSO et al,2016).

O rastreamento familiar é útil, pois propicia o aconselhamento apropriado. Poucos países são tão racialmente diversificados como o Brasil, que é povoado por um grande número de descendentes de imigrantes, incluindo asiáticos, africanos, árabes e, em particular, europeus. Os portugueses trouxeram séculos de miscigenação genética entre os europeus, incluindo celtas, romanos, alemães e lusitanos. As diferenças quanto à prevalência dos genótipos entre as diversas regiões do Brasil podem ser atribuídas às

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diferentes origens de imigrantes (RUSSO et al,2016).A prevalência da deficiência de AAT em pacientes com DPOC no Brasil foi

semelhante à encontrada na maioria dos países apesar da diversidade racial da população brasileira. A verdadeira prevalência da deficiência de AAT no Brasil pode ser mais bem determinada por meio da investigação de recém-nascidos. Estudos genéticos para determinar a ascendência dessa população são fundamentais para estabelecer uma correlação entre os alelos mutantes e a verdadeira ascendência dos indivíduos (RUSSO et al,2016) para finalidade de prevenção.

PROTEINAS PLASMÁTICAS-GLOBULINAS (ALFA-1,2, BETA E GAMA)

Os hepatócitos sintetizam a maioria das proteínas plasmáticas, como as globulinas, a albumina, a protrombina e o fibrinogênio (SILVA et al, 2008).

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A análise das proporções das frações das proteínas identificadas no soro, que diferem entre si estruturalmente e participam em vários processos fisiológicos, tais como anticorpos, carreadores de moléculas e íons, enzimas, inibidores enzimáticos, fatores de coagulação, entre outras funções, tem considerável valor na abordagem de desordens agudas e crônicas, fornecendo informações clinicamente úteis. A EPS (eletroforese das proteínas sanguíneas) é um método laboratorial simples para separar as proteínas presentes no plasma humano em frações, de acordo com suas respectivas cargas elétricas. Trata-se do teste de triagem mais utilizado para investigação de anormalidades proteicas presentes no sangue (SILVA et al, 2008).

É uma ferramenta importante para monitorar pacientes por longos períodos, quando existem alterações específicas nos níveis de determinadas proteínas, como no mieloma múltiplo, síndrome nefrótica e cirrose, por exemplo.

As proteínas percorrem distâncias diferentes, formando bandas denominadas: albumina, alfa-1-globulina, alfa-2-globulina, betaglobulina e gamaglobulina. Essas bandas são, em seguida, quantificadas (SILVA et al,2008).

A albumina é a proteína mais abundante no plasma e corresponde a cerca de 60% da concentração total de proteínas. É sintetizada exclusivamente no fígado e possui funções importantes no organismo, como transporte de diversas substâncias e manutenção da pressão oncótica. Trata-se de uma das menores moléculas proteicas e, em consequência disso, tende a se perder na urina sempre que ocorre dano aos glomérulos renais. Observa-se diminuição da concentração de albumina em situações que promovam sua perda, baixa ingesta proteica ou elevado catabolismo. As frações alfas-globulinas apresentam níveis aumentados em processos inflamatórios, infecciosos e imunes (SILVA et al,2008).

A banda alfa-2 é constituída por um grupo variado de proteínas, entre elas a haptoglobina, a alfa-2-macroglobulina, a ceruloplasmina, a eritropoetina e a colinesterase. Da mesma forma que as alfa-1-globulinas, as proteínas pertencentes a essa banda também se comportam como proteínas de fase aguda, aumentando sua concentração na presença de infecção, em processos inflamatórios e imunes. A alfa-2-macroglobulina e a haptoglobina correspondem à maior parte dessa banda (SILVA et al,2008).

O aumento da betaglobulina é observado em situações de perturbação do metabolismo lipídico ou dificuldade na excreção biliar, verificadas nas colestases. O aumento na taxa da betaglobulina é encontrado, geralmente, nos casos de anemia ferropriva, por aumento da síntese de transferrina; e a queda dessa fração pode ter valor prognóstico nos processos de evolução crônica (SILVA et al,2008).

A ausência ou diminuição da banda gama indica imunodeficiências congênitas ou adquiridas. O seu aumento sugere elevação policlonal das imunoglobulinas associado às condições inflamatórias, neoplásicas ou infecciosas, além da elevação monoclonal observada no mieloma múltiplo e em outras desordens linfoproliferativas, como a macroglobulinemia de Waldenström (SILVA et al,2008).

A EPS é um método adequado de triagem perante a suspeita de deficiência grave dessas proteínas. Diante da ausência da banda alfa-1 ou pico diminuído, é necessário completar a propedêutica com testes mais específicos. Essa deficiência só é detectável pela eletroforese quando homozigótica; os estados heterozigóticos só podem ser identificados por técnicas imunoenzimáticas, que também são utilizadas para

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confirmação das deficiências homozigóticas (SILVA et al,2008).

ALFA-1 GLOBULINAS

Componentes não específicos do sistema imune, as proteínas de fase aguda (PFA) inibem a continuidade do dano tecidual, isolando e destruindo o agente agressor e ativando o processo de reparação necessária do tecido para o retorno à normalidade (MURATA et al,2004). A maioria dessas proteínas é formada por glicoproteínas sintetizadas pelos hepatócitos, como resposta à injúria tecidual, e são encontradas na circulação sanguínea (JACOBSEN,2007).

Na espécie animal, as PFA são consideradas indicadores mais fiéis da resposta sistêmica frente aos processos inflamatórios e infecciosos, quando comparadas a outras variáveis, tais como hipertermia e a presença de leucocitose associados à neutrofilia (JAIN,1989). De modo geral, o estímulo à síntese de proteína de fase aguda ocorre no período de 6 a 8 horas após a injúria, sendo que a concentração máxima é alcançada em 2 a 5 dias. Porém, o pico e a persistência das concentrações plasmáticas dessas proteínas dependem do metabolismo, extravasamento vascular e deposição tecidual (JAIN,1993).

Sobre a função biológica da resposta das proteínas de fase aguda, MURATA et al (2004) afirmaram que, apesar de as PFA produzirem uma resposta a uma injúria tecidual, podem participar da proteção contra o hospedeiro.

Esse grupo é constituído por um conjunto de várias proteínas, entre as quais a alfa-1- antitripsina, protrombina, transcortina, globulina ligadora de tiroxina e alfa-fetoproteína. Em geral, há aumento dessa fração em processos inflamatórios, infecciosos e imunes, de forma inespecífica. A alfa-1-antitripsina corresponde a 90% do pico normal de alfa-1-globulina. Nos 10% restantes, estão a alfa-1-glicoproteína ácida, a alfa-fetoproteína e outras proteínas (SILVA et al,2008).

Em um isolado das isoformas de alfa-1 antitripsina, as isoformas que normalmente estão presentes em baixa concentração, tem seu nível aumentado em mais de 100 vezes sob condições inflamatórias. O aumento pode ser resultado da fragmentação da alfa-1 antitripsina, que tem papel importante na função pulmonar.

A fragmentação desta proteína pode ser um fator na patogênese da SARA (Síndrome da angustia respiratória aguda), indicando que seu aumento pode ser relevante e, portanto, um marcador biológico útil para o diagnóstico da SARA (SILVA et al,2008).

Enquanto muitas dessas proteínas são utilizadas como biomarcadores de inflamação e de resposta aguda, Paiva et al, (2010) identificou uma lista de proteínas expressas durante a sepse, que podem, portanto, também servir como biomarcadores de infecção. Tais proteínas estão relacionadas a efeitos importantes sobre a coagulação, sistema imune, metabolismo lipídico, apoptose e informação genética. Com relação à função da proteína e expressão diferencial nos estágios da sepse identificou-se proteínas nas categorias processos celulares/sistema imune (66,6%), processos celulares/ sistema endócrino (13,3%), metabolismo (13,3) e informação genética/fator de transcrição (6,6%) segundo PAIVA et al (2010).

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ESTRUTURA E FUNÇÕES DA A1AT

A alfa-1-antitripsina é uma glicoproteína presente na fase aguda de infecção, com peso molecular de 52 KDa. Possui 394 aminoácidos (LOMAS e PARFREY, 2004), e três resíduos de Asparagina (Asn46, Asn83, Asn247) ligados a carboidratos (LOEBERMANN et al, 1984). É sintetizada no retículo endoplasmático rugoso dos hepatócitos, secretada no plasma com concentração de 1.9-3.5mg/ml (LOMAS e PARFREY, 2004), e constitui em média 80 a 90 % dos níveis séricos da fração alfa-1-globulina (A-1G) segundo SILVA et al (2001).

É uma glicoproteína circulante difusa, solúvel em água e de tamanho médio (6,7 × 3,2 nm), e uma meia-vida do sangue de 4-5 dias. Os seres humanos produzem aproximadamente 34 mg kg-1 dia -1, resultando em altas concentrações plasmáticas de 1-2 g L -1. Durante as respostas de fase aguda, os níveis de AAT aumentam até quatro vezes. Do plasma, 80% difunde-se aos tecidos intersticiais, e 0,5-10% alcança fluidos biológicos (SERRES e BLANCO,2014). A glicoproteína AAT é produzida principalmente no fígado, e em menor quantidade, nos macrófagos e no epitélio brônquico, mais de 80% de AAT é sintetizado e secretado por hepatócitos, e em quantidades adicionais por monócitos, macrófagos, pâncreas, células alveolares pulmonares, enterócitos, endotélio e alguns canceres. Pela circulação alcança os pulmões, onde vai exercer sua função antielastolítica (CAMELIER et al,2008).

As proteínas extracelulares exercem funções diferentes em compartimentos diferentes. São eles compartimento de transporte, morfogênica, hemostasia, hormônios, matriz extracelular, inflamação e resposta à infecção, e inibição de protease onde se encontra a alfa-1 antitripsina. A A1AT é uma proteína importante do soro que inibe a atividade de várias enzimas proteolíticas especificas, tais como a tripsina, a quimiotripsina e a elastase pancreática (NUSSBAUM et al,2007).

O substrato específico da AAT é a serina proteinase elastase, com a qual reage com uma das mais altas constantes de associação conhecidas em biologia (k = 6,5 × 10 7 M -1 s -1) (SERRES e BLANCO,2014). Ainda segundo estes autores, a AAT proporciona 90% da atividade antiprotease no soro humano, com os 10% restantes pertencentes à macroglobulina α-2. Além disso, a alfa-1antitripsina é um membro da família dos inibidores de proteases séricas ou família das serpinas que também inclui a alfa-1antiquimotripsina, alfa-2 antiplasmina, ativador de plasminogênio1, globulina ligadora de tiroxina, globulina ligadora de cortisol, angiotensinogénio e o inibidor de leucócitos (SERRES e BLANCO,2014).

Os membros dessa família têm mais de 30% de sequências homólogas e possuem uma arquitetura molecular semelhante, particularmente nas regiões móveis de sua molécula. Eles diferem das outras famílias de inibidores de protease por terem um mecanismo de ação complexo, que envolve a capacidade de mudar a sua conformação (LÉSM NETO et al,2004).

Recebe este nome por convenção, pois além de inibir a ação de várias enzimas como elastase de neutrófilos, elastase pancreática, quimiotripsina, tripsina, catepsina de macrófagos, colagenáses, catepsina G, trombina, plasminogênio, entre outras, também forma complexos dissociáveis com proteases, excretadas através do catabolismo hepático, dentre essas variações também é denominada como alfa-1-antiprotease

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(COX,1994).A alfa-1-antitripsina é conhecida como inibidora de tripsina e exerce papel central

no controle da homeostase neutralizando os efeitos deletérios da elastase, enzima poderosa encontrada nos leucócitos. Como inibidoras das proteases, as serpinas tem um arranjo de funções incluindo regulação da coagulação sanguínea, remodelação e motilidade celular, regulação da pressão sanguínea e angiogênese (PAIVA RA et al,2010)

Seus níveis séricos podem estar aumentados em ocasiões reativas às inflamações (VIDAL et al, 2006), devido ao fato de que, normalmente ela encontra-se atuante no soro, em líquidos teciduais e macrófagos, inibindo várias proteases que são secretadas por neutrófilos durante a inflamação (RUFINO E LAPA,2006).

Ao longo da última década, uma quantidade crescente de evidências indicou que AAT possui múltiplas propriedades anti-inflamatórias e protetoras de tecidos independentes de sua atividade antiprotease de amplo espectro (SERRES e BLANCO,2014). A AAT reduz a expressão de leucotrieno B4, NO e as citocinas pró inflamatórias, fator de necrose tumoral (TNF) -a, interleucina (IL) -1β, IL-6, IL-8, IL-32 e Monócito quimioatractante da proteína-1, sem interferir com a liberação de citocinas anti-inflamatórias IL-10 e antagonista do receptor IL-1.Além disso, a AAT inibe as caspases 1 e 3, protegendo as células alveolares e endoteliais pulmonares, as células β do pâncreas, os cardiomiócitos e os fibroblastos cutâneos da apoptose.

A AAT impede que os microorganismos se liguem às células hospedeiras (SERRES e BLANCO,2014).

Ainda, segundo Silva et al (2008), esta proteína é codificada por dois alelos co- dominantes denominados M (mais comum) e Z. A homozigose ZZ gera níveis insuficientes de alfa-1-antitripsina e está relacionada ao surgimento de enfisema panlobular grave, bem como uma forma rapidamente progressiva de cirrose, ambos de início ainda na primeira infância.

DOENÇAS EM CLASSES DIFERENTES DE PROTEÍNA

As proteínas desempenham funções diferentes. As mutações em todas as classes funcionais de proteínas podem levar a um distúrbio genético. As proteínas diretamente envolvidas num distúrbio genético molecular podem ser proteínas de manutenção (housekeeping) que estão presentes em todas as células de um organismo e têm papeis fundamentais na manutenção da estrutura e da função celular. As quantidades de proteínas de manutenção variam entre diferentes células ou diferentes momentos dependendo da sua função naquele tecido. Dentre os 15.000 a 10.000 genes expressos em uma célula eucariota a qualquer instante, 90% são genes de manutenção e os 10% restantes codificam proteínas especiais ou especificas do tecido (NUSSBAUM et al,2007).

Temos proteínas histoespecificas que são produzidas em determinado tecido, ou tipo celular, em determinada fase do desenvolvimento do organismo, ou ambos. Elas têm funções únicas, que contribuem para a indidualidade das células nas quais são expressas. Alterações em proteínas especificas produzem uma patologia associada apenas ao tecido afetado, porém isto nem sempre é verdade. As proteínas de manutenção

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e as patologias associadas à suas alterações, frequentemente estão ligadas a um ou poucos tecidos, onde a proteína é muito abundante, e tem uma função especial. Essas mutações são graves e podem inviabilizar o organismo, apenas aquelas com expressão clinicas menor levam a nascimentos vivos (NUSSBAUM et al,2007).

Essas classes de proteínas associadas a doenças com forte componente genético são em sua maioria monogênica. Os distúrbios monogênicos quase sempre resultam de mutações que alteram a função de uma proteína, com exceções conhecidas como as mutações encontradas em vários genes de DNA mitocondrial que codificam RNAt (NUSSBAUM et al,2007). Conhecer os tecidos nos quais uma proteína é expressa, bem como os tecidos onde ela é expressa em maior quantidade é útil na compreensão da patologia da doença. Podem ser feitas correlações entre o local de expressão de uma proteína e o local da patologia. Raramente causam patologias diferentes em cada tecido (NUSSBAUM et al,2007).

PROTEASES E ENZIMAS PROTEOLÍTICAS

A alfa-1-antitripsina (AAT) é o componente mais importante entre os “inibidores de proteases”, que é um grupo de proteínas cuja função é a de neutralizar as atividades das enzimas proteolíticas, durante processo inflamatório agudo (FILIPPO et al,2011).

A clivagem proteolítica de peptídeos é uma das mais frequentes e importantes modificações de proteínas. As proteases digestivas de secreções gástricas e pancreáticas são as enzimas mais bem caracterizadas, gerando o conhecimento atual sobre as estruturas e funções das enzimas proteolíticas em geral (NEURATH, 1990).

O estudo das proteases iniciou por aquelas que atuam em processos fisiológicos específicos, por serem uma ferramenta importante na análise de sequência de proteínas, na identificação e no isolamento de domínios das enzimas multifuncionais mais complexas. No entanto, o isolamento de proteínas intactas nativas de tecidos biológicos requer a inativação seletiva das proteases por inibidores específicos, o que se tornou possível com o advento da biologia molecular, utilizando clonagem e sequenciamento dos seus DNAs correspondentes. E assim tem se tornado possível o entendimento da organização, função e evolução das proteases regulatórias complexas (RICHARDSON,1991), inclusive porque elas também representam 60% do total de enzimas produzidas pela indústria mundial, nas áreas de alimentação e de detergentes (GODFREY e WEST,1996).

As proteases são classificadas como um subgrupo das hidrolases e sua nomenclatura é feita segundo o tipo de reação catalisada, a natureza química do sítio catalítico e de acordo com sua estrutura. As enzimas proteolíticas quebram as ligações peptídicas das proteinas, e são encontradas em todas as células e tecidos, onde elas degradam proteinas que se tornaram desnecessárias ou danificadas, além de ajudarem na digestão dos alimentos proteicos (LEHNINGER,1995).

Dessa maneira, subdividem-se em exopeptidases e endopeptidases, dependendo de seu local de ação, ou seja, clivando peptídeos terminais ou aqueles distantes dos terminais dos substratos, respectivamente. O termo protease é sinônimo de peptídeo hidrolase e inclui todas as enzimas que clivam peptídeos. E o termo proteinase é

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sinônimo para o grupo das endopeptidases (LEHNINGER,1995).Quatro classes de enzimas proteolíticas são reconhecidas pela União

Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular, as quais compreendem seis famílias (Tabela 4). Cada família possui um grupo característico de resíduos de aminoácidos funcionais, agrupados em uma configuração particular para formar o sítio ativo. Os membros de cada família provavelmente descenderam de um ancestral comum no decorrer da evolução (NEURATH, 1986).

As serino proteases incluem duas famílias distintas: as serino proteases de mamíferos (quimiotripsina, tripsina, elastase) e a protease bacteriana subtilisina. Diferem entre si na sequência de aminoácidos e na estrutura tridimensional, embora tenham um sítio ativo e um mecanismo enzimático em comum. Analogamente, as metalo proteases incluem duas famílias: as carboxipeptidase pancreáticas de mamíferos e a termolisina bacteriana, que diferem uma da outra na estrutura química, embora ambas tenham zinco em seu sítio ativo (KRAUT,1977).

A família de protease mais bem caracterizada e mais fisiologicamente versátil é a das serino proteases, exemplificada pelas enzimas pancreáticas tripsina, quimiotripsina, elastase e calicreína (TREMACOLDI,2009).

Tabela 4. Famílias de enzimas proteolíticas (Adaptação de Neurath,1986).

Família serino proteases Protease(s) representativa (s) Sítios ativos

Serino I Protease Quimiotripsina Tripsina ElastaseCalicreína pancreática

Asp, Ser, His

Serino Protease II Subtilisina Asp, Ser, His

Cisteíno proteases

Cisteíno protease Papaína Actinidina Catepsina

Cis, His, Asp

Aspárticas proteases

Aspártica protease Penicilopepsina Renina Asp

Metalo proteases

Metalo protease I Carboxipeptidase A Termolisina

Zn, Glu, Try Zn, Glu, His

Diferenças na especificidade do substrato podem estar relacionadas à substituição de aminoácidos no sítio primário do substrato, comumente denominado de P1, e a diferenças menores, no sítio secundário. Os genes que codificam para tripsina, quimiotripsina e elastase diferem em número e distribuição de íntrons (CRAIK et

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al,1982).

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A grande maioria das proteases de origem animal é produzida no aparelho digestório, como a tripsina, a quimiotripsina, a pepsina e a renina (GODFREY e WEST,1996; WARD,1983). As enzimas proteolíticas executam várias funções fisiológicas, elas podem exercer papel-chave em processos como o catabolismo de proteínas, a coagulação sanguínea, o crescimento e a migração celulares, a formação de tecidos, a morfogênese em desenvolvimento, inflamações e crescimento de tumores, a ativação de zimogênios, a liberação de hormônios e de peptídeos farmacologicamente ativos de proteínas precursoras e, também, o transporte de proteínas através das membranas. Em geral, as proteases extracelulares catalisam a hidrólise de grandes proteínas a moléculas menores para a subsequente absorção pela célula, enquanto as proteases intracelulares desempenham um importante papel na regulação do metabolismo. Os processos fisiológicos que mais requerem a participação de proteases humanas são renovação de proteínas, modificação enzimática, nutrição e regulação da expressão gênica (RAO et al,1998).

Todas as células vivas mantêm uma renovação de proteínas pela contínua e balanceada degradação e síntese protéica. O catabolismo proteico gera um suprimento de aminoácidos necessários à síntese de outras proteínas. A síntese de novo de proteínas intracelulares em eucariotos é afetada por uma via envolvendo proteases ATP-dependentes (HERSHKO et al,1984).

GENE SERPINA1

As serpinas (serina proteinase inibidores) são proteínas encontradas em plantas, animais e vírus (GROSSE-HOLZ,2016; ZHENG D et al,2012). O genoma humano codifica 16 clones de serpinas, denominados de A a P. Até agora, foram identificadas 36 serpinas humanas, entre as quais 29 têm uma função primária na regulação da atividade proteolítica. As mutações nos genes serpinas estão associadas a diferentes doenças humanas, denominadas globalmente serpinopatias (MATAMALA N et al,2017).

A superfamília de genes codificadores da imunoglobulina contém genes de reconhecimento da superfície celular nos sistemas imune e nervoso, apresentam-se nos cromossomos 2, 14 e 22 que codificam as próprias cadeias pesadas e leves de uma imunoglobulina. No cromossomo 6 temos histocompatibilidade, nos cromossomos 7 e 14 os produtos constituem o receptor de células T, e os genes que são expressos primariamente em tecidos neurais, para moléculas de adesão celular ou glicoproteínas associadas à mielina (NUSSBAUM et al,2007). Os genes que são expressos na maioria dos tecidos (genes de manutenção ou housekeeping), em geral não têm o CAT e TATA boxes, são mais típicos de genes histoespecificos (NUSSBAUM et al,2007). Genes de manutenção contêm uma alta proporção de citosinas e guaninas em relação ao DNA circulante, ilhas CPG assim chamadas por função de aumento da concentração do dinucleotídeo 5’-CG-3’ que fica fora da região cromossômica, mas geralmente rica em AT. Servem também como pontos de ligação para fatores específicos de transcrição (NUSSBAUM et al,2007). Citocinas, quimiocinas, hormônios e outras substâncias controlam a expressão constitutiva e modulada, e liberação de A1AT (KALSHEKER N et al,2002; e YUAN ZA et al,1992).

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O gene da A1AT é conhecido como Serpina1, designado PI, localiza-se no braço longo do cromossomo 14 na posição (14q32.13) segundo COX et al (1985). O lócus PI, pertence a um cluster gênico (Figura 8) que inclui, dentre outros, os loci da antiquimiotripsina e do pseudogene A1-AT (PI*L). Este complexo gênico localiza-se a

280quilo bases (Kb) dos lócus da imunoglobulina (14q32.33) conforme BARKER et al. (1997). É formado por um segmento de DNA de 12,2 Kb, constituído por 4 éxons codificantes, 3 não traduzidos e 6 íntrons (BILLINGSLEY et al,1993). Os éxons – IA e IB são transcritos nos monócitos e macrófagos. O éxon IC é transcrito nos hepatócitos, porém essas três regiões são não codificantes, ou seja, são eliminadas do RNAm por splicing não codificando a proteína, portanto, toda a informação estrutural da proteína final é codificada pelos éxons II, III, IV e V (LEE & BRANTLY,2000).

As mutações em regiões codificantes resultam em proteínas estruturalmente anormais, que têm uma perda ou um ganho de função. As mutações em sequências não codificantes em geral são de dois tipos: as que alteram a estabilidade e a recomposição (turn-over) do RNAm e as que alteram elementos reguladores ou mudam a dosagem gênica. As mutações nos elementos reguladores alteram a abundância do mRNA, ou o momento, ou o tipo de célula no qual são expressos (NUSSBAUM et al,2007).

As asparaginas estão ligadas aos carboidratos, e são codificadas nos éxons II e III. Na posição metionina 358, encontramos o sítio ativo da proteína, codificado no éxon V. E no éxon II ocorre a inicialização da tradução (LEE & BRANTLY,2000).

Cada alelo, com um tamanho de 12,2 kb codifica uma glicoproteína de 52 KDa, composta por uma cadeia única de 394 aminoácidos, glicosilada em três pontos distintos. A proteína após ser glicosilada e modificada no retículo endoplasmático rugoso, conclui a sua estrutura terciária, e dirige-se ao complexo de golgi, onde as suas cadeias laterais de carbo-hidrato são modificadas antes do empacotamento e da libertação da proteína. Todo o processo desde a tradução até a secreção dura menos de 90 minutos (LÈSM NETO et al,2004).

Embora o principal local de síntese da A1AT seja os hepatócitos, sua síntese também ocorre nos fagócitos mononucleares e neutrófilos, dentre outras células. O RNAm produzido nos hepatócitos possui 1,6 Kb e contêm as sequências provenientes dos exons Ic, éxon II-V e a sequência 3’. Em relação aqueles produzidos pelos macrófagos, três foram identificados: dois de 1,8 kb e um de 2,0 kb, sendo produtos de splicing alternativos dos exons IA, IB e IC (BARKER et al,1997).

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Figura 2. Lócus de genes e estrutura esquemática do gene AAT (SERPINA1) Fonte: (Serres e Blanco,2014).

A maioria da transcrição nos hepatócitos é direcionada por um fragmento de 557pb que se inicia a 20 nucleotídeos da 5´do sítio de transcrição e contém os sítios TATA Box e três elementos (X, Y e P), críticos para a transcrição eficiente tecido-específica. Tais elementos compartilham características em comum com outros promotores de proteínas hepáticas de resposta aguda. A IL-6 (interleucina 6), que é a principal citocina responsável pelas respostas de fase aguda, também atua na regulação da transcrição da A1AT hepática, principalmente na via de fatores de transcrição NF-IL6, os quais tem no mínimo duas sequências consensos dentro do promotor da A1AT (BARKER et al,1997).

O gene é transmitido de forma autossômica co-dominante e é altamente polimórfico. Cerca de 100 variantes genéticas dos alelos da A1AT foram identificadas até à data, resultando em alterações conformacionais moleculares específicas que determinam diferentes padrões proteicos (CARDOSO, 2009).

Os níveis de expressão de diferentes transcritos de SERPINA1 foram medidos em um painel de vários tecidos humanos como mostra a figura 3 (MATAMALA et al,2015).

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Figura 3. Analise de transcrição de transcritos Serpina 1, e seus níveis relativos de expressão dos transcritos IA, IB e IC nos 16 tecidos humanos.

Fonte:(MATAMALA et al, 2015).

Em comparação com outros tecidos, os leucócitos mostraram a maior expressão dos transcritos 1A, 1B e 1C. O transcrito 1A, foi principalmente expresso em leucócitos e tecido pulmonar, mas também foi detectado em menor quantidade no fígado, cólon, baço, próstata, rim ou cérebro. Os transcritos 1C também foram expressos no pulmão, fígado e rim e menos abundantemente expressos no pâncreas e no intestino delgado. O transcrito 1B foi restringido quase exclusivamente a leucócitos, apesar de também ter sido observado nos pulmões e baço (MATAMALA N et al,2015).

RELAÇÃO ENTRE GENÓTIPO E FENÓTIPO DA DOENÇA.

A variação no fenótipo clínico em uma doença herdada pode ser de um dos três tipos de variação genética: heterogeneidade alélica, heterogeneidade de lócus, ou o efeito de genes modificadores. O gene da Serpina 1 apresenta o tipo de variação de heterogeneidade alélica, o que se deve de modo mais comum à presença de alelos múltiplos em um mesmo lócus. Em muitos casos, há uma clara correlação genótipo-fenótipo entre um alelo especifico e um fenótipo especifico. A explicação mais comum é que os alelos que conferem mais função residual em geral estão associados a um fenótipo mais brando. Em outros casos, os alelos que conferem alguma função residual a uma proteína estão associados a um fenótipo parcial de todo espectro clínico associado a um alelo nulo (NUSSBAUM et al,2007).

Uma segunda explicação da variação alélica no fenótipo é que a variação fenotípica pode refletir uma subfunção específica da proteína mais prejudicada pela mutação. Nesta situação, alguns alelos podem estar associados a fenótipos clinicamente distintos. Os alelos mais comumente associados à deficiência de alfa-1 antitripsina é o alelo Z, S e as variantes nulas diversas. A quantidade total da proteína funcional que o indivíduo produz, é o que determina se ele será mais ou menos afetado (NUSSBAUM et al, 2007).

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VARIANTES DIVERSAS, IMPLICAÇÕES E ASSOCIAÇÕES.

Das 100 variantes diferentes (SERRA et al,2008), cerca de 30 podem ter implicações clínicas (SANDHAUS, 2004; CAMELIER et al,2008). Dos alelos descritos, PI* M, PI*S e PI*Z apresentam-se com frequências polimórficas (FARIA et al,2005).

O elevado nível do polimorfismo genético da A1AT está ligado às variantes estruturais, derivadas da substituição isolada de um único aminoácido, identificadas pelo método de fenotipagem (COHEN et al,2005). Estas variantes são nomeadas com letras do alfabeto (A-Z), classificadas conforme o sistema PI (Protease Inhibitor), e a velocidade de migração da molécula em um gradiente de pH isoelétrico em gel de poliacrilamida (DEMEO e SILVERMAN,2004). As duas variantes mais comuns que conferem níveis plasmáticos deficientes da proteína possuem as denominações “Z”, com migração em direção ao cátodo, e “S” (slow), com mobilidade catódica, no gel, mais lenta (SERRA et al ,2008).

De acordo com os níveis séricos e função molecular da alfa-1-antitripsina, temos quatro grupos de fenótipos classificatórios para as variantes conforme observa-se na tabela 5.

Tabela 5. Relação dos principais fenótipos da alfa-1-antitripsina, seus níveis séricos relacionados, e risco associado para desenvolvimento de doença pulmonar e hepática. (Adaptação de VIDAL et al 2006 e CAMELIER AA et al,2008).

Fenótipos Nível Sérico de A1AT Risco de enfisema Risco de hepatopatia

Mg/dl μmol/L

MM 103-200 20-39 Sem aumento Sem aumento

MS 100-180 19-35 Sem aumento Sem aumento

SS 70-105 14-20 Sem aumento Sem aumento

MZ 66-120 13-23 Possível leve aumento Leve aumento

SZ 45-80 9-15 Leve aumento Leve aumento

ZZ 10-40 2-8 Alto risco Alto risco

Nulo 0 0 Alto risco Sem aumento

Alelos Normais (M) – responsáveis por níveis séricos da proteína que variam de 20-53 μmol/l (150-350mg/dl), quando em homozigose (BARKER et al,1997);

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Alelos deficientes - caracterizam-se pelos níveis séricos da proteína reduzidos para menos de um terço dos valores normais (CAMELIER et al ,2008) porém mais detectáveis, estão associados à riscos elevados para desenvolvimento de doenças pulmonares e hepáticas, o que inclui as variantes deficientes mais frequentes Z e S, e variantes mais raras (LUISETTI e SEERSHOLM,2004).

Alelos Nulos (Null) - Atualmente são designados por Q0 (CAMELIER et al ,2008), implicam níveis indetectáveis no sangue, produzem taxas menores à 1% da concentração normal de A1AT no plasma, ou até mesmo nenhuma, representando menos de 1% de todos os alelos da alfa-1-antitripsina (TAKAHASHI e CRYSTAL,1990).

Esses alelos raros respondem por 1. 6% das variantes deletérias registadas no Registo Espanhol de Doentes com Deficiência de AAT segundo HERNÁNDEZ et al (2015). Mutações nulas comprometem a estabilidade do RNA mensageiro ou da proteína, resultando em níveis extremamente baixos ou indetectáveis de AAT no soro. Portanto, genótipos compostos de alelos nulos homozigóticos ou acompanhados por outros alelos de SERPINA1 deficientes têm um risco particularmente elevado para o desenvolvimento precoce de enfisema pulmonar.

Alelos Disfuncionais - nível sérico da A1AT normal, mas com função reduzida, por exemplo os alelos F e Pittsburgh, entre outros (CAMELIER et al ,2008).

Tais alelos são considerados como alelos raros na população mundial (YANG et al,1999; TETEBENISSAN & GBEASSOR ,2009) conforme revela a tabela 6.

Tabela 6. Alguns dos alelos mais frequentemente relacionados à deficiência de alfa-1 antitripsina, mutações envolvidas e dados clínicos associados. (Adaptação de CAMELIER AA et al,2008; MATAMALA N et al,2015).

Alelos Tipo de mutação Doença (s) associada (s)

Variantes normais

M (vários subtipos) Substituição (1 par de bases) Nenhuma

Variantes deficientes

S Substituição (1 par de bases) Pulmonar

Z Substituição (1 par de bases) Pulmonar, hepática

Mmalton Deleção (3 pares de bases) Pulmonar, hepática

SiiyamaProcida e variações

Substituição (1 par de bases) Pulmonar, hepática Pulmonar, triagem familiar

Alelos nulos

Q0(subtipos) Q0madrid e Q0porto_Mmattawa, Brescia/Brescia e ZMvarallo e variações.

Deleção ou substituição Splicing prejudicado-duplicação

Nonsense

Pulmonar, eventualmente hepática Maior efeito pulmonar, todos com A1AT baixa ou indetectável.

Alelos disfuncionais

Pittsburgh Substituição (1 par de bases) Diátese hemorrágica

Z Substituição (1 par de bases) Pulmonar, hepática

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* O alelo Z é deficiente e também disfuncional.

O M é o alelo normal para a formação da alfa-1-antitripsina e existem mais de 80 variantes de mutações para este gene. O alelo Z resulta da mutação de glutamato para a lisina, enquanto o alelo S produz a mutação de glutamato para valina. Em indivíduos com genótipos SS, MZ e SZ, os níveis séricos de A1AT são reduzidos para 40 a 60% dos níveis normais. Entre as pessoas não tabagistas, essa concentração de A1AT é quase sempre suficiente para proteger os pulmões dos efeitos da elastase. Por outro lado, entre os indivíduos com genótipo ZZ, os níveis de A1AT são geralmente inferiores a 15% do valor da normalidade, e esses pacientes podem desenvolver doença pulmonar em idade jovem. Além disso, indivíduos com o genótipo ZZ podem desenvolver doenças hepáticas associadas a secreção diminuída de A1AT e seu consequente acúmulo no fígado, observadas nos primeiros 20 anos de vida. Portanto, pacientes com deficiência de alfa-1 antitripsina podem desenvolver doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) - Enfisema e bronquite crônica, pneumotórax, bronquiectasias (dilatação da VA), asma (com obstrução de fluxo de ar que não reverte), enfisema panacinar e hepatopatias diversas como hepatite, hepatopatia crônica e carcinoma hepatocelular em adultos. Pode ainda ocorrer cirrose hepática em crianças, adolescentes e adultos, hepatite neonatal “idiopática” em 5 a 10% dos casos, e colestases neonatal em recém-nascidos, além de paniculite necrotizante (uma condição da pele) e vasculite de tipo C-Anca positivo (inflamação dos vasos sanguíneos pequenos) (VASCONCELOS YA et al,2015; TOMMASO, 2009).

Os sintomas pulmonares da deficiência de alfa-1 antitripsina incluem dispneia progressiva, tosse mínima, com produção de pequena quantidade de escarro mucoide. As infecções do trato respiratório inferior são menos frequentes do que nos pacientes com bronquite crônica predominante. Os sinais e sintomas são os mesmos encontrados no exame físico do enfisema pulmonar e na bronquite crónica. A aparência característica do enfisema nos pacientes portadores de deficiência de alfa-1-AT na radiografia de tórax é um aumento na translucência dos campos pulmonares, com um predomínio nas bases, e uma escassez da vascularização pulmonar, a qual não se estende até à periferia, sendo que a trama vascular nos lobos superiores é relativamente preservada. Bolhas estão comumente presentes, e há evidências de hiperinsuflação pulmonar. A atopia pode ser um factor de risco para o desenvolvimento de obstrução ao fluxo aéreo na deficiência de alfa-1 antitripsina (LÈSM NETO et al,2004).

Esse enfisema panacinar (panlobular) também pode ser identificado em fumantes, no pulmão do idoso ou em processos de obstrução bronquiolar. Observa-se a presença de bronquiectasias em alguns pacientes com deficiência grave de alfa-1- AT com prevalência de 5 a 10%. O tipo de bronquiectasias mais frequente nesses pacientes, a cilíndrica, pode ocorrer como resultado da patologia pulmonar na DPOC usual. Portanto, as bronquiectasias podem ser uma consequência do enfisema pulmonar nos pacientes com fenótipo PI*ZZ. Crianças e adolescentes com deficiência de alfa-1-antitripsina parecem não apresentar anormalidades significativas da função pulmonar (LÈSM NETO et al,2004).

Observa-se, em aproximadamente 10% das crianças com fenotipo proteína Z,

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icterícia obstrutiva prolongada, e cerca de 2% dessas crianças evoluem com insuficiência hepática e necessitam de transplante de fígado. Com o aumento da idade, existe alto risco de hepatopatias. A doença hepática associada a deficiência de A1AT também pode ser descoberta no final da infância ou no início da adolescência, quando se observa distensão abdominal devido a hepatoesplenomegalia ou ascite, esplenomegalia ou hemorragia digestiva alta causada por varizes de esôfago (VASCONCELOS YA et al,2015).

A deficiência também está associada a glóbulos Schiff diastase-resistente em alguns dos hepatócitos. Não está definido por que muitos hepatócitos não apresentam esses glóbulos, os chamados hepatócitos globulares-desprovido (VASCONCELOS YA et al,2015).

ASSOCIAÇÃO DA DA1AT COM TEA

Um estudo realizado por RUSSO et al. (2009) demonstra aumento de pessoas com baixos níveis séricos de AAT em famílias de indivíduos autistas, causada pelo menos em partes, pelo genótipo PI*MZ. Assim, os autores concluíram que o baixo AAT sérico em crianças autistas sugere fortemente uma associação entre o autismo e a deficiência de AAT. Uma vez que a concentração de AAT pode ser menor que a da população normal, a detecção de AAT sérica baixa e o estabelecimento do genótipo AAT podem ser ferramentas úteis para avaliar o prognóstico no autismo e sugeriram que uma melhor compreensão da incidência de deficiência de AAT em famílias autistas e sua relação potencial com doenças gastrointestinais, hepáticas e pulmonares pode melhorar a terapia.

Se as crianças autistas expressam baixos níveis de alfa-1-antitripsina eles podem ser mais suscetíveis a danos proteolíticos causados pelo excesso digestivo de enzimas liberadas por glóbulos brancos durante a inflamação ou infecção (WALKER e ANDREWS,1972; ENGSTROM et al,2004).

Crianças autistas também têm anormalidades gastrointestinais funcionais. Foram encontradas baixas atividades de enzimas disacaridase (lactase, maltase, sucrase, palatinase e glucoamilase) em crianças autistas (HORVATH K. et al, 1999). Testes de função hepática anormais do soro tem sido descrito em crianças com AD (ALBERTI A. et al, 1999; O'Reilly B. e WARING R., 1993). Obtiveram biópsias ileocolônicas de 60 crianças consecutivas com transtornos do desenvolvimento, 83% das quais tinham autismo. Uma vez que algumas crianças autistas têm problemas GI que podem estar associados com a inflamação, a hipótese de que baixos níveis de AAT podem estar associados a estas condições (WAKEFIELD et al, 2000).

No estudo de Russo et al. (2009) um elevado número de crianças autistas com baixos níveis de AAT também apresentou hiperbilirrubinemia neonatal (8/22), problemas respiratórios (9/23) e distúrbios digestivos (7/22), portanto os autores consideraram que pode haver uma associação entre a deficiência de AAT e esses distúrbios, além de uma associação entre crianças autistas com doença regressiva e deficiência de AAT. Hipotetizaram ainda que, além da predisposição genética, fatores ambientais podem estar influenciando os níveis de AAT sérica nesses indivíduos. Sabendo que os baixos níveis de alfa-1 antitripsina é herdada, e que os baixos níveis de

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AAT pode estar associado com doenças gastrointestinais, a genotipagem de crianças autistas pode ajudar a identificar os autistas suscetíveis ao desenvolvimento de problemas digestivos. E uma melhor compreensão da incidência de deficiência de AAT em famílias autistas e seu potencial relacionamento com doenças hepáticas, pulmonares e intestinais pode levar a melhores estratégias terapêuticas.

ORIGEM DAS VARIANTES ALÉLICAS

Dados obtidos por mapeamento genético indicam que o alelo PI*Z provavelmente surgiu no norte da Europa há 107-135 gerações (3.210-4.070 anos atrás), no período neolítico (Camelier et al,2008). Acredita-se que tenha origem no sul da Escandinávia ha 66 gerações, ou 2.000 anos atrás e se dispersou com as conquistas do legado dos Vikings. A mutação no alelo PI*Z teve origem no éxon V do gene da A1AT havendo a substituição da guanina na posição 9985 por uma adenina, o que ocasionou a troca do ácido glutâmico na posição 342 pela lisina na cadeia polipeptídica (CARLSON et al ,1989).

Quando em homozigose (PI ZZ), este alelo denota concentrações de A1AT no soro com variação entre 15 a 50 mg/dl, o que corresponde a aproximadamente 10 a 20% da concentração determinada pelos alelos PI*M (SERRA et al ,2008). O alelo deficiente PI*S teria surgido antes, mas os dados são mais imprecisos; estima-se que tenha surgido há 279- 470 gerações (8.370-14.100 anos atrás), provavelmente na Península Ibérica, em razão da sua alta incidência nessa região (CAMELIER AA et al,2008). Acredita-se que tenha origem na Península Ibérica, com um conjunto de tribos, que lutavam contra os Romanos, entre elas os Lusitanos. Se dispersou para o resto do mundo através de migrações desses povos. O alelo PI*S é mais comum do que o alelo PI*Z, e representa 0,02 a 0,04 de todos os alelos do sistema PI em caucasianos no norte da Europa. Em indivíduos de origem da Península Ibérica, especialmente do norte de Portugal e na Galícia, região da Espanha, foi descrito com frequência de 0,15 (HUTCHISON et al ,1998).

A mutação PI*S ocorreu pela substituição (no códon do éxon III do gene) de uma adenina por timina, desencadeando a troca do ácido glutâmico na posição 264 da cadeia polipeptídica por valina (CRYSTAL et al ,1991). Os homozigotos SS secretam em média 40% menos alfa-1 antitripsina do que células normais, atingindo níveis de 100-200mg/dl (CURIEL et al ,1989).

FISIOLOGIA E FISIOPATOLOGIA

O fígado é tanto o maior órgão interno quanto a maior glândula do corpo humano. O fígado humano tem uma série de funções fisiológicas, incluindo produção de bile, hormônios e vitaminas, armazenamento de glicogênio, remoção de substâncias tóxicas, decomposição de glóbulos vermelhos, síntese de proteínas plasmáticas e regulação homeostática dos constituintes plasmáticos. O fígado é formado por células

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parenquimatosas (hepatócitos e células dos ductos biliares) e células não parenquimatosas (células endoteliais sinusoidais, células de Kupffer e células estreladas hepáticas) que sincronizam as funções vitais na homeostase do fígado. O fígado recebe sangue venoso e arterial da circulação sistêmica, rico em substâncias absorvidas do trato gastrintestinal, para nutrição de seus tecidos. Ele é dividido em dois lobos, o direito e o esquerdo. São compostos por unidades funcionais chamada de lóbulos. Um lóbulo consiste de fileiras de hepatócitos, dispostas em torno de uma veia central. Sinusóides são capilares grandes, que ficam entre as fileiras de hepatócitos por onde o sangue passa. São parcialmente revestidos de células reticuloendoteliais estreladas fagocíticas (de Kupffer), que destroem os leucócitos e eritrócitos velhos, bactérias e substâncias toxicas. As células de Kupffer removem os micróbios e a matéria estranha ou morta do sangue. Ramos de ambas (artéria hepática e veia porta) conduzem o sangue aos sinusóides, onde o oxigênio e maioria dos nutrientes e das toxinas é extraído pelos hepatócitos.

Os nutrientes são armazenados ou usados para fazer novos materiais. Nutrientes necessários para outras células são secretados no sangue. Toxinas são armazenadas ou há desintoxicação. Em geral o fígado monitora as substâncias antes que passem à circulação geral. Pode remover glicose excessiva e armazená-la. Modifica substâncias para ser utilizadas pelas células. Faz desintoxicação de substâncias perigosas absorvidas pelo trato gastrintestinal e destrói bactérias por fagocitose (TORTORA GJ,2000).

A análise de transcriptoma mostra que 59% de todas as proteínas humanas (n = 19628) são expressas no fígado e 422 destes genes mostram uma expressão elevada no fígado em comparação com outros tipos de tecidos. Uma análise dos genes com expressão elevada no fígado com relação às funções biológicas mostra genes associados com processos do sistema imunológico, resposta ao estímulo, crescimento e processos metabólicos. Uma análise dos níveis de expressão de cada gene torna possível calcular o conjunto de RNAm relativo para cada uma das categorias. A análise mostra que 52% das moléculas de RNAm no fígado correspondem a genes de manutenção e, interessantemente, 45% do grupo de RNAm corresponde a genes classificados como fígado enriquecido. Assim, uma grande parte da atividade transcricional no fígado refere-se a proteínas com funções específicas do fígado. A análise aprofundada dos genes elevados no fígado identificou proteínas plasmáticas, enzimas, proteínas biliares e transportadores (UHLÉN, 2015).

POLIMERIZAÇÃO

As mudanças conformacionais oriundas da mutação do gene SERPINA1 que configura a proteína Z, modificam os blocos de construção de proteína simples (aminoácidos) na alfa-1 antitripsina, que alteram a estrutura da proteína predispondo as moléculas a sofrerem um processo de polimerização irreversível com consequente acúmulo de polímeros nos hepatócitos, que não pode deixar o fígado. Esta polimerização da AAT dentro do hepatócito impede a sua secreção para a circulação (CAMELIER et al 2008; LOMAS,2002; STOLLER,2005). Ainda que esse processo possa ocorrer em condições normais, fatores como altas concentrações de proteína Z, temperaturas elevadas e variações de pH facilitam a polimerização, porém, apenas cerca de 15% das moléculas produzidas atingem a circulação, levando à redução dos níveis séricos. O acúmulo destes polímeros danifica o fígado (CAMELIER et al,2008).

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A hepatopatia relacionada à deficiência de A1AT não é causada pela redução dos níveis séricos da enzima, mas pelo acúmulo de polímeros no interior dos hepatócitos. Desse modo, somente os portadores de mutações que resultam em polimerização, como Siiyama, Mmalton variantes nulas e, principalmente, Z, podem apresentar hepatopatia. Após serem formados, os polímeros se acumulam no retículo endoplasmático dos hepatócitos, onde, em condições normais, são degradados por enzimas que atuam com função de "controle de qualidade". A doença hepática, aparentemente, correlaciona-se à resultante da relação entre a formação de polímeros e a capacidade do sistema celular de "controle de qualidade" em degradar esses polímeros anormalmente formados. Parece haver considerável variabilidade individual na capacidade de degradação desses polímeros, o que explicaria o porquê de indivíduos de mesmo fenótipo apresentarem graus variáveis de doença hepática (CAMELIER et al,2008).

DOENÇA PULMONAR

A doença pulmonar associada ao alelo Z na deficiência de alfa-1 antitripsina é decorrente da alteração no balanço normal entre elastase e alfa-1-antitripsina, permitindo a degradação progressiva da elastina das paredes alveolares. Dois mecanismos contribuem para o desbalanço da elastase alfa-1AT. No primeiro, o bloqueio da secreção hepática de proteína Z mutante, embora incompleto, é grave, e os pacientes Z/Z apresentam apenas cerca de 15% da concentração plasmática normal de alfa-1AT. No segundo, a alfa-1-antitripsina com mutação Z apresenta apenas 20% da capacidade da proteína alfa-1-antitripsina normal de inibir a elastase neutrofílica (NUSSBAUM et al,2007).

A fração circulante da AAT corresponde a cerca de 40% do total corpóreo da proteína; o restante é encontrado no compartimento extracelular extravascular, impregnando os tecidos corporais, como os pulmões, onde fará parte do sistema de defesa tecidual contra a elastólise. Em condições normais, existe um excesso de AAT nos pulmões, o que garante proteção frente à ação elastolítica da elastase neutrofílica, que pode danificar o tecido pulmonar se não for controlada (CAMELIER et al,2008).

A elastase neutrofílica, catepsina G e proteinase 3 constituem os maiores inibidores de alfa-1-antitripsina dos pulmões. O parênquima pulmonar está exposto à ação dessas enzimas proteolíticas devido à passagem de neutrófilos através do tecido conjuntivo pulmonar. A elastase neutrofílica é liberada em grandes quantidades em resposta à ativação dos neutrófilos e tem como substratos certos componentes da matriz extracelular. A liberação excessiva de elastase neutrofílica resulta em destruição do parênquima pulmonar, portanto, a alfa-1- antitripsina tem a importante função de impedir essa destruição atuando como uma “anti- enzima” nos pulmões (LÉSM N et al,2004).

O mecanismo inibitório ocorre por meio de ligação entre a molécula de AAT e a protease. No processo de inibição, ocorre a destruição de uma molécula de AAT para cada protease inibida, de modo que existe uma perda de moléculas de AAT. A elastase neutrofílica é liberada pelos leucócitos para combater a infecções (GHR, 2017).

A elastase neutrofílica é armazenada nos grânulos azurofílicos de leucócitos polimorfos nucleares maduros. Esses grânulos são exocitados com a ativação dos

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neutrófilos e a protease contida é libertada na sua forma ativa. A concentração de elastase dentro desses grânulos é de aproximadamente 5 µM, quantidade muito maior do que a concentração normal de alfa-1antitripsina no plasma, que é de 30 µM, e no interstício, que é de 24 µM. Apesar da concentração cair rapidamente permanece acima de 10 µM. Portanto, a concentração de elastase cai rapidamente e iguala-se à concentração de alfa-1-antitripsina nos pacientes normais ou heterozigotos. Logo, o dano proteolítico fica limitado a uma área próxima do grânulo, mesmo em pessoas com deficiência parcial. No fenótipo PI*ZZ, a concentração plasmática média de alfa-1-antitripsina é de 5 µM, o que resulta teoricamente numa concentração intersticial de 4µM. Consequentemente, a quantidade de elastase libertada nos pulmões excede a quantidade de alfa-1-antitripsina presente, resultando numa atividade persistente da elastase com consequente destruição pulmonar e enfisema (LÉSM N et al,2004).

O desequilíbrio protease-antiprotease proporcionado pela ausência de A1AT funcional resulta num ambiente favorável à destruição da matriz extracelular do parênquima pulmonar. Esta hipótese é baseada na evidência de que a molécula de A1AT representa a principal antielastase na defesa alveolar, e indivíduos gravemente deficientes de A1AT possuem pouca ou nenhuma molécula de A1AT nos alvéolos. A quantidade de eventos proteolíticos é anormalmente maior e prolongada em indivíduos deficientes de A1AT, levando diretamente a um risco aumentado de lesão tecidual na proximidade dos neutrófilos ativados (CAMPBELL et al,1999). Além disso, segundo CAMELIER et al (2008), o tabagismo, além de potencializar a agressão pulmonar, reduz a ação da molécula de AAT como antiprotease em cerca de 2.000 vezes, e, portanto, representa importante fator evitável para o desenvolvimento de enfisema.

DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO

Em pacientes com alterações clínicas sugestivas de deficiência de AAT como enfisema de início precoce, história familiar de enfisema e doença hepática sem causa definida, entre outras o diagnóstico diferencial deve considerar além da clínica, a eletroforese de proteínas séricas para verificar banda alfa-1 reduzida ou ausente, e a quantificação dos níveis séricos de AAT. Além disso, deve ser realizado um estudo de fenotipagem para identificação das variantes de AAT. Atualmente, no Brasil e em outros países, existem programas que oferecem métodos simples para determinação fenotípica por meio de coleta de gotas de sangue em papel filtro seco, que pode ser enviado por correio a um laboratório de referência. Esses métodos diagnósticos podem ser facilmente obtidos junto ao Registro Nacional ou às sociedades locais. Estudos têm demonstrado que a determinação do fenótipo a partir de gotas de sangue em papel filtro seco é factível por ser simples e de baixo custo (CAMELIER et al,2008).

O diagnóstico de deficiência de AAT, portanto, é confirmado quando níveis séricos reduzidos são encontrados concomitantemente com um fenótipo sabidamente relacionado à doença. O diagnóstico em nível molecular (genotipagem), disponível em laboratórios especializados, é um método de exceção para a confirmação diagnóstica nos casos em que haja discrepância entre os níveis séricos de AAT e o fenótipo identificado; é indicado também para a identificação de variantes raras e para o estudo de novas

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variantes (CAMELIER AA et al,2008).A avaliação pulmonar segue rotina própria da prática pneumológica, que inclui

principalmente exame radiológico e prova de função pulmonar. O diagnóstico da doença em crianças com doença hepática colestática (com redução do fluxo de bile e icterícia) é feito com mais facilidade, pois é uma das causas mais comuns. Já no adulto que se apresenta com cirrose estabelecida, muitas vezes com ascite ou hemorragia por varizes de esôfago, entre outras complicações da cirrose, o diagnóstico não é feito tão facilmente, pois a redução da A1AT no sangue não é tão severa (pode ser normal e até elevada em períodos de inflamação sistêmica) e o adulto tem outras causas de cirrose muito mais comuns, como a cirrose alcoólica, as hepatites B e C, a NASH, e a CBP dentre outras (JORGE, 2016).

Os portadores de DPOC secundária à deficiência de AAT devem receber tratamento usual conforme as principais diretrizes vigentes, incluindo fármacos bronco-dilatadores, corticosteroides inalatórios (quando indicados), reabilitação pulmonar e tratamento precoce e adequado de exacerbações. Em geral, os portadores de deficiência de AAT apresentam resposta imunológica normal, e indica-se vacinação (anual contra influenza e a cada 5 anos contra pneumococos). O transplante pulmonar é outra opção cirúrgica para pacientes com doença pulmonar avançada. O tratamento específico atualmente disponível para a doença pulmonar secundária à deficiência de AAT consiste em infusão intravenosa periódica de concentrados da proteína purificados a partir de plasma humano; tal reposição visa a elevar os níveis séricos de AAT e, assim, reconstituir a defesa pulmonar contra a elastólise tecidual. Sua eficácia em atingir determinados desfechos (como manutenção de níveis séricos suficientes, retardo do declínio da função pulmonar e melhora na sobrevida), a segurança e o custo- efetividade (CAMELIER AA et al,2008).

Pode-se ainda realizar a suplementação de A1AT por via parenteral (aplicação de A1AT humana purificada por via endovenosa uma vez por semana) ou, experimentalmente, por via nasal. A maioria dos adultos que se apresentam com complicações da doença hepática já não teriam mais benefício de um tratamento que reduzisse a lesão no fígado.

Nesses pacientes, a vacinação contra as hepatites A e B e a abstinência alcoólica poderiam reduzir a sobreposição de patologias e, portanto, a velocidade de progressão da doença. São necessários também cuidados para evitar complicações da cirrose, como a hemorragia por varizes esôfago-gástricas, a ascite (e consequentemente a peritonite bacteriana espontânea), a encefalopatia hepática e o rastreamento de hepatocarcinoma e colangiocarcinoma (JORGE, 2016).

Têm-se buscado outras formas de administração, bem como terapias que não envolvam reposição de AAT exógena, seja por meio da estimulação da produção endógena da molécula ou do uso de outros fármacos. Terapias genéticas têm também sido alvo de estudos recentes, envolvendo tanto a indução de produção de moléculas normais de AAT quanto a inibição da produção de moléculas mutantes. Genes normais foram inseridos com sucesso, por meio de vetores virais, em células musculares e hepáticas, e também no espaço pleural, resultando em produção sustentada de níveis expressivos de AAT. Um estudo recente demonstrou inibição da produção da forma Z da AAT em camundongos, usando clones de siRNA integrados a vetores virais. Evidenciou-se tanto a redução da produção quanto do acúmulo de moléculas no interior dos hepatócitos após 3 semanas (SERRES e BLANCO,2014).

Os hepatócitos com o gene implantado que conseguirem se "fixar", tendem a se

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multiplicar em uma velocidade superior aos "nativos", o que permitiria o "repovoamento" parcial do fígado por células capazes de produzir A1AT em quantidade mais próxima do normal, protegendo o pulmão de lesões e evitando a insuficiência hepática (CAMELIER et al,2008).

O transplante hepático, que tem as mesmas indicações na deficiência de A1AT que nas demais doenças hepáticas crônicas, tem a particularidade de levar a uma "cura" da doença, pois o fígado transplantado produziria A1AT normal. Na legislação brasileira, o portador de deficiência de A1AT tem posição privilegiada na lista de transplante hepático, conforme a portaria 1.160 do Ministério da Saúde (JORGE, 2016).

ACONSELHAMENTO GENÉTICO

Em pacientes com DPOC de 2% a 3% são diagnosticados com deficiência de alfa-1- antitripsina. Uma das razões para esse sub-diagnóstico constitui na dificuldade da classe médica em associar as manifestações de DPOC com a deficiência de alfa-1-antitripsina. Ocorre um atraso médio estimado de 7,2 anos entre os primeiros sintomas e o diagnóstico da condição. Além disso, não se sabe qual é a proporção de indivíduos com deficiência grave de alfa-1-antitripsina que não desenvolve manifestações clínicas, o que pode contribuir para esse provável sub-diagnóstico (LÉSM et al,2004).

Com o diagnóstico precoce, existe a possibilidade de aconselhamento desses pacientes a evitar o tabagismo. Entre os indivíduos identificados no nascimento há uma menor incidência de tabagismo (3% em adolescentes) do que entre os que foram diagnosticados mais tardiamente. Apesar deste potencial para educar as pessoas identificadas com ênfase num estilo saudável e, assim, diminuir os impactos da doença pulmonar sobre a morbidade e a mortalidade de futuras gerações, o rastreio neonatal não tem sido largamente aceito. Principalmente em países subdesenvolvidos onde não se têm informação suficiente sobre a doença, e incentivo a pesquisas. É recomendado que sejam desenvolvidos programas de rastreio neonatal em todos os países desenvolvidos com populações caucasianas, e que apresentem miscigenação com etnias onde os alelos têm maior prevalência. Programas epidemiológicos devem ser realizados em países desenvolvidos para determinar a frequência de genes determinantes da deficiência e o desenvolvimento da manifestação de doenças nessas populações (LÉSM N et al,2004).

Embora a deficiência de alfa-1-antitripsina seja uma doença hereditária de alta prevalência, principalmente em determinadas populações, além de potencialmente fatal, o rastreio populacional em adultos não é praticável, levando-se em consideração os custos, embora seja útil para se estimar a prevalência de casos não diagnosticados de deficiência de alfa-1-antitripsina na comunidade. As indicações para o rastreio da doença com um exame quantitativo incluem: bronquite crónica em paciente que nunca fumou; bronquiectasias na ausência de fatores de risco; DPOC em pacientes menores de 50 anos;

enfisema pulmonar predominantemente basal; asma de difícil tratamento, especialmente em menores de 50 anos; cirrose sem fatores de risco. O Consenso Brasileiro de DPOC recomenda a dosagem de alfa- 1-antitripsina nos casos de aparecimento de enfisema pulmonar em pacientes com idade inferior a 50 anos que nunca fumaram, com história

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familiar de enfisema grave, com doença hepática de causa desconhecida associada ao enfisema e nos casos em que há predomínio de alterações radiológicas de enfisema nas bases pulmonares. Os pacientes com resultados anormais nos exames iniciais devem ser submetidos à tipagem do inibidor de protease (LÉSM N et al,2004).

CONCLUSÃO

A deficiência de alfa-1-antitripsina em seres humanos é uma das alterações genéticas hereditárias mais prevalentes na população caucasiana condicionada por um padrão de herança autossômico co-dominante que apresenta heterogeneidade alélica. Essa deficiência, provocada por mutações no gene da Serpina 1 - localizada em 14q32.1 e que sintetiza uma glicoproteína circulante chamada alfa-1 antitripsina, é responsável por alterações de expressão gênica principalmente nos leucócitos, hepatócitos e tecido pulmonar conferindo, portanto, aumento do risco de desenvolvimento de doenças pulmonares e hepatopatias normalmente não detectáveis precocemente. Sendo assim, faz-se necessário a criação de programas de rastreio neonatal em todos os países desenvolvidos que possuem populações caucasianas, além dos que apresentam miscigenação que sugerem prevalência elevada dos alelos que promovem a deficiência, como é o caso do Brasil. Esses programas diminuiriam a morbidade e a mortalidade destas doenças melhorando a saúde pública brasileira.

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