marilda keico taciro processo contínuo de produção de

MARILDA KEICO TACIRO

PROCESSO CONTÍNUO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS DE CADEIA MÉDIA (PHAMCL)

SOB LIMITAÇÃO MÚLTIPLA DE NUTRIENTES

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia.

São Paulo 2008

PROCESSO CONTÍNUO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS DE CADEIA MÉDIA (PHAMCL) SOB LIMITAÇÃO MÚLTIPLA DE NUTRIENTES


Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia.

São Paulo 2008


PROCESSO CONTÍNUO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS DE CADEIA MÉDIA (PHAMCL) SOB

LIMITAÇÃO MÚLTIPLA DE NUTRIENTES

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia Orientador: Doutor José Geraldo da Cruz Pradella

São Paulo 2008

DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

© reprodução total

Taciro, Marilda Keico. Processo contínuo de produção de polihidroxialcanoatos de cadeia média (PHAMCL) sob limitação múltipla de nutrientes / Marilda Keico Taciro. -- São Paulo, 2008. Orientador: José Geraldo da Cruz Pradella. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia EP/IPT/ICB/Butantan. Área de concentração: Biotecnologia. Linha de pesquisa: Biopolímeros. Versão do título para o inglês: Medium-chain-length polyhydroxylkanoates production in chemostat culture under multiple nutrient limitation.

Descritores: 1. Polihidroxialcanoatos 2. Biopolímeros 3. Processo contínuo de produção 4. Polihidroxialcanoatos de cadeia média I. Pradella, José Geraldo da Cruz II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós Graduação em Biotecnologia. III. Título.

ICB/SBIB069/2008

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia Universidade de São Paulo, Instituto Butantan, Instituto de Pesquisas Tecnológicas ______________________________________________________________________________________________________________

Candidato(a): Marilda Keico Taciro.

Título da Tese: Processo contínuo de produção de polihidroxialcanoatos de cadeia média (PHAMCL) sob limitação múltipla de nutrientes.

Orientador(a): José Geraldo da Cruz Pradella.

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão pública realizada a ................./................./................., considerou

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................ Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................

Presidente: Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................

Aos meus filhos Júlia e Gabriel, Ao Newton por entender o significado

desse trabalho para mim

AGRADECIMENTOS

Ao Doutor José Geraldo da Cruz Pradella não só pela orientação desse trabalho, mas

pelos muitos outros ao longo de toda minha carreira profissional.

Ao Professor Doutor José Gregório Cabrera Gomez, sempre presente com sua visão

positiva e incentivando o trabalho. Agradeço pelas sugestões, ajuda e apoio ao longo de todo

o trabalho.

À Doutora Rosane Aparecida Muniz Piccoli, amiga de todas as horas, pela ajuda na

realização dos ensaios e, principalmente, fazer rodar e entender o “Metatool”. Amiga que

dividiu comigo as angústias de finalizar uma tese sendo mãe e em cima da hora.

À Professora Doutora Luiziana Ferreira da Silva pela incentivo, ajuda e apoio na

realização desse trabalho.

Aos amigos: Cezar Vanzin pelas amostras da meia noite na saída da faculdade; Rafael

Costa dos Santos Rocha, Sonia Regina da Silva Queiroz, Luana Rissi, sempre prontos a

ajudar; Johana Bocanegra, sempre disposta a passar a noite amostrando ensaio e fazendo

companhia; Rogério Gomes, pela ajuda no preparo do banco da linhagem e pela paciência em

explicar e estudar genética molecular comigo.

Aos Técnicos de Laboratório, Renato de Jesus Andrade, Aelson Luis dos Santos,

Sérgio Fernandes e Antônio Montemor pela ajuda nas análises, no preparo e condução dos

ensaios.

Em especial aos Técnicos de Laboratório Valter de Oliveira e Regis Norberto de

Carvalho, o primeiro sempre pronto a ajudar e o segundo, o meu “anjo do laboratório”,

quantas não foram as vezes em que tarde da noite ou mesmo nos fins de semana, a centrifuga

não funcionava ou a bomba de alimentação dava algum problema e ele estava por perto para

ajudar. Mais do que profissionais do Laboratório, grandes amigos!!

Vários foram os estagiários que ajudaram na realização desse trabalho, alguns só de

passagem, mas todas as contribuições sem exceção, muito importantes: Vanessa Baldacim,

Letícia Nivoloni, Natália Cavinato e Vinícius Villas Boas de Alencar.

As secretárias Maria das Graças F. de Oliveira e Nilza T. Dantas ela ajuda e apoio.

Ao Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo que possibilitou a

realização desse trabalho e a todos que de alguma forma contribuíram para que esse trabalho

se concretizasse.

“ Sonho que se sonha junto é realidade”

(Raul Seixas)

RESUMO

TACIRO, M.K. Processo contínuo de produção de polihidroxialcanoatos de cadeia média (PHAMCL) sob limitação múltipla de nutrientes. 2008. 273 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) – Programa Interunidades em Biotecnologia USP/IPT/IBUTANTAN, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.

A produção de polihidroxialcanoato de cadeia média por Pseudomonas putida IPT 046 em

cultivo contínuo sob limitação múltipla de nutrientes foi estudada, utilizando glicose e frutose

como fontes de carbono. O estudo da limitação em nitrogênio, limitação em fósforo e

limitação simultânea de nitrogênio e fósforo como forma de indução de acúmulo de

polihidroxialcanoato apontou que os maiores valores de acúmulo de polímero, cerca de 70%

da biomassa celular, foram alcançados quando fósforo foi o nutriente limitante. Quando a

limitação foi somente em nitrogênio, o máximo teor acumulado foi de 40% da biomassa

celular. A limitação simultânea de nitrogênio e fósforo, além do alto teor de polímero obtido

(68%) resultou em maior fator de conversão de fonte de carbono em polímero (YPHA/C de 0,19

g/g) quando comparado com a limitação em fósforo, 0,16 g/g, ou à limitação em nitrogênio,

0,10 g/g. A partir dos fatores de conversão de fonte de carbono e nutrientes em biomassa

residual foi possível delimitar as regiões de crescimento com múltipla limitação nas formas

estudadas. Os fatores de conversão de oxigênio em biomassa residual e os respectivos

coeficientes de manutenção obtidos para a condição de limitação em nitrogênio (Yxr/o = 0,96

g/g e mo =0,11g/gh), para limitação em fósforo (Yx/o = 1,39 g/g e mo = 0,13 g/gh) e para

limitação em nitrogênio e fósforo (Yx/o = 1,53 g/g e mo = 0,12 g/gh) indicaram que a

limitação simultânea em nitrogênio e fósforo implicou em menor consumo de oxigênio para

gerar células quando comparada com a condição de limitação somente em nitrogênio ou

fósforo e que o oxigênio utilizado para manutenção das células independeu do tipo de

limitação e dos valores das vazões específicas de alimentação empregadas, que variaram entre

0,04 e 0,50 h-1. O balanço de carbono mostrou que, independente do tipo de limitação, nas

condições de maior acúmulo de polímero a fração destinada a CO2 representou 60% do total

de carbono consumido. A fração de carbono destinada à biossíntese de polímero foi de 30%

na condição de limitação simultânea de nitrogênio e fósforo, 17,5% para limitação somente

em nitrogênio e de 21,5% para limitação em fósforo, correspondentemente, a fração de

carbono destinada a fazer células foi de 10%, 20,5% e 17,5%, respectivamente. Um modelo

metabólico foi proposto, ajustando aos dados experimentais na condição de limitação em

nitrogênio. Os fluxos metabólicos obtidos propõem que glicose ou frutose sejam consumidas

8

utilizando a via de Embden-Meyerhoff-Parnas, não ocorrendo fluxo entre 6-fosfogliconato e

2-ceto-3-desoxi-6-fosfogliconato. Piruvato, formado a partir de fosfoenolpiruvato, seja

descarboxilizado a acetil-CoA. Uma fração deste intermediário seja oxidado no Ciclo de

Krebs e outra direcionada para a biossíntese de polímero. A fração metabolizada no ciclo de

Krebs levaria à formação de NADPH pela ação da isocitrato desidrogenase com geração de

CO2. O modelo propõe ainda que NADPH e CO2 também devem ser gerados pelo desvio da

hexose monofosfato. As relações elementares geradas pelo modelo, também foram utilizadas

para analisar possíveis modificações na rede metabólica que pudessem resultar em aumento

da conversão de substrato em produto.

Palavras-chave: Polihidroxialcanoatos. Biopolímeros. Processo contínuo de produção.

Polihidroxialcanoatos de cadeia média.

ABSTRACT TACIRO, M.K. Medium-chain-length polyhydroxyalkanoates production in chemostat culture under multiple nutrient limitation. 2008. 273 p. PhD thesis (Biotecnology) – Programa Interunidades em Biotecnologia USP/IPT/IBUTANTAN, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.

Multiple nutrient limited growth of Pseudomonas putida IPT 046 was studied in a chemostat

culture from glucose and fructose as the carbon source. Nitrogen (N), phosphorus (P) and

both nitrogen and phosphorus (N and P) limitation was performed in order to accumulate

medium-chain-length polhydroxyalkanoate. P limitation resulted in higher content of polymer

accumulated (70%). N limited experiments achieved only 40% of cellular biomass in

polymer. N and P simultaneous limitation resulted in 68 % polymer content and best yields of

carbon into polymer (YPHA/C = 0,19 g/g) when compared with 0,16 g/g of P limitation and

0,10 g/g of N limitation. The border of the nutrient limitation zone was delimited from the

yields of carbon and nutrients into residual biomass and the extension of the nutrient limited

growth zone for the cultivation of Pseudomonas putida IPT 046 was established. The yields

of oxygen in residual biomass and the related maintenance coefficients for N limitation (Yxr/o

= 0,96 g/g e mo =0,11g/gh), P limitation (Yx/o = 1,39 g/g e mo = 0,13 g/gh) and N and P

limitation (Yx/o = 1,53 g/g e mo = 0,12 g/gh) indicate that N and P simultaneous limitation

result in less oxygen demand to synthesize cells and the oxygen demand for maintenance is

the same, independent of limitation strategy or dilution rate performed (0,04 to 0,50 h-1). In all

the limitation conditions tested, the carbon balance of the experiments showed that 60 % of

consumed carbon resulted in CO2 when polymer content was the highest. Polymer synthesis

took 17,5 % of consumed carbon in experiments limited in N, 21,5 % in P limited and 30 % in

N and P simultaneous limited. Cellular biosynthesis took 20,5 %, 17,5 % and 10% of carbon

consumed, respectively.

A metabolic pathway model was proposed and matched with N limited experimental data.

The resulting metabolic fluxes indicated that glucose and fructose should be metabolized by

Embden-Meyerhoff-Parnas pathway, without flux from 6-phosphogluconate to 2-keto-3-

deoxy-6-phosphogluconate. Pyruvate formed from phosphoenolpyruvate and decarboxylated

into acetyl-CoA. A fraction of this intermediary was oxidated on Krebs Cicle and another one

goes to polymer synthesis. Isocitrate desidrogenase action resulted in NADPH and CO2

released. Also NADPH and CO2 were produced by hexose monophosphate shunt. Elementary

mode analysis was used to verify the possible effects of biochemical network modifications

10

and also for design of further modifications that could improve the system’s conversion of

substrate into polymer.

Key Words: Polyhydroxyalkanoates. Biopolymer. Chemostat culture. Medium-chain-length

polyhydroxyalkanoates.

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1: Fórmula genérica de monômeros detectados em PHA................................ 19

Figura 3.2: Modelo metabólico genérico para a síntese de PHA (GOMEZ, 2000)........ 20

Figura 3.3: Esquema representativo das vias metabólicas que fornecem

intermediários para síntese de polihidroxialcanoatos de cadeia média (adaptado de

WITHOLT e KESSLER, 1999)..................................................................................... 22

Figura 3.4: Esquema representando os limites da região de crescimento com múltipla

limitação de nutrientes Adaptado de DURNER et al.,1998........................................... 24

Figura 4.1: Esquema de preparo de inóculo................................................................... 32

Figura 4.2: Esquema do biorreator operado de forma contínua..................................... 33

Figura 5.1: Valores de Ln (X/Xo) em função do tempo para o ensaio de

determinação de µmax pelo método dinâmico para P. putida IPT 046.........................

39

Figura 5.2: Valores de concentração de biomassa (X) obtidos nas diferentes vazões

específicas de alimentação (D): a) ensaios não limitados na fonte de carbono (MCLc

6, 8, 9, 10, 12 e 21); b) ensaios limitados na fonte de carbono (MCLc 5, 7e 11)........... 41

Figura 5.3: Fator de conversão de fonte de carbono em biomassa residual (livre de

polímero) (Yxr/c) calculado nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos

ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e

limitados em nitrogênio e fósforo (N e Plim), não limitados em fonte de C (•) e

limitados na fonte de C (ο)............................................................................................. 43

Figura 5.4: Fator de conversão de fósforo em biomassa residual (Yxr/p) calculado

nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em

nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N

e Plim), não limitados em fonte de C (•) e limitados na fonte de C (ο)......................... 44

Figura 5.5: Fator de conversão de nitrogênio em biomassa residual (Yxr/n) calculado

nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente

em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo

(N e Plim), não limitados em fonte de C (•) e limitados na fonte de C (ο).................... 45

12

Figura 5.6: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C e N): relações

Co/No (g de C/g de N consumidos) para diferentes vazões específicas de

alimentação (D).............................................................................................................. 46

Figura 5.7: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C e P): relações

Co/Po (g de C/g de P consumidos) para diferentes vazões específicas de alimentação

(D)................................................................................................................................... 48

Figura 5.8: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C, N e P):

relações Co/No (g de C/g de N consumidos) para diferentes vazões específicas de

alimentação (D).............................................................................................................. 48

Figura 5.9: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C, N e P):

relações Co/Po (g de C/g de P consumidos) para diferentes vazões específicas de

alimentação (D).............................................................................................................. 49

Figura 5.10: Teor de polímero (PHA) obtido nas vazões específicas de alimentação

(D), obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em

fósforo (Plim) e limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim), não limitados em fonte

de C................................................................................................................................. 50

Figura 5.11: Fator de conversão de fonte de carbono em polímero (YPHA/C) calculado

nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em


e Plim) e não limitados em fonte de C............................................................................ 53

Figura 5.12: Composição do polímero acumulado nas vazões específicas de

alimentação (D) testadas nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim),

somente em fósforo (Plim) e limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e não

limitados em fonte de C.................................................................................................. 54

Figura 5.13: Produtividade de PHA (Prod) calculada nas vazões específicas de

alimentação (D) testadas nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim),

somente em fósforo (Plim) e limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e não

limitados em fonte de C.................................................................................................. 55

Figura 5.14: Velocidades específicas de consumo de oxigênio (qO2) calculadas nas

vazões específicas de alimentação (D), obtidas nos ensaios limitados somente em


e Plim) e, não limitados em fonte de carbono................................................................ 57

Figura 5.15: Velocidade específica de produção de CO2 (qCO2) [□ e ■] e coeficiente

respiratório (RQ) [○ e ●] calculados nas vazões específicas de alimentação (D),

obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo

(Plim), limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e, não limitados em fonte de

carbono............................................................................................................................ 58

Figura 5.16: Ensaio MCLc 18: (a) concentrações de biomassa (X), absorbância (DO)

e teor de polímero (PHA); (b) concentrações residuais de glicose (G), frutose (F),

nitrogênio (N) e fósforo (P)............................................................................................ 60




Figura 5.18: velocidades de consumo de oxigênio (OUR) e de produção de CO2

(CER) do ensaio MCLc 19............................................................................................ 63





(CER) do ensaio MCLc 20............................................................................................. 65





(CER) do ensaio MCLc 22............................................................................................. 68

Figura 5.23: Esquema representativo do modelo (E1) utilizado para análise de fluxos

metabólicos no cultivo de P. putida IPT 046................................................................. 70

Figura 5.24: Fração de carbono destinado a fazer células (CEL), polímero (F4) e CO2

(F14) a partir de glicose e frutose consumidos nos ensaios limitados em fonte de

carbono........................................................................................................................... 73

Figura 5.25: Fração de carbono destinado a fazer células (CEL), polímero (F4) e CO2

(F14) a partir de glicose e frutose consumidos nos ensaios não limitados em fonte de

carbono........................................................................................................................... 74

Figura 5.26: Esquema representativo do modelo E2 proposto para análise de fluxos

no cultivo de P. putida IPT 046..................................................................................... 75

Figura 5.27: Esquema representativo do modelo E3 proposto para análise de fluxos

no cultivo de P. putida IPT 046..................................................................................... 77

Figura 5.28a: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma

de indução de acúmulo de 40% PHA. Relações elementares 9 e 61.............................. 82

Figura 5.28b: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma

de indução de acúmulo de 40% PHA. Relação elementar 69........................................ 83


de indução de acúmulo de 40% PHA. Relações elementares 29 e 59............................ 84







LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1: Quadro resumo de resultados obtidos de produção de PHAMCL em

biorreator......................................................................................................................... 27

Tabela 4.1: Composição dos meios de alimentação dos ensaios em alta densidade

(quantidade dos reagentes em g/litro de meio alimentado)............................................. 35

Tabela 5.1: Condições dos ensaios realizados para estudar o efeito da limitação de

nutrientes na produção de PHAMCL................................................................................ 41

Tabela 5.2: Valores de concentração de biomassa (X), teor de polímero (PHA), fator

de conversão de fonte de carbono em biomassa residual (Yxr/c), fator de conversão

de nitrogênio em biomassa residual (Yxr/n), fator de conversão de fósforo em

biomassa residual (Yxr/p), velocidade específica de consumo de oxigênio (qO2),

velocidade específica de produção de CO2 (qCO2) para os ensaios preliminares em

alta densidade celular...................................................................................................... 68

Tabela 5.3: Correlações utilizadas no modelo E1 para análise de fluxo metabólico...... 71

Tabela 5.4: Relações elementares geradas pelo programa Metatool para a condição de

limitação em N, e os correspondentes valores de fator de conversão de fonte de

carbono em biomassa (Yx/c), fator de conversão de fonte de carbono em polímero

(YPHA/C), quantidade de oxigênio consumido por biomassa residual formada (1/YXr/O2),

quantidade de CO2 produzido por biomassa residual formada (1/YXr/CO2) e quantidade

de ATP formado por biomassa residual formada (YATP/Xr)............................................... 81

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................16

2 OBJETIVO ..........................................................................................................................18

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...........................................................................................19

3.1 Polihidroxialcanoatos .......................................................................................................19

3.2 Metabolismo de PHAMCL .................................................................................................20

3.3 Produção de PHAMCL em biorreator ..............................................................................22

3.4 Engenharia metabólica na produção de PHAMCL .........................................................28

3.5 Aplicações para PHAMCL .................................................................................................29

4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................31

4.1 Ensaios em biorreator ......................................................................................................31

4.2 Metodologias analíticas ....................................................................................................36

4.3 Avaliação de fluxos metabólicos na produção de PHAMCL...........................................38

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................39

5.1 Determinação de velocidade específica máxima crescimento (µmax) para a linhagem IPT 046....................................................................................................................39

5.2 Crescimento com limitação de nutrientes - ensaios contínuos em baixa densidade celular ......................................................................................................................................40

5.3 Ensaios preliminares em alta densidade para produção de PHAMCL..........................59

5.4 Avaliação de fluxos metabólicos na produção de PHAMCL...........................................69

6 CONCLUSÕES....................................................................................................................88

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................91

ANEXO....................................................................................................................................99

ANEXO A - Ensaios em baixa densidade – Dados experimentais ...................................100

ANEXO B - Ensaios preliminares em alta densidade – Dados experimentais................138

ANEXO C – METATOOL – Entradas e saídas.................................................................152

16

1 INTRODUÇÃO

Polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres acumulados por diversas bactérias,

despertam grande interesse, pois apresentam propriedades termoplásticas, são biodegradáveis

e biocompatíveis e podem ser sintetizados a partir de matérias-primas renováveis.

O Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo (IPT) estuda a produção

de PHA desde 1992, explorando diversos aspectos para o seu desenvolvimento, tais como: o

isolamento e caracterização de bactérias produtoras de PHA, a compreensão do metabolismo

de síntese destes polímeros a partir de diferentes substratos, o melhoramento genético de

linhagens bacterianas, o estudo e desenvolvimento de processos de produção, extração e

purificação de PHA, além da modelagem matemática dos mesmos.

Em 1998, o Laboratório de Biotecnologia Industrial (LBI) do IPT em cooperação com

o Laboratório de Materiais Avançados da Universidade Estadual Norte Fluminense

(LAMAV-UENF) com apoio do PADCT (CNPq), realizou estudos para a produção em

batelada e batelada alimentada de polihidroxialcanoatos de cadeia média (PHAMCL) e seu uso

em aplicações médico-veterinárias. Foram selecionadas linhagens produtoras de PHAMCL a

partir de carboidratos (GOMEZ, 2000) e óleos vegetais (SILVA et al., 1999 e SILVA-

QUEIROZ, 2003) e estudada a produção destes materiais a partir de carboidratos (GOMEZ et

al., 2000, DINIZ et al., 2004) além da caracterização dos mesmos (SANCHEZ et al., 2003).

Dando continuidade ao trabalho iniciado em 1998 na área de biopolímeros

degradáveis de cadeia média, o LBI-IPT em cooperação com o LAMAV-UENF, aprovou

junto a FAPESP o projeto “Avaliação do metabolismo de síntese de PHAMCL e controle de

sua composição monomérica” e, o presente trabalho constitui parte desse projeto.

PHA contendo monômeros de cadeia média (PHAMCL) são elastômeros produzidos por

Pseudomonas sensu stricto e compreendem mais que 90% dos monômeros detectados como

constituintes de PHA. Essa grande diversidade de monômeros que podem ser incorporados e

o potencial para a produção de PHA sob medida para diferentes aplicações, permite

aplicações amplas que vão da área de embalagens e materiais descartáveis, dominado por

“comodities” petroquímicos, para os quais o preço de venda tem que ser competitivo, até a

área médico-farmacêutica e de cosméticos que envolvem produtos com alto valor agregado.

Nos trabalhos anteriores, diversos aspectos básicos da produção de PHAMCL foram

estudados, bem como o uso de técnicas avançadas como o melhoramento genético de

linhagens associado ao uso de estratégias/técnicas de engenharia bioquímica. O presente

trabalho envolve estudos em processo conduzido de modo contínuo, associado à análise de

17

fluxos metabólicos visando o controle da composição monomérica dos PHAMCL e fornecendo

subsídios para melhor conhecer o metabolismo de sua produção e assim direcionar tais fluxos

segundo critérios de interesse. A possibilidade de controle de concentrações reais dos

substratos fornecidos, o equilíbrio dinâmico presente quando se estabelecem estados

estacionários no cultivo contínuo, coloca essa ferramenta como a mais indicada para fornecer

dados para a análise de fluxos metabólicos. Assim sendo, os resultados deste trabalho

contribuirão para o melhor entendimento e otimização do processo de produção dos PHAMCL

a partir de carboidratos.

18

2 OBJETIVO

O presente trabalho teve como objetivos otimizar o teor de polímero acumulado por P.

putida IPT 046 e obter PHAMCL com diferentes composições monoméricas em biorreator.

Para atingir esses objetivos foram realizados estudos em biorreator operado de forma

contínua, empregando-se regimes de crescimento com limitação de nutrientes, buscando-se

otimizar o teor de polímero e variar a composição dos mesmos através da adição controlada

de carboidratos.

Tomando como base esquemas do metabolismo de produção de PHAMCL, fluxos

metabólicos sob diferentes condições de cultivo foram estabelecidos, procurando uma maior

compreensão do metabolismo de síntese destes polímeros e norteando novas estratégias de

cultivo para aumentar a eficiência e o teor acumulado de polímero.

19

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Polihidroxialcanoatos

Polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres acumulados por diversas bactérias na

forma de grânulos intracelulares como reserva de carbono, energia e equivalentes redutores

(ANDERSON e DAWES, 1990). A estrutura básica destes polímeros está representada na

Figura 3.1.

Figura 3.1: Fórmula genérica de monômeros detectados em PHA

Cerca de 150 monômeros diferentes já foram identificados como constituintes de PHA

produzidos por bactérias a partir de diversas fontes de carbono (REHM e STEINBÜCHEL,

1999), variando-se n, bem como a estrutura do substituinte R (Figura 3.1). PHA são

classificados em dois grandes grupos segundo Steinbüchel e Valentin (1995): (i) PHASCL

(polihidroxialcanoatos de cadeia curta), compostos por HASCL (“HydroxyAcids of Short-

Chain-Length”), contendo monômeros com 3 a 5 átomos de carbono na cadeia principal e, (ii)

PHAMCL (polihidroxialcanoatos de cadeia média), formados por HAMCL (“HydroxyAcids of

Medium-Chain-Length”), contendo monômeros com 6 a 16 átomos de carbono na cadeia

principal.

A composição monomérica, a massa molecular e a distribuição de massas moleculares

do polímero são responsáveis pelas propriedades físicas e mecânicas destes materiais,

direcionando sua aplicação. Assim, um maior domínio sobre o processo de síntese permitirá

um melhor controle, seja da composição, seja das massas moleculares ou de sua distribuição,

resultando em polímeros feitos sob medida para diferentes aplicações. As propriedades de

PHA permitem a obtenção desde materiais rígidos, como o poli-3-hidroxibutirato (P3HB),

que é um PHASCL, a materiais flexíveis, como PHAMCL, que podem também se apresentar

como materiais viscosos e aderentes se contiverem uma grande fração de monômeros

insaturados (GOMEZ, 2000).

20

PHAMCL são produzidos por Pseudomonas sensu stricto e compreendem mais que

90% dos monômeros detectados como constituintes de PHA (SUDESH et al., 2000). Estes

polímeros são elastômeros com baixo grau de cristalinidade e baixas temperaturas de fusão,

apresentando propriedades distintas das dos PHA mais conhecidos (P3HB e seu copolímero

P3HB-co-3HV), que são termoplásticos com alto grau de cristalinidade, possibilitando

vislumbrar aplicações distintas para os mesmos. PHAMCL tem merecido destaque como um

polímero funcional dado sua versatilidade, facilitada pela incorporação de vários grupos

funcionais, incluindo grupos como alquil, fenil, fenoxi e alcanos (KIM, 2002).

3.2 Metabolismo de PHAMCL

A síntese de PHA depende do fornecimento de um substrato adequado que possa ser

convertido a um hidroxiacil-CoA através das vias metabólicas existentes na célula (Figura

3.2), bem como da presença de uma PHA sintase na bactéria, capaz de incorporar este

hidroxiacil-CoA ao poliéster em formação. Ambos os fatores podem impedir a combinação de

certos monômeros em uma mesma cadeia polimérica ou restringir a quantidade de um

determinado monômero incorporado ao PHA (GOMEZ, 2000).

Figura 3.2: Modelo metabólico genérico para a síntese de PHA (GOMEZ, 2000).

PHA sintases são as enzimas chaves no processo de síntese destes polímeros,

catalisando a ligação dos monômeros por transesterificação (WITHOLT e KESSLER, 1999),

estando agrupadas em três classes. PHA sintases da classe I estão presentes em várias

bactérias e possuem especificidade por HASCL, raramente incorporando HAMCL. PHA sintases

de classe II são encontradas exclusivamente em Pseudomonas e apresentam maior

21

especificidade por HAMCL, incorporando HASCL mais raramente. Enquanto PHA sintases de

classe I e II são constituídas de um único polipeptídeo, as da classe III são constituídas por

duas subunidades polipeptídicas com especificidade para HASCL.

Dentre os vários monômeros detectados em PHA, mais que 90% estão presentes

apenas em PHAMCL produzidos por Pseudomonas, devido à especificidade de suas PHA

sintases e à grande versatilidade metabólica deste gênero (ORNSTON, 1971; INOUYE,

1998).

A síntese de PHAMCL é dividida em dois grupos com base nos substratos fornecidos:

síntese a partir de substratos relacionados, na qual a composição do polímero produzido

reflete o substrato fornecido (hidrocarbonetos, álcoois, ácidos carboxílicos), permitindo a

incorporação dos mais diversos monômeros ao polímero e, síntese a partir de substratos não

relacionados, que pode ser observada em diversas Pseudomonas quando cultivadas em

presença de substratos que são metabolisados a acetil-CoA (glicose, frutose, gliconato,

acetato, glicerol), produzindo um polímero contendo 3-hidroxidecanoato (3HD) como

principal constituinte, além de outros constituintes secundários.

As vias metabólicas que fornecem os intermediários nos dois tipos de síntese de

PHAMCL são distintas como ilustra a Figura 3.3. A β-oxidação de ácidos graxos é a principal

via fornecedora para substratos relacionados e a biossíntese de ácidos graxos para os

substratos não relacionados (EGGINK et al., 1992; HUIJBERTS et al., 1992; HUIJBERTS et

al., 1994).

Segundo Gomez (2000), embora ensaios específicos realizados com inibidores da β-

oxidação ou da biossíntese de ácidos graxos por Huijberts et al. (1994) deixem claro o

envolvimento específico destas vias na síntese de PHAMCL, não pode ser descartada a

possibilidade de existirem várias vias fornecendo intermediários para a síntese de PHAMCL.

Huijberts et al. (1994) apresentam resultados que sugerem que a partir de hexanoato, os 3-

hidroxiacil-CoA são gerados por três rotas diferentes: (i) β-oxidação parcial do hexanoato,

gerando 3-hidroxihexanoil-CoA que corresponde a 72 % dos monômeros incorporados ao

PHA; (ii) a presença de constituintes insaturados indica que a biossíntese de ácidos graxos

também está operante (13% dos monômeros sintetizados) e (iii) síntese de 3-hidroxioctanoil-

CoA por elongação de 3-hidroxihexanoil-CoA com acetil-CoA.

22

Figura 3.3: Esquema representativo das vias metabólicas que fornecem intermediários para síntese de

polihidroxialcanoatos de cadeia média (adaptado de WITHOLT e KESSLER, 1999).

3.3 Produção de PHAMCL em biorreator

Duas são as estratégias utilizadas para a produção em biorreator de PHAMCL. Na mais

comumente empregada, o processo é operado de modo descontínuo-alimentado, aplicando-se

um desbalanceamento nutricional no meio de cultura para promover o acúmulo do polímero.

Após uma fase de crescimento celular em meio balanceado, impõe-se a limitação de um

nutriente imprescindível ao crescimento, que não seja a fonte de carbono (PEREIRA, 1996;

TACIRO et al., 1997; KIM et al., 1997; PICCOLI, 2000; LEE, 2002; KIM, 2002; ROCHA et

al., 2002; TACIRO et al., 2002; PEREIRA, 2003; DINIZ et al., 2004). A outra estratégia

consiste na operação do biorreator de modo contínuo, buscando modular a relação fonte de

carbono/nutriente e, em decorrência, o crescimento celular e acúmulo de polímero

(PREUSTING et al., 1993; HUIJBERT et al., 1996, DURNER et al., 2000).

Os trabalhos envolvendo regimes de crescimento com limitação dupla de nutrientes

descritos na literatura para acúmulo de PHAMCL se baseiam no fato de que o crescimento com

limitação múltipla de nutrientes pode ser utilizado para forçar as células a um estado

fisiológico particular e que tais condições podem resultar em aumentos de produtividade de

enzimas e metabólitos.

23

O procedimento consiste, basicamente, na condução de ensaios contínuos em

biorreator nos quais estados estacionários são estabelecidos para uma dada vazão específica

de alimentação (D) e a uma dada relação fonte de carbono/nutriente limitante (Co/Nxo). Os

resultados podem ser apresentados na forma de um ábaco onde se identificam três regiões

distintas (Figura 3.4): i) crescimento limitado na fonte de carbono e com o nutriente em

excesso; ii) condição de limitação do nutriente e fonte de carbono em excesso; iii) um regime

intermediário de crescimento em que carbono e o nutriente são supridos ao meio, porém não

são detectadas concentrações significativas da fonte de carbono e do nutriente limitante.

Essa sistemática de abordagem procura, principalmente, definir as interfaces entre

essas três regiões, procurando otimizar o suprimento de substratos e a formação de produto.

No caso da produção de PHA, o que tem se buscado é o cultivo celular na faixa de transição

entre a região de dupla limitação de nutriente e a de nutriente limitado e fonte de carbono em

excesso, pois essa região satisfaz duas condições importantes: baixas concentrações reais de

nutrientes inibitórios ou tóxicos que possam ser utilizados e otimização do suprimento de

substratos para se obter máximo teor de PHA com completa utilização da fonte de C.

Segundo Egli (1991) e Durner et al. (2000), o limite em torno da região onde ocorre

múltipla limitação pode ser estimado a partir de dados de fatores de conversão medidos em

condições de limitação única de um dos substratos. Egli e Quayle (1986) propuseram que para

dois nutrientes (carbono e nitrogênio) em cultivo contínuo pode-se estabelecer esta região a

partir das definições dos fatores de conversão:

Yx/c = X/(Co – C) (1)

Yx/n = X/(No – N) (2)

onde Co e No são as concentrações de carbono e nitrogênio no meio alimentado, C e N as

correspondentes concentrações residuais e Yx/c e Yx/n os fatores de conversão de

biomassa em carbono e nitrogênio, respectivamente.

De (1) e (2) temos:

X = (Co – C)* Yx/c = (No – N)* Yx/n (3)

Dado que C e N se aproximam de zero quando o crescimento é limitado em carbono e

nitrogênio, a equação (3) resulta em:

24

Figura 3.4: Esquema representando os limites da região de crescimento com múltipla limitação de

nutrientes. D corresponde à vazão específica de alimentação empregada e Co/Nxo a relação entre a massa de carbono e a do nutriente limitado no meio de alimentação, que corresponde aos valores consumidos na condição de crescimento limitado. Adaptado de DURNER et al. ,1998.

Co/No = Yx/n / Yx/c (4)

Assumindo como constantes os fatores de conversão sob crescimento limitado em um

único substrato, o limite em torno da região onde ocorre múltipla limitação pode ser estimado

a partir dos valores de fatores de conversão medidos em condições de crescimento limitado

em carbono e, de modo semelhante, para a condição de limitação em nitrogênio. Segundo Egli

(1991), o conceito de crescimento com dupla limitação carbono/nitrogênio pode ser estendido

a outros dois ou mesmo a múltiplas combinações de nutrientes.

Exemplos de crescimento com limitação simultânea de diferentes nutrientes têm sido

reportados na literatura: Cooney et al. (1976) para nitrogênio e fósforo, Hueting e Tempest

(1979) para carbono e nitrogênio e carbono e potássio, Egli (1982), Egli (1991), Durner

(1998) e Durner et al. (2000) para carbono e nitrogênio.

A manipulação da relação C/N do meio de alimentação para atingir estados de dupla

limitação, empregado no presente trabalho, foi também utilizada para produção de poli-3-

hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato, por Yan et al. (2005). Ralstonia eutropha ATCC 17669

foi cultivada em biorreator em processo descontínuo-alimentado utilizando como fonte de

carbono uma mistura de ácidos orgânicos (butírico, propiônico, acético e láctico) e sulfato de

amônio como fonte de N. Diferentes vazões de alimentação com diferentes relações C/N

25

foram experimentadas e as zonas de dupla limitação dos substratos determinadas. Foi possível

estabelecer qual a melhor relação das correntes de alimentação das fontes de C e N e observar

que até cerca de 50% do polímero formado se deu durante o período de dupla limitação.

A Tabela 3.1 resume os resultados mais significativos descritos na literatura de

produção de PHAMCL em biorreatores com diversas linhagens.

Considerando que a fonte de carbono utilizada na produção de PHA representa uma

importante parcela do item de custos do processo, vários são os trabalhos que empregam

substratos de baixo custo, tais como óleos vegetais ou mesmo ácidos graxos deles derivados

(EGGINK et al., 1995; CROMWICK et al., 1996; TAN et al., 1997; HAZER et al., 1998).

Segundo Gomez (2000), a produção de PHAMCL a partir de carboidratos seria outra alternativa

para redução dos custos, entretanto, tem sido pouco estudada e sem uma real avaliação do

potencial de produção industrial destes polímeros (HAYWOOD et al., 1990; TIMM e

STEINBÜCHEL, 1990). Kim et al. (1996) cultivaram P. putida BMO1 em glicose, atingindo

100 g/L de biomassa total, porém, com apenas 0,6 g/L de PHA em cultivo descontínuo

alimentado. Weusthuis et al. (1997) atribuem o descaso com a produção de PHAMCL a partir

de carboidratos à diferença nos valores máximos teóricos dos fatores de conversão destes

substratos em PHAMCL, quando comparados aos valores com ácidos carboxílicos. Entretanto,

do ponto de vista industrial, o fator importante que deve ser considerado é o impacto da fonte

de carbono no custo de produção. Gomez (2000) apresenta uma comparação dos custos

mínimos de fonte de carbono para produção de PHAMCL a partir de sacarose ou de óleo de

soja demonstrando valores semelhantes.

O IPT e a USP tem estudado a produção de PHAMCL utilizando tanto óleos de origem

vegetal como carboidratos. Gomez (2000) isolou várias linhagens bacterianas capazes de

acumular PHAMCL a partir de carboidratos e a linhagem P. putida IPT 046 foi selecionada por

apresentar a melhor eficiência na conversão de carboidratos nestes polímeros. Ensaios em

biorreator com essa linhagem e utilizando glicose e frutose, resultaram em um polímero

contendo monômeros de 3-hidroxihexanoato (3HHx), 3-hidroxioctanoato (3HO), 3-

hidroxidecanoato (3HD), 3-hidroxidodecanoato (3HDd) e cerca de 5% de monômeros

insaturados 3-hidroxi-5-cis-dodecenoato (3HDd∆5) e 3-hidroxi-7-cis-tetradecenoato

(3HTD∆7) (SANCHEZ et al., 2003). Diniz et al. (2004) estudaram a produção de PHAMCL

com P. putida IPT 046 cultivada em glicose e frutose como fontes de carbono. Foram testados

vários procedimentos descontínuos-alimentados para o crescimento microbiano, seguidos de

limitação por nitrogênio ou fósforo para indução da síntese do polímero. O melhor resultado

foi obtido através de um cultivo com alimentação a vazão constante da fonte de carbono até

26

crescimento de biomassa de cerca de 30 g/L, seguida de limitação da fonte de fósforo,

resultando em cerca de 50 g/L de biomassa com 63% de teor de polímero e produtividade de

cerca de 0,8 g/L.h.

Dentre vários isolados, Silva-Queiroz (2003) identificou 4 linhagens bacterianas

capazes de acumular PHAMCL utilizando diferentes óleos vegetais (soja, milho, canola, arroz,

girassol). A utilização de óleo de soja como fonte de carbono resultou num polímero

constituído de monômeros 3HHx, 3HO, 3HD, 3HDd e 3HTD (3-hidroxitetradecenoato) com

cerca de 30 a 40% de monômeros insaturados.

Além do cultivo em biorreator, operações para separação e purificação do polímero

intracelular também têm que ser consideradas para a produção industrial de PHAMCL. Os

procedimentos para separação e purificação são semelhantes em vários aspectos àqueles

originalmente desenvolvidos para P3HB ou P3HB-co-3HV. De Koning e Witholt (1997)

desenvolveram processo de solubilização de todos os constituintes celulares de P. oleovorans

e P. putida com a conseqüente liberação do PHAMCL produzido, obtendo-se um látex, ou seja,

grânulos de PHA suspensos em água em concentrações de aproximadamente 300 g/L. O látex

representa uma boa maneira de manipular industrialmente estes materiais, uma vez que o

produto puro apresenta-se aderente e pode demorar vários dias para cristalizar (DE KONING

et al., 1997a).

27

Tabela 3.1: Quadro resumo de resultados obtidos de produção de PHAMCL em biorreator.

Bactéria Fontes de C PHA X

(g/L)

PHA

(%)

P

(g/Lh)

Tipo de processo Referência

P. putida IPT046 glicose e frutose C8 a C12 (1) 51 63 0,8 descontínuo alimentado DINIZ et al., 2004

P. oleovorans ATCC29347

ac. Octanóico - 63

55

62

75

1

0,63

descontínuo alimentado KIM, 2002

P. putida ác. Oléico - 141 52 1,91 descontínuo alimentado LEE et al., 2000

P. oleovorans n-octano - 18 63 1,06 contínuo (2 estágios) JUNG et al., 2000

P. putida KT2442 ác. octanóico e ác. undecenóico

C6 a C11 (2) 30 33 0,20 descontínuo alimentado KELLERHALS et al., 1999

P. oleovorans n-octano - 12

18

30

63

0,74

1,1

contínuo

contínuo (2 estágios)

HAZENBERG e WITHOLT, 1977

P. putida glicose e octanoato - 54,8 66 0,92 descontínuo alimentado KIM et al., 1997

P. putida BM01 Glicose - 100 1 - descontínuo alimentado KIM et al., 1996

P. putida ác.oleico C6 a C16 (3) 30 35 0,67 contínuo HUIJBERTS et al., 1996

P. putida KT2442 ác.oleico C6 a C16 (3) 92 45 1,50 descontínuo alimentado HUIJBERTS et al., 1996

11,6 23 0,58 contínuo (2 estágios) PREUSTING et al., 1993 P. oleovorans n-octano C6 e C8

37,1 33 0,25 descontínuo-alimentado PREUSTING et al., 1993

(1) polímero com 5% de constituintes insaturados; (2) polímero com 43,5 mol% de constituintes insaturados, presença de constituintes impares (C7, C9 e C11); (3) somente constituintes pares.

28

3.4 Engenharia metabólica na produção de PHAMCL

A engenharia metabólica permite otimizar a produtividade e os fatores de conversão

de substrato aos produtos de interesse através da análise do fluxo metabólico (AFM) e se

preocupa em modelar os sistemas biológicos de uma forma mais estruturada, realizando

balanços de massa envolvendo metabólitos intracelulares para calcular os seus fluxos através

de toda a rede metabólica, nem sempre considerados na modelagem matemática convencional

(STEPHANOPOULOS et al., 1998).

Estes fluxos podem ser calculados através das medidas das velocidades específicas de

produção e consumo de metabólitos intracelulares, bem como de consumo de substratos e

formação de produtos medidos fora do envelope celular. Por meio de balanço de massa e

considerando a estequiometria das diversas reações metabólicas, é possível o estabelecimento

de um modelo estequiométrico de um processo biológico, utilizando-se ferramentas de

álgebra linear e otimização linear para resolução do modelo. Outra forma de abordagem inclui

o uso de isótopos marcados para determinar a partição dos fluxos pelas vias metabólicas,

permitindo elaborar um mapa metabólico com um diagrama das principais reações

bioquímicas envolvidas e a estimativa das velocidades de cada passo em estado estacionário

(GOMBERT e NIELSEN, 2000). Isto permite comparar os fluxos metabólicos estabelecidos

em diferentes situações de cultivo, fluxos para linhagens de células modificadas

geneticamente em diferentes pontos da via metabólica e identificar pontos chaves de

ramificação, para a proposição de vias metabólicas alternativas, para a estimativa de fluxos

extracelulares não considerados durante a elaboração do modelo e para o cálculo dos fatores

de conversão máximos teóricos a partir de um dado substrato (STEPHANOPOULOS et al.,

1998).

Recentemente, a AFM tem sido utilizada para estudar as vias de síntese de PHA em

diferentes microrganismos (LEAF e SRIENC, 1998; KATO et al., 1999), permitindo entender

melhor as vias metabólicas envolvidas e indicar pontos relevantes onde se poderia atuar para

maximizar o rendimento da produção do polímero (SHI et al., 1999; SRIENC, 2002; LEE,

2002; LANGE et al., 2002). A biossíntese de PHA oferece uma situação ideal para análise de

fluxos metabólicos, pois, em diversas situações, a análise é facilitada devido ao fluxo de

metabólitos desviados para o crescimento celular ser nulo, ou seja, todo o carbono é

direcionado para a síntese de PHA (BRÄMER et al., 2002).

29

3.5 Aplicações para PHAMCL

Considerando que as propriedades dos PHA variam com sua composição monomérica,

um aspecto a ser destacado sobre a produção de PHA é a grande diversidade de monômeros

que podem ser a eles incorporados e seu potencial para a produção sob medida para diferentes

aplicações. Embora diversos monômeros tenham sido detectados em PHA, na maioria dos

casos, sua incorporação só foi obtida utilizando substratos com estrutura estritamente

relacionada ao monômero produzido e as possibilidades de combinações ainda são bastante

restritas (STEINBÜCHEL e VALENTIN, 1995). Além disso, a pequena escala de produção

da maioria do PHAMCL dificulta sua caracterização completa e com isso o estabelecimento de

relações entre a composição monomérica e as propriedades do material obtido.

Embora ainda não disponíveis comercialmente, uma série de aplicações potenciais têm

sido desenvolvidas para PHAMCL. Por sua fácil manipulação na forma de látex, podem ser

utilizados como filmes de revestimentos de papel, papelão, etc. (DE KONING et al., 1997b).

Uma outra aplicação promissora para PHAMCL é como fonte para monômeros quirálicos

(WITHOLT e KESSLER, 1999). Babu et al. (1997) verificaram que formulações baseadas em

determinados PHA apresentam características específicas boas para adesivos sensíveis à

pressão. Van der Walle et al. (1999) cita a utilização de PHA produzidos por P. putida como

agentes ligantes em formulações de tintas, que permitiriam a substituição dos solventes

orgânicos por água, possibilitando o desenvolvimento de tintas não agressivas ao meio

ambiente. Por serem biocompatíveis, aplicações na área medica, também têm sido objeto de

estudos. PHAMCL têm sido avaliados para a produção de "scaffolds" (moldes que suportam e

dirigem o crescimento das células) em aplicações de engenharia de tecidos (WILLIAMS et

al., 1999). Diversas aplicações para PHA na área de aparatos médicos bioabsorvíveis vêm

sendo desenvolvidas pela Tepha, Inc. (http://www. tepha.com).

Vários são os trabalhos citados por Kim et al. (2007) para modificação de

propriedades de PHAMCL visando aplicações na área médica. Estudos que envolvem blendas

com outros materiais (MALLARDÉ et al., 1998; RENARD et al., 2004; KIM et al., 2005),

“crosslinking” (ligações cruzadas) de PHAMCL insaturados empregando luz ultravioleta (KIM

et al, 2001), raios γ (ASBY et al., 1998; DUFRESNE et al., 2001) ou peróxidos (GAGNON et

al., 1994), ou mesmo a utilização de tratamentos térmicos juntamente com ultravioleta e

peróxidos (HAZER et al.,2001; CHUNG, 2005). Substituições químicas nas cadeias laterais

em PHAMCL insaturados introduzindo grupos funcionais tais como epóxi (BEAR et al., 2001),

30

hidroxila (LEE et al., 2000; EROGLU et al., 2005) ou grupos clorados (ARKIN et al., 2000)

também são citados.

Dentro desse panorama mundial apresentado, esse trabalho se insere neste cenário que

ainda carece de estudos e metodologias que otimizem condições para obter PHAMCL com

diferentes composições monoméricas para testar e ampliar suas aplicações.

31

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Ensaios em biorreator

Microrganismo: a linhagem Pseudomonas putida IPT 046 foi a utilizada em todos os

ensaios.

Preparo de inóculo: o inóculo foi preparado a partir de colônias isoladas de cultura

mantida em freezer a –70ºC. A Figura 4.1 apresenta um esquema do preparo de inóculo.

As composições dos meios de cultura utilizados nessa etapa estão descritos a seguir.

O Meio Caldo Nutriente (CN) continha a seguinte composição por litro:

[1] peptona ......................... 5,0 g [2] extrato de carne ............ 3,0 g

O meio de Agar Nutriente (AN) continha a mesma composição do meio CN, porém,

acrescido de 20 g de ágar bacteriológico por litro de meio de cultura.

O Meio Mineral-inóculo (MM) continha a seguinte composição por litro:

[1] (NH4)2SO4...................... 3,0 g [2] Na2HPO4........................3,5 g

[3] KH2PO4 ........................1,5 g [4] MgSO4.7H2O ................1,0 ml [5] CaCl2.2H2O ...................1,0 ml [6] Citr. Fe NH4....................1,0 ml [7] Elementos traços.............1,0 ml [8] Glicose............................10,0 g

Soluções estoque contendo MgSO4.7H2O (20%), CaCl2.2H2O (1%) e Citrato Fe NH4 (6%),

porcentagens expressas em massa por volume, eram mantidas em geladeira para o preparo

desse meio (MM), sendo a solução de citrato férrico amoniacal armazenada em frasco escuro.

A solução de elementos traços era composta por: 0,30 g/L de H3BO3, 0,20 g/L de

CoCl2.6H2O, 0,10 g/L de ZnSO4.7H2O, 0,03 g/L de MnCl2.4H2O, 0,03 g/L de

NaMoO4.2H2O, 0.02 g/L de NiCl2.6H2O e 0,01 g/L de CuSO4.5H2O e também mantida em

geladeira.

Os ensaios realizados foram divididos em dois grupos: os realizados a baixa densidade

celular (concentração de biomassa celular menor que 6 g/L) e os em alta densidade celular

(concentração de biomassa celular acima de 15 g/L).

32

Figura 4.1: Esquema de preparo de inóculo.

Todos os ensaios em biorreator foram realizados com pH e temperatura controlados a

7,0 e 30oC, respectivamente. O controle do pH era feito com NaOH e H2SO4 0,5 N nos

ensaios a baixa densidade celular e, 1,0 N nos ensaios em alta densidade celular, sendo o

consumo acompanhado com o auxílio de balança. Os ensaios iniciais foram realizados em

biorreator New Brunswick Scientific modelo Microferm com dorna de 3 litros (1,75 L) e

posteriormente em biorreator B. Braun modelo Biostat B (1,5 L) com dorna de 2 litros.

Ensaios preliminares visando obter maiores valores de produtividade (alta densidade) foram

realizados no biorreator B. Braun modelo Biostat B (2,4 L) com uma dorna de 4 litros. Os

biorreatores foram acoplados a um analisador Hartmann & Braun modelo Uras de CO2 e O2

para realização de balanço gasoso. Para a alimentação e retirada de meio de cultura do

biorreator utilizaram-se bombas peristálticas (Masterflex, modelo 7523-35). A figura 4.2

ilustra a montagem dos ensaios em biorreator operado de forma contínua.

33

Figura 4.2: Biorreator operado de forma contínua.

Os cultivos a baixa densidade celular tinham início com uma batelada em meio com

composição descrito a seguir (Meio Mineral – batelada) e após cerca de 5 horas da batelada

inicial, iniciava-se o cultivo contínuo através do acionamento das bombas peristálticas.

O Meio Mineral- batelada continha a composição descrita abaixo (por litro).

[1] (NH4)2SO4...................... 1,570 g [2] KH2PO4 ........................0,209 g [3] MgSO4.7H2O ................0,195 g [4] CaCl2.2H2O ..................0,001 g [5] Citr. Fe NH4................. 0,003 g [6] Elementos traços........... ....2,0 ml [7] NaCl..................................1,0 g [8] Glicose..............................5,25 g Frutose..............................5,25 g

A solução de elementos traços era a mesma empregada no preparo do meio de inóculo (MM)

e foi a utilizada em todos os meios minerais nos ensaios realizados.

O meio alimentado nesses ensaios (Meio Mineral–contínuo) possuía a composição

básica (por litro) descrita abaixo, estimada para cerca de 1,8 g/L de biomassa celular livre de

polímero, variando-se apenas a concentração da fonte de carbono:

34

[1] (NH4)2SO4.......................1,570 g [2] KH2PO4 ......................0,209 g [3] MgSO4.7H2O..................0,168 g [4] CaCl2.2H2O....................0,001 g [5] Citr. Fe NH4...................0,003 g [6] Elementos traços....................2 ml [7] NaCl........................................1 g

Para aplicação do método dinâmico de determinação de velocidade específica de

crescimento, segundo Pirt (1975), foi utilizado o seguinte meio de cultura (composição por

litro):

[1] (NH4)2SO4.......................2,762 g [2] KH2PO4 ......................0,368 g [3] MgSO4.7H2O.................0,295 g [4] CaCl2.2H2O....................0,002 g [5] Citr. Fe NH4...................0,006 g [6] Elementos traços...................2 ml [7] NaCl.......................................1 g [8] Glicose..................................20 g Frutose..................................20 g

Nos ensaios com excesso de fonte de carbono, os meios foram preparados com cerca

de 12,5 g/L de glicose e 12,5 g/L de frutose, tendo os outros componentes a composição

descrita para o Meio Mineral – contínuo. Ensaios limitados em fonte de carbono foram

preparados com cerca de 2,5 g/L de glicose e 2,5 g/L de frutose. Nos ensaios limitados em

fósforo, a concentração da fonte de nitrogênio (NH4)2SO4 foi aumentada de 1,57 g/L para 4,71

g/L e nos ensaios limitados em nitrogênio, à concentração da fonte de fósforo (KH2PO4) que

inicialmente era de 0,209 g/L foi aumentada para 0,45 g/L e, num segundo ensaio, para 0,90

g/L. A composição da solução de elementos traços do Meio mineral – contínuo e do meio

utilizado para determinação da velocidade específica de crescimento foi a mesma do preparo

de inóculo.

Nos ensaios em alta densidade celular o meio Meio Mineral - batelada continha a

composição descrita a seguir (por litro):

[1] (NH4)2SO4.....................11,630 g [2] KH2PO4 .........................1,550 g [3] MgSO4.7H2O .................1,240 g [4] CaCl2.2H2O ...................0,0073 g [5] Citr. Fe NH4...................0,0237 g [6] Elementos traços........... ....2,0 ml [7] NaCl...................................1,0 g [8] Glicose..............................22,23 g Frutose..............................22,23 g

35

Os cultivos em alta densidade celular tinham início com uma batelada em meio com a

composição descrita acima (Meio Mineral – batelada) e, iniciava-se o cultivo contínuo quando

as concentrações de glicose e frutose atingiam valores próximos de zero, através do

acionamento das bombas peristálticas.

A Tabela 4.1 apresenta a composição dos meios alimentados nos ensaios de alta

densidade.

Tabela 4.1: Composição dos meios de alimentação dos ensaios em alta densidade (quantidade dos reagentes em g/litro de meio alimentado).

Ensaio MCLc 17 MCLc 18 MCLc 19 MCLc 20 MCLc 22

Glicose 102 75 54 68 198 258

Frutose 102 75 54 68 198 258

(NH4)2SO4 26,164 26,164 12,129 25,48 24,81 33,35 24,67

KH2PO4 3,487 3,487 1,395 2,48 3,29 4,44 2,30 2,08

MgSO4.7H2O 2,794 2,794 1,118 1,49 2,65

CaCl2.2H2O 0,017 0,017 0,007 0,009 0,016

Citr. Fe NH4 0,053 0,053 0,021 0,028 0,051

Elementos Traços(1) 6 6 2 4 4

NaCl 3 3 1 1,33 1,33

(1) Mililitros por litro de meio alimentado.

Em todos os ensaios as vazões de alimentação eram verificadas periodicamente e

amostragens foram realizadas para a análise de: biomassa celular, teor e composição de PHA,

concentração das fontes de carbono, fósforo, nitrogênio e ácidos, segundo as metodologias

descritas a seguir. O controle de possíveis contaminações ao longo dos ensaios também foi

realizado através de observação microscópica de lâminas coradas (coloração de Gram) e

estrias em placas com meio de Ágar Nutriente.

36

4.2 Metodologias analíticas

Massa seca celular: a biomassa celular foi determinada por gravimetria após

centrifugação de volume conhecido da cultura, filtração em membrana de poro 0,45 µm

(Millipore) e secagem em estufa a 105oC por 5 horas.

A biomassa celular também foi estimada por determinação da absorbância a 625 nm,

após centrifugação da amostra, descarte do sobrenadante e suspensão em solução salina (8,5%

NaCl). Solução salina foi utilizada como branco e as amostras foram diluídas com a mesma

solução quando necessário.

Concentração de nitrogênio amoniacal: A concentração de nitrogênio amoniacal foi

determinada em potenciômetro (Procyon - mod SA720) com eletrodo específico para

detecção de amônia (Orion - mod. 95-12) após alcalinização da amostra (pH > 9) com NaOH

10 M. Soluções de (NH4)2SO4 contendo cerca de 10, 25, 50, 100, 250 e 500 ppm de

nitrogênio foram utilizadas para obtenção de curva de calibração.

Concentração dos ácidos acético, propiônico, pirúvico e fórmico A concentração dos

ácidos foi determinada por cromatografia de fase líquida (HPLC). Um volume de 20 µL de

amostra, adequadamente diluída para uma concentração entre 0,1 e 4,0 g/L, filtrada em

membrana de poro 0,45 µm (Millipore), foi injetado em cromatógrafo (Waters) equipado com

uma coluna para determinação de ácidos (Shodex KC 811). Os ácidos foram detectados

através de índice de refração diferencial (Waters 410 differential refractometer). Soluções

contendo cerca de 0,1 a 4,0 g/L de cada um dos ácidos analisados foram utilizadas para

obtenção de uma curva de calibração. As condições de operação do aparelho foram as

seguintes: temperatura de coluna de 55 oC, e como fase móvel uma solução aquosa de H3PO4

0,1% com vazão de 1,0 mL/min.

Concentração de carboidratos: As concentrações de glicose e frutose foram

determinadas por cromatografia de fase líquida (HPLC). Um volume de 10 µL de amostra,

adequadamente diluída para uma concentração entre 0,1 e 3,5 g/L, foi filtrada em membrana

de poro 0,45 µm (Millipore) e injetada em cromatógrafo (Waters) equipado com coluna para

determinação de açúcares (Shodex SC 1011). Os carboidratos foram detectados por índice de

refração diferencial (Waters 410 differential refractometer). A calibração do aparelho foi

realizada utilizando soluções contendo aproximadamente 0,1 a 3,5 g/L de cada um dos

açúcares. As condições de operação do aparelho foram as seguintes: temperatura de coluna de

72 oC e como fase móvel uma solução aquosa de EDTACa(Na)2 0,5 M com vazão de 0,6

mL/min.

37

Teor e composição de PHA: a quantidade e composição de PHA foram determinadas

por cromatografia de fase gasosa, segundo metodologia descrita por Gomez (2000). A

quantidade e composição de PHA foram determinadas através de cromatografia de fase

gasosa de propil-ésteres (RIIS e MAI, 1988). Entre 10 e 15 mg de células liofilizadas foram

transferidas para tubos, aos quais foram adicionados 2 mL de uma solução de ácido clorídrico

em propanol (1:4 v/v), 2 mL de 1,2-dicloroetano e 100 µL de uma solução de ácido benzóico

(40 g/L) em propanol. Os tubos foram fechados fortemente, agitados e submetidos a

propanólise por 3 horas a 100 oC, com agitação após os primeiros 30 minutos de propanólise.

Após resfriamento, foram adicionados aos tubos 4 mL de água destilada, agitando-os

vigorosamente por 30 segundos. Após separação, a fase aquosa (superior) foi descartada e a

fase orgânica (inferior) utilizada para análise. Um volume de 1 µL da fase orgânica foi

analisado após fracionamento da amostra ("split" 1:20) em cromatógrafo gasoso HP6890

Series GC System equipado com um coluna HP-5 (5% fenil-metil-siloxane, comprimento 30

m, diâmetro 0,25 mm, espessura do filme 0,25 µm). A análise foi realizada nas seguintes

condições: hélio como gás de arraste (0,8 mL/min), temperatura do injetor de 250 oC,

temperatura do detector de 300 oC, sistema de detecção FID (ionização de chama) e a seguinte

programação de temperatura: 100 oC por 1 minuto, elevação da temperatura até 185 oC a 8 oC/min e 185 oC por 15 minutos.

Ácido benzóico foi utilizado como padrão interno. Polímeros produzidos por P. oleovorans

ou P. putida a partir de diferentes fontes de carbono foram utilizados como padrões para a

geração das curvas de calibração. O PHA total foi calculado somando-se as quantidades dos

constituintes 3-hidroxihexanoato (3HHx), 3-hidroxioctanoato (3HO), 3-hidroxidecanoato

(3HD) e 3-hidroxidodecanoato (3HDd).

Concentração de fósforo: a concentração de fósforo foi determinada por colorimetria

pelo método do ácido ascórbico, descrita por Franson (1985). Uma solução de reativo era

preparada a partir da mistura das soluções: ácido sulfúrico (5N), tartarato de antimônio e

potássio (2,713g/L), molibdato de amônio (40g/L) e ácido ascórbico (0,1 M) na proporção em

volume de 10:1:3:6, respectivamente. No preparo da curva padrão partiu-se de uma solução

de K2HPO4 (219,5 mg/L). A leitura de absorbância era realizada a 880 nm, misturando-se:

200 µl de amostra ou padrão ou água (branco), 4,9 ml de água deionizada, 800 µl de reativo,

após 10 minutos de incubação e num intervalo de tempo de no máximo 30 minutos.

38

4.3 Avaliação de fluxos metabólicos na produção de PHAMCL

A análise de fluxos metabólicos (AFM) foi baseada no procedimento proposto por

Stephanopoulos et al. (1998). Ao longo de todos os ensaios foram retiradas amostras

periódicas e analisadas as concentrações de biomassa total, PHA, fontes de carbonos

fornecidos e ácidos orgânicos excretados (ácidos acético, pirúvico, fórmico e propiônico),

bem como o teor de O2 e CO2 nos gases de saída. A partir desses dados, calcularam-se as

velocidades específicas de cada um dos substratos consumidos e produtos formados bem

como os fatores de conversão dos substratos aos monômeros. Para a efetivação da AFM,

propuseram-se modelos de metabolismo, avaliando-se os fluxos dos metabólitos intracelulares

através da realização do balanço de massa em estado estacionário, utilizando-se das medidas

de velocidades específicas e da estequiometria dos modelos de metabolismo propostos.

No caso do modelo E3 utilizou-se o programa Metatool (FEIFFER et al., 2000 de

acesso livre na internet: http://pinguin.biologie.uni-jena.de/bioinformatik/networks/metatool/

metatool.html) para simulação do modelo. O programa analisa e constrói vias metabólicas a

partir de dados bioquímicos e/ou seqüências genômicas. A metodologia adotada para o

desenvolvimento desse programa é baseada no conceito de modos elementares de fluxos. A

obtenção desses modos elementares de fluxos permite testar se conjuntos de enzimas formam

uma via metabólica consistente, compreendendo, principalmente, o direcionamento das

reações, a irreversibilidade. A partir da análise de um conjunto de vias metabólicas, o

programa gera regiões admissíveis de distribuição de fluxo em estado estacionário,

fornecendo as possíveis vias metabólicas juntamente com os respectivos fluxos das enzimas

responsáveis pelas reações. Um resumo da forma como funciona o programa se encontra no

Anexo C junto com os programas de entrada e saída utilizados nesse trabalho.

39

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Determinação de velocidade específica máxima crescimento (µmax) para a linhagem

IPT 046

A determinação da velocidade específica de crescimento máxima (µmax) da linhagem

IPT 046 foi realizada empregando o Método dinâmico. Para esse experimento, utilizou-se

meio mineral descrito no item Material e Métodos.

Diniz et al. (2004) obtiveram valores de µmax de 0,65 h-1 para essa mesma linhagem.

Assim, com base nesses autores, a vazão específica de alimentação utilizada foi de 0,95 h-1.

Inicialmente, a vazão específica de alimentação foi mantida constante por 4 estados

estacionários em 0,4 h-1, atingindo uma concentração de biomassa de 2,97g/L. O valor de D

foi então alterado para 0,95 h-1, realizando-se amostragem a cada hora. A Figura 5.1 abaixo,

ilustra os resultados obtidos nesse ensaio, que corresponde as amostras realizadas entre as 70

e 78h do ensaio MCLc 04 (ANEXO A).

A equação da reta resultante obtida foi Ln (X/Xo) = – 0,321T – 0,038 e o valor de

µmax calculado de 0,63 h-1, valor praticamente igual ao obtido por Diniz et al. (2004) no

cultivo em batelada, que foi de 0,65 h-1.

Os ensaios conduzidos de forma contínua foram então planejados, considerando o

valor obtido de µmax, a vazões de alimentação menores e não muito próximas a esse valor

(µmax) para que os estados estacionários fossem atingidos e, não ocorresse desestabilização

do sistema (“lavagem”).

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

00 2 4 6 8

Tempo (h)

Ln(X

/Xo)

Figura 5.1: Valores de Ln (X/Xo) em função do tempo para o ensaio de determinação de µmax pelo método dinâmico para P. putida IPT 046.

40

5.2 Crescimento com limitação de nutrientes - ensaios contínuos em baixa densidade

celular

Aspectos econômicos da produção de PHAMCL foram avaliados por Hazenberg e

Witholt (1997) e De Koning et al. (1997a). Segundo De Koning et al. (1997a), os fatores mais

importantes que compõem o custo de produção de PHA são: o retorno do capital investido na

planta de produção, os substratos utilizados para se obter o produto, especialmente a fonte de

carbono, e a etapa de separação e purificação. Enquanto a produtividade do processo tem

grande influência no capital investido na planta, o fator de conversão de substrato em produto

impacta no valor a ser gasto com insumos para produção e, as operações unitárias utilizadas

sobre a separação e purificação do PHA. Já o teor de polímero acumulado pela biomassa

influenciará em todos os três fatores citados, assim, a busca por altos teores de PHAMCL é de

vital importância para a definição do seu processo de produção.

No planejamento desse conjunto de ensaios foi considerada a necessidade de otimizar

o suprimento de substratos e a formação de produto, que no caso da produção de PHA,

significa cultivo celular na faixa de transição entre a região de dupla limitação de substratos

(por exemplo, fontes de carbono e nitrogênio) e a de nutriente limitante (por exemplo, fonte

de nitrogênio) e fonte de carbono em excesso. Também foi admitido que o conceito de

crescimento com limitação simultânea de carbono e nitrogênio pode ser estendido a outros

dois ou mesmo a múltiplas combinações de substratos, bem como que o limite em torno da

região de múltipla limitação pode ser estimado a partir de dados de fatores de conversão

medidos em condições de limitação única de um dos substratos.

A Tabela 5.1 resume o conjunto de ensaios realizados para se estudar o efeito das

limitações carbono/nitrogênio e carbono/fósforo na produção de PHAMCL e estimar os limites

em torno da região em que ocorrem essas limitações.

Cabe lembrar que cada condição testada equivale a um meio de cultura com uma

relação carbono/nutriente e cerca de cinco vazões de alimentação, cada uma mantida por um

tempo equivalente a cerca de 4 tempos de residência no estado estacionário. Os valores de

vazão específica de alimentação (D) testados variaram entre 0,04 e 0,50 h-1.

A Figura 5.2 ilustra os resultados de concentração de biomassa (X) obtidos nos

ensaios. Verifica-se que os valores de X são crescentes para valores decrescentes de D nos

ensaios com excesso de fonte de carbono (MCLc 6, 8, 9, 10, 12 e 21, Figura 5.2 a), já nos

ensaios limitados também na fonte de carbono (MCLc 5, 7 e 11, Figura 5.2 b), os valores de

X variaram pouco com D, ficando em torno de 2 g/L.

41

Tabela 5.1: Condições dos ensaios realizados para estudar o efeito da limitação de nutrientes na produção de PHAMCL.

Condição testada Ensaio Fonte de carbono Fonte de nitrogênio Fonte de fósforo

MCLc 9 e 8* Excesso Limitado Limitado

MCLc 10 e 8* Excesso Limitado Excesso

MCLc 6, 12 e 21 Excesso Excesso Limitado

MCLc 5 Limitado Limitado Limitado

MCLc 11 Limitado Limitado Excesso

MCLc 7 Limitado Excesso Limitado

* Foram detectadas quantidades significativas de P no meio de cultivo para alguns valores de D do ensaio MCLc 8, por esse motivo ele aparece em duas condições testadas.

(a)

0

1

2

3

4

5

6

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60D (h-1)

X (g

/L)

MCLc 06

MCLc 08

MCLc 09

MCLc 10

MCLc 12 e 21

(b)

0

1

2

3

4

5

6

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60

D (h-1)

X (g

/L)

MCLc 05

MCLc 07

MCLc 11

Figura 5.2: Valores de concentração de biomassa (X) obtidos nas diferentes vazões específicas de alimentação (D): a) ensaios não limitados na fonte de carbono (MCLc 6, 8, 9, 10, 12 e 21); b) ensaios limitados na fonte de carbono (MCLc 5, 7 e 11).

42

Ensaios anteriores realizados em batelada e batelada alimentada mostraram que quase

não ocorre acúmulo de polímero para crescimento exponencial em meio não limitado em

nutrientes com essa linhagem (Diniz et al., 2004). Assim, para valores mais próximos da

velocidade específica máxima de crescimento dessa linhagem, menores valores de PHA eram

esperados como ocorrido. O baixo teor de polímero ou mesmo a não detecção do mesmo, na

condição de limitação da fonte de carbono também eram esperados, dado que o polímero

constitui material de reserva de fonte de carbono para o microrganismo, sendo acumulado

quando em excesso de fonte de carbono (ANDERSON e DAWES, 1990).

Quanto aos fatores de conversão, o que se observou é que variam com D e, nos ensaios

em que a fonte de carbono não foi limitante, o fator de conversão de fonte de carbono em

biomassa residual (livre de polímero) (Yxr/c) aumenta com o aumento da velocidade de

crescimento da biomassa, atingindo valores máximos da ordem de 0,4 – 0,5 g/g, como mostra

a Figura 5.3 quando praticamente não se observa acúmulo de polímero. O valor de 0,4 g/g é

citado no trabalho de Diniz et al. (2004) para essa mesma linhagem em condições de

crescimento celular, sem acúmulo de polímero e com a mesma fonte de carbono. Já nos

ensaios limitados em fonte de carbono, não foi possível estabelecer uma relação direta desse

parâmetro com D.

A limitação ou não na fonte de carbono resultou em comportamentos semelhantes de

valores de Yxr/p (Figura 5.4), valores praticamente constantes para toda a faixa de Ds

ensaiadas, valores na faixa de 30 – 40 g/g na condição de limitação em P, 20 – 25 g/g na

condição de limitação em N e 35 – 50 g/g para N e P limitados, sendo que nessa última

condição para limitação de fonte de C, os valores parecem ser um pouco inferiores aos com

excesso de fonte de carbono.

Quanto a Yxr/n (Figura 5.5), este variou pouco para os valores de D testados,

independente da limitação ou não da fonte de C. Os valores obtidos para a condição de

limitação em nitrogênio mostram-se um pouco superiores aos das duas outras condições

ilustradas nessa figura, porém são valores próximos aos citados para essa linhagem por Diniz

et al. (2004) e para A. eutrophus utilizando a mesma fonte de carbono na produção de PHA

(PICOLLI, 1995).

43

Nlim

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

Yxr/c

(g/g

)

Plim

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

Yxr/c

(g/g

)

N e Plim

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

Yxr/c

(g/g

)

Figura 5.3: Fator de conversão de fonte de carbono em biomassa residual (Yxr/c) calculado nas

vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N e Plim), não limitados em fonte de C (•) e limitados na fonte de C (ο).

44

Nlim

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

Yxr/p

(g/g

)

Plim

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

Yxr/p

(g/g

)

N e Plim

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

Yxr/p

(g/g

)

Figura 5.4: Fator de conversão de fósforo em biomassa residual (Yxr/p) calculado nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N e Plim), não limitados em fonte de C (•) e limitados na fonte de C (ο).

45

Nlim

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

Yxr/n

(g/g

)

Plim

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

Yxr/n

(g/g

)

N e Plim

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)

Yxr/n

g/g

)

Figura 5.5: Fator de conversão de nitrogênio em biomassa residual (Yxr/n) calculado nas vazões

específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N e Plim), não limitados em fonte de C (•) e limitados na fonte de C (ο).

46

A partir dos valores de Co/No e Co/Po calculados segundo Egli e Quayle (1986), construiram-

se as Figuras 5.6, 5.7, 5.8 e 5.9. As Figuras representam uma estimativa dos limites da região

de múltipla limitação de nutrientes buscada, isto é, a fronteira entre a região limitada em

nutriente e fonte de carbono (região inferior) e a região limitada em nutriente e não limitada

em fonte de carbono (região superior). Para a construção desses gráficos (Figura 5.6 a 5.9)

considerou-se que concentrações de nitrogênio residuais menores que 200 mg/L, fósforo

residual menores que 20 mg/L e fonte de carbono residual (glicose + frutose) menores que 2

g/L eram limitantes (MARANGONI et al., 2002; DINIZ et al., 2004).

Nlim

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0Co/No (gC/gN)

D (h

-1)

MCLc10MCLc11MCLc 8

Limitação em N e não limitação em C

Limitação em C e não limitação em N

Figura 5.6: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C e N): relações Co/No (g de

C/g de N consumidos) para diferentes vazões específicas de alimentação (D).

Os resultados obtidos ilustrados nas Figuras 5.6 a 5.9, indicam que o limite superior da

região de múltipla limitação é função da velocidade de crescimento do microrganismo, sendo

os valores de Co/No e Co/Po crescentes com a diminuição de D. Já para o limite inferior,

Co/No e Co/Po variam muito pouco com D.

Para a condição de limitação somente em N (Figura 5.6), obteve-se uma região de

crescimento com múltipla limitação com Co/No variando num intervalo entre 9,5 e 27,8

gC/gN para D variando de 0,05 a 0,45 h-1. Durner et al. (2000) obtiveram uma região de

crecimento com múltipla limitação bastante semelhante para cultivo contínuo limitado em N

47

de P. oleovorans, um intervalo entre 7 e 28 gC/gN para D variando de 0,05 a 0,40 h-1, embora

utilizando uma fonte de carbono distinta. Egli (1991) cita valores de 6 a 24 gC/gN para D

variando de 0,9 a 0,02 h-1 para cultivo de Klebisiella pneumoniae em quimiostato empregando

glicerol como fonte de carbono. Durner et al. (2001) relacionam o fenômeno de crescimento

em limitação múltipla de nutrientes a habilidade do microrganismo em ajustar sua

composição celular a disponibilidade desses nutrientes. Segundo esses autores, quanto maior a

flexibilidade do microrganismo mais extenso é o regime de crescimento com limitação

múltipla em cultivo contínuo.

Na Figura 5.7, sob condição de limitação em P, os valores de Co/Po variaram no

intervalo aproximado de 30 a 160 gC/gP para D entre 0,05 a 0,49 h-1 na região de crescimento

com múltipla limitação.

Quando a limitação foi simultaneamente em N e P, a região de crescimento com

múltipla limitação foi observada para D variando entre 0,05 e 0,49 h-1 para Co/No no

intervalo aproximado de 7,5 e 26 gC/gN (Figura 5.8) e Co/Po entre 31 e 131 gC/gP (Figura

5.9). Se compararmos a extensão da faixa de limitação múltipla das figuras 5.6 e 5.8 e, 5.7 e

5.9, o que se observa é uma diminuição dessa extensão quando a limitação é conjunta em N e

P, em ambos os casos. Se considerarmos a afirmação de Durner et al. (2001) com relação à

extensão do regime de crescimento com múltipla limitação, essa diferença pode ser atribuída

ao fato de que para um mesmo microrganismo, a habilidade em ajustar a composição celular à

limitação de um nutriente deve ser mais simples do que para dois nutrientes.

A necessidade de se otimizar o suprimento de substratos e a formação de produto, que

no caso da produção de PHA significa cultivo celular na faixa de transição entre a região de

dupla limitação de substratos (por exemplo, fontes de C e N) e a de nutriente limitante (por

exemplo fonte de N) e não limitado na fonte de C, faz com que a atenção maior seja

dispensada para essa região desses gráficos. Assim, foram construídas as Figuras 5.10 a 5.13

que representam o teor de PHA acumulado, o fator de conversão da fonte de C em polímero, a

composição do mesmo e a produtividade nas vazões de alimentação testadas para os ensaios

limitados em N, limitados em P e limitados em N e P.

48

Plim

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0 40 80 120 160 200Co/Po (gC/gP)

D (h

-1)

MCLc 6 e 6bMCLc 12MCLc 7MCLc 21

Limitação em P e não limitação em C

Limitação em C e não limitação em P

Figura 5.7: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C e P): relações Co/Po (g de C/g

de P consumidos) para diferentes vazões específicas de alimentação (D).

N e Plim

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0Co/No (gC/gN)

D (h

-1)

MCL5MCL9MCL8

Limitação em N e P e não limitação em CLimitação

em C e não limitação em N e P

Figura 5.8: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C, N e P): relações Co/No (g de C/g de N consumidos) para diferentes vazões específicas de alimentação (D).

49

N e Plim

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0 40 80 120 160 200Co/Po (gC/gP)

D (h

-1)

MCLc 5

MCLc 9

MCLc 8

Limitação em C e não limitação em N e P

Limitação em N e P e não limitação em C

Figura 5.9: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C, N e P): relações Co/Po (g de

C/g de P consumidos) para diferentes vazões específicas de alimentação (D).

A Figura 5.10 mostra valores de PHA para as diferentes condições de limitação e o

que se observa é que maiores valores de polímero são acumulados quando P é o

nutriente limitante (valores máximos próximos a 70% de polímero). Quando a limitação é

somente na fonte de N, o máximo valor de teor de PHA obtido é de somente 40% da biomassa

celular. Entretanto, a limitação em ambos os substratos (N e P), além do alto teor de

polímero (68%) resulta em melhores fatores de conversão de fonte de carbono em polímero,

valores de YPHA/C de 0,19 g/g quando comparado com 0,16 g/g para limitação só em P e 0,10

g/g para limitação só em N (Figura 5.11).

Segundo Aguena (2007) existe um regulon (PHO), cuja principal característica é sua

indução exclusivamente na carência de P inorgânico, ou seja, sob limitação de fosfato a célula

muda o padrão de expressão gênica.

Assim, uma explicação para um maior acúmulo de PHA sob limitação de P poderia

estar relacionado com a indução da expressão de genes importantes ao acúmulo de PHA e que

fazem parte do regulon PHO. Resultado semelhante foi observado por Elbahloul e

Steinbüchel (2006) com relação ao acúmulo de cianoficina em Acinetobacter sp. Em

linhagem recombinante de Acinetobacter superexpressando o gene phoB (ativador do regulon

PHO) foi observado um maior acúmulo de cianoficina mesmo em condições não limitantes de

fosfato.

50

Nlim

0

20

40

60

80

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

PHA

(%)

Plim

0

20

40

60

80

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

PHA

(%)

N e Plim

0

20

40

60

80

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)

PHA

(%)

Figura 5.10: Teor de polímero (PHA) obtido nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos

ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim), não limitados em fonte de C.

51

A Figura 5.12 mostra a composição do polímero acumulado para os diferentes valores

de D testados, correspondentes à Figura 5.10. Observa-se que, independente do tipo de

limitação, a predominância é do monômero de 3-hidroxidecanoato (C10) cuja fração molar

fica na faixa de 70% a 80%. Os monômeros 3-hexanoato (C6), 3-hidroxioctanoato (C8) e o 3-

hidroxidodecanoato (C12) também estão presentes no polímero e, na condição de maior

acúmulo, a composição é praticamente a mesma para as 3 condições testadas, cerca de: 3%

mol de C6, 20% mol de C8, e 5% mol de C12.

A composição de um polímero produzido pela mesma linhagem utilizada neste

trabalho em regime descontínuo-alimentado, limitado em N a partir de glicose e frutose é

descrita por Sánchez et al. (2004). O polímero obtido nesse trabalho também tem como

monômero predominante C10 porém, em porcentagens um pouco menores (60 - 70% mol), 20

- 25% mol de C8 e 6% mol de monômeros insaturados.

A Figura 5.13 mostra os valores de produtividade para as diferentes condições de

limitação e os maiores valores obtidos são da ordem de 0,16 – 0,18 gPHA/L.h, obtidos para D

= 0,05 h-1, nas condições de limitação somente em P e em N e P simultaneamente. Na

condição de limitação em N os valores máximos foram da ordem de 0,08 gPHA/L.h. Esses

valores são inferiores ao citado para essa mesma linhagem em cultivo descontínuo-alimentado

à alta densidade celular por Diniz et al. (2004) que foi de 0,8 g/Lh. Cabe lembrar, entretanto,

que o conjunto de ensaios realizados tinha como objetivo principal, otimizar o suprimento de

substratos e a formação de produto e foram realizados a baixas densidades celulares.

A partir dos dados coletados ao longo dos ensaios da composição em O2 e CO2 do gás

de saída do biorreator, foi possível calcular as velocidades de consumo de O2 e produção de

CO2. Para cada D testado, um valor médio foi calculado tomando os pontos do estado

estacionário estabelecido.

Pirt (1985) cita que a velocidade específica de consumo de oxigênio (qO2) pode ser

equacionada segundo a relação (equação 5) a seguir, que relaciona o fator de conversão de

oxigênio em células (Yx/o), a quantidade de oxigênio gasto pelas células para manutenção das

mesmas (mo), a velocidade específica de crescimento celular (µ) e a concentração da

biomassa celular (x).

qO2 = mo + (1/Yx/o) µx (5)

52

Partindo da definição de velocidade de consumo de oxigênio e considerando que em

cultivos contínuos a velocidade específica de crescimento celular é dada pela vazão específica

de alimentação, tem-se que a velocidade específica de consumo de oxigênio (qO2) é

proporcional a D (equação 6), possibilitando o cálculo de Yx/o através do coeficiente angular

( = 1/Yx/o) e do coeficiente de manutenção (mo) respectivo, pelo coeficiente linear da reta

obtida.

qO2 = mo + (1/Yx/o) D (6)

Os valores de qO2 obtidos nos ensaios foram plotados em função de D e um ajuste

linear possibilitou o cálculo do fator de conversão de oxigênio em células (Yx/o) e o

coeficiente de manutenção (mo) respectivo para as condições de limitação em N, P e N e P

simultâneos, como mostra a Figura 5.14. Para essas condições foi possível o cálculo da

velocidade específica de consumo de oxigênio nos diferentes valores de D e os valores de

Yxr/o e mo. No ajuste linear para condição de Nlim, não foi considerado o ponto

correspondente a D = 0,45 h-1.

Para a condição de limitação em N, obteve-se Yxr/o = 0,96 g/g (0,031 g/mmol), para

limitação em P Yx/o = 1,39 g/g (0,045 g/mmol) e para limitação em N e P o valor de Yx/o =

1,53 g/g (0,049 g/mmol). O valor de mo obtido foi praticamente o mesmo para as três

condições: 3,45mmol/gh para a primeira condição, 4,09 mmol/gh na segunda e 3,72 mmol/gh

na terceira, ou seja, 0,11-0,13 g/gh, indicando que a limitação simultânea em N e P implica

em menor consumo de oxigênio para gerar células quando comparada com a condição de

limitação somente em N ou P e, que o oxigênio gasto para manutenção das células independe

do tipo de limitação e da vazão específica de alimentação empregada no caso dessa linhagem.

Diniz et al. (2004) cita valores de Yx/o de 0,0264 – 0,0510 g/mmol para a mesma

linhagem (P. putida IPT 046) cultivada em batelada utilizando glicose e frutose como fontes

de carbono, a diferentes concentrações de nitrogênio (400 – 3500 mg/L), corroborando os

valores obtidos, porém valores de mo não são citados.

Valores semelhantes de Yx/o são citados por Batista Neto (2004) para ensaios

operados de forma contínua para produção de ácido clavulânico por Streptomyces

clavuligerus ATCC 27064 (1,02 – 2,08 g/g variando com as condições do cultivo), porém os

valores de mo obtidos foram bem menores, variando entre 0,0343 e 0,0018 g/gh.

53

Nlim

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

YPH

A/C

(g/g

)

Plim

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

YPH

A/C

(g/g

)

N e Plim

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

YPH

A/C

g/g

%)

Figura 5.11: Fator de conversão de fonte de carbono em polímero (YPHA/C) calculado nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e não limitados em fonte de C.

54

Nlim

0

20

40

60

80

100

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)

% m

ol

C6 C8 C10 C12

Plim

0

20

40

60

80

100

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)

% m

ol

C6 C8 C10 C12

N e Plim

0

20

40

60

80

100

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)

% m

ol

C6 C8 C10 C12

Figura 5.12: Composição do polímero acumulado nas vazões específicas de alimentação (D) testadas

nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e não limitados em fonte de C.

55

Nlim

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)

Prod

(g/lh

)

Plim

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)

Prod

(g/lh

)

N e Plim

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)

Prod

(g/lh

)

Figura 5.13: Produtividade de PHA (Prod) calculada nas vazões específicas de alimentação (D) testadas nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e não limitados em fonte de C.

56

Valores da mesma ordem de grandeza de Yx/o e mo são apresentados por Taciro

(1992) para cultivo em batelada de Azospirilum brasilense sp 245 utilizando frutose como

fonte de carbono: Yx/o de 0,07 – 0,09 g/mmol e mo de 1,32 – 2,10 mmol/gh.

A Figura 5.15 ilustra os valores de velocidade específica de produção de CO2 (qCO2) e

o coeficiente respiratório (RQ), dados pela relação qCO2/qO2, correspondentes aos da Figura

5.14.

Se considerarmos que nos ensaios temos 2 fenômenos ocorrendo simultaneamente,

crescimento celular e acúmulo de polímero e, que o crescimento celular implica em maior

produção de CO2 do que o acúmulo de polímero, pois demanda maior energia e, portanto,

uma maior quantidade da fonte de carbono deve ser oxidada para suprir essa necessidade, o

comportamento de qCO2 e RQ (Figura 5.15) pode ser melhor compreendido quando observado

em conjunto com a Figura 5.10.

De modo geral, os valores de qCO2 foram crescentes com D, coerentes com o fato de

que o crescimento celular deve prevalecer sobre o acúmulo de polímero com o aumento de D,

sendo que na condição de limitação em N esse fato ocorreu de forma mais pronunciada até o

ponto de D = 0,33 h-1, ficando então constante. Se observarmos a Figura 5.10, para D ≥ 0,33

h-1, praticamente não se observa acúmulo de polímero, ou seja o fenômeno que predomina é o

crescimento celular, justificando o “patamar” existente. Quanto aos valores de RQ, o acúmulo

significativo de polímero (~40%) se observa para D = 0,05 h-1 cujo valor de RQ é maior. Já a

semelhança do restante dos valores pode ser atribuída ao baixo teor de polímero acumulado

nessa condição.

Na condição de limitação em P, o aumento de qCO2 com D não é tão pronunciado mas

na condição em que praticamente não se observa acúmulo de polímero (D = 0,49 h-1) atinge

valores da ordem de 16 mmol/g.h, valor este semelhante aos obtidos na condição de limitação

em N com baixo acúmulo de polímero. Para valores de D onde menores quantidades de

polímero foram acumuladas, os valores de RQ também estão próximos de 1, atingindo valores

maiores para Ds de 0,05 e 0,11 h-1 quando maiores quantidades de polímero foram

acumuladas (68 e 39 %).

Na condição de N e P limitados, os valores de RQ também ficaram próximos de 1,

porém observa-se um comportamento decrescente com o aumento de D (Figura 5.15),

coerente com o teor decrescente de polímero acumulado com D (Figura 5.10).

57

Nlim

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

q (m

mol

/gh)

qO2 = 32,46 D +3,45 r = 0,97

Yx/o = 0,96g/gmo = 0,11g/gh

Plim

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

q (m

mol

/gh)

qO2 = 23,12D + 4,09 r = 0,96

Yx/o = 1,39g/gmo = 0,13g/gh

N e Plim

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

q(m

mol

/g.h

)

qO2 = 20,27 D +3,72 r = 0,98

Yx/o = 1,53g/gmo = 0,12g/gh

Figura 5.14: Velocidades específicas de consumo de oxigênio (qO2) calculadas nas vazões específicas de alimentação (D), obtidas nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e, não limitados em fonte de carbono.

58

Nlim

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

q (m

mol

/g.h

)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

RQ

Plim

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

D (h-1)

q (m

mol

/g.h

)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

RQ

N e Plim

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)

q(m

mol

/gh)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

RQ

Figura 5.15: Velocidade específica de produção de CO2 (qCO2) [□ e ■] e coeficiente respiratório (RQ) [○ e ●] calculados nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim), limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e, não limitados em fonte de carbono.

59

5.3 Ensaios preliminares em alta densidade para produção de PHAMCL

Foram realizados cinco experimentos (MCLc 17, 18, 19, 20 e 22) com valores de D

em torno 0,05 h-1, buscando obter acúmulo de polímero em alta densidade celular. As

planilhas contendo os dados dos ensaios encontram-se no Anexo B.

O ensaio MCLc 17 teve sua composição de meio definido a partir do ensaio limitado

em P e N e não limitado em fonte de C em baixa densidade. A quantidade de fonte de C foi

calculada considerando as relações C/N e C/P obtidas para a condição de D = 0,05 h-1, onde

ocorreu maior acúmulo de polímero (C/N = 22 gC/gN e C/P = 112 gC/gP). Os outros

componentes do meio alimentado (Tabela 4.1 – Seção 4 - Material e Métodos) foram

multiplicados por 16,7 vezes. O ensaio iniciou com uma batelada com duração de 11h. A

vazão específica de alimentação empregada foi de 0,05 h-1 e o biorreator apresentava 10 g/L

de concentração de biomassa, concentração de glicose zero, porém ainda existia cerca de 10

g/L de frutose quando iniciada a alimentação. Após 26 horas de alimentação a concentração

de glicose atingiu 90,8 g/L, a de frutose 102,0 g/L e a concentração de biomassa começou a

cair lavando o sistema. A concentração de biomassa inferior a estimada e a frutose presentes

no biorreator, quando do início da alimentação do meio, resultaram em concentrações

crescentes de fonte de C, atingindo valores muito altos e inibindo o crescimento da biomassa

celular, desestabilizando o sistema.

O ensaio seguinte (MCLc 18) representado nas Figuras 5.16 a e b teve suas

concentrações de glicose e frutose no meio alimentado definido a partir do ensaio MCLc 17 e

as concentrações dos sais mantidas. Esse ensaio teve início com uma batelada com duração de

16h, atingiu X = 16,2 g/L com concentrações de fonte de C próximas de zero (G = 0,0 g/L e F

= 0,22 g/L). Na primeira tentativa de estabelecer um estado estacionário (D = 0,049 h-1), o

consumo de frutose foi menor que o esperado. A vazão de alimentação foi então diminuída

para 0,035 h-1, porém, tanto a glicose quanto a frutose acumularam, atingindo cerca de 64 g/l

de cada fonte de C após 173,5 h de ensaio, com presença de ácidos fórmico, acético e pirúvico

significativas (ácidos fórmico e acético ≥ 1 g/L e ácido propiônico ~ 0,7 g/L), lavando o

sistema. A alimentação foi então interrompida e um cultivo em batelada realizado até que as

concentrações de glicose e frutose se aproximassem de zero.

Um novo meio contendo menos fonte de carbono foi então alimentado (G = 52,72

g/L, F = 53,56 g/L) e um estado estacionário foi então estabelecido, com concentração de

biomassa média de 32,8 g/L, porém com cerca de 900 mg/L de nitrogênio e cerca de 10 g/L

de fonte de carbono residual As amostragens foram realizadas por cerca de 3,9 tempos de

60

residência no estado estacionário. Nesse ensaio não foi possível realizar a dosagem de fósforo,

pois o sobrenadante das amostras após centrifugação se mostrou bastante turvo,

provavelmente, devido a lise de células, interferindo na análise que é colorimétrica. A

presença de espuma no biorreator também foi observada, além do aspecto gelatinoso no

sobrenadante das amostras. O teor de polímero não passou de 15% da biomassa celular.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

0 50 100 150 200 250 300 350Tempo(h)

X (g

/L),

DO

0

15

30

45

60

75

PHA

(%)

X DOPHA

(a)

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 50 100 150 200 250 300 350Tempo (h)

G, F

(g/L

)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000N

e P

(mg/

L)

GFN P

(b)

Figura 5.16: Ensaio MCLc 18: (a) concentrações de biomassa (X), absorbância (DO) e teor de polímero (PHA); (b) concentrações residuais de glicose (G), frutose (F), nitrogênio (N) e fósforo (P).

61

O ensaio seguinte (MCLc 19) foi calculado para se obter uma concentração de

biomassa residual (Xr) de 18 g/L a partir do valor de Yx/n dos ensaios realizados em baixa

densidade. A concentração de fonte de C considerou a relação C/N = 26 gC/gN. A

composição do meio preparado foi a apresentada na Tabela 4.1 – Seção 4 - Material e

Métodos. A Figura 5.17 a e b ilustram os resultados desse ensaio.Uma batelada inicial com

duração de 19,5 h resultou em 15,5 g/L de biomassa celular, 0,24 g/L de glicose e consumo

total de frutose. Na primeira vazão específica de alimentação testada (0,05 h-1) foram

observadas concentrações crescentes das fontes de C e, D foi então diminuído para 0,04 h-1

(0,035 h-1). Observou-se um estado estacionário, amostrado por 3,4 tempos de residência,

porém ainda com altas concentrações de fonte de C (28,7 g/L de glicose e 48,5 g/L de

frutose), nitrogênio em concentrações muito baixas (6 mg/L) e fósforo em cerca de 22 mg/L.

Não foi observado concentrações significativas dos ácidos dosados (ácidos fórmico,

propiônico, acético e pirúvico). A concentração de biomassa obtida foi de cerca de 18 g/L e o

teor de polímero acumulado foi de 13%. Nesse ensaio a composição do gás de saída do

biorreator foi acompanhada e no estado estacionário obteve-se OUR = 43,8 mmol/L.h e CER

= 53,9 mmol/L.h ( Figura 5.18). Os valores calculados de qO2 e qCO2 foram 2,79 mmol/g.h e

3,44 mmol/g.h, respectivamente, sendo esses valores inferiores aos observados nos ensaios de

baixa densidade em qualquer das condições ensaiadas (Figuras 5.15 e 5.14).

O ensaio MCLc 20 teve sua forma de preparo modificada. Os componentes do meio

de cultura foram preparados e esterilizados num balão em separado das fontes de carbono.

Um terceira bomba peristáltica foi introduzida para a alimentação da glicose e frutose, além

de uma quarta bomba com água, de forma a compensar uma possível diminuição da vazão de

açúcar e, mesmo assim, manter a vazão específica de alimentação constante. A composição

dos meios alimentados está apresentada na Tabela 4.1– Seção 4 - Materiais e Métodos.

A batelada inicial teve a duração de 17,5 horas, obtendo ao seu final X = 19,5 g/L, G

= 0,00 g/L e F = 3,01 g/L. O primeiro valor de D (0,045 h-1) foi ensaiado por cerca de 77 h e

correspondeu a vazão de 29,8 ml/h da solução contendo as fontes de C (Bc) e 96,6 ml/h da

solução contendo os outros constituintes do meio de cultura (Bs). Nas primeiras 10 h de

alimentação alguns ajustes foram feitos na vazão de alimentação contendo glicose e frutose na

tentativa de adequar o fornecimento da fonte de carbono ao seu consumo (Tabela B.3 - Anexo

B) e em seguida as alimentações permaneceram constantes. O que se observou foram

concentrações de biomassa em cerca de 20 g/L, P entre 13 a 30 mg/L, traços de N (4 e 31

mg/L) e uma tendência de aumento de concentração de glicose e diminuição de frutose

(Figura 5.19 a e b). O teor de polímero permaneceu em cerca de 11 % da biomassa e dos

62

ácidos acompanhados, verificou-se a presença de ácido propiônico em concentrações

chegando a 1,30 g/L. O valores de Bc foi então diminuído para 28,5 ml/h e consequentemente

D para 0,044 h-1, o que resultou numa diminuição das concentrações de fonte de C, porém

pouco alterou a concentração de biomassa que continuou em cerca de 20-21 g/L.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

0 25 50 75 100 125 150 175 200Tempo(h)

X (g

/L),

DO

0

15

30

45

60

75

PHA

(%)

XDOPHA

(a)

0,0

15,0

30,0

45,0

60,0

0 25 50 75 100 125 150 175 200Tempo (h)

G, F

(g/L

)

0

500

1000

1500

2000

N e

P (m

g/L)

GFNP

(b)

Figura 5.17: Ensaio MCLc 19: (a) concentrações de biomassa (X), absorbância (DO) e teor de

polímero (PHA); (b) concentrações residuais de glicose (G), frutose (F), nitrogênio (N) e fósforo (P).

63

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150 200Tempo (h)

OUR (mmol/L.h)CER (mmol/L.h)

Figura 5.18: velocidades de consumo de oxigênio (OUR) e de produção de CO2 (CER) do ensaio

MCLc 19.

Um novo lote de meio foi então preparado, considerando Yx/n = 5,6 g/g, D =

0,045 h-1, Xr = 16,5 g/L, Fs = 0,096 ml/h e volume de meio no reator de 2,84 L. O biorreator

foi então alimentado com D = 0,046 h-1 com o novo meio (Bs = 96,6 ml/h e Bc = 28,5 ml/h).

Ajustes nos valores de Bs e Bc foram realizados com o intuíto de adequar o consumo de fonte

de C com a oferta e entre 190,8 e 226h de ensaio a concentração de glicose ficou em zero,

porém cerca de 22 g/L de frutose permaneceram, além de cerca de 27 mg/L de P. Dos ácidos

dosados, a presença do ácido propiônico em cerca de 1g/L foi observada.

Um terceiro lote de meio foi então preparado fornecendo mais fonte de N e P que no

lote anterior porém, com menor quantidade de P com relação a N. Esperava-se que o consumo

desse N a mais resultasse na diminuição da concentração de frutose no reator e que todo o P

no meio fosse consumido induzindo o acúmulo de polímero. A concentração de frutose

diminuiu de cerca de 22 g/L para 16 – 17 g/L mas o P não. A concentração de biomassa que

era de cerca de 20 g/L aumentou para cerca de 22 g/L, quase sem polímero ( < 10%). O ácido

propiônico continuou presente em cerca de 1,5 g/L e ácido fórmico em cerca de 0,7 g/L.

A Figura 5.20 ilustra os valores de OUR e CER obtidos nesse ensaio. Analisando o

conjunto dos valores apresentados podemos separá-lo segundo as alimentações empregadas

(linhas tracejadas da Figura 5.20). Apesar do não estabelecimento de estados estacionários, se

considerarmos os valores obtidos de respiração no intervalo de 50 – 144h para a primeira

alimentação, 150 – 226h para a segunda e 228 – 310h para a terceira, observamos valores

crescentes de OUR e CER. Valores da ordem de 45, 52 e 65 mmol/L.h de OUR e 56, 63 e 74

64

mmol/L.h de CER para os intervalos, respectivamente. Se considerarmos ainda, os valores de

concentração de biomassa e PHA nesses intervalos, os valores de qO2 e qCO2 calculados foram:

2,5, 2,8 e 3,2 mmol/g.h de qO2 e 3,2, 3,3 e 3,6 mmol/g.h de qCO2, respectivamente. Valores

estes crescentes, porém inferiores aos menores valores obtidos em baixa densidade que foram

de cerca de 5 mmol/L.h para qO2 e de 7,5 mmol/L.h para qCO2.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

0 50 100 150 200 250 300 350Tempo (h)

X (g

/L),

DO

0

15

30

45

60

75

PHA

(%)

X DOPHA

(a)

0,0

15,0

30,0

45,0

60,0

0 50 100 150 200 250 300 350Tempo (h)

G, F

(g/L

)

0

500

1000

1500

2000N

e P

(mg/

L)

GFN P

(b)



65

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150 200 250 300Tempo (h)



MCLc 20.

O ensaio MCLc 22 manteve a forma de alimentação do ensaio MCLc 20: alimentações

em separado, uma com glicose e frutose, outra com o restante dos componentes do meio e a

possibilidade de adicionar água para compensar uma possível diminuição da vazão de açúcar

e, mesmo assim, manter a vazão específica de alimentação constante. A composição dos

meios alimentados está apresentada na Tabela 4.1 – Seção 4 - Materiais e Métodos.

A batelada inicial teve a duração de 19,5 horas, obtendo ao seu final X = 16,5 g/L, G

= 0,25 g/L e F = 0,46 g/L.

Duas composições de meio de cultura (Tabela 4.1 – Seção 4 - Materiais e Métodos)

foram experimentadas nesse ensaio. Uma composição base foi fixada e duas concentrações

(2,30 g/L e 2,08 g/L) de KH2PO4 foram utilizadas, buscando limitar em P o cultivo. A Tabela

B.4 - Anexo B apresenta os valores dos parâmetros medidos ao longo do ensaio.

O primeiro valor de D ensaiado foi 0,054 h-1. Correspondia à vazão de 30,9 ml/h da

solução contendo as fontes de C (Bc) e 90,5 ml/h da solução contendo os outros constituintes

do meio de cultura (Bs) em um volume de meio no biorreator de 2,24 L. Do mesmo modo

que no ensaio MCLc 20, ajustes foram feitos na vazão de alimentação contendo glicose e

frutose na tentativa de adequar o fornecimento da fonte de carbono ao seu consumo. Os

valores de Bc e Bs foram mantidos entre as amostras 10 e 14 (cerca de 24h) e, dada a

tendência de aumento da fonte de C, Bc foi diminuído para 28,1 ml/h. A concentração de

fonte de C continuou aumentando e Bc foi novamente alterado (25 ml/h) e água alimentada

(5,7 ml/h) para manter D em 0,054 h-1. A glicose residual foi consumida mas cerca de 33 g de

frutose permaneceram. A bomba de água foi então desligada para que D diminuísse (0,052h-1)

66

e o tempo de residência fosse aumentado permitindo um maior consumo de fonte de C. Essa

modificação resultou num estado estacionário com X = 22,2 g/L, G = 2,52 g/L, F = 30,78 g/L,

N = 19 mg/L, p = 16 mg/L e PHA = 13,6 %, ou seja, ocorreu diminuição da frutose porém foi

compensada pelo surgimento de glicose. Os valores de OUR e CER medidos foram de 56,1

mmol/L.h e 64,4 mmol/L.h, respectivamente. Os valores de qO2 e qCO2 calculados (2,93

mmol/g.h e 3,36 mmol/g.h, respectivamente) foram próximos aos obtidos no ensaio MCLc 20

entre 50 e 144 h. Não foi observado concentrações significativas dos ácidos analisados.

Uma outra condição foi experimentada, alterou-se o volume de meio no biorreator

com o objetivo de aumentar D, mantendo a mesma relação entre fonte de C e os outros

nutrientes e assim obter dados comparativos com o estado estacionário obtido com essa

relação de nutrientes. O volume foi alterado para 2,37 L resultando num D = 0,049 h-1. A

concentração de biomassa caiu para cerca de 15 g/L e as concentrações de fonte de C

começaram a aumentar . A alimentação foi desligada e uma batelada realizada buscando

diminuir as concentrações de fonte de C e retomar o experimento.

Um novo lote de meio de cultura foi preparado mantendo as mesmas concentrações de

nutrientes com exceção da fonte de P, que foi diminuída.

O ensaio contínuo foi retomado na amostra 34 (240,5 h de ensaio). O valor de D

inicial foi de 0,052 h-1, Bc = 99,8 ml/h e Bs = 23,3 ml/h. Os resultados indicavam uma

diminuição de P no biorreator, glicose zerada, porém frutose continuava presente com cerca

de 18 g/L. Tentativas para que não sobrasse P no meio foram feitas (226,0 e 241,3 h do

ensaio) e um problema no controle de pH acabou desestabilizando o sistema. Nova batelada

foi realizada e o ensaio retomado na amostra 45 ( 412,5 h de ensaio) com concentrações de

fonte de C baixas (G = 1,14 g/L e F = 3,01 g/L), X = 18,5 g/L, N = 194 mg/L e P = 18 mg/L.

Acatando uma sugestão da banca de qualificação desse trabalho, ao fato de que não se

observava acúmulo significativo de polímero nas tentativas de alta densidade realizadas, o

experimento foi direcionado procurando aumentar D e realizando isso de forma gradual.

Valores de D de 0,052 h-1, 0,055 h-1 e 0,074 h-1 foram testados.

O que se observou foram valores crescentes de concentração de fonte de C e uma

tendência a diminuição da concentração de biomassa e polímero. Na condição de D = 0,074

h-1, o aparecimento de aglomerados foi observado com 3h de mudança das vazões para essa

condição, em 24 horas nessa condição o ensaio ficou totalmente floculado, impossibilitando

uma amostragem homogênea, com aumento das concentrações de fonte de C, N e P, e

diminuição do consumo de oxigênio (Figuras 5.21 b e 5.22).

67

Não foram observadas concentrações significativas dos ácidos dosados nesse ensaio,

com exceção das amostras 34 e 56, os valores máximos não ultrapassaram 0,30 g/L.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Tempo (h)

X (g

/L),

DO

0

15

30

45

60

75

PHA

(%)

XDOPHA

(a)

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Tempo (h)

G,F

(g/L

)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

N e

P (m

g/L)

GFNP

(b)



68

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Tempo (h)



MCLc 22.

A partir dos estados estacionários obtidos nos ensaios preliminares em alta densidade

foi construída a Tabela 5.2.

Tabela 5.2: Valores de concentração de biomassa (X), teor de polímero (PHA), fator de conversão de fonte de carbono em biomassa residual (Yxr/c), fator de conversão de nitrogênio em biomassa residual (Yxr/n), fator de conversão de fósforo em biomassa residual (Yxr/p), velocidade específica de consumo de oxigênio (qO2), velocidade específica de produção de CO2 (qCO2) para os ensaios preliminares em alta densidade celular.

Ensaio X

(g/L)

PHA

(%)

Yxr/c

(g/g)

Yxr/n

(g/g)

Yxr/p

(g/g)

MCLc 18 32,80 15,1 0,29 6,89 -

MCLc 19 18,02 12,8 0,23 7,58 36,8

MCLc 22 22,2 13,6 0,18 5,03 33,8

Ao comparar os valores dos fatores de conversão obtidos nos estados estacionários dos

ensaios MCLc 19 e 22 (Tabela 5.2) aos obtidos para limitação em N e P em baixa densidade

celular (Yxr/c = 0,11 g/g, Yxr/p = 43 g/g e Yxr/n = 7 g/g), com exceção do valor de Yxr/n do

ensaio MCLc 18, fica evidente a diferença entre os mesmos, indicando que para

concentrações de biomassa celular cerca de 10 vezes superiores ou mais, as correlações C/N

e C/P obtidas em baixa densidade celular para acúmulo de PHA não são aplicáveis.

No estado estacionário do ensaio MCLc 18 não ocorreu limitação em N (900 mg/L

presentes) e não foi realizada a determinação de P. Assim mesmo, supondo que tenha

ocorrido limitação em P, os valores dos fatores de conversão calculados (Tabela 5.2) também

69

são distintos quando comparados aos obtidos para limitação em P em baixa densidade (Yxr/c

= 0,08 g/g e Yxr/n = 5 g/g).

5.4 Avaliação de fluxos metabólicos na produção de PHAMCL

Procurando uma maior compreensão do metabolismo de síntese destes polímeros

buscou-se analisar os fluxos metabólicos envolvidos nas diferentes condições de cultivo

testadas. A análise partiu dos valores obtidos de fonte de carbono consumida (glicose e

frutose), biomassa celular, polímero produzido, O2 consumido e CO2 produzido nos ensaios.

Inicialmente, um modelo simplificado E1 foi proposto (Figura 5.23), procurando-se

fechar o balanço de carbono a partir das velocidades específicas dos parâmetros medidos.

Apesar da análise ainda considerar o microrganismo (P. putida IPT 046) como uma “caixa

preta”, as reações envolvidas nas possíveis vias metabólicas foram consideradas: vias de

Entner-Doudoroff (ED) e das Pentoses, o Ciclo de Krebs (CK) e a obtenção de NADPH via

isocitrato desidrogenase, além da via de biossíntese de ácidos graxos.

Segundo Gomez (2000), para que o metabolismo possa fluir sem problemas é

necessário um balanço adequado que permita que as moléculas geradas pelas vias catabólicas

sejam utilizadas nas vias anabólicas e, de forma similar, coenzimas fosforiladas ou reduzidas

durante o catabolismo sejam regeneradas durante o anabolismo. Assim, além do balanço de

carbono considerou-se também o balanço de coenzimas no estudo em questão.

Na proposição do modelo E1 considerou-se as seguintes hipóteses: i) a partir da fonte

de carbono fornecida (glicose e frutose) há formação somente de células, PHA e CO2; ii) o

crescimento celular ocorre com um valor de Yxr/c determinado e supre não só carbono mas

coenzimas reduzidas e energia também; iii) a estimativa de CO2 e O2 proveniente/consumido

do processo de síntese de biomassa celular sem polímero (Xr) pode ser feita utilizando as

relações obtidas em ensaios nos quais não se observa acúmulo de polímero. As correlações

estabelecidas para o modelo E1 estão apresentadas na Tabela 5.3.

70

NADH

GLICOSE FRUTOSE

F7 NADP+ F8 NADPH

CO2 CEL CélulasF1 NAD+

F6 F2 CO2 O2

Acetil-CoA F9 NADH F11 NAD+

F3 H2O

O2

F5F10 FADH2 F12 FAD

F4H2O

Biossíntese de Ác. Graxos O2 F13 H2O

F14 CO2

C D E F3HHx 3HO 3HD 3HdD RQ F15

TCA

Figura 5.23: Esquema representativo do modelo (E1) utilizado para análise de fluxos metabólicos no cultivo de P. putida IPT 046.

O modelo E1 foi então simulado a partir das velocidades específicas (mmol/gcel.h) de

consumo de glicose, frutose, formação de polímero e assumindo valores fixos de Yxr/c (0,40

e 0,45 g/g) para estimar o fluxo de carbono para síntese de Xr (CEL). Diniz et al. (2004)

apresentam valores de Yxr/c nessa faixa para o crescimento dessa mesma linhagem. A análise

dos resultados indicaram que assumir um valor único de Yxr/c, assim como estimar CO2 e O2

proveniente/consumido do processo de síntese de biomassa celular livre de polímero (O2CEL e

CO2CEL) a partir dos valores obtidos nos ensaios nos quais não se observava acúmulo de

polímero, eram hipóteses que deveriam ser descartadas pois resultavam em valores muito

discrepantes dos medidos de velocidade de consumo de oxigênio (qO2) e produção de gás

carbônico (qCO2), além de não possibilitar o balanço de coenzimas.

Partiu-se então para verificar se com os valores de velocidade específica de consumo

das fontes de carbono, de produção de polímero medida, qO2 e qCO2 medidos na condição

ensaiada era possível fechar o balanço de carbono. O fluxo de carbono para fazer células

(CEL) e a quantidade de CO2 resultante desse fato, foi calculado a partir dos valores de

velocidades conhecidos, procurando satisfazer o balanço de coenzimas como propunha o

modelo E1. Das 35 condições testadas, somente 3 não fecharam o balanço com relação a

parcela de CO2CEL, no ensaio MCLc5 (limitado em C e N e P simultâneo) a vazão específica

de 0,50 h-1 e no ensaio MCLc7 (limitado em C e P) as vazões específicas de 0,05 e 0,45 h-1.

A Figura 5.24 e 5.25 foram construídas a partir dos valores calculados dos fluxos

obtidos, expressos em mmol C/g.h. Procurando visualizar melhor qual parcela de carbono

71

consumida foi destinada a fazer células (CEL), a polímero (F4) e a CO2 (F14), esses valores

foram representados como uma fração do fluxo de glicose somado ao de frutose.

Tabela 5.3: Correlações utilizadas no modelo E1 para análise de fluxo metabólico.

Nos ensaios limitados na fonte de carbono (Figura 5.24), observa-se que na menor

vazão específica testada (D = 0,05 h-1), independente do tipo de limitação imposta, metade do

carbono vai para síntese de biomassa celular e a outra metade para CO2. Exceto pelo ponto

correspondente a vazão específica de 0,11 h-1 na condição de limitação em N e P

simultaneamente, o comportamento é semelhante para os três tipos de limitação: a fração de

carbono destinada a fazer células aumenta com D até atingir valores pouco superiores a

0,6 (60 % do C consumido) e como praticamente não se observa formação de polímero, a

fração de C para CO2 (F14) apresenta comportamento inverso, aproximando de valores

ligeiramente inferiores a 40% do C consumido. Também nos ensaios não limitados na fonte

de C (Figura 5.25), observa-se uma tendência de crescimento da fração de C para fazer células

com D, atingindo valores semelhantes (próximos a 60 %) para valores de D acima de 0,2 h-1,

com valores muito baixos para C direcionado para formação de polímero. Já para os valores

de D menores (≤ 0,2 h-1), independente do tipo de limitação, a fração de C destinada a CO2

aumenta atingindo cerca de 60% para as menores vazões testadas (0,05-0,06 h-1). A fração de

C destinada a fazer polímero aumenta com a diminuição de D, atingindo para D igual a 0,06

h-1 cerca de 30% na condição de N e P lim e 17,5% para N lim e, para D igual a 0,05 h-1 o

72

valor de 21,5% para P lim, correspondentemente, a fração de C destinada a fazer células foi

de 10%, 20,5% e 17,5%, respectivamente.

Na busca por um melhor entendimento dos fluxos e vias metabólicas envolvidas no

cultivo de P. putida IPT 046, um segundo modelo (E2) mais detalhado foi proposto. Foram

consideradas as vias de Entner-Doudoroff (ED), Pentoses e o Ciclo de Krebs, seguindo

metodologia descrita por Cocaign (1992) e empregada por Piccoli (1995) para Alcaligenes

eutrophus. O modelo considera a quantidade necessária dos principais precursores para a

formação de 1 grama de biomassa celular, baseado nos dados citados por Neidhardt et al.

(1990) para Escherichia coli.

A utilização da via de Entner-Doudoroff no metabolismo de Pseudomonas foi

amplamente estudada por Lessie e Phibbs (1984), Phibbs (1988) e descrita por Conway

(1992). Segundo esse último autor, existem grandes evidências que a via de ED é operada de

forma cíclica, envolvendo reciclagem de fosfatotrioses por enzimas gliconeogênicas, o

gliceraldeído-3-fosfato formado pela ação da enzima 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogliconato

aldolase é aparentemente reciclado a 6-fosfogliconato por enzimas gliconeogênicas.

Temple et al. (1998) descrevem que P. aeruginosa metaboliza açúcares com três e seis

carbonos pela via de ED de forma cíclica preferencialmente à via de Embden-Meyerhoff-

Parnas (EMP), assim, gliceraldeído-3-fosfato é preferencialmente reciclado ao invés de

continuar até piruvato pelas reações subseqüentes da via EMP. Succinato e outros

intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos são utilizados antes da glicose e esse

microrganismo não possui a via oxidativa de hexose monofosfato. Apesar de possuir 1-

fosfofrutoquinase indutiva compatível com o catabolismo de frutose pela via EMP, muitas

espécies de Pseudomonas utilizam ED como rota principal no catabolismo de frutose.

73

N lim

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

D (h-1)

F4

F14

CEL

P lim

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

D (h-1)

F4

F14

CEL

N e P lim

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

D (h-1)

F4

F14

CEL

Figura 5.24: Fração de carbono destinado a fazer células (CEL), polímero (F4) e CO2 (F14) a partir de glicose e frutose consumidos nos ensaios limitados em fonte de carbono.

74

N lim

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

D (h-1)

F4

F14

CEL

P lim

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

D (h-1)

F4

F14

CEL

N e P lim

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

D (h-1)

F4

F14

CEL

Figura 5.25: Fração de carbono destinado a fazer células (CEL), polímero (F4) e CO2 (F14) a partir

de glicose e frutose consumidos nos ensaios não limitados em fonte de carbono.

75

O modelo E2 foi então proposto, considerando a via de ED operando de forma cíclica

e gliceraldeído-3-fosfato preferencialmente reciclado ao invés de continuar até piruvato pelas

reações subsequentes da via EMP, além da ausência da via oxidativa de hexose monofosfato.

A figura 5.26 ilustra esse modelo proposto. A simulação desse modelo (E2) resultou em

valores distintos dos medidos experimentalmente de qO2 e qCO2.

Figura 5.26: Esquema representativo do modelo E2 proposto para análise de fluxos no cultivo de P.

putida IPT 046.

Modificações nesse modelo (E2) foram realizadas considerando o Ciclo do Glioxilato

e a via oxidativa de hexoses monofosfato, dado que as afirmações de Temple et al. (1998)

eram para P. aeruginosa, e a linhagem empregada nos ensaios é uma P. putida. A

AcCoA

PIR

Cit

Isocit

KG2

SucCoA

Suc

Mal

Fum

OAA

NADP+

NADPH

CoASH

NAD+

NADH

ADP +Pi

ATP

FAD

FADH2

CoASH

NAD+

NADH

CO2

CO2

CO2

NAD+

NADH

CoASH

NADP+

NADPH

CO2

ATP

CO2

ADP +Pi

3HHx

3HO

3HD

3HDd

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

PEPATP

ADP +Pi

PG3

PG2

ADP +Pi

ATP

BPG13NAD+

NADH

G3PKDPG2

GLICOSE

G6P

GL6P

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

NADP+

NADPH

PG6

FRUTOSE

F6P

E4P

S7P

X5P

Rb5P

F16P

G3P

LEGENDA

G6P glicose-6-fosfato

F6P frutose-6-fosfato

F16P frutose-1-6-difosfato

GL6P glicono-g-lactona-3-fosfato

PG6 6-fosfogliconato

KDPG2 2-ceto-desoxi-6-fosfogliconato

G3P gliceraldeído-3-fosfato

E4P eritrose-4-fosfato

S7P sedoheptolose-7-fosfato

Rb5P ribose-5-fosfato

X5P xilulose-5-fosfato

BPG13 1,3-bifosfoglicerato

PG3 3-fosfoglicerato


PEP fosfoenolpiruvato

PIR piruvato

AcCoA acetil-CoA

Cit citrato

Isocit isocitrato

KG2 a-cetoglutarato

SucCoA succinil-CoA

Suc succinato

Fum fumarato

Mal malato

OAA oxaloacetato

3HHx 3-hidroxihexanoato

3HO 3-hidroxioctanoato

3HD 3-hidroxidecanoato

3HDd 3-hidroxidodecenoato

76

possibilidade de que as quantidades de precursores necessários para a formação de biomassa

celular era a mesma de E. coli foi mantida, resultando em um novo modelo (E3).

A versão 4.9.3 double do programa Metatool foi utilizado para simular o modelo

proposto (E3) ilustrado na Figura 5.27. O Anexo C mostra arquivos de entrada e de saída para

as simulações realizadas.

Foram simuladas as 3 condições de acúmulo de PHA estudadas: limitação em N,

limitação em P e limitação em N e P simultâneas, todas na condição de maior acúmulo de

polímero observado (menores Ds testados). Para cada condição, um conjunto de relações

elementares foi gerado e dentre essas, as que resultavam em acúmulo de polímero com um

balanço energético favorável (formação de ATP) foram selecionadas e calculados os fatores

de conversão Yx/c e YPHA/C, além do consumo de oxigênio por biomassa formada (1/Yxr/o) e a

quantidade de CO2 produzido por biomassa formada (1/Yxr/co2). As tabelas C.1, C.3 e C.4 do

ANEXO C apresentam os valores desses parâmetros calculados que foram comparados com

os obtidos a partir dos respectivos ensaios.

Para a condição de limitação em N, os valores obtidos experimentalmente (Tabela

5.3) foram semelhantes, com exceção do valor de 1/YX/O2 que foi de 0,10 molO2/gcel e o

menor valor correspondente obtido foi de 0,13 molO2/gcel. A partir da relação

correspondente, foi gerada a Figura 5.28a (relação elementar 9 e 61) e Figura 5.28b (relação

elementar 69) que apresentam os fluxos na rede metabólica que melhor representariam os

dados experimentais obtidos.

Uma vez que glicose-6-fosfato (G6P) pode ser isomerizada em frutose-6-fosfato

(F6P), do ponto de vista do modelo metabólico relações elementares idênticas são geradas

considerando o consumo de frutose ou glicose. Essas mesmas relações elementares também

poderiam ser aplicadas considerando o consumo de glicose e frutose em diferentes

proporções.

Na Figura 5.28a e b o modelo propõe que glicose ou frutose devem ser consumidas

utilizando a via EMP ao invés de ED, não ocorrendo fluxo entre 6-fosfogliconato e 2-ceto-3-

desoxi-6-fosfogliconato (ED4 = 0) e nem de 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogliconato para piruvato

(ED5 = 0), sendo o piruvato formado a partir de fosfoenolpiruvato (ED10). Acetil-CoA é

então produzido a partir do piruvato e parte dele é metabolizado no Ciclo de Krebs e a outra é

direcionada para a biossíntese de polímero. A parte que é metabolizada no ciclo de Krebs

também leva a formação de NADPH pela ação da isocitrato desidrogenase e gera CO2. A via

do glioxilato não é utilizada para repor intermediários do ciclo de Krebs. O modelo propõe

ainda que a via oxidativa de hexose monofosfato (VP5) ocorra para gerar NADPH e CO2 .

77

Figura 5.27: Esquema representativo do modelo E3 proposto para análise de fluxos no cultivo de P. putida IPT 046.

O próximo passo foi selecionar as relações elementares que permitiriam obter valores

de Yx/c e YPHA/C maiores que aqueles obtidos experimentalmente (0,24g/g e 0,10 g/g,

respectivamente). Ou seja, de que forma os fluxos metabólicos deveriam ser alterados para

AcCoA

PIR

Cit

Isocit

KG2

SucCoA

Suc

Mal

Fum

OAA

GLXAcCoA

NADP+

NADPH

CoASH

NAD+

NADH

ADP +Pi

ATP

FAD

FADH2

CoASH

NAD+

NADH

CO2

CO2

CO2CoASH

NAD+

NADH

CoASH

CO2

ATP

CO2

ADP +Pi

3HHx

3HO

3HD

3HDd

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

PEP

ATP

ADP +Pi

PG3

PG2

ADP +Pi

ATP

BPG13NAD+

NADH

G3PKDPG2

GLICOSE

G6P

GL6P

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

NAD+

NADH

PG6

FRUTOSE

F6P

E4P

S7PX5PRb5P

F16P

ADP +PiATP

DHP

Rbl5PCO2

NADP+

NADPH

LEGENDA

G6P glicose-6-fosfato

F6P frutose-6-fosfato

F16P frutose-1-6-difosfato

GL6P glicono-g-lactona-3-fosfato

PG6 6-fosfogliconato

KDPG2 2-ceto-desoxi-6-fosfogliconato

G3P gliceraldeído-3-fosfato

E4P eritrose-4-fosfato

S7P sedoheptolose-7-fosfato

Rb5P ribose-5-fosfato

Rbl5P ribulose-5-fosfato

X5P xilulose-5-fosfato

DHP dihidroxiacetona

BPG13 1,3-bifosfoglicerato



PEP fosfoenolpiruvato

PIR piruvato

AcCoA acetil-CoA

Cit citrato

Isocit isocitrato

KG2 a-cetoglutarato

SucCoA succinil-CoA

Suc succinato

Fum fumarato

Mal malato

OAA oxaloacetato

GLX glioxilato

3HHx 3-hidroxihexanoato

3HO 3-hidroxioctanoato

3HD 3-hidroxidecanoato

3HDd 3-hidroxidodecenoato

78

resultar em um melhor desempenho do processo (maiores fatores de conversão de fonte de C

em células e polímero). O maior valor obtido para Yx/c foi de 0,50 g/g e YPHA/C = 0,20 g/g

(relação elementar 29 ou 59 e 15 ou 75) e os fluxos na rede metabólica para atingir esses

fatores de conversão estão representados na Figura 5.29 a e b.

O modelo propõe que a partir de frutose ou glicose a Via de ED seja utilizada de

forma cíclica, ocorrendo a formação de piruvato a partir de 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogliconato e

não de fosfoenolpiruvato (ED10 = 0), gliceraldeído-3-fosfato seja transformado em

fosfoenolpiruvato somente para suprir precursores utilizados para fazer célula (Xr). A via

oxidativa de hexose monofosfato (VP5) continuaria ocorrendo gerando NADPH e CO2,

porém com fluxo bastante reduzido. Apenas algumas reações do ciclo de Krebs estariam

ocorrendo e somente para suprir intermediários metabólicos necessários à síntese de biomassa

residual (Xr). A reposição de oxaloacetato ocorreria via piruvato carboxilase. Assim, os

fatores de conversão seriam aumentados, pois NADPH seria gerado essencialmente na via de

ED evitando as descarboxilações (que resultam em perda de C) que ocorrem na via das

hexoses monofosfato e no ciclo de Krebs. Um outro aspecto importante a ser analisado é se a

quantidade de ATP gerado seria suficiente para satisfazer as necessidades de manutenção das

células na reação elementar proposta que garantiria maior rendimento. Segundo Russel e

Cook (1995), a demanda de energia para manutenção corresponde à quantidade de ATP

necessária para suprir as demandas energéticas de funções não diretamente relacionadas ao

crescimento. A Tabela 5.4 apresenta os valores de ATP gerados por biomassa residual

formada (YATP/Xr) e que deveria satisfazer as necessidades energéticas de manutenção para as

condições estudadas. Considerando o valor de 0,045 mmolATP/mg de células, citado por

Russel e Cook (1995), para Sreptococcus bovis em cultivo contínuo como um valor de

referência, a quantidade de ATP obtida na relação elementar que se ajusta aos dados

experimentais é cerca de 20 vezes a necessária. Por outro lado, quando se analisa as relações

elementares que permitem um melhor desempenho do processo para um acúmulo de 40% de

polímero, teríamos um valor de 0,033 – 0,036 molATP/gcel. Esse valor é ligeiramente inferior

ao estimado como necessário sugerindo que essa relação elementar possa não acontecer

biologicamente.

A análise acima foi realizada para o teor de acúmulo obtido experimentalmente (PHA

= 40%), o próximo passo consistiu em analisar as relações elementares geradas para um

acúmulo de polímero de 70%, ou seja, semelhante aos valores obtidos nas outras condições de

limitação estudadas. O conjunto gerado das relações elementares está representado no Anexo

C e os valores dos parâmetros calculados na Tabela C.2 do mesmo anexo. Escolhendo a

79

melhor condição de conversão de fonte de C em biomassa celular e PHA (Yx/c = 0,42 g/g e

YPHA/C = 0,29 g/g), o mesmo conjunto de vias metabólicas, que resultaram no melhor

desempenho para um acúmulo de PHA de 40%, seria utilizado pela bactéria. Esse fato

evidencia que no caso dessa bactéria (P. putida IPT 046) a melhor condição para produzir

PHA implicaria em gerar NADPH, que é consumido para fazer polímero, utilizando a Via

ED de forma cíclica e direcionando o fluxo de gliceraldeído-3-fosfato para a formação de

fosfoenolpiruvato somente para suprir precursores para síntese de biomassa residual (Xr),

uma vez que a produção de NADPH pelo Ciclo de Krebs ou pela via das hexoses monofosfato

implicariam em perdas da fonte de C na forma de CO2.

A quantidade de ATP gerados nessas relações elementares estão apresentadas na

Tabela 5.4. O valor obtido foi de 0,033 – 0,034 molATP/gcel, portanto teríamos um balanço

energético desfavorável também nesse caso, lembrando que o valor utilizado como referência

foi levantado para um microrganismo diferente do utilizado nos experimentos.

Tanto para a condição de limitação em P como em P e N (Tabela 5.4), os valores

obtidos da simulação (Tabelas C.3 e C.4 – ANEXO C) não foram os esperados, ou seja, o

modelo proposto não se ajusta. Nos dois casos, quando os valores de Yx/c e YPHA/C são

semelhantes aos experimentais, os de 1/Yxr/o e 1/Yxr/co2 diferem.

No caso da limitação somente em P, a não adequação do modelo fica evidenciada pelo

fato de que nenhum dos valores calculados de 1/Yxr/o e 1/Yxr/co2 sequer se assemelham aos

obtidos experimentalmente (Tabela C.3 – ANEXO C).

Considerando o modelo metabólico testado (E3), a não adequação do mesmo nos

casos de limitação em P e em N e P, talvez possa ser atribuída a composição da biomassa

celular que foi assumida como igual a de E. coli citada por Neidhardt et al. (1990). Fonseca

(2007) apresenta composições celulares de K. marxianus para diferentes formas de cultivo,

mostrando que a sua composição em proteína, carboidratos, RNA e DNA variam

significativamente dependendo do D utilizado. Valores de proteína variando entre 36 a 72%

(p/p), carboidratos de 26,5 a 51,1 % (p/p), ou sejam, valores 2 vezes maiores dependendo da

condição experimentada. Se considerarmos ainda que nos dois casos de não ajuste de

modelo, P foi o ou um dos elementos limitantes e que isso também deve resultar em

composição de biomassa celular distinta, essa hipótese parece mais razoável ainda. Uma outra

consideração que pode ser realizada, e vai nessa mesma direção, diz respeito ao nível de

oxidação da biomassa. Se observarmos os valores de Yx/o obtidos (Figura 5.14) e as frações

de carbono consumido que resultou em CO2 (Figura 5.25) é possível relacionar com a

composição da biomassa produzida. Nas três condições avaliadas foram observadas as

80

mesmas quantidades de CO2 gerado a partir da fonte de carbono consumida (60%). Um maior

consumo de oxigênio para uma determinada quantidade de biomassa produzida, implica em

mais coenzimas sendo reduzidas, ou seja, uma maior oxidação dos componentes da biomassa.

Assim, podemos afirmar que o nível de oxidação da biomassa não foi o mesmo nas situações

avaliadas, sendo mais próximos no caso da limitação em P e em N e P (valores de Yx/o mais

parecidos), porém diferente do caso de limitação em N, sugerindo diferenças na composição

da biomassa nesses casos.

81

Tabela 5.4: Relações elementares geradas pelo programa Metatool para a condição de limitação em N, e os correspondentes valores de fator de conversão de

fonte de carbono em biomassa (Yx/c), fator de conversão de fonte de carbono em polímero (YPHA/C), quantidade de oxigênio consumido por biomassa residual formada (1/YXr/O2), quantidade de CO2 produzido por biomassa residual formada (1/YXr/CO2) e quantidade de ATP formado por biomassa residual formada (YATP/Xr).

Relações Elementares D (h-1)

YX/C (g/g)

YPHA/C (g/g)

1/YXr/O2 (mol O2/gcel)

1/YXr/CO2 (mol CO2/gcel)

YATP/Xr (molATP/g cel)

Limitação N (PHA = 40% )

Experimental

9 e 61: 9.30 F(G) + 210.20 ADP + 64.46 O = 210.20 ATP + 35.79 CO2 + 64.46 H2O + 1 XT

69: 1 G + 19.75 F + 469,04 ADP + 143,84 O = 469,04 ATP + 79,85 CO2 + 143,84 H2O + 2,23 XT



Limitação N (PHA = 70% )

15 e 75: 3,10 F(G) + 8,05 ADP + 5,46 O = 8,05 ATP + 6,08 CO2 + 5,46 H2O + 1 XT

29 e 89: 3,10 F(G) + 8,27 ADP + 5,50 O = 8.27 ATP + 6,10 CO2 + 5,50 H2O + 1 XT

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05 0,05

0,24

0,24

0,24

0,50

0,50

0,42 0,42

0,095

0,098

0,098

0,20

0,20

0,29 0,29

0,098

0,131

0,131

0,015

0,015

0,039 0,039

0,146

0,146

0,146

0,029

0,029

0,087 0,087

-

0,856

0,856

0,036

0,033

0,033 0,034

Limitação P

Experimental

0,06

0,21

0,129

0,095

0,199

-

Limitação P e N

Experimental

0,05

0,06

0,27

0,35

0,19

0,20

0,097

0,092

0,153

0,127

-

-

82

Figura 5.28a: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma de indução de

acúmulo de 40% PHA. Relações elementares 9 e 61.

PEP fosfoenolpiruvatoPIR piruvatoAcCoA acetil-CoACit citratoIsocit isocitratoKG2 α-cetoglutaratoSucCoA succinil-CoASuc succinatoFum fumaratoMal malatoOAA oxaloacetatoGLX glioxilato3HHx 3-hidroxihexanoato3HO 3-hidroxioctanoato3HD 3-hidroxidecanoato3HDd 3-hidroxidodecenoato

LEGENDA

G6P glicose-6-fosfato F6P frutose-6-fosfatoF16P frutose-1-6-difosfatoGL6P glicono-g-lactona-3-fosfatoPG6 6-fosfogliconatoKDPG2 2-ceto-desoxi-6-fosfogliconatoG3P gliceraldeído-3-fosfatoE4P eritrose-4-fosfatoS7P sedoheptolose-7-fosfatoRb5P ribose-5-fosfatoRbl5P ribulose-5-fosfatoX5P xilulose-5-fosfatoDHP dihidroxiacetonaBPG13 1,3-bifosfogliceratoPG3 3-fosfogliceratoPG2 2-fosfoglicerato

AcCoA

PIR

Cit

Isocit

KG2

SucCoA

Suc

Mal

Fum

OAA

GLX

AcCoA

NADP+

NADPH

CoASH

NAD+

NADH

ADP +Pi

ATP

FAD

FADH2

CoASH

NAD+

NADH

CO2

CO2

CO2CoASH

NAD+

NADH

CoASH

CO2

ATP

CO2

ADP +Pi

3HHx

3HO

3HD

3HDd

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

PEP

ATP

ADP +Pi

PG3

PG2

ADP +Pi

ATP

BPG13NAD+

NADH

G3PKDPG2

GLICOSE

G6P

GL6P

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

NAD+

NADH

PG6

FRUTOSE

F6P

E4PS7PX5P

Rb5P

F16P

ADP +PiATP

DHP

Rbl5PCO2

NADP+

NADPH

P3HHx = 0,244

P3HO = 1,792

P3HD = 5,701

P3HDd = 0,407

PHAMCL = 0,081PHA

Xr

XTBIOTOT = 8,14E-03

BIOMASSA = 2,00E-03

VP14 = 3,650

AD1 = 5,735

ED10 = 141,005

ED11 = 129,601

CGLX1 = 0,000

CK1 = 83,253 CK2 =

83,253

CK5 = 81,094

CK4 = 81,094

CK3 = 83,253

CK6 = 81,094

CK7 = 81,094

CK8 = 81,094

CGLX2 = 0,000

AD2 = 0,000

ED9 = 142,044

ED8 = 142,044

ED7 = 145,038

ED6 = 145,038ED5 = 0,000

ED4 = 0,000

ED3 = 3,240

ED2 = 3,240

ED1 = 0,000 VP2 = 75,718

VP13 = -72,648

VP12 = -72,648

VP11 = -72,648

VP8 =0,722

VP9 = 0,72

VP10 = 0,000

VP5 = 3,240

VP7 = 0722

VP6 = 2,517

FADH2

FAD

OXFAD = 81,094

OXNAD = 443,925

NADH

NAD

H2O

O2

H2O

O2

CO2

291,453

83

Figura 5.28b: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma de indução

de acúmulo de 40% PHA. Relação elementar 69.

AcCoA

PIR

Cit

Isocit

KG2

SucCoA

Suc

Mal

Fum

OAA

GLX

AcCoA

NADP+

NADPH

CoASH

NAD+

NADH

ADP +Pi

ATP

FAD

FADH2

CoASH

NAD+

NADH

CO2

CO2

CO2CoASH

NAD+

NADH

CoASH

CO2

ATP

CO2

ADP +Pi

3HHx

3HO

3HD

3HDd

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

PEP

ATP

ADP +Pi

PG3

PG2

ADP +Pi

ATP

BPG13NAD+

NADH

G3PKDPG2

GLICOSE

G6P

GL6P

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

NAD+

NADH

PG6

FRUTOSE

F6P

E4PS7PX5P

Rb5P

F16P

ADP +PiATP

DHP

Rbl5PCO2

NADP+

NADPH

P3HHx = 0,070

P3HO = 0,516

P3HD = 1,641

P3HDd = 0,117

PHAMCL = 0,023PHA

Xr

XTBIOTOT = 2,34E-03

BIOMASSA = 5,76E-04

VP14 = 0,000

AD1 = 1,651

ED10 = 40,589

ED11 = 37,306

CGLX1 = 0,000

CK1 = 23,965

CK2 = 23,965

CK5 = 23,343

CK4 = 23,343

CK3 = 23,965

CK6 = 23,343

CK7 = 23,343

CK8 = 23,343

CGLX2 = 0,000

AD2 = 0,000

ED9 = 40,888

ED8 = 40,888

ED7 = 41,750

ED6 = 41,750ED5 = 0,000

ED4 = 0,000

ED3 = 0,933

ED2 = 0,933

ED1 = 1,051 VP2 = 20,745

VP13 = -20,912

VP12 = -20,912

VP11 = -20,912

VP8 = 0,208

VP9 = 0,21

VP10 = 0,000

VP5 = 0,933

VP7 = 0,208

VP6 = 0,725

FADH2

FAD

OXFAD = 23,343

OXNAD = 127,786

NADH

NAD

H2O

O2

H2O

O2

CO2

83,896


LEGENDA


84



AcCoA

PIR

Cit

Isocit

KG2

SucCoA

Suc

Mal

Fum

OAA

GLX

AcCoA

NADP+

NADPH

CoASH

NAD+

NADH

ADP +Pi

ATP

FAD

FADH2

CoASH

NAD+

NADH

CO2

CO2

CO2CoASH

NAD+

NADH

CoASH

CO2

ATP

CO2

ADP +Pi

3HHx

3HO

3HD

3HDd

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

PEP

ATP

ADP +Pi

PG3

PG2

ADP +Pi

ATP

BPG13NAD+

NADH

G3PKDPG2

GLICOSE

G6P

GL6P

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

NAD+

NADH

PG6

FRUTOSE

F6P

E4PS7PX5P

Rb5P

F16P

ADP +PiATP

DHP

Rbl5PCO2

NADP+

NADPH

P3HHx = 0,066

P3HO = 0,049

P3HD = 0,154

P3HDd = 0,011

PHAMCL = 2,20E-3PHA

Xr

XTBIOTOT = 2,20E-04

BIOMASSA = 5,42E-05

VP14 = 2,008

AD1 = 0,155

ED10 = 0,000

ED11 = 1,313

CGLX1 = 0,000

CK1 = 0,585

CK2 = 0,585

CK5 = 0,000

CK4 = 0,000

CK3 = 0,585

CK6 = 0,000

CK7 = 0,000

CK8 = 0,000

CGLX2 = 0,000

AD2 = 0,000

ED9 = 0,028

ED8 = 0,028

ED7 = 0,109

ED6 = 0,109ED5 = 1,622

ED4 = 1,622

ED3 = 1,997

ED2 = 1,997

ED1 = 0,000 VP2 = 1,000

VP13 = 0,801

VP12 = 0,801

VP11 = 0,801

VP8 = 0,115

VP9 = 0,115

VP10 = 0,096

VP5 = 0,375

VP7 = 0,211

VP6 = 0,164

FADH2

FAD

OXFAD = 0,000

OXNAD = 1,615

NADH

NAD

H2O

O2

H2O

O2

CO2

2,118


LEGENDA


85


de acúmulo de 40% PHA. Relações elementares 15 e 75.

AcCoA

PIR

Cit

Isocit

KG2

SucCoA

Suc

Mal

Fum

OAA

GLX

AcCoA

NADP+

NADPH

CoASH

NAD+

NADH

ADP +Pi

ATP

FAD

FADH2

CoASH

NAD+

NADH

CO2

CO2

CO2CoASH

NAD+

NADH

CoASH

CO2

ATP

CO2

ADP +Pi

3HHx

3HO

3HD

3HDd

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

PEP

ATP

ADP +Pi

PG3

PG2

ADP +Pi

ATP

BPG13NAD+

NADH

G3PKDPG2

GLICOSE

G6P

GL6P

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

NAD+

NADH

PG6

FRUTOSE

F6P

E4PS7PX5P

Rb5P

F16P

ADP +PiATP

DHP

Rbl5PCO2

NADP+

NADPH

P3HHx = 0,007

P3HO = 0,049

P3HD = 0,155

P3HDd = 0,011

PHAMCL = 0,002PHA

Xr

XTBIOTOT = 2,21E-04

BIOMASSA = 5,43E-05

VP14 = 2,026

AD1 = 0,184

ED10 = 0,000

ED11 = 1,316

CGLX1 = 0,000

CK1 = 0,059

CK2 = 0,059

CK5 = 0,000

CK4 = 0,000

CK3 = 0,059

CK6 = 0,000

CK7 = 0,000

CK8 = 0,000

CGLX2 = 0,000

AD2 = 0,028

ED9 = 0,000

ED8 = 0,000

ED7 = 0,081

ED6 = 0,081ED5 = 1,654

ED4 = 1,654

ED3 = 2,015

ED2 = 2,015

ED1 = 0,000 VP2 = 1,000

VP13 = 0,829

VP12 = 0,829

VP11 = 0,829

VP8 = 0,111

VP9 = 0,111

VP10 = 0,091

VP5 = 0,361

VP7 = 0,202

VP6 = 0,159

FADH2

FAD

OXFAD = 0,000

OXNAD = 1,590

NADH

NAD

H2O

O2

H2O

O2

CO2

1,581


LEGENDA


86



AcCoA

PIR

Cit

Isocit

KG2

SucCoA

Suc

Mal

Fum

OAA

GLX

AcCoA

NADP+

NADPH

CoASH

NAD+

NADH

ADP +Pi

ATP

FAD

FADH2

CoASH

NAD+

NADH

CO2

CO2

CO2CoASH

NAD+

NADH

CoASH

CO2

ATP

CO2

ADP +Pi

3HHx

3HO

3HD

3HDd

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

PEP

ATP

ADP +Pi

PG3

PG2

ADP +Pi

ATP

BPG13NAD+

NADH

G3PKDPG2

GLICOSE

G6P

GL6P

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

NAD+

NADH

PG6

FRUTOSE

F6P

E4PS7PX5P

Rb5P

F16P

ADP +PiATP

DHP

Rbl5PCO2

NADP+

NADPH

P3HHx = 0,010

P3HO = 0,071

P3HD = 0,226

P3HDd = 0,016

PHAMCL = 0,003PHA

Xr

XTBIOTOT = 3,22E-04

BIOMASSA = 2,26E-05

VP14 = 2,147

AD1 = 0,077

ED10 = 0,000

ED11 = 1,647

CGLX1 = 0,000

CK1 = 0,024

CK2 = 0,024

CK5 = 0,000

CK4 = 0,000

CK3 = 0,024

CK6 = 0,000

CK7 = 0,000

CK8 = 0,000

CGLX2 = 0,000

AD2 = 0,012

ED9 = 0,000

ED8 = 0,000

ED7 = 0,034

ED6 = 0,034ED5 = 1,788

ED4 = 1,788

ED3 = 2,142

ED2 = 2,142

ED1 = 0,000 VP2 = 1,000

VP13 = 0,929

VP12 = 0,929

VP11 = 0,929

VP8 = 0,114

VP9 = 0,114

VP10 = 0,106

VP5 = 0,354

VP7 = 0,220

VP6 = 0,134

FADH2

FAD

OXFAD = 0,000

OXNAD = 1,761

NADH

NAD

H2O

O2

H2O

O2

CO2

1,961


LEGENDA


87


de acúmulo de 70% PHA. Relações elementares 15 e 75.

AcCoA

PIR

Cit

Isocit

KG2

SucCoA

Suc

Mal

Fum

OAA

GLX

AcCoA

NADP+

NADPH

CoASH

NAD+

NADH

ADP +Pi

ATP

FAD

FADH2

CoASH

NAD+

NADH

CO2

CO2

CO2CoASH

NAD+

NADH

CoASH

CO2

ATP

CO2

ADP +Pi

3HHx

3HO

3HD

3HDd

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

PEP

ATP

ADP +Pi

PG3

PG2

ADP +Pi

ATP

BPG13NAD+

NADH

G3PKDPG2

GLICOSE

G6P

GL6P

ATP

ADP +Pi

ATP

ADP +Pi

NAD+

NADH

PG6

FRUTOSE

F6P

E4PS7PX5P

Rb5P

F16P

ADP +PiATP

DHP

Rbl5PCO2

NADP+

NADPH

P3HHx = 0,010

P3HO = 0,071

P3HD = 0,226

P3HDd = 0,016

PHAMCL = 0,003PHA

Xr

XTBIOTOT = 3,22E-04

BIOMASSA = 2,26E-05

VP14 = 2,139

AD1 = 0,065

ED10 = 0,000

ED11 = 1,646

CGLX1 = 0,000

CK1 = 0,024

CK2 = 0,024

CK5 = 0,000

CK4 = 0,000

CK3 = 0,024

CK6 = 0,000

CK7 = 0,000

CK8 = 0,000

CGLX2 = 0,000

AD2 = 0,000

ED9 = 0,012

ED8 = 0,012

ED7 = 0,046

ED6 = 0,046ED5 = 1,774

ED4 = 1,774

ED3 = 2,134

ED2 = 2,134

ED1 = 0,000 VP2 = 1,000

VP13 = 0,917

VP12 = 0,917

VP11 = 0,917

VP8 = 0,116

VP9 = 0,116

VP10 = 0,108

VP5 = 0,360

VP7 = 0,224

VP6 = 0,136

FADH2

FAD

OXFAD = 0,000

OXNAD = 1,771

NADH

NAD

H2O

O2

H2O

O2

CO2

1,965


LEGENDA


88

6 CONCLUSÕES

As conclusões do trabalho são as seguintes:

1. nas condições ensaiadas com excesso de fonte de carbono, os valores de

concentração de biomassa (X) foram crescentes para valores decrescentes da

vazão específica de alimentação (D), já nas condições ensaiadas com limitação de

fonte de carbono, os valores de X variaram muito pouco com D, resultando em

valores semelhantes;

2. o fator de conversão de fonte de carbono em biomassa residual (Yxr/c) aumenta

com D, atingindo valores máximos de 0,4 – 0,5 g/g, quando a fonte de carbono

não é limitante. Nos ensaios limitados em fonte de carbono, não foi possível

estabelecer uma relação direta desse parâmetro com D;

3. a limitação ou não em fonte de carbono resultou em comportamento semelhante

dos valores do fator de conversão de fósforo em biomassa residual (Yxr/p).

Valores praticamente constantes para toda a faixa de Ds ensaiadas, valores na

faixa de 30 – 40 g/g na condição de limitação em P, 20 – 25 g/g na condição de

limitação em N e 35 – 50 g/g para limitação em N e P simultânea;

4. o fator de conversão de nitrogênio em biomassa residual (Yxr/n) variou pouco

para os valores de D testados, independente da limitação ou não da fonte de C.

Valores de 10 g/g para limitação em N, 8 g/g para limitação em P e 9g/g para

limitação em N e P. Na condição de limitação em P e N e P simultânea, Yxr/n foi

menor ( 5 g/g e 7 g/g, respectivamente) para o D em que ocorreu maior acúmulo

de polímero;

5. a partir dos fatores de conversão de fonte de carbono e nutrientes em biomassa

residual foi possível delimitar as regiões de crescimento com múltipla limitação

nas formas estudadas;

6. o limite superior da região de múltipla limitação é função da velocidade de

crescimento do microrganismo, sendo os valores de Co/No e Co/Po crescentes

com a diminuição de D. Já para o limite inferior, Co/No e Co/Po variam muito

pouco com D;

7. maiores valores de polímero são acumulados quando P é o nutriente limitante

(70%). Quando a limitação é somente na fonte de N, o máximo valor de teor de

PHA obtido é de somente 40% da biomassa celular. A limitação em ambos os

89

substratos (N e P), além do alto teor de polímero (68%) resulta em melhores

fatores de conversão de fonte de carbono em polímero, valores de YPHA/C de 0,19

g/g quando comparado com 0,16 g/g para limitação só em P e 0,10 g/g para

limitação só em N;

8. independente do tipo de limitação, a predominância na composição do polímero é

do monômero de 3-hidroxidecanoato (C10) cuja fração molar fica na faixa de

70% a 80%. Os monômeros 3-hexanoato (C6), 3-hidroxioctanoato (C8) e o 3-

hidroxidodecanoato (C12) também estão presentes no polímero e, na condição de

maior acúmulo, a composição é praticamente a mesma para as 3 condições

testadas, cerca de: 3 % mol de C6, 20 % mol de C8, e 5 % mol de C12.

9. os maiores valores de produtividade obtidos são da ordem de 0,16 – 0,18

gPHA/L.h, obtidos para D = 0,05 h-1, nas condições de limitação somente em P e

em N e P simultaneamente. Na condição de limitação em N os valores máximos

foram da ordem de 0,08 gPHA/L.h;

10. os fatores de conversão de oxigênio em biomassa residual e os respectivos

coeficientes de manutenção obtidos para a condição de limitação em nitrogênio

(Yxr/o = 0,96 g/g e mo =0,11g/gh), para limitação em fósforo (Yx/o = 1,39 g/g e

mo = 0,13 g/gh) e para limitação em nitrogênio e fósforo (Yx/o = 1,53 g/g e mo =

0,12 g/gh) indicaram que a limitação simultânea em nitrogênio e fósforo implicou

em menor consumo de oxigênio para gerar células quando comparada com a

condição de limitação em N ou P e que o oxigênio utilizado para manutenção das

células independe do tipo de limitação e dos valores das vazões específicas de

alimentação empregadas (entre 0,04 e 0,50 h-1);

11. os valores de qCO2 foram crescentes com D, coerentes com o fato de que o

crescimento celular deve prevalecer sobre o acúmulo de polímero com o aumento

de D;

12. os ensaios preliminares em alta densidade resultaram em estados estacionários

com valores de concentração de biomassa de até 32,80 g/L ( D = 0,045 h-1), porém

com teores de polímero da ordem de 15 % da biomassa celular;

13. os valores de Yxr/p e Yxrc para os ensaios preliminares em alta densidade foram

diferentes dos obtidos em baixa densidade celular indicando que as relações C/N e

C/P devam ser diferentes para atingir um maior acúmulo de polímero em alta

densidade celular;

90

14. o modelo metabólico (E3) proposto ajustou aos dados experimentais na condição

de limitação em nitrogênio. Os fluxos metabólicos obtidos propõem que glicose

ou frutose sejam consumidas utilizando a via de Embden-Meyerhoff-Parnas, não

ocorrendo fluxo entre 6-fosfogliconato e 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogliconato. O

modelo propõe ainda que NADPH e CO2 são gerados pelo desvio da hexose

monofosfato;

15. as relações elementares geradas pelo modelo (E3), foram utilizadas para analisar

possíveis modificações na rede metabólica que pudessem resultar em aumento da

conversão de substrato em produto. Os fluxos resultantes indicaram que a melhor

condição para produzir PHA implica em gerar NADPH, que é consumido para

fazer polímero, utilizando a Via de Entner-Doudoroff de forma cíclica e

direcionando o fluxo de gliceraldeído-3-fosfato para a formação de

fosfoenolpiruvato somente para suprir precursores para síntese de biomassa

residual (Xr), uma vez que a produção de NADPH pelo Ciclo de Krebs ou pela

via das hexoses monofosfato implicam em perdas da fonte de C na forma de CO2;

16. a partir dos valores de Yx/o e das frações de carbono que resultaram em CO2

pode-se afirmar que o nível de oxidação da biomassa não foi o mesmo nas

situações de limitação avaliadas, sugerindo diferenças na composição celular

nesses casos;

17. a não adequação do modelo E3 nos casos de limitação em P e em N e P, foi

atribuída a composição da biomassa celular, assumida como igual a de E. coli no

modelo.

91

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ANEXOS

marilda keico taciro processo contínuo de produção de

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