Análise de expressão gênica

Helena Brentani

Helena.brentani@gmail.com

Professora Departamento de Psiquiatria da FMUSP

DNA

RNA

Proteínas

Funçõescelulares

Como estudar o transcriptoma

Análises em larga-escala

ESTs; SAGE; Microarray; RNA-seq

Exons Introns

cDNA

Coding Non-coding

Sequências Expressas de Tag

AAAAAAAAA

ESTs: genes muito expressos, depende do tipo da biblioteca,

Disponibilidade de genoma

SAGE

Tags são isoladas e concatenadas.

Níveis de expressão podem ser comparados entre células em diferentes estados.

SAGE – pros e contras

Vantagens

•Não há hibridização nem referência – as medidas são relativas somente ao total de tags da biblioteca;

•Teoricamente, todos os mRNAs são medidos através das tags – não é preciso fixá-los;

•Maior sensitividade

Shui Qing YE, Tera LAVOIE, David C USHER, Li Q. ZHANG - Cell Research 2002; 12(2):105-115

Dificuldades

•Relacionar tag com transcrito;

•Custo elevado;

MicroArray

Microarray – prós e contras

Vantagens:

•Custo relativamente baixo

•Muitos transcritos (600-25k)

•Relação cDNA->gene quase inequívoca

Desvantagens

•Baixa reproducibilidade

•Two-colors: hibridização competitiva, diferença de marcação de um mesmo cDNA

•One-color: falta de parâmetro para comparar lâminas

•Dificuldade de mesclar experimentos numa mesma análise

As cinco etapas da análise de expressão gênica

Preparação das amostras

Reação Bioquímica

Spot identification

Análise dos dados

Questão Biológica/desenho

experimental

Verificação biológicae interpretação

Experimento de Microarray

Desenho experimental

Análise de imagem

Normalização

Questão biológica(baseada em hipóteses ou

exploratória)

TesteEstimaçã

oDiscriminaç

ão

AnáliseClusterizaçã

o

Medida daqualidade

Falhou

Passou

Pré-processamento

Desenho experimental

• Número de indivíduos para cada classe– Estimar a variabilidade biológica entre os indivíduos

da mesma classe

• Número de replicatas– Estimar a variabilidade experimental

• Tipo de desenho experimental– Reference design

– Balanced Block design

– Loop design

• Número limitado de bibliotecas, arrays...

Preparação das Amostras

– Extração do RNA total– Qualidade do RNA– Amplificação– Controle da amplificação– Tipos de protocolos

Identificação de Pontos

Histograma de pixel

Intensidade de um único ponto

• O sinal do ponto é quantificado.

„Donuts“

Média / Média / MedianaMediana / / ModoModo // 75% quantil 75% quantil

Dados brutos não sãoconcentrações de mRNA

• Contaminação do tecido

• Degradação do RNA

• Eficiência na amplificação

• Eficiência da transcrição reversa

• Eficiência na Hybridização e especificidade

• Identificação de clones e mapeamento

• Redimento da PCR e contaminação

• Eficiência dos pontos

• Suporte de ligação ao DNA

• Questões relacionadas a

outros fabricantes de

arranjos

• Segmentação da imagem

• Quantificação do sinal

• Correção do fundo

Controle de Qualidade:Ruído e Sinal confiável

arranjos 1 ... n

Nível arranjo Nível GeneNível sonda

Nível Sonda: qualidade da medida da expressão de um ponto particular em um array

Nível Arranjo: qualidade da medida da expressão em uma lâmina de vidro

Nível Gene: qualidade da medida da expressão de uma sonda em todas as matrizes

Controle de Qualidade do Nível da Sonda

• Pontos individuais impressos no slide• Fontes:

– impressão defeituosa, distribuição desigual, contaminação por detritos, magnitude do sinal em relação ao ruído, medição deficiente dos pontos;

• Inspeção visual:– cabelos, pó, arranhões, bolhas de ar, as regiões escuras, regiões com

neblina;• Qualidade do Ponto:

– Brilho: primeiro plano em relação a razão fundo– Uniformidade: variação da intensidades em pixel e a razão da intensidade

de um ponto– Morfologia: área, perímetro, circularidade.– Tamanho do Ponto: número de pixels no primeiro plano

• Ação:– medidas definidas para NA (valores não presentes).– local procedimentos de normalização, que representam idiossincrasias

regionais.– use weights for measurements to indicate reliability in later analysis.

Controle de Qualidadodo Nível do Arranjo

• Problemas:– Defeito de fabricação do arranjo– Problema com a extração de RNA– Falha na reação de rotulagem– Más condições de hibridização– Leitor avariado

• Medidas de Qualidade:– Porcentagem de pontos em sinal (~30% pontos excluídos) – Calibre da intensidade– (Av. Primeiro plano)/(Av. Fundo) > 3 nos dois canais– Distribuição do sinal da área dos pontos– Valor do ajuste necessário: sinais que alteram substancialmente

para comparar slides.

Controle de Qualidadedo Nível do Gene

Gene g• Hibridização ruim no canal de

referencia. Pode introduzir viés na mudança do fold.

• Algumas probes pode não hibridizar

bem com o RNA.

• Problemas de impressão: como

todos os pontos de um bom relatório,

podem ter baixa qualidade.

• Baixa qualidade – Contaminação

• Genes com baixo sinal de consistência no canal de referência são suspeitos

Gene

Amostras mRNA

Nível de expressão do gene ou razão por gene i na amostra de RNA j.

M =Log2 (intensidade vermelho/ intensidade verde)

Função (PM, MM) do MAS, dchip ou RMA

amostra1 amostra2 amostra3 amostra4 amostra5 …

1 0.46 0.30 0.80 1.51 0.90 ...2 -0.10 0.49 0.24 0.06 0.46 ...3 0.15 0.74 0.04 0.10 0.20 ...4 -0.45 -1.03 -0.79 -0.56 -0.32 ...5 -0.06 1.06 1.35 1.09 -1.09 ...

A =Média: log2(intensidade vermelho ), log2(intensidade verde)

Função (PM, MM) do MAS, dchip ou RMA

Dados de Expressão Gênica

Dados Dados (escala de log)

Dispersão

Mensagem: Veja seus dados em escala de log!

MA Plot

A = 1/2 log2(RG)

M =

log

2(R

/G)

Centralização da Mediana

Log S

inal,

centr

aliz

ado n

o 0

Uma das estratégias mais simples é a de trazer todos os centros "da matriz de dados ao mesmo nível.

Assunção: a maioria dos genes permanecem inalterados entre as condições.

A mediana é mais robusta a outliers do que a média.

Divide todas as medições de expressão de cada matriz pela mediana.

Problemas de Centralização da Mediana

Verde Log

Ver

mel

ho L

og

Dispersão do sinal logado depois da Centralização da Mediana

A = (Verde log+ Vermelho log) / 2

M =

Ver

mel

ho L

og –

Ver

de L

og

M-A Plot dos mesmos dados

Centralizar a Mediana é um método global. Não ajusta para efeitos locais, efeitos dependente da intensidade, efeitos de impressão, etc

Normalização por Lowess

A = (Verde Log + Vermelho Log) / 2

M =

Ver

mel

ho L

og –

Ver

de L

og

Local estimado Use a estimativa para

dobrar a banana em linha reta

Partindo de Dados Conhecidos

Gene

Amostras mRNA

amostra1 amostra2 amostra3 amostra4 amostra5 …

1 0.46 0.30 0.80 1.51 0.90 ...2 -0.10 0.49 0.24 0.06 0.46 ...3 0.15 0.74 0.04 0.10 0.20 ...4 -0.45 -1.03 -0.79 -0.56 -0.32 ...5 -0.06 1.06 1.35 1.09 -1.09 ...

Ok, agora nós temos certeza que nosso dado é de alta qualidade e sistemático, efeitos não biológicos foram removidos.O resultado é uma matriz de expressão gênica

Já um resultado? Não! São apenas dados, não conhecimento.Precisamos usar estes dados para responder a uma questão científica.

Desenho do Experimento

• Tipo I: (n = 2)– Como é que este gene expresso no alvo 1 em

relação ao alvo 2?

– Que genes mostram alta/baixa regulação entre os dois alvos?

• Tipo II: (n > 2)– Como é que a expressão do gene A varia ao longo

do tempo, tecidos ou tratamentos?– Será que algum dos perfis de expressão exibem

padrões similares de expressão?

Tipos de experimentose a ferramenta adequada

Três tipos básicos de perguntas que os experimentos de microarray se propõe a resolver:

Genes diferencialmente expressos

•Encontrar genes que se comportem de maneira diferente em duas classes, com evidência estatística

•Teste T, Teste exato de Fischer, Chi quadrado, Fold change, BER

Padrões de expressão

•Encontrar listas de genes que tenham comportamento semelhante

•Clustering hierárquico

Classificação de amostras

•Encontrar uma lista reduzida de genes (1 para cada ~20 amostras) cujo comportamento permita predizer alguma informação sobre a amostra, e então construir um classificador

•Encontrar os genes (data mining): SVM-FS, busca exaustiva

•Construir o classificador: SVM, plano de Fischer, CART

Networks

•Encontrar redes de relação

entre genes

•Correlação, TOM, entropia

Métodos estatísticos usuais de análise de expressão diferencial

• Média/desvio padrão de classes• Fold change• SAM• Teste t student• wilcoxon• Bayes Error Rate• ANOVA• Correção multi-testes (Bonferroni, pFDR)

Padrões de Expressão Gênica

• Dados “Eisen”ized (dendrogramas)

• Mapas Auto-Organizados

• Análises dos Componentes Principais

• Agrupamento de K-médias

Classificação por SVM

• O SVM tenta encontrar um hiperplano separador ótimo entre os membros de duas classificações iniciais.

Separating hyperplane

Máquinas de Vetores de Suporte (SVM, Support Vector Machines)

Hiperplano separadorde margem maximal

Pontos mais próximosa hiperplano separador = vetores de suporte

O quão bem nós fizemos?

O classificador geralmente irá agir pior que antes:

Erro de teste > Erro de treinamento

Mesmo classificador (= linha)

Novos dados das mesmas classes

Erro de treinamento: O quão bem nós fazemos no dados nos quais treinamos o classificador?

Mas quão bem nós faremos no futuro, em novos dados?

Erro de teste: O quão bem o classificador generaliza?

EASE(Expression Analysis Systematic Explorer)

A análise do EASE identifica temas biológicos prevalentes em clusters de genes.

A significância de cada tema identificado é determinada por sua prevalência no cluster e na população de genes da qual o cluster foi criado.

Sistema de arquivos EASE

-Quais são alguns dos temas biológicos predominantes representados em um cluster e como deveria ser atribuída significância a um tema biológico descoberto?

Considere certo cluster…

Exemplo:

Tamanho da População: 40 genesTamanho do Cluster: 12 genes

10 genes, mostrados em verde, têm um tema biológico comum e 8 ocorrem no cluster.

A frequência do tema na população é 10/40 = 25%

A frequência do tema no cluster é 8/12 = 67%

40

12

10

8

* 80% dos genes relacionados ao tema na populaçãoterminaram em um cluster relativamente pequeno.

E

Considere o resultado

Atribuindo Significância às Descobertas

Teste Exato de Fisher, distribuição Hipergeométrica, Cálculo das probabilidades.

8 2

4 26

in out

in

out

Cluster

Tema p ≈ .0002

( 2x2 matriz de contingência)

Conjunto de genes cujos perfis de expressão são preditivos de algum outro.

Genes com baixa entropia(variabilidade mínima nos experimentos)são excluídos da análise.

H = -Σp(x)log2(p(x))x=1

10

Pode ser usado para identificar correlações negativas entre genes.

Redes de Relevância

Redes de Relevância

Coeficientes de correlação fora dos limites definidos pelos limiares máximo e mínimo são eliminados.

A

D

E B

C

.28

.75

.15.37

.40

.02

.51

.11

.63

.92A

D

E B

C

Tmin = 0.50O padrão de expressão da cada gene comparado aos de todos os outros.

À capacidade de cada gene de predizer a expressão de cada um dos outros genes é atribuído um coeficiente de correlação

Tmax = 0.90

As relações entre genes que restam definem as subredes

Microarray

• 1990s tecnologia escolhida para estudos em large-scale expressão gênica

• Habilidade em verificar simultaneamente milhares de transcritos, levou importantes avanços para:

– Identificação de genes diferencialmente expressos

– Farmacogenômica

– Evolução da regulação gênica

• Limitações– Níveis de hibridização do Background (sonda que ocorre independentemente do

nível de expressão correspondente do transcrito)

– Precisão da medida de expressão, particularmente por transcritos presentes em baixa abundância

Sequenciadores Segunda Geração

• Roche/454 and AB SOLiD– Construção in vitro adaptadores (adaptadores de amarelo e

verde)

– Multi-template PCR, com um único par de primers.

– Emulsão em água e óleo.

– Adição de Beads

Morozova, O., Hirst, M., & Marra, M. A. (2009). Applications of New Sequencing Technologies for Transcriptome Analysis. Annual Review of Genomics and Human Genetics. doi: 10.1146/annurev-genom-082908-145957.

Sequenciadores Segunda Geração

• Illumina– Construção in vitro adaptadores (adaptadores de amarelo e

verde)

– Amplificação por bridge PCR (ponte)

– Os dois primers podem são fixados

Morozova, O., Hirst, M., & Marra, M. A. (2009). Applications of New Sequencing Technologies for Transcriptome Analysis. Annual Review of Genomics and Human Genetics. doi: 10.1146/annurev-genom-082908-145957.

RNA-SeqNext-Generation Sequencing

(NGS)

Experimento RNA-Seq

Sciences, M. L. (2010). RNA-seq: from technology to biology ¨. Cellular and Molecular Life Sciences, 569-579. doi: 10.1007/s00018-009-0180-6.

Qualidade•

Diferentes plataformas NGS, diferentes formas de avaliar e filtrar a qualidade da sequência.

Exemplo: Sequência 454

>FPO586001EP0DK rank=0421118 x=1819.0 y=1494.0 length=495

TACCTCTCCGCGTAGGCGCTCGTTGGTCCAGCAGAGGCGGCCGCCCTTGCGCGAGCAGAA

TGGCGGTAGGGGGTCTAGCTGCGTCTCGTCCGGGGGGTCTGCGTCCACGGTAAAGACCCC

GGGCAGCAGGCGCGCGTCGAAGTAGTCTATCTTGCATCCTTGCAAGTCTAGCGCCTGCTG

CCATGCGCGGGCGGCAAGCGCGCGCTCGTATGGGTTGAGTGGGGGACCCCATGGCATGGG

GTGGGTGAGCGCGGAGGCGTACATGCCGCAAATGTCGTAAACGTAGAGGGGCTCTCTGAG

TATTCCAAGATATGTAGGGTAGCATCTTCCACCGCGGATGCTGGCGCGCACGTAATCGTA

TAGTTCGTGCGAGGGAGCGAGGAGGTCGGGACCGAGGTTGCTACGGGCGGGCTGCTCTGC

TCGGAAGACTATCTGCCTGAAGATGGCATGTGAGTTGGATGATATGGTTGACGCTGGAAG

ACGTTGAAGCTGGCG

>FPO586001EP0DK rank=0421118 x=1819.0 y=1494.0 length=495

40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 34 34 21 21 21 39 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 33 33 33

40 40 40 40 39 39 39 40 26 26 26 26 26 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 22 22 22 22 22 22 40 40 40 40 40 40 40 40 40

26 26 26 25 39 39 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40

40 40 40 40 40 40 40 40 39 39 39 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 39 39 39 40 40 40 39 39 40 28 30 30 30 30 40

34 40 37 37 37 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 34 24 19 17 17 28 36 36 40 36 28 17 17 19 30 40 40 40 40

40 35 34 34 39 39 40 40 40 40 40 40 40 40 39 35 34 34 34 40 40 34 39 39 40 39 39 39 39 39 39 39 39 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40

40 40 35 34 34 40 40 40 40 40 40 40 39 39 39 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 28 28 28 36 34 34 28 32 28 28 22 22 19 32 30 30 28 27 27

Default Phred paraQualidade = 20

RNA-Seq mapeamento

• Contagem confiável no mapeamento contra o genoma de referência ou de novo assembly.

• Desafios para obter mapeamento com eficiência e confiabilidade– Recursos computacionais para mapear grande número de reads

– Taxa de erro relativamente alta. (o número de alinhamentos, não perfeitos, deve ser considerado).

– Taxa de erro é particularmente relevante para detecção de Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

– Distinguir erros de sequenciamento de SNPs

– Viés e artefatos da preparação das bibliotecas e procedimentos de sequenciamento.

RNA-Seq Quantificação

Quantificar o número de genes que foi representado

• O número de reads por gene

• Tamanho do gene representado

– Genes grandes

• Protocolos foram utilizados na construção da biblioteca

– Diferentes plataformas e protocolos

C = Número de reads mapeados

N = Número total de reads mapeados

L = Tamanho total dos éxons

Mortazavi et al., 2008

RNA-Seq

• Contagem confiável do mapeamento gerado contro o genoma de referência.

• Possibilidade de encontrar rearranjos, modificações pós-transcricionais que não foram mapeados diretamente no genoma de referência

• de novo assembly de dados de RNA-Seq

• Grande cobertura

• Alta sensibilidade que permite a detecção de mais transcritos, comparado com o que é detectado com Microarray.

Microarray RNA-Seq

O scaner retorna a intensidade do sinal para cada probe do experimento de array

O número de reads mapeado para qualquer região do genoma representa o sinal

RNA-Seq x Microarray(expressão gênica)

• Illumina

• Affymetrix U133 Plus 2 arrays

• Procurar genes diferencialmente expressos entre amostras de:

– Rim

– Fígado

RNA-Seq x Microarray(expressão gênica)

• Para analisar a diferença de achados, utilizaram a técnica Quantitative PCR – (qPCR) para testar a diferenças de expressão entre as amostras de Rim e Fígado.

• 5 genes considerados diferencialmente expressos apenas nos dados de sequenciamento foram escolhidos (MMP25, SLC5A1, MDK, ZNF570, GPR64).

• 6 genes considerados diferencialmente expressos nos dados de array foram escolhidos (C16orf68, CD38, LSM7, S100P, PEX11A, GLOD5)

.

RNA-seq: An assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Research, 1509-1517. doi: 10.1101/gr.079558.108.

• Dados do sequenciamento– Dos 5 genes, 4 foram confirmados por qPCR. O gene (ZNF570)

como falso positivo.

• Dados de array– Dos 6 genes, apenas 2 foram confirmados (CD38 e GLOD5).

RNA-Seq x Microarray(expressão gênica)

Aderbal R. T. Silva, Paulo J. S. Silva, Cecília Feio, Luis P. Camargo, Lea T. Grinberg, Renata E. L. Ferreti, Renata Leite, José M. Farfel, Cesar H. Torres, Dirce M. Carraro, Diogo Patrão, and

Brazilian Aging Brain Study Group

Marcadores biológicos de diagnóstico precoce e prognóstico em AlzheimerUsando dados de expressão gênica

O PROBLEMA

Cadastro inicial do paciente e

amostras

Nro do VO, Nome do paciente, Questionários (opcionais)Qtd tubos por região do cérebroQtd tubos de sangue, timo, rim, etc

Geração do código de barras

Para cada amostra cadastrada, o sistema gera e imprime um código de barras único

Armazenamento das amostras

Freezer específico para cada tipo de amostra, controle de posição por código de barras.

Retirada das amostras

Em qual cuba de formaldeído está o hemisfério esquerdo?Em que freezer está o tubo de sangue?

Transformação das amostras

Hemisfério em cuba de FA => K7K7 => Lâmina HELâmina HE => Lâmina coradaTecido/sangue => RNA e/ou DNA

- Banco de Encéfalos Humanos do Grupo de Estudos de Envelhecimento Cerebral (FMUSP)

- SVOC

Córtex frontal

Hipocampo

CASUÍSTICA

Tecido ExperimentalsAD/nsAD/OD/N

Tecido de ReferênciaApanhado de 15 linhagens celulares

Isolação Total de RNAMini Kit RNeasy - QIAGEN

Amplificação de mRNA2 ciclos

abordagem com polimerase T7

Trascrição reversa,rotulada com fluorescência

Cy3 (verde) e Cy5 (vermelho)

Plataforma de cDNA personalizada: - 4.800 cDNA sequências- 4.608 genes humanos

- 192 controles positivos e negativos

Captura da Intensidadedo Sinal (Scanner)

Análise estatística

ANOVA (p < 0.05)

Processos biológicos (GO) (p < 0.05) - WebGestalt

classificadores lineares, com 3 genes

MATERIAL E MÉTODOS

A pergunta?

+ -

+DA definida

(sintomática)Outras

Demências

- DA assintomática

Indivíduos Normais

Apresentação Clínica de Demência

Neuropatologia da Doença de Alzheimer (DA)

Reserva Cognitiva

Capacidade de tolerar alterações relacionadas a idade/doença no cérebro sem desenvolver sintomas ou sinais claros

Resultados

• Genes diferencialmente expressos

DAa → DAd

Resultados• Processos Biológicos (GO)

Resultados• Rede dos processos biológicos

Module 1 Module 2

Up-reguladosDown-regulados

Resultados

• Vias de Sinalização (KEGG)

Resultados

• Clusterização Hierárquica (genes fold ≥│1,8│)

Resultados

• Classificadores

Conclusões• Genes que distinguem DAa de DAd estão

envolvidos, principalmente, com ciclo celular e plasticidade sináptica.

• HIPÓTESE

Neurônios erroneamente convertem sinais que seriam utilizados para plasticidade sináptica na ativação do ciclo celular, o que, subsequentemente, leva-os à morte.

DA assintomática

Neurônios diferenciados, após se retirarem do ciclo celular, são capazes de usar alternativamente mecanismo, essencialmente desenvolvido para controlar proliferação, para controlar plasticidade sináptica.

DA ‘sintomática’

Arendt T, Bruckner NK. Biochim Biophys Acta. 2007; 1772:413-421.Frank CL, Tsai LH. Neuron. 2009; 62:312-326.

Análise global de transcrição por sequenciamento paralelo para avaliar ativação gênica mediada por

super expressão de ERBB2

• HER2/neu (também conhecido como ErbB-2, ERBB2)

• Significa: Human Epidermal growth factor Receptor 2, é um proteína que confere maior agressividade em câncer de mama. É membro da família ErbB, mas conhecida como a família do receptor epidérmico do fator de crescimento.

• 20 – 30 % de câncer de mama super expressa HER2 – Herceptin

ERBB2

Experimento• Método para comparação de Whole Transcriptome com múltiplas

amostras

• Avaliação da arquitectura e as alterações quantitativas da transcrição.

– DpnII-restriction

– 4nt-tagging Barcoding

– Roche-454 platform

• Hb4a and C5.2 (super expressa ERBB2) (Harris et al., Int J Cancer. 1999 Jan 29;80(3):477-84)

Figure 1. Schematic representation of cDNA Figure 1. Schematic representation of cDNA libraries. libraries.

Exclusion of Mitochondrial, ribosomal RNAs, and also

sequences with no adapters

Average size: 197 bp

Average size: 244 bp

A – A frequência dos reads :distribuição dos reads ao longo da posição dos transcritos B – A posição relativa da sequence da Poly A+ biblioteca em relação ao tamanho do transcrito. A espessura das barras corresponde à freqüência de seqüências em cada grupo.

C, D – Dados da biblioteca amplificada.

Frequência da posição relativa de transcritos no RefSeq

Números

• 800K dataset

– 17,887 RefSeq (38.93% - 45,946 entradas do RefSeq - build 36).

– 11,366 human genes (40.74% - 27,827 genes - 7,562 and 3,804 genes were represented by one or 2 to 20 transcripts, respectively).

– Par de bases 23.48% - 14,208,089 nt of the potential 60,500,115 nt were covered

• 300K dataset – 11,117 RefSeq (24.20% - 45,946 entradas do RefSeq - build 36). – 7,1691 human genes (25.76% - 27,827 genes).

– base-pair representation was of 13.32% - 5,661,345 nt of the potential 60,500,115 nt were covered

Variantes Estruturais: Descoberta de novos (SNPs) e fusões gênica

Validation of novel SNPs. The eletropherogram represents the validation of the SNPs for each gene. The SNPs from the HB4a and C5.2 cell lines are shown separately and classified as homo or heterozygosis.

18 SNPs mapping to exonic regions were selected to validation -genomic DNA of the two cell lines

High validation rate (89%) - 16 out of 18 SNPs

• 52 putative novel gene fusions - 45 matched 2 different chromosomes (inter-52 putative novel gene fusions - 45 matched 2 different chromosomes (inter-chromosomal gene fusions) and 7 matched 2 different regions in the same chromosomal gene fusions) and 7 matched 2 different regions in the same chromosome (intra-chromosomal gene fusion) chromosome (intra-chromosomal gene fusion)

• Specific probe-ligation-based techniqueSpecific probe-ligation-based technique- 13 inter and 2 intra-chromosomal gene fusions were selected for validation – 2 - 13 inter and 2 intra-chromosomal gene fusions were selected for validation – 2 confirmedconfirmed

RNA-seq assessment: discovery of splicing variants RNA-seq assessment: discovery of splicing variants and novel genesand novel genes

Quantificação do RNA: ERBB2 efeitos mediados no transcriptoma de linhagem celular de mama

Criteria for DEG fold-change >4 BER<0,0001

15,1 Fold change – ERBB2

52.3% confirmed by qRT-PCR (46 out of 88)

Conclusão NGS• NGS revolucionando pesquisas genômicas em um contexto rápido

e rentável comparado com tradicional Sanger.

• Custo reduzido se comparado ao número de reads gerado por corrida.

• RNA-Seq permite quantificar transcriptoma independente do tamanho do transcrito.

• Identificar possíveis rearranjos cromossômicos, SNPs, splice alternativo.

Agradecimentosao time do LBHC

Renato Puga

Leandro Lima

Barbara Mello

Aderbal Silva

Cecília Feio

César Torres

Hospital A.C. Camargo

Laboratório de Genômica

Dra. Dirce Maria Carraro

Elisa Napolitano

Gustavo Molina