UNIVERSIDADE DE SO PAULO

INSTITUTO DE FSICA DE SO CARLOS

Mario de Oliveira Neto

Espalhamento de raios X a baixo ngulo aplicado ao estudo

estrutural de protenas

So Carlos 2008

MARIO DE OLIVEIRA NETO

Espalhamento de raios X a baixo ngulo aplicado ao estudo

estrutural de protenas

Tese apresentada ao programa de Ps-graduao em Fsica do Instituto de Fsica de So Carlos, da Universidade de So Paulo, para obteno do ttulo de Doutor em Cincias. rea de concentrao: Fsica Aplicada. Opo: Fsica Biomolecular.

Orientao: Prof. Dr. Igor Polikarpov Co-orientao: Prof. Dr. Aldo Flix Craievich

So Carlos 2008

AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Ficha catalogrfica elaborada pelo Servio de Biblioteca e Informao IFSC/USP

Oliveira Neto, Mario de Espalhamento de raios X a baixo ngulo aplicado ao estudo estrutural de protenas /Mario de Oliveira Neto; orientador Igor Polikarpov./ co-orientador Aldo Felix Craievich.-- So Carlos, 2008.

153p.

Tese (Doutorado em Cincias - rea de concentrao: Fsica Aplicada Opo Fsica Biomolecular) Instituto de Fsica de So Carlos da Universidade de So Paulo.

1. SAXS. 2.Receptores nucleares. 3. IL-22/IL-22R1. 4. ferredoxina. I. Ttulo.

DEDICATRIA

A Pri, aos meu pais e irmos, com todo

amor e carinho.

AGRADECIMENTOS

Aos orientadores, prof. Igor Polikarpov, prof. Aldo Flix Craievich, prof. Yvonne

Primerano Mascarenhas e Hannes Fischer, pela confiana, amizade e pelas aulas de SAXS; a

Maria Auxiliadora dos Santos, Marcos Calgaro e Ana Carolina M. Figueira pelos ensinamentos

no laboratrio de bioqumica; a equipe da oficina mecnica do IFSC, sob coordenao de Carlos

Nazareth Gonalves que desenvolveram os projetos mecnicos solicitados para o equipamento de

SAXS do IFSC; aos tcnicos de raios X, Jos Augusto L. Rocha e Jos Geraldo Catarino; as

tcnicas do laboratrio de Bioqumca Norma Bianca Saes e Susana Andrea Sculaccio; ao Michel

Ballestero, aluno de iniciao cientfica, parceiro nos estudos de SAXS; ao Thiago Bueno

(ICMC/USP) pelo programa de pr-tratamento de dados feito para o equipamento de SAXS do

IFSC; ao Ronaldo Luiz Alonso pelas demonstraes matemticas envolvidas no fenmeno de

espalhamento; as pessoas que confiaram no meu trabalho, e que desenvolvo estreita colaborao:

Douglas Machado (IQSC/USP), Tatiana Bastista (IQSC/USP), Carla Cristina Schmitt

Cavalheiro (IQSC/USP), Caroline Migliorini Figueira (IFSC/USP), Wanius Garcia

(IFSC/USP), Fabio de Lima Leite (Embrapa), Eliangela de Morais Teixeira. Jos Ribamar S.

F. Jnior (USP) e Jos Ramon Beltran Abrego (Ibilce/UNESP); aos professores, colegas de

trabalho e funcionrios do Departamento de Cristalografia; aos amigos Luis Maurcio T. R. Lima

(UFRJ), Napoleo F. Valadares (IFSC/USP), Rodrigo Mello, Fabiano Mello, Carlos

Castilho A. Frana e Helena Aguiar Frana. Aos amigos de longa data, Eric Marques Regadas,

Renan Marques Regadas, Fabio Fuckuma, Emerson Ribeiro e Antnio Joaquim da Silva Neto.

Em especial a famlia pelo constante apoio, meu pai Gilmar Andrade de Oliveira, minha me

Cristina Dantas de Oliveira, meus irmos Rodrigo Andrade de Oliveira e Luciana Dantas Di

Stfano, Renato Di Stfano, Lorenzo Di Stfano, Ceclia A. de Paula; aos meus padrinhos

Shiguero Takai e Leomar Leite Takai, a minha futura esposa Priscila Maziero. e seus pais

Alcides Antnio Maziero (Alemo) e Sonia Regina Maziero. Muito obrigado!!!Todos vocs esto

comigo...

No convm a gente levantar escndalo de comeo: s aos poucos que o escuro claro

(Guimares Rosa)

Resumo

O espalhamento de raios X a baixo ngulo tem se mostrado uma poderosa ferramenta na

nalise estrutural de protenas em soluo. Estudos em condies prximas ao estado nativo

podem ser realizados, permitindo a visualizao tridimensional de protenas ou complexos

formados. A tese apresentada aborda a teoria envolvida para utilizao desta ferramenta. Uma

nova metodologia foi proposta para a determinao da massa molecular de protenas em soluo,

utilizando apenas uma curva de SAXS em unidades arbitrrias, visto que at o momento, este

procedimento era realizado em comparao com outra protena padro de peso molecular

conhecido. Com relao instrumentao cientfica, um equipamento de SAXS foi desenvolvido

no Instituto de Fsica de So Carlos, permitindo agora que medidas de SAXS em protenas em

soluo sejam realizadas no instituto. Clonagem, expresso e purificao foram realizadas para o

domnio de ligao ao DNA da isoforma do receptor tireoideano humano, a caracterizao

experimental desta protena foi realizada por anisotropia de fluorescncia, crosslink e SAXS.

Aps formao do complexo DNA-protena, F2-DBD hTR, o mesmo foi submetido a

cristalizao, os cristais obtidos para o complexo no apresentaram padro de difrao e modelos

de baixa resoluo foram gerados utilizando SAXS. Alm disso, estudos de baixo ngulo foram

realizados linha de SAXS do LNLS para a enzima ferredoxina redutase de leptospira interrogans

e para o complexo formado por interleucina-22 e pelo receptor interleucina-22, sendo seus

modelos tridimensionais resolvidos.

Palavras-Chave: SAXS. receptores nucleares. IL-22/IL-22R1. ferredoxina.

ABSTRACT

Small angle X-ray scattering has been proven to be a powerful tool in the structural

analysis of proteins in solution. This technique permits the three-dimensional visualization of

native proteins envelop at the level of nanometers. In this study we discuss the small angle X-ray

scattering theory and we proposed a new methodology to determine the molecular weight of

proteins in solution, using only SAXS curve in arbitrary units. Prior the development of this

method, the proteins molecular weighs were calculated by comparison with another of known

size, usually bovine serum albumin. We also assembled SAXS equipment at the Physics Institute

of So Carlos, which will permits in house measurements; as well as the cloning, expression and

purification of DBD hTR, followed by the characterization of this protein by fluorescence

anisotropy, crosslink and SAXS. The DNA-protein complex, F2-DBD hTR, was subjected to

crystallization assays. Although, the crystals obtained for the complex showed no pattern of

diffraction we were able to generate low-resolution models for the F2-DBD hTR using SAXS

analysis. Moreover, the studies of the protein LepFNR and the complex IL-22/IL-22R1 by small

angle X-ray scattering were performed in the line of SAXS of the LNLS, and their three-

dimensional models were resolved.

Keywords: SAXS. nuclear receptor. IL-22/IL-22R1. ferredoxin.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 - viso esquemtica do espalhamento de raios X por eltrons livres. Um eltron est localizado na origem O na qual um feixe monocromtico, paralelo e polarizado de raios X incidente...........................................................................................................................................22

Figura 1.2 - viso esquemtica do espalhamento de raios X por um eltron sobre a ao de um feixe no polarizado. O eltron localizado na origem O na qual um feixe de raios X paralelo, monocromtico e no polarizado incidente na direo Ox. O campo incidente tem uma componente paralela ao plano OXP, E//, e outra perpendicular a este plano, E. ...................................23

Figura 1.3 - viso esquemtica do espalhamento de raios X por um par de eltrons. (A). Um eltron est localizado na origem e o outro a uma distncia r

r. Existe uma diferena (AB + BC)

no caminho ptico entre os dois feixes espalhados, causando uma diferena de fase. (B).

Relao geomtrica entre os vetores 1Br

, 0Br

, e qr

. ...............................................................................25

Figura 1.4 - Lei da reciprocidade entre espaos real e reciproco. Duas esferas com densidade eletrnica constante )(r

r e raios R1 e R2 sofrendo a ao do mesmo feixe de raios X. As

intensidades so normalizadas por I(0). .................................................................................................28

Figura 1.5 - Representao esquemtica para a amplitude de espalhamento. Carbono (linha azul) e oxignio (linha vermelha).......................................................................................................................29

Figura 1.6 - Intensidades de espalhamento e funo de distribuio de distncias para diferentes objetos geomtricos. Figura extrada de (SVERGUN, KOCH, 2003). ..................................................38

Figura 1.7 Representao esquemtica de uma protena em soluo........................................................................45

Figura 3.1 - Esquema do equipamento de SAXS do IFSC. 1. Gerador de Raios X; 2. monocromador; 3. Fendas horizontal e vertical, o equipamento possui duas caixas de fendas espaadas de 1 metro; 4. Tubo evacuado de 1 metro de comprimento; 5 Fenda horizontal (parasita); 6. Porta-amostra; 7. caminho de vcuo; 8. Bloqueador do feixe direto; 9. Detector unidimensional sensvel a posio..........................................................................................................51

Figura 3.2 - Viso geral do mocromomador. ...............................................................................................................53

Figura 3.3 - Sistema de colimao. (A) Viso geral do sistema de colimao. (B) Viso frontal da caixa das fendas 1 e 2 . (C) Viso frontal da fenda 3 ( fenda parasita). ...........................................................54

Figura 3.4 Porta-amostra...........................................................................................................................................55

Figura 3.5 - Caminho de vcuo e bloquador do feixe direto. (A) viso geral do caminho de vcuo. (B) O bloqueador do feixe direto encontra-se em frente a janela de sada dos ftons espalhados, o bloqueador pode ser movimentado com a ajuda de um micrmetro................................56

Figura 3.6 - Sistema de deteco unidimensional sensvel a posio. .........................................................................57

Figura 3.7 - esquema demonstrando a geometria de feixe linha com detector unidimensional. A altura do feixe, assim como a janela do detector causam deformao na curva de SAXS. ..............................60

Figura 3.8 - Monocromador otimizado para o Cobre. (A) viso lateral da caixa do espelho monocromador. (B) viso superior da caixa do espelho monocromador. ..............................................63

Figura 3.9 - Cela do porta-amostra com cmara para exposio de filmes de raios X para verificao do alinhamento do porta-amostra. .............................................................................................................. 63

Figura 3.10 - Perfil Trapezoidal do feixe de raios X. .................................................................................................. 64

Figura 3.11 - Imagens do feixe de raios X obtidas durante o alinhamento do equipamento. Na imagem da esquerda verficamos o feixe branco contendo todos os comprimentos de onda de raios X do Cu e o feixe com comprimento de onda do K do Cu. Na imagem da direita, temos somente o feixe K do Cu, aps o fechamento da fenda de sada da cmara do espelho monocromador....................................................................................................................................... 66

Figura 3.12 - (A) Cela do porta-amostra, e cmara para exposio de filme. (B) Filme de raios X demonstrando o perfil do feixe na posio do porta-amostra. ............................................................... 67

Figura 3.13 - Medida experimental do perfil da altura do feixe de raios X, obtido no plano de deteco. ................. 68

Figura 3.14 - Intensidade de espalhamento em funo do vetor de espalhamento q. (A) BSA medida a distncia de 339 mm. (B) ferredoxina medida a distncia de 739 mm. ................................................. 69

Figura 3.15 - (A) Curvas de espalhamento corrigidas pelo efeito de deformao de ferredoxina a 5 mg/mL (B) Funo de distribuio de distncias para ferredoxina obtidas no IFSC. Pontos com barras de erros so os dados experimentais corrigidos pelo efeito de deformao da curva e a linha azul o espalhamento simulado para o monmero de ferredoxina pdb id:2RC5 ....................................................................................................................... 70

Figura 3.16 - Principais componentes da linha de SAXS do LNLS. (1) espelho para focalizao vertical do feixe; (2) cristal de silcio para monocromatizao e focalizao horizontal do feixe; (3) sistema de colimao; (4) porta-amostra; (5) detector de raios X. Uma viso lateral do equipamento mostrada na parte superior da figura e outra viso superior do equipamento mostrada na parte inferior da figura (KELLERMAN et al, 1997)................................. 72

Figura 4.1 - Volume calculado para esferas de diferentes Rg ( 33/4 RV = ) contra o volume calculado pela relao QI /)0(2 2 a partir das curvas de I(q) calculadas para estas esferas. A equao 45 foi calculada para diferentes qmx. Os intervalos mostrados vo de 1x10

3 3 V 106 3 e 0.1 -1 qmax 0.9

-1. .................................................................................................... 78

Figura 4.2 - Volume calculado com o programa Crysol para as 1148 protenas do PDB em funo do volume calculado a partir das curvas simuladas de SAXS para as mesmas 1148 protenas utilizando a relao QI /)0(2

2 para diferentes valores de qmx. Os valores so mostrados em intervalos de qmx. 0.2, 0.3 e 0.4-1. A linha tracejada representa o volume esperado para as protenas. ................................................................................................................................... 79

Figura 4.3 - Coeficientes obtidos a partir da reta obtida na figura 4.2 (A) coeficiente linear contra o valor de qmx (B) coeficiente angular contra o valor de qmx . ................................................................. 79

Figura 4.4 - (A) Intensidade de espalhamento para Ferrodoxina. (B) Intensidade vezes (q2) para Ferrodoxina. Os dados experimentais so dados em pontos e o ajuste do Gnom extrapolado a q=0 em linha preta........................................................................................................... 80

Figura 4.5 - Razo entre a massa molecular real (MMreal) e calculada (MMcalculado) contra a massa molecular do oligmero (MMreal) para 25 protenas estudadas.............................................................. 83

Figura 5.1 - Ilustrao esquemtica do RXR DBD.. ................................................................................................... 86

Figura 5.2 - Elementos de resposta a receptores nucleares. ........................................................................................ 89

Figura 5.3 - Eletroforese em 1% gel de agarose (BioRad) para visualizao do produto da reao de digesto com as enzimas de restrio NdeI e XhoI...............................................................................108

Figura 5.4 - Eletroforese em 1% gel de agarose (BioRad) para visualizao do produto da reao de PCR. .....................................................................................................................................................109

Figura 5.5 - SDS PAGE, expresso em funo do tempo de induo. (1) MM, (2) T0 Induo, (3) 1 hora (4) 2 horas (5) 3 horas (6) 4 horas (7) 5 horas. .....................................................................................109

Figura 5.6 - SDS PAGE - Lise celular (1)MM, (2) extrato lisado, (3) pellet. A seta preta indica o His6DBD hTR (15.3 KDa). ................................................................................................................110

Figura 5.7 - SDS PAGE - cromatografia de afinidade (1) MM, (2) extrato, (3) 1 Lavagem 10 mM Imidazol(4) 2 Lavagem 10 mM Imidazol (5) 3 Lavagem 10 mM Imidazol (6) Eluio 3 vc 250 mM Imidazol (7) Eluio 3 vc 500 mM Imidazol (8) Eluio 3 vc 500 mM Imidazol. A seta preta indica o His6 DBD-hTR (15.3 KDa)...............................................................111

Figura 5.8 - Curva de calibrao da Superdex 75 HL 26/60......................................................................................112

Figura 5.9 - Eluio isocrtica do His6-DBD hTR, perfil medido a 280 nm. ..........................................................112

Figura 5.10 - SDS PAGE do his6 DBD-hTR aps purificao por excluso molecular: (1) padro de MM (2)his6 DBD-hTR .......................................................................................................................113

Figura 5.11 - SDS PAGE - Digesto com trombina bovina (1) padro de MM (2) T0 (3) 1 hora (4) 2 horas (5) 3 horas (6) 4 horas.................................................................................................................114

Figura 5.12 - Anisotropia de fluorescncia do DBD hTR. A anisotropia visualizada em funo da concentrao da protena. .....................................................................................................................114

Figura 5.13 Determinao da concentrao de DSS utilizado na reao de crosslinking. 130 M de DBD hTR reagiram com diferentes concentraes de DSS e as amostras foram resolvidas por SDS-PAGE em gel de poliacrilamida 15%. As concentraes finais de DSS, em mM, esto indicadas nas figuras. Os gel foi corado com Coomassie blue. ...........................115

Figura 5.14 - Crosslink qumico de DBD hTR em concentraes de 2 130 M com 2.5 mM de DSS e as amostras foram resolvidas por SDS-PAGE em gel de poliacrilamida 15%. As concentraes finais de DBD hTR em M, esto indicadas nas figura. O gel foi corado com Prata..............................................................................................................................................116

Figura 5.15 - Curva experimental de SAXS do DBD hTR a 40 M com ajuste do programa Oligomer (KONAREV et al, 2003). .....................................................................................................................117

Figura 5.16 - Gel Nativo da reao de ligao com DNA (1) padro de pesos moleculares, (2) DBD-hTR (3) DNA F2 (3) DBD-hTR . Aps eletrofores, protena e DNA podem ser visualizados no mesmo ponto no gel, o DNA em excesso pode ser visualizado mais abaixo no gel. .......................................................................................................................................117

Figura 5.17 - Micro cristais obtidos em condies de cristalizao (Hampton Research HR2-116). a.(0.05 M de Cacodilato de Sdio, pH 6.5, 0.08 M Acetato deMagnsio, 30% w/v PEG-4000) b.(0.05 MES, pH 5.6, 0.1 M Sulfato de Amnio, 0.01 M MgCl2, 20% w/v PEG-8000). ...................................................................................................................................................122

Figura 5.18 - Curva de espalhamento em soluo do hTR DBD ligado ao elemento responsivo F2 e resultados de procedimento de ajuste. Curva experimental (pontos com barras de erro);

intensidade de espalhamento para os DAMs (Gasbor) (linha azul clara); intensidade de espalhamento para o complexo em alta resoluo (linha amarela). O inserto contm o grfico de Guinier (ln I versus q)........................................................................................................ 123

Figura 5.19 - Funo de distribuio de distncia evoluda a partir da curva de espalhamento do complexo hTR DBD ligado ao F2. .................................................................................................... 124

Figura 5.20 - Sobreposio do modelo de tomos dummy (DAM) com o modelo proposto em alta resoluo. Os modelos so rotados 90 em relao aos eixos x e y. ................................................... 125

Figura 6.1 - Curva experimental de SAXS de LepFNR e ajuste terico com modelo modelo cristalogrfico. Curva experimental de SAXS (crculos com barra de erros); intensiade de espalhamento simulado a partir da DAM (linha verde); intensidade de espalhamento simulado a partir do monmero cristalogrfico de LepFNR (pdb id: 2RC5) (linha azul). O inserto contem o grfico de guinier, do qual foi calculado o Rg. ..................................................... 129

Figura 6.2 Comparao da funo de distribuio de distncias para LepFNR. As p(r) foram calculadas com o programa Gnom a partir dos dados experimentais (circulos com barra de erros); a partir do DAM (linha verde); a partir do monmero cristalogrfico de LepFNR (pdb id: 2RC5) (linha azul). .................................................................................................. 130

Figura 6.3 Viso stereo mostrando a superposio do monmero cristalogrfico de LepFNR com o modelo obtido ab initio por SAXS. A imagem superior foi rotacionada 90 em torno dos eixos x (centro) e y (inferior). .............................................................................................................. 131

Figura 6.4 (A) Estrutura cristalogrfica de IL-22 (pdb id:1M4R). (B) Estrutura cristalogrfica de IL-10 (pdb id: 1J7V)................................................................................................................................. 133

Figura 6.5 - Estrutura cristalogrfica do complexo IL-10/IL-10R1 (pdb id:1J7V). .................................................. 134

Figura 6.6 - Curva de espalhamento experimental de IL-22/IL-22R1 (log I contra q) e resultados de procedimento de ajuste. O inserto contm o grfcio de Guinier (log I versus q2). Curva experimental aps a subtrao da constante de Porod (crculo com barra de erros); intensidade de espalhamento simulado para o DAM (Dammin) (linha verde); intensidade de espalhamento simulado para o modelo de corpo rgido (linha azul); intensidade de espalhamento simulado para o IL-10/IL-10R1 (pdb id: 1J7V) (linha vermelha)................................. 136

Figura 6.7 - Funo de distribuio de distncias para os dados experimentais de IL-22/IL-22R1 (crculos com barras de erros); para o modelo de corpo rgido (linha azul); e para IL-10/IL-10R1 (linha vermelha). .............................................................................................................. 137

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1 - Parmetros responsveis pelo efeito de deformao nas curvas de SAXS. .............................................69

Tabela 3.2 - parmetros estruturais da ferredoxina obtidos por SAXS em comparao com Ferrodoxina cristalogrfico. ...................................................................................................................71

Tabela 4.1 - Volume, MM calculados e razo entre MM calculado e esperado (34.4 kDa) utilizando vrios valores de qmx para ferredoxina. ..............................................................................................81

Tabela 4.2 - Volume, MM calculados e razo utilizando vrios valores de qmax para as 25 protenas estudadas. Os resultados so mostrados em ordem crescente de MM....................................................81

Tabela 5.1 - oligonucleotdeos iniciadores utilizados para a amplificao ds gene DBD hTR. ................................91

Tabela 5.2 - Reagentes utilizados na reao de PCR. ..................................................................................................91

Tabela 5.3 - Protocolo do programa de PCR (com Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity) utilizado pelo termociclador PTC-100 TM Programable Thermal Controller..........................................92

Tabela 5.4 - Reagentes usados na reao de adio de dATP no gene DBD hTR.....................................................93

Tabela 5.5 - Reagentes usados na reao de ligao do fragmento do DBD hTR adenilado no vetor pGEM-T (Promega). ............................................................................................................................93

Tabela 5.6 - Reagentes utilizados nas reaes de clivagem. ........................................................................................95

Tabela 5.7 - Reagentes usados nas reaes de clivagem (NdeI e XhoI). .....................................................................95

Tabela 5.8 - Reagentes utilizados na reao de ligao com T4 DNA Ligase (Invitrogen). ........................................96

Tabela 5.9 - condio de cristalizao dos complexos de DBDs dos receptores nucleares e seus elementos responsivos. .........................................................................................................................119

Tabela 5.10 - condio do poo - 20 mM Hepes, PEG 3350 w/v 15-50%, pHs 6.5 8.0 ........................................121

Tabela 5.11 - Parmetros estruturais do complexo F2 DBD hTR. ..........................................................................123

Tabela 6.1 Parmetros estruturais da LepFNR. ......................................................................................................132

Tabela 6.2 Parmetros estruturais da IL-22/IL-22R1..............................................................................................139

LISTA DE ABREVIATURAS AF-1 - funo de ativao 1

BSA albumina de soro bovino

DAM modelo de tomos dummy

DBD domnio de ligao ao DNA

DBD hTR - domnio de ligao ao DNA da isoforma do receptor tireoideano humano

Dmx. dimetro mximo

DMSO sulfoxido de dimetil

DR repetio direta

DSS succinimidil

DTT - Ditioiodotreitol

ER receptor do estrognio

F2 Palmdromo invertido espaado por 6 pares de base

FITC Isotiocianato de fluoresceina

GR receptor de glucocorticide

HREs elementos responsivos dos hormnios

IL-22/IL-22R1 interleucina 22/receptor 1 de interleucina 22

IPTG - Isopropil -D-tiogalactopiranosdeo

LBD domnio de ligao ao ligante

LB Meio de cultura c

LepFNR ferredoxina de Leptospira interrogans

MM massa molecular

NGFI-B protena B induzida pelo fator de crescimento neural

PCR reao de polimerizao em cadeia

PDB banco de dados de protenas

PPAR - receptor ativador da proliferao de peroxissomos

PSD 1D detector unidimensional sensvel a posio

PTC controle de temperature programvel

RAR receptor do cido retinico

Rg raio de giro

RXR receptor do cido retinico X

SAXS espalhamento de raios X a baixo ngulo

TR receptor tireoideano

TREs elementos responsivos do T3

V - volume

VDR receptor de vitamina D

SUMRIO

1 Teoria de espalhamento de raios X a baixo ngulo aplicado ao estudo estrutural de protenas. ............................. 20

1.1 Princpios do espalhamento de raios X. ................................................................................................................ 21 1.1.1 Espalhamento de raios X por eltrons livres. ...................................................................................................... 21 1.1.2. Espalhamento de raios X por dois elementos de volume, interferncia. ............................................................ 25 1.1.3 Lei da reciprocidade............................................................................................................................................ 27 1.1.4 O problema de fase............................................................................................................................................. 28 1.1.5 Espalhamento de raios X por um tomo ............................................................................................................. 29 1.1.6 Espalhamento de raios X para um grupo de n tomos ........................................................................................ 30 1.1.7. Transformada inversa da funo Intensidade. .................................................................................................... 30 1.1.8 Espalhamento para sistemas diludos. ................................................................................................................. 32 1.1.9 Redefinio da funo de correlao................................................................................................................... 35 1.1.10 Sistema isotrpico, diludo e monodisperso...................................................................................................... 36

1.2 Anlises das curvas de SAXS ............................................................................................................................... 38 1.2.1 Regio dos menores qs na curva de SAXS, determinao do raio de girao .................................................... 39 1.2.2 Regio central da curva de SAXS, determinao do volume.............................................................................. 39

1.3 Anlises de protenas em soluo utilizando SAXS.............................................................................................. 41 1.3.1 Reconstruo ab-initio da forma da protena a partir de dados de SAXS. .......................................................... 41 1.3.2 Clculo de intensidade de SAXS a partir das coordenadas atmicas .................................................................. 44

2 Objetivos do trabalho ............................................................................................................................................... 47

3 Instrumentao para o espalhamento de raios X a baixo ngulo.............................................................................. 49

3.1 Equipamento de SAXS do Instituto de Fsica da USP de So Carlos ................................................................... 49

3.1.1 Introduo. ......................................................................................................................................................... 50 3.1.1.1 Descrio detalhada dos componentes do equipamento.................................................................................. 52 3.1.1.2 Efeito de deformao da curva de intensidade de SAXS (smearing) ............................................................... 58 3.1.2 Metodologia ........................................................................................................................................................ 62 3.1.2.1 Alinhamento do equipamento .......................................................................................................................... 62 3.1.2.2 Efeito de deformao da curva de intensidade de SAXS (smearing) ............................................................... 64 3.1.2.2.1 Medida dos parmetros do feixe ................................................................................................................... 64 3.1.2.3 Experimentos para caracterizao do equipamento.......................................................................................... 65 3.1.3 Resultados ........................................................................................................................................................... 66 3.1.3.1 Alinhamento do equipamento .......................................................................................................................... 66 3.1.3.2 Correo da deformao da curva de intensidade de SAXS ............................................................................ 68 3.1.3.3. Experimento padro para caracterizao do equipamento. ............................................................................. 69

3.2 Linha de SAXS do Laboratrio Nacional de Luz Sincrotron................................................................................ 72

4 Procedimento e resultados de determinao do estado oligomrico de protenas em soluo utilizando SAXS em escala relativa....................................................................................................... 74

4.1 Introduo ............................................................................................................................................................. 75

4.2 Metodologia .......................................................................................................................................................... 75

4.3 Resultados ............................................................................................................................................................. 77

4.4 Concluso.............................................................................................................................................................. 83

5 Caracterizao do domnio de ligao ao DNA da isoforma do receptor tireoideano (DBD hTR) .................. 84 5.1 Introduo ............................................................................................................................................................. 85

5.1.1 Os receptores nucleares....................................................................................................................................... 85 5.1.1.1 Detalhes da ligao do DBD aos elementos responsivos do DNA .................................................................. 86 5.1.1.2 Os Receptores Tireoideanos ............................................................................................................................ 89

5.2 Metodologia ...........................................................................................................................................................90 5.2.1 Sub-clonagem do fragmento de DNA codificador do DBD hTR ..................................................................... 90 5.2.2 Expresso do DBD hTR em clulas competentes de Escherichia coli BL21(DE3).......................................... 98 5.2.3 Purificao do domnio de ligao ao DNA do Receptor Tireoideano Isoforma ............................................. 99 5.2.3.1 Cromatografia por afinidade do domnio DBD do hTR ................................................................................ 99 5.2.3.2 Cromatografia por excluso molecular .......................................................................................................... 100 5.2.4 Digesto com trombina bovina ......................................................................................................................... 100 5.2.5 Anisotropia de Fluorescncia............................................................................................................................ 101 5.2.6 Crosslink Qumico ............................................................................................................................................ 101 5.2.7 SAXS do DBD hTR........................................................................................................................................ 103 5.2.8 Ligao do DBD hTR no elemento responsivo F2 ......................................................................................... 104 5.2.9 Ensaio de cristalizao do DBD hTR ............................................................................................................. 104 5.2.10 SAXS do complexo F2-DBD hTR................................................................................................................ 105

5.3 Resultados............................................................................................................................................................107 5.3.1 Sub-clonagem do fragmento de DNA codificador do DBD hTR ................................................................... 107 5.3.1.1 Sub-clonagem do fragmento de DNA codificador do DBD hTR no vetor pGEM-T ................................ 107 5.3.1.2 Sequenciamento do fragmento DBD hTR ................................................................................................... 108 5.3.1.3 Transformao em clulas competentes de Escherichia coli BL21(DE3) ..................................................... 108 5.3.2 Expresso do DBD hTR em clulas competentes de Escherichia coli BL21(DE3)........................................ 109 5.3.3 Purificao do domnio de ligao ao DNA do Receptor Tireoideano Isoforma ........................................... 110 5.3.3.1 Cromatografia por afinidade do DBD hTR.................................................................................................. 110 5.3.3.2 Cromatografia por excluso molecular .......................................................................................................... 111 5.3.4 Digesto com trombina bovina ......................................................................................................................... 113 5.3.5 Anisotropia de Fluorescncia............................................................................................................................ 114 5.3.6 Crosslink Qumico ............................................................................................................................................ 115 5.3.7 SAXS do DBD hTR........................................................................................................................................ 116 5.3.8 Ligao do DBD hTR no elemento responsivo F2 ......................................................................................... 117 5.3.9 Estudos de cristalizao do complexo DBD hTR ligado ao elemento responsivo F2 .................................... 118 5.3.10 SAXS do F2 DBD hTR................................................................................................................................. 122

5.4 Concluso ............................................................................................................................................................125

6 Estudos por SAXS de ferredoxina-FAD e do complexo formado por interleucina-22 e interleucina-22R1 .....................................................................................................................................................126

6.1 Estrutura de baixa resoluo de ferredoxina de Leptospira interrogans...............................................................127 6.1.1 Introduo ......................................................................................................................................................... 127 6.1.2 Metodologia ...................................................................................................................................................... 128 6.1.3 Resultados e Discusso ..................................................................................................................................... 129 6.1.4. Concluso ........................................................................................................................................................ 132

6. 2 Estrutura de baixa resoluo do complexo IL-22/IL-22R1.................................................................................133 6.2.1 Introduo ......................................................................................................................................................... 133 6.2.2 Metodologia ...................................................................................................................................................... 134 6.2.2.1 Anlise dos dados de SAXS .......................................................................................................................... 134 6.2.2.2 Modelagem de corpo rgido do complexo IL-22/IL-22R1............................................................................. 135 6.2.3 Resultados e discusso...................................................................................................................................... 136 6.2.4 Concluso ......................................................................................................................................................... 139

Referncias 140

Anexo 1. Lista de trabalhos publicados durante o perodo. ...............................................................................151 Anexo 2 Publicaes descritas na tese .................................................................................................................... 153

20 Captulo 1

1 Teoria de espalhamento de raios X a baixo ngulo aplicado ao

estudo estrutural de protenas.

Resumo

A determinao da estrutura terciria e quaternria de protenas em soluo um

importante passo para completa caracterizao da amostra em estudo. A interpretao de dados

de SAXS - espalhamento de raios X a baixo ngulo permite uma anlise detalhada da estrutura

global de protenas, as quais podem ter seu tamanho varivel entre poucos kDa e muitos MDa. A

determinao direta do envelope molecular, a predio de estruturas quaternrias em oligmeros,

a verificao de transies conformacionais que ocorrem por interao com ligantes, assim como,

a visualizao de processos de enovelamento e desenovelamento protico (SVERGUN; KOCH,

2003) podem ser realizadas com SAXS (SVERGUN et al, 1996). Com o empacotamento

cristalogrfico, perdemos a informao exata a respeito da estrutura quaternria de uma protena.

Uma ligeira mudana na posio relativa dos domnios, ou subunidades, pode ser melhor

visualizada prximo ao estado nativo, utilizando SAXS. Neste tipo de experimento, uma soluo

de macromolculas exposta aos raios X. A intensidade espalhada I(q) funo da transferncia

de momento q. O captulo a seguir explana detalhadamente a teoria envolvida em SAXS, o

mesmo foi sintetizado no captulo Simulated Annealing of Two Electron Density Solution

Systems, aceito para publicao no livro Global Optimization: Focus on Simulated Annealing, I-

Tech Education and Publishing KG.

Captulo 1 21

1.1 Princpios do espalhamento de raios X.

1.1.1 Espalhamento de raios X por eltrons livres.

O uso dos raios X na caracterizao estrutural de materiais depende essencialmente de sua

interao com a matria atravs dos eltrons que constituem seus tomos e molculas. Os eltrons

so sensveis aos campos, eltrico e magntico oscilando senoidalmente. Se a radiao incidente

monocromtica, os campos, eltrico e magntico podem ser representados por uma funo

peridica do tipo:

tEE 2cos0rr

=

tHH 2cos0rr

=

(1)

onde 0Er

e 0Hr

so respectivamente os valores mximos dps campos eltricos e magnticos e

a freqncia da radiao.

A direo da propagao dos raios X dada pelo vetor de Poynting: HEcPrrr

= )4/( .

Considerando-se um eltron situado na origem de um sistema de coordenadas xyz, sobre o qual

incide um feixe paralelo, polarizado e monocromtico de raios X. (figura 1.1). O eltron sob a

ao do campo eltrico 0Er

da onda incidente sofre a ao de uma fora dada por:

tEeF 2cos0rr

= (2)

22 Captulo 1

Figura 1.1 - viso esquemtica do espalhamento de raios X por eltrons livres. Um eltron est localizado na origem O na qual um feixe monocromtico, paralelo e polarizado de raios X incidente.

Sob a ao dessa fora o eltron acelerado

tm

Ee

m

Fa 2cos0

rrr

== (3)

em decorrncia desta acelerao o eltron torna-se uma fonte esfrica de ondas eletromagnticas

de mesma freqncia que a radiao incidente (espalhamento elstico). O espalhamento

produzido pelo eltron foi analisado por J. J. Thomson, o qual determinou que:

204

sin

cR

eaE

= (4)

Substituindo a equao 3 em 4 temos:

20

02

4

sin2cos

cRwt

m

EeE

= (5)

onde o ngulo entre a direo do feixe espalhado e a direo do campo eltrico da onda

incidente, o a constante dieltrica do vcuo, R a distncia entre o eltron e o ponto de

observao, c a velocidade da luz, e m e e so respectivamente, a massa e carga do eltron. A

Captulo 1 23

expresso mc

e2

0

2

4 tem a dimenso de comprimento e, de acordo com o eletromagnetismo

clssico, denominada comprimento de espalhamento ou raio do eltron ( m1510.82.2 ). Para

simplificar a notao a amplitude da onda espalhada por um eltron livre ser designada apenas

por eA .

mc

eAe 2

0

2

4=

(6)

Para o caso do feixe incidente no polarizado, considerara-se o campo eltrico do feixe

incidente decomposto em duas componentes iguais mutuamente perpendiculares. Na figura 1.2

temos um feixe no polarizado paralelo propagando-se na direo Ox incidindo sobre um eltron

situado em O. Para determinar a natureza do campo eltrico espalhado na direo OP, o campo

eltrico incidente pode ser decomposto em duas componentes mutuamente perpendiculares, uma

paralela ao plano OXP, E//, e outra perpendicular, E.

Figura 1.2 - viso esquemtica do espalhamento de raios X por um eltron sobre a ao de um feixe no polarizado. O eltron localizado na origem O na qual um feixe de raios X paralelo, monocromtico e no polarizado incidente na direo Ox. O campo incidente tem uma componente paralela ao plano OXP, E//, e outra perpendicular a este plano, E.

24 Captulo 1

Sob a ao desses dois campos o eltron adquire uma acelerao com componentes

perpendicular e paralela dadas respectivamente por a meEa / = e meEa ///// = . Substituindo

estas expresses na equao 5, obtemos o campo eltrico da onda espalhada:

R

EA

mRc

EeE e == 2

0

2

4'

R

EA

mRc

EeE e

2cos4

2cos' //

20

//2

// ==

(7)

a intensidade Io do feixe incidente pode tambm ser decomposta em duas componentes iguais

perpendicular e paralela, respectivamente proporcionais a 2E and E//2:

2022

//

IEE =

(8)

E a intensidade total espalhada no ponto P ser dada por:

]''[)2( 22// += EEI

2

)2cos1(

4)2(

22

20

2

20

+

=

mc

e

R

II

2

)2cos1()()2(

22

20

+

= eAR

II

(9)

Levando-se em conta ainda que Io e R podem ser considerados constantes durante a

medida, a intensidade espalhada pelo eltron dada por:

2

)2cos1()2,(

22

+= ee ARI

(10)

Pode-se observar pelas equaes 6 e 9 que apenas os eltrons contribuem efetivamente

para a intensidade espalhada, pois a mesma varia inversamente com o quadrado da sua massa.

Por essa razo, embora os ncleos atmicos tambm sejam carregados e, portanto, tambm

Captulo 1 25

sofram a ao do campo eltrico da onda incidente, sua massa muito maior que a dos eltrons

(massa do prton = 1837 vezes a massa do eltron) e sua contribuio para a intensidade total

desprezvel. O termo (1 + cos2 2)/2 chamado fator de polarizao, em experimentos de SAXS,

o mximo ngulo de espalhamento est em torno de 5 graus e (1 + cos2 2)/2 praticamente 1.

1.1.2. Espalhamento de raios X por dois elementos de volume, interferncia.

Para calcular a amplitude de um feixe monocromtico de raios X espalhado por um corpo

com densidade eletrnica )(rr

arbitrria, calcularemos primeiramente a amplitude espalhada por

um elemento de volume )(rdr

. Consideremos em uma partcula, dois eltrons espaados por um

rr

, imersos em um feixe de raios X paralelo e monocromtico, como ilustrado na figura 1.3(A).

As ondas espalhadas sero coerentes, espalhamento incoerente tambm pode ocorrer, mas ser

desprezvel para os baixos ngulos.

(A) (B)

Figura 1.3 - viso esquemtica do espalhamento de raios X por um par de eltrons. (A). Um eltron est localizado na origem e o outro a uma distncia r

r. Existe uma diferena (AB + BC) no caminho ptico

entre os dois feixes espalhados, causando uma diferena de fase. (B). Relao geomtrica entre os

vetores 1Br

, 0Br

, e qr

.

Como existe uma diferena de caminho ptico entre os dois feixes, haver

obrigatoriamente uma diferena de fase entre eles representada por :

26 Captulo 1

l

=2

(11)

como a diferena de caminho ptico dada por BCB A l += , a diferena de fase :

) A(2 BCB +

= (12)

As direes dos feixes, incidente e espalhado so dadas pelos versores unitrios 0Br

e 1Br

.

0BrABrr

= e 1BrBCrr

= (13)

E a diferena de fase pode ser reescrita:

)(2 1 0BBr

rrr

= (14)

onde:

)(2 1 0BBq

rrr

= (15)

ento:

2cosrqqr ==rr

(16)

onde 2 o ngulo entre rr

e sr

. Assim, somente o produto dos componentes qrrr

relevante

para .

Na prtica, devido ao enorme nmero de eltrons em uma macromolcula, conveniente

introduzir o conceito de densidade eletrnica )(rr

. A amplitude de espalhamento ser dada por:

= dVerAqA ie )()(rr

(17)

Substituindo a equao 16 em 17:

dVerAqA qrie =rrrr

)()( (18)

Captulo 1 27

A Figura 1.3(B) mostra as relaes geomtricas existentes entre os vetores 12 Br

, 02 Br

,

e qr

. Pode ser visto facilmente que qr

perpendicular a bissetriz do ngulo entre 12 Br

e 02 Br

,

e que seu mdulo :

sin4

=q (19)

1.1.3 Lei da reciprocidade

Qualquer processo de espalhamento caracterizado por uma lei de reciprocidade que d

uma relao inversa entre tamanho da partcula e ngulo de espalhamento. No caso de duas

esferas com densidade eletrnica )(rr

e raios R1 and R2 sob a ao do mesmo feixe de raios X;

dI a intensidade espalhada para um elemento de volume dV para dois diferentes pontos da

esfera. (figura 1.4). Assim, existe uma diferena de caminho ptico nas duas esferas. Se 2

zero, ento q, e so nulos para todos os elementos de volume. A mesma diferena de

caminho igual a , por exemplo, ocorre a mais altos ngulos para a esfera menor. As curvas de

espalhamento para as duas esferas claramente revelam a reciprocidade existente entre os espaos

real e de espalhamento, tambm chamado, espao recproco. Uma conseqncia para a relao de

reciprocidade entre os espaos, direto e recproco que quanto maior for a partcula, seu

espalhamento de raios X a baixo ngulo estar concentrado em menores intervalos 2.

(GLATTER; KRATKY, 1982)

28 Captulo 1

Figura 1.4 - Lei da reciprocidade entre espaos real e reciproco. Duas esferas com densidade eletrnica constante )(r

r e raios R1 e R2 sofrendo a ao do mesmo feixe de raios X. As intensidades so

normalizadas por I(0).

1.1.4 O problema de fase

A intensidade de espalhamento )(qIr

pode ser medida quantitativamente, e proporcional

ao quadrado da amplitude de espalhamento A(q):

*)()()( qAqAqIrrr

(20)

onde *)(qAr

o complexo conjugado de )(qAr

.

De acordo com as propriedades de Fourier, a transformada inversa de )(qAr

(equao 18)

permite o clculo da )(rr

, o qual uma quantidade real e positiva. Contudo, para obter a )(rr

, a

fase e o mdulo do vetor de espalhamento )(qAr

so requeridos:

ieqAqA )()(rr

= (21)

Captulo 1 29

A intensidade de espalhamento, a qual medida experimentalmente, dada pela

multiplicao entre a amplitude de espalhamento e seu conjugado.

( ) 222 )()()()( qAeeqAqAqI ii rrrr == (22)

Somente o mdulo de )(qAr

pode ser conhecido, sua fase perdida. Este denominado

Problema da Fase. Desta forma, no podemos determinar )(qAr

, pois no conhecemos ie .

1.1.5 Espalhamento de raios X por um tomo

A equao 18 pode ser calculada para os tomos de todos os elementos sempre que se

conhea a funo )(rr

. Para qr

= 0, a integral da equao 18 resulta no nmero total de eltrons

dos diversos tomos neutros, i.e., o seu nmero atmico Z. Conforme qr

cresce, as diferenas de

fase levam a uma diminuio progressiva do valor de )(qAr

. Curvas deste tipo so mostradas para

o carbono e o oxignio na figura 1.5.

Figura 1.5 - Representao esquemtica para a amplitude de espalhamento. Carbono (linha azul) e oxignio (linha vermelha).

30 Captulo 1

Por definio, o fator de espalhamento atmico a razo entre a amplitude espalhada pelo

tomo e a amplitude espalhada por um eltron.

e

tomo

A

qAqf

)()(

rr

= (23)

1.1.6 Espalhamento de raios X para um grupo de n tomos

Uma vez obtidos os fatores de espalhamento atmicos, a equao 18 pode ser re-escrita

levando-se em conta o vetor posio jrr

de cada tomo e somando-se sobre todos n tomos, com

fator de espalhamento )(qf jr

:

=

=n

j

rqi

jjeqfqA

1

)()(rrrr

(24)

A intensidade de espalhamento pode ser obtida se as coordenadas atmicas dos tomos

so conhecidas. Para n tomos com fatores de espalhamento )(qf jr

e coordenadas jrr

para cada

centro de espalhamento da partcula:

= =

=n

j

n

k

rqi

kjjkefqfqI

1 1

)()(rrrr

(25)

1.1.7. Transformada inversa da funo Intensidade.

Devido ao Problema da Fase, no possvel inverter diretamente )(qAr

para obter a

densidade eletrnica )(rr

. Patterson props o clculo da transformada de Fourier tomando como

coeficientes as intensidades dos feixes espalhados, obtidos pelo produto de )(qAr

(equao 18) e

seu complexo conjugado (PATTERSON, 1935):

Captulo 1 31

Se considerarmos a partcula isolada (na prtica, um sistema diludo), esta integral

depende apenas dos pares de distncias relativas entre os elementos de volume da mesma e do

produto das respectivas densidades eletrnicas. Esta integral pode ser calculada em dois passos:

1o passo: Matematicamente esta etapa corresponde ao clculo da funo de auto-

correlao )(~ rr

, fazendo 12 rrrrrr

= constantes.

dVrrr )()()(~ 21rrr

= (27)

Esta funo, conhecida como funo de Patterson ou funo de distribuio de pares,

definida num novo espao C(r) (espao de correlao) no qual cada rr

corresponde a uma

distncia )( 12 rrrr

tomada sobre todo o objeto espalhador e cujo valor a mdia dos produtos das

densidades eletrnicas nos pontos 1rr

e 2rr

.

2o passo: Consiste na integrao no espao C(r) para obter )(qIr

:

rqierdVqIrrrr = )(~)( 2 (28)

Para um sistema concentrado de macromolculas em soluo, a intensidade de

espalhamento dada por )().()(* qSqIqIrrr

= , onde )(qIr

chamado fator de forma (equao 26) e

est relacionada com as distncias intra-partculas, ou seja, correlaes de distncias internas das

macromolculas, enquanto )(qSr

chamado fator de estrutura, e est associado com correlaes

entre as partculas. Para sistemas diludos, os quais sero abordados nesta tese, )(qSr

se aproxima

de 1, e somente o fator de forma contribui para o espalhamento (CRAIEVICH, 2005).

= )(2121 21)()()( rrrrrrrr qi

errdVdVqI (26)

32 Captulo 1

Podemos concluir que a distribuio das intensidades espalhadas no espao recproco

funo da distribuio de densidade eletrnica na partcula espalhadora atravs da sua funo de

auto-correlao e que esta ltima pode ser obtida diretamente das intensidades espalhadas pelo

clculo da transformada inversa de Fourier da equao 28:

= rqiedVqIrrrrr *3

212 )()()(~ (29)

onde *dV o elemento de volume no espao recproco.

Uma propriedade importante da funo de auto-correlao a existncia de um centro de

inverso nessa funo, pois o produto )()( 21 rrrr

igual a )()( 12 rrrr

, resultando no mesmo valor

para a funo tanto para r como para r, independentemente do fato da partcula espalhadora

possuir ou no um centro de inverso. Devemos ainda notar a relao de reciprocidade existente

entre as equaes 28 e 29, pois os seus valores dependem apenas do produto rq r

. Assim

conforme rr

cresce, forosamente qr

diminui.

1.1.8 Espalhamento para sistemas diludos.

Para anlise das curvas de SAXS, adotaremos algumas restries simplificadoras:

(a) O sistema estatisticamente isotrpico devido esfericidade da partcula, ou a

distribuio espacial das partculas ou ainda devido ao movimento randmico das partculas no

meio.

(b) No h interao de longa distncia entre as partculas, i.e, o sistema suficientemente

diludo.

De acordo com a restrio (a), a )(~2 rr

centro simtrica dependendo somente do mdulo

de rr

. Assim podemos substituir o fator de fase rqierr

pelo valor mdio em torno de rr

. A equao

chamada de frmula de Debye (GLATTER; KRATKY, 1982).

Captulo 1 33

qr

qre rqi

sin=

rr

(30)

Assim podemos reescrever as equaes 25 e 28:

= =

=n

i

n

j ij

ij

jiqr

qrffqI

1 1

sin)(

(31)

= qrqr

rdVqIsin

)(~)( 2 (32)

Ainda, a expresso da reciprocidade entre r e q aparente na frmula de Debye. Se o

produto qr mantido constante, um acrscimo em r causa um decrscimo em q .

O termo qrsin uma funo peridica e o denominador qr chamado fator de

amortecimento, gerando mximos progressivamente menores. Desta forma, o intervalo para

medida usual de espalhamento aproximadamente de 0 a 2.5o.

A conseqncia da restrio (b) que para grandes valores de r , as densidades

eletrnicas ficam independentes e podem ser substitudas pelo seu valor mdio . A funo de

auto-correlao deve tender para um valor constante 2

V , enquanto que na origem )0(~2 toma

o valor mximo 2V (o mximo do curso). Assim, no espao C(r) haver informao estrutural

relevante apenas na regio em que 2

for significativamente diferente do valor constante final.

Por essa razo a funo de auto-correlao redefinida como = , expressando de fato

apenas as flutuaes de densidade eletrnica responsveis pelo fenmeno de espalhamento:

)())(()(~ 22 rVrr == (33)

Com a conveniente mudana de notao, a funo de correlao )(r introduzida, a

qual est associada com a mdia da flutuao de densidade eletrnica entre dois elementos de

volume separados pela distncia r, onde r = r1 r2 .

34 Captulo 1

)()()( 21 rrr = (34)

As flutuaes de densidade eletrnica, tomadas em relao ao meio que contm os

espalhadores, podem ser negativas ou positivas. Assim a presena de poros em um material leva

a uma flutuao negativa. Entretanto a funo caracterstica (r) ser sempre positiva, uma vez

que, de acordo com a equao 33, ela dada por )(~2 r , com 2)0( = e 0 para grandes rs.

Adicionando (r) e os limites de integrao de 0 a na equao 32 e mudando o parmetro de

integrao para dr, a intensidade :

=0

2 sin)(4)(qr

qrrdrrVqI

(35)

Para q = 0

=0

2 )(4)0( rdrrVI (36)

(r) encontrado como a transformada inversa de Fourier da equao 35:

=0

22

sin)(

2

1)(

qr

qrqdqIqrV

(37)

Para r = 0

2

0

22

)(2

1)0(

VqdqIqV ==

(38)

O valor de )0(I dado pela equao 36 experimentalmente impossvel de medir por

coincidir com a direo do feixe incidente. Entretanto ele pode ser obtido por extrapolao da

curva I(q) e permite obter, ao menos aproximadamente, o nmero total de eltrons existente no

volume da partcula.

Captulo 1 35

Por sua vez, a equao (38) nos diz que o valor da integral da intensidade no espao

recproco constante. Mesmo que uma dada partcula apresente alteraes em sua forma, se ela

se conservar ntegra, o valor da integral ser constante igual a 2V , apesar das eventuais

alteraes que ocorram no padro de difrao ou espalhamento. Esta constante, chamada

Invariante, e dada por:

=0

2 )(qdqIqQ (39)

A condio de restrio para sistemas isotrpicos nos levaram a considerar valores mdios

dando, como conseqncia, um carter escalar distribuio da funo de auto-correlao no

espao C(r).

1.1.9 Redefinio da funo de correlao

Devido ao quadrado da diferena de densidade eletrnica ser constante e sempre positiva

(a densidade das protenas so sempre maiores que a do solvente), conveniente separar )(r ,

definida na equao 33, na forma

( ) )()( 02

rr = (40)

Onde )(0 r uma nova funo de correlao, dependente somente da geometria da

partcula, com 1)0(0 = e 0)( max0 = Dr (onde maxD a mxima distncia intra partcula).

)(0 r chamada funo caracterstica e tem significado mais intuitivo.

Assim, conveniente reescrever as equaes 35, 36, 37, 38 e 39:

( ) =D

qr

qrrdrrVqI

0

022 sin)(4)(

(41)

36 Captulo 1

( ) ( ) 220

022 )(4)0( VrdrrVI

D

= (42)

( )

=0

22

20

sin)(

2

1)(

qr

qrqdqIqrV

(43)

( )

=0

22

20 )(2

1)0( qdqIqV

(44)

( )220

2 2)( ==

VqdqIqQ (45)

1.1.10 Sistema isotrpico, diludo e monodisperso

Assumindo-se que o sistema de interesse uma soluo diluda de partculas idnticas

(monodisperso) com densidade eletrnica constante , embedida em um meio com densidade

constante 0 (solvente). Assim somente )( 0p= relevante para o espalhamento. A

condio de sistema diludo garante que cada partcula faa contribuio independente para

intensidade de espalhamento, como todas as partculas so idnticas, somente uma nica partcula

precisa ser considerada.

Uma anlise mais completa para determinao da geometria da partcula pode tambm ser

feita atravs do clculo, a partir dos dados experimentais, da funo de distribuio de distncias

p(r), onde )(4)( 02 rrrp = . Assim, a equao 41 pode ser reescrita como:

( ) =D

qr

qrdrrpVqI

0

2 sin)()( (46)

A p(r) pode ser obtida a partir da transformada inversa da transformada de Fourier de I(q),

a qual possui valor igual a 0 na mxima dimenso da partcula Dmax. importante a considerao

Captulo 1 37

de que este material assume condies restritivas de um sistema monodisperso de partculas

suficientemente diludas em soluo. Alm disso, tambm importante ter contraste entre

partcula e solvente.

A p(r) contm a mesma informao da intensidade de espalhamento I(q), mas a

representao da p(r) no espao real mais intuitiva. Alm disto, informao sobre a forma da

partcula em soluo pode ser deduzida visualmente da p(r). A figura 1.6 apresenta padres de

espalhamento e p(r) caractersticos de objetos geomtricos com mesmo Dmx. Partculas

globulares possuem uma p(r) na forma de uma funo gaussiana centro simtrica com um

mximo em Dmax/2. Partculas alongadas possuem uma p(r) com mximo em menores distncias

correspondendo ao raio da seco de corte Rc. Partculas achatadas mostram um mximo mais

alargado, tambm deslocando o mximo para distncias menores que Dmax/2. p(r) com um

mximo deslocado para distncias maiores que Dmax/2 indicativa de cascas esfricas. Partculas

consistindo de subunidades bem separadas apresentam dois mximos, o primeiro correspondendo

s distncias intra-subunidades e outro a separao entre as subunidades. (SVERGUN, KOCH,

2003).

As diferenas nos padres de espalhamento permitem determinar objetos esfericamente

simtricos, os quais produzem mnimos no padro de espalhamento. Partculas muito

anisotrpicas possuem padro de espalhamento com um decaimento bem menor comparado com

partculas globulares.

38 Captulo 1

Figura 1.6 - Intensidades de espalhamento e funo de distribuio de distncias para diferentes objetos geomtricos. Figura extrada de (SVERGUN, KOCH, 2003).

1.2 Anlises das curvas de SAXS

Para anlise de uma curva de SAXS, conveniente distinguir trs regies na curva de

espalhamento. Na regio dos ngulos prximos de zero, pode-se determinar o raio de girao Rg

da macromolcula. Na regio central, a razo I(0)/Q pode fornecer informao relativa ao

volume e na regio de mais alto ngulo obtemos a relao superfcie/volume da macromolculas

(Feigin e Svergun, 1987).

Captulo 1 39

1.2.1 Regio dos menores qs na curva de SAXS, determinao do raio de girao

Assumindo o caso ideal, de partculas esfricas no interagentes em soluo, Guinier

mostrou que para 0q , a curva de Intensidade pode ser descrita como uma funo

exponencial: (GUINIER; FOURNET, 1955)

3

22

)0()(gRq

eIqI

= (47)

Onde Rg o raio de girao correspondente a distncia mdia quadrtica dos eltrons da

partcula at o seu centro de gravidade, analogamente, o Rg pode ser visto com o raio de inrcia

na mecnica clssica. Aproximaes similares, no discutidas nesta tese, so consideradas para

partculas alongadas e achatadas. Para um sistema monodisperso, o grfico de Guinier,

2)(ln qqI demonstra uma linha reta a qual intercepta I (0), a inclinao desta reta proporcional

ao Rg. Contudo devemos ter em mente que a aproximao de Guinier vlida somente para os

ngulos prximos de 0, respeitando a equao q < 1.3/ Rg (GLATTER; KRATKY, 1982).

tambm possvel obter o Rg como o segundo momento normalizado da funo de distribuio de

distncias p(r) da partcula (Svergun e Koch, 2003). O programa Gnom (Semenyuk e Svergun,

1991) (Svergun, 1992) calcula o Rg a partir da p(r), este pode ser comparado com Rg obtido pelo

mtodo de Guinier.

1.2.2 Regio central da curva de SAXS, determinao do volume

Ao se dividir a equao 42 por 45, tem-se um termo relativo a uma intensidade arbitrria

presente tanto no enumerador como no denominador da equao. As caractersticas associadas a

estas intensidades sero canceladas, permitindo o clculo do volume ser realizado em unidades

absolutas (3):

40 Captulo 1

22

)0(

V

Q

I=

(48)

importante frisar que para o clculo de V , os dados devem ser corretamente

extrapolados a )0(I utilizando a aproximao de Guinier. A relao 48 ser utilizada no captulo

4 para determinao do estado de oligomerizao de protenas em soluo.

1.2.3 Regio de mais alto ngulo da curva de SAXS, determinao da razo

superfcie/volume

A anlise da regio de mais alto ngulo de SAXS contm informao acerca dos aspectos

finos da partcula, ou seja, expressa o comportamento de )(0 r a pequenos rs., ns assumimos

que a partcula tenha densidade eletrnica uniforme (corpo homogneo) com interface bem

definida com a densidade eletrnica do solvente. Porod mostrou que neste caso o comportamento

assinttico no final da curva dado pela relao existente entre a parte da curva de intensidade e

a quarta potncia de q (GLATTER; KRATKY, 1982):

( ) ( ) Sqq

VqI4

2

4

2 28)(

= (49)

O valor assinttico para I(q) x q4 esperado ser proporcional a superfcie total da

partcula:

)(lim 4 qIqQV

Sq =

(50)

Os dados a altos ngulos so assumidos seguir um comportamento linear em )(4 qIq contra

4q . Se houver heterogeneidades na densidade eletrnica da particular espalhadora, verifica-se

uma inclinao na regio linear de AqIBqqIq + )()( 44 . Subtraindo B (constante de Porod) de

I(q), a o espalhamento correspondente ser caracterstico de um corpo homogneo.

Captulo 1 41

1.3 Anlises de protenas em soluo utilizando SAXS

1.3.1 Reconstruo ab-initio da forma da protena a partir de dados de SAXS.

Um dos objetivos de SAXS aplicado ao estudo de protenas em soluo est em resolver

um modelo tridimensional a partir de uma curva unidimensional de espalhamento. Exceto para

casos triviais de partculas esfricas, a soluo no claramente nica e modelos diferentes

podem ser obtidos da mesma curva de SAXS, possuindo estes quase a mesma discrepncia em

relao s curvas experimentais. (VOLKOVA, 2003)

No passado, a determinao de forma de objetos espalhadores foi realizada por

julgamento de acerto erro, computando modelos tridimensionais de objetos geomtricos como,

esferas, cilindros, elipses, prismas, etc, e comparando-os com os dados experimentais. O primeiro

mtodo ab initio para determinao de forma foi proposto por Stuhrmann (1970, 1970b). Neste

mtodo a partcula representada por uma funo de envelope angular r = F (), que descreve as

partculas em coordenadas esfricas (r, ). Contudo, a utilizao de funo de envelope angular,

se limita a formas relativamente simples.

Um modelo tridimensional de melhor qualidade, utilizando um modelo de tomos dummy

do ingls DAM - dummy atom model pode ser construdo ab initio utilizando mtodo de Monte

Carlo (Hromkovic, 2001). O mtodo foi primeiramente implementado no programa DALAI_GA

(CHACON, 1998, 2000). Um volume, por exemplo uma esfera de dimetro igual ao Dmx, a qual

determinada a partir dos dados experimentais definida e preenchida com empacotamento

denso de esferas menores de raio r0 e k fases (relativas s densidades eletrnicas intra partcula).

Assim o nmero de esferas ser N=(R/r0)3.

42 Captulo 1

Cada tomo assinado com um ndice jX indicando a fase a qual ele pertence ( jX possui

intervalo de zero para o solvente at k) . Dando a posio atmica jX , a forma e estrutura do

DAM pode ser descrita.

Cada tomo dummy de kth fase assumido tem contraste k , e a intensidade de

espalhamento para o DAM dada por:

=

=

K

k

kk qAqI1

)()( (51)

onde )(qAk a amplitude de espalhamento para o volume ocupado pela kth fase. Representando as

amplitudes utilizando os harmnicos esfricos )(lmY .

)()()(0

1

1

)( =

= =lm

l m

k

lmk YqAqA (52)

As amplitudes parciais para o volume ocupado pela kth fase no DAM so dadas por:

=

=kN

j

jlmj

lk

lm YqrjqfiqA1

*1

)( )()()(/2)( (53)

onde a somatria age sobre todos os tomos dummy de kth fase. rj, j so dados em coordenadas

polares, )(1 xj a funo de Bessel e )(qf a funo de espalhamento (fator de forma).

Assim a intensidade dada por:

= = >=

+=

0

1

1

*)()(

1

2)(2 )]([)(2)]([2)(l m kn

n

lmn

k

lmk

K

k

k

lmk qAqAqAqI (54)

No programa Dammin (SVERGUN, 1999). Para simplicar a soluo, uma estrutura

homognea assumida, tomando como constante a densidade eletrnica interna da partcula, (a

influncia de no homogeneidade da partcula pode ser corrigida pela subtrao da constante de

Porod (seo 1.2.3). Esta simplificao razovel para a determinao de estruturas

Captulo 1 43

tridimensionais com informaes de espalhamento concentradas no baixo ngulo. Assim, cada

esfera de raio r0 recebe um ndice k igual a 1, ao solvente atribudo ndice igual a 0.

Dando o conjunto de M curvas experimentais MiqI i ,...1),()(exp = , temos o objetivo de

minimizar a discrepncia entre a curva de espalhamento gerado a partir do modelo inicial (esfera)

e a curva experimental.

2

1

)(

1

)()(exp

2 )](/))()([(1

= =

=M

i

iN

j

jj

i

j

i qqIqIM

(55)

em que N(i) o nmero de pontos esxperimentais na ith curva e q( ) denota os erros

experimentais. Pretende-se encontrar no fim do processo de minimizao (da diferena global

entre a curva experimental e a calculada a partir do modelo) a forma tridimensional da

macromolcula em soluo.

O programa assume empacotamento hexagonal Nc = 12, exceto para os tomos de borda.

A perda de conectividade entre os tomos definida por ][1)(1)( 5.05.0 ce NNee eeNPNC == ,

em que C(12) = 1 para conectividade ideal e a conectividade individual de tomos no solvente

caracterizada pela quantidade de tomos contactantes eN pertencentes a mesma fase k. A funo

decai de C(12) = 1 para C(6) = 0.943 (partculas de borda), seguindo at C(0)=0.0002 para os

tomos que no devem aparecer no modelo final. A compacidade de uma configurao X pode

ser dada como uma mdia de conectividade dos tomos os quais no so solvente )( eNC . A

configurao pode ser caracterizada como uma funo mdia = )(1)( eNCXP .

A tarefa de recuperar um modelo de baixa resoluo a partir de uma curva de SAXS pode

ser formulada do seguinte modo: a apartir de um DAM inicial, encontrar uma configurao X que

minimize a funo

44 Captulo 1

)()( 2 XPXf += (56)

em que > 0 a funo peso de penalidade de P(X).

O mtodo de minimizao por simulated annealing descrito abaixo:

1. Inicio em uma configurao randmica 0X a altas temperaturas 0T , sendo )( 00 XfT = .

2. Seleo de um tomo do conjunto, mudana randmica de sua fase (configurao 'X ),

e aplicao da funo )()'( XfXf = .

3. Alterao do valor 'X para a opo testada, se 0

Captulo 1 45

Figura 1.7 Representao esquemtica de uma protena em soluo.

Protenas em soluo podem ser esquematicamente representadas como ilustrado na

Figura 1.7. A partcula com densidade eletrnica )(rar

cercada por um solvente de densidade

eletrnica mdia 0 . A hidratao da protena representada por uma camada de espessura e

densidade b . A curva de SAXS de uma protena em uma soluo suficientemente diluda

proporcional ao espalhamento de um nico objeto espalhador. A intensidade de espalhamento

pode ser descrita como:

+=

2)()()( qAAqAqI bssa

(57)

onde )(qAa a amplitude espalhada para protena no vcuo, sA e bA so respectivamente, as

amplitudes de espalhamento para o volume excludo (solvente) e para a camada de hidratao,

ambas com densidade eletrnica respectivamente, s e b . A camada de solvatao modelada

contendo espessura de 3.0 . A contribuio da amplitude acrescida por )(qAb , onde

sb = . O smbolo significa a promediao da mdia.

Quando a estrutura cristalogrfica da protena conhecida, a amplitude )(qI , equao 51,

pode ser determinada utilizando mtodo de expanso multipolar com o programa Crysol. O nico

46 Captulo 1

parmetro desconhecido que precisa ser ajustado o volume excludo da protena, V, e a

diferena entre a densidade eletrnica entre o solvente e a camada de hidratao. Esses

parmetros e um fator de escala c, so obtidos num procedimento de ajuste utilizando o programa

Crysol (Svergun, 1995). Assim a intensidade de espalhamento obtida experimentalmente por

SAXS e a I(q) obtida por simulao a partir de um banco de dados de protenas podem ser

comparadas:

2

1

00

2

)(

),,()(1),(

=

=

pN

i i

iie

p q

rqcIqI

Nr

(58)

onde pN o nmero de pontos experimentais, )( iq so os erros da intensidade experimental

)( ie qI e c o fator de escala entre os dados experimentais e o modelo cristalogrfico.

Captulo 2 47

2 Objetivos do trabalho

Os objetivos deste trabalho esto concentrados na apreciao da teoria envolvida no

espalhamento de raios X a baixo ngulo aplicado a um sistema monodisperso de protenas em

soluo, em diferentes estudos de SAXS para caracterizao de diferentes protenas, assim como

no desenvolvimento de uma metodologia para determinao do estado de oligomerizao de

protenas em soluo e na implementao de instrumentao para SAXS. Os objetivos

especficos desta tese foram:

(1) Instrumentao de SAXS.

Implementao de um equipamento de baixo ngulo no Instituto de Fsica da USP de So

Carlos capaz de obter curvas de SAXS de boa qualidade, para o estudo estrutural de

macromolculas em soluo.

(2) Desenvolvimento de metodologia para determinao do estado de oligomerizao de

protenas em soluo.

` Utilizando medidas realizadas na linha de SAXS do LNLS, uma metodologia para

determinao da massa molecular de protenas, a qual no so necessrias medidas de protena

padro para comparao da massa molecular, foi extensivamente utilizada demonstrando alta

confiabilidade.

48 Captulo 2

(3) Caracterizao do DBD hTR.

Clonagem, expresso e purificao foi realizada para o DBD hTR, com o intuito da

caracterizao experimental desta protena. Para isto, anisotropia de fluorescncia, crosslink e

SAXS foram realizados. Aps formao do complexo DNA-protena, F2-DBD hTR, o mesmo

foi submetido a cristalizao e SAXS.

(4) Estudos por SAXS de ferredoxina-FAD e do complexo formado por interleucina-22

e interleucina-22R1.

A protena ferredoxina redutase de leptospira interrogans e o complexo formado por

interleucina-22 e o receptor interleucina-22R1 foram submetidos a baixo ngulo com o intuito de

determinao do estado de oligomerizao, assim como do envelope tridimensional dos

complexos.

Capitulo 3 49

3 Instrumentao para o espalhamento de raios X a baixo ngulo

3.1 Equipamento de SAXS do Instituto de Fsica da USP de So Carlos

Resumo

Durante o desenvolvimento deste trabalho dependemos da linha de SAXS do Laboratrio

Nacional de Luz Sincrotron (LNLS) para realizao de experimentos com protenas em soluo.

Muitas destas coletas poderiam ter sido feitas no Instituto de Fsica da USP de So Carlos se

possussemos um equipamento adequado. Por isso, foi desenvolvida, como parte da tese, uma

cmara de SAXS com deteco unidimensional associada a uma fonte de raios X do tipo nodo

rotatrio posicionada para obteno de feixe linha.

50 Captulo 3

3.1.1 Introduo.

Com recursos do projeto temtico FAPESP no 2006/00182-8 do prof. Dr. Igor Polikarpov,

intitulado Biofsica estrutural dos receptores nucleares e protenas relacionadas, foram

adquiridos uma tica multicamadas para monocromatizao do feixe de raios X, um sistema de

colimao e um detector unidimensional sensvel a posio. Um porta-amostra, uma caixa de

fendas, um caminho de vcuo de distncia varivel, assim como um dispositivo para

posicionamento do bloqueador de feixe direto e os sustentadores do sistema foram desenvolvidos

com o apoio da oficina mecnica do IFSC. Acessrios, como micrmetros, e outros dispositivos

foram adquiridos com reserva tcnica do projeto FAPESP no 02/14041-6.

Capitulo

3

51

Um

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3.1

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52 Capitulo 3

3.1.1.1 Descrio detalhada dos componentes do equipamento

Uma descrio detalhada dos componentes do equipamento mostrada abaixo:

Gerador de Raios X

Anodo rotatrio de Cobre (Cu), Rigaku Rotaflex modelo RU 200B. O gerador foi

posicionado verticalmente de modo a se obter um feixe de raios X com seo reta, com foco de

tamanho 10 x 1 mm a uma inclinao de 6 contra o plano horizontal do foco. A utilizao do

feixe linha conveniente com o uso do anodo rotatrio, pois permite maior fluxo de ftons de

raios X incidentes na amostra.

Monocromador

Uma tica multicamadas composta de tungstnio e silcio otimizada para amplificar um

feixe linha de comprimento de onda caracterstico do K do Cu de 8.04 keV utilizada

(MACRANDER, 1998). O espelho monocromador tem comprimento de 60 mm e fica

posicionado dentro de uma cmara constantemente evacuada. Em ticas multicamadas, somente

para ngulos rasantes, menores que o ngulo crtico (c), o feixe de raios X refletido.

Captulo 3 53

Figura 3.2 - Viso geral do mocromomador.

Sistema de colimao

O sistema de colimao consiste de duas fendas paralelas. Sendo a abertura destas fendas

muito menor que a distncia entre elas. Este sistema tem a desvantagem que as fendas emitem

espalhamento secundrio (espalhamento parasita) na regio dos ngulos prximos de zero.

Contudo uma terceira fenda foi posicionada rente ao feixe, eliminando o o espalhamento parasita

causado pelas duas primeiras fendas. Assim, o sistema de colimao composto de trs fendas de

tntalo, sendo que as duas primeiras, espaadas de 1 metro, so responsveis pela colimao

horizontal e vertical do feixe e a terceira, chamada de fenda parasita, foi posicionada de modo a

no tocar o feixe. O sistema de colimao do equipamento evacuado minimizando o contato do

feixe colimado com molculas de ar.

54 Captulo 3

(A)

(B) (C)

Figura 3.3 - Sistema de colimao. (A) Viso geral do sistema de colimao. (B) Viso frontal da caixa das fendas 1 e 2 . (C) Viso frontal da fenda 3 ( fenda parasita).

Porta-amostra

O sistema de colimao tem como objetivo um feixe linha vertical, de modo que o feixe

no ultrapasse os parmetros da cela do porta-amostra 12 x 2 mm, que possui espao para

aproximadamente 200 L de soluo entre duas janelas de mica. O porta-amostra acoplado a

um banho trmico, o qual permite que a soluo de amostra seja resfriada.

Captulo 3 55

Figura 3.4 Porta-amostra.

Caminho de vcuo e bloqueador do feixe direto

No equipamento de SAXS do IFSC possvel utilizar diferentes distncias entre amostra

e detector (339 mm e 739 mm), cobrindo assim, diferentes intervalos em q. O caminho entre a

amostra e o detector encontra-se em vcuo, de modo a eliminar o espalhamento caracterstico das

molculas presentes no ar. Ao fim do caminho de vcuo, uma placa de chumbo de

aproximadamente 3 mm de largura, chamada de bloqueador do feixe direto, impede que o feixe

de raios X incida diretamente sobre o detector. O bloqueador do feixe direto foi posicionado

sobre uma haste conectada a um micrmetro, o qual permite seu movimento lateral.

56 Captulo 3

(A) (B)

Figura 3.5 - Caminho de vcuo e bloquador do feixe direto. (A) viso geral do caminho de vcuo. (B) O bloqueador do feixe direto encontra-se em frente a janela de sada dos ftons espalhados, o bloqueador pode ser movimentado com a ajuda de um micrmetro.

Sistema de deteco

O sistema de deteco de raios X do equipamento de SAXS do IFSC do tipo

unidimensional sensvel a posio e constitudo de um detector de raios X e uma eletrnica

associada que fornece um sinal digital para o computador de leitura dos dados, o sistema foi

desenvolvido pelo grupo de detectores do Centro Brasileiro de Pesquisas Fsicas. O detector de

raios X est posicionado sobre uma mesa de posicionamento XYZ a qual permite movimentar o

detector verticalmente, em profundidade, e lateralmente (figura 3.6) (BARBOSA, 1996).

Captulo 3 57

Figura 3.6 - Sistema de deteco unidimensional sensvel a posio.

O detector possui em seu interior um fio condutor (anodo), frente a uma janela de Berlio

(80 mm x 8 mm). O detector selado e no seu interior h uma mistura de 90% Argnio e 10%

Metano. Os ftons de raios X incidentes entram pela janela do detector e ionizam o gs, gerando

pulsos eltricos que so capturados pelos respectivos eletrodos (anodo e