fato de que o endosperma, aproxima-damente 80% do peso seco do grão,possuir uma baixa porcentagem deproteínas ricas em aminoácidos essen-ciais necessários à manutenção deuma dieta balanceada (Nelson, 1969).

Na América Latina, África e Ásia,vários milhões de pessoas dependemdo milho como fonte diária de alimen-to. Para muitos, este cereal é a princi-pal fonte de proteína da dieta. Ogrande estado de pobreza, em algu-mas regiões do planeta, faz com queseja impossível para seus habitantescomprar carne, ovos, leite, ou mesmooutros alimentos à base de vegetaisricos em proteínas para suplementar omilho. Muitas pessoas, entre elas re-cém-nascidos, crianças, mulheres grá-vidas e doentes, têm sua alimentaçãobaseada em uma dieta quase que total-mente derivada do milho, o que não écapaz de proporcionar crescimento esaúde adequados (National ResearchCouncil, 1988). Dietas não balancea-das em carboidratos, proteínas, lipíde-os e micronutrientes são um problemamundial. Atualmente, mais de 800milhões de pessoas, o equivalente a15% da população do mundo, obtêmmenos do que 2.000 calorias por dia evivem em estado de fome permamen-te ou intermitente, sendo cronicamen-te subnutridos (Conway, 2000). Por-tanto, o melhoramento da composiçãonutricional de plantas usadas na ali-mentação, principalmente de culturasbásicas como o milho, é uma necessi-dade ao redor do mundo.

MILHO A

TRANSGENICOMelhoria da qualidade nutricional do grão

Andréa Almeida CarneiroPh.D Biologia Molecular

andreacêcnpms.embrapabrNeuiton. Portilho Carneiro

Ph.D Biologia Molecularnewlonc@cnpms.embrapa.br

Carlos Henrique S. CarvalhoPh.D Biologia Molecular

benriqueêcnpms.embrapa.brMariaJ. V. Vasconcelos

MS Agroquimicamariajose@cnpms.embrapa.br

Edilson PaiuaPh.D Biologia Molecular

edilsonãcnpms.embrapa.brEmbrapa Milbo e Sorgo

Sete Lagoas, MG.Mauricio Antônio Lopes

Pb.D Biologia Molecularmauriciolopesãembrapa.brEmbrapa Sede - Brasilia, DF

42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

Fotos cedidas pelos autores

Omilho, uma das maioresfontes de alimento, écultivado em todo omundo. Movimenta ummercado de, aproxima-damente, U$40 bilhões

anuais, distribuídos entre indústrias deprodução de alimentos para consumohumano, rações e matéria-prima paracentenas de produtos industrializados.O Brasil produz mais de 30 milhões detoneladas de milho anualmente, em 13milhões de hectares. Apesar de possuirteores protéicos em torno de 10% da

Figura 1: Estrutura do Grão deMilho. (A) Pericarpo; (B)Endosperma, (C) Embrião; (D)Pendúculo

matéria seca, a proteína do grão domilho não é considerada adequadapara a nutrição de animais monogástri-cos incluindo o homem. Isso se deve ao

o Grão do Milho

O milho é uma planta cultivadade grande versatilidade, sendo utiliza-

GRÃo NORMAl DE MILHO GRÃo TRANSGÊNICO DE MILHO

Delta zeíno (rico em mefienine)PROIA ORF

PROM ORFGomo zeíno

~l(J---PROM ORF

Figura 2: Melhoria da Qualidade Nutricional do Milho - Hipótese emEstudo. A ORF do gene da ê-zeína, representado pelo bloco vermelho,codifica para uma proteína rica em metionina, um aminoácido essencial.Entretanto, essa proteína corresponde a apenas 5% das zeínas presentesno endosperma do milho. No bloco azul está representado o gene da y-zeínas, o qual codifica para uma proteína abundante no endosperma, maspobre em aminoácidos essenciais. A abundância de y-zeínas no grão édevida principalmente à alta atividade endosperma-específico do promotordesse gene (PROM). Na tentativa de aumentar a produção da O-zeína noendosperma e, consequentemente, o teor de metionina do grão, um genequimérico composto da região promotora do gene das y-zeínas ligada àregião codante do gene das O-zeína foi construído (representado noesquema acima pelo bloco azul e vermelho). PROM: região promotora dosgenes: ORF: "open reading frame" ou região codificadora das proteínas

do diretamente como alimento, forra-gem ou matéria-prima para vários pro-dutos industrializados. Somente é co-nhecido em cultivo e, na sua formaatual, não apresenta indicativos deque pudesse sobreviver sem os cuida-dos do homem. Os programas demelhoramento genético têm desen-volvido tipos tão diferentes de milho,que seu cultivo é possível desde o

Equador até o limite das ter-ras temperadas e desde onível do mar até altitudessuperiores a 3.600 m.

O grão de milho é umacariopse que consiste deembrião, endosperma, peri-carpo e pedúnculo (Figura1). O pericarpo (camada ex-terna) é derivado da parededo ovário e pode ser incolor,vermelho, marrom ou varie-gado. Os embriões do milhonão armazenam reservasdurante o desenvolvimentoda semente, a não ser umapequena quantidade de Iipí-dios no escutelo. Observa-se, entretanto, que as reser-vas de carboidratos são poli-merizadas no endosperma naforma de amido e as reservasde proteínas, acumuladas noscorpos protéicos distribuídosem todo o endosperma.

O endosperma é um teci-do triplóide, que se formacomo resultado da fusão donúcleo do pólen com doisnúcleos femininos (Wolf etal., 1952). Esse tecido é res-ponsável por 98% do amido,80% da proteína e 15% doslipídios presentes no grão

Figura 3: Processo de Seleção e Regeneração de Plantas Transgêni-cas de Milho. (A) Embrião imaturo de milho com 2 mm; (B) Embri-ões imaturos após 2 semanas em meio de cultura N6 suplementadocom Dícamba, (C) Calo embriogênico cultivado em meio seletivocom glufosinato de amônio, (D) Processo de maturação de calosembriogênicos; (E) Germinação de embriões transgênicos: (F)Plantas transgênicas em casa de vegetação

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 43

(Glover and Mertz, 1987).As proteínasdo endosperma do milho podem serdivididas, de acordo com sua solubili-dade, em quatro frações: albuminas,globulinas, prolaminas e glutelinas. Asalbuminas são solúveis em água e asglobulinas em soluções salinas diluí-das. Albuminas e globulinas contribu-em com 6% das proteínas do endos-perma: sendo que várias delas sãoenzimas sintetizadas no início do de-senvolvimento do embrião. As gluteli-nas podem ser extraídas com soluçõesácidas ou alcalinas diluídas e contribu-em com 30 a 40% das proteínas' totaisdo grão. As prolaminas, 60% das pro-teínas, são solúveis em soluções alco-ólicas e não possuem atividade enzi-mática, sendo apenas fonte de amino-ácidos, nitrogênio e esqueletos carbô-nicos para o desenvolvimento da plân-tula (Guimarães, 1993). Prolaminas domilho são também conhecidas comozeínas.

As zeínas são classificadas em qua-tro tipos distintos baseados na suaestrutura primária e solubilidade: 19 -22 kD alfa zeína (a), 14 kD beta zeína(P), 16-27kD gamma zeína (y) e 10 kDdelta zeína (o) (Esen, 1986; Larkins etaI., 1989). Alfa zeínas são as proteínasmais abundantes, perfazendo aproxi-madamente 60% das proteínas de re-serva, sendo seguidas pela y-zeína(25%), p-zeínas (5-10%) e o-zeínas(5%). As zeínas possuem uma consti-tuição aminoacídica bastante diversifi-cada. As e-zeínas têm conteúdo eleva-do de glutamina (25%), leucina (20%)alanina 05%) e prolina 01 %) e variamem tamanho de 210 a 245 aminoáci-dos. A proteína p-zeína é constituídade 160 aminoácidos e contém menosglutamina 06%), leucina 00%) e pro-lina (9%) que as n-zeínas, mas temsignificativamente mais metionina (4%)e cisteína (7%). A y-zeína possui 180aminoácidos e 7%de cisteína e 25%deprolina. A o-zeína é uma proteína de130 aminoácidos e conteúdo muitoalto do aminoácido sulfurado metioni-na (23%) (Kirihara et ai, 1988). Apesardas zeínas constituirem a maior por-ção do grão de milho, seu valor protéi-co para alimentação de animais mono-gástricos, incluindo o homem, é baixo,devido à baixa concentração de ami-noácidos essencias, tais como lisina,metionina e triptofano.

Os genes que codificam para essasproteínas já foram isolados e caracte-

44 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

rizados (revisão Feix e Quayle, 1993).As a-zeínas são codificadas por umafamília de genes múltiplos com 50 a100 membros (Heidecker et al., 1991).Em contraste, P, ye Ozeínas são codi-ficadas por apenas um ou dois genes.Um dos maiores desafios no melhora-mento do milho é entender a regula-ção desses genes para que eles pos-sam ser manipulados com o objetivode melhorar a qualidade física e nutri-cional do grão.

Melhoria da Qualidade Nutricio-nal do Milho Utilizando Sequênci-

as Endógenas: Uma EstratégiaDesejável do Ponto de Vista de

Biossegurança

Os melhoristas de plantas depen-dem da variabilidade genética existen-te na natureza como matéria-primapara desenvolverem cultivares superi-ores. A revolução biotecnológica ocor-rida na última década possibilitou odesenvolvimento de tecnologias quepermitem acesso a novas e variadasfontes de variabilidade genética. Emespecial, o aprimoramento das tecno-logias de DNA recombinante tem ge-rado um crescente interesse na aplica-ção desses conhecimentos para gera-ção de nova variabilidade genética,utilizável em programas de melhora-mento de plantas. O desenvolvimentode cultivares com uma melhor quali-dade protéica pode ser drasticamenteacelerado com a utilização de técnicasde manipulação gênica e transforma-ção. O Núcleo de Biologia Aplicada daEMBRAPAMilho e Sorgo - Sete Lagoas/ MGdesenvolve uma ação multidisci-plinar, que engloba a utilização con-junta de técnicas de melhoramentogenético e de biologia molecular, como objetivo de desenvolver novas linha-gens de milho tropical com qualidadenutricional melhorada. Para alcançaresse objetivo, genes endógenos quecodificam proteínas raras de alta qua-lidade nutricional tiveram sua regula-ção alterada por meio da engenhariagenética, com adição de promotoresde proteínas de reserva de alta ativida-de endosperma-específica. Do pontode vista de biossegurança, a estratégiade transformar milho com seqüênciasisoladas da própria espécie é desejá-vel, uma vez que se buscará apenasalterar a regulação de genes que já sãonaturalmente expressos na planta.

Na tentativa de aumentar a produ-ção da o-zeína no endosperma utili-zando-se técnicas de biologia molecu-lar, foi construído um gene quimérico,onde a região promotora do gene dasy-zeínas foi ligada à região codante dogene das o-zeína. Como foi expostoanteriormente, a o-zeína é uma prote-ína que contém 23% do aminoácidoessencial metionina, mas essa proteínacorresponde a apenas 5%das prolami-nas presentes no endosperma. Poroutro lado, um dos promotores demaior atividade no endosperma domilho é aquele dos genes que codifi-cam a proteína de reserva y-zeínas. Emmilhos normais, 25% das proteínas dereserva dos grãos são representadospelas y-zeínas. As O-zeínas e as y-zeínas são codificadas por genes pre-sentes em uma ou duas cópias nogenoma, o que torna seus sistemasregulatórios ferramentas potenciaispara alteração da atividade gênica viaengenharia genética. Hipoteticamen-te, plantas transgênicas de milho, con-tendo a construção quimérica descritaacima, produzirão uma maior quanti-dade de ô-zeína no endosperma, umavez que essa proteína está sob o co-mando de um promotor de alta ativi-dade endosperma-específico - pro-motor y-zeínas. Um esquema da estra-tégia utilizada para o melhoramentoda qualidade nutricional do grão demilho é mostrado na Figura 2. Umaumento da o-zeína no endospermaacarretará um conseqüente aumentodo aminoácido essencial metionina nogrão do milho, possibilitando o desen-volvimento de plantas de milho tropi-cal transgênicas de alta qualidade nu-tricional sem a necessidade da utiliza-ção de genes exógenos, uma vez queo-zeína e y-zeínas são normalmenteexpressas no endosperma de milhosnão transgênicos.

Transformação Genética doMilho Via Biobalistica

Atualmente, com o desenvolvimen-to da biologia molecular, houve umgrande avanço na compreensão dosmecanismos genéticos e bioquímicosbásicos, o que permitiu o desenvolvi-mento de novas estratégias de melho-ramento por meio da transformaçãogenética. Sendo uma das' maiores co-modites na agricultura internacional euma fonte importante de nutrientes

para homens e animais, o milho temsido alvo de muitos estudos de mani-pulação gênica (Barcelo e Lazzeri,1995). Entretanto, a maioria dos estu-dos sobre produção de plantas trans-gênicas de milho foram realizados coma utilização de genótipos adaptados aoclima temperado (Bohorova et al.,1999), portanto foi necessário o desen-volvimento de tecnologias para a pro-dução de linhagens de milho transgê-nicas adaptadas ao clima tropical esubtropical.

Apesar dos cereais serem um dosgrupos mais difíceis de se transforma-rem, plantas transgênicas têm sidoconsegui das utilizando estratégias taiscomo eletroporação, biobalística eAgrobacterium tumefaciens (Hiei et

1 2 3 4 s 6

---

madas via A. tumefaciens. Esse méto-do também oferece vantagens sobre atransformação mediada por Agrobac-terium tumefaciens, tais como inde-pendência de genótipos específicos,simplicidade dos protocolos de trans-formação, uso de construções maissimplificadas e eliminação de falso-positivos devido à persistência de Agro-bacterium no tecido infectado.

A biobalística é baseada na trans-formação de células usando micropar-tículas de tungstênio ou de ouro reves-tidas com o DNA de interesse. Usando-se equipamentos especiais denomina-dos "particle gun", as micropartículassão propulsionadas sob alta pressão epenetram na parede celular e nasmembranas sem matar as células (Klein

7 8 9 10

Figura 4: Comparação Entre asZeínas Presentes no Endosper-ma de Grãos de Milho não-Transgênicos e Transgênicos. Afração das zeínas foi extraída deendospermas de grãos de milhoe separadas utilizando gel depoliacrilamida. Coluna 1:Marcador de peso molecular;Coluna 2: Milho não transgêni-co: Colunas de 3 a 10: Milhotransformado com a construçãogênica que contém o promotorda y-zeínas, e a região codanteda b-zeína

al., 1994; Ishida et al., 1996; Cheng etal., 1997). Bombardeamento de mi-cropartículas cobertas com DNA deinteresse, biobalística, tem sido o mé-todo de maior sucesso para produçãode miho transgênico, uma vez que asgramíneas não são facilmente transfor-

- Gama zeina 27 KDaAlfa zeina 19 KDa

.~-Beta zeina 14 KDa- Delta zerna 10 KDa

et al., 1987). Em geral, o tecido que ébombardeado pode ser regenerado eplantas transgênicas são produzidas.

Para a produção de milho tropicaltransgênico via biobalística, foi desen-volvido um protocolo na EMBRAPAMilho e Sorgo, onde embriões imatu-ros, de 1,5 a 2,0 mm, foram isoladosem condições estéreis e cultivadosdurante 2 a 6 dias, em meio básico N6(Chu et al., 1975) suplementado com2,4-D ou Dicamba. Durante o bomba r-deamento, foram utilizadas micropar-tículas de tungstênio aceleradas porum aparelho movido a hélio. Um esto-que de micropartículas de tungstêniofoi preparado ressuspendendo 60 mgde tungstênio MIO (Sylvania, GTEChemicals/ Towanda - USA) em 1 mlde uma solução com 50% de glicerolestéril. DNA plasmidial, construçãoque contém o gene da ô-zeína sobre ocontrole do promotor da y-zeínas, foiprecipitado sobre 50 ul da soluçãoestoque de tungstênio. As partículas

de tungstênio cobertas com DNA fo-ram cuidadosamente lavadas e ressus-pendidas em 60 ul de etanollOO%. Seismicrolitros foram depositados no cen-tro dos macrocarreadores, discos (24mm) de membranas Kapton (Du Pont).Essas membranas foram usadas nobombardeamento dos tecidos de inte-resse utilizando 1100 psi de pressão degás hélio, 1,6 ug/tíro de DNA plasmi-dial e os explantes foram posicionadasa 6 em da plataforma de lançamentodas micropartículas. Foram mantidosconstantes a distância entre a câmarade gás de alta pressão e a membranacarreadora contendo as micropartícu-Ias cobertas com DNA (8 mm), distân-cia entre a membrana carreadora e atela de retenção (12 mm) e a pressãode vácuo (27 mm Hg).

A seleção de plantas transgênicasfoi iniciada 14 dias após o bombarde-amento, quando os calos de milhoforam transferidos para meio básicoN6 suplementados com glufosinato deamônia, o composto ativo do herbici-da Finale. Os calos foram subcultiva-dos a cada 2 semanas, em dosagenscrescentes de glufosinato de amõnia.Para regeneração, os calos embriogê-nicos foram transferidos para meio MSsuplementado com glufosinato deamônia e cultivados a 26°c em luz (16horas). As plantas com aproximada-mente 5 em de altura foram transferi-das para o solo, em casa de vegetação.A Figura 3 ilustra o processo de sele-ção e regeneração de plantas transgê-nicas a partir de embriões imaturos demilho.

O DNA genômico foi isolado dasplantas transformadas, usando-se oprotocolo de Dellaporta et al. (1983).30 ug de DNA enzimaticamente dige-rido com EcoRI foi transferido parauma membrana de nylon pela técnicade "Southern blot". O DNA transgêni-co foi detectado usando-se o métodoquimioluminescente de digoxigenina.As frações zeínas, não-zeínas e a pro-teína total extraídas foram quantifica-das pelo teor de nitrogênio determina-do pelo método micro-Kjeldhal.

Resultados e Conclusões

O protocolo de regeneração etransformação de milho tropical de-senvolvido nos laboratórios do Núcleode Biologia Aplicada (NBA) da EM-BRAPAMilho e Sorgo, atualmente atin-

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 45

giu uma eficiência entre 0,66 e 3,0%para a produção de plantas transgê-nicas pelo uso do bombardeamentodo tecido escutelar de embriões ima-turos de milho tropical. Essa eficiên-cia de produção de plantas transgê-nicas de milho é similar à descritapor vários laboratórios internacio-nais que trabalham com milho dezonas climáticas temperadas. -O do-mínio da tecnologia para transfor-mação genética de milho tropicalnos insere em um seleto grupo deinstituições capazes de executar to-das as etapas técnicas necessárias à

obtenção de plantas transgênicas demilho. Ressaltando que esse conhe-cimento deverá ser utilizado nãoapenas para obtenção de plantastransgênicas, mas, também, em pro-cessos de avaliação e monitoramen-to de produtos transgênicos disponi-bilizados no mercado brasileiro.

As plantas transgênicas obtidasnesse estudo, confirmadas atravésda técnica de Southern blot, cresce-ram normalmente e produziram grãosde milho duros e vítrios. Análisesiniciais da proteína do endospermados grãos transgênicos (Figura 4)mostraram que, conforme o previs-to, em alguns eventos transgênicos,houve um aumento na produção da8-zeína, entretanto um aumento naprodução da ~-zeína, outra proteínarica em aminoácidos essenciais, tam-bém foi observado. Interessantemen-te, a y-zeína desapareceu na maioriados grãos transgênicos analisados.Alterações no nível da y-zeína pare-cem estar relacionadas com a durezae a vitricidade dos grãos de milho.Muitos dos grãos transgênicos pro-duzidos, apesar de serem vítrios, nãopossuem y-zeína no endosperma,portanto, novos questionamentos re-lacionados ao processo de modifica-ção do endosperma farináceo paravítrio surgiram com esse trabalho.Os estudos do grão para avaliar asconsequências da mudança do teorprotéico na formação ultraestruturaldos corpos protéicos e na deposiçãode amido, bem como estudos bio-químicos para analizar detalhada-mente a nova composição aminoací-dica dos grãos transgênicos produzi-dos continuam em andamento.

Os resultados obtidos nesse pro-jeto servirão como base para a pro-dução de linhagens de milho tropical

46 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

transgênicos que poderão ser incor-poradas a programas de melhora-mento tradicional, diminuindo o tem-po e o custo na produção de novosgenótipos de melhor qualidade nu-tricional.

Agradecimentos

Os autores agradecem o suportetécnico dado pelas seguintes pesso-as: Antônio G. P. Filho, Célio V.Moreira, Douglas Barduche, LuanaM. Costa, Luciano Paiva, Luciano P.Nogueira, Marcelo A. Fontes, Maria-na e. A. Gonçalves, Maurício S. An-tunes, Raymundo D.Filho, Rosimeree. S. Saraiva, Solange M. Barbosa,Ubiraci G. P. Lana. AAC é bolsistarecém-doutor pelo CNPq. Orgãosfinanciadores: SEP EMBRAPA, PRO-MOAGRO, CNPq, FAPEMIG, IAEA,PADCT, PRONEX.

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