mecanismos moleculares y papel del mastocito en la

MECANISMOS MOLECULARES Y PAPEL DEL MASTOCITO

EN LA INFLAMACIÓN DE LA MUCOSA INTESTINAL ASOCIADA AL SÍNDROME DEL INTESTINO IRRITABLE.

Memoria presentada por Cristina Martínez Martínez para optar al grado de Doctor del Programa de Doctorado en

Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina Barcelona, Julio de 2011

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Universitat Autònoma de Barcelona

Tesis Doctoral dirigida por Francisco Javier Santos Vicente y

María Vicario Pérez

FRANCISCO JAVIER SANTOS VICENTE, Doctor en Medicina, y MARÍA VICARIO

PÉREZ, Doctora en Farmacia.

HACEN CONSTAR

Que la memoria titulada ”Mecanismos moleculares y papel del mastocito en la

inflamación de la mucosa intestinal asociada al síndrome del intestino irritable”

presentada por Cristina Martínez Martínez para optar al grado de Doctor, se ha

realizado bajo su dirección y, al considerarla concluida, autorizan su presentación para

ser juzgada por el tribunal correspondiente.

Y para que conste a los efectos, firman la presente en Barcelona, Julio de 2011

Dr. Francisco Javier Santos Dra. Maria Vicario

Director Co-Directora

La imagen de la portada corresponde a una micrografía tomada por microscopía

confocal de la mucosa del yeyuno de un paciente con SII-D en la que se muestra el

marcaje de la forma fosforilada de la proteína MLC, que forma parte de los resultados

de esta tesis.

La imagen de la parte posterior corresponde a una micrografía tomada por

microscopía electrónica de barrido de la mucosa ileal de ratas Wistar-Kioto, cedida por

la Dra. María Vicario Pérez.

“Si he conseguido ver más lejos, es porque me he aupado en hombros de gigantes.”

Isaac Newton (1642-1727) Físico y matemático inglés.

AGRADECIMIENTOS

Supongo que todo el mundo que llega a este momento y echa la vista atrás tiene la

sensación de llevar toda una vida luchando para conseguir cruzar la barrera del

doctorado y seguir avanzando en la carrera investigadora. Mi camino, además de duro

y muy largo, ha sido bastante atípico.

No puedo evitar esbozar una sonrisa cuando recuerdo una conversación que

mantuve en la cafetería de la universidad durante mi último año de carrera. En aquel

momento tenía clarísimo que mi futuro profesional estaba ligado a alguna empresa

privada. Nada de investigación que es muy sacrificado y está mal pagado. Quién lo

hubiera dicho… No se muy bien cómo ni por qué, pero acabé metiéndome de lleno en

el mundo de la investigación y haciendo mil sacrificios para poder continuar hacia

delante. Pese a todo me considero enormemente afortunada porque he tenido la

oportunidad de conocer a personas extraordinarias que me han enseñado mucho

acerca del mundo de la ciencia, pero también de la vida. Son los gigantes de Newton a

los que me he aupado para poder ver mejor y más lejos.

Me niego rotundamente a escribir una lista interminable de nombres a los que

agradecer uno a uno su contribución personal y/o profesional, sobretodo porque son

demasiados y, inevitablemente, me olvidaría de alguien. Sin embargo, no puedo evitar

hacer una mención especial a dos grupos que han sido fundamentales para haber

llegado hasta donde estoy ahora mismo. El primero al inicio de mi camino como

investigadora, hace ya muchos años, y el otro al principio del final de esta larguísima

etapa pre-doctoral.

En primer lugar gracias a Jose Luis, Víctor, Pilar, Miguel, Ángeles y Adela. Por

transmitirme la pasión y el entusiasmo por la ciencia. Fuisteis los primeros en

enseñarme que pese a los malos momentos siempre es posible mantener la ilusión.

Aunque fueron muy duros, recuerdo aquellos dos años con muchísimo cariño. Y cómo

no, gracias a Alfredo por darme la oportunidad de incorporarme a este magnífico

equipo humano y estimularme para luchar por mis objetivos. Recuerdo como si fuera

ayer lo que me dijo el día que fui a expresarle mi preocupación por mi futuro

profesional: “Quiero saber si eres como un buque rompehielos que va abriéndose

camino, lenta pero inexorablemente”. En aquel momento me pareció bastante cruel,

dadas las circunstancias, pero la verdad es que consiguió que sacara lo mejor de mí y

me abrí paso, aunque más lejos de lo que probablemente él esperaba… Esas

palabras fueron el estímulo que hizo que se desencadenaran todos los

acontecimientos que finalmente me han traído hasta aquí.

El Show de Truman. La verdad es que en este punto me quedo sin palabras.

Cualquier cosa que dijera se quedaría corta para describir la calidad humana y

científica de este grupo. Javier, gracias por apostar por mí. Me diste una oportunidad

única y a lo largo de todos estos años me has apoyado y me has dado la libertad que

necesitaba para poner en marcha la línea de biología molecular. María, eres la

persona más extraordinaria que conozco. Gran amiga y mejor persona. Gracias por

co-pilotar la nave y llevarnos siempre a buen (aero)puerto. Porque un día vi la luz y

decidí incluirte como directora de tesis. Y, sobretodo, porque se que aunque no lo

hubiera hecho tu me habrías ayudado exactamente igual. Bea, gracias por ser como

eres. Por las carreras y las risas que nos hemos echado por los aeropuertos de medio

mundo, por pensar siempre en los demás antes que en ti misma. Porque el tiempo que

has pasado en el Show ha sido súper intenso y me he reído más que en toda mi vida.

Ana, por tu cariño y tus sonrisas incondicionales. Marc, por la dispensación gratuita de

abrazos y por tener siempre la solución más divertida a todos los problemas. Carmen y

Mar, junto con María las fundadoras del Show. Gracias por acogerme y ayudarme a

sentirme una más pese a la confusión inicial. Todo era demasiado novedoso, para mí

y para vosotras, pero nos ha ido bien y nos hemos reído mucho durante todos estos

años.

Gracias a todos los demás, aunque no sois nombrados uno a uno. Vosotros sabéis

quiénes sois y cuánto me habéis ayudado. Todos, en mayor o menor medida, me

habéis prestado vuestra ayuda, vuestra amistad, hemos compartido nuestros secretos

culinarios e incluso alguna que otra ha ejercido de segunda madre, lo cual valoro en

gran medida puesto que hace mucho tiempo que tengo a la mía lejos.

Ha sido un camino largo y duro en el que reconozco que, algunas veces, la fijación

por lograr mis objetivos me ha hecho olvidar un poco la importancia del contacto

humano. Los más perjudicados han sido mi familia y los amigos que están lejos. A

todos gracias, porque pese a todo seguís estando ahí. En especial a Ángela, por tu

amistad sincera e incondicional. Por tus valiosos consejos y por tener siempre un

punto de vista diferente y divertido para ayudarme a superar los malos momentos.

A mi familia, por apoyarme y dejarme elegir mi camino aunque muchas veces haya

podido ser complicado entenderlo. A mis sobrinos, Ana, Aitor y Gonzalo, por hacerme

sonreír incluso cuando no os veo y por recordarme constantemente a la niña que aún

llevo dentro.

Y, finalmente, le dedico esta tesis a Rubén que ha sufrido tanto o más que yo,

sobretodo durante los últimos meses que han sido particularmente duros. Gracias por

sentirte orgulloso de mí, por tu paciencia y por tu apoyo incondicional, por aguantar

estoicamente mis arrebatos de mal humor fruto del estrés, y mil cosas más… Gracias

porque tu contribución va más allá de todo esto y te has convertido en el voluntario

estrella del Show. Y, sobretodo, gracias por tener tan claro que por encima de todo lo

más importante es lo mucho que nos queremos.

A Rubén y a todo lo que está por venir en nuestra vida juntos

ÍNDICE -i-

ÍNDICE

OBJETIVOS .......................................................................................................... 1

INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 5

1. Síndrome del Intestino Irritable .......................................................................... 5

1.1. Criterios diagnósticos ............................................................................... 5

1.2. Manifestaciones clínicas ........................................................................... 7

1.2.1. Dolor abdominal ............................................................................... 7

1.2.2. Patrón de deposiciones ................................................................... 8

1.3. Etiopatogenia .......................................................................................... 12

1.3.1. Factores relacionados en el inicio y/o perpetuación del SII ........... 12

1.3.2. Substrato biológico ........................................................................ 15

2. El Intestino: estructura y función ...................................................................... 18

2.1. Estructura histológica del intestino ......................................................... 18

2.2. Función del intestino delgado ................................................................. 20

2.2.1. Transporte a través del epitelio intestinal ...................................... 20

2.2.2. Función de barrera de la mucosa intestinal ................................... 22

3. Uniones intercelulares ..................................................................................... 24

3.1. Componentes de las uniones intercelulares ........................................... 24

3.2. Uniones estrechas .................................................................................. 26

3.2.1. Ocludina ......................................................................................... 28

3.2.2. Claudinas ....................................................................................... 28

3.3. Placa citoplasmática ............................................................................... 29

3.4. Citoesqueleto .......................................................................................... 30

4. Señalización intracelular a través de las TJ del intestino ................................ 31

4.1. Señalización por fosforilación / defosforilación ....................................... 31

-ii- ÍNDICE

4.1.1. Ser/Thr kinasas .............................................................................. 32

4.1.2. Ser/Thr fosfatasas .......................................................................... 34

4.2. Señalización por Rho GTPasas .............................................................. 34

4.3. Señalización por PI3K/AKT .................................................................... 35

5. Regulación de la permeabilidad intestinal ....................................................... 36

5.1. Estrés psicológico y la regulación de la permeabilidad intestinal ........... 39

5.2. Células y mediadores del sistema inmunológico implicados en la regulación

de la permeabilidad intestinal ........................................................................ 40

5.2.1. Mastocitos ...................................................................................... 40

5.2.2. Eosinófilos ...................................................................................... 42

5.2.3. Linfocitos T ..................................................................................... 43

CAPÍTULO I ........................................................................................................ 47

6. The jejunum of diarrhea-predominant irritable bowel syndrome shows molecular

alterations in the tight junction signaling pathway that are associated with mucosal

pathobiology and clinical manifestations ............................................................. 47

6.1. Introduction ............................................................................................. 48

6.2. Methods .................................................................................................. 49

6.2.1. Participants .................................................................................... 49

6.2.2. Clinical Assessment ....................................................................... 50

6.2.3. Biological Evaluation ...................................................................... 50

6.2.4. Statistical Analysis ......................................................................... 52

6.2.5. Pathway Analysis ........................................................................... 52

6.3. Results .................................................................................................... 54

6.3.1. Study population ............................................................................ 54

6.3.2. The jejunum of IBS-D shows hyperplasia of mucosal MCs ........... 54

ÍNDICE -iii-

6.3.3. The jejunal mucosa of IBS-D shows a distinctive transcriptional

profile linked to alterations in intestinal permeability, MC function and

TJ signaling .............................................................................................. 54

6.3.4. The altered expression of TJ-related proteins correlates with mucosal

MC activation and bowel dysfunction in IBS-D ........................................ 60

6.3.5. Integrative multivariate analysis of clinical and biological data

differentiates between IBS-D and healthy populations ............................ 64

6.4. Discussion .................................................................................................... 67

6.5. References ................................................................................................... 72

CAPÍTULO II ....................................................................................................... 77

7. Transcriptomic and proteomic profiling of the intestinal mucosa of diarrhea-IBS

patients reveals similar biological pathways as differentially active compared to

healthy subjects ................................................................................................... 77

7.1. Introduction ............................................................................................. 78

7.2. Methods .................................................................................................. 79

7.2.1. Participants .................................................................................... 79

7.2.2. Clinical assessment ....................................................................... 79

7.2.3. Biological evaluation of participants ............................................... 80

7.2.4. Statistical analysis .......................................................................... 83

7.3. Results .................................................................................................... 83

7.3.1. Study population ............................................................................ 83

7.3.2. The jejunum of IBS-D shows a distinctive transcriptomic profile ... 84

7.3.3. Gene and protein expression profiles in the jejunal mucosa of IBS-D

are associated with similar canonical pathways, biological functions and

disease mechanisms ............................................................................... 88

-iv- ÍNDICE

7.4. Discussion .............................................................................................. 88

7.5. References ............................................................................................. 91

CAPÍTULO III ...................................................................................................... 95

8. Altered jejunal tight junction signaling correlates with mucosal mast cell activation

and symptom severity in diarrhea-prone irritable bowel syndrome patients ........ 95

8.1. Introduction ............................................................................................. 96

8.2. Methods .................................................................................................. 97

8.2.1. Participants .................................................................................... 97

8.2.2. Clinical assessment ....................................................................... 98

8.2.3. Biological evaluation of participants ............................................... 98

8.2.4. Statistical analysis ........................................................................ 101

8.3. Results .................................................................................................. 102

8.3.1. The jejunum of IBS-D shows hyperplasia of activated mucosal

MCs ........................................................................................................ 102

8.3.2. Altered expression and distribution of structural TJ proteins correlates

with bowel dysfunction in IBS-D patients ............................................... 104

8.3.3. Phosphorylation of myosin light chain (MLC) is increased in

IBS-D ..................................................................................................... 107

8.3.4. TJ architecture is altered in IBS-D ............................................... 109

8.4. Discussion ............................................................................................ 111

8.5. References ........................................................................................... 115

DISCUSIÓN GENERAL .................................................................................... 121

CONCLUSIONES .............................................................................................. 133

BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 137

ÍNDICE -v-

ANEXO .............................................................................................................. 149

9. Supplementary Material from Chapter 1 ........................................................ 149

9.1. Supplementary methods ....................................................................... 149

9.1.1. Microarray analysis ...................................................................... 149

9.1.2. Statistical Analysis of Microarray Data ......................................... 149

9.1.3. Ingenuity Pathway Analysis ......................................................... 150

9.1.4. Supplementary References ......................................................... 151

9.2. Supplementary Figures and Tables ...................................................... 152

9.2.1. Supplementary Table 1. Gene Expression Assays (GEA) used for

Q-RT-PCR ............................................................................................. 152

9.2.2. Supplementary Table 2. Individual counts of mucosal mast cells

(CD117+) and intraepithelial lymphocytes (CD3+) in jejunal biopsies ..... 153

9.2.3. Supplementary Table 3. Differentially expressed transcripts in IBS-D

patients compared with the healthy group ............................................. 154

9.2.4. Supplementary Figure 1. Quantitative Real Time PCR validation of

microarray data ...................................................................................... 163

9.2.5. Supplementary Table 4. All Networks identified .......................... 164

9.2.6. Supplementary Table 5. Identified canonical pathways associated to

the IBS-D transcripcional profile ............................................................ 167

9.2.7. Supplementary Table 6. Coordinates for selected genes from the

integrative multivariate analysis ............................................................. 169

10. Supplementary Material from Chapter 2 ...................................................... 174

10.1. Supplementary Figures and Tables .................................................... 174

10.1.1. Supplementary Table 1. Differentially expressed spots identified in

IBS-D patients compared with the healthy group ................................... 174

-vi- ÍNDICE

11. Supplementary Material from Chapter 3 ...................................................... 177

11.1. Supplementary Figures and Tables .................................................... 177

11.1.1. Supplementary Table 1. Antibodies used for western-blot (WB) and

confocal immunofluorescence (IF) ......................................................... 177

11.1.2. Supplementary Table 2. Gene Expression Assays (GEA) used for

Q-RT-PCR ............................................................................................. 178

11.1.3. Supplementary Figure 1. Relationships between differentially expressed

genes in the highest scored network and related Canonical Pathways (CP) and

Biological Functions (Fx) ........................................................................ 179

ABREVIATURAS -vii-

ABREVIATURAS

5-HT Serotonina (5-hidroxitriptamina)

Ǻ Angstrom

AKT v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1

AJ Uniones adherentes (del inglés, adherens junctions)

CLDN Claudina

CRF Factor liberador de corticotropina (del inglés, corticotropin releasing

factor)

CRH-F1 Receptor del factor liberador de corticotropina, subtipo 1 (del inglés

corticotropin releasing factor receptor)

CRH-F2 Receptor del factor liberador de corticotropina, subtipo 2 (del inglés

corticotropin releasing factor receptor)

DIGE Difference gel electrophoresis

EII Enfermedad inflamatoria intestinal

GALT Tejido linfoide asociado al intestino (del inglés gut associated lymphoid

tissue)

GAP Proteína activadora de GTPasa (del inglés GTPase activating proteins)

GEF Factor de intercambio de guanina (del inglés guanine nucleotide

exchange factos)

GSK-3β Kinasa glicógeno sintasa, beta 3 (del inglés glycogen synthase kinase 3

beta)

HPA Eje hipotálamo-pituitario-adrenal

IBS Irritable bowel syndrome

IBS-D Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome

IEL Linfocitos intraepiteliales (del inglés intraepithelial lymphocites)

-viii- ABREVIATURAS

IFNγ Interferón gamma

IL-1β Interleucina 1 beta

IL-4 Interleucina 4

IL-6 Interleucina 6

IL-6r Receptor de interleucina 6

IL-10 Interleucina 10

IL-13 Interleucina 13

IPA Ingenuity pathway analysis

JAM Molécula de adhesión de las uniones (del inglés, junctional adhesión

molecule)

kDa Kilodaltons

LIMK Proteína kinasa Lim

MAGI MAGUK inverted protein

MAGUK Membrane-associated guanylate kinase

MAPK Proteína kinasa activada por mitógenos (del inglés mitogen-activated

protein kinase)

MBP Proteína principal básica (del inglés major basic protein)

MC Mastocitos

MLC Cadena ligera de la miosina (del inglés myosin light chain)

MLCK Proteína kinasa de la cadena ligera de la miosina (del inglés myosin

light chain kinase)

MYPT Subunidad diana de la fosfatasa de la cadena ligera de la miosina (del

inglés myosin phosphatase target subunit)

OCLN Ocludina

PAR-2 Receptor activado por proteasas 2 (del inglés protease activated

receptor 2)

ABREVIATURAS -ix-

PDK Proteínas kinasas dependientes de fosfoinositol (del inglés 3-

phosphoinositide dependent protein kinase)

PDZ Postsynaptic density-95/Drosophila disc large/Zonula occludens-1

protein

PI Fosfoinositol

PI3K Fosfoinositol 3-kinasa (del inglés phosphoinositide 3-kinases)

PKC Proteína kinasa C

PP1cδ Subunidad catalítica de la fosfatasa de la cadena ligera de la miosina

(del inglés protein phosphatase 1C delta)

PP2A Fosfatasa 2A (del inglés protein phosphatase 2A)

PP2B Fosfatasa 2B (del inglés protein phosphatase 2B)

PTEN Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10

RNA Ácido ribonucleico (del inglés ribonucleic acid)

ROCK Proteína kinasa de rho

RXR Retinoid X receptor

Ser Serina

SIBO Sobrecrecimiento bacteriano en el intestino delgado (del inglés, small

intestinal bacterial overgrowth)

SII Síndrome de intestino irritable

SII-A Síndrome de intestino irritable con patrón alternante

SII-C Síndrome de intestino irritable con predominio de estreñimiento

SII-D Síndrome de intestino irritable con predominio de diarrea

SII-PI Síndrome de intestino irritable post-infeccioso

SNC Sistema nervioso central

SNE Sistema nervioso entérico

TGF-β Factor de crecimiento tumoral, beta (del inglés tumoral growth factor

beta)

-x- ABREVIATURAS

Thr Treonina

TJ Uniones estrechas (del inglés tight junctions)

TNFα Factor de necrosis tumoral, alfa (del inglés tumor necrosis factor alpha)

Tyr Tirosina

ZO Zonula occludens

OOBBJJEETTIIVVOOSS

OBJETIVOS - 1 -

OBJETIVOS

Las enfermedades funcionales digestivas incluyen síndromes clínicamente muy

heterogéneos, como el síndrome del intestino irritable, caracterizados por

manifestaciones crónicas y recurrentes, cuya base estructural o biológica permanece

ignorada (Drossman, 1995). Consecuentemente, carecemos de biomarcadores

diagnósticos útiles para estas enfermedades funcionales, siendo el manejo terapéutico

y la calidad de vida deficientes, y el gasto sanitario creciente. En consecuencia, es de

gran importancia dirigir la investigación en este campo para permitir la identificación de

marcadores biológicos que faciliten el diagnóstico positivo y el diseño de nuevas

estrategias terapéuticas más eficientes.

El objetivo principal de esta tesis es determinar si la barrera mucosa intestinal del

SII-D presenta alteraciones moleculares y estructurales distintivas y establecer su

asociación patogénica con el sustrato patobiológico mucoso subyacente (hiperplasia y

activación mastocitaria) y con las manifestaciones clínicas predominantes.

Asimismo, es objetivo de esta tesis establecer las funciones biológicas y las vías

de señalización diferencialmente activas en la mucosa intestinal de pacientes con SII-

D, en comparación con controles sanos, especialmente de aquellas involucradas en el

control funcional de la barrera mucosa intestinal.

Afortunadamente, durante los últimos años la genómica, la proteómica y la

bioinformática se han desarrollado de forma sinérgica, lo que ha supuesto una

verdadera revolución en el diagnóstico y tratamiento de multitud de enfermedades. El

diagnóstico molecular ha resultado especialmente fructífero para el descubrimiento de

biomarcadores diagnósticos y dianas terapéuticas. La aplicación de las técnicas de

análisis masivo de la expresión génica y proteica en el síndrome del intestino irritable,

- 2 - OBJETIVOS

aquí empleada, puede mostrarse como un enfoque integrador e innovador de gran

utilidad potencial para el estudio de los mecanismos etiopatogénicos de esta

enfermedad y su significado biológico.

IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN

INTRODUCCIÓN - 5 -

INTRODUCCIÓN

1. SÍNDROME DEL INTESTINO IRRITABLE

El síndrome del intestino irritable (SII) es un trastorno funcional digestivo crónico

que se caracteriza por la presencia de dolor abdominal asociado a un cambio en el

número y/o consistencia de las deposiciones. El SII alcanza una prevalencia de hasta

el 20% de la población adulta (Mayer, 2008), constituye el diagnóstico más frecuente

del especialista en aparato digestivo y presenta, como otras enfermedades crónicas,

una clara, pero poco entendida, predominancia en el sexo femenino (2-3:1) (Chang &

Heitkemper, 2002). Además, la etiología y la fisiopatología de esta enfermedad no

están bien establecidas y tampoco existen métodos diagnósticos altamente sensibles

ni específicos, ni opciones terapéuticas claramente eficaces. A pesar de su elevada

prevalencia y de su gran impacto socio-económico, en la actualidad el diagnóstico

todavía se fundamenta en criterios derivados de las manifestaciones clínicas

principales, conocidos como los criterios de ROMA (Longstreth et al, 2006), y en la

exclusión de otras enfermedades orgánicas. Por todo ello, muchos pacientes con SII

experimentan un importante deterioro de su calidad de vida (El-Serag et al, 2002),

causa indirecta del progresivo crecimiento del gasto sanitario relacionado con esta

dolencia (Williams et al, 2007).

1.1. CRITERIOS DIAGNÓSTICOS

En la década de 1970-1979, Manning y colaboradores (Manning, 1978) realizaron

el primer intento para establecer unos criterios diagnósticos distintivos del SII. Estos

criterios se denominaron, por tanto, criterios de Manning. Posteriormente, el SII fue

adquiriendo cada vez mayor relevancia, lo cual propició la constitución de un comité de

expertos internacionales dedicado a la elaboración de criterios más detallados y

- 6 - INTRODUCCIÓN

precisos, desde entonces difundidos como los criterios de ROMA (así llamados por ser

el lugar de reunión del comité). En su primera versión, originada en 1990 (Drossman,

1990) y acordada en 1992 (Thompson et al, 1992), los criterios de ROMA I adoptaron

la mayoría de los criterios de Manning. Los criterios de ROMA II aparecieron en 1999

(Thompson, 1999) incorporando aspectos psicosociales, junto con nuevos

conocimientos y evidencias científicas en el campo de la neuro-gastroenterología.

Dichos criterios son los siguientes:

a. Presencia de dolor o molestia* abdominal durante más de 12 semanas, no

necesariamente consecutivas, en los últimos 12 meses.

b. Dicho dolor debe cumplir al menos dos de las siguientes características:

- Se alivia con la defecación.

- Comienzo asociado a una alteración en la frecuencia de las deposiciones.

- Comienzo asociado a una alteración en la consistencia de las deposiciones.

* Como molestia se entiende una sensación desagradable que no se describe como

dolor.

En 2006, se publicaron los criterios de ROMA III, que son los que están vigentes

en la actualidad. Estos criterios, menos restrictivos, modificaron el tiempo de evolución

necesario para establecer el diagnóstico, y revisaron los subtipos del SII (Longstreth et

al, 2006).

Al inicio de esta tesis los criterios ROMA III no estaban disponibles, por tanto todos

los pacientes incluidos fueron diagnosticados siguiendo los criterios ROMA II.

INTRODUCCIÓN - 7 -

1.2. MANIFESTACIONES CLÍNICAS

1.2.1. Dolor abdominal

El dolor o molestia abdominal es la primera manifestación clínica que caracteriza a

esta enfermedad, según establecen los criterios de ROMA, y está asociado a la

función intestinal. Este dolor se alivia con la defecación y está relacionado con una

alteración en la frecuencia y/o consistencia de las deposiciones. Con frecuencia, el

dolor es difuso y cambiante, puntiforme, se presenta con intensidad variable, puede

verse agravado por la ingesta y puede localizarse en cualquier parte del abdomen,

aunque típicamente predomina en el hemiabdomen inferior.

En la actualidad, la hipótesis más aceptada para explicar el dolor abdominal

crónico característico del SII consiste en la existencia de una percepción anómala de

estímulos en el intestino también llamada hipersensibilidad visceral (Mayer & Gebhart,

1994). La hipersensibilidad visceral comprende dos fenómenos: la hiperalgesia o

percepción dolorosa más intensa y prolongada asociada con un descenso del umbral

de activación; y la alodinia o sensación dolorosa de un evento fisiológico que previa y

habitualmente no causaba dolor. La sensibilidad en el tubo digestivo es el resultado de

la estimulación de varios quimiorreceptores y mecanorreceptores situados en la pared

del intestino. Estos receptores transmiten las señales a través de las vías neuronales

aferentes hacia el asta dorsal de la médula espinal y, finalmente, al cerebro (Azpiroz et

al, 2007). Habitualmente, en individuos sanos, el flujo constante de información a

través de este circuito no provoca una sensación consciente. Sin embargo, el 20-90%

de los pacientes con SII tienen una hipersensibilidad a la distensión intraluminal

(Azpiroz et al, 2007; Barbara et al, 2011). Este dato sugiere que estos pacientes

podrían tener anomalías en el procesamiento de las señales sensoriales, bien a nivel

central debido a una alteración en el procesamiento de los estímulos nociceptivos

(Azpiroz et al, 2007); o bien a nivel periférico por alteraciones en la sensibilidad de los

- 8 - INTRODUCCIÓN

receptores de la mucosa intestinal o del plexo mientérico en respuesta a la activación

del sistema inmunológico o a la liberación de mediadores por las células

enteroendocrinas (Barbara et al, 2011).

Por otra parte, la hipersensibilidad visceral no solo se limita a estímulos

provocados como la distensión, sino que algunos pacientes con SII frecuentemente

relacionan el inicio o la exacerbación de los síntomas con factores fisiológicos o

patológicos, incluyendo los movimientos intestinales (Kellow et al, 1991), ciertos

alimentos (Simrén et al, 2001; Simrén et al, 2007a; Simrén et al, 2007b) y estrés

(Whitehead et al, 1992; Bhatia & Tandon, 2005).

1.2.2. Patrón de deposiciones

La segunda manifestación que define el SII es la alteración de la consistencia de

las deposiciones. Así, de acuerdo con los criterios de ROMA II, los pacientes de SII se

clasifican en varios subtipos según la consistencia de sus deposiciones evaluada

mediante la escala de Bristol (figura 1): pacientes con predominio de diarrea (SII-D),

pacientes con predominio de constipación o estreñimiento (SII-C) y pacientes que

presentan un patrón alternante de ambos episodios (SII-A). Los criterios en los que se

basa dicha clasificación son los siguientes:

a. SII-D: aquellos pacientes que presentan una o más de las siguientes

características:

- Más de 3 deposiciones por día.

- Más de la cuarta parte de las deposiciones son blandas o acuosas.

- Más de la cuarta parte de las deposiciones se producen con urgencia.

b. SII-C: aquellos pacientes que presentan una o más de las siguientes

características:

- Menos de 3 deposiciones por semana.

INTRODUCCIÓN - 9 -

- Más de la cuarta parte de las deposiciones son duras o en forma de bolas.

- Más de la cuarta parte de las deposiciones se producen con esfuerzo.

c. SII-A: aquellos pacientes que presentan episodios fluctuantes de los dos

patrones anteriores.

La transición evolutiva de estreñimiento a diarrea, o viceversa, no es muy

frecuente pero tampoco está claramente establecido, ya que los patrones clínicos son

heterogéneos, típicamente variables e intermitentes entre los distintos subtipos

(Drossman, 2005). Es un tema de debate pero el hecho fundamental es que la

transición de estreñimiento a diarrea, o viceversa, es infrecuente mientras que ambos

subtipos pueden terminar o provenir del tipo alternante.

Figura 1. Escala de Bristol (adaptado de Lewis & Heaton, 1997).

- 10 - INTRODUCCIÓN

Durante muchos años se ha considerado a las alteraciones de la motilidad

digestiva como un factor fisiopatológico de gran relevancia para el SII. La motilidad

intestinal se define como el conjunto de contracciones coordinadas de las capas

musculares del intestino que tienen por finalidad propulsar el contenido luminal en

dirección aboral. Sin embargo, no existe un patrón motor específico del SII, sino más

bien alteraciones de carácter cuantitativo respecto a personas sanas. Así pues, en los

pacientes con SII se han descrito las siguientes alteraciones:

- Un tránsito intestinal acelerado en los pacientes con SII-D, o ralentizado en los

pacientes con SII-C (Quigley, 2005).

- Mayor afectación de la función intestinal por transgresiones dietéticas o factores

psicosociales.

- Alteración del tráfico y de la tolerancia intestinal a una sobrecarga con gas (Serra

et al, 2001).

- Respuesta motora excesiva a: reflejo gastrocólico, distensión rectal, estrés

(Kellow et al, 1992; Chang, 2008) y a la administración de colecistoquinina, o de factor

liberador de corticotropina (CRF) (Fukudo et al, 1999).

Sin embargo, las alteraciones motoras observadas en los pacientes con SII no son

específicas ni consistentes y correlacionan parcialmente con la clínica, por tanto no

pueden considerarse marcadores para el diagnóstico (Quigley, 2005).

INTRODUCCIÓN - 11 -

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1.3. ETIOPATOGENIA

Pese a que no disponemos de marcadores biológicos fiables, existen evidencias

que sugieren que el origen del SII es multifactorial, incluyendo determinantes

genéticos, ambientales, infecciosos, psicosociales y género-dependientes, entre otros.

La interacción dinámica entre estos factores conforma la base conceptual del modelo

biopsicosocial (figura 2), el cual define al SII como una enfermedad resultante de las

respuestas inadecuadas a factores fisiológicos, psicosociales, de conducta y

ambientales (Halpert & Drossman, 2005).

1.3.1. Factores relacionados con el inicio y/o la perpetuación del SII

En condiciones de homeostasis, la interacción entre el sistema nervioso central

(SNC) y el sistema nervioso entérico (SNE), denominado eje cerebro-intestino,

desempeña un papel crucial en la regulación de la función digestiva, en la modulación

del sistema inmunológico asociado al intestino y en la coordinación entre el estado

físico y emocional general del individuo y la actividad del tracto gastrointestinal (Kellow

et al, 2006). Se especula que la disfunción de este eje cerebro-intestino podría

contribuir a la generación de los síntomas del SII, siendo responsable de la

hipersensibilidad visceral y de la alteración de la motilidad intestinal (Drossman, 2006).

Aunque se desconoce la base fisiopatológica subyacente a esta alteración, se han

identificado algunos factores relacionados con el inicio, la perpetuación y la severidad

de las manifestaciones clínicas del SII. Estos factores son el estrés psicológico crónico

y las infecciones gastrointestinales (Faresjo et al, 2007; Bennet et al, 1998; Nicholl et

al, 2008; Spiller & Garsed, 2009), así como factores genéticos, tal y como se describe

a continuación.

a. Estrés psicológico: el estrés tiene un papel particularmente relevante en las

alteraciones del eje cerebro-intestino. Se ha demostrado que la exposición


experimental a diferentes tipos de estrés tanto físico como psicológico, actuando a

través del SNC, provoca la alteración de la respuesta secreto-motora del tracto

gastrointestinal (Mayer et al, 2001). Además, existen evidencias que apoyan la

existencia de una comunicación multi-direccional entre todos los componentes del

circuito estrés-inflamación (Santos et al, 2002), que se consigue gracias a la liberación

de neuropéptidos, hormonas, neurotransmisores y otros mediadores. Numerosos

datos apoyan la relevancia funcional de estas interacciones en la modulación de los

procesos inmunológicos e inflamatorios en la mucosa intestinal a través de su

influencia sobre los procesos de secreción y absorción, transporte de macromoléculas

a través del epitelio, la atracción y activación de células del sistema inmunológico o de

la capacidad metabólica de la microbiota intestinal (Wood, 2007). La alteración de este

delicado equilibrio a cualquier nivel puede dar lugar al desarrollo de un proceso

inflamatorio.

Numerosas evidencias apoyan el papel esencial del estrés en la sintomatología del

SII (Taché et al, 2004; Chang, 2008). Diferentes estudios clínicos han demostrado que

hasta un 50% de los pacientes con SII presentan trastornos psiquiátricos como

ansiedad, depresión, somatización y alteraciones de la personalidad (Lydiard, 2001;

Whitehead et al, 2002). Además, el estrés psicosocial, ya sea agudo o crónico,

precede frecuentemente el inicio o la exacerbación de los síntomas (Chang, 2008) y

varios estudios han demostrado que estos pacientes sufren más estrés crónico que los

individuos sanos (Whitehead et al, 1992; Bennet et al, 1998; Guilarte et al, 2007). En

los últimos años, la aplicación de técnicas de imagen, como la resonancia magnética

funcional, ha permitido demostrar que en los pacientes con SII existen alteraciones en

la densidad de la materia gris en áreas clave del cerebro involucradas en la atención,

la inhibición de regulación de la emoción, el dolor y el tratamiento de la información

visceral (Seminowicz et al, 2010).


b. Infecciones gastrointestinales: la activación del sistema inmunológico es un

mecanismo de defensa crucial frente a las infecciones, sin embargo la persistencia de

la respuesta inflamatoria tras la resolución del proceso infeccioso puede dar lugar a la

cronificación de los síntomas. En particular, la gastroenteritis, ya sea vírica o

bacteriana, es uno de los factores de riesgo más importantes asociados al desarrollo

del SII (Marshall et al, 2004; Mearin, 2005; Spiller & Garsed, 2009). Se calcula que un

4-36% de individuos que contraen una infección gastrointestinal desarrollará SII

(Spiller & Garsed, 2009). La sintomatología del llamado, por tanto, SII post-infeccioso

(SII-PI) se asemeja notablemente al SII-D. Uno de los hallazgos más significativos en

la mucosa del colon de pacientes con SII-PI es el incremento de células

enterocromafines y de linfocitos intraepiteliales que persiste hasta cuatro meses

después de la resolución de la infección aguda junto con el aumento de la expresión

de citocinas pro-inflamatorias (Spiller et al, 2000; Dunlop et al, 2003). Los mecanismos

que provocan la persistencia de las alteraciones inmunológicas y el desarrollo de SII-

PI no se conocen con exactitud, sin embargo se han identificado varios factores de

riesgo asociados. Entre estos factores de riesgo los más relevantes son el género

femenino, la severidad de la infección, la susceptibilidad genética y la presencia de

trastornos psicológicos previos como la ansiedad o la depresión (Gwee et al, 1999;

Thabane & Marshall, 2009).

c. Factores genéticos: Existen evidencias que apuntan a la contribución relativa del

componente genético como factor de riesgo para el desarrollo del SII. Los datos de

concordancia en gemelos monocigóticos, junto con el riesgo relativo de los parientes

de primer grado, representan una evidencia a favor del componente genético del SII

(Hotoleanu et al, 2008). Sin embargo, los estudios realizados hasta la fecha en este

sentido no permiten descartar un papel clave de los factores ambientales (Locke et al,

2000). De hecho, estudios de agregación familiar han descrito que el papel


fundamental del aprendizaje social es tan importante como la carga genética, de

manera que la existencia de un familiar de primer grado con síntomas de dolor

abdominal o trastornos intestinales se asocia a la probabilidad de padecer SII ((Levy et

al, 2001; Kalantar et al, 2003).

Por otro lado, el papel de los factores genéticos también se ha puesto de

manifiesto gracias a la identificación de polimorfismos genéticos en pacientes con SII

que podrían conferir cierta susceptibilidad a desarrollar esta enfermedad (Camilleri,

2009; Saito, 2011). Los polimorfismos mejor estudiados se localizan en genes

implicados en la síntesis, metabolismo y receptores de la serotonina (o 5-

hidroxitriptamina, 5-HT); en mediadores inflamatorios, como la citocina anti-

inflamatoria interleucina 10 (IL-10); en genes relacionados con la función de barrera

epitelial; y en genes asociados a trastornos psiquiátricos (Saito, 2011).

1.3.2. Substrato biológico

La fisiopatología del SII es muy compleja y poco conocida. En los últimos años se

han producido una serie de hallazgos indicativos de la existencia de un substrato

biológico en esta enfermedad, lo cual ha llevado a cuestionar su naturaleza funcional,

al menos en algunos subgrupos de pacientes. Los factores mejor caracterizados son:

la presencia micro-inflamación en la mucosa intestinal, las alteraciones en la

señalización neuronal y las alteraciones en la microbiota intestinal.

a. Micro-inflamación: recientes observaciones en pacientes con SII denotan la

existencia de inflamación en la mucosa intestinal con hiperplasia y activación de

algunas estirpes de células inmunológicas (mastocitos, linfocitos T) (Chadwick et al,

2002; Barbara et al, 2004; Guilarte et al, 2007). Esta infiltración y activación celular se

asocia, en algunos subgrupos de pacientes, con el aumento de la expresión de

moléculas pro-inflamatorias como la interleucina 1 beta (IL-1β) en la mucosa intestinal


(Gwee et al, 2003) y con una liberación en sangre periférica de citocinas pro-

inflamatorias como el factor de necrosis tumoral α (TNFα, del inglés tumor necrosis

factor alpha) y la interleucina (IL)-6 y su receptor (IL-6r) junto a una disminución de

citocinas anti-inflamatorias como IL-10 y el factor de crecimiento tumoral beta (TGF-β,

del inglés tumoral growth factor beta) (Dinan et al, 2006; Macsharry et al, 2008).

La persistencia de la activación inmunitaria junto a la liberación constante de

mediadores pro-inflamatorios en la mucosa intestinal podría ser el origen de la hiper-

excitabilidad de las terminaciones nerviosas en la mucosa intestinal contribuyendo a

iniciar o perpetuar la hipersensibilidad visceral en el subgrupo de pacientes con SII-D.

Esta hipótesis se ve reforzada por los estudios realizados en animales de

experimentación en los que se ha podido comprobar que incluso una inflamación leve

o anatómicamente distante puede provocar cambios persistentes en los nervios

entéricos y en la función muscular digestiva, siendo el mecanismo responsable de la

sensibilización de las terminaciones aferentes de la pared intestinal (Bercik et al, 2004;

Akiho et al, 2005). Además, la severidad del dolor abdominal en los pacientes con SII

se correlaciona positivamente con el número de unidades mastocito-nervio, sobre todo

nervios inmunorreactivos a substancia P (Barbara et al, 2007), y con la liberación por

parte del mastocito de potentes mediadores neuromoduladores como la histamina y la

triptasa, que son capaces de actuar sobre las terminaciones nerviosas aferentes.

El origen de dicha micro-inflamación es desconocido, pero podría ser

consecuencia de la alteración de la función de barrera del epitelio intestinal, la cual

juega un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis de la mucosa intestinal

(Turner, 2009). Esta función depende tanto de la conservación de la integridad física,

para prevenir interacciones descontroladas entre el huésped y el contenido y la

microbiota intestinal, como de la ejecución adecuada del programa de vigilancia


inmunológica que modula el procesamiento de la enorme carga antigénica presente en

la luz intestinal.

b. Señalización neuronal: el neurotransmisor mejor estudiado en relación con la

fisiopatología del SII es la serotonina (o 5-hidroxitriptamina, 5-HT), la cual presenta

una amplia distribución en todo el tracto digestivo localizándose en las terminaciones

nerviosas del SNE y en las células enterocromafines de la mucosa intestinal. Tras su

liberación, la 5-HT actúa sobre receptores específicos en las neuronas aferentes de la

mucosa y del plexo mientérico provocando una respuesta secreto-motora que tiene

como consecuencia el aumento de la secreción intestinal, del reflejo peristáltico y, por

tanto, el desarrollo de diarrea (Spiller, 2008). Alteraciones en los niveles de 5-HT

podrían explicar la sintomatología de los pacientes con SII. De hecho, en el SII-PI y en

el SII-D se ha descrito un aumento de la liberación de 5-HT asociado a un defecto en

el metabolismo de este neurotransmisor (Dunlop et al, 2005; Atkinson et al, 2006). Por

otra parte, se ha estudiado una gran variedad de neuropéptidos entre los que se

encuentran la colecistoquinina, el neuropéptido Y, la somatostatina y la sustancia P,

entre otros (Clarke G et al, 2009).

c. Microbiota intestinal: la comunidad de bacterias comensales que habita el

intestino humano supera, en al menos 10 veces, el número total de células que forman

el cuerpo humano y contiene una carga genética total 100 veces superior al número de

genes que conforma el genoma humano (Gill et al, 2006). Estas bacterias tienen un

gran impacto en la fisiología del huésped y se ha sugerido que desempeñan una

función clave en la fisiopatología de diversas enfermedades inflamatorias y

autoinmunes (Chow et al, 2010). El sobrecrecimiento bacteriano en el intestino

delgado (SIBO, del inglés, small intestinal bacterial overgrowth) se ha asociado a la

sintomatología del SII, sin embargo, los resultados en este sentido no son

concluyentes (Ford et al, 2009). Por otra parte, varios estudios han demostrado


alteraciones cualitativas y cuantitativas en la microbiota fecal de pacientes con SII.

Estos pacientes presentan una menor estabilidad temporal en las poblaciones

bacterianas que, además, se ha asociado a la sintomatología del SII a través del

incremento en la producción de ácido acético y de ácido propiónico (Lee & Tack, 2010;

Tana et al, 2010). El efecto de estos ácidos orgánicos podría estar mediado por un

aumento en la sensibilidad de las vías vagales aferentes a estímulos químicos que

contribuiría a la hipersensibilidad visceral en estos pacientes, tal y como se ha descrito

en un modelo de estrés experimental (Aerssens et al, 2007).

2. EL INTESTINO: ESTRUCTURA Y FUNCIÓN

Su función principal es la digestión y absorción de nutrientes esenciales para el

mantenimiento de las funciones del organismo y, al mismo tiempo, la protección frente

a la intrusión de agentes potencialmente nocivos. Para aumentar la superficie de

absorción, la mucosa intestinal presenta unas invaginaciones y evaginaciones

llamadas criptas de Lieberkühn y vellosidades, respectivamente, representado en la

figura 3. Esta estructura se denomina eje cripta-vellosidad y representa la unidad

funcional básica del intestino delgado (Reya & Clevers, 2005).

2.1. ESTRUCTURA HISTOLÓGICA DEL INTESTINO

La pared del intestino presenta una arquitectura histológica similar constituida por

4 capas concéntricas (figura 3): la mucosa, la submucosa, la muscular y la serosa

(Young & Heath, 2000).

a. Capa mucosa: es la más externa y en contacto con la luz intestinal, se divide a

su vez en tres subcapas concéntricas: el epitelio columnar, la lámina propria y la

muscularis mucosae.


- Epitelio: formado por una monocapa de células epiteliales especializadas, los

enterocitos, cuyas funciones principales son la absorción de nutrientes, la

secreción de agua y de electrolitos y la función de barrera frente a bacterias y

sustancias nocivas.

- Lámina propria: formada por tejido conectivo que contiene numerosos vasos

sanguíneos y linfáticos, así como fibras nerviosas. Está compuesta de una gran

variedad celular con funciones defensivas y de comunicación. Esta capa de la

mucosa incluye el tejido linfoide asociado al intestino (GALT, del inglés Gut-

Associated Lymphoid Tissue). El GALT está formado por el tejido linfoide difuso y

los folículos linfoides prominentes, que contienen células del sistema inmunitario.

Las células presentadoras de antígenos (linfocitos, macrófagos y células

dendríticas) del GALT reconocen e inducen respuestas inmunológicas contra

microbios y otros antígenos, como las bacterias que penetran el epitelio.

- Muscularis mucosae: separa la mucosa de la submucosa y constituye el soporte

físico de ésta. Incluye una capa circular interna y una capa longitudinal externa de

músculo liso.

b. Capa submucosa: es la capa de tejido conectivo que se encuentra por debajo

de la mucosa. En la capa submucosa se encuentra el plexo submucoso o plexo de

Meissner que forma parte del SNE y su función principal consiste en regular la

secreción de las glándulas digestivas.

c. Capa muscular: formada por células musculares lisas distribuidas

estructuralmente en dos capas, la circular y la longitudinal. Es la capa responsable

de los movimientos peristálticos que desplazan el contenido de la luz a lo largo del

tubo digestivo. Entre sus dos capas se encuentra otro componente del SNE, el plexo

mientérico o plexo de Auerbach, que regula la actividad motora de esta capa.


d. Capa serosa: formada básicamente por células epiteliales planas y tejido

conjuntivo.

Figura 3. Corte transversal del intestino delgado. (Fuente: http://www.bu.edu/histology/m/intro.htm) y Eje cripta-

vellosidad en el intestino delgado. (Reproducido de Reya & Clevers, 2005)

2.2. FUNCIÓN DEL INTESTINO DELGADO

2.2.1. Transporte a través del epitelio intestinal

La absorción es el proceso por el cual los nutrientes son transportados al interior

de la mucosa y al torrente circulatorio. Los enterocitos presentan una gran actividad

transportadora: se encargan del movimiento de grandes cantidades de sales y agua

desde la luz hacia el torrente circulatorio y viceversa. Dichas células epiteliales están

equipadas con canales iónicos, transportadores y bombas, localizados en la

membrana apical y basolateral, que participan en el movimiento de los electrolitos. El

transporte neto es el resultado del balance entre la absorción y la secreción.


Existen tres rutas a través de las cuales el epitelio intestinal regula el transporte

selectivo de sustancias: la ruta transcelular, la ruta paracelular (figura 4) y la ruta de

endocitosis.

a. Transporte transcelular: consiste en el transporte de solutos a través de la

membrana del enterocito. Este transporte puede ser activo como resultado de

la acción de transportadores específicos (iones, aminoácidos, antígenos), o

bien puede producirse como resultado de la difusión pasiva a través de la

membrana apical del enterocito.

b. Transporte paracelular: consiste en el transporte pasivo a través del espacio

entre dos enterocitos adyacentes y está regulado por complejos proteicos

intercelulares localizados en las uniones latero-apicales de las membranas

celulares.

c. Transporte por endocitosis: las partículas más grandes como proteínas y

productos bacterianos no pueden pasar a través de la membrana celular ni del

espacio paracelular, pero son captados por las células mediante

invaginaciones de la membrana plasmática seguido de la formación de

vesículas en un proceso llamado endocitosis. Tras la endocitosis, las partículas

captadas son transportadas activamente mediante un proceso llamado

transcitosis vectorial, a través del citoplasma, hacia los lisosomas. Este es un

fenómeno esencial que media la captación de antígenos para la iniciación de

una respuesta inmunológica apropiada. Ambos procesos son susceptibles de

ser manipulados por bacterias patógenas, como parte de su estrategia

invasiva, para penetrar e infectar al huésped (Keita & Söderholm, 2010).


Transcelular Paracelular

Membrana apical

Membrana basolateral

Unión estrecha

Membrana lateral


Membrana apical


Unión estrecha

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Membrana apical


Unión estrecha

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Figura 4. Rutas de transporte a través del epitelio intestinal. (Reproducido de Groschwitz & Hogan, 2009).

2.2.2. Función de barrera de la mucosa intestinal

El mantenimiento de la homeostasis intestinal depende fundamentalmente de la

existencia de una barrera intacta que impida el paso de antígenos presentes en la luz

intestinal y el consiguiente desarrollo de procesos infecciosos y daño tisular. Esta

barrera está compuesta por elementos físicos (epitelio, reflejo peristáltico) y químicos

(la capa de mucinas, la secreción de agua e iones y la liberación de compuestos

antimicrobianos). Además, existen células especializadas que dirigen la respuesta

inmunológica (GALT y células del sistema inmunitario sistémico). Estos elementos

actúan en la mucosa intestinal de manera coordinada, y están organizados en dos

niveles de protección:


a. El primer nivel de protección está compuesto por elementos extracelulares como

el reflejo peristáltico, el glicocálix y la secreción de agua, iones y sustancias

antimicrobianas por parte de las células del epitelio.

- Reflejo peristáltico: consiste en el conjunto de movimientos coordinados de

las capas musculares del intestino, cuya finalidad es propulsar el contenido luminal en

sentido aboral.

- Glicocálix: la superficie de la mucosa intestinal está recubierta por una densa

capa de moco compuesto por glicoproteínas, mucinas y diversos enzimas. Este moco

protege al epitelio frente al estrés mecánico e impide el contacto directo de las células

epiteliales con las bacterias presentes en la luz intestinal (Renes et al, 2002).

- Secreción de agua e iones: dificultan la adhesión de bacterias al epitelio.

Junto con el reflejo peristáltico la secreción de agua se incrementa en respuesta a

infecciones víricas o bacterianas, con la finalidad de arrastrar el contenido luminal

expulsando rápidamente el agente nocivo.

- Liberación de sustancias antimicrobianas: principalmente defensinas y

lisozimas producidas por las células de Paneth que ejercen su función produciendo

poros en la pared celular de las bacterias.

b. El segundo nivel de protección es el propio epitelio. Consiste en una monocapa

de células columnares especializadas llamadas enterocitos, las cuales mantienen un

delicado equilibrio entre dos funciones críticas para la homeostasis intestinal: la

función absortiva de nutrientes a través de la membrana apical, y la función de barrera,

que impide el paso de antígenos.

Además de los enterocitos, en el epitelio encontramos células del sistema

inmunológico, como los linfocitos intraepiteliales y otras células con funciones

secretoras, como las células caliciformes secretoras de moco (células de Goblet),

células enteroendocrinas secretoras de hormonas y neuropéptidos y las células de


Paneth productoras de péptidos antimicrobianos (Young & Heath, 2000) (figura 5).

Bajo esta capa se encuentra la lámina propria que contiene diferentes células

inmunocompetentes que forman una unidad funcional junto con las células epiteliales

(Kato & Owen, 1999; Mayer, 2000).

Figura 5. Corte transversal de la mucosa del intestino delgado y detalle de las criptas de Lieberkühn (Fuente:

http://www.bu.edu/histology/m/intro.htm).

3. UNIONES INTERCELULARES

Los tejidos epiteliales están formados por láminas continuas de células que

revisten y protegen el interior de órganos y cavidades del organismo. Las uniones

intercelulares son necesarias para dar al epitelio la integridad estructural y la actividad

celular necesarias para llevar a cabo sus funciones específicas.

3.1. COMPONENTES DE LAS UNIONES INTERCELULARES

Se clasifican en tres grupos funcionales: uniones estrechas, uniones de anclaje

(uniones adherentes y desmosomas) y uniones comunicantes (figura 6).


a. Uniones estrechas: las uniones estrechas (TJ, del inglés tight junctions) son las

uniones intercelulares más apicales. Forman una barrera selectiva y

semipermeable que facilita la difusión pasiva de solutos a través del espacio

intercelular mientras que, al mismo tiempo, bloquean la entrada de antígenos

luminales, microorganismos y toxinas (Balda & Matter, 2008).

b. Uniones de anclaje:

- Uniones adherentes: las uniones adherentes (AJ, del inglés adherens

junctions) regulan la adhesión entre células adyacentes mediante la unión del

citoesqueleto de actina de ambas células a través de moléculas de adhesión

transmembrana y los complejos proteicos asociados a éstas. El núcleo de

estas uniones consiste en dos unidades básicas de adhesión: la interacción

entre las glicoproteínas transmembrana de la superfamilia de las caderinas y

los miembros de la familia de las cateninas (Niessen & Gottardi, 2008).

- Desmosomas: son las uniones intercelulares más fuertes. Su función es

mantener unidas a las células del epitelio, asociando el citoesqueleto de

filamentos intermedios de las células vecinas, formando así una red

transcelular con una alta resistencia a la tracción mecánica. Esta disposición

permite que las células mantengan su forma y que la lámina epitelial exista en

forma estable. Además, son centros de señalización y participan en varios

procesos celulares como la diferenciación, la proliferación y la morfogénesis

(Garrod & Chidgey, 2008).

c. Uniones comunicantes: están formados por 6 proteínas transmembrana

llamadas conexinas. La función de estas uniones es formar un canal que

atraviese las membranas de células vecinas, permitiendo la comunicación

entre sus citoplasmas.


Figura 6. Uniones intercelulares en el epitelio del intestino delgado. A. Fotografía de microscopía electrónica

que muestra las uniones entre dos enterocitos adyacentes (cortesía de la Dra. Vicario). B. Esquema de las

uniones donde se muestran las interacciones entre las proteínas integrales de las uniones y sus conexiones con el

citoesqueleto de acto-miosina (reproducido de Turner, 2009).

3.2. UNIONES ESTRECHAS

La función de las TJ es fundamental en el mantenimiento de la barrera del epitelio

intestinal, y de la polaridad celular, limitando la difusión de lípidos y proteínas desde la

región apical hacia la región basolateral de las membranas. Las TJ se componen de

complejos multiproteicos constituidos por cuatro familias de proteínas transmembrana:

ocludina, claudinas, moléculas de adhesión de las uniones (JAM, del inglés junctional

adhesion molecules) y tricelulina (figura 7).


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3.2.1. Ocludina

La ocludina es una proteína integral de membrana de 60-82 kDa que posee cuatro

segmentos transmembrana (Balda & Matter, 2008). Se expresa de forma

predominante en células epiteliales y endoteliales, y también se ha descrito su

expresión en astrocitos, neuronas, macrófagos y células dendríticas (Bauer et al, 1999;

Blank et al, 2011). Existen varias isoformas de esta proteína, algunas de las cuales

están relacionadas con la alteración de su distribución subcelular y la interacción con

otras proteínas que forman parte de las TJ (Mankertz et al, 2002).

A pesar de ser la primera proteína específica de TJ descrita, la función de la

ocludina no está totalmente definida. Por una parte, varios estudios in vitro sugirieron

inicialmente un papel clave de esta proteína en la regulación de la función de barrera

de las TJ (Balda et al, 1996; Chen et al, 1997). Sin embargo, los ratones deficientes en

ocludina no muestran alteraciones aparentes en la estructura o función de las TJ del

epitelio intestinal (Schulzke et al, 2005) lo que sugiere la existencia de otras proteínas

capaces de compensar la función de la ocludina.

La localización de la ocludina y su participación en el ensamblaje y desensamblaje

de las TJ están reguladas mediante fosforilación en residuos específicos de Ser, Thr y

Tyr, de manera que la alteración en el patrón de fosforilación de esta proteína provoca

su translocación al citoplasma (Simonovic et al, 2000), desestabilizando las TJ con el

consiguiente aumento de la permeabilidad paracelular (Rao, 2009; Elias et al, 2009).

3.2.2. Claudinas

Las claudinas son proteínas integrales de membrana de 20-27 kDa con cuatro

segmentos transmembrana. Esta familia de proteínas consta de 24 miembros

identificados hasta la fecha. Presentan un patrón de expresión específico de tejido

(Chiba et al, 2008) y se localizan mayoritariamente en las TJ de células epiteliales y


endoteliales. Sin embargo, recientemente se han detectado también en vesículas

citoplasmáticas, en células no epiteliales (macrófagos y células dendríticas) y en

neuronas de los sistemas nerviosos central y entérico (Blank et al, 2010; Karaki et al,

2007).

Las claudinas son el principal factor que determina la función de barrera de las TJ

controlando el paso de iones a través del espacio paracelular (Chiba et al, 2008).

Estas proteínas forman canales con propiedades biofísicas similares a los canales

iónicos tradicionales incluyendo la selectividad por la carga iónica y la permeabilidad

dependiente de la concentración iónica (Hartsock & Nelson, 2008).

Al igual que ocurre con la ocludina, la localización de las claudinas en las TJ y su

función están reguladas mediante la fosforilación específica de residuos de Ser y Thr.

3.3. PLACA CITOPLASMÁTICA

La denominada placa citoplasmática está formada por una red muy compleja de

proteínas adaptadoras que interconectan las proteínas integrales de las uniones

intercelulares y las acoplan al citoesqueleto de actina. Además, las proteínas que

forman esta placa son capaces de reclutar una gran variedad de componentes de

señalización incluyendo kinasas, fosfatasas y proteínas G (figura 7). Así, la placa

citoplasmática juega un papel fundamental en la regulación de la adhesión y la

permeabilidad paracelular, y también en la transmisión de señales desde las uniones

intercelulares hacia el interior de la célula para la regulación de procesos celulares

fundamentales como la migración y la expresión génica (Guillemot et al, 2008).

El eje estructural de la placa citoplasmática está compuesto por proteínas con

dominios PDZ (del inglés Postsynaptic density-95/Drosophila disc large/Zonula

occludens-1 protein). A este grupo pertenecen, entre otras, las proteínas de la familia

MAGUK (del inglés membrane-associated guanylate kinase), que incluye las proteínas


zonula occludens (ZO)-1, ZO-2 y ZO-3; la familia MAGI (del inglés MAGUK inverted

protein), que incluye MAGI-1 y MAGI-3; y un grupo de proteínas implicadas en el

establecimiento de la polaridad apico-basal de las células epiteliales (Guillemot et al,

2008).

La proteína ZO-1 fue la primera proteína asociada a las TJ que fue identificada y

es una de las mejor caracterizadas. Esta proteína juega un papel fundamental para el

reclutamiento de las claudinas en la TJ, la formación de las TJ y el establecimiento de

la función de barrera (Umeda et al, 2006). Las proteínas ZO contienen, además, varias

señales que determinan la localización y la exportación nuclear de manera que, en

respuesta a estímulos nocivos como el estrés celular, se concentran en el núcleo

donde se asocian a factores de transcripción y a proteínas reguladoras del ciclo celular

(Matter & Balda, 2007).

3.4. CITOESQUELETO

El citoesqueleto de actina y miosina también tiene un papel fundamental en la

regulación de la estructura y la función de las TJ (Madara & Pappenheimer, 1987). En

las células epiteliales polarizadas los filamentos de actina forman un cinturón que

rodea la zona más apical de la membrana lateral sosteniendo las uniones

intercelulares. Varias proteínas de la placa citoplasmática interaccionan directamente

con la actina y la miosina. Dichas interacciones estabilizan el complejo de las uniones

y proporcionan la fuerza necesaria para su interrupción tras la contracción del anillo de

acto-miosina (Miyosi & Takai, 2008).

Además de los filamentos de actina, la proteína miosina II juega un papel clave en

la regulación de la permeabilidad paracelular. Esta proteína está compuesta de dos

cadenas pesadas de aproximadamente 200 kDa cada una y cuatro cadenas ligeras de

20 kDa, las cuales, agrupadas de dos en dos, reciben el nombre de cadena esencial


(MLC1, del inglés myosin light chain 1), y cadena reguladora (MLC2), respectivamente.

El mecanismo por el cual se produce el desensamblaje de las TJ epiteliales implica la

fosforilación de MLC2 en el residuo de Ser19, lo cual provoca la contracción del anillo

de acto-miosina y la consiguiente pérdida de función de las TJ cuya consecuencia final

es el aumento de la permeabilidad paracelular (González-Mariscal et al, 2008; Turner,

2009).

4. SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR A TRAVÉS DE LAS TJ DEL INTESTINO

Además del papel en la regulación de la función de barrera y de la permeabilidad

paracelular del epitelio intestinal, las TJ también están vinculadas a varios

mecanismos de señalización intracelular que controlan la proliferación, la polarización

y la diferenciación de las células epiteliales (Balda & Matter, 2008). Tal y como se

describe anteriormente, las TJ se componen de una gran variedad de proteínas

integrales y periféricas que se asocian a diversas moléculas implicadas en cascadas

de señalización, como kinasas, fosfatasas y proteínas G. Estas interacciones permiten

la transmisión de información desde las uniones intercelulares hacia el interior de la

célula. Además, el ensamblaje y el desensamblaje de las TJ están regulados mediante

la comunicación entre varias vías de señalización, tal y como se detalla a continuación.

4.1. SEÑALIZACIÓN POR FOSFORILACIÓN/DEFOSFORILACIÓN

Uno de los mecanismos más importantes de regulación de la función de las

proteínas es la fosforilación y la defosforilación de aminoácidos específicos. La

relación entre el grado de fosforilación de proteínas específicas de las TJ se empezó a

estudiar a finales de los años ochenta (Stevenson et al, 1989) y, desde entonces, se

han realizado importantes progresos en este campo.


4.1.1. Ser/Thr kinasas.

Existen tres familias de Ser/Thr kinasas cuyos efectos sobre la permeabilidad

intestinal han sido bien descritos: la proteína kinasa de la cadena ligera de la miosina

(MLCK, del inglés myosin light chain kinase), la familia de proteínas kinasas C (PKC) y

la familia de proteínas kinasas activadas por mitógenos (MAPK, del inglés mitogen-

activated protein kinases).

a. Señalización por MLCK:

La MLCK es una Ser/Thr kinasa que fosforila específicamente a MLC2. Existen

varias isoformas de esta proteína, de las cuales sólo MLCK1 y MLCK2 se expresan en

el epitelio intestinal (Marchiando et al, 2010). La actividad de MLCK depende de la

unión a la proteína calmodulina en presencia de Ca2+. El dominio de unión a

calmodulina puede ser fosforilado por PKC provocando la inactivación de MLCK y la

consiguiente disminución en la fosforilación de MLC2, seguido de la relajación del

anillo de acto-miosina y la disminución de la permeabilidad paracelular (González-

Mariscal et al, 2008).

En el epitelio intestinal, la sobre-expresión del dominio catalítico de MLCK produce

un aumento de la permeabilidad paracelular, tanto in vitro como in vivo (Shen et al,

2006; Su et al, 2009; Weber et al, 2010). Este efecto de la activación de MLCK sobre

la función de la barrera intestinal se ha relacionado con diversos estímulos pro-

inflamatorios y con modelos de infección por bacterias enteropatógenas (Nusrat et al,

2000; Clayburgh et al, 2005; Wang et al, 2005). Todos estos resultados sugieren que

la disfunción de la barrera intestinal tras la activación de MLCK podría predisponer y

contribuir a la patogénesis de procesos inflamatorios intestinales. De hecho, la

expresión y la activación de MLCK son mayores en la mucosa intestinal de pacientes

con otras patologías asociadas a un aumento de la permeabilidad intestinal, como la


enfermedad de Crohn, y, además, este aumento se correlaciona directamente con la

severidad de la inflamación (Blair et al, 2006).

b. Señalización por PKC:

La familia de PKC incluye 12 isoenzimas que difieren en su mecanismo de acción,

en su localización subcelular, en el substrato y en su expresión. Estas isoenzimas se

clasifican en tres subfamilias: convencionales o clásicas, nuevas y atípicas (Farhadi et

al, 2006).

En el intestino, la permeabilidad epitelial depende del equilibrio entre algunas de

las isoformas de PKC. La alteración de este equilibrio puede producir la

desestabilización del citoesqueleto de actina y, en consecuencia, la ruptura de la

integridad de la barrera intestinal, aunque los resultados en este sentido son

contradictorios (Farhadi et al, 2006).

c. Señalización por MAPK:

Las MAPK responden a estímulos extracelulares, como factores de crecimiento y

estrés celular, y modulan varios procesos celulares incluyendo la expresión génica, la

mitosis, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis. Esta vía de señalización

también modula el transporte paracelular, controlando la expresión génica de varias

proteínas de las TJ, o bien mediante la interacción directa de proteínas integrales de

las TJ con otras proteínas transmembrana necesarias para la activación de las MAPK

(González-Mariscal et al, 2008).

La activación de las isoformas JNK y p38 MAPK se ha asociado a la inflamación

crónica en la mucosa intestinal, aunque los resultados son controvertidos (Hommes et

al, 2002; Malamut et al, 2006; Docena et al, 2010). Ambas son, al mismo tiempo,

activadores y receptores para el TNFα, un mediador esencial para la iniciación y

amplificación de la inflamación. Uno de los mecanismos de acción clave del TNFα es


la desestabilización de la función de barrera del epitelio intestinal a través del aumento

de la actividad de MLCK (Clayburgh et al, 2005; Wang et al, 2005).

4.1.2. Ser/Thr fosfatasas.

La fosfatasa 2A (PP2A, del inglés protein phosphatase 2A) induce la

defosforilación de ZO-1, ocludina y claudina-1, lo cual resulta en un incremento de la

permeabilidad paracelular. Además, la inhibición específica de PP2A con ácido

okadaico da como resultado la hiperfosforilación de estas proteínas acelerando el

ensamblaje de las TJ (Nunbhakdi-Craig et al, 2002; Seth et al, 2007).

Por otro lado, las Ser/Thr fosfatasas pueden ejercer efectos contrarios en la

función barrera de las TJ mediante la inhibición selectiva de diferentes isoformas de

PKC. Así, en una línea celular de epitelio renal se ha descrito que PP2A inhibe la

isoforma atípica PKCζ provocando el desensamblaje de las TJ (Nunbhakdi-Craig et al,

2002), mientras que en cultivos de células endoteliales se ha observado que PP2B

bloquea la actividad de la isoforma convencional PKCα y, en consecuencia, promueve

el ensamblaje de las TJ (Lum et al, 2001).

4.2. SEÑALIZACIÓN POR RHO GTPASAS

Rho es una familia de proteínas perteneciente a la superfamilia de pequeñas

proteínas de unión a GTP que incluye RhoA, Rac y Cdc42. La activación de estas

proteínas está mediada por la acción de factores de intercambio de guanina (GEF, del

inglés guanine nucleotide exchange factors) y proteínas activadoras de GTPasa (GAP,

del inglés GTPase activating proteins) (Terry et al, 2010).

La función principal de las proteínas Rho es la modulación de la permeabilidad

paracelular mediante la reorganización del citoesqueleto de acto-miosina. Los


efectores de esta vía de señalización son la familia de proteínas Ser/Thr kinasas

ROCK, las cuales actúan a dos niveles:

a. Regulación de la estabilidad de los filamentos de actina: a este nivel, las

proteínas ROCK actúan estabilizando el citoesqueleto de actina a través de la

activación de la proteína kinasa Lim (LIMK). LIMK actúa fosforilando e inactivando a la

proteína de unión a actina cofilina, la cual interfiere en la polimerización de los

filamentos de actina (Bernard, 2007).

b. Regulación de la actividad de la miosina: las proteínas ROCK inducen la

contractilidad del citoesqueleto de acto-miosina mediante la fosforilación directa bien

de la MLC2 (Amano et al, 1996), o bien de la subunidad diana de la fosfatasa de

miosina (MYPT, del inglés myosin phosphatase target subunit) (Essler et al, 1998), lo

cual da lugar a la inactivación de esta fosfatasa y, en consecuencia, a la

hiperfosforilación de MLC2. Este efecto se asocia con un incremento en la

permeabilidad paracelular similar al descrito para MLCK.

4.3. SEÑALIZACIÓN POR PI3K/AKT

Las proteínas fosfoinositol 3-kinasas (PI3K, del inglés phosphoinositide 3-kinases)

son enzimas que fosforilan el grupo hidroxilo de fosfoinositol (PI) en la posición 3,

convirtiéndolo de PI(4,5)P2 a PI(3,4,5)P3. Esto inicia una serie de eventos moleculares

que tienen como resultado la modulación de varios procesos esenciales como la

supervivencia y la proliferación celular, cuyo efector es la proteína AKT (en inglés v-akt

murine thymoma viral oncogene homolog 1) (Hawkins et al, 2006).

La presencia de PI(3,4,5)P3 provoca la translocación de AKT, una Ser/Thr kinasa,

a la membrana plasmática. AKT se activa por fosforilación en los residuos Ser473 y

Thr308 por las proteínas kinasas dependientes de PI (PDK1 y PDK2 del inglés 3-

phosphoinositide dependent protein kinase). AKT, a su vez, activa varios mediadores


incluyendo la kinasa glicógeno sintasa (GSK-3β, del inglés glycogen synthase kinase 3

beta), responsable de la degradación de β-catenina por la vía del proteasoma; y el

factor de transcripción snail, que inhibe la transcripción de E-caderina, ocludina y

claudinas. Por otra parte, PTEN (del inglés phosphatase and tensin homolog deleted

on chromosome 10) es una fosfatasa que antagoniza la vía de PI3K defosforilando

PI(3,4,5)P3. La activación de esta vía de señalización puede inducir efectos opuestos

sobre la modulación de la función barrera de las TJ, bien fortaleciéndola o bien

debilitándola, dependiendo de cuál sea el estímulo activador (González-Mariscal et al,

2008).

5. REGULACIÓN DE LA PERMEABILIDAD INTESTINAL

La barrera epitelial no es un elemento estático, al contrario, su función se

encuentra regulada por diversos estímulos fisiológicos, farmacológicos y patológicos.

Así, las TJ están sometidas a una reestructuración constante en respuesta a factores

dietéticos, señales humorales o neuronales, mediadores inflamatorios y una gran

variedad de vías de señalización celulares que incluso pueden ser usurpadas por

patógenos bacterianos o virales como estrategia para acceder a la mucosa intestinal

(Graham et al, 2009). Los cambios rápidos de permeabilidad suceden a través de la

contracción del citoesqueleto, inducida por la acción de la MLCK y por la endocitosis

de proteínas de las TJ (Shen & Turner, 2006; Utech et al, 2010); mientras que las

alteraciones de la permeabilidad más duraderas implican la regulación transcripcional

de las proteínas de las TJ, la apoptosis de las células epiteliales y la aparición de

alteraciones estructurales en el epitelio (Prasad et al, 2005; Schulzke et al, 2006).

La permeabilidad de la barrera epitelial difiere considerablemente dependiendo de

las características fisiológicas de cada epitelio (Anderson & van Itallie, 2009).

Concretamente, en el intestino, existe un cierto nivel de permeabilidad que permite el


paso de sustancias desde la luz intestinal al interior de la mucosa. Sin embargo, el

correcto funcionamiento del sistema inmunológico es capaz de prevenir los efectos

negativos de la presencia de patógenos en la luz intestinal. Por otra parte, en la

mucosa del intestino delgado, la capacidad de las TJ para discriminar y restringir el

paso de solutos en base a su tamaño, varía a lo largo del eje cripta-vellosidad. De

manera que, conforme avanzamos desde la base de las criptas hacia la punta de las

vellosidades, más expuestas al contenido luminal, el número y el tamaño de los poros

disminuye sensiblemente (desde 50-60 Ǻ hasta 4-7 Ǻ) (Fihn et al, 2000). Este

gradiente de tamaño es concordante con la función absortiva y secretora del

enterocito, de manera que la absorción tiene lugar en las vellosidades intestinales,

mientras que la secreción se produce en las criptas (Curran, 1972; Desjeaux, 1977).

Además, en condiciones fisiológicas, este gradiente en el tamaño de los poros es

concordante con el estado de maduración y diferenciación de los enterocitos a lo largo

del eje cripta-vellosidad y contribuye a la selectividad de la barrera epitelial.

En condiciones fisiológicas, la barrera epitelial tiene la capacidad de restablecerse

una vez ha cesado el estímulo inductor. Sin embargo, en ciertas condiciones

patológicas, esta capacidad de autorregulación se puede perder, lo cual contribuiría a

que el incremento en la permeabilidad se perpetuara en el tiempo, facilitando el paso

de antígenos a la mucosa intestinal, dando lugar, consecuentemente, a la inflamación

intestinal crónica. Este es el caso de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal

(EII), enfermedad celíaca y también se ha sugerido en pacientes de SII (Arrieta et al,

2006).

En el caso del SII, existen numerosas evidencias que muestran que las

alteraciones de la permeabilidad intestinal podrían desempeñar un papel fundamental

en la fisiopatología de la enfermedad. Diversos estudios funcionales in vivo, en los que

se mide la excreción en orina de diversas sustancias no metabolizables


(lactulosa/manitol, 51Cr-EDTA), han demostrado que los pacientes con SII-PI muestran

una permeabilidad intestinal aumentada en comparación con individuos sanos tanto en

el colon (Marshall et al, 2004) como en el intestino delgado (Spiller et al, 2000; Dunlop

et al, 2006). Este incremento es incluso mayor en pacientes con SII-D de origen no

post-infeccioso (Dunlop et al, 2006). Pese a que se ha demostrado que la

permeabilidad está alterada en toda la longitud del intestino, todos los estudios

dirigidos a desentrañar las bases moleculares de dicha alteración en el SII, se han

centrado en la mucosa del colon. Así, varios estudios in vitro con biopsias de colon de

pacientes con SII han demostrado que la disfunción de la barrera en estos pacientes

está asociada al aumento de la permeabilidad paracelular, a la disminución en la

expresión de proteínas integrantes de las TJ en la mucosa colónica, concretamente la

proteína adaptadora ZO-1 (Piche et al, 2009) y a la degradación de ocludina mediante

la vía del proteasoma (Coeffier et al, 2010). Es interesante destacar que este aumento

de la permeabilidad paracelular parece ser dependiente de la presencia del receptor

activado por proteasas PAR-2 (del inglés protease activated receptor 2) y de la

fosforilación de MLC2 (Gecse et al, 2008). Los mediadores responsables de este

efecto y su origen no han sido identificados, aunque los candidatos más plausibles son

las proteasas producidas y liberadas por la mucosa del intestino, en concreto la

triptasa liberada por los mastocitos y las proteasas derivadas de las bacterias

presentes en la luz intestinal (Jacob et al, 2005; Steck et al, 2009).

En la mucosa intestinal, las células del sistema inmunológico se encuentran en

estrecha conexión con las fibras nerviosas, lo cual propicia la comunicación

bidireccional entre el SNC, el SNE y el sistema inmunológico. Esta comunicación tiene

la misión de modular la permeabilidad intestinal, de manera que se favorezca el estado

de homeostasis en la mucosa. Dicha homeostasis puede verse alterada en respuesta

a diversos factores tal y como se detalla a continuación.


5.1. EL ESTRÉS PSICOLÓGICO Y LA REGULACIÓN DE LA PERMEABILIDAD INTESTINAL.

La respuesta del organismo al estrés comprende una compleja cadena de

procesos neuro-hormonales que comienzan con la liberación en el hipotálamo del

factor liberador de corticotropina (CRF, del inglés corticotropin releasing factor),

seguida de la liberación de glucocorticoides y catecolaminas, que, para ser efectivas,

requieren de la integridad funcional del eje hipotálamo-hipofisario-adrenal y del

sistema autonómico periférico. El objetivo de esta respuesta es el mantenimiento del

equilibrio funcional interno. En algunos casos, cuando la homeostasis se ve

amenazada de manera continuada o excesiva (sobreestrés), el organismo puede

generar respuestas anómalas que pueden dar lugar a diversos procesos de naturaleza

inflamatoria, como el SII. De hecho, estudios clínicos han observado que los pacientes

con SII presentan más eventos vitales estresantes y empeoran cuando son expuestos

a factores estresantes (Bhatia & Tandon, 2005; Guilarte, et al 2007; O’Malley et al,

2011). Además, frecuentemente los pacientes de SII presentan co-morbilidad con

trastornos psiquiátricos asociados al estrés, particularmente ansiedad y depresión

(Lydiard, 2001; Whitehead et al, 2002; Tanaka et al, 2011) y se ha asociado el estrés

traumático en la infancia a un mayor riesgo de desarrollo de esta enfermedad

(Bennett et al, 1998; Tanaka et al, 2011).

En el ámbito experimental, diversos estudios en modelos animales y en humanos,

han demostrado que el estrés psicológico crónico provoca cambios importantes en la

secreción de agua e iones y en la permeabilidad del epitelio intestinal (Santos et al,

1999; Alonso et al, 2008; Vicario et al, 2010). Estos cambios se asocian a signos

ultraestructurales de daño epitelial (Vicario et al, 2010) y están mediados, al menos en

parte, por la activación de los mastocitos de la mucosa (Santos et al, 1999; Vicario et

al, 2010), por la activación de vías neuronales colinérgicas y adrenérgicas y por CRF

(Santos et al, 1999). Además, el estrés experimental puede iniciar y reactivar la


inflamación de la mucosa y alterar la función epitelial (Qiu et al, 1999). Estas

alteraciones en la barrera intestinal podrían facilitar una penetración excesiva de

antígenos presentes en la luz intestinal a través del epitelio, con la consiguiente

activación del sistema inmunológico y el posterior desarrollo de la inflamación

intestinal.

5.2. CÉLULAS Y MEDIADORES DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO IMPLICADOS EN LA

REGULACIÓN DE LA PERMEABILIDAD INTESTINAL.

5.2.1. Mastocitos

Los mastocitos son granulocitos que se originan en la médula ósea, desde donde

migran a los tejidos para completar su maduración. Estas células son residentes

habituales de las mucosas del organismo y constituyen el 2-3% del total celular de la

lámina propria intestinal (Bischoff et al, 1996). Varios estudios han demostrado la

estrecha relación anatómica existente entre los mastocitos y las terminaciones

nerviosas de la mucosa intestinal (Park et al, 2003; Barbara et al, 2004). Esta

proximidad neuronal habilita la comunicación bidireccional entre el mastocito, el SNC y

el SNE, lo cual junto al incremento del número de mastocitos y sus mediadores,

observado en pacientes de SII, podría contribuir a la generación de los síntomas de

esta enfermedad (Guilarte et al, 2007; Barbara et al, 2004; Barbara et al, 2007).

Numerosos estudios han demostrado la implicación de los mastocitos en la

regulación de la función de barrera del intestino a través de la liberación de

mediadores específicos (Groschwitz et al, 2009; Groschwitz & Hogan, 2009; Keita &

Söderholm, 2010). Entre estos mediadores destacan particularmente el interferón

gamma (IFNγ), el TNFα y la proteasa específica de mastocitos triptasa (figura 8). La

capacidad de las citocinas, como el TNFα y el IFNγ, para regular la función de la

barrera epitelial fue descrita por primera vez hace 20 años. Desde entonces se han


identificado varios mecanismos para explicar dicha pérdida de función de la barrera,

tales como la degradación, el aumento de la transcripción y la endocitosis de proteínas

de TJ, la activación de kinasas y la modulación del citoesqueleto a través de la

activación de MLCK (Turner, 2009; Utech et al, 2010). Por otro lado, la triptasa

liberada tras la activación de los mastocitos influye directamente sobre la

permeabilidad intestinal a través de los receptores PAR-2 presentes en la membrana

apical y basolateral de las células epiteliales, pero también de forma indirecta a través

de los receptores PAR-2 de las terminaciones nerviosas entéricas y en los propios

mastocitos (Keita & Söderholm, 2010).

Además de liberar mediadores pro-inflamatorios, los mastocitos expresan en su

membrana receptores de CRF (subtipos CRF1 y CRF2) (Wallon et al, 2008) y liberan

hormonas relacionadas, como la urocortina (Kempuraj et al, 2004), por lo que su

activación sería consistente con la participación del eje neuro-celular del estrés en la

generación de las alteraciones fisiopatológicas del SII. De hecho, los cambios

morfológicos y funcionales del epitelio intestinal en respuesta al estrés o a mediadores

como la CRF son revertidos tras la inhibición farmacológica de los mastocitos (Santos

et al, 1999; Barreau et al, 2007) y están ausentes en animales deficientes en

mastocitos (Santos et al, 2001). Asimismo, estudios realizados en humanos también

indican un marcado aumento de la secreción y la permeabilidad intestinal y colónica en

respuesta a la exposición a un estrés experimental; cambios que se acompañan de la

activación del mastocito y de la liberación luminal de sus mediadores como triptasa e

histamina (Santos et al, 1998). La participación de los mastocitos en las alteraciones

epiteliales inducidas por el estrés se ha confirmado en estudios con humanos que

demuestran la regulación de la permeabilidad epitelial en biopsias de colon humano

mediante la activación de receptores específicos (CRF1 y CRF2) en los mastocitos y la


activación mastocitaria inducida por la CRF en pacientes con SII-D (Guilarte et al,

2004).

5.2.2. Eosinófilos.

Los eosinófilos son leucocitos polimorfonucleares de tipo granulocito que se

originan en la médula ósea donde completan su maduración antes de migrar a los

tejidos. Son células multifuncionales implicadas en la patogenia de numerosos

procesos inflamatorios, incluyendo infecciones, asma y enfermedades

gastrointestinales. Son células residentes a lo largo de todo el tubo digestivo, a

excepción de la mucosa del esófago, y se encuentran en mayor número en diversas

enfermedades digestivas como la gastroenteritis eosinofílica, la esofagitis eosinofílica y

la EII (Powel et al, 2010).

Al igual que los mastocitos, los eosinófilos son capaces de sintetizar y almacenar

en sus gránulos una gran cantidad de mediadores inflamatorios de naturaleza muy

diversa (proteínas catiónicas, factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas,

mediadores lipídicos y neuromoduladores) (Powel et al, 2010). Se ha descrito la

presencia de un mayor número de eosinófilos en la lámina propria del colon de

pacientes con SII (Park et al, 2008), aunque los resultados aún son controvertidos y no

se han relacionado aún con la fisiopatología de la enfermedad.

En cuanto a su participación en la modulación de la barrera epitelial, se ha descrito

la disminución de la resistencia transepitelial y la alteración de la permeabilidad en

estudios in vitro de co-cultivos de células epiteliales intestinales con eosinófilos o tras

la estimulación de las células epiteliales con la proteína principal del eosinófilo (MBP,

del inglés major basic protein). Esta alteración en la función de barrera se asocia a la

disminución de la expresión de ocludina (Groschwitz & Hogan, 2009) (figura 8).


5.1.3. Linfocitos T

Los linfocitos T son leucocitos que se originan en la médula ósea a partir de

progenitores linfoides inmaduros, desde donde migran hacia el timo, donde se produce

todo el proceso de maduración. Los linfocitos T maduros dejan el timo y alcanzan el

torrente sanguíneo, diseminándose por todo el organismo hasta alojarse en los tejidos

linfoides.

Varios estudios han mostrado un aumento en el número y en la activación de los

linfocitos T CD4+ en el colon de pacientes con SII (Spiller et al, 2000; Chadwick et al,

2002; Cremon et al, 2009), los cuales participan en la alteración de la permeabilidad

paracelular del epitelio intestinal mediante la liberación de interleucinas y citocinas pro-

inflamatorias como el TNFα y el IFNγ (figura 8). Por un lado, TNFα e IFNγ estimulan la

actividad de MLCK lo cual conduce a un incremento en la fosforilación de MLC2 y la

consiguiente contracción del citoesqueleto (Clayburgh et al, 2005; Wang et al, 2005).

Por otra parte, el IFNγ provoca la redistribución de proteínas de las TJ ocludina,

claudina-1 y claudina-4 mediante macropinocitosis (Bruewer et al, 2005).

Alternativamente, ambas citocinas comprometen la estabilidad de las TJ e inducen un

incremento de la permeabilidad intestinal mediante la regulación de la expresión de

ocludina. Por otro lado, las interleucinas 4 y 13 (IL-4, IL-13) provocan un aumento de la

permeabilidad intestinal mediante la inducción de apoptosis epitelial y la regulación de

la expresión de claudina-2 (Wisner et al, 2008; Weber et al, 2010).

Por otra parte, los linfocitos intraepiteliales o gamma/delta (IEL, γδ+) también están

implicados en la modulación de la función de barrera intestinal en respuesta a

parasitosis entérica. La importancia de esta población celular en el mantenimiento de

la integridad epitelial, se ha demostrado en estudios con ratones deficientes en IEL.

Estos ratones presentan una deslocalización de claudina-3, ocludina y ZO-1; una


disminución de la fosforilación de ocludina y formación anómala de TJ en el epitelio

(Groschwitz & Hogan, 2009) (figura 8).

Figura 8. Regulación de la función de barrera del intestino por estímulos inmunológicos. Los linfocitos T, a

través de la liberación de mediadores pro-inflamatorios como TNFα y IFNγ, estimulan la fosforilación de MLC2 y la

consiguiente contracción del citoesqueleto. Por otra parte, IFNγ provoca la redistribución de varias proteínas de las TJ.

Los linfocitos intraepiteliales (IEL) participan, mediante un mecanismo no descrito, en la modulación de la fosforilación

en serina de la ocludina. Los mediadores mastocitarios, incluyendo TNFα, proteasas como la triptasa, histamina y

prostaglandinas aumentan la conductancia a iones Cl- incrementando así la permeabilidad intestinal. Las proteasas del

mastocito, además, pueden participar en la degradación de la ocludina con la consiguiente alteración de la función de

barrera. Por último, la MBP derivada de los eosinófilos provoca la reducción en la expresión de ocludina en células

epiteliales de colon. (Reproducido de Groschwitz & Hogan, 2009).

CCAAPPÍÍTTUULLOO II

CAPÍTULO I - 47 -

CAPÍTULO I

6. THE JEJUNUM OF DIARRHEA-PREDOMINANT IRRITABLE BOWEL

SYNDROME SHOWS MOLECULAR ALTERATIONS IN THE TIGHT JUNCTION

SIGNALING PATHWAY THAT ARE ASSOCIATED WITH MUCOSAL

PATHOBIOLOGY AND CLINICAL MANIFESTATIONS.

Authors: Cristina Martínez1, María Vicario1, Laura Ramos1, Beatriz Lobo1, Jose Luis

Mosquera2, Carmen Alonso1, Alex Sánchez2,6, Mar Guilarte1,3, María Antolín1, Inés de

Torres4, Ana M. González-Castro1, Marc Pigrau1, Esteban Saperas1, Fernando

Azpiroz1,5, Javier Santos1,5.

1Digestive System Research Unit and 2Statistics and Bioinformatics Unit, Institut de

Recerca Vall d’Hebron; Departments of 1Gastroenterology, 3Allergy, and 4Pathology,

Hospital Universitari Vall d’Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona,

Spain. 5Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y

Digestivas (Ciberehd). 6Statistics Department, Facultad de Biología, Universidad de

Barcelona, Barcelona, Spain.

Grant Support: Supported in part by the Fondo de Investigación Sanitaria and

CIBERehd, Instituto Carlos III, Subdirección General de Investigación Sanitaria,

Ministerio de Ciencia e Innovación (CM05/00055, LR; CP10/00502, MV; CM08/00229,

BL; CM04/00019, CA; MTM2008-00642, AS; CM10/00155, MP; PI05/1423,

EC07/90148, PI/080940 & CB06/04/0021, JS; CB06/04/0021, FA), Agència de Gestió

d’Ajuts Universitaris i de Recerca, Generalitat de Catalunya (2009 SGR 219, to FA &

JS); the International Foundation for Functional Gastrointestinal Disorders (2008 IFFGD

to JS) and the 2010 Rome Foundation Award (to JS).

- 48 - CAPÍTULO I

6.1. INTRODUCTION

There is convincing epidemiological evidence to support the connection between

psychosocial determinants1-3 and gastrointestinal infections4 and the onset,

persistence, and severity of IBS manifestations, although a pathophysiological hallmark

has not been elucidated. Our general hypothesis is that a leading event in such

connection is the breakdown of intestinal epithelial barrier’s surveillance. This is

inferred from converging observations describing abnormal intestinal permeability in

IBS subpopulations5-8 related to the onset and severity of visceral hypersensitivity and

bowel habit6,9,10. Barrier dysfunction might facilitate unfettered penetration of food and

bacterial antigens to stimulate disruptive immunological responses favoring the

development of mucosal inflammation11,12. Interestingly, both stress and infections

display significant ability to disturb the mucosal barrier and to initiate and reactivate

mucosal inflammation in animal models and humans9,10,13-15. Additional support to this

hypothesis comes from several reports showing the presence of low-grade

inflammation and immune activation as a frequent, yet not universal16,17, pathological

hallmark in the intestinal mucosa of certain IBS subgroups18,19. This pathobiological

substrate is dominated by activated mast cells (MCs) in both the small bowel and the

colon20-22. Upon activation, MCs release multiple potent biological mediators, some of

which have been involved in the regulation of the intestinal barrier function and in the

generation of gastrointestinal motor abnormalities and visceral pain in IBS16,23,24.

Although clinical studies have shown that increased intestinal permeability occur along

the whole intestine, studies aimed at unraveling the molecular underpinnings of this

abnormality in IBS are focused on the large bowel. In this sense, recent reports have

shown that barrier dysfunction in IBS is linked to the down-regulation of the tight

junction (TJ) scaffolding protein zonula occludens 1 (ZO-1)9 and to the degradation of

the TJ structural protein occludin by the proteasome in the colonic mucosa10.

CAPÍTULO I - 49 -

Luckily, the intense efforts to unravel the mechanistic basis of IBS pathogenesis

may be experiencing a giant leap forward with the incorporation of innovative and

powerful tools, such as microarray analysis, into biomedical research. Indeed, recent

genomic studies of colonic biopsies of IBS describe significant changes in the

expression and secretion of selected pro-inflammatory cytokines and the impairment of

mucosal immune response to microbial pathogens25,26. To elucidate differential

pathways operating in IBS we applied a new strategy consisting of transcriptomic

profiling in the jejunal mucosa combined with canonical signaling pathway analysis and

regulatory network identification. Since TJ signaling and mast cell biology emerge as

the most altered pathways linked to the transcriptomic signature of IBS-D, we further

studied the expression of TJ proteins and mast cell activation and its relation to clinical

symptoms in this disorder.

6.2. METHODS (see also supplementary methods section in page 149)

6.2.1. Participants

Newly diagnosed IBS-D patients meeting the Rome II criteria27 and H volunteers,

aged ≥18 or ≤60 years, were prospectively recruited from the gastroenterology unit and

by public advertising, respectively. Additionally, all IBS patients were experiencing daily

watery or mushy stools at inclusion. A complete medical history and physical

examination were carried out. Food allergy was excluded using a battery of skin prick

tests (Leti) for 32 common food allergens in all candidates. Reasonable exclusion of

past episodes of infectious gastroenteritis and gastrointestinal comorbidities was

achieved by means of a broad biochemical and serological profile including anti-

transglutaminase antibodies, upper and lower fiberoptic and small bowel capsule

endoscopy, abdominal sonography and barium studies, when considered pertinent.

The study protocol was approved by the Ethics Committee at Hospital Vall d´Hebron

(PR(AG)76/2006). Written informed consent was obtained from each participant.

- 50 - CAPÍTULO I

6.2.2. Clinical Assessment

The following parameters were recorded in all participants for the last 10 days prior

to the biopsy:

a) Background stress by the Modified Social Readjustment Scale of Holmes-

Rahe28.

b) The severity of abdominal pain by a 100-point visual analogue scale.

c) The frequency of abdominal pain (number of days with pain).

d) The stool frequency (maximum number of bowel movements).

e) The stool consistency by the Bristol scale29.

6.2.3. Biological evaluation

Jejunal biopsy

A single mucosal biopsy per participant was obtained from the proximal jejunum, 5-

10 cm distal to the Treitz’s angle, using a Watson’s capsule. Tissue samples were

immediately split into two similar pieces with a sterile scalpel. One fragment was fixed

in formalin and embedded in paraffin for further microscopic examination. The

remaining fragment was placed in RNAse free tubes containing 500 μL of RNA Later

Solution (Ambion) and stored at -80ºC until processed for RNA isolation.

Histology and Immunohistochemistry

Tissue sections were processed for routine hematoxylin & eosin following general

procedures to assess epithelial morphology and eosinophilic infiltration. In addition, the

number of MCs and IELs was determined at x 400 magnification using anti-human c-kit

(CD117) and CD3 antibodies (Dako), as previously described21. Specimens were

blindly examined by one experienced pathologist.

CAPÍTULO I - 51 -

Immunofluorescence

Sections were blocked with Blocking Solution (Dako) for 10 minutes followed by 60

minutes room temperature incubation in mouse anti-human ZO-1 and ZO-2 monoclonal

antibodies (Invitrogen) or rabbit anti-human ZO-3 monoclonal antibody (Cell Signaling

Technologies). Secondary antibodies were Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG and

488 goat anti-mouse IgG (Molecular Probes). Nuclei were counterstained with 4',6-

diamidino-2-phenylindole (DAPI) before mounting in Prolong antifade reagent

(Molecular Probes). Negative control slides were set by exposing the serial sections

under similar conditions but without the primary antibody. Images were acquired with a

laser scanning confocal microscope (FV-10) and quantification of TJ protein expression

was performed in a blinded manner measuring the average of fluorescence intensity in

10 non-overlapping fields per subject using the FV-10-ASW Olympus software.

Microarray analysis

Five jejunal biopsy samples per group were randomly selected for this analysis

aimed at identifying genes showing consistent differential expression between groups.

See the supplementary methods section for a detailed protocol. The complete dataset

is available at the NCBI Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo;

accession number GSE14841).

Quantitative Real Time PCR

Amplification of cDNA was used to further validate microarray results and to assess

ZO-1, ZO-2 and ZO-3 gene expression. cDNA synthesis was performed using 1 μg of

total RNA with the High Capacity Reverse Transcription Reagents Kit (Applied

Biosystems). Q-RT-PCR was performed on an ABI PRISM® 7500 FAST Sequence

Detection System (Applied Biosystems) using validated TaqMan Gene Expression

Assays (GEA), and the human 18S subunit ribosomal RNA gene as the endogenous

control (supplementary table 1) (Applied Biosystems). Each sample, including distilled

- 52 - CAPÍTULO I

water as negative control, was run in triplicate and data were analyzed by the 2-ΔΔCt

method, as previously described30. The expression of each gene was normalized to the

endogenous control and the fold-change was calculated individually respect to the

average of the H group.

6.2.4. Statistical analysis

Two-tailed parametric or nonparametric tests were used when appropriate

(unpaired Student’s t-test, Mann-Whitney U test) using GraphPad Prism 5.0 software.

Relationships between clinical variables and gene expression were assessed by

Spearman’s rho correlation. Randomization of patients (microarray study) and genes

(validation of microarray data) were performed using a standard random number

generator (a linear congruential generator was used to generate uniform random

values, followed by a transformation to obtain integer values in a set with the same size

as the number of patients/genes). Data are expressed as mean ± standard deviation

(SD), unless otherwise stated; P-values of < 0.05 were considered significant. To

control errors derived from multiple simultaneous testing, P-values were adjusted to

obtain strong control over the “false discovery rate” (FDR).

6.2.5. Pathway Analysis

To highlight relevant biological pathways implicating those genes differentially

expressed, we applied IPA methodology (IPA Software 7.0, Ingenuity® Systems,

www.ingenuity.com). IPA integrates selected genomic data sets with mining techniques

to predict functional linkages and their interpretation in the context of protein networks

that comprise protein-protein interactions and related biological functions and canonical

signaling pathways. The list of genes was overlaid onto a global molecular network

developed from information contained in the IPA knowledge base. Focus genes were

defined as those with a mean fold-change of ≤0.7 and ≥1.4, compared to H individuals.

Detailed explanation of IPA methods is included in the supplementary methods section.

CAPÍTULO I - 53 -

Table 1. Clinical and demographic characteristics of participants.

Stool consistency: 1 (hard) to 7 (entirely liquid). Holmes-Rahe scale: 0-150, low stress; 151-300, moderate stress;

>300 severe stress.

Note: IBS-D, diarrhea-predominant irritable bowel syndrome; H, healthy; F, female; M, male; NA, non-applicable.

Other exclusion criteria: active smoking, major psychiatric and organic diseases, those having taken any drug,

pharmaceutical compound, or herb in the last 2 weeks, those having taken steroids, anti-allergic or immunosuppressive

and related drugs in the last 3 months, and those having received radiotherapy or chemotherapy in the last 6 months.

- 54 - CAPÍTULO I

6.3. RESULTS

6.3.1. Study population

Twenty-three H volunteers and twenty-five IBS-D patients were included in the

study. Study groups were similar in age (H, 31.4 [95% CI: 27.8-34.9]; IBS-D, 35.2 [95%

CI: 31.0-39.5] years); P=0.16) (table 1). In IBS-D, the severity of abdominal pain was

52.8/100 (SD 22.3; 95% CI 43.6 to 62.0), the frequency of abdominal pain was 5.3/10

days (SD 2.9; 95% CI 4.1 to 6.5), and the stool consistency was 5.3 (SD 0.9; 95% CI

5.0 to 5.7). H volunteers had low stress levels while IBS-D patients showed higher yet

moderate stress levels in the last year (H: 85.0 [25-75% percentile: 64.0-152.0]; IBS-D:

157.0 [25-75% percentile: 117.5-278.5]; P=0.0006).

6.3.2. The jejunum of IBS-D shows hyperplasia of mucosal MCs

All biopsies disclosed normal epithelial architecture, no increase in eosinophil

counts, and no parasites, microbial or viral inclusions. Confirming previous findings21,

patients showed a marked increased in MCs (CD117+) counts (IBS-D: 25.8 (SD 8.8;

95% CI 22.1-29.4); H: 18.1 (SD 10.3; 95% CI 13.7-22.5) MCs/hpf; P=0.008). No

significant differences were found in the number of CD3+ cells between both groups

(IBS-D: 24.8 (SD 16.9; 95% CI 17.9-31.8); H: 17.8 (SD 5.4; 95% CI 15.6-20.3); P=0.06)

(supplementary table 2).

6.3.3. The jejunal mucosa of IBS-D shows a distinctive transcriptional profile

linked to alterations in intestinal permeability, MC function and TJ signaling

Analysis of microarray data revealed 286 genes as differentially expressed in IBS-D

compared to H (FDR-adjusted P-value<0.05) (supplementary table 3). Not surprisingly,

the analysis disclosed predominant low to moderate expression fold-changes (range:

0.3-2.8; figure 1A). Hierarchical clustering of the individual signal intensities uncovered

a high similarity of transcript expression patterns among IBS-D (figure 1A). Validity of

our microarray analysis is supported by significant and consistent expression

CAPÍTULO I - 55 -

differences (in the same direction, up or down) between groups as shown by Q-RT-

PCR analysis (supplementary figure 1) of a selection of 14 randomly selected genes.

To define how individual genes interact to have a coordinated role in specific

biological functions and signaling pathways we identified the potential networks of the

IBS-D transcriptomic profile. Seventeen significant biological networks were identified

by IPA (supplementary table 4). Further analysis of the highest scored network (score

44, 26 focus genes) identified intestinal permeability (P<0.01), the apoptosis of

leukocytes and MCs (P<0.01) and immunological disorder (P<0.05), as the most

significant biological functions, and phosphatase and tensin homologue deleted on

chromosome ten (PTEN) (P<0.001) and TJ signaling (P<0.001), as the main canonical

signaling pathways linked to this network (figure 1B).

In order to confirm the altered expression of genes related to the functions and

pathways identified in this network, Q-RT-PCR analysis was performed in a larger IBS-

D population (figure 1C). Assessment of genes related to MCs-dependent alterations in

intestinal permeability, disclosed consistent up-regulation of tryptase (TPSAB1/TPSB2)

in IBS-D patients (P<0.001), yet no change in proteinase activated receptor 2 (PAR-2)

expression. In addition, genes related to apoptosis and survival of MCs, including

forkhead box O3 transcription factor (FOXO3), myeloid cell leukemia-1 (MCL-1), and

stem cell factor (SCF) were down-regulated in IBS-D tissue samples (P<0.001 for all).

Although we failed to confirm up-regulation of the pro-apoptotic factor CASP10, we

indeed found over-expression of TRAIL (P<0.01) and TRAIL-R1 (P<0.05), known target

molecules in CASP10-mediated apoptosis signaling cascade. Moreover, we validated

the significant reduction in PTEN expression in IBS-D, which may also link FOXO3 to

MCs survival.

- 56 - CAPÍTULO I

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CAPÍTULO I - 57 -

- 58 - CAPÍTULO I

Figure 1. Transcriptional signature of IBS-D patients and IPA functional analysis (cont).

B. Relationships between differentially expressed genes in the highest scored network and related Canonical

Pathways (CP) and Biological Functions (Fx). The list of differentially expressed genes in IBS-D, compared to

healthy, linked to their approved nomenclature (http://www.genenames.org), and fold-change was uploaded into the IPA

application. Node (gene) and edge (gene relationship) symbols are described in the figure. The intensity of the node

color indicates the degree of up-(red) or down-(green) regulation. Genes in uncolored nodes were not identified as

differentially expressed in our study and were integrated into the computationally generated networks on the basis of the

evidence stored in the IPA knowledge memory indicating relevance for this network. The network score is based on the

hypergeometric distribution and is calculated with the right-tailed Fisher’s Exact Test. The score is the negative Log of

this P-value (P-score=-log10 (P-value)). C. Q-RT-PCR validation of microarray data of genes related to functions

and pathways from Network 1. Expression of genes involved in apoptosis of leukocytes and mucosal mast cells

(MCL1, FOXO3 and SCF), intestinal permeability (PAR-2 and tryptase) and PTEN signaling. Level of expression of

selected genes was measured in 12 H volunteers and 17 IBS-D patients. To obtain the fold-change value for each

sample the target gene/18S mRNA ratio was calculated for each sample and then normalized to the average of the H

group. Groups were compared using the parametric unpaired t-test and P-values are indicated.

Note: F2RL1, coagulation factor II (thrombin) receptor-like 1, also known as PAR2, protease-activated receptor 2.

CAPÍTULO I - 59 -

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- 60 - CAPÍTULO I

IPA analysis also identified a number of new canonical signaling pathways key for

intestinal homeostasis as playing an important role in IBS-D (supplementary table 5).

Interestingly, caveolar-mediated endocytosis, TJ signaling, and PTEN signaling,

appeared as the most significant in IBS-D (table 2).

6.3.4. The altered expression of TJ-related proteins correlates with mucosal MC

activation and bowel dysfunction in IBS-D

As TJ signaling is one of the most significant pathways highlighted by IPA analysis,

we next studied TJ protein expression. IBS-D samples showed differential mRNA

expression of several proteins belonging to the TJ (figure 2A), including tight junction

protein (TJP)-1 and 2 (also known as zonula occludens (ZO)-1 and 2) which, together

with ZO-3, are responsible for connecting the integral transmembrane proteins of the

intercellular junctions to the cytoskeleton31.

In order to further assess TJ dysregulation, we measured the expression and

protein distribution of ZO proteins in a larger set of participants. Q-RT-PCR analysis

demonstrated a significant down-regulation of ZO-1 and ZO-3 mRNA in IBS-D patients

(P<0.01 for both), while ZO-2 remained unchanged (figure 2B).

At the protein level, IBS-D showed reduced staining for both, ZO-1 (H: 128 ± 28 vs.

IBS-D: 45 ± 20 arbitrary units; P<0.0001) and ZO-2 (H: 423 ± 156 vs. IBS-D: 281 ± 149

arbitrary units; P<0.05), and no change in ZO-3 staining (figure 2C). Moreover, we

observed a marked labeling of the intracellular compartment in IBS-D samples,

suggesting intensive internalization of this protein, as opposed to H where ZO-1 was

restricted to the surface of epithelial cells (figure 2C).

CAPÍTULO I - 61 -

- 62 - CAPÍTULO I

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IBS-D

Healthy

Figure 2. Assessment of TJ signaling pathway in the jejunal mucosa of IBS-D patients.

A. Microarray analysis of TJ signaling-related genes in the jejunal mucosa of IBS-D and H

subjects. Affymetrix accession number of genes and their fold change expression in IBS-D with respect to H are

indicated. P-values were adjusted to obtain strong control over the “false discovery rate” (FDR) using the Benjamini and

Hochberg method. B. qRT-PCR validation of genes related to TJ signaling pathway. Expression of genes involved

in connecting the integral transmembrane proteins of the TJ to the cytoskeleton (ZO-1, ZO-2 and ZO-3). Level of

expression of selected genes was measured in 12 H volunteers and 17 IBS-D patients. To obtain the fold-change value

for each sample the target gene/18S mRNA ratio was calculated for each sample and then normalized to the average of

the H group. Groups were compared using the parametric unpaired t-test and P-values are indicated. C. Detection of

ZO proteins in the jejunal epithelium by laser scanning confocal microscopy. Representative micrographs of the

jejunal epithelium of 16 IBS-D and 16 H samples where zonula occludens (ZO)-1 (green), ZO-2 (green) and ZO-3 (red)

are identified (high-power field, x400). Nuclear labeling of 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blue) is also shown for

reference. Inserts show magnified localization of ZO proteins.

CAPÍTULO I - 63 -

The expression of ZO proteins significantly correlated with tryptase and SCF, which

are indicative of mast cell activation and proliferation, respectively (table 3). Bowel

frequency and stool consistency correlated with both numbers (CD117+) and activation

of MCs (tryptase mRNA expression), and with the expression of ZO proteins (table 4).

Table 3. Correlation between MC-related variables and ZO expression in the jejunal mucosa of IBS-D

patients (n=17) and H volunteers (n=12).

Note: A FDR <15% was accepted as significant.

Table 4. Correlation between clinical parameters and MC-related variables and ZO expression in the jejunal

mucosa of IBS-D patients (n=17) and H volunteers (n=12).

Note: For correlations of abdominal pain intensity and frequency, only IBS-D participants were evaluated, as H

subjects do not have pain by definition. A FDR <15% was accepted as significant.

- 64 - CAPÍTULO I

6.3.5. Integrative multivariate analysis of clinical and biological data

differentiates between IBS-D and healthy populations

To get insights on the biological relevance of our findings and to discover

association between different groups of variables, MFA was performed using all

differentially expressed probe sets plus ECH variables. In this analysis, each graph

was built with the two first components of the PCA, showing that the first component

explains an extraordinary high proportion, 74.14%, of the total variability of the data.

For the correlation circle, only genes with a correlation value >0.8 over the first

component were plotted (supplementary table 6) revealing two well-identified gene

patterns (figure 3A). Over-expressed genes in IBS-D (left side) linked to the vast

majority of quantitative ECH parameters, being the intensity of abdominal pain the most

relevant variable (the longest arrow, meaning the higher correlation), whereas under-

expressed genes (right side) did not correlate with any of the ECH variables studied.

Furthermore, individual factor maps for frequency of abdominal pain, bowel movements

and Bristol stool scale showed two distinctive clusters over the first dimension: H (4

individuals) and IBS-D (5 individuals) (figure 3B).

Overall, in the MFA, the ECH variables together with the differentially expressed

genes completely discriminates the H and IBS-D groups, confirming that there is a

consistent pathophysiological process related to the transcriptomic profile underlying

the IBS-D entity.

CAPÍTULO I - 65 -

Figure 3. Integrative multivariate analysis and clustering of participants based on gene expression and ECH

variables.

A. PCA for variables in Healthy vs. IBS-D. Quantitative ECH variables are represented by colored arrows and gene

expression are represented by black arrows. Proximity of arrow-heads to 1.0 indicates better projection. Only genes with

a correlation value ≥0.8 are represented. On the left side, genes over-expressed in IBS-D are linked to most of the

quantitative ECH variables. On the contrary, only one variable (Holmes-Rahe) appear on the right side where under-

expressed genes are plotted.

- 66 - CAPÍTULO I

B.

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CAPÍTULO I - 67 -

6.4. DISCUSSION

We provide the first evidence of the alteration of TJ signaling in the jejunal mucosa

of IBS-D patients and its relation to mast cell activation and to the clinical outcome of

these patients. Conjointly, these findings come to challenge the classical view of IBS as

a model functional disorder while reinforce its organic parentage, which extends

beyond the colon to affect also the small bowel.

The integrative analysis of our data illustrates relevant issues related to the nature

and the mechanistic understanding of IBS-D: 1) The jejunum of IBS-D patients displays

a distinctive gene transcriptional profile; 2) Intestinal permeability, MC biology and TJ

signaling emerge as distinctive biological functions in IBS-D; and 3) There is a

consistent pathophysiological process linking clinical outcome and transcriptomic

signature in IBS-D.

Altered intestinal permeability has been described as a key feature of IBS5,6,7,8,

being more pronounced in IBS-D patients than in other subgroups of IBS5. Importantly,

our study identified the TJ signaling as one of the most significant pathways. Of

particular clinical interest to IBS-D is the down-regulation of ZO-1, given its ability to

modulate paracelular permeability, and its correlation with enhanced intestinal

permeability and abdominal pain severity in the colon of IBS6,9. In our study, both Q-

RT-PCR and confocal microscopy confirmed the down-regulation of ZO-1 in the

jejunum of IBS-D. In addition, we found ZO-1 redistribution from the apical membrane

of the enterocytes to the cytoplasm only in IBS-D samples. The same effect on ZO-1

localization has been found in mouse colonocytes added with fecal supernatants from

IBS-D32. Besides protein down-regulation, structural and functional modulation of

barrier function can be also achieved by endocytosis of TJ proteins by a mechanism

that depends on the stimulus involved33. Pro-inflammatory factors such as tumor

necrosis factor (TNF) and bacterial products have been shown to induce the

- 68 - CAPÍTULO I

internalization of ZO-1 and occludin by caveolar-mediated endocytosis34,35 together

with a concomitant loss of barrier function. Notably, caveolar-mediated endocytosis is

identified in our study as the most significant signaling pathway associated with the

transcriptional signature of IBS-D. Taken together, these results suggest that ZO-1

down-regulation and redistribution may help to explain the increased intestinal

permeability observed in IBS-D, although further studies are needed to define the

mechanism and functional consequences of this alteration.

Interestingly, the down-regulation of ZO proteins negatively correlated with

activation of mast cells and bowel dysfunction in these patients. Given that tryptase has

been shown to trigger redistribution of ZO-1 increasing paracelular permeability in

colonocytes36, it can be speculated that the clinical outcome of IBS-D may rely on

distinctive mast cell-related impairment of jejunal TJ biology. This mechanism may be

of critical importance in the control of inflammation in the intestine. However, additional

studies are needed in order to define its role in the pathophysiology of IBS-D.

Remarkably, regulation of intestinal permeability through PAR-2 is highlighted in

the main network of our study. Activation of PAR by endogenous or microbial-derived

proteases has been implicated in the modulation of gastrointestinal physiology,

including epithelial permeability, enteric neurotransmission, secretion, motility,

inflammation and visceral sensitivity37. Interestingly, fecal samples, colonic explants

and supernatants from IBS patients show higher proteolytic activity than healthy

controls16,32. Moreover, colonic supernatants from IBS activate human submucosal

neurons23, increase the paracelular permeability in mice16,32 and Caco-2 cells9 and

evoke visceral hyperalgesia and allodynia in mice, through PAR-2-mediated

mechanisms16. A good candidate to mediate these PAR-2-linked responses is the mast

cell tryptase, since it is increased in IBS16,21,23, and has been shown to enhance

paracelular permeability36,38 and to induce hyperalgesia23. Our study demonstrated

CAPÍTULO I - 69 -

increased jejunal tryptase expression in IBS-D, as previously shown in the colon16.

Notably, the positive correlation between tryptase and bowel dysfunction deserves

special attention in upcoming investigations.

Cell death, particularly by apoptosis, is also a relevant function highlighted in our

study. The jejunal mucosa of IBS-D showed several alterations in genes belonging to

the apoptotic pathway of leukocytes and MCs. Interestingly, we found that three key

intertwined anti-apoptotic molecules, SCF, FOXO3, and MCL1, were significantly

down-regulated in these patients. Of note, SCF is a central modulator of the biology of

human MCs in peripheral tissues acting via multiple mechanisms39, including the

induction of MCL140 and the prevention of growth factor withdrawal-mediated apoptosis

via the inactivation of FOXO341. Conversely, we also observed the differential over-

expression of several promoters of human MCs apoptosis in IBS-D, namely TRAIL,

and TRAIL-R142. Moreover, PTEN expression was decreased in IBS-D. PTEN

signaling is also involved in MCs homeostasis and function, acting at crucial steps on

phosphoinositide 3-kinase-mediated pathways43. Overall, our data support that IBS-D

pathophysiology is partially determined by the mucosal imbalance of factors controlling

survival, proliferation, and activation of human MCs. MCs deregulation may possibly

dampen the natural resolution of mucosal inflammation, hence acting as a critical

driving factor for persisting inflammation. Furthermore, based on the specific inverse

correlation observed between SCF expression and bowel dysfunction, it is tempting to

speculate that the above alterations may also relate to clinical manifestations of IBS-D,

though additional studies are needed to clarify this issue.

Interpreting the functional consequences in microarray screening is one of the

major goals of this exploratory technique. In order to achieve this, IBS-D gene profile

was further analyzed with the IPA software, which integrates all biological knowledge

extracted from the recent scientific literature. Our microarray gene analysis yielded a

- 70 - CAPÍTULO I

list of 286 differentially expressed genes in IBS-D. Other gene expression studies

performed in the colon yielded a list of 20 to 33 genes25,26, disparities that may respond

to heterogeneous IBS populations, to variations between gut segments (i.e. the

different antigenic load to which jejunal and colonic mucosa are exposed), and to the

larger size and deeper penetration of suction vs. endoscopic biopsies. Despite this

difference, we obtained consistent and discrete differences in gene expression (<2-fold

in 86.5% of the genes), similar to previous studies25,26. This apparently subtle change in

gene expression is indeed concordant with the low-grade inflammatory nature of IBS-

D19,22,44-46, only reflected in our study by the increase in MC counts.

Finally, the integrative multivariate analysis separates the H group and IBS-D

patients into two well-defined clusters according to both gene expression profiles and

clinical variables. It would be not surprising to note that patients and H volunteers are

clustered depending on the clinical variables, as IBS is currently diagnosed only by

clinical criteria, but the relevance of this study is that this clustering is supported by the

differential transcriptomic profile of both groups of participants.

We acknowledge that the relatively small size of participants and the reduced

number of samples examined for microarray profiling is a potential weakness of the

study. However, this limitation is well compensated by the highly homogeneous group

population studied and by the consistency of reported differences. Moreover, the

validation of the data by Q-RT-PCR and further assessment of alterations in TJ

signaling at both mRNA and protein level in a higher number of patients also reinforce

the reported results. Anyhow, some caution is advised when interpreting the

translational relevance of our results to the clinical practice, waiting for own and

independent reassessment in a larger population of patients.

In conclusion, this study adds a few glimpses of the complex network of

interactions regulating the inflammatory response in the intestine of IBS-D and allows

CAPÍTULO I - 71 -

us to generate some new intriguing hypothesis to be tested in future research in the

fields of mast cell biology and regulation of paracelular permeability. Although much

remains to be learned, the integration of computational and high-throughput genomic

resources may help to develop strategies aimed at providing disease biomarkers and

uncover additional targets for therapeutic intervention in those affected by IBS.

- 72 - CAPÍTULO I

6.5. REFERENCES

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CCAAPPÍÍTTUULLOO IIII

CAPÍTULO II - 77 -

CAPÍTULO II

7. TRANSCRIPTIONAL AND PROTEOMIC PROFILING OF THE INTESTINAL MUCOSA OF DIARRHEA-IBS PATIENTS REVEALS SIMILAR BIOLOGICAL PATHWAYS AS DIFFERENTIALLY ACTIVE COMPARED TO HEALTHY SUBJECTS

Authors: Cristina Martínez1, María Vicario1,3, Laura Ramos1, Beatriz Lobo1, Carmen

Alonso1, Ana M. González-Castro1, Marc Pigrau1, Mar Guilarte1,2, María Antolín1,

Fernando Azpiroz1,3, Javier Santos1,3.

1Digestive System Research Unit, Institut de Recerca Vall d’Hebron; Department of

1Gastroenterology, 2Allergy Section, Hospital Universitari Vall d’Hebron, Universitat

Autònoma de Barcelona, Barcelona, Spain. 3Centro de Investigación Biomédica en

Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (Ciberehd).


Ciberehd, Instituto Carlos III, Subdirección General de Investigación Sanitaria, Ministerio

de Ciencia e Innovación; and the International Foundation for Functional

Gastrointestinal Disorders (IFFGD). C. Alonso (CM04/00019), L Ramos (CM05/00055),

M. Vicario (CP10/00502), and J. Santos (PI05/1423; PI/080940; EC07/90148, 2008

IFFGD Research Grant Award) were the recipients of these grants.

- 78 - CAPÍTULO II

7.1. INTRODUCTION

Irritable bowel syndrome (IBS) is the most common functional disorder diagnosed

by gastroenterologists, affecting 10-25% of people worldwide1,2. Its heterogeneous

clinical manifestations, coupled with our incomplete understanding on their

etiopathogenesis, explains the current lack of effective therapeutic tools and the

progressive burden on healthcare systems1,2. Such limitations have promoted research

initiatives aimed at deciphering the mechanisms involved in IBS origin. As a

consequence, recent findings reveal that a prominent feature in the intestine of certain

IBS subgroups, the presence of mucosal inflammation and immune activation, may be

linked to IBS symptoms3,5, challenging the traditional assumption of its strict non-

organic nature.

A consistent approach to improve our current knowledge on the molecular

mechanisms underlying IBS pathogenesis is the comprehensive analysis of the real

endpoints of physiological regulatory processes, the proteins, and by extension gene

expression. Therefore, transcriptomics stands as an innovative tool in the field of

gastroenterology offering a valuable aid to identify disease and prognostic biomarkers

which could be implemented in the clinical strategies of stress-related digestive

disorders. In this sense, recent data from our laboratory showed differential changes in

the gene expression profile of the jejunal mucosa of IBS-D patients linked to increased

mucosal tryptase mRNA expression and alterations in the expression and distribution

of proteins belonging to the TJ signaling pathway6. Accordingly, recent reports have

shown that barrier dysfunction in the colonic mucosa of IBS is linked to the down-

regulation of the TJ scaffolding protein zonula occludens 1 (ZO-1)7 and to the

degradation of the TJ structural protein occludin (OCLN) by the proteasome8.

Proteomics approaches are widely used in biomarker research to discover

molecular signatures useful for disease diagnosis or prognosis9-11. Therefore, in the

CAPÍTULO II - 79 -

present study we have applied two-dimensional (2D) difference gel electrophoresis

(DIGE) analysis to identify proteins as potential candidate molecules involved in the

pathogenesis of IBS-D. As an extension of our previous investigation6, we now

describe the alterations in the proteomic profile and associated biological functions and

signaling pathways of the jejunal mucosa of IBS-D patients comparing the results

obtained with this approach to those previously obtained with microarray analysis.

7.2. METHODS

7.2.1. Participants

Newly diagnosed, diarrhea-predominant IBS (IBS-D) patients meeting the Rome II

criteria for IBS12 and healthy (H) volunteers were prospectively recruited from the

outpatient gastroenterology clinic and by public advertising, respectively. Prior to

inclusion, a complete medical history and physical examination were carried out in all

participants. Food allergy was ruled out using a battery of skin prick tests (Leti) for 32

common allergens with histamine and saline as positive and negative controls,

respectively. Other exclusion criteria included age <18 or >60 years, active smoking,

major psychiatric and organic diseases, previous history of acute gastroenteritis and

gastrointestinal co-morbidities, those having taken any drug or pharmaceutical

compound in the last 2 weeks, those having taken steroids, anti-allergic or

immunosuppressive and related drugs in the last 3 months, and those having received

radiotherapy or chemotherapy in the last 6 months. Written informed consent was

obtained from each participant and data was stored in an anonymous fashion

according to the approval from the ethics committee of the Institut de Recerca Hospital

Universitari Vall d´Hebron (PR(AG)76/2006).

7.2.2. Clinical assessment


to the biopsy: a) the severity of abdominal pain by a 100-point visual analogue scale;

- 80 - CAPÍTULO II

b) the frequency of abdominal pain (number of days with pain); c) the stool frequency

(maximum number of bowel movements); d) the stool consistency by the Bristol

scale13.

7.2.3. Biological evaluation of participants

Jejunal biopsy


10 cm distal to the Treitz’s angle, using a Watson’s capsule. Tissue samples were

obtained by suction with a 50 mL syringe and immediately split into two similar pieces

with a sterile scalpel. One fragment was fixed in formalin and embedded in paraffin for

further microscopic examination. The remaining fragment was placed in RNAse free

tubes containing 500 μL of RNA Later Solution (Ambion) and stored at -80ºC until

processed for RNA isolation or snap frozen in liquid nitrogen for protein isolation and

2D DIGE analysis, as follows.

RNA isolation and microarray analysis

Biopsies were homogenized in the FastPrep mixer (Bio101) in RLT cell lysis buffer

(Qiagen, Madrid, Spain) followed by RNA isolation (RNeasy Mini Kit, Qiagen) and on-

column DNAse treatment (Qiagen). Prior to gene array analysis, RNA quantity and

quality were confirmed by capillary electrophoresis (Agilent 2100 Bioanalyzer; Agilent

Technologies, Palo Alto, CA, USA).

Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133 Plus 2.0 arrays were used for

expression profiling. Labeling, hybridization and washing were performed according to

manufacturer’s instructions. Data was analyzed using R packages (http://www.r-

project.org) and submitted to Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Software 7.0 as

described in Chapter 1 (page 52 and 149).

CAPÍTULO II - 81 -

Protein isolation and DIGE analysis

Samples were homogenized in the FastPrep mixer (Bio101) in T-PER buffer and

protease and phosphatase inhibitor cocktail (Invitrogen), following manufacturer

recommendations. Insoluble material was removed by centrifugation (350 g, 5 min,

4°C) and the supernatant was sonicated four times for 10 seconds at 4°C.

Isolated protein samples were then subjected to a modified acetone-trichloroacetic

acid precipitation (2D-CleanUp kit; GE Healthcare). The protein pellets were

resuspended in the DIGE labeling buffer {8 M urea, 4% [wt/vol] 3-[(3-cholamidopropyl)-

dimethylammonio]-1-propanesulfonate [CHAPS], 30 mM Tris [pH 8.0]}, and the protein

concentration was determined using the Bio-Rad RCDC protein assay as described by

the manufacturer (Bio-Rad, United Kingdom). The protein concentration in the samples

was then adjusted to 2 mg/mL by addition of DIGE labeling buffer. Fifty micrograms of

each sample was labeled with either Cy3 or Cy5 cyanine dye (GE Healthcare),

following general procedures.

Two-dimension electrophoresis was performed using GE Healthcare reagents and

equipment. First-dimension isoelectric focusing was performed on immobilized pH

gradient strips (24 cm; pH 3 to 10 or 4 to 7) using an Ettan IPGphor system. Samples

were applied via cup loading near the basic ends of the strips, which were previously

rehydrated overnight in 450 μL of rehydration buffer (8 M urea, 4% [wt/]vol CHAPS,

1% Pharmalytes [pH 3 to 10], 100 mM DeStreak). After focusing for a total of 67 kV-h,

the strips were equilibrated first for 15 min in 6 ml of reducing solution (6 M urea, 100

mM Tris-HCl [pH 8], 30% [vol/vol] glycerol, 2% [wt/vol] SDS, 5 mg/mL DTT) and then

for a further 15 min in 6 mL of alkylating solution (6 M urea, 100mM Tris-HCl [pH 8],

30% [vol/vol] glycerol, 2% [wt/vol] SDS, 22.5 mg/mL iodoacetamide) on a rocking

platform. Second-dimension SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was run by

overlaying the strips on 12.5% isocratic Laemmli gels (24 by 20 cm), cast in low-

- 82 - CAPÍTULO II

fluorescence glass plates, on an Ettan DALT VI system. Gels were run at 20°C and at

a constant power of 2.5 W per gel for 30 min, followed by 17 W per gel until the

bromophenol blue tracking front had run off the bottoms of the gels (about 5 h).

Fluorescence images of the gels were acquired on a Typhoon 9400 scanner (GE

Healthcare). Cy3 and Cy5 images were scanned at 532 nm excitation/580 nm

emission and 633 nm excitation/670 nm emission, respectively, at a 100-μm

resolution. Image analysis and determination of significant alterations in protein

abundances were performed automatically with the DeCyder V. 5.0 software (GE

Healthcare).

Protein identification and data analysis

Protein spots of interest were excised from the gel by using an automated Spot

Picker (GE Healthcare). In-gel trypsin digestion was performed essentially as

previously described14, using autolysis-stabilized trypsin (Promega, Madison, WI).

Tryptic digests were purified using ZipTip microtiter plates (Millipore, Carrigtwohill,

Ireland).

Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometric analysis of tryptic

peptides was performed on an Ultraflex time-of-flight/time-of-flight (TOF-TOF)

instrument (Bruker, Germany). Samples were prepared using α-cyano-4-hydroxy-

cinnamic acid as a matrix on anchor chip targets (Bruker, Germany). Identification of

the proteins was carried out by peptide mass fingerprint data and/or by TOF-TOF

PSD. Database searches were performed using the Mascot algorithm (Matrix

Science). Identified proteins where then submitted to Ingenuity Pathway Analysis (IPA)

Software 7.0 as previously described6.

CAPÍTULO II - 83 -

7.2.4. Statistical analysis



Data are expressed as mean ± standard deviation (SD), unless otherwise stated; P-

values of 0.05 or lower were considered significant.

7.3. RESULTS

7.3.1. Study population

Five H volunteers and 8 IBS-D patients were included in the study. Groups were

similar in age (table 1). All patients reported daily watery or mushy stools that varied in

number (3 to 9/day) associated with abdominal pain or discomfort that was relieved

with defecation. Moreover, H volunteers had low stress levels while IBS-D patients

showed higher, yet moderate, stress levels in the last year (table 1).



Stool consistency: 1 (hard) to 7 (entirely liquid).

Holmes-Rahe scale: 0-150, low stress; 151-300, moderate stress; >300 severe stress.

Groups were compared using the non parametric Mann Whitney U-test and P-values are indicated.

- 84 - CAPÍTULO II

7.3.2. The jejunum of IBS-D shows a distinctive transcriptomic profile

We previously reported that the jejunal mucosa of IBS-D patients display a

distinctive gene expression profile compared to H and that this profile reflects

alterations in canonical pathways and biological networks associated with mast cell

function, intestinal permeability and tight junction (TJ) signaling6.

As a second approach to unravel the molecular underpinnings of IBS pathogenesis,

we applied DIGE analysis to identify differentially expressed proteins in IBS-D patients.

Analysis of proteomic data revealed approximately 1,200 protein spots. By selecting an

abundance ratio of 1.3-fold as the threshold for the study, at least 139 spots were

differentially produced (P < 0.05) between the two groups studied. From those, we

were able to identify 95 proteins (figure 1; supplementary table 1).

IPA analysis revealed a number of new canonical signaling pathways key for

intestinal homeostasis as playing an important role in IBS-D. Interestingly, LPS/IL1

mediated alterations of nuclear RXR receptors, mitochondrial dysfunction and

regulation of actin-based motility by rho, appeared as the most significant in IBS-D

(table 2).

Interestingly, among the proteins identified, we found several subunits of those

involved in the degradation of proteins through the proteasome pathway as significantly

down-regulated (table 3).

CAPÍTULO II - 85 -

Table 2. Canonical signaling pathways most significantly associated with IBS-D protein expression profile.

* Ratio: number of genes in the analysis that are associated with the canonical pathway divided by the total

number of genes that map to the canonical pathway.

Table 3. Proteins belonging to the proteasome pathway are differentially expressed in the jejunal mucosa

of IBS-D patients. Uniprot accession number of proteins and their fold change expression in IBS-D with respect to H

are shown.

- 86 - CAPÍTULO II

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CAPÍTULO II - 87 -

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5

- 88 - CAPÍTULO II

7.3.3. Gene and protein expression profiles in the jejunal mucosa of IBS-D are

associated with similar canonical pathways, biological functions and disease

mechanisms

While there was no apparent concordance between the exact genes and proteins

identified as differentially expressed in IBS-D patients, IPA comparative analysis of

gene and protein expression data revealed that the same canonical pathways,

biological functions and disease/disease mechanisms were associated with both

expression profiles (figure 2).

Interestingly, both microarray and proteomic approaches identified cellular

assembly and cell-to-cell signaling as two of the most significant biological functions

associated with IBS-D. Moreover, immunological, gastrointestinal and inflammatory

diseases were among the most relevant disease mechanism associated with both IBS-

D transcriptional profiles.

7.4. DISCUSSION

In the present study, we demonstrate that the jejunum of IBS-D patients has a

distinctive proteomic profile compared to H, extending our previous reports by showing

that gene and protein alterations are associated to the same signaling pathways. The

classification of the RNA and protein transcripts in the same canonical pathways

demonstrates that many different biological processes are identified by both

approaches as differentially active in the jejunal mucosa of IBS-D patients. This

underlines the difficulty in unraveling the cellular networks involved in the pathogenesis

of this complex and multifactorial disease.

Increased intestinal permeability has been described by several clinical studies as

a key feature of IBS15-18, being more pronounced in IBS-D patients than in other

subgroups of IBS15. In the present study, we identified bile acid metabolism as one of

CAPÍTULO II - 89 -

the most relevant pathways associated with the IBS-D proteomic profile. Bile acids can

stimulate secretion in the colon and in many animal studies chenodeoxycholic acid

(CDCA) and deoxycholic acid (DCA) in concentrations between 1 and 8 mmol/L have

produced a dose-related increase in paracellular mucosal permeability and also

damaged the mucosa, as verified by light and electron microscopy19. Moreover, it has

been demonstrated that bile acids can modulate tight junction structures and barrier

function in Caco-2 monolayers by activating the epithelial growth factor receptor20 or

generating reactive oxygen species21. Increased colonic exposure to bile acids as a

consequence of bile acid malabsorption has been associated with IBS-D22, however,

the potential relationship of increased bile acid exposure and increased intestinal

permeability has not been addressed. Interestingly, time-course studies in hepatic

epithelial cells demonstrated that mitochondrial injury preceded impairments in Na+-

dependent glucose transport and TJ permeability in response to bile acids

exposure23. Moreover, exposure to bile acids exacerbates mucosal barrier dysfunction

in colonic biopsies of patients with collagenous colitis in remission allowing a

substantially increased bacterial uptake, which may contribute to recurrence of

inflammation24. In line with this observation, we identified LPS-mediated inhibition of

RXR function as the most significant pathway associated with the proteomic profile of

IBS-D patients. The RXR pathway, acting synergistically with PPARγ, negatively

regulates intestinal inflammation through inactivation of NFκB and MAPK pathways25 In

view of these findings, we may speculate that bile acids may influence epithelial barrier

function in IBS-D allowing access of bacterial antigens to the intestinal mucosa which

may lead to the inactivation of RXR function and, therefore, contributing to chronic

inflammation.

Another remarkable finding of the present study is that several proteins involved in

the proteasome pathway are differentially expressed in the jejunal mucosa of IBS-D

- 90 - CAPÍTULO II

patients, as proteasome-mediated protein degradation contribute to the regulation of

several cellular pathways related to cell proliferation, apoptosis, inflammatory response

and antigen presentation26. Moreover, it has been shown that proteasomes can

strongly influence the production of pro-inflammatory cytokines through the

regulation of the NFκB pathway27,28, and several studies have shown that

administration of proteasome inhibitors can suppress systemic cytokine storm in

sepsis and related inflammatory conditions29,30. Interestingly, recent data have

suggested that proteasome could have an important function during experimental

intestinal inflammation21-33, as well as in inflammatory bowel diseases32,34,35. Mucosal

intestinal proteins have a high turnover rate, ~50% per day, in humans36,37. Thus,

proteasome-mediated proteolysis, which degrades proteins in a specific manner, may

have important functions in intestinal cell metabolism. In this sense, it has been

recently suggested that proteasome alterations may contribute to the pathophysiology

of IBS by increasing occludin degradation in the colonic mucosa of IBS patients8. Our

results reinforce this hypothesis by showing an impaired expression of ubiquitin-

proteasome related proteins in IBS-D samples, although further studies will be needed

to further identify the implications for epithelial barrier dysfunction and intestinal

inflammation in these patients.

These observations, together with our recent findings on altered TJ signaling6,

support the assessment of intestinal barrier dysfunction in future studies. The

application of powerful platforms like proteomics can help to unravel the underlying

molecular mechanisms, and contribute to the diagnosis, prevention, and monitoring of

IBS.

CAPÍTULO II - 91 -

7.5. REFERENCES

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Increased rates of duodenal mucosal protein synthesis

in vivo in patients with untreated celiac disease. Gut

1996;39:176-9.

CCAAPPÍÍTTUULLOO IIIIII

CAPÍTULO III - 95 -

CAPÍTULO III

8. ALTERED JEJUNAL TIGHT JUNCTION SIGNALING CORRELATES WITH MUCOSAL MAST CELL ACTIVATION AND SYMPTOM SEVERITY IN DIARRHEA-PRONE IRRITABLE BOWEL SYNDROME PATIENTS.

Authors: Cristina Martínez1, María Vicario1,5, Beatriz Lobo1, Guilá M1, Laura

Ramos1, Carmen Alonso1, Jose Luis Mosquera2, Alex Sánchez2,6, Ana M. González-

Castro1, Marc Pigrau1, Mar Guilarte1,3, María Antolín1, Inés de Torres4, Esteban

Saperas1, Fernando Azpiroz1,5, Javier Santos1,5.

1Digestive System Research Unit and 2Statistics and Bioinformatics Unit, Institut de

Recerca Vall d’Hebron; Departments of 1Gastroenterology, 3Allergy, and 4Pathology,

Hospital Universitari Vall d’Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona,

Spain. 5Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y

Digestivas (Ciberehd). 6Statistics Department, Faculty of Biology, University of

Barcelona, Barcelona, Spain.


Ciberehd, Instituto Carlos III, Subdirección General de Investigación Sanitaria, Ministerio

de Ciencia e Innovación; and the International Foundation for Functional

Gastrointestinal Disorders (IFFGD). A. Sánchez (MTM2008-00642), C. Alonso

(CM04/00019), L. Ramos (CM05/00055), M. Vicario (CP10/00502), and J. Santos

(PI05/1423; PI/080940; EC07/90148, 2008 IFFGD Research Grant Award) were the

recipients of these grants.

- 96 - CAPÍTULO III

8.1. INTRODUCTION

The molecular and functional integrity of the intestinal epithelial barrier is pivotal to

preserve energy supply and to restrict the internal contact with luminal content. Barrier

dysfunction might allow the passage of bacterial antigens through the mucosal layer of

the gut leading to activation of mucosal immune responses1,2 and contributing,

therefore, to IBS manifestations3. Interestingly, increased intestinal permeability has

been described by several clinical studies as a key feature of IBS4-7, being more

pronounced in IBS-D patients than in other subgroups of IBS3. A plausible contributor

to this phenomenon is the low-grade inflammation that has been identified as a

frequent, yet not universal8,9, pathological hallmark in the intestinal mucosa of some

IBS patients10,11. In these patients, the inflammatory infiltrate is dominated by increased

populations of mast cells (MCs)12-14 which have been largely implicated in the

regulation of stress and infectious related intestinal barrier dysfunction and in the

generation of gastrointestinal motor abnormalities and visceral pain8,15,16. Upon

activation, MCs release a wide range of neurotransmitters and other inflammatory

mediators. Among all these mediators, tryptase seems particularly relevant as it can

activate protease-activated receptor 2 (PAR-2) on epithelial cells, resulting in

modulation of tight junction (TJ) proteins and increases in permeability through

paracellular pathways in the intestinal epithelium17. Noteworthy, increased tryptase

mucosal expression18,19 and release to the intestinal lumen13 has been recently

described in IBS patients. In line with all these observations, recent data from our

laboratory showed differential changes in the transcriptomic profile of the jejunal

mucosa of IBS-D patients linked to increased mucosal tryptase mRNA expression and

alterations in the expression and distribution of proteins belonging to the TJ signaling

pathway19. Accordingly, recent reports have shown that barrier dysfunction in the

colonic mucosa of IBS is linked to the down-regulation of the TJ scaffolding protein


zonula occludens 1 (ZO-1)20 and to the degradation of the TJ structural protein occludin

(OCLN) by the proteasome21.

The barrier function in epithelial cells is regulated by the apical intercellular

junctional complex in which TJ are the major constituents22. TJ act as both a gate that

prevents the paracellular transport of ions and solutes; and a fence that separates the

plasma membrane into the apical and basolateral domains23. The TJ transmembrane

proteins, claudins (CLDN) and occludin, are structurally associated to the cytoskeleton,

composed of actin, myosin II and other proteins, through the scaffolding proteins ZO.

This association to the perijunctional actomyosin ring, which encircles the cell at the

apical surface, is crucial for the dynamic regulation of paracellular permeability2.

In this study, we aimed (i) to evaluate the expression of structural TJ proteins and

the mechanisms of TJ disassembly through modulation of cytoskeleton proteins in the

jejunal mucosa of IBS-D patients, (ii) to assess the relationship of TJ alterations to

MCs numbers and activation, and (iii) to investigate the clinical impact of TJ alterations

in these patients.

8.2. METHODS

8.2.1. Participants

Newly diagnosed, diarrhea-predominant IBS (IBS-D) patients meeting the Rome II

criteria for IBS24 and healthy volunteers (H) were prospectively recruited from the

outpatient gastroenterology clinic and by public advertising, respectively. Prior to

inclusion, a complete medical history and physical examination were carried out in all

participants. Food allergy was ruled out using a battery of skin prick tests (Leti) for 32

common allergens with histamine and saline as positive and negative controls,

respectively. Other exclusion criteria included age <18 or >60 years, active smoking,

major psychiatric and organic diseases, previous history of acute gastroenteritis and

gastrointestinal co-morbidities, those having taken any drug, pharmaceutical


compound, or herb in the last 2 weeks, those having taken steroids, anti-allergic or

immunosuppressive and related drugs in the last 3 months, and those having received

radiotherapy or chemotherapy in the last 6 months. Written informed consent was

obtained from each participant and data was stored in an anonymous fashion

according to the approval from the ethics committee of the Institut de Recerca Hospital

Universitari Vall d´Hebron (PR(AG)76/2006).

8.2.2. Clinical assessment


to the biopsy: a) the severity of abdominal pain by a 100-point visual analogue scale;

b) the frequency of abdominal pain (number of days with pain); c) the stool frequency

(maximum number of bowel movements); d) the stool consistency by the Bristol

scale25.

8.2.3. Biological evaluation of participants

Jejunal biopsy and fluid content aspirate


10 cm distal to the Treitz’s angle, using a Watson’s capsule with an attached 3 mm

diameter aspiration tube. Jejunal fluid (5 mL) was obtained by gentle aspiration with a

10 mL syringe, snap frozen and stored at -80º C until analyzed. Then, tissue samples

were obtained by suction with a 50 mL syringe and immediately split into two similar

pieces with a sterile scalpel. One fragment was fixed in formalin and embedded in

paraffin for further microscopic examination. The remaining fragment was placed in

RNAse free tubes containing 500 μL of RNA Later Solution (Ambion) and stored at

-80ºC until processed for RNA isolation, snap frozen in liquid nitrogen for protein

isolation or processed for ultrastructure assessment of TJ by transmission electron

microscopy, as follows.


Histology and Immunohistochemistry

Tissue sections were processed for routine hematoxylin & eosin following general

procedures to assess epithelial morphology and eosinophilic infiltration. In addition, the

number of MCs and IELs was determined at x 400 magnification using anti-human c-

kit (CD117) (Dako), as previously described13,19. Specimens were blindly examined by

one experienced pathologist.

Immunofluorescence.

Tissue sections were deparaffinated and hydrated following general procedures,

and blocked with Dako Blocking Solution (Dako) for 10 minutes followed by 60 minutes

room temperature incubation in primary antibodies (Supplementary Table 1).

Secondary antibodies were Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG and 488 goat anti-

mouse IgG (Molecular Probes). Nuclei were counterstained with 4',6-diamidino-2-

phenylindole (DAPI) before mounting in Prolong antifade reagent (Molecular Probes).

Negative control slides were set by exposing the serial sections under similar

conditions but without the primary antibody. Images were acquired with a laser

scanning confocal microscope (FV-10) and quantification of TJ protein expression was

performed in a blinded manner measuring the average of fluorescence intensity in 10

non-overlapping fields per subject using the FV-10-ASW Olympus software.

Microarray analysis


(Qiagen, Madrid, Spain) followed by RNA isolation (RNeasy Mini Kit, Qiagen) and on-

column DNAse treatment (Qiagen). Prior to gene array analysis, RNA quantity and

quality were confirmed by capillary electrophoresis (Agilent 2100 Bioanalyzer; Agilent

Technologies, Palo Alto, CA, USA).

Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133 Plus 2.0 arrays were used for

expression profiling. Labeling, hybridization and washing were performed according to


manufacturer’s instructions. Data was analyzed using R packages (http://www.r-

project.org) and submitted to Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Software 7.0 as

described in Chapter 1 (page 52 and 149).

Quantitative Real-Time PCR (Q-RT-PCR)

cDNA synthesis was performed using 1 μg of total RNA with the High Capacity

Reverse Transcription Reagents Kit (Applied Biosystems). Q-RT-PCR was performed

on an ABI PRISM® 7500 FAST Sequence Detection System (Applied Biosystems)

using validated TaqMan Gene Expression Assays (GEA), and the human 18S subunit

ribosomal RNA gene as an endogenous control (Supplementary Table 2) (Applied

Biosystems), as previously described19.

Protein isolation and western blotting

Samples were homogenized in the FastPrep mixer (Bio101) in T-PER buffer and

protease and phosphatase inhibitor cocktail (Invitrogen), following manufacturer

recommendations. Insoluble material was removed by centrifugation (350 g, 5 min,

4°C) and the supernatant was sonicated four times for 10 seconds at 4°C. Protein

concentrations were determined by Pierce bicinchoninic acid assay (Pierce). Equal

amounts of protein were separated by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-

polyacrylamide gel electrophoresis) and transferred to a poly(vinylidene difluoride)

membrane. Primary antibodies and dilutions used are listed in supplementary table 1.

Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG or goat anti-mouse IgG (Pierce) and the

chemiluminescence detection system SuperSignal West Femto (Thermo Scientific)

were used to detect bound antibodies. All blots were probed with mouse anti-human β-

actin (Sigma-Aldrich) as a protein loading control. Densitometric comparison was

carried out on the same immunoblot using the ImageJ software (National Institutes of

Health; http://rsb.info.nih.gov/ij/).


Transmission electron microscopy (TEM)

Samples were fixed with 2.5% (v/v) glutaraldehyde and 2% (v/v) paraformaldehyde

(EM grade, TAAB) in 100 mM phosphate buffer (PB, pH 7.4) for 2 h and rinsed with

100 mM PB. Tissues were then post-fixed in 1% (w/v) osmium tetroxide (TAAB)

containing 0.8% (w/v) of potassium hexacyanoferrate (III) (Sigma) 2 h and washed

with 100 mM PB. Samples were dehydrated through a graded acetone series,

infiltrated in Epon’s resin and polymerized for 48h at 60ºC. Ultra thin sections were

mounted in copper grids, contrasted with standard uranyle acetate and lead citrate

double-staining, and observed in a transmission electron microscope Hitachi H-7000 at

75Kv equipped with a camera MegaView III (Soft Imaging System). To evaluate

changes in TJ ultrastructure only well-oriented sections with longitudinally sectioned

microvilli were examined in each sample. Examinations were performed in a blinded

manner on a minimum of 50 junctions per sample in non-overlapping fields. The

architecture of the apical junctional complex was considered altered when the

maximum length of the intercellular dilatation measured was bigger than 20 nm26,27.

Other features observed were aberrant microvilli structure28 and increased

perijunctional cytoskeleton condensation29.

8.2.5 Statistical analysis



Relationships between clinical variables and gene or protein expression were

assessed by Spearman’s rho correlation. Data are expressed as mean ± standard

deviation (SD), unless otherwise stated; P-values of < 0.05 were considered

significant.


8.3. RESULTS

8.3.1. The jejunum of IBS-D shows hyperplasia of activated mucosal MCs

Twenty-seven healthy volunteers (H) and forty-five diarrhea-IBS (IBS-D) patients

were included in the study (table 1). Confirming our previous findings13,19, IBS-D

patients showed a marked increased in MCs (CD117+) counts and tryptase mRNA

over-expression (figure 1a). Western blot analysis confirmed this increase in tryptase in

the jejunal mucosa (figure 1a). Noteworthy, tryptase expression positively correlated

with the number of bowel movements and stool consistency (table 2).



Stool consistency: 1 (hard) to 7 (entirely liquid).

Other exclusion criteria: active smoking, major psychiatric and organic diseases, those having taken any drug,

pharmaceutical compound, or herb in the last 2 weeks, those having taken steroids, anti-allergic or immunosuppressive

and related drugs in the last 3 months, and those having received radiotherapy or chemotherapy in the last 6 months.


Figure 1. Assessment of MC numbers and activation in the jejunal mucosa of IBS-D patients.

a. Mast cell counts. Mast cells were counted in 8 contiguous, non-overlapping, histological fields, at 400x, and

expressed as CD117+ cells per high power field (hpf) after immunohistochemistry for CD117. IBS-D patients (n=45)

showed a significant increase of mast cell numbers compared to H (n=27). Groups were compared using the parametric

unpaired t-test and P-values are indicated. b. Tryptase gene expression. Tryptase mRNA expression was measured

by Q-RT-PCR in 12 H volunteers and 17 IBS-D patients. To obtain the fold-change value for each sample the

tryptase/18S mRNA ratio was calculated for each sample and then normalized to the average of the H group. Groups

were compared using the parametric unpaired t-test and P-values are indicated. c. Tryptase protein expression.

Tryptase protein expression was measured by western-blot in 7 H and 7 IBS-D patients. To obtain the fold-change value

for each sample the tryptase/β-actin ratio was calculated for each sample and then normalized to the average of the H

group. Groups were compared using the parametric unpaired t-test and P-values are indicated.

Table 2. Correlation between MC-related variables and clinical symptoms in the jejunal mucosa of IBS-D

patients (n=7-45) and H volunteers (n=7-27).

Note: For correlations of abdominal pain intensity, only IBS-D participants were evaluated, as H subjects

experiencing abdominal pain would not meet inclusion criteria.


8.3.2. Altered expression and distribution of structural TJ proteins correlates

with bowel dysfunction in IBS-D patients

IPA analysis revealed that several genes belonging to TJ-related biological

functions and the TJ signaling pathway are differentially expressed in IBS-D

(supplementary figure 1).

In order to further assess TJ dysregulation, we analyzed the expression of

structural TJ proteins at both mRNA and protein levels. Q-RT-PCR analysis showed

the mRNA down-regulation of claudins (CLDN) 1, 2 and 4 (P<0.01 for all) in IBS-D

(figure 2a); while at the protein level CLDN2 protein expression was significantly up-

regulated in IBS-D (P<0.05) (figure 2b).

Furthermore, gene and protein expression of occludin (OCLN) was similar in both

groups (figure 3a-b), but OCLN phosphorylation (p-OCLN) was reduced in IBS-D

(P<0.05) (figure 3b). As the phosphorylation status of OCLN has been linked to its

distribution in epithelial cells, we assessed OCLN staining by confocal

immunofluorescence. IBS-D samples showed increased staining of OCLN in the

cytoplasm of epithelial cells suggesting intensive internalization of this protein, as

opposed to H where OCLN was predominantly located in the TJ (figure 3c).


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Interestingly, we found a significant direct correlation between both, CLDN2 protein

over-expression and increased OCLN cytoplasmic staining and MC activation (table 3).

Moreover, stool frequency and consistency also correlated with the increased

expression of CLDN2 and OCLN redistribution (table 4). Noteworthy, samples showing

less expression of CLDN3 and CLDN4 also showed reduced p-OCLN (r=0.84,

P=0.0001 for CLDN3; r=0.73, P=0.003 for CLDN4).

Table 3. Correlation between MC-related variables and expression of TJ transmembrane proteins in the

jejunal mucosa of IBS-D patients (n=7-11) and H volunteers (n=7-8).

8.3.3. Phosphorylation of myosin light chain (MLC) is increased in IBS-D

To define the mechanisms that regulate TJ function we evaluated MLC

phosphorylation at Ser19 (pMLC), which leads to contraction of the acto-myosin belt

and disassembly of TJs; and phosphorylation at Thr18+Ser19, which has been related

to the de novo TJ assembly. IBS-D patients showed a significant increase in pMLC

compared to H (P<0.01), while ppMLC remained unchanged (figure 4a). In

concordance, IBS-D showed increased expression of MLC kinase (MLCK) (1.6 fold,

P=0.02), while the catalytic subunit of myosin phosphatase (PP1cδ) was decreased

(0.7 fold, P<0.05) (figure 4b). Remarkably, pMLC level significantly correlated with

bowel frequency and consistency (table 4).


Figure 4. Assessment of the MLCK-dependent pathway in the jejunal mucosa of H volunteers and IBS-D

patients.

a. Detection of MLC phosphorylation in the jejunal epithelium by laser scanning confocal microscopy.

Representative micrographs of the jejunal epithelium of 14 IBS-D and 14 H samples where Ser19-phosphorylated MLC

(pMLC) (green) and Ser19/Thr18-phosphorylated MLC (ppMLC) (red) are identified (high-power field, x400). Nuclear

labeling of 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blue) is also shown for reference. Quantitative analysis of fluorescence

intensity was performed in a blinded manner on stained sections using the FV-10-ASW Olympus software. The average

of fluorescence intensity in 10 non-overlapping fields per subject is represented. Groups were compared using the

parametric unpaired t-test and P-values are indicated. b. MLC kinase (MLCK) and MLC phosphatase (PP1cδ) protein

expression analysis. Protein expression was measured by western-blot in 7 H and 7 IBS-D patients. To obtain the

fold-change value for each sample the target protein/β-actin ratio was calculated for each sample and then normalized

to the average of the H group. Groups were compared using the non parametric Mann Whitney U-test and P-values are

indicated.


8.3.4. TJ architecture is altered in IBS-D

Routine processing of jejunal samples for hematoxilin and eosin staining disclosed

no differences in epithelial architecture or the presence of inflammatory cells in the

lamina propria between IBS-D patients and H (data not shown). However, widening of

intercellular spaces, peri-junctional cytoskeleton condensation at the TJ and aberrant

apical junction structures were frequently observed by TEM in enterocytes from IBS-D

patients (figure 5a). Measurement of the maximum paracellular space length revealed

that IBS-D patients showed a larger proportion of samples showing dilated intercellular

spaces (>20 nm) (P<0.01) and a significant increase of the apical intercellular distance

(P<0.0001) (figure 5b). Moreover, IBS-D samples showed a higher percentage of

junctions with peri-junctional cytoskeleton condensation (P<0.001) (figure 5b).

Interestingly, we found a significant correlation between both, the proportion of dilated

intercellular junctions and the intercellular distance and IBS-D symptoms (table 4).

Cytoskeleton condensation also correlated with bowel dysfunction (table 4).

Table 4. Correlation between expression of TJ-related proteins, ultraestructural TJ alterations and clinical

parameters in the jejunal mucosa of IBS-D patients (n=7-15) and H volunteers (n=7-14).

Note: For correlations of abdominal pain intensity, only IBS-D participants were evaluated, as H subjects

experiencing abdominal pain would not meet inclusion criteria.


Figure 5. Assessment of apical junctional complex ultrastructure in the jejunal mucosa of H volunteers and

IBS-D patients.

a. Ultrastructural TJ alterations. Representative micrographs of the jejunal epithelium of 15 IBS-D and 12 H

samples showing widening of the paracellular space (indicated by white arrow) and peri-junctional cytoskeleton

condensation. Original magnification x60.000. b. Quantification of ultrastructural alterations. The percentage of

subjects showing paracellular spaces measuring more than 20 nm and electron-dense material around the apical

junctional complex was calculated within each group of participants. The maximum length of intercellular dilatation was

measured in a minimum of 50 junctions per sample in non-overlapping fields. Groups were compared using the

parametric unpaired t-test and P-values are indicated.


8.4. DISCUSSION

In the present study, we demonstrate both structural and functional alterations in TJ

proteins in the jejunal mucosa of IBS-D patients and its association to mast cell

activation and to the clinical outcome of these patients. We have recently showed that

the jejunal mucosa of IBS-D patients displays a distinctive transcriptomic signature

linked to alterations in the expression and distribution of proteins belonging to the TJ

signaling pathway19. The results reported in this study extend our previous findings by

showing that these patients show alterations in structural and regulatory TJ proteins

paralleled by disrupted architecture of the apical junctional complex.

Increased intestinal permeability has been previously described in IBS3-6, being

higher in IBS-D patients than in other subgroups3. A major determinant to the rate of

intestinal permeability is the ‘‘tightness’’ of the TJ between enterocytes, which vary

considerably in different intestinal segments, i.e. the proximal gut is leakier than distal

segments30. Claudins play a central role in the coordination of barrier function and

signaling activity at the TJ and its differential expression and properties appear to

determine the tissue-specific variations in electrical resistance and paracellular ionic

selectivity31. The pathophysiological relevance of claudins in the intestine has recently

been highlighted by the finding of alterations in several members of this family of

transmembrane proteins in the colonic epithelia of inflammatory bowel disease (IBD)

patients, which have been demonstrated to contribute to barrier dysfunction32,33. In our

study, we have shown that mRNA expression of sealing claudins (CLDN1 and CLDN4)

and the pore-forming CLDN2 were decreased in IBS-D. On the contrary, at the protein

level CLDN2 was found to be up-regulated. This protein has been described to

contribute prominently to the paracellular permeability to Na+ and K+ in the rodent small

intestinal epithelium34 and to mediate water permeability in renal epithelial cells35. Thus,

alterations in the claudin profile would be expected to enhance paracellular


permeability to cations providing the molecular basis for the so-called leak-flux

diarrhea, as suggested in IBD32,33, even though the contribution of other mechanisms

including the transcellular route can not be excluded. On the other hand, the opposite

effect on CLDN2 mRNA and protein expression is intriguing and deserves further

exploration, but we may speculate that it could be due to counteracting mechanisms

aimed at controlling intestinal barrier dysfunction and, therefore, intestinal inflammation

in IBS.

In addition to claudins, other proteins have been described to play a role in the

modulation of TJ integrity, including the transmembrane protein OCLN and the

scaffolding protein ZO1. We have recently reported jejunal ZO1 down-regulation and

redistribution linked to mast cell activation and bowel dysfunction in IBS-D patients19. In

the present study we show similar mRNA expression of OCLN than healthy subjects, in

agreement with other studies in the colon of IBS20,21. Of note, OCLN protein expression

has been reported to be decreased in the colon of IBS as a result of an increased

proteasome activity in these patients21. However, our study did not confirm this result

probably due to differences in the IBS population studied and to variations between gut

segments. Besides gene and protein expression regulation, OCLN-mediated

modulation of TJ integrity can be also achieved by phosphorylation36. When separated

by SDS-PAGE, OCLN resolves as two bands of 65 and 85 KDa, where the higher

molecular weight band represents ser/thr-phosphorylated OCLN37,38 that selectively

concentrate at the TJ, while the lower molecular weight band represent non- or less

phosphorylated OCLN and is localized in the cytoplasm38. Our study identified a

reduction in the 85 KDa band corresponding to pOCLN in the jejunum of IBS-D patients

and a consequent redistribution of OCLN from the TJ to the cytoplasm. In addition,

specific phosphorylation of cytoskeleton proteins is also crucial for the assembly and

maintenance of TJ integrity. Our study identified increased MLCK expression and


reduced PP1cδ (the catalytic subunit of MLCP) and, consequently, enhanced

phosphorylation of MLC. This is in coincidence with studies showing the ability of

colonic supernatants of IBS patients to induce an increase of intestinal permeability

involving enhanced pMLC when infused in the colon of mice39. Taken together, these

results suggest that TJ phosphorylation/dephosphorylation events may be of critical

importance in the control of inflammation in the intestine of IBS-D patients modulating

the passage of luminal antigens through the paracellular pathway. Indeed, the reduced

pOCLN and increased pMLC levels suggest structural changes of TJ in the jejunum of

IBS-D, which may be, at least in part, responsible for the increased small bowel

permeability observed in this disease. Further support for these results comes from the

electron microscopy data which demonstrates a significant increase in the paracellular

space between adjacent enterocytes in the jejunum of IBS-D patients that may be the

result of alterations in the expression and distribution of structural TJ proteins.

Moreover, the observed electron-dense material around the TJ in IBS-D samples may

be the consequence of the MLCK-mediated contraction of the perijunctional

actomyosin ring, a phenomenon that has been previously linked to T-cell activation40.

This study provides evidence of gut epithelial barrier dysfunction in IBS-D patients,

but does not elucidate the precise mechanism. Noteworthy, the relationship between

regulatory and structural TJ alterations and clinical parameters leads us to speculate

that TJ integrity dysregulation may be a critical step for the development and

exacerbation of IBS symptoms. A possible explanation for our findings is a mast cell-

induced disruption of TJ proteins through diverse mechanisms given the ability of mast

cell mediators, including cytokines and specific proteases, to modulate paracellular

permeability27,41,42. We have previously demonstrated an increase in mast cell numbers

and activation in the jejunum of IBS-D patients13,19 which is further confirmed in this

study by showing that tryptase expression is increased in IBS-D, not only at mRNA but


also at the protein level, and its association with mast cell numbers and bowel

dysfunction. Noteworthy, both increased CLDN2 protein expression and increased

cytoplasmic pool of OCLN correlated with tryptase expression and bowel dysfunction

suggesting a pivotal role of MC in the disruption of gut mucosal integrity which may

explain the symptoms in these patients. On the other hand, several studies have

reported differences in serum and colonic cytokine levels, which may also be

responsible for the alteration of TJ proteins in the intestinal mucosa, although to date

the results obtained in this area have been inconsistent10,11,43-46. However, there are no

studies addressing this point in the small bowel epithelium.

In summary, these results suggest that changes in structural and regulatory TJ

proteins may help to explain the increased intestinal permeability previously observed

in IBS-D patients, although further studies are needed to precisely define the

mechanism and functional consequences of these alterations.


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DDIISSCCUUSSIIÓÓNN GGEENNEERRAALL

DISCUSIÓN GENERAL - 121 -

DISCUSIÓN GENERAL

El síndrome del intestino irritable (SII) es una enfermedad digestiva de curso

crónico, con una alta prevalencia en los países industrializados (10-20% de la

población; Mayer, 2008). El desconocimiento de su etiopatogenia, junto a la

inexistencia de marcadores biológicos que ayuden en su diagnóstico, determina que el

manejo terapéutico de esta enfermedad sea deficiente. El deterioro en la calidad de

vida de los pacientes y el creciente coste socio-económico que se genera convierten al

SII en un problema importante de salud pública. En consecuencia, es de vital

importancia que la investigación en este campo se oriente hacia la identificación del

sustrato biológico subyacente a la sintomatología de esta enfermedad, que pueda ser

utilizado tanto como marcador diagnóstico como para el desarrollo de dianas

terapéuticas.

Afortunadamente, y en estrecha vinculación con la irrupción progresiva de

tecnologías innovadoras y ultrasensibles, así como de su rápida incorporación a los

protocolos de investigación, nuestra comprensión mecanística del origen del SII puede

estar experimentando en la actualidad un gran salto hacia adelante. Un avance

notable es la reciente identificación de la existencia de un aumento de la

permeabilidad epitelial en el intestino delgado de los pacientes con SII, más acusado

en aquellos pacientes con diarrea de origen no post-infeccioso (Dunlop et al, 2006), y

un aumento del número y de la activación de los mastocitos en la mucosa del yeyuno

de pacientes con SII-D (Guilarte et al, 2007). Estos hallazgos cuestionan la naturaleza

funcional del SII y proporcionan los primeros cimientos sobre los que estudiar este

síndrome como una enfermedad orgánica, lo que podría ser cierto para algunos

subgrupos de pacientes. Bajo este nuevo enfoque, la trayectoria a seguir conlleva la

identificación de alteraciones en la mucosa intestinal que constituyan el sustrato

biológico subyacente a la etiopatogenia del SII. Como punto de partida en la búsqueda

- 122 - DISCUSIÓN GENERAL

de dicho sustrato, la hipótesis de trabajo que plantea la presente tesis es que la

barrera mucosa intestinal de los pacientes con SII-D presenta alteraciones

moleculares y estructurales distintivas asociadas con un sustrato inmuno-inflamatorio

patobiológico subyacente y con las manifestaciones clínicas predominantes.

Como primera aproximación para evaluar nuestra hipótesis, hemos analizado el

perfil de expresión génica y proteica en muestras de mucosa yeyunal de pacientes con

SII-D y voluntarios sanos mediante microarrays y electroforesis diferencial en gel

(DIGE), respectivamente. Este tipo de tecnologías están ampliamente aceptadas por la

comunidad científica y han contribuido significativamente a la comprensión de los

mecanismos moleculares subyacentes a varias enfermedades complejas. Sin

embargo, la interpretación de los resultados de este tipo de análisis y su traslación a

la práctica clínica diaria conlleva una serie de limitaciones, que pueden ser

parcialmente superadas mediante la combinación de diferentes métodos

bioinformáticos que nos permiten profundizar en el significado biológico de los cambios

de expresión génica. Así pues, hemos utilizado el análisis de microarrays y de DIGE

como técnicas exploratorias iniciales seguidas del análisis del significado biológico

asociado al perfil transcriptómico diferencial obtenido. Para ello hemos proyectado la

lista de genes y proteínas diferencialmente expresadas en SII-D en el programa de

análisis IPA, el cual cuenta con una base de datos propia que integra todo el

conocimiento biológico extraído en la literatura científica reciente. Este análisis nos ha

permitido clasificar los genes y proteínas diferencialmente expresados según su

participación en funciones biológicas y en redes de señalización.

Por otro lado, hemos realizado un análisis multivariante con el objetivo de obtener

una mayor comprensión de la importancia biológica de nuestros resultados y descubrir

las posibles asociaciones entre los diferentes grupos de variables biológicas, clínicas y

epidemiológicas, recogidas en todos los participantes del estudio.


Nuestros resultados demuestran que la mucosa del yeyuno de los pacientes con

SII-D tiene un perfil transcriptómico característico que, además, es distinto al de los

voluntarios sanos. Dicho perfil se compone de 286 genes, un número elevado si lo

comparamos con estudios recientes realizados en biopsias de colon donde el listado

de genes diferencialmente expresados comprende un número de 20 a 33 genes

(Aerssens et al, 2008; Macsharry et al, 2008). Las diferencias entre nuestros

resultados y los obtenidos por otros grupos de investigación podrían ser debidas a

diferentes factores: la heterogeneidad de la población de SII estudiada, el segmento

intestinal objeto de estudio, ya que las mucosas del colon y del yeyuno presentan

diferente estructura y función, por lo tanto, sus poblaciones celulares varían, y,

además, están expuestas a diferente carga antigénica; y también por los diferentes

métodos utilizados para la obtención de la biopsia. A pesar de estas diferencias, es

interesante comprobar que también existen ciertas similitudes con estos estudios en la

mucosa colónica. Fundamentalmente, las funciones más relevantes identificadas en

estos estudios previos están asociadas a la respuesta inmunológica frente a bacterias

intestinales. Es interesante destacar que, en nuestro análisis también identificamos

genes implicados en los mecanismos de respuesta inmunológica frente a la microbiota

intestinal en el yeyuno de los pacientes con SII-D, con mayor relevancia aquellos que

participan en la señalización de las vías de ERK/MAPK y NFκB.

Por otro lado, es de gran importancia destacar que las redes moleculares y las vías

de señalización asociadas al perfil transcriptómico del SII-D que emergen como las

más relevantes, son aquellas relacionadas con la regulación de la permeabilidad

intestinal a través de la modulación de las uniones estrechas (TJ). En vista de este

resultado inicial, nos planteamos evaluar de manera exhaustiva las proteínas

pertenecientes a la vía de señalización de las TJ y su posible relación con el estado de

activación de los mastocitos en la mucosa del yeyuno de estos pacientes. En concreto,


analizamos las alteraciones en la expresión de las proteínas ZO, identificadas en el

análisis de microarrays, pero también de las proteínas estructurales de las TJ

claudinas y ocludina, y otras proteínas implicadas en la regulación del ensamblaje y

desensamblaje de las TJ en estos pacientes.

El principal factor que determina la tasa de permeabilidad del epitelio intestinal es

la “fuerza” de las TJ que se establecen entre los enterocitos adyacentes. Este factor

varía considerablemente en función de las propiedades fisiológicas de cada segmento

intestinal, de manera que el intestino más proximal, en el cual se produce la absorción

de nutrientes e iones, es más permeable que el intestino distal, el cual está sometido a

una mayor carga antigénica (Sleisenger & Fordtran, 2010). Esta “fuerza” de las TJ

viene determinada por las proteínas transmembrana que las componen. Entre ellas,

las claudinas desempeñan un papel esencial en la coordinación de la función de

barrera y en la señalización de las TJ, de manera que su expresión diferencial y sus

propiedades parecen determinar las variaciones específicas de cada epitelio en la

resistencia eléctrica y en la selectividad iónica paracelular (Van Itallie & Anderson,

2006). En el epitelio intestinal, la relevancia fisiopatológica de las claudinas ha sido

puesta de manifiesto recientemente gracias al hallazgo de alteraciones en la expresión

de varios miembros de esta familia de proteínas en el epitelio del colon de pacientes

con enfermedad inflamatoria intestinal (EII) demostrándose, además, la contribución

de estas alteraciones a la disfunción de la barrera epitelial (Prasad et al, 2005; Zeisig

et al, 2007). Nuestros resultados demuestran que la mucosa del yeyuno de los

pacientes con SII-D presenta alteraciones en la expresión del perfil de claudinas.

Concretamente, se observó una disminución de la expresión de mRNA de CLDN1 y

CLDN4, que forman parte del grupo de claudinas denominado “selladoras”, y de la

CLDN2, que forma parte del grupo de claudinas denominado “formadoras de canales”.

Por el contrario, la expresión proteica de CLDN2 estaba aumentada. Recientemente


se ha descrito la contribución de esta proteína a la permeabilidad paracelular a iones

de Na+ y de K+ en el intestino delgado de roedores (Tamura et al, 2011) y con su

implicación en la permeabilidad al agua descrita en células epiteliales de riñón

(Rosenthal et al, 2010). Todos estos resultados sugieren que las alteraciones en el

perfil de expresión de las claudinas podrían tener como consecuencia el aumento de la

permeabilidad a cationes proporcionando un soporte molecular potencialmente

involucrado en el origen de la diarrea crónica que caracteriza a estos pacientes, al

igual que se ha sugerido en los pacientes con EII (Prasad et al, 2005; Zeisig et al,

2007). Sin embargo, no podemos excluir la contribución de otros mecanismos, como

deficiencias en la absorción de agua o alteraciones en la función secretora, tal y como

se ha descrito previamente en respuesta a un estímulo de estrés, tanto agudo como

crónico (Santos et al, 1998; Santos et al, 2000; Alonso et al, 2008).

Además de las claudinas, existen otras proteínas que tienen un papel esencial en

la modulación de la integridad de las TJ. Estas proteínas incluyen la proteína integral

transmembrana ocludina y la familia de proteínas adaptadoras ZO, responsables de

conectar las proteínas transmembrana estructurales de las uniones intercelulares al

citoesqueleto de actina y miosina (Guillemot et al, 2008). Nuestro estudio no mostró

diferencias en la expresión de mRNA de ocludina, en consonancia con otros estudios

en la mucosa colónica de pacientes con SII (Piche et al, 2009; Coëffier et al, 2010).

Cabe destacar que, en el colon de pacientes con SII, se ha descrito una reducción de

la expresión proteica de ocludina como resultado del aumento en la actividad del

proteasoma (Coëffier et al, 2010). Sin embargo, nuestro estudio no ha confirmado este

resultado en la mucosa del intestino delgado, posiblemente debido a que los

mecanismos de regulación de la función de barrera difieren según el segmento

intestinal estudiado. Por otro lado, nuestros resultados confirmaron la disminución de

la expresión de ZO-1 identificada por microarrays, tanto en mRNA como en proteína.


Esta proteína tiene una especial relevancia para el SII, debido a que se ha demostrado

previamente que los cambios de expresión de ZO-1 se asocian con el aumento de la

permeabilidad intestinal y con la intensidad del dolor abdominal en el colon de

pacientes con SII (Zhou et al, 2009; Piche et al, 2009).

La modulación estructural y funcional de la barrera intestinal también puede

producirse a través de la endocitosis de las proteínas específicas de las TJ mediante

un mecanismo que depende del estímulo implicado (Utech et al, 2010). Se ha

demostrado que diversos estímulos pro-inflamatorios como el TNF-α y productos

bacterianos son capaces de inducir la internalización de ZO-1 y de ocludina a través

de un mecanismo de endocitosis mediado por la proteína caveolina junto con la

consiguiente pérdida de la función de barrera (Hopkins et al, 2003; Marchiando et al,

2010). Es importante destacar que, en nuestro estudio, la endocitosis mediada por

caveolina se identifica como la vía de señalización más significativa asociada al perfil

transcriptómico del SII-D. Por tanto, analizamos la localización subcelular de las

proteínas ZO-1 y ocludina mediante microscopía confocal. En el caso de ZO-1,

observamos su redistribución desde la membrana apical hacia el citoplasma

únicamente en las muestras de los pacientes con SII-D. Este efecto ha sido descrito

con anterioridad en células epiteliales del colon de ratones en respuesta a la

exposición al sobrenadante fecal de pacientes con SII-D (Gecse et al, 2008). En lo que

respecta a la ocludina, también observamos una redistribución de esta proteína hacia

el citoplasma en las muestras de los pacientes. Este resultado concuerda con la

disminución de la fosforilación específica de la ocludina en residuos de Ser y Thr

observada en los pacientes analizados en el presente trabajo, tal y como se ha

descrito en estudios previos (Sakakibara et al, 1997; Simonovic et al, 2000).

Por otro lado, el citoesqueleto de actina y miosina también juega un papel

fundamental en el mantenimiento de la integridad de la función de las TJ a través de la


fosforilación específica de la cadena ligera de la miosina (MLC). Nuestro estudio

identificó un aumento en la expresión de la kinasa de miosina (MLCK) y una reducción

en la expresión de la subunidad catalítica de la fosfatasa de miosina (PP1cδ) junto con

el consiguiente aumento de fosforilación de MLC. Estudios previos en ratones han

demostrado que la exposición al sobrenadante obtenido de biopsias de colon de

pacientes con SII provoca un aumento de la permeabilidad intestinal dependiente de la

fosforilación de MLC (Gecse et al, 2008). Por lo tanto, nuestros resultados podrían

ayudar a explicar el aumento de permeabilidad intestinal observada previamente en

estos pacientes.

A la luz de todos estos resultados nos planteamos evaluar si las alteraciones en

las diferentes proteínas analizadas podrían tener como consecuencia final una

alteración de la ultraestructura de las TJ y, consecuentemente, contribuir al aumento

de la permeabilidad intestinal observada en los pacientes de SII. Nuestros resultados

mostraron un incremento en la distancia paracelular de los enterocitos del epitelio

yeyunal en los pacientes con SII-D, presumiblemente, como consecuencia de la

alteración en la expresión y en la distribución de las proteínas estructurales de las TJ.

Además, la mayor proporción de uniones intercelulares con condensación del

citoesqueleto alrededor de las TJ observada en las muestras de SII-D, podría reflejar

la contracción del citoesqueleto de acto-miosina como consecuencia del aumento en la

fosforilación de MLC.

Los resultados presentados en esta tesis demuestran que la mucosa del yeyuno

de los pacientes con SII-D presenta alteraciones moleculares y estructurales de la

barrera epitelial que podrían tener implicaciones clínicas importantes para esta

enfermedad. De hecho, es importante destacar que las alteraciones en las proteínas

estructurales y reguladoras de las TJ descritas en este trabajo están asociadas a los

parámetros clínicos que definen al SII, de manera que podríamos especular que la


presencia de una disfunción epitelial persistente en estos pacientes podría aumentar el

paso de sustancias antigénicas a través de la barrera constituyendo un factor crítico en

el inicio y la exacerbación de los síntomas. Sin embargo, todavía no estamos en

posición de determinar si estas alteraciones de la barrera son causa o consecuencia

de la micro-inflamación mucosa observada en estos pacientes. Existen evidencias que

indican que el estrés puede alterar la barrera física y la vigilancia inmunológica del

epitelio intestinal, pudiendo iniciar, facilitar y perpetuar respuestas inmunológicas

defectuosas. En este sentido, resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio en

un modelo animal de estrés por aglomeración (Vicario et al, 2010; Vicario et al 2011)

nos permiten especular que el estrés podría ejercer como inductor primario de la

inflamación de la mucosa y, posteriormente, de la disfunción de la barrera intestinal.

Varios estudios han demostrado la habilidad de los mastocitos para modular la

barrera epitelial intestinal, a través de mediadores, principalmente citoquinas y

proteasas, liberados tras su activación (Jacob et al, 2005; Groschwitz et al, 2009; Lee

et al, 2010). Resultados previos en nuestro laboratorio han demostrado un aumento en

el número y en la activación de los mastocitos en el yeyuno de pacientes con SII-D

(Guilarte et al, 2007), lo cual se confirmó en la presente tesis mostrando, además, que

el aumento en la expresión de la proteasa específica del mastocito triptasa se asocia a

las manifestaciones clínicas del SII, concretamente a la frecuencia y a la consistencia

de las deposiciones. Pese a que no conocemos el mecanismo de activación de los

mastocitos en estos pacientes, los datos existentes en la literatura nos permiten

especular que el eje estrés-mastocito podría ser un factor esencial en la generación y

perpetuación de las alteraciones fisiopatológicas del SII-D (Santos et al, 1998; Santos

et al, 1999; Santos et al, 2001; Guilarte et al, 2004; Barreau et al, 2007; Vicario et al,

2010). Además, tanto el aumento de expresión de CLDN2 como la redistribución de

ocludina están asociados a la activación de los mastocitos y a la disfunción intestinal,


lo que sugiere que el mastocito desempeña un papel esencial en la alteración de la

integridad de la función de barrera intestinal que podría explicar los síntomas de los

pacientes con SII-D.

En resumen, esta tesis contribuye a implementar el conocimiento sobre la

patogénesis del SII-D demostrando que existen alteraciones en el perfil de expresión

génica en la mucosa del yeyuno de pacientes con SII-D. En particular, los resultados

de esta tesis ponen de manifiesto la importancia del mastocito como célula clave en la

iniciación y perpetuación de esta enfermedad a través de su implicación en la compleja

red de interacciones moleculares destinadas a regular la función de barrera del epitelio

intestinal y de su relación con las manifestaciones clínicas de esta enfermedad.

Conjuntamente, estos resultados cuestionan la visión clásica de esta enfermedad

como un modelo de trastorno funcional a la vez que refuerzan su filiación orgánica,

que se extiende más allá del colon para afectar también al intestino delgado.

CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS

CONCLUSIONES - 133 -

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral han dado lugar a las siguientes

conclusiones:

1. La mucosa del yeyuno de los pacientes con SII-D posee un perfil transcripcional

característico diferente al de individuos sanos. Este perfil está asociado a alteraciones

en vías de señalización y en funciones biológicas relacionadas con la modulación de la

permeabilidad intestinal a través de las uniones estrechas.

2. La mucosa del yeyuno de los pacientes con SII-D presenta alteraciones en la

expresión y en la distribución de proteínas estructurales y reguladoras de la función de

barrera del epitelio intestinal. Estas alteraciones moleculares comprometen la

integridad ultraestructural de las uniones estrechas.

3. La mucosa del yeyuno de los pacientes con SII-D presenta una hiperplasia y

activación mastocitaria que se correlaciona con la sintomatología de estos pacientes y

con alteraciones de las proteínas estructurales de las TJ.

4. Las manifestaciones clínicas del SII-D se asocian a la pérdida de la integridad

molecular de la barrera intestinal.

BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFÍÍAA

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6.

AANNEEXXOO

ANEXO - 149 -

ANEXO

9. SUPPLEMENTARY MATERIAL FROM CHAPTER 1

9.1. SUPPLEMENTARY METHODS

9.1.1. Microarray analysis


(Qiagen) followed by RNA isolation (RNeasy Mini Kit, Qiagen) and on-column DNase

treatment (Qiagen). Prior to gene array analysis, RNA quantity and quality were

confirmed by capillary electrophoresis (Agilent 2100 Bioanalyzer; Agilent

Technologies). Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133 Plus 2.0 arrays

(Affymetrix) were used for expression profiling, following general procedures. The

images were captured using Affymetrix Genechip Scanner 3000. The resulting images

were processed with Microarray Analysis Suite 5.0 (Affymetrix). Raw expression values

obtained directly from CEL files were pre-processed using the RMA (Robust Multi-chip

Average) method1. The complete dataset is available at the NCBI Gene Expression

Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; accession number GSE14841).

9.1.2. Statistical analysis of microarray data

For microarray data, we used the open source R statistical software package

(http://www.r-project.org) and the libraries developed by the Bioconductor Project

(www.bioconductor.org). Main methods and tools have been described by Gentleman

et al2. The selection of differentially expressed genes between conditions was based

on a linear model analysis with empirical Bayes moderation of the variance estimates3.

To control errors derived from multiple simultaneous testing (one per gene), P-values

were adjusted to obtain strong control over the “false discovery rate” (FDR) using the

Benjamini and Hochberg method4.

- 150 - ANEXO

To get further insight of the biological relevance of our findings and to discover

associations between different groups of variables, we performed an integrative

multivariate analysis based on a Multiple Factor Analysis (MFA)5,6 combining

microarray expression data and epidemiological, clinical and histological (ECH)

variables. The core of these methods is a principal component analysis (PCA) with

supplementary quantitative and qualitative variables, which reduces the dimensionality

of a dataset with a large number of interrelated variables into a smaller number of

independent variables called principal components. First principal component retains

as much as possible of the variability present in the data, and each succeeding

component retains as much of the remaining variability, but always less variability than

the previous component7. The integrative multivariate analysis disclosed two types of

PCA plots, the correlation circle, which includes the quantitative ECH variables; and

individual factor maps, with the categorical ECH variables. Both types of graphics show

the distribution of the data according to the same two axes representing the first and

second components obtained after PCA analysis.

9.1.3. Ingenuity pathway analysis (IPA)

For network analysis, IPA computed a score (p-score=-log10(p-value)) according to

the fit of the set of supplied focus genes and a list of biological functions stored in the

IPKB. The score takes into account the number of focus genes in the network and the

size of the network to approximate how relevant this network is to the original list of

focus genes and allows the networks to be prioritized for further studies. A score >3

(p<0.001) indicates a >99.9% confidence that a focus gene network was not generated

by chance alone. The network identified is presented as a graph indicating the

molecular relationships between genes/gene products.

ANEXO - 151 -

The functional analysis identified biological functions and canonical signaling

pathways most significant to the data set. The significance of the association between

the data set and functions/pathways was determined based on two parameters: (1)

ratio of the number of genes from the data set that map to the function/pathway divided

by the total number of genes that map to the function/pathway and (2) a P-value

calculated using Fischer’s exact test determining the probability that the association

between the dataset and the function/pathway is explained by chance alone.

9.2. Supplementary References

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normalization, and summaries of high density

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2. Gentleman R, Carey V, Huber W, et al.

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3. Smyth GK. Linear models and empirical bayes

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microarray experiments. Stat. Appl. Genet. Mol. Biol.

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4. Benjamini Y and Hochberg Y. Controlling the

false discovery rate: A practical and powerful approach

to multiple testing. J. Roy. Statist. Soc. B. 1995;85:289-

300.

5. Escofier B and Pagès J. Analyses factorielles

simples et multiples. Objetifs, methodes et interpretation.

3rd ed. Dunod; Paris, 1998.

6. Lê S, Josse J and Husson F. FactoMineR: An R

package for multivariate analysis. J. Stat. Softw.

2008;25:1-18.

7. Jolliffe IT. Principal Component Analysis. Second

Edition. Springer Series in Statistics. Springer-Verlag,

2002.

- 152 - ANEXO

9.2. SUPPLEMENTARY FIGURES AND TABLES

9.2.1. Supplementary table 1. Gene expression assays (GEA) used for Q-RT-PCR.

ANEXO - 153 -

9.

2.2.

Sup

plem

enta

ry ta

ble

2.In

divi

dual

cou

nts

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ucos

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9.2.

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HLA

-DQ

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Q8.

Hpf

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wer

fiel

d.

- 154 - ANEXO

9.2.3. Supplementary table 3. Differentially expressed transcripts in IBS-D patients

compared with the healthy volunteer (H) group. Entrez and Affymetrix accession number of

genes and their fold change expression in IBS-D with respect to H are indicated. P-values were

adjusted to obtain strong control over the “false discovery rate” (FDR) using the Benjamini and

Hochberg method.

EntrezID affyIDs Gene Symbol Fold Change P-Value FDR-adjusted P-Value

55269 226574_at PSPC1 1,87 0,000004 0,005 78993 229741_at MGC3260 1,89 0,000004 0,005 238918_at 0,54 0,000005 0,005 8125 201043_s_at ANP32A 0,28 0,000006 0,005 7531 210317_s_at YWHAE 0,34 0,000007 0,005 9877 243648_at ZC3H11A 2,81 0,00001 0,01 9685 230609_at CLINT1 0,51 0,00001 0,01 3191 35201_at HNRNPL 2,06 0,00002 0,01 1314 214336_s_at COPA 0,28 0,00002 0,01 85455 229579_s_at DISP2 2,22 0,00002 0,01 830 201237_at CAPZA2 1,68 0,00003 0,01 64787 222546_s_at EPS8L2 0,38 0,00003 0,01 1553575_at 2,19 0,00003 0,01 51582 213747_at AZIN1 0,42 0,00003 0,01 5878 201156_s_at RAB5C 0,52 0,00005 0,01 10611 211681_s_at PDLIM5 0,43 0,0001 0,01 3177 1560062_at SLC29A2 2,01 0,0001 0,01 659 231873_at BMPR2 0,57 0,0001 0,01 91304 213986_s_at C19orf6 0,42 0,0001 0,01 6564 207254_at SLC15A1 1,83 0,0001 0,01 23428 216604_s_at SLC7A8 0,47 0,0001 0,01 23516 1555434_a_at SLC39A14 0,35 0,0001 0,01 8289 210649_s_at ARID1A 0,57 0,0001 0,01 51322 219679_s_at WAC 0,53 0,0001 0,01 23060 1559401_a_at ZNF609 0,60 0,0001 0,01 229713_at 0,55 0,0001 0,01 1200 214196_s_at TPP1 0,56 0,0001 0,02 6734 200917_s_at SRPR 0,48 0,0001 0,02 212103_at 1,73 0,0001 0,02 228919_at 2,30 0,0001 0,02 57447 214279_s_at NDRG2 0,40 0,0001 0,02 5284 226147_s_at PIGR 1,65 0,0001 0,02 1636 209749_s_at ACE 0,47 0,0002 0,02 2017 227473_at CTTN 0,53 0,0002 0,02

ANEXO - 155 -

145376 237654_at C14orf50 1,66 0,0002 0,02 5911 225585_at RAP2A 1,49 0,0002 0,02 56993 222474_s_at TOMM22 1,65 0,0002 0,02 972 1567628_at CD74 0,46 0,0002 0,02 5343 238875_at PLGLB1 0,59 0,0002 0,02 221037 224933_s_at JMJD1C 0,54 0,0002 0,02 678 201367_s_at ZFP36L2 0,51 0,0002 0,02 29927 222385_x_at SEC61A1 0,49 0,0002 0,02 9039 1556338_at UBA3 0,60 0,0002 0,02 236219_at 1,74 0,0002 0,02 81688 213872_at C6orf62 0,49 0,0002 0,02 23117 211996_s_at LOC23117 1,89 0,0002 0,02 6654 229261_at SOS1 0,56 0,0002 0,02 84189 232176_at SLITRK6 1,66 0,0002 0,02 114876 208158_s_at OSBPL1A 1,58 0,0002 0,02 79064 220934_s_at MGC3196 1,82 0,0003 0,02 23196 1555945_s_at FAM120A 1,61 0,0003 0,02 10611 203242_s_at PDLIM5 0,55 0,0003 0,02 23389 216109_at MED13L 0,60 0,0003 0,02 4289 235067_at MKLN1 0,63 0,0003 0,02 9749 242277_at PHACTR2 0,57 0,0003 0,02 5725 212016_s_at PTBP1 0,58 0,0003 0,02 25791 243556_at NGEF 0,47 0,0003 0,02 5530 202425_x_at PPP3CA 1,52 0,0003 0,02 93010 1555963_x_at B3GNT7 1,74 0,0003 0,02 4094 209347_s_at MAF 0,45 0,0003 0,02 22906 226013_at TRAK1 1,59 0,0003 0,02 2130 229966_at EWSR1 1,88 0,0003 0,02 6687 230885_at SPG7 1,85 0,0003 0,02 8550 1561937_x_at MAPKAPK5 0,31 0,0003 0,02 240180_at 0,57 0,0004 0,02 4154 1556657_at MBNL1 0,61 0,0004 0,02 57224 231034_s_at NHSL1 0,57 0,0004 0,02 10611 216804_s_at PDLIM5 0,61 0,0004 0,02 10180 228030_at RBM6 0,57 0,0004 0,02 3191 202072_at HNRNPL 2,03 0,0004 0,02 2052 202017_at EPHX1 0,49 0,0004 0,02 9948 210935_s_at WDR1 0,39 0,0004 0,02 23185 228196_s_at LARP5 0,49 0,0004 0,02 23428 216603_at SLC7A8 0,53 0,0004 0,02 26027 1554938_a_at ACOT11 0,61 0,0004 0,02 3685 236251_at ITGAV 0,58 0,0004 0,02 811 214315_x_at CALR 0,66 0,0005 0,02 481 201243_s_at ATP1B1 1,60 0,0005 0,02

- 156 - ANEXO

93010 1555962_at B3GNT7 1,69 0,0005 0,02 2618 230097_at GART 0,63 0,0005 0,02 2150 206429_at F2RL1 0,53 0,0005 0,02 56995 218184_at TULP4 1,53 0,001 0,02 79683 219247_s_at ZDHHC14 1,54 0,001 0,02 682 208677_s_at BSG 0,51 0,001 0,02 2746 200947_s_at GLUD1 1,66 0,001 0,02 7422 211527_x_at VEGFA 0,63 0,001 0,02 85315 227626_at PAQR8 2,04 0,001 0,02 216908_x_at 0,63 0,001 0,02 7644 206059_at ZNF91 0,66 0,001 0,02 338 223579_s_at APOB 0,41 0,001 0,02 2065 1563253_s_at ERBB3 0,56 0,001 0,02 57234 227383_at FAM91A2 0,63 0,001 0,02 9112 211783_s_at MTA1 1,66 0,001 0,02 2934 214040_s_at GSN 0,55 0,001 0,02 3291 204130_at HSD11B2 1,83 0,001 0,02 244354_at 0,66 0,001 0,02 29881 224305_s_at NPC1L1 0,50 0,001 0,02 4170 200796_s_at MCL1 0,40 0,001 0,02 51133 241903_at KCTD3 0,64 0,001 0,02 1495 1558214_s_at CTNNA1 0,43 0,001 0,02 55258 219044_at THNSL2 2,30 0,001 0,02 243386_at 1,56 0,001 0,02 7086 208699_x_at TKT 0,62 0,001 0,02 89866 1564423_a_at SEC16B 0,51 0,001 0,02 92482 228993_s_at LOC92482 0,57 0,001 0,03 7798 1558173_a_at LUZP1 1,92 0,001 0,03 5284 229659_s_at PIGR 0,51 0,001 0,03 6428 232392_at SFRS3 0,64 0,001 0,03 236685_at 0,66 0,001 0,03 90187 228307_at EMILIN3 0,57 0,001 0,03 220494_s_at 0,62 0,001 0,03 6822 206292_s_at SULT2A1 0,53 0,001 0,03 55684 225377_at C9orf86 1,80 0,001 0,03 10944 235526_at C11orf58 0,63 0,001 0,03 158405 235112_at KIAA1958 0,64 0,001 0,03 231174_s_at 0,53 0,001 0,03 26137 237803_x_at ZBTB20 0,57 0,001 0,03 55500 231576_at ETNK1 0,45 0,001 0,03 5870 239445_at RAB6A 0,60 0,001 0,03 55122 223144_s_at C6orf166 1,51 0,001 0,03 57466 243759_at SFRS15 0,59 0,001 0,03 153222 225956_at C5orf41 0,65 0,001 0,03

ANEXO - 157 -

57019 208424_s_at CIAPIN1 1,53 0,001 0,03 8566 218019_s_at PDXK 1,55 0,001 0,03 5527 1557718_at PPP2R5C 0,63 0,001 0,03 283991 224785_at FAM100B 0,63 0,001 0,03 51090 204519_s_at PLLP 1,52 0,001 0,03 283131 238320_at TncRNA 0,30 0,001 0,03 645166 228158_at LOC645166 1,82 0,001 0,03 10370 207980_s_at CITED2 0,59 0,001 0,03 7039 205016_at TGFA 1,55 0,001 0,03 166647 1569542_at GPR125 0,59 0,001 0,03 92 244332_at ACVR2A 0,64 0,001 0,03 5074 204004_at PAWR 0,70 0,001 0,03 148867 243524_at SLC30A7 0,66 0,001 0,03 916 205456_at CD3E 0,61 0,001 0,03 7072 1558922_at TIA1 0,65 0,001 0,03 6431 206108_s_at SFRS6 2,83 0,001 0,03 9520 201454_s_at NPEPPS 1,49 0,001 0,03 64163 214801_at IFRG15 1,44 0,001 0,03 5734 204896_s_at PTGER4 0,54 0,001 0,03 243495_s_at 0,37 0,001 0,03 4008 242722_at LMO7 1,67 0,001 0,03 5286 1553694_a_at PIK3C2A 0,55 0,001 0,03 7082 243184_at TJP1 0,64 0,001 0,03 800 201616_s_at CALD1 0,65 0,001 0,03 29035 225197_at C16orf72 1,47 0,001 0,03 51312 226179_at SLC25A37 2,22 0,001 0,03 238956_at 1,60 0,001 0,03 167153 238706_at PAPD4 0,63 0,001 0,03 164091 242123_at PAQR7 1,82 0,001 0,03 2055 223912_s_at CLN8 0,63 0,001 0,03 5286 226094_at PIK3C2A 0,67 0,001 0,03 84364 238161_at ARFGAP2 0,61 0,001 0,03 10682 202735_at EBP 1,53 0,001 0,03 6238 201206_s_at RRBP1 1,66 0,001 0,03 54897 232699_at CASZ1 1,74 0,001 0,03 56894 224282_s_at AGPAT3 0,56 0,001 0,03 6446 201739_at SGK1 2,01 0,001 0,03 79148 239272_at MMP28 1,84 0,001 0,03 10055 1555618_s_at SAE1 0,63 0,001 0,03 57599 222157_s_at WDR48 0,63 0,001 0,03 10613 202444_s_at ERLIN1 0,59 0,001 0,03 23543 213901_x_at RBM9 0,59 0,001 0,03 54896 1555781_at PQLC2 1,67 0,001 0,03 1778 229115_at DYNC1H1 1,88 0,001 0,03

- 158 - ANEXO

55970 222834_s_at GNG12 1,82 0,001 0,03 9927 216205_s_at MFN2 0,49 0,001 0,03 26118 227501_at WSB1 0,59 0,001 0,03 6314 209964_s_at ATXN7 0,65 0,001 0,03 80736 1555203_s_at SLC44A4 0,43 0,001 0,03 143098 238778_at MPP7 1,49 0,001 0,03 7586 214670_at ZKSCAN1 0,68 0,001 0,03 378938 224567_x_at MALAT1 1,83 0,001 0,03 54584 226204_at GNB1L 1,55 0,001 0,03 10097 1558015_s_at ACTR2 0,45 0,001 0,03 440556 242269_at FLJ42875 1,61 0,001 0,03 567 232311_at B2M 1,57 0,001 0,03 54904 242968_at WHSC1L1 0,63 0,001 0,03 3954 222006_at LETM1 1,53 0,001 0,03 85315 226423_at PAQR8 1,65 0,001 0,03 647305 1566472_s_at LOC647305 0,63 0,002 0,03 64398 219321_at MPP5 0,68 0,002 0,03 1455 202573_at CSNK1G2 1,51 0,002 0,03 93589 228083_at CACNA2D4 1,59 0,002 0,03 3172 236652_at HNF4A 2,39 0,002 0,03 25945 241970_at PVRL3 0,59 0,002 0,03 4149 210734_x_at MAX 0,64 0,002 0,03 4076 200722_s_at CAPRIN1 0,59 0,002 0,03 116138 214383_x_at KLHDC3 0,65 0,002 0,03 8490 1555725_a_at RGS5 0,54 0,002 0,03 23043 213109_at TNIK 1,55 0,002 0,03 9589 227621_at WTAP 0,67 0,002 0,03 9223 225465_at MAGI1 1,71 0,002 0,03 988 209055_s_at CDC5L 0,66 0,002 0,03 22978 243158_at NT5C2 0,63 0,002 0,03 23554 230626_at TSPAN12 1,65 0,002 0,03 54665 222791_at RSBN1 0,65 0,002 0,03 232527_at 0,68 0,002 0,03 10207 223681_s_at INADL 1,43 0,002 0,03 2113 241435_at ETS1 0,65 0,002 0,03 253260 237330_at RICTOR 0,65 0,002 0,03 55502 226446_at HES6 1,46 0,002 0,03 3998 203294_s_at LMAN1 0,50 0,002 0,03 2528 211885_x_at FUT6 0,62 0,002 0,03 6934 232522_at TCF7L2 0,68 0,002 0,03 122970 229534_at ACOT4 1,79 0,002 0,03 535 205095_s_at ATP6V0A1 0,64 0,002 0,03 1942 202023_at EFNA1 0,65 0,002 0,03 9522 212417_at SCAMP1 1,66 0,002 0,03

ANEXO - 159 -

80704 220736_at SLC19A3 0,56 0,002 0,03 230795_at 0,59 0,002 0,03 124975 236225_at GGT6 1,71 0,002 0,03 60313 1569320_at GPBP1L1 0,66 0,002 0,03 9414 232017_at TJP2 0,64 0,002 0,03 3183 200751_s_at HNRNPC 0,66 0,002 0,03 11252 1554691_a_at PACSIN2 0,61 0,002 0,03 10963 212009_s_at STIP1 0,57 0,002 0,03 7422 210513_s_at VEGFA 0,66 0,002 0,03 665 221479_s_at BNIP3L 1,49 0,002 0,03 2063 209261_s_at NR2F6 0,65 0,002 0,03 57466 222311_s_at SFRS15 0,69 0,002 0,03 4077 201383_s_at NBR1 0,64 0,002 0,03 4901 242993_at NRL 1,74 0,002 0,03 54700 216902_s_at RRN3 0,57 0,002 0,03 11309 211557_x_at SLCO2B1 0,69 0,002 0,03 1499 1554411_at CTNNB1 2,20 0,002 0,03 401466 1555241_at C8orf59 1,51 0,002 0,03 10204 202397_at NUTF2 1,46 0,002 0,03 401261 1559964_at FLJ38717 0,67 0,002 0,04 55608 227260_at ANKRD10 0,51 0,002 0,04 10299 201737_s_at MARCH6 0,67 0,002 0,04 57556 215028_at SEMA6A 0,50 0,002 0,04 360 39249_at AQP3 0,66 0,002 0,04 4012 231866_at LNPEP 0,65 0,002 0,04 9058 239805_at SLC13A2 1,65 0,002 0,04 56994 1559739_at CHPT1 0,66 0,002 0,04 116540 225523_at MRPL53 1,43 0,002 0,04 4116 210092_at MAGOH 0,65 0,002 0,04 284443 1558486_at ZNF493 0,64 0,002 0,04 1499 201533_at CTNNB1 1,46 0,002 0,04 84934 44065_at C12orf52 1,57 0,002 0,04 202915 1558281_a_at TMEM184A 1,91 0,002 0,04 84062 223446_s_at DTNBP1 0,68 0,003 0,04 232325_at 1,53 0,003 0,04 84134 226059_at TOMM40L 1,52 0,003 0,04 6934 233689_at TCF7L2 0,65 0,003 0,04 3958 1557197_a_at LGALS3 2,22 0,003 0,04 7559 1559881_s_at ZNF12 0,71 0,003 0,04 79085 226010_at SLC25A23 1,55 0,003 0,04 2530 203988_s_at FUT8 1,58 0,003 0,04 8675 1558249_s_at STX16 0,68 0,003 0,04 4486 205455_at MST1R 1,59 0,003 0,04 213549_at 1,55 0,003 0,04

- 160 - ANEXO

9121 206600_s_at SLC16A5 1,61 0,003 0,04 9245 219508_at GCNT3 1,54 0,003 0,04 643854 215549_x_at hCG_2030429 0,66 0,003 0,04 9910 232702_at RABGAP1L 0,64 0,003 0,04 5878 201140_s_at RAB5C 0,63 0,003 0,04 230958_s_at 0,64 0,003 0,04 4299 237006_at AFF1 0,67 0,003 0,04 51099 213805_at ABHD5 0,52 0,003 0,04 9554 214257_s_at SEC22B 0,66 0,003 0,04 3557 212657_s_at IL1RN 1,91 0,003 0,04 8792 238846_at TNFRSF11A 1,55 0,003 0,04 5887 201222_s_at RAD23B 0,60 0,003 0,04 1398 202226_s_at CRK 0,67 0,003 0,04 6668 235282_at SP2 1,48 0,003 0,04 9099 229337_at USP2 1,54 0,003 0,04 8773 229773_at SNAP23 0,59 0,003 0,04 8543 209205_s_at LMO4 1,59 0,003 0,04 114793 226184_at FMNL2 1,61 0,003 0,04 227959_at 1,61 0,003 0,04 378938 226675_s_at MALAT1 1,72 0,003 0,04 6240 201476_s_at RRM1 0,61 0,003 0,04 55500 242059_at ETNK1 0,55 0,003 0,04 10097 1554390_s_at ACTR2 0,56 0,003 0,04 10746 221695_s_at MAP3K2 0,67 0,003 0,04 843 205467_at CASP10 1,42 0,003 0,04 1558236_at 1,53 0,003 0,04 56882 229120_s_at CDC42SE1 1,41 0,003 0,04 54530 1564164_at C1orf218 0,66 0,003 0,04 5795 227396_at PTPRJ 1,45 0,003 0,04 10390 219375_at CEPT1 1,41 0,003 0,04 51107 1554417_s_at APH1A 0,65 0,003 0,04 255743 244747_at NPNT 0,64 0,003 0,04 158158 1553986_at RASEF 0,60 0,003 0,04 80351 222562_s_at TNKS2 0,67 0,003 0,04 51554 220351_at CCRL1 1,59 0,003 0,04 228478_at 0,65 0,003 0,04 81611 229128_s_at ANP32E 0,48 0,003 0,04 27086 241993_x_at FOXP1 0,68 0,003 0,04 120 201753_s_at ADD3 0,63 0,003 0,04 55331 222689_at PHCA 1,47 0,003 0,04 55696 222527_s_at RBM22 0,69 0,003 0,04 10144 232628_at FAM13A1 0,61 0,004 0,04 116224 241948_at FAM122A 0,65 0,004 0,04 284266 215856_at SIGLEC15 1,83 0,004 0,04

ANEXO - 161 -

5030 242337_at P2RY4 1,80 0,004 0,04 232687_at 0,59 0,004 0,04 286077 226129_at FAM83H 1,55 0,004 0,04 5757 211921_x_at PTMA 1,48 0,004 0,04 2195 201579_at FAT 1,43 0,004 0,04 2355 228188_at FOSL2 1,47 0,004 0,04 8490 209071_s_at RGS5 0,67 0,004 0,04 4035 200785_s_at LRP1 1,47 0,004 0,04 8490 209070_s_at RGS5 0,64 0,004 0,04 4924 200646_s_at NUCB1 0,66 0,004 0,04 80704 239345_at SLC19A3 0,65 0,004 0,04 130399 1552519_at ACVR1C 0,65 0,004 0,04 6654 212777_at SOS1 0,59 0,004 0,04 6713 213577_at SQLE 1,45 0,004 0,04 27086 223287_s_at FOXP1 0,68 0,004 0,05 64062 218422_s_at RBM26 1,55 0,004 0,05 23288 204202_at IQCE 1,61 0,004 0,05 22820 217749_at COPG 1,41 0,004 0,05 1906 218995_s_at EDN1 0,65 0,004 0,05 7011 205727_at TEP1 1,57 0,004 0,05 378805 238619_at FLJ43663 0,71 0,004 0,05 23022 200906_s_at PALLD 1,59 0,004 0,05 10548 209149_s_at TM9SF1 0,67 0,004 0,05 6822 206293_at SULT2A1 0,61 0,004 0,05 3309 230031_at HSPA5 1,59 0,004 0,05 64771 217924_at C6orf106 0,66 0,004 0,05 51201 222731_at ZDHHC2 1,83 0,004 0,05 144871 225284_at LOC144871 1,38 0,004 0,05 6667 1553685_s_at SP1 0,55 0,004 0,05 1139 210123_s_at CHRNA7 0,66 0,004 0,05 50809 220633_s_at HP1BP3 0,71 0,004 0,05 152485 226764_at ZNF827 1,91 0,004 0,05 55893 239619_at ZNF395 0,66 0,004 0,05 3703 202223_at STT3A 1,60 0,004 0,05 10521 230180_at DDX17 1,73 0,004 0,05 375 208750_s_at ARF1 0,62 0,004 0,05 4641 32811_at MYO1C 1,43 0,004 0,05 3437 204747_at IFIT3 0,68 0,004 0,05 4967 1554152_a_at OGDH 0,49 0,004 0,05 9414 1565863_at TJP2 0,59 0,004 0,05 58480 223169_s_at RHOU 0,66 0,004 0,05 8106 201545_s_at PABPN1 1,56 0,004 0,05 5500 228222_at PPP1CB 0,64 0,004 0,05 55500 226432_at ETNK1 0,66 0,004 0,05

- 162 - ANEXO

9331 235333_at B4GALT6 1,44 0,005 0,05 84542 243539_at KIAA1841 1,39 0,005 0,05 441454 208549_x_at LOC441454 1,45 0,005 0,05 10097 200727_s_at ACTR2 0,55 0,005 0,05 4735 1554747_a_at SEPT2 0,64 0,005 0,05 84759 210023_s_at PCGF1 0,71 0,005 0,05 3326 1557910_at HSP90AB1 0,55 0,005 0,05 56894 219723_x_at AGPAT3 0,66 0,005 0,05 5692 228204_at PSMB4 0,71 0,005 0,05 1739 217208_s_at DLG1 0,57 0,005 0,05 3685 232797_at ITGAV 0,66 0,005 0,05 2309 204132_s_at FOXO3 0,70 0,005 0,05 378938 228582_x_at MALAT1 0,47 0,005 0,05 7775 219123_at ZNF232 1,49 0,005 0,05 23112 230779_at TNRC6B 0,65 0,005 0,05 23389 238883_at MED13L 0,70 0,005 0,05 1564077_at 0,64 0,005 0,05 2935 240452_at GSPT1 0,68 0,005 0,05 227576_at 0,69 0,005 0,05 79109 229846_s_at MAPKAP1 0,66 0,005 0,05 3709 216614_at ITPR2 0,66 0,005 0,05 114224 223797_at PRO2852 0,69 0,005 0,05 26578 204479_at OSTF1 1,52 0,005 0,05 29894 201639_s_at CPSF1 1,59 0,005 0,05 5880 207419_s_at RAC2 0,63 0,005 0,05 2872 223199_at MKNK2 1,51 0,005 0,05 55333 235722_at SYNJ2BP 1,46 0,01 0,05 7837 212013_at PXDN 1,72 0,01 0,05 171586 241940_at ABHD3 0,64 0,01 0,05 51274 225140_at KLF3 0,61 0,01 0,05 56882 218157_x_at CDC42SE1 1,41 0,01 0,05 5757 200772_x_at PTMA 1,49 0,01 0,05 3643 226216_at INSR 1,53 0,01 0,05 523 201971_s_at ATP6V1A 0,58 0,01 0,05 11325 1559954_s_at DDX42 0,57 0,01 0,05 51290 226422_at ERGIC2 1,40 0,01 0,05 55847 218597_s_at CISD1 1,56 0,01 0,05

ANEXO - 163 -

9.2.4. Supplementary Figure 1. Quantitative real time PCR validation of microarray data.

Level of expression for 14 randomly selected genes (7 up-regulated and 7 down-regulated) was

measured in 12 healthy volunteers and 17 IBS-D patients. Randomization was performed using

a standard random number generator (a linear congruential generator was used to generate

uniform random values, followed by a transformation to obtain integer values in a set with the

same size as the number of genes). *P<0.05.

- 164 - ANEXO

9.2.5. Supplementary table 4. All networks identified associated to the IBS-D

transcripcional profile Network IDs are assigned based on the network score. The network

score is based on the hypergeometric distribution and is calculated with the right-tailed Fisher’s

Exact Test. The number of focus genes in each network is also indicated. The three most

significant functions for each network are also listed.

ID Genes in Network Score Focus Genes

Top Functions

1 Actin, ANP32A, BNIP3L, CASP10, Caspase, CD74, Coup-Tf, DYNC1H1, EPS8L2, F2RL1, FOXO3, Glycogen synthase, GSN, GSPT1, hCG, HNRNPC, HNRNPL, HSD11B2, KLF3, LETM1, MCL1, NFkB (complex), NR2F6, PAWR, peptidase, PP2A, PPP2R5C, PTBP1, RAB6A, Rxr, SGK1, SP1, SULT2A1, TPP1, WTAP

44 26 Cell Death, Immunological Disease, Digestive System Development

2 Akt, Alpha Actinin, APOB, BSG, Calcineurin protein(s), CALD1, Calmodulin, CALR, CaMKII, CD3E, CHRNA7, CTNNA1, CTNNB1, DDX17, DLG1, F Actin, GPR125, Guk, Hsp90, HSP90AB1, IKK, INADL (includes EG:10207), LMO7, MAGI1, MPP5, MPP7, MST1R, PALLD, PPP3CA, Proteasome, STIP1, TCF7L2 (includes EG:6934), TIA1, TJP1, TJP2

40 25 Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Cellular Assembly and Organization, Cellular Function and Maintenance

3 ACVR2A, AQP3, B2M, C12ORF52, Creb, Cyclin A, E2f, ERBB3, ERK1/2, FSH, Histone h3, Histone h4, HNF4A, IFIT3, IL1RN, Insulin, LDL, LNPEP, Mapk, MRPL53, NDRG2, PDXK, Pka, Pkc(s), Pld, RAB5C, RBM6, RGS5, SAE1, SCAMP1, SLC19A3, SNAP23, TNKS2, Vegf, WDR1

32 21 Digestive System Development and Function, Inflammatory Disease, Cellular Assembly and Organization

4 BMPR2, CD3, CK1, Collagen(s), CRK, CSNK1G2, EFNA1, ERK, FOSL2, growth factor receptor, Ige, Integrin, ITGAV, Laminin, LGALS3, LMO4, MAP3K2, Mek, MFN2, MHC Class I, MKNK2, MTA1, OGDH, Pdgfr, PHACTR2, PTGER4, PTPRJ, Rap1, Ras, Ras homolog, Sos, SOS1, TCR, TGFA, TNFRSF11A

28 19 Cell Morphology, Tissue Morphology, Cellular Development

5 14-3-3, ACTR2, AMPK, ARF1, Ck2, COP I, COPA, COPG, Hsp70, IFN Beta, IL12, INSR, Interferon alpha, Jnk, LRP1, MAX, NUTF2, PI3K, PIK3C2A, PPP1CB, PSPC1, PTMA, RAD23B, RAP2A, RNA polymerase II, RRM1, Shc, STAT, STAT5a/b, SYNJ2BP, TNIK, tyrosine kinase, UBA3, Ubiquitin, YWHAE

28 19 Lipid Metabolism, Molecular Transport, Small Molecule Biochemistry

ANEXO - 165 -

6 AGTR1, CAPZA2, CHPT1, EGFR, EWSR1, FUT8, G3BP2, GART, GPBP1L1, Hd-neuronal intranuclear inclusions, JMJD1C, KCTD3, MED13L, MIRN101B, MVK, NFYB, POLR1C, POU4F1, PVRL3, RRN3, SCAMP1, SFRS3, SFRS15, SNAPC1, STX16, TAF13, TAF1A, TAF1B, TAF1C, TBP, TEP1, TFAP4, TP53, TULP4, TWISTNB

23 17 Gene Expression, Cancer, Neurological Disease

7 APH1A (includes EG:51107), C6ORF62, C9ORF86, CDC5L, CISD1, ERLIN1, FASTKD2, GNB1L, HNF4A, MAGOH, MDFI (includes EG:4188), MIRN199A1, MRTO4, NAT13, NDUFA7, NPEPPS, NUDT11, PAN2 (includes EG:9924), PHPT1, PRCC, PRKAB1, REXO2, SEC61A1, SP2, SPG7, STT3A, TRAF6, UFM1, USP2, USP30, USP36, USP46, WBSCR22, WDR42A, ZNF764

20 15 RNA Damage and Repair, Cellular Development, Lipid Metabolism

8 ACVR2A, AKIRIN2, ANKRD10, ATXN1, AZIN1, BNIP3L, C5ORF41, CNBP, DDX42, DLGAP4, EMILIN3, FAM100B, FAM120A, HNRNPH1, MAT2A, MIRN339, MIRN17 (includes EG:406952), MIRN181A1, MIRN212 (includes EG:406994), MIRN291A (includes EG:100049715), MIRN298 (includes EG:723832), MIRN301A (includes EG:407027), MIRNLET7D (includes EG:406886), MNT, PABPN1, PAPOLG, PAQR8, RBM9, RICS, SLC2A1, TCOF1, TSPAN12, UBE3A, VAMP2, ZNF609

20 15 RNA Post-Transcriptional Modification, Developmental Disorder, Embryonic Development

9 ACE, ADD3, ALP, Ap1, CTTN, Dynamin, EDN1, ETS1, Fgf, GART, Hsp27, IgG, IL1, IRS, MAF, MAPKAPK5, Mmp, MMP28, Nfat, NGEF, NRL, P38 MAPK, PACSIN2, Pak, Pdgf, PDGF BB, PLA2, PLC gamma, Rac, RAC2, RHOU, Smad2/3, Tgf beta, TOMM22, VEGFA

20 16 Organismal Development, Cardiovascular System Development and Function, Skeletal and Muscular System Development and Function

10

ACVRL1, AHNAK, amino acids, ANGPTL4, BDKRB1, Ca2+, CAPRIN1, CDC42SE1, CFTR, CITED2, CLINT1, CNN3, COG7, FUT6, GLUD1, KLF16, LMAN1, MAPK6, MCFD2, P2RY4, PDLIM5, PDX1 (includes EG:3651), PHCA, PINK1, PRSS3 (includes EG:5646), PTPRK, RABGAP1L, RCN1, S100G, SLC39A14, SRPK1, STAT4, TGFB1, WHSC1L1, ZFP36L2

19 14 Amino Acid Metabolism, Post-Translational Modification, Small Molecule Biochemistry

11

ACVR1C, APOD, ATP12A, ATP1B1, BAZ1A, beta-estradiol, cholesterol, CNN1, DHX8, dihydrotestosterone, EPHX1, GNS, GPR172B, HES6, HOXA9, HSD17B2, MBNL1, MSMB, NCOA4, NPC1L1, OSTF1, PAQR7, PTPRG, PXDN, RRBP1, SLC25A37, SLC7A8, SMAD2, SRC, ST5, TGFBR3, TMF1, Type I Receptor, WSB1, ZNF91

19 14 Drug Metabolism, Endocrine System Development and Function, Lipid Metabolism

- 166 - ANEXO

12

ADIPOR1, ANGPTL4, ARPC3, ATP5G2, BPGM, CFL2, D-glucose, GAPDH (includes EG:14433), GH1, GRB2, GYS1, GYS2, INS1, LCK, LEP, LTA4H, LUZP1, MAFA, MIRN373, MYO1C, NDRG2, SEPT2, SLC13A2, SLC15A1, SLC25A11, SLC25A23, SLC29A2, SLC37A4, SLCO2B1, SRPR, steroid, THNSL2, TKT, WDR1, WDR48

19 14 Endocrine System Development and Function, Lipid Metabolism, Small Molecule Biochemistry

13

ANP32A, ANP32E, ASGR1, ASGR2, CPSF1, DNAJ, DTNBP1 (includes EG:84062), ERN2, EVL, FOS, FOXP1, GCNT3, GTF2E1, HNF1A, HSPA5, HTT, LIPA, MIRN341, MIRN195 (includes EG:406971), MIRN300 (includes EG:723833), NBR1, NCK1, NQO1, NR1D1, PLLP, PRKCB, RBM26, RNASEN, SEL1L, SEMA6A, SNX3, SYMPK, TBCA, ZBTB20, ZNF827

17 13 Embryonic Development, Tissue Development, Gastrointestinal Disease

14

ABHD5, ACAA2, AGPAT3, ATP6, ATP5C1, ATP5D, ATP5G2, ATP5G3, ATP5O, ATP6V0A1, ATP6V0C, ATP6V0D2, ATP6V1A, ATP6V1C2, ATP6V1D, ATP6V1E1, ATP6V1F, ATP6V1G1, ATP6V1G3, ATP6V1H, C11ORF58, C16ORF72, EBP, ERBB2, FAM83H, H+-transporting two-sector ATPase, KLHDC3, LARP5, MIRN124, MIRN122 (includes EG:406906), NPNT, PGM1, SLC30A7, TCIRG1, YBX2

15 12 Molecular Transport, DNA Replication, Recombination, and Repair, Energy Production

15

ABCC2, Adaptor protein 1, B4GALT6, BDKRB2, CCL9, CCL19, CCL21, CCL25, CCL27, CCRL1, CIAPIN1, CXCL5, CXCL13, CYLD, FAT1, GNB4, GNG12, HLA-F, inosine, IRF3, LBP, LTB, MARCH6, nicotinic acid, NOS3, NT5C2, PIGR, SEC22B, SLC12A6, SLC16A5, SQLE, TFAP2C, TNF, ZDHHC2

15 12 Antigen Presentation, Hematological System Development and Function, Tissue Morphology

16

AFF1, butyric acid, CDC2L1 (includes EG:984), CEPT1, CLK1, CRKRS, EFTUD2, GAPDH (includes EG:14433), Ggt, GGT6, HADHB, HIST2H4A, HTATIP2, ITPR2, MAPKAP1, MKLN1, MYC, NUCB1, PCBP2, PNN, POLR1B, POLR2A, PRPF6, RNGTT, RNPS1, SFRS2, SFRS4, SFRS6, SFRS9, SFRS11, SRPK1, TNRC6B, TRAK1, UBQLN4, WAC

13 11 RNA Post-Transcriptional Modification, Cancer, Respiratory Disease

17

ARID1A, ARNT, ARNT2, ATXN7, BCL6, CASP7, CCND1, CD40LG, CDKN1A, EGFR, EP300, EPO, GATA2, HDAC1, HDAC2, HDAC7, IL5, IL10, JUN, NCOR1, NCOR2, NR3C1, OSBPL1A, PML, SIM1, SIN3A, SIRT1, SMAD3, SMARCD2, SP1, SP100, TGFB1, TP53, ZBTB16, ZDHHC14

4 5 Gene Expression, Cellular Development, Cellular Growth and Proliferation

ANEXO - 167 -

9.2.6. Supplementary table 5. Identified canonical pathways associated to the IBS-D

transcripcional profile. * Ratio: number of genes in the analysis that are associated with the

canonical pathway divided by the total number of genes that map to the canonical pathway. The

genes from the input data set that belong to each canonical pathway are also indicated.

Canonical Pathways P-value Ratio* Genes

Caveolar-mediated Endocytosis 0,0002 8,54E-02 B2M, RAB5C, COPA (includes EG:1314), ITGAV,

INSR, MAP3K2, COPG

Tight Junction Signaling 0,0006 5,49E-02 TJP2, PPP2R5C, MPP5, TJP1, PVRL3, CTNNA1,

CPSF1, INADL, CTNNB1

PTEN Signaling 0,0008 6,67E-02 RAC2, MAGI1, SOS1, FOXO3, BMPR2, INSR,

TNFRSF11A

Ephrin Receptor Signaling 0,002 4,62E-02 VEGFA, RAC2, ACTR2, NGEF, SOS1, CRK,

GNB1L, GNG12, EFNA1

ERK/MAPK Signaling 0,003 4,69E-02 ETS1, RAC2, PPP2R5C, PIK3C2A, SOS1,

MAPKAPK5, PPP1CB, CRK, MKNK2

Integrin Signaling 0,004 4,43E-02 RAC2, ACTR2, ARF1, PIK3C2A, SOS1, ITGAV,

RHOU, PPP1CB, RAP2A

Role of NFAT in Regulation of the Immune

Response 0,008 4,17E-02

CD3E, PIK3C2A, CSNK1G2, ITPR2, SOS1,

GNB1L, GNG12, PPP3CA

TGF-β Signaling 0,01 5,81E-02 SOS1, BMPR2, HNF4A, ACVR1C, ACVR2A

Regulation of Actin-based Motility by Rho 0,01 5,38E-02 RAC2, ACTR2, RHOU, PPP1CB, GSN

PI3K/AKT Signaling 0,01 4,38E-02 PPP2R5C, YWHAE, HSP90AB1, SOS1, FOXO3,

CTNNB1

VEGF Signaling 0,02 5,15E-02 VEGFA, YWHAE, PIK3C2A, SOS1, FOXO3

SAPK/JNK Signaling 0,02 5,21E-02 RAC2, PIK3C2A, SOS1, CRK, MAP3K2

PPAR Signaling 0,02 4,90E-02 HSP90AB1, IL1RN, SOS1, INSR, CITED2

- 168 - ANEXO

Antigen Presentation Pathway 0,02 7,69E-02 B2M, CALR, CD74

Axonal Guidance Signaling 0,02 2,97E-02

VEGFA, RAC2, ACTR2, NGEF, PIK3C2A, SOS1,

SEMA6A, CRK, GNB1L, GNG12, PPP3CA,

EFNA1

GM-CSF Signaling 0,02 5,97E-02 ETS1, PIK3C2A, SOS1, PPP3CA

Actin Cytoskeleton Signaling 0,02 3,38E-02 RAC2, ACTR2, PIK3C2A, SOS1, PPP1CB, CRK,

GSN, GNG12

Leukocyte Extravasation Signaling 0,03 3,59E-02 RAC2, MMP28, PIK3C2A, CTNNA1, CRK,

CTNNB1, CTTN

NF-κB Signaling 0,03 4,00E-02 PIK3C2A, IL1RN, TGFA, BMPR2, INSR,

TNFRSF11A

B Cell Receptor Signaling 0,04 3,87E-02 ETS1, RAC2, PIK3C2A, SOS1, PPP3CA,

MAP3K2

Clathrin-mediated Endocytosis 0,04 3,59E-02 VEGFA, ACTR2, PIK3C2A, RAB5C, CTTN,

PPP3CA

CD28 Signaling in T Helper Cells 0,04 4,00E-02 ACTR2, CD3E, PIK3C2A, ITPR2, PPP3CA

CCR3 Signaling in Eosinophils 0,04 4,13E-02 PIK3C2A, ITPR2, PPP1CB, GNB1L, GNG12

EGF Signaling 0,05 5,77E-02 PIK3C2A, ITPR2, SOS1

ANEXO - 169 -

9.2.7. Supplementary table 6. Coordinates for selected genes from the integrative

multivariate analysis. Genes that show a correlation >0.8 for component 1 in the correlations

circle and were selected for further analysis using IPA.

Gene Name Component 1 Component 2 238918_at 0.9 0.3 ANP32A 1.0 0.0 CLINT1 0.8 0.4 COPA 1.0 0.1

EPS8L2 0.8 0.4 RAB5C 0.9 0.0 C19orf6 0.9 0.3 SLC7A8 0.9 0.2 ARID1A 0.9 0.1

WAC 1.0 0.0 TPP1 0.9 0.2 SRPR 0.9 0.1

NDRG2 0.9 0.2 229261_at 0.9 0.0

MKLN1 0.9 0.1 PTBP1 0.9 0.4 NGEF 0.9 0.2

240180_at 0.9 0.2 WDR1 0.9 0.1

ACOT11 0.9 0.2 VEGFA 0.9 0.4

LOC730092 0.9 0.0 ZNF91 0.8 0.5 ERBB3 0.9 0.3

GSN 0.9 0.1 244354_at 0.9 0.1 NPC1L1 0.9 0.1

MCL1 0.9 0.1 SEC16B 0.9 0.3 SFRS3 0.9 0.0

235526_at 0.8 0.4 231174_s_at 0.8 0.4

C5orf41 0.9 0.3 FAM100B 0.9 0.1 CITED2 0.9 0.3

244332_at 0.9 0.3 204896_s_at 0.9 0.1 238161_at 0.9 0.1 AGPAT3 0.9 0.3

SAE1 0.9 0.2 WDR48 0.9 0.2 RBM9 0.9 0.2 MFN2 1.0 0.1

227501_at 0.9 0.3

- 170 - ANEXO

SLC44A4 0.9 0.0 ZKSCAN1 0.9 0.0

MPP5 0.9 0.0 232527_at 0.9 0.0

FUT6 0.9 0.4 232522_at 0.9 0.3 PACSIN2 0.9 0.3 NR2F6 0.9 0.2 NBR1 0.9 0.1

216902_s_at 0.9 0.1 SLCO2B1 0.9 0.3

AQP3 0.8 0.3 DTNBP1 0.8 0.5

CRK 0.9 0.2 RRM1 0.9 0.0 RBM22 0.9 0.4 NUCB1 0.9 0.1 FOXP1 0.9 0.2

SP1 0.9 0.2 ARF1 1.0 0.0

SEPT2 0.9 0.1 GSPT1 0.9 0.1 KLF3 0.9 0.1

DDX42 0.9 0.1 YWHAE 1.0 0.0 AZIN1 0.9 -0.1

PDLIM5 1.0 -0.1 SLC39A14 1.0 0.0

1559401_a_at 0.9 -0.2 229713_at 0.9 -0.2 227473_at 0.9 -0.3

CD74 1.0 -0.1 238875_at 0.9 -0.4 JMJD1C 1.0 0.0 ZFP36L2 1.0 -0.1 SEC61A1 0.9 0.0

1556338_at 0.9 -0.1 C6orf62 0.9 -0.3 MED13L 0.9 -0.1

1556657_at 0.9 0.0 NHSL1 0.9 0.0 RBM6 0.9 -0.3

LARP4B 0.9 -0.3 236251_at 0.9 0.0

CALR 0.9 0.0 F2RL1 0.9 0.0 APOB 0.9 -0.1

227383_at 0.9 0.0 241903_at 0.9 -0.1 CTNNA1 1.0 -0.1

TKT 0.8 -0.4

ANEXO - 171 -

236685_at 0.9 -0.1 EMILIN3 0.8 -0.5

235112_at 0.9 -0.1 237803_x_at 0.9 -0.1

SFRS15 0.9 -0.4 PPP2R5C 0.9 0.0

1569542_at 1.0 0.0 PAWR 0.9 -0.4

PIK3C2A 0.9 -0.2 CALD1 0.9 -0.2 PAPD4 0.9 -0.3 ERLIN1 1.0 0.0 ATXN7 0.8 -0.5 ACTR2 0.9 -0.3

242968_at 0.9 -0.4 241970_at 0.9 -0.4

MAX 0.9 -0.3 CAPRIN1 1.0 -0.1 KLHDC3 0.9 -0.2 WTAP 0.8 -0.6 CDC5L 0.9 -0.3 RSBN1 0.8 -0.5

237330_at 0.9 -0.3 LMAN1 0.9 -0.2

ATP6V0A1 0.9 0.0 GPBP1L1 0.9 -0.3 HNRNPC 0.9 -0.3

STIP1 0.9 -0.2 ANKRD10 0.9 -0.2 ZNF493 0.9 0.0 ZNF12 0.8 -0.5 STX16 0.9 -0.2

RABGAP1L 0.9 -0.2 214257_s_at 0.8 -0.3 242059_at 0.9 -0.2 MAP3K2 0.8 -0.5 APH1A 0.9 -0.4 TNKS2 0.8 -0.4

228478_at 0.9 -0.3 241948_at 0.9 -0.1 TM9SF1 0.9 0.0 HP1BP3 0.9 0.0

HSP90AB1 0.9 0.0 PSMB4 0.8 -0.5 DLG1 0.9 0.0

232797_at 0.9 -0.5 238883_at 0.8 -0.5 MAPKAP1 1.0 -0.1 PRO2852 0.9 -0.5

RAC2 0.9 0.0 ATP6V1A 0.9 -0.4

- 172 - ANEXO

243648_at -0.9 0.4 SLC15A1 -0.9 0.1 KPNA6 -0.9 0.3 PIGR -0.9 0.2

TMEM223 -0.9 0.4 FAM120A -0.9 0.1 B3GNT7 -0.9 0.1 EWSR1 -0.9 0.3 SPG7 -0.8 0.4 TULP4 -0.9 0.2

ZDHHC14 -0.9 0.3 GLUD1 -0.9 0.2 MTA1 -0.9 0.2 CASZ1 -0.9 0.3 LUZP1 -0.9 0.5 C9orf86 -0.9 0.1 PDXK -0.9 0.2 PLLP -0.9 0.1

NPEPPS -0.9 0.1 214801_at -0.9 0.1

LMO7 -0.9 0.3 RRBP1 -0.8 0.4

232699_at -0.8 0.5 DYNC1H1 -0.8 0.3

GNG12 -0.8 0.3 MALAT1 -0.9 0.2

B2M -0.9 0.3 CSNK1G2 -0.8 0.5

MAGI1 -0.8 0.5 HES6 -0.9 0.1 GGT6 -0.9 0.0

BNIP3L -0.9 0.4 242993_at -0.9 0.0 TMEM184A -0.9 0.4 242337_at -0.8 0.4

PTMA -0.9 0.2 SQLE -0.9 0.0

RBM26 -0.9 0.4 COPG -0.9 0.2

ZNF827 -0.8 0.6 MYO1C -0.8 0.5 PTMAP7 -0.9 0.2 MKNK2 -0.8 0.3 PSPC1 -0.9 -0.3 MAVS -0.9 -0.3

HNRNPL -0.9 -0.1 DISP2 -0.9 -0.3

CAPZA2 -1.0 -0.2 ND6 -0.9 -0.5

228919_at -0.9 0.0 C14orf50 -0.9 -0.1

ANEXO - 173 -

RAP2A -0.9 -0.4 TOMM22 -0.9 -0.3

236219_at -0.9 -0.1 OSBPL1A -0.9 -0.3 PPP3CA -0.9 -0.4 TRAK1 -0.9 -0.1 ATP1B1 -0.9 -0.3 TGFA -0.9 -0.1

225197_at -0.8 -0.5 MPP7 -0.8 -0.5 LETM1 -0.8 -0.4

SCAMP1 -0.9 -0.2 CDC42SE1 -0.8 -0.4

FAM83H -0.9 -0.3 DNAJC3 -0.8 -0.5

230180_at -0.9 -0.1

- 174 - ANEXO

10. SUPPLEMENTARY MATERIAL FROM CHAPTER 2

10.1. SUPPLEMENTARY FIGURES AND TABLES

10.1.1. Suplementary table 1. Differentially expressed spots identified in IBS-D

patients compared with the healthy volunteer group. Uniprot accession number of proteins

and their fold change expression in IBS-D with respect to H are indicated.

P-value Fold-change Identificació # acces

(Uniprot) Gene name

0,01 -1,59 Annexin A5 P08758 ANXA5 0,004 -1,61 Cytochrome b5 P00167 CYB5A 0,011 -1,71 Actin P62736 ACTA

9,33E-04 1,63 Aconitate hydratase, mitochondrial precursor Q99798 ACO2

0,012 -1,38 Peptydil-prolyli cis-trans isomerase P62937 PPIA 0,002 -1,57 14-3-3 protein zeta/delta P63104 YWHAZ 0,032 -1,35 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase P25325 MPST 0,045 -1,34 LGALS4 protein Q6FHZ4 LGALS4 0,006 -1,64 Glutathione S-transferase theta-1 P30711 GSTT1 0,015 1,45 Isoform I of Serum albumin precusor P02768 ALB

0,002 -1,78 proteasome activator subunit 1 isoform 1 (29KDa protein) Q06323 PSME1

0,001 -1,83 proteasome activator subunit 1 isoform 1 (29KDa protein) Q06323 PSME1

0,001 -1,68 Annexin A5 P08758 ANXA5 0,003 -1,52 EF-hand domain-containing protein D2 Q96C19 EFHD2 0,003 -1,70 Actin, aortic smooth muscle P62736 ACTA2 0,004 1,69 Aconitate hydratase, mitochondrial Q99798 ACO2

9,33E-04 1,63 Aconitate hydratase, mitochondrial precursor Q99798 ACO2

0,009 -1,59 Cofilin-1 P23528 CFL1 0,001 -1,52 Cathepsin D P07339 CTSD 0,038 -1,60 Bile salt sulfotransferase Q06520 SULT2A1 0,002 1,34 Elongation factor 2 P13639 EEF2

0,004 1,50 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit, mitochondrial P31040 SDHA

0,011 1,30 Keratin, type II cytoskeletal 8 P05787 KRT8 0,008 -1,54 Annexin A1 P04083 ANXA1

3,59E-04 1,42 Heat shock 70 kDa protein 1 P08107 HSPA1A 0,013 -1,55 Alpha-soluble NSF attachment protein P54920 NAPA 0,017 -1,49 Cathepsin D P07339 CTSD

0,002 -1,59 NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotein 2, mitohondrial precursor P19404 NDUFV2

1,38E-04 1,58 Keratin, type I cytoskeletal 18 P05783 KRT18

0,019 -1,46 Superoxide dismutase (Mn), mitochondrial precursor P04179 SOD2

0,004 -1,33 Protein DJ-1 (Oncogene DJ1) Q99497 PARK7

ANEXO - 175 -

0,003 -1,45 14-3-3 protein zeta/delta P63104 YWHAZ 0,008 -1,69 cytidylate kinase (UMP-CMP kinase) P30085 CMPK1 0,001 -1,50 Proteasome subunit beta type 2 P49721 PSMB2

-1,50 Isoform 1 of Growth factor receptor-bound protein 2 P62993 GRB2

-1,50 Calcineurin B homologous protein 2 O43745 CHP2 8,44E-05 -1,32 Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial P30084 ECHS1

0,008 -1,45

22 kDa Protein (tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5- monooxygenase activation protein, epsilon polypeptide [synthetic construct]) (14-3-3 epsilon )

P62258 YWHAE

0,005 -1,47 Alcohol dehydrogenase [NADP+] P14550 AKR1A1

0,005 -1,43 Isoform short of 14-3-3 protein beta/alpha A4K2U9 YWHAB

0,004 1,42 Guanine deaminase Q9Y2T3 GDA

0,002 -1,35 Phosphoglycerate mutase 1 (Brain) variant Q53G35 PGAM1

0,003 1,31 Retinal dehydrogenase P00352 ALDH1A1 0,001 1,43 Protein transport protein Sec23A Q15436 SEC23A

0,03 -1,35 LIM and SH3 domain protein 1 Q14847 LASP1

0,044 -1,35 Abhydrolase domain-containing protein 14B (22 kDa protein) Q96IU4 ABHD14B

-1,35 Peroxiredoxin-2 P32119 PRDX2 0,008 1,49 Serotransferrin precursor P02787 TF

9,91E-05 1,48 Serotransferrin precursor P02787 TF 1,48 Vesicle-fusing ATPase P46459 NSF

0,002 1,33 Elongation factor 2 P13639 EEF2 2,61E-04 1,91 Isoform 1 of Adseverin Q9Y6U3 SCIN

0,002 1,30 Stress-70 protein, mitochondrial P38646 HSPA9 1,30 Xaa-Pro aminopeptidase 1 Q9NQW7 XPNPEP1

0,003 1,28 Lamin-B1 P20700 LMNB1 1,28 Serum albumin P02768 ALB

0,014 1,55 Serum albumin P02768 ALB 0,004 1,69 ALB protein P02768 ALB

6,51E-05 1,44 WD repeat-containing protein 1 O75083 WDR1

1,44 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit, mitochondrial P31040 SDHA

0,001 1,59 WD repeat-containing protein 1 O75083 WDR1

1,59 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit, mitochondrial P31040 SDHA

0,005 1,63 Gamma-tubulin complex component 2 (83 Kda Protein) Q9BSJ2 TUBGCP2

0,001 1,53 KRT8 protein Q969I0 KRT8 0,025 1,34 Selenium-binding protein 1 Q13228 SELENBP1

1,34 Aldehyde dehydrogenase X, mitochondrial P30837 ALDH1B1

0,003 1,25 Keratin, type I cytoskeletal 20 P35900 KRT20 1,25 Actin-related protein 3 P61158 ACTR3

7,48E-04 1,69 Actin-like protein 3 P61158 ACTR3 0,002 1,27 Eukaryotic initiation factor 4A-II Q14240 EIF4A2

- 176 - ANEXO

0,004 1,38 GDP-mannose 4,6 dehydratase O60547 GMDS 1,38 Fructose-bisphosphate aldolase B P05062 ALDOB

0,007 -1,40 Annexin A1 P04083 ANXA1

0,004 -1,30 phenol sulfotransferase 1A5/1A possible alternative splicing form P50224 SULT1A3

0,041 -1,29 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase P25325 MPST 0,007 -1,31 Inorganic pyrophosphatase Q15181 PPA1 0,017 -1,39 EF-hand domain-containing protein D2 Q96C19 EFHD2 0,017 -1,53 Prohibitin P35232 PHB 0,025 -1,31 Thiopurine S-methyltransferase P51580 TPMT

0,006 -1,86 Endoplasmic reticulum protein ERp29 precursor P30040 ERP29

0,002 -1,76 Endoplasmic reticulum protein ERp29 precursor P30040 ERP29

-1,76 6-phosphogluconolactonase O95336 PGLS 0,006 -1,43 Pyridoxine-5'-phosphate oxidase Q9NVS9 PNPO

0,007 -1,35 Thioredoxin-dependent peroxide reductase, mitochondrial P30048 PRDX3

0,013 -1,45 Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 P30086 PEBP1

0,014 -1,51 Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 P30086 PEBP1

0,003 -1,37 Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD Q9ULZ3 PYCARD

-1,37 Proteasome subunit beta type-3 P49720 PSMB3

0,013 -1,51 Myosin regulatory light chain 2, nonsarcomeric P19105 MRCL3

0,001 -1,46 Nucleoside diphosphate kinase A P15531 NME1

5,43E-04 -1,60 Eukaryotic translation initiation factor 5A-1 P63241 EIF5A

0,007 -1,46 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A P62938 PPIA 0,012 -1,60 Transthyretin P02766 TTR 0,018 -1,44 Fatty acid-binding protein, liver P07148 FABP1 0,025 -1,47 Fatty acid-binding protein, liver P07148 FABP1

ANEXO - 177 -

11. S

UPP

LEM

ENTA

RY

MA

TER

IAL

FRO

M C

HA

PTER

3

11.1

. Sup

plem

enta

ry fi

gure

s an

d ta

bles

11.1

.1. S

uppl

emen

tary

tabl

e 1.

Ant

ibod

ies

used

for w

este

rn-b

lot (

WB

) and

con

foca

lim

mun

oflu

ores

cenc

e(IF

).

11. S

UPP

LEM

ENTA

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MA

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M C

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e 1.

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lot (

WB

) and

con

foca

lim

mun

oflu

ores

cenc

e(IF

).

- 178 - ANEXO

11.1.2. Supplementary table 2. Gene expression assays (GEA) used for Q-RT-PCR.

ANEXO - 179 -

11.1.3. Supplementary figure 1. Relationships between differentially expressed genes

in the highest scored network and related Canonical Pathways (CP) and Biological

Functions (Fx). The list of differentially expressed genes in IBS-D, compared to healthy

volunteers, linked to their approved nomenclature (http://www.genenames.org), and fold-change

was uploaded into the IPA application. Node (gene) and edge (gene relationship) symbols are

described in the figure. The intensity of the node color indicates the degree of up-(red) or down-

(green) regulation. Genes in uncolored nodes were not identified as differentially expressed in

our study and were integrated into the computationally generated networks based on the

evidence stored in the IPA knowledge memory indicating relevance for this network. The

network score is based on the hypergeometric distribution and is calculated with the right-tailed

Fisher’s Exact Test. The score is the negative Log of this P-value (P-score=-log10 (P-value)).

- 180 - ANEXO

mecanismos moleculares y papel del mastocito en la

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