MELHORAMENTO GENÉTICO DE AGENTES

BIORREMEDIADORES E SEU USO EM

BIORREATORES

Ronaldo BiondoDoutor em Biotecnologia

2009

PESQUISAS DE MELHORAMENTO GENÉTICO DE

MICRORGANISMOS VISANDO A BIORREMEDIAÇÃO

DE EFLUENTES DE METAIS PESADOS

PARTE II

Convênio CVRD/CPB-NAP-USP

Coordenadoras: Profª Drª Ana Clara Guerrini Schenberg

Profª Drª Elisabete José Vicente

2009

LINHAS DE PESQUISA:

• DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES BACTERIANOS PARA DETECÇÃO DE METAIS PESADOS.

• DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS BIORREMEDIADORES DE EFLUENTES CONTAMINADOS POR METAIS PESADOS.

Laboratório de Genética de Microrganismos

2007 - 6 bilhões

2025 – 9,1 bilhões

Consumo

74% setor agrícola

20% setor inustrial

6% consumo doméstico

Aumento de

resíduos

Metais pesados

resíduos

PRINCIPAIS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA A METAIS PESADOS

BIOSSENSORES

CONSTRUÇÃO DO BIOSSENSOR PARA DETECÇÃO DE MERCÚRIO EM AMOSTRAS AMBIENTAIS

Faixa de detecção: 0,15 µM – 2,5 µM

CONAMA: 0,05 µMVANTAGENS: •Testes rápidos e de baixo custo;

• Fácil análise dos resultados;• Não necessita de substrato.

Aumento da Faixa de Sensibilidade do Biossensor de Mercúrio;

Construção do Biossensor de Chumbo;

Construção do Biossensor de Arsênio.

ETAPAS EM DESENVOLVIMENTO (2009-2010)

BIORREMEDIADORES

DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS PARA BIORREMEDIAÇÃO DE AMBIENTES CONTAMINADOS

POR METAIS PESADOS:

BACTÉRIAS Gram-negativas;

BACTÉRIAS Gram-positivas;

LEVEDURAS

Resistência

Ag+2, Bi+2, Cd+2, Co+2, CrO4-2,

Cu+2, Hg+2, Mn+2, Ni+2, Pb+2, SeO4

-3, Tl+1 e Zn+2

150 genes

Cupriavidus metallidurans CH34

BACTÉRIAS Gram-negativas

Figura esquemática do plasmídeo pBB-panEGFP.

pan = derivado do promotor do gene mrgA(metal regulated gene A) de Bacillus subtilis com modificações.

Expressão do promotor pan em C. metallidurans CH34

B

Visualização de células de C. metallidurans CH34/pBB-panEGFP em microscópio de epifluorêscencia com aumento de 1000 vezes.

Medida da Fluorescência por Citometria de Fluxo (FACS) emC. metallidurans

µM de Cd+2

mg psµM de Co+2

mg psµM de Cu+2

mg psµM de Hg+2

mg psµM de Mn+2

mg psµM de Ni+2

mg psµM de Zn+2

mg psµM de Pb+2

mg ps

C. metalliduransCH34

11,1 4,5 24,29 0,05 4,73 5,84 16,0 17,62

C. metalliduransCH34/pCM2

12,6 5,0 25,72 0,1 5,06 6,46 18,82 25,14

C. metalliduransCH34/pCM2

Induzido

17,6(59%)

5,1(13%)

42,65(76%)

0,05-

6,2 (31%)

8,46(45%)

51,07(219%)

54,75 (210%)

Capacidade de Biossorção de metais

Espectrometria de massas de alta resolução com fonte de plasma indutivamente ativado (ICP-MS), realizada no Laboratório de Caracterização Química e Isotópica do IPEN.

Eletromicrografia de transmissão de cortes histológicos de células de C. metallidurans CH34.

A - C. metallidurans CH34 cultivada em meio TSM e incubada com água MilliQ;

B - C. metallidurans CH34 cultivada em meio TSM e incubada com água MilliQcontendo Pb+2;

C - C. metallidurans CH34/pCM2 cultivada em meio TSM e incubada com água MilliQe;

D - C. metallidurans CH34/pCM2 cultivada em meio TSM contendo Pb+2 e incubada com água MilliQ contendo Pb+2.

A visualização das células foi realizada com aumento de 46.000 vezes. As setas indicam a presença de agregados do elemento Pb+2 ligados na membrana externa da célula bacteriana.

• 02 - Pedidos de Patentes – INPI

• 02 - Prêmios

Santander de Ciência e Inovação Prêmio ANA/MMA (Biotecnologia) (Agência Nacional de Águas)

• 01 -Menção Honrosa no Congresso do ICB/2008

• Artigo 1 – Environmental Microbiology

• Artigo 2 – Journal of Biotechnology

ETAPAS EM DESENVOLVIMENTO (2009-2010)

• Estabilização Genética das Linhagens recombinantes já construídas;

• Biorreatores;

• Construção de bactérias Gram-positivas remediadoras;

• Construção de Leveduras remediadoras (fase final);

• Construção de linhagens bacterianas que apresentam capacidade de biorremediar íons seletivamente: Ar+2, Pb+2 e Hg+2.

Biorreatores

• Batelada: volumes de operação definidos;

• Contínuo: amplamente utilizados em tratamento de efluentes;

• Batelada Alimentada: produção de produtos biológicos.

Reator de Biodisco Rotativo (RBR)

Problema: Formação de Biofilme

(exopolímeros que encobrem a membrana)

Inviabiliza o Cell surface display daCupriavidus metallidurans recombinante.

1ª Abordagem do Projeto

Processo Contínuo

As células podem ser mantidas em estado fisiológico e crescimento constantes;

Cultivo mais longo que a batelada;

Reatores e equipamentos associados menores, gerando menor custo;

A principal aplicação é no tratamento de efluentes.

2ª Abordagem do Projeto

Escolha do melhor tipo de reator

Vantagens do Air-lift em relação aos reatores agitados:

Agitação mais suave;Melhor transferência de O2;

Mais baratos;Permitem processos contínuos;Homogeneidade;Eficiência de mistura; São empregados em tratamento de efluentes.

Air-liftCSTR

“Continuous Stirred Tank Reactor”

Reator

Representação esquemática do aparato de biorremediação usado neste trabalho.

Outros Projetos:

• Construções Genéticas de linhagens microbianas biorremediadoras de poluentes orgânicos.

• Fitorremediação de solos.

robiondo@usp.br

A – Na célula portadora do plasmídeo codificante do lócus ParB, ocorre a expressão do RNA-m de hok e do RNA antisenso sok, evitando a expressão da toxina letal Hok; B – Na célula onde o plasmídeo é perdido, ocorre a tradução do RNA-m hok devido à falta da fita antisenso, ocorrendo a expressão da toxina letal.

Diferenças entre os envoltórios celularesDiferenças entre os envoltórios celulares

• Gram-negativas • Gram-positivas

Membrana externa

Membrana interna

Membrana interna

Periplasma

Camada de peptideoglicanos