Material disponível no site http://www.ufsm.br/larp

Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ou Thin Layer Chromatography (TLC)

Prof. Renato Zanella (UFSM)

A cromatografia em camada delgada é outra forma de cromatografia onde o

material adsorvente fica sobre um vidro, alumínio ou filme plástico.

A separação pode ser convenientemente expressa como um fator de retardo

ou fator de retenção (Rf), definido como:

Rf A = dA/dS e Rf B = dB/dS 0 ≤ Rf ≤ 1

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- Rf difícil de reproduzir pois depende de:

natureza e granulometria do adsorvente

natureza do eluente, grau de ativação, técnica do operador, T e

quantidade amostra.

- Câmaras de eluição (tanque, sandwich, HPTLC); Preparo das placas

- Avaliação qualitativa, Avaliação semi-quantitativa

O exemplo de cromatografia mais clássico é a cromatografia em papel

onde uma amostra líquida flui por uma tira de papel adsorvente vertical. O

papel é composto por moléculas extremamente longas chamadas celulose. A

celulose é um polímero polar com muitas regiões de altas e baixas

densidades de elétrons. A cromatografia em papel é uma das técnicas mais

simples e que requerem menos instrumentos para realização, porém também

apresenta as maiores restrições para realização em termos analíticos.

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Aplicação

ou

Eluição Resultado

Exemplos de aplicação:

Cromatograma de 10 óleos essenciais. Placa revelada com vanilina.

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CCD Bidimensional (Eluição efetuada em duas direções com solventes

diferentes)

CCD de clorofila Pigmentos utilizados em tinta de marcador preto (A), amarelo (B) e vermelho (D) são os mesmos. Vamos investigar se a tinta do marcador verde (C) é um corante só ou uma combinação.

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Revelação empregando derivatização pós-cromatográfica

Se as substâncias na placa não forem ativas em UV, a absorbância ou

fluorescência pode ser gerada pela imersão ou spray de reagentes

adequados, chamados reveladores.

Imersão para derivatização é indicada para:

� Aumentar a reprodutibilidade em determinações quantitativas

� Aumentar a proteção ambiental/higiene industrial

� Evitar contaminação do ambiente de trabalho

Revelação

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Contraceptivos

1 = cholesterol 4 = estriol 7* = contraceptive 2 10 = alpha norgestrel

2 = beta-estradiol 5 = diethyl stilbestrol 8 = progesterone 11 = cortisol

3 = estrone 6* = contraceptive 1 9 = norethindrone

Rf values

contraceptive 1 0.36, 0.25, 0.03

contraceptive 2 0.92, 0.35, 0.2, 0.02

cholesterol 0.75

beta-estradiol 0.25

estrone 0.5

estriol 0.05

diethyl stilbestrol 0.24

progesterone 0

norethindrone 0.4

alpha-norgestrel 0.6

cortisol 0

Based on a comparison of Rf values

and colorimetric identification, I

deduce that both unknown

contraceptives contain norethindrone

and beta-estradiol. Unfortunately, the

progesterone, estriol, and cortisol

standards did not give very clear

marks on the silica gel paper.

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Cromatografia de aminoácidos em papel

Na cromatografia em papel, por exemplo, a resolução de uma mistura de

solutos sobre um papel de filtro pode depender de uma variedade de

fenômenos, tais como adsorção à superfície do papel, troca iônica ou na

partição entre solventes.

Os aminoácidos podem ser separados por cromatografia em papel devido a

sua solubilidade que os diferentes tipos desta substância apresentam pela

água de hidratação ao redor das fibras de celulose e pela fase orgânica

móvel que flui através destas fibras. A solubilidade relativa dos aminoácidos

nestas duas fases pode ser mudada por alterações na polaridade do

solvente, ou no pH da solução, o qual irá alterar o estado iônico dos

aminoácidos. Sob um conjunto adequado de condições, então, cada

molécula de uma mistura irá se deslocar a uma diferente velocidade sobre a

fase estacionária e estará a uma distância específica de um do ponto de

origem, quando cessar o fluxo de solvente.

Os aminoácidos não absorverem luz no comprimento de onda visível, assim

a reação de ninhidrina é usada para este propósito por que reage com

grupamentos amino livres produzindo um composto colorido (usualmente

púrpura). Diversos aminoácidos, contudo, produzem diversas tonalidades de

cores com a ninhindrina, o que pode ajudar em sua identificação. A reação

da ninhindrina com prolina, por exemplo, gera um composto amarelo e a

reação com a tirosina produz uma coloração azul metálica.

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CROMATOGRAFIA de ADSORÇÃO

....fenómeno de superfície que ocorre na interfase, implicando interacções

dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, pontes de hidrogénio, complexos p

FE: Adsorvente FM: Eluente

Sílica: silanol SiO2.xH2O; Alumina: Al3+, 02-

Influenciada por:

• Natureza da FE

• Solubilidade substâncias FM

• Capacidade adsorção na FE para cada substância

FE Inorgânicas:

• Sílica • Alumina ácida, básica ou neutra • Florisil

FE Orgânicas:

• Celulose • Poliamidas • “Sephadex”

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Poder adsorvente das fases estacionárias

Poder adsorvente da silica (maior afinidade = maior retenção = menor Rf)

Polaridade dos solventes

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“Efeito de Bordo” = Saturação da Câmara Deficiente ou Excesso de amostra

HPTLC – High Performance Thin Layer Chromatography

Instrumental TLC usada para descrever uma técnica moderna, instrumental e

de alta performance, onde a avaliação é feita através de equipamentos e

software

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Princípio do Método

Separação de misturas de compostos moleculares através da migração

diferencial dos mesmos entre duas fases: uma fixa (ou estacionária) e outra

móvel, que desliza sobre a primeira.

Ou também pode ser expresso como um procedimento de separação

microanalítico no qual os componentes de uma mistura são transportados

para diferentes distâncias em uma placa recoberta com uma fina camada de

material poroso. A espessura da camada pode variar de 100 a 250 mm.

A placa que serve de suporte em geral é de vidro, mas pode ser de plástico

ou de alumínio. A camada que recobre a placa recebe o nome de fase

estacionária e em geral é constituída de sílica gel.

O mecanismo de transporte é um solvente e é conhecido como fase móvel.

Primeiro a amostra é dissolvida em um solvente adequado, então, uma certa

alíquota desta solução é aplicada na região de partida e o conjunto é seco.

A placa de TLC/HLTPC é então colocada em uma câmara de

desenvolvimento ou cuba, o qual contém o solvente.

Inicia-se o que chamamos de desenvolvimento cromatográfico onde os

componentes da amostra são influenciados pela ação de duas forças,

opostas entre si:

Capilaridade: é a responsável pelo avanço do solvente ou fase móvel sobre

a fase estacionária que contém a amostra.

Interação: tão logo se inicia a migração da fase móvel, a amostra é

dissolvida e começa a ser arrastada pela fase móvel. Neste momento

aparecem forças de interação entre os componentes da amostra e a fase

estacionária. Estas forças de interação se opõem à força de arraste da fase

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móvel (capilaridade) retardando o avanço dos componentes da amostra.

Este retardo não ocorre da mesma forma para os diversos constituintes

presentes na amostra aplicada. Forças de interação como dipolo induzido,

pontes de hidrogênio, forças de Van der Waals tomam parte neste processo,

fazendo ocorrer mecanismos de separação como adsorção, dispersão e

troca iônica.

Diferenças entre Placas de TLC e HPTLC

Placas comercialmente já preparadas são mais indicadas pois garantem boa

reprodutibilidade, devido à homogeneidade da aplicação da fase estacionária

no suporte.

Na tabela abaixo estão as diferenças entre as placas TLC e HPTLC

TLC HPTLC

Tamanho médio de

partículas 10 – 15 µm 5 – 7 µm

Distribuição de partículas Larga Estreita

Espessura da placa 250 µm 100, 200 µm

Número máximo de

amostras 12 36 – 72

Distância de migração 100 – 150 mm 30 – 50 mm

Tempo de migração 30 – 200 min 3 – 20 min

Quantidade de solvente 50 mL 5 – 10 mL

Limite de detecção Abs 100 – 1000 ng

Fluor 1 – 100 ng

Abs 10 – 100 ng

Fluor 0,1 – 10 ng