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Eduardo Alécio – CEFET/PE
Métodos Microbiológicos para Contagem de Fungos e Bactérias
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Contagem Padrão em PlacaÉ um método de inoculação, onde se introduz uma quantidade de amostra num meio de cultura adequado.
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• Inoculação em placas de Petri: Técnica em superfície (Spread Plate)
IncubaçãoMeio Sólido
Espalhamento
Amostra
Adiciona-se 0,1 mL de uma diluição da amostra com pipeta estéril no centro da placa e espalha-se com o auxílio de uma alça de Drigalski ou um bastão estéril.
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Contagem Padrão em Placa (cont.)3
• Inoculação em placas de Petri:
Técnica em Profundidade (Pour Plate)
Incubação
Meio Líquido
Amostra
Adiciona-se 1 mL da amostra ou sua diluição na placa de Petri vazia. Verte-se 20 mL de meio de cultura fundido e resfriado a 45ºC. Agita-se a placa em movimentos circulares .
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Resultado a ser alcançado:
• Que no meio sólido cada célula viável (UFC) dê origem a uma colônia isolada.
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Contagem Padrão em Placa (cont.)
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Número Mais Provável - NMPTécnica de diluição idealizada por McCrady (1915), onde se faz uma estimativa da densidade média dos microrganismos na amostra
De fácil execução, mas é laboriosa.
Baseia-se em fórmulas de probabilidade
É estimada utilizando fórmula ou tabelas
A densidade microbiana é estimada pela relação de tubos positivos e negativos
Aplicado apenas para contagem de Bactérias
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Número Mais Provável - NMP (cont.)
1. Diluições sucessivas:
10 g
da Amostra
1mL 1mL
90mL
9 mL 9 mL
Dil 1/10 Dil 1/100 Dil 1/100
1 mL Dil. 1/10
1 mL Dil. 1/100
1 mL Dil. 1/1000
1 mL Diluente
2. Incubação: Em meios adequados
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Número de tubos cujo crescimentoé visível para cada quantidade do
produto sob exame
NúmeroMais
Provávelde
microrganismos
por g oumL
Limite NMP
100 mg ou 0,1 mL
/tubo
10 mg ou0,01 mL
/tubo
1 mg ou0,001 mL
/tubo
Inferior
Inferior
00011111222233333
00100112001123333
01001010010120123
<333477
11119
141520210240460
1100>2.400
-<0,5<0,50,511331337
35367150-
-913202123363636374489
470130024004800
-
Número Mais Provável - NMP (cont.)
Leitura: Tabela estatística
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Filtração por Membrana8
O método baseia-se na filtração de volumes adequados da amostra diluída através de membrana filtrante com porosidade de 0,45 µm.
As bactérias e fungos a serem detectados, apresentando dimensões maiores, ficarão retidas na superfície da membrana, a qual é então transferida para placa de Petri contendo meio seletivo e diferencial.
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Filtração por Membrana (cont.)9
2. Montar assepticamente a membrana no sistema de filtração
3. Ligar a fonte de vácuo
1. Diluir a amostra
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Filtração por Membrana (cont.)
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4. Filtrar a amostra diluída (Equivalente a 1g da amostra)
5. Transferir o filtro para o meio sólido em placa de Petri
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Filtração por Membrana (cont.)
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6. Incubar em temperatura para bactéria e fungo
7. Contar as colônias e calcular o nº de microrganismo / g ou mL
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•Determinar o número total de bactérias e fungos em produtos e matérias-primas Não-estéreis
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Contagem de Microrganismos Viáveis Totais em Produtos Farmacêuticos (Farmacopéia Brasileira 4ª edição, 1988)
-Contagem da população microbiana que cresce após 4 dias emágar Caseína-soja a 30-35ºC
-Contagem da população microbiana que cresce após 7 dias emágar Sabouraud Dextrose a 20-25ºC
Sobre o Método:
Realizar o teste preferencialmente em capela de fluxo laminar.
Quando possível utilizar filtração por membrana.
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•Limites Microbianos para Produtos Farmacêuticos (USP XXIV)
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Contagem de Microrganismos Viáveis Totais em Produtos Farmacêuticos (cont.)
-Preparações para Uso Oral e Tópico:
Bactérias mesófilas aeróbias: Máximo 500/g ou mLBolores e leveduras: Ausência
-Outros Produtos
Bactérias mesófilas aeróbias: Máximo 103/g ou mLBolores e leveduras: Máximo 102/g ou mL
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