Diálise

Eletroforese(SDS-PAGE)

SequenciamentoeIdentificação deproteínas

Sayuri Miyamoto 2017

Cromatografia de troca-iônica

Levedura - Lise

Medida de atividade total e específica (após)

Medida de atividade total e específica (antes)

Acompanhamento de expressão e purificação de proteínas

Determinaçãodamassamolecular

Sequenciamentodaproteína

DeterminaçãodeMassaMoleculardaProteína

SDS-PAGECromatografia deexclusãoEspectrometriademassas

dD

Rm =d/D

Mr

Mr=massamolecular(oupesomolecular)

SDS-PAGE

Migração relativa

CromatografiadeExclusão

Eluição relativa

Precisão± 10%

Precisão± 1%

Método bastante sensívelValores de massa/carga bastante precisos

EspectrometriadeMassas

Precisão± 0.01%

Comparativo entre métodos que permitem determinação de massa

EspectrometriadeMassasComo funciona a técnica?

Espectrometria de massas (MS, Mass Spectrometry) é uma técnica analíticaextremamente sensível que permite determinar a massa molecular.Ela também fornece informações acerca da estrutura da molécula.

O equipamento que faz a medida da massa é o Espectrômetro de Massas.

MALDI-TOF Q-TOF

Características básicas de um espectrômetro de massas

EspectrômetrodeMassas

Fonte de Ionização

SampleInlet

+_

Analisador de Massas Detector

ESPETRO DE MASSAS(m/z)

ÍONS EM FASE GASOSA

AMOSTRA(ex. proteínas)

SISTEMA DE AQUISIÇÃO DE

DADOSALTO VÁCUO

O resultado obtido na análise por espectrometria de massas é um espectro de massas.

O espectro de massa é um gráfico que mostra a abundância (intensidade) relativa de cada íon commassa/carga (m/z) definidos.

EspectrodeMassas

Importante: o equipamento faz uma medida da razão (m/z) entre a massa do íon (m) sobre a carga do íon (z) e não da massa em si.

A molécula pode ser ionizada:-pela adição de um ou mais prótons ( [M+nH+]n+): modo de ionização positiva-pela perda de um ou mais prótons ( [M-nH+]n-): modo de ionização negativa

Proteínas e peptídeosnormalmente sofrem protonaçãoe são analisados como íonscarregados positivamente

Ionização

IONIZAÇÃO (formação de íons com carga positiva ou negativa) é o primeiro passo

fundamental para que a molécula possa ser introduzida no analisador de massas

Duas principais técnicas de ionização ”BRANDAS (Soft)” empregadas para análise de

biomoléculas:

ELECTROSPRAY e o MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization).

NobelPrize inChemistry,2002

John B. Fenn is the chemist who invented the ELECTROSPRAY method (1988). Professor of Chemistry at Yale University, USA, and at Virginia Commonwealth University, USA

Koichi Tanaka research engineer who developed the MALDI technique (1987).Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan.

Voet Biochemistry 3e©2004JohnWiley&Sons,Inc.

Ionização por Electrospray (ESI)

Massa =(m/z x z) – z

Massa =(1027.6) x (100) – (100)

Massa= 102760-100

Massa = 102660

Ionização por MALDI

Massa =(m/z x z) – z

Massa =(29281 x 1) – 1

Massa= 29280

Espectros de Massa de Proteína Intacta

ESI MALDI

Sayuri Miyamoto 2014

Acompanhamento de expressão e purificação de proteínas

Determinaçãodamassamolecular

Sequenciamentodaproteína

1-análise da composição de aa

2-análise da seq. de aa

1- Análise da composição total de aminoácidos• Hidrólise de todas as ligações peptídicas em meio fortemente ácido ou básico ( 2-4 M de

NaOH ou 6 M HCl) ou por enzimas (mistura de proteases)

• Aminoácidos são separados por técnicas cromatográficas (exemplo HPLC)

Asp-Ala-Gly-Arg-His-Cys-Lys-Trp-Lys-Ser-Glu-Asn-Leu-Ile-Arg-Thr-Tyr

Asp 1Glu 1Asn 1Ser 1Gln 0His 1Gly 0Thr 0Arg 2Ala 1

Tyr 1Met 0Val 0Phe 0Ile 1Leu 1Lys 1

Asp

AlaGly

Arg

His

CysLys

Trp

Arg

ThrAsn

Ile

Ser

GluLys

Leu

Tyr

HCl 6 M, 100C, 24h

Derivatização pré-coluna(o-ftalaldeído, fenilisotiocianto, etc.)

Tripsina (Cliva após resíduos básicos Lys e Arg)

Fragmentos Peptídicos

+H3N- -COO-

II. Clivagem da cadeia polipeptídica usando métodos de clivagem específicos. (ex. Proteases como a Tripsina).

2-SequenciamentodeProteínas

I. Redução de pontes de disulfeto usando agentes redutores como o 2-mercaptoetanol.É importante alquilar as cisteínas para evitar que as pontes de disulfetos se formem

novamente.

* O uso combinado de mais de um método de clivagem ajuda no ordenamento das sequência de peptídeos, principalmente no método de Sanger

2-SequenciamentodeProteínas

Degradação de Edman(Sequenciamento a partir do N-terminal)

Sequenciamento através de análisepor MS e/ou MS/MS

MALDI-TOF Q-TOF

Limitado a oligopeptídeos de até 50 aa

III. Sequenciamento dos fragmentos peptídicos

2-SequenciamentodeProteínas

Degradação de Edman (1950)Edman desenvolveu um método que permite remover

aminoácidos sequencialmente a partir do N-terminal.

Usar mais de um método de clivagem da cadeia polippetídica....

Asp-Ala-Gly-Arg-His-Cys-Lys-Trp Lys-Ser-Glu-Asn-Leu-Ile-Arg-Thr-Tyr

Exemplo: Quimotripsina (Cliva após resíduos aromáticos)

Tripsina (Cliva após resíduos básicos Lys e Arg)

Como ordenar a sequência de peptídeos??

Foi sequenciada por Frederik Sanger

Prêmio Nobel em 1958

INSULINA

http://www.whatisbiotechnology.org/exhibitions/sanger/insulin

Limitações:Tempo de análise longo!Grande quantidade de amostra!Muito lento para os padrões de hoje!!!

Hoje em dia o sequenciamento é feito por espectrometria de massas. (+rápido, requer pouquíssima amostra)

Sequenciadores Automáticos

Degradação de Edman

EspectrometriadeMassas

AnálisedemassadeProteínasIntactas(MS)AnálisedemassadePeptídeos(MS)

Sequenciamento

Wenk, M.R. 2010 Cell 143, 188.

Espectrometria de massas propiciou grandes avanços nas áreas de Proteômica, Glicômica e Lipidômica

Sequenciamentodeproteínasporespectrometriademassas

Massa de cada peptídeo Fragmentos de um peptídeo selecionado

Busca baseada em dados de MS/MS(sequenciamento)

Busca em Banco de Dados (ex. Mascot)

Busca baseada em dados de MS

(PMF)

Exemplo de análise de glicosidase por

SDS-PAGE e espectrometria de massas

Padrão de glicosidase

Determinação da pureza e da massa molecular da glicosidase por SDS-PAGE

57288.292

0

1000

2000

3000

Inte

ns. [

a.u.

]

40000 45000 50000 55000 60000 65000 70000 75000m /z

Massa = 57287 Da

Determinação da massa molecular da glicosidase por MALDI-TOF

MALDI-TOF

Tripsinização

MALDI-TOF-TOF

Remoção da banda da glicosidase, digestão com tripsina e análise por espectrometria de massa

1179.511

963.414

1333.524

1515.656742.326

898.397

1783.703

2065.844 2383.8363313.0822938.198 4074.899

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500m /z

Espetro de massa dos peptídeos da beta-glicosidase

Listadepeptídeos

m/z698.315742.326780.283866.400936.431963.4141034.0661082.4831121.5021154.5191170.5171179.5111361.5551383.5281515.6561728.7361783.7031940.7662089.8672272.8532288.8532310.8012938.198

Busca no Mascot utilizando as massas dos peptídeos detectados

Listadepeptídeos

m/z698.315742.326780.283866.400936.431963.4141034.0661082.4831121.5021154.5191170.5171179.5111361.5551383.5281515.6561728.7361783.7031940.7662089.8672272.8532288.8532310.8012938.198

Swiss-ProtSe a proteína é de um organismo bem caracterizado comohumanos, camundongos, levedura, ou arabdopsis, o Swiss Prot é o recomendado

NCBIprotSe a proteína é de bactéria ou planta, usar o NCBIprot, pois é um banco de dados mais amplo que o Swiss-Prot

Banco de Dados (Database)

Modificações fixasExemplo mais comum é a alquilação de cisteínas.O alquilante mais comum é a iodoacetamida (carbamidomethyl) ouácido iodoacético (carboxymethyl).

Modificações

Modificações variáveisExemplo:- Oxidações que ocorrem durante o processamento de amostra(oxidação de metionina)- Modificações pós-traducionais (fosforilação)

Scoresacimade93:significantes (p<0.05)

Oscore obtidonabuscafoide121.

Massa de cada peptídeo Fragmentos de um peptídeo selecionado

Busca baseada em dados de MS/MS(sequenciamento)

Busca em Banco de Dados (ex. Mascot)

Busca baseada em dados de MS

(PMF)

Sequenciamento de Peptídeos baseado em MS/MS

Matching dos escpectros de MS/MS realizado por software

MS/MSExperimental

MS/MSTeórico

Sequência do peptídeo

Resumo: Identificação de Proteínas/Enzimas

1. Determinação da massa molecular • SDS-PAGE• cromatografia de exclusão molecular• espectrometria de massas (MALDI-TOF, Q-TOF)

2. Determinação da sequência de aminoácidos• Degradação de Edman• Espectrometria de massas

Em ambos os casos proteínas precisam ser clivadas especificamente (ex. Proteases) para gerar peptídeos menores.

A espectrometria de massas é a técnica mais precisa e mais utilizadaatualmente.

Eletroforese em gel bidimensional das proteínas de E. coli

- mais de 2,000 proteínas podem ser visualizadas

Lenhinger

Utilizada para comparar níveis de expressão de proteínas

Proteínas de interesse podem ser identificadas utilizando-se anticorpos

Proteínas são identificadas por espectrometria de massas

36761 espectros de MS/MS

Análise Proteômica de uma Célula Eucariótica (HeLa)- mais de 2,000 proteínas identificadas

Avisos:

Gabaritos e materiais da aula disponíveis na página do Sandro

Entregar exercício 1

Resolver exercício 2 em casa

Próxima aula (20/Junho) teremos plantão de dúvidas na sala 4

Prova 2 será no dia 27/Junho no Anfiteatro Vermelho