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Marielza Andrade Nunes

AVALIAÇÃO DO PAPEL DO LÍTIO, EM MICRODOSES, SOBRE O

COMPORTAMENTO E ESTEREOLOGIA CEREBRAL DE UM MODELO

TRANSGÊNICO DA DOENÇA DE ALZHEIMER (APPSWIND), EM

CAMUNDONGOS.

São Paulo 2014

Tese apresentada ao curso de Pós-

Graduação da Faculdade de Ciências

Médicas da Santa Casa de São Paulo

para a obtenção do título de Doutor em

Medicina

Marielza Andrade Nunes

AVALIAÇÃO DO PAPEL DO LÍTIO, EM MICRODOSES, SOBRE O

COMPORTAMENTO E ESTEREOLOGIA CEREBRAL DE UM MODELO TRANSGÊNICO DA DOENÇA DE ALZHEIMER (APPSWIND), EM

CAMUNDONGOS.

São Paulo

2014

Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação da

Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa

de São Paulo para a obtenção do título de Doutor

em Medicina.

Área de Concentração: Ciências da Saúde

Orientador: Prof. Dr. Hudson de Sousa Buck

(Versão Corrigida)

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo

Nunes, Marielza Andrade

Avaliação do papel do lítio, em microdoses,

sobre o comportamento e estereologia cerebral de

um modelo transgênico da doença de Alzheimer

(APPSWIND)./ Marielza Andrade Nunes. São

Paulo, 2014.

Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências

Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de

Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

Área de Concentração: Ciências da Saúde

Orientador: Hudson de Sousa Buck

1. Doença de Alzheimer 2. Lítio 3. Modelos

animais de doença 4. Camundongos transgênicos 5. Comportamento 6. Contagem de células/métodos

BC-FCMSCSP/18-14

Dedico esse trabalho

Ao meu marido Fábio, dedico esta tese e essa pesquisa como um todo. Por

todo seu apoio, sua paciência, dias e noites de ausência. Desde o início desta minha

caminhada, nunca duvidou de minhas ideias, de minhas expectativas e de que teria

capacidade para concluí-la.

Sem sua companhia, amor, afeto, carinho, tolerância e suporte não seria capaz

de chegar ao fim dessa jornada.

A você todo meu amor e agradecimento.

Aos meus filhos Felipe, Maria Elysia, Maria Clara e Maria Luiza, que sempre

me incentivaram a buscar mais, a acreditar em mim e nunca pensaram que era

muito velha para modificar meus horizontes. Amo vocês.

Aos meus pais Cid e Ivone. Meu pai porque me ensinou a força do trabalho, da

honestidade e do respeito, em especial aos mais velhos. Minha mãe por sua alegria

e por me ensinar que não existe velhice, os anos é que passam; mas, seremos

sempre eternas crianças.

Aos meus irmãos Mariangela, José Roberto e Fábio Henrique. Porque sua

existência em minha vida a tornam mais colorida e divertida.

Aos pacientes do ambulatório de Alzheimer do Hospital Geriátrico e de

Convalescentes Dom Pedro II da Irmandade de Misericórdia da Santa Casa de São

Paulo, que com sua generosidade e de seus familiares nos deram a certeza de

estarmos no caminho certo.

Agradecimentos

Aos meus pais científicos, Hudson de Sousa Buck e sua brilhante esposa Tânia

Araújo Viel, minha eterna coorientadora. Agradeço por me aceitaram em sua família,

me apoiando, corrigindo a abrindo a porta de sua casa, nos proporcionando até

mesmo um retiro de aprimoramento.

À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo que me

acolheu e me proporcionou a oportunidade de executar essa pesquisa e que, com a

beleza de suas paredes centenárias, me aquece, me recebe e me faz sentir em

casa.

Aos meus amigos do Departamento de Ciências Fisiológicas, em especial

Ariadiny Caetano, Ticiana Baraldi, Natália Schöwe, Laura Coelho (Laurinha), Marilia

Albuquerque, Karla Monteiro, Káris Dong, Janaina Balthazar, Milena Telles (Gigi),

Viviane Bressani e Rafael Suti (sempre Marieeeelza).

Aos professores do departamento que acreditam em mim e tanto me divertem.

Ao Sr Martinho de Castro por seu cuidado, carinho e conversas no biotério.

Aos meus anjos. No departamento, Célia Nascimento. Na secretaria da pós,

Mirtes, Sônia e Daniel. Sem vocês e sua presença sempre serena, que nos acalma

na hora do desespero, não seria possível chegar até aqui.

À minha tia Lia, que um dia me disse que ninguém jamais teria o direito de

dizer que eu não podia fazer qualquer coisa em minha vida.

Aos órgãos de fomento CAPES e FAP da FCMSCSP.

A Deus que me ilumina, aos anjos que me aconselham e a Nossa Senhora que

me cobre com seu manto.

Ao passado, que me norteia e ao futuro que me espera com muitas realizações

por vir.

"A verdadeira viagem do descobrimento não consiste em procurar novas

paisagens, mas em ver com novos olhos."

Marcel Proust (1871-1922)

Índice de Figuras

Figura 1: Análise prospectiva demográfica mundial. ................................................... 2

Figura 2: Participação dos grandes grupos de idade na população total residente,

IBGE. ........................................................................................................................... 3

Figura 3: Projeção da pirâmide etária absoluta (IBGE, 2011). .................................... 3

Figura 4: Evolução da população de 80 anos ou mais de idade por sexo - Brasil:

1980 / 2050. ................................................................................................................ 4

Figura 5: Prevalência estimada de demência para pessoas de 60 anos ou mais

(WHO, 2012). .............................................................................................................. 5

Figura 6: Prevalência da DA (percentagem) com a idade nos continentes e países

(Qiu et al, 2009). 2009 ................................................................................................. 8

Figura 7: Formação da memória. .............................................................................. 10

Figura 8: Representação da formação hipocampal e região parahipocampal no

cérebro de rato. ......................................................................................................... 13

Figura 9: Visão lateral e medial do córtex cerebral humano. .................................... 14

Figura 10: Diagrama esquemático da produção do peptídeo βAmiloide a partir da

Proteína Precursora Amiloide (APP) ......................................................................... 23

Figura 11: Mecanismo de formação da placa βAmiloide a partir do peptídeo

βAmiloide. ................................................................................................................. 27

Figura 12: Formação de Fibrilas Amiloides. .............................................................. 28

Figura 13: Formação da placa Amiloide .................................................................... 28

Figura 14: Fosforilação normal e patológica da proteína tau .................................... 30

Figura 15: Mecanismo de formação dos filamentos helicoidais pareados ................ 31

Figura 16: Mecanismo molecular pelo qual a fosforilação inibe a GSK-3 ................. 33

Figura 17: GSK-3 na fosforilação dos fatores de transcrição. ................................... 34

Figura 18: GSK-3 na fosforilação das proteínas estruturais. ..................................... 35

Figura 19: Resumo dos efeitos neuroprotetores do lítio. ........................................... 38

Figura 20: Delineamento Experimental. .................................................................... 48

Figura 21: Ingestão de água para cálculo de concentração do lítio. ......................... 64

Figura 22: Ingestão semanal de água dos animais tratados com água e lítio. .......... 65

Figura 23: Mortalidade dos animais entre 15 e 18 meses. ........................................ 66

Figura 24: Média de idade do óbito dos animais. ...................................................... 66

Figura 25: Atividade Motora Horizontal aos 6 e 18 meses. ....................................... 67

Figura 26: Atividade Motora Vertical aos 6 e 18 meses. ........................................... 68

Figura 27: Aprendizado dos animais em labirinto de Barnes .................................... 69

Figura 28: Números de erros cometidos pelos animais no labirinto de Barnes. ........ 70

Figura 29: Memória Espacial avaliada em labirinto de Barnes - Tempo inicial. ........ 71

Figura 30: Erros iniciais cometidos em labirinto de Barnes. ...................................... 72

Figura 31: Distância percorrida - Labirinto terrestre de Barnes. ................................ 73

Figura 32: Tempo de permanência no quadrante alvo em labirinto de Barnes. ........ 74

Figura 33: Comparação do desempenho dos animais na sessão de aquisição (treino)

.................................................................................................................................. 75

Figura 34: Memória aversiva em Esquiva Inibitória aos 18 meses. ........................... 76

Figura 35: Avaliação da ansiedade em Labirinto em Cruz Elevado – Tempo nos

braços abertos. .......................................................................................................... 77

Figura 36: Avaliação da ansiedade em labirinto em cruz elevado – número de

entradas nos braços abertos. .................................................................................... 78

Figura 37: Avaliação da ansiedade em labirinto em cruz elevado – tempo de

permanência nos braços fechados. ........................................................................... 79

Figura 38:Avaliação da ansiedade em labirinto em cruz elevado – número de

entradas nos braços fechados. ................................................................................. 79

Figura 39: Avaliação de comportamento obsessivo-compulsivo. Teste de enterrar

esferas. ..................................................................................................................... 80

Figura 40: Avaliação de comportamento obsessivo-compulsivo. Tempo de

escavação. ................................................................................................................ 80

Figura 41: Concentração de BDNF (pg/mg) no hipocampo....................................... 81

Figura 42: Concentração de BDNF (pg/mg) no córtex. ............................................. 82

Figura 43: Número de placas amiloides todos os animais ........................................ 83

Figura 44: Número de placas amiloides animais TG. ................................................ 83

Figura 45: Fotos placas amiloides por Tioflavina-S : ................................................. 84

Figura 46: NeuN no hipocampo ................................................................................. 85

Figura 47: Fotos corpos neuronais Hipocampo NeuN ............................................... 86

Figura 48: NeuN no cortex ........................................................................................ 87

Figura 49: Fotos corpos neuronais cortex NeuN ....................................................... 88

Figura 50: Atividade da enzima GSK-3β no hipocampo. ........................................... 89

Figura 51: Atividade da enzima GSK-3β no cortex.................................................... 89

Figura 52: Densidade de terminais pré-sinápticos em hipocampo. ........................... 90

Índice de Tabelas

Tabela 1 ..............................................................................................................6

Tabela 2..............................................................................................................21

Tabela 3..............................................................................................................24

Lista de Abreviações

AAMI – Prejuízo à memória associado à idade (age-associated memory impairment). Aβ – Peptídeo β Amiloide. ADAM – Desintegrina e Metaloproteinase (A Desintegrin And Metalloproteinase) ADAS-Cog – Escala de Avaliação Cognitiva da doença de Alzheimer (Alzheimer's Disease Assessment Scale-cognitive). AKT ou PKB – Proteína cinase B (Protein Kinase B) AICD – Domínio Intracelular da APP (APP intracellular domain). AMPc – Monofosfato Cíclico de Adenosina (Ciclic Adenosine Monophosphate). ANOVA – Análise de Variância (Analysis of Variance) APOE - Apolipoproteína APP – Proteína Precursora Amiloide (Amyloid β precursor protein). APPsα – Proteína precursora amiloide solúvel alfa. APPβ - Proteína Precursora amiloide Beta. APPsβ – Proteína precursora solúvel Beta. BACE1 - Enzima 1 de clivagem do sítio β da APP (Beta site enzyme clivage1). BACE2 – Enzima 2 de clivagem do sítio β da APP (Beta site enzyme clivage2) BDNF – Fator Neurotrófico derivado do cérebro (Brain Derived Neurotrophic Factor). CA1 – Cornu Ammonis 1 CA2 – Cornu Ammonis 2 CA3 – Cornu Ammonis 3 CAMDEX – Exame para doenças mentais dos idosos de Cambridge (Cambridge Examination for Mental Disorders of the Elderly). CASI-S – Instrumento de varredura de habilidades cognitivas – curto. (Cognitive Abilities Screening Instrument-short). CERAD – Consórcio para estabelecer um registro da doença de Alzheimer. (Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease). CES – Canal Epitelial de Sódio CR – Resposta Condicionada (Conditioned Response). CREB – Elemento Ligador de Proteína com resposta ao cAMP (cAMP response element-binding protein). CS – Estímulo Condicionado (Conditioned Stimulus). CTFs – Fragmentos carboxil terminais. Ctr – Tratados com água. DA – doença de Alzheimer DAB – Diaminobenzidina 45 DESA – Departament of Economica and Social Affairs. DG – Giro denteado (Dentate Girus) DNA – Ácido Desoxirribonucleico (desoxirrionucleic acid) EC – Cortex Entorhinal ELISA – Ensaio de Imunoabsorção Ligado a Enzima (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ENF – Emaranhado Neurofibrilar. ERK – Cinase Regulada por sinal extracelular. EUA – Estados Unidos da América. FAD – Doença de Alzheimer Familiar (Familial Alzheimer´s Disease). FHP – Filamentos Helicoidais Pareados. GSK-3α – Glicogênio Sintase cinase-3 alfa (Glycogen syinthase Kinase-3 alpha). GSK-3β – Glicogênio Sintase quinase-3 beta (Glycogen syinthase Kinase-3 beta).

HSP- Heat Shock Protein. IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística Kg – Quilograma (Kilogram) JNK - c-Jun N-terminal-kinase-p53-Bax. WT – Não Transgênico TG - Transgênico Li – Lítio Li2 – Tratado com lítio a partir dos 2 meses de idade Li10 – Tratado com lítio a partir dos 10 meses de idade LTM – Memória de Longa Duração (Long Term memory). LTP – Potenciação de Longa Duração (Long Term Potentiation) MAPK – Proteína Cinase ativada por mitógeno (mitogen-activated protein kinase). MCI – Comprometimento Cognitivo Leve (Mild Cognitive Impairment) MDC-9 – Metaloproteína Desintegrina 9. MEEM – Mini Exame do estado Mental MEK - Mitogen-activated protein kinase kinase mg – Miligrama. mRNA – RNA mensageiro. NeuN – Proteína nuclear neuronal (Neuronal Nuclei) NFκβ – Fator nuclear kapa de transcrição β (nuclear factor kappa β) c-jun – Proteína codificada pelo gene JUN. µg – Micrograma. NMDA – N- Metil D Aspartato. One Way ANOVA – Análise de Variância de uma Via ONU – Organização das Nações PBS – Tampão Fosfato Salina (Phosphate Buffer Saline). PCR – Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction) Pg – picograma PEN2 – Potencializador da Presenilina (Presenilin Enhancer2). PI3K – Fosfatidil Inositol 3 cinase (Phosphoinositide 3-Kinase) PKA – Proteína Cinase A (Protein Kinase A) PKB – Proteína Cinase B (Protein Kinase B) PKC – Proteína cinase C (Protein kinase C) % - Por cento. PLC – Fosfolipase C (Phospholipase C) RC – Resposta Condicionada RNAm – RNA mensageiro. SGZ – Zona subgranular do hipocampo. SNC – Sistema Nervoso Central. STM – Memória de Curta Duração (Short Term Memory) TACE – Enzima conversora de TNFα. TG – Transgênico. TRkB – Tirosina cinase B (tirosine kinase B). Two Way ANOVA – Análise de variância de Duas Vias. UCS – Estímulo Não Condicionado (unconditionated stimulus). WAIS-R – Escala Weschler de inteligência do adulto (Weschler Adult Intteligence Scale). WHO – World Health Organization. Wnt – Wingless. WT – Não transgênico (Wild Type).

Sumário

Introdução ................................................................................................................... 1

Epidemiologia da Doença de Alzheimer .................................................................. 1

Memória ................................................................................................................... 8

Cérebro e Envelhecimento ..................................................................................... 15

Doença de Alzheimer ............................................................................................. 17

Definição ............................................................................................................. 18

Classificação da DA ............................................................................................ 19

Critérios clínicos ................................................................................................. 20

Lesões ultraestruturais básicas da DA ............................................................... 22

Proteína βAmiloide ................................................................................................. 23

Proteína tau ........................................................................................................... 29

GSK-3 .................................................................................................................... 32

Lítio ........................................................................................................................ 36

Toxicidade do Lítio .............................................................................................. 39

BDNF ..................................................................................................................... 42

Densidade de corpos neuronais ............................................................................ 43

Sinaptofisina .......................................................................................................... 44

Objetivos ................................................................................................................... 46

Geral ...................................................................................................................... 46

Específicos ............................................................................................................. 46

Material e Métodos .................................................................................................... 47

Delineamento experimental ................................................................................... 47

Animais .................................................................................................................. 48

Tratamento ............................................................................................................. 49

Testes Comportamentais ....................................................................................... 51

Avaliação da atividade motora ............................................................................ 51

Avaliação do comportamento de ansiedade ....................................................... 51

Avaliação do Comportamento Compulsivo ......................................................... 52

Avaliação da memória espacial .......................................................................... 53

Avaliação da memória aversiva .......................................................................... 55

Análises Estereológicas ......................................................................................... 56

Obtenção das amostras de cérebro .................................................................... 56

Obtenção dos cortes histológicos ....................................................................... 56

BDNF .................................................................................................................. 57

Avaliação das alterações do número de corpos celulares e de sinapses ........... 58

NeuN................................................................................................................... 58

Sinaptofisina ....................................................................................................... 60

Avaliação das placas amiloides .......................................................................... 60

Avaliação da atividade das enzimas GSK-3α e GSK-3β .................................... 61

Análises estatísticas ............................................................................................... 63

Resultados ................................................................................................................ 64

Avaliação da ingestão de água para cálculo da concentração de lítio ................... 64

Comparação da ingestão de água entre animais tratados e não tratados ............. 65

Mortalidade ............................................................................................................ 65

Avaliação da atividade motora ............................................................................... 67

Avaliação da Memória Espacial ............................................................................. 68

Avaliação da memória relacionada a estímulo aversivo ........................................ 75

Avaliação do comportamento de ansiedade .......................................................... 76

Avaliação do Comportamento Compulsivo ............................................................ 80

Análises Estereológicas ......................................................................................... 81

BDNF .................................................................................................................. 81

Placas amiloides ................................................................................................. 82

Densidade Neuronal ........................................................................................... 84

Avaliação da atividade da enzima GSK-3β ......................................................... 88

Densidade de terminais pré-sinápticos ............................................................... 90

Discussão .................................................................................................................. 92

Conclusão ............................................................................................................... 106

Aprovação da Comissão de Ética no uso de animais ............................................. 108

Referências Bibliográficas ....................................................................................... 109

1

Introdução

A doença de Alzheimer (DA), uma doença neurodegenerativa progressiva, de

etiologia ainda desconhecida e que leva progressivamente a uma severa

incapacidade e à morte, tem sido considerada uma pandemia no século XXI.

Cem anos após a primeira descrição pelo psiquiatra alemão Alois Alzheimer, a

doença que recebeu seu nome, se tornou a doença neurodegenerativa mais comum

em todo o mundo e é a causa de mais de 65% dos casos de demência no fim da

vida. Leva, implacavelmente, a um prejuízo severo das funções cognitivas e

finalmente à morte dentro de 3 a nove anos em média (Sonnen et al, 2007).

Epidemiologia da Doença de Alzheimer

Mudanças demográficas resultantes do aumento da expectativa de vida e, por

consequência, do número de pessoas idosas levaram a um aumento dramático das

demências, entre elas, da DA.

O principal fator de risco para a DA é a idade. A incidência da doença dobra a

cada 5 anos após 65 anos de idade, com o diagnóstico de aproximadamente 1275

novos casos por ano por 100.000 indivíduos com mais de 65 anos de idade (Hirtz et

al, 2007). Nesse contexto, o risco da DA entre 65 e 100 anos é de 33% para homens

e 45% para mulheres com uma prevalência até quase 60% na décima década (Van

der Flier et al, 2005).

Previsões atuais mostram que, no ano de 2025, o número de pessoas nos

Estados Unidos com idade entre 80 e 90 anos deverá dobrar e dos centenários

deverá ser maior ainda, podendo ter um aumento de 200% (Ferri et al, 2005). O

2

número de pessoas com 85 e mais irá mais que quadruplicar para 8 milhões de

pessoas. O número entre 75 e 84 irá dobrar para 4,8 milhões. Enquanto o número

entre 65 e 74 permanecerá constante em 0,3 a 0,5 milhões (Hebert et al, 2003).

Podemos observar que, após o ano de 2050, a tendência é que a população de 20 a 60 anos permaneça estável com aumento significativo da população de mais de 60 anos. Fonte: Departament of Economic and Social Affairs (DESA), 2011.

No Brasil observaremos evolução semelhante, pois baseado no censo do IBGE

2010 observamos a seguinte participação dos grandes grupos de idade na

população total:

Figura 1: Análise prospectiva demográfica mundial.

3

Figura 2: Participação dos grandes grupos de idade na população total residente, IBGE.

Evolução da participação da população de 40 anos e mais em relação à população abaixo de 40 anos de idade, mostrando aumento da participação da população mais idosa na composição da população total. Fonte: Censo Demográfico 1960/2010.

A população idosa brasileira vai aumentar expressivamente até 2050 (IBGE,

2004). Segundo as projeções da ONU, os idosos de 65 anos e mais deverão passar

de 10 milhões para 50 milhões entre 2000 e 2050 e os de 80 anos e mais deverão

passar de 1,7 milhões para quase 14 milhões nesse período (DESA, 2011).

Figura 3: Projeção da pirâmide etária absoluta (IBGE, 2011).

A Pirâmide etária absoluta projetada para 2050 apresenta padrões de envelhecimento populacional com alargamento da porção apical da pirâmide, onde identificamos indivíduos com maior idade, e estreitamento da base que reflete diminuição da taxa de natalidade.

4

Deveremos ter uma atenção especial, no campo da saúde pública, para uma

população que vem ganhando longevidade. Na figura 4, observamos que, em 2000,

eram 1,8 milhão de pessoas com 80 anos ou mais de idade e, em 2050, poderão ser

13,7 milhões de pessoas nesta mesma faixa etária.

Figura 4: Evolução da população de 80 anos ou mais de idade por sexo - Brasil: 1980 / 2050.

O gráfico acima mostra a evolução da população de 80 anos dos anos de 1980 com projeção para 2050, divididos por sexo. Observamos um aumento absoluto da população de 80 anos ao longo dos anos com maior aumento do sexo feminino.

O número de casos de demência, em termos de incidência e prevalência,

apresenta-se diretamente proporcional ao aumento desse segmento etário

(Charchat-Fichman et al., 2005).

A prevalência estimada de demências entre as pessoas de 60 anos e mais

tende a variar entre 5 e 7 % na maioria dos países. Essa prevalência quando

ajustada para a idade pode variar de menos de 2 % em algumas partes da África até

mais de 8 % em algumas partes da América Latina (World Health Organization,

2012).

5

Figura 5: Prevalência estimada de demência para pessoas de 60 anos ou mais (WHO, 2012).

Avaliação da percentagem de indivíduos com 60 anos e mais, portadores de demência. Podemos verificar uma uniformidade nos dados nos diversos continentes com discreto aumento dessa prevalência nos continentes Sul Americanos e Caribe.

Estudos realizados com base em uma revisão bibliográfica sobre a América

latina mostraram uma prevalência de demência mais elevada que a média mundial

(Nitrini et al, 2009) em seis países estudados, Brasil (Herrera et al, 2002; Ramos-

Cerqueira et al, 2005; Bottino, 2008), Colômbia (Pradilla et al, 2003; Dias-Cabezas et

al, 2006), Chile (Albala et al, 1997), Cuba (Llibre et al, 2008), Peru (Custodio et al,

2008), Uruguai (Ketzoian et al, 1992) e Venezuela (Maester et al, 2002; Molero et al,

2007).

Resultados utilizando abordagens mais adequadas, com o uso de uma

adequação cultural para países menos desenvolvidos, sugerem que a incidência de

demência nos países em desenvolvimento é 1,5 a 2,5 vezes mais alta que em

países desenvolvidos (Prince et al, 2012), chegando a níveis iguais ou superiores

aos observados nos países europeus.

Com o aumento da população idosa, a prevalência de demências será

aproximadamente de 13 a 16 milhões de casos nos Estados Unidos pela metade do

século (Ferri et al, 2005).

6

O estudo de consenso Delphi, realizado pela Alzheimer’s Disease International,

prevê um aumento global das demências de 24,3 para 42 milhões em 2020, quase

dobrando a cada 20 anos para 81 milhões em 2040 (Ferri et al, 2005), supondo que

não haja modificações na mortalidade ou em estratégias efetivas de prevenção ou

tratamentos efetivos. O aumento estimado da prevalência de demências nos países

desenvolvidos é de 100% entre 2001 e 2040, mas pode ir até a 300% nos países em

desenvolvimento (Hebert et al, 2003).

O gasto anual estimado à sociedade, em todo o mundo, é de U$ 604 bilhões de

dólares americanos (Wimo et al, 2013). Isto mostra o tremendo impacto que a

demência tem nas condições sociais no mundo todo.

Os estudos realizados no Brasil são poucos e executados em poucas áreas do

país. Verificou-se maior prevalência em pobres, mulheres e indivíduos muito idosos

(Herrera Jr et al, 1998, Scazufca et al, 2008, Fagundes et al, 2011).

Déficits cognitivos segundo a idade observados no Brasil:

Tabela 1: Distribuição de frequência (%) dos idosos, segundo idade e resultado do MEEM (Mini

Exame do Estado Mental), São Paulo, 2000.

Idade

MEEM < ou = 12 13 ou +

% %

60-64 65-69 70-74 75-79 80-84 85 e + Total

96.4 96.7 93.5 87.2 80.5 68.4 93.1

3.6 3.3 6.5

12.8 19.4 31.6 6.9

Tabela mostrando a percentagem de pacientes entre as idades de 60 a 85 anos e mais, segundo a pontuação no teste do MEEM. Um teste utilizado para avaliar o estado cognitivo em pacientes, cuja pontuação vai de 0 a 30. De 9 a 20 pontos, demência leve; abaixo de 9 demência grave. A perda cognitiva se acentua com o avançar da idade (Lebrão e Laurenti, 2005).

7

Como os estudos realizados no Brasil são, em sua maioria, da região sul e

sudeste do país; estudos mais consistentes deveriam ser realizados para uma

avaliação real do quadro demencial no país.

Nos idosos com 85 anos e mais a probabilidade de receber o diagnóstico de

Alzheimer é de um em três (Hebert et al, 2003). Mas, dados em centenários

mostram que a DA não é, necessariamente, consequência do envelhecimento (den

Dunnen et al, 2008).

A causa mais comum de demência nos indivíduos de 60 anos e mais é a DA

(Plassman et al, 2007). Em 2000 havia 4,5 milhões de pessoas com DA nos EUA

(Estados Unidos da América). Em 2050, esta população irá aumentar quase 3 vezes

chegando a 13,2 milhões (World Health Organization, 2008).

O diagnóstico clínico da DA é de difícil execução e precisão, pois se baseia em

testes cognitivos e de autonomia (McKhann et al, 1984). Hoje aos critérios clínicos

se juntam critérios laboratoriais de marcadores e imagem (McKhann, 2011).

Na Europa, a prevalência de demências em pessoas com 65 anos e mais é de

6,4% e de DA é de 4,4% (Ferri et al, 2005). Nos EUA, estudos com indivíduos de 70

anos e mais mostraram uma prevalência de DA de 9,7% (Plassman et al, 2007). No

mundo estimamos a prevalência de demência em 3,9% em indivíduos acima de 60

anos e mais, sendo geograficamente assim distribuídos: 1,6% na África, 4.0% na

China e regiões do Pacífico Ocidental, 4,6% na América latina, 5,4% na Europa

Ocidental, e 6,4% na América do Norte (Ferri et al, 2005). Podemos observar que os

níveis de prevalência são muito menores em países em desenvolvimento que em

países desenvolvidos. Na América Latina (Brasil e Cuba), os índices são parecidos

com os de países desenvolvidos, aproximadamente 5,1% (Scazufca et al, 2008;

Zhang et al, 2005; Libre Rodriguéz et al, 2008).

8

A prevalência da DA praticamente dobra a cada 5 anos após os 65 anos. Nos

países desenvolvidos aproximadamente uma a cada dez pessoas acima de 65 anos

e um terço das de mais de 85 anos, apresenta certo grau de demência. A DA é a

causa de 50 a 70% dos casos e demência vascular, em segundo lugar, de 5 a 25%

dos casos (Plassman et al, 2007; Scazufca et al, 2008; Lobo et al, 2000; Dong et al,

2007).

Observamos um aumento da prevalência da DA na população, com o aumento da idade, no continente europeu, China, Estados Unidos da América e Brasil.

Memória

A alteração mais conhecida da DA é o prejuízo cognitivo. A memória é uma das

primeiras funções cognitivas a mostrar declínio durante o envelhecimento e seu

declínio tem um impacto social e econômico nos indivíduos, famílias, sistemas de

saúde a sociedade como um todo. O prejuízo da memória associada à idade (AAMI),

quando outras causas óbvias, como a DA foram descartadas, se inicia em torno dos

50 anos de idade e sua prevalência é estimada em 18.5% nos indivíduos de 50 anos

Figura 6: Prevalência da DA (percentagem) com a idade nos continentes e países (Qiu et al, 2009).

2009

9

e mais, aumentando até 38% entre as idades de 60 a 78 anos de idade. Esse

declínio parece ser muito proeminente, mas, não é uma consequência inevitável do

envelhecimento normal da população e não acomete grupos específicos da

população (Häninen e Soninen, 1997).

10

Adaptado de Squire, 2004.

Figura 7: Formação da memória.

11

Estudos em animais mostram que a formação da memória, normalmente,

requer várias fases temporais durante a sua formação e consolidação. A aquisição

normalmente requer repetição e necessita da atuação de um extenso circuito neural.

Depois da estimulação quando a experiência cessa, a memória de curta duração

decai rapidamente. Em minutos, esta velocidade de decaimento se torna mais lenta,

indicando o desenvolvimento de um estado intermediário da memória que dura

algumas horas e é caracterizada por uma transição de uma memória lábil a uma

forma persistente. Depois de várias horas esta memória finalmente se transforma em

uma memória de longa duração (LTM). Estes estudos mostram que é necessária a

síntese de proteínas para a formação da memória de longa duração, mas não para a

de curta duração. Estudos genéticos mostram que estas fases são funcionalmente

distintas (Tully et al, 1994).

A execução do processamento da memória se dá por mecanismos de

aquisição, consolidação, retenção e recuperação desta memória (Kandel et al,

2000).

Para a execução dos passos acima se faz necessária a Potenciação de longa

duração (LTP), uma forma de plasticidade sináptica.

As estruturas anatômicas envolvidas com o processamento da memória para o

aprendizado espacial são o hipocampo (Bachevalier et al, 1999), parahipocampo

(Zola-Morgan et al, 1989), subiculum, o córtex temporal (Insausti et al, 2013), tálamo

e córtex parietal posterior (Alexinsky, 2001). Para a memória emocional, temos o

envolvimento da amígdala (Rogan et al, 1997). Para a memória de trabalho o

hipocampo e córtex pré-frontal (Laroche et al, 2000).

O hipocampo é uma estrutura do cérebro de mamíferos que está abaixo do

lobo temporal medial, de cada lado do cérebro. Geralmente, o termo hipocampo e

12

seu córtex adjacente se aplica ao giro denteado (DG), os campos do hipocampo

descritos como Cornu Ammonis CA1, CA2 e CA3 e o subiculum. A organização da

circuitaria neuronal hipocampal tem sido tradicionalmente caracterizada como vias

trisinápticas excitatórias unidirecionais (Li et al, 2009). O cortex entorhinal (EC) provê

a grande parte das entradas de informações para o hipocampo, através de conexões

com o DG (Li, 2009). O fluxo de informações procede do DG para o CA3, para o

CA1. O CA1, em troca projeta para o subiculum e envia estímulos de volta às

camadas mais profundas do EC (cortex entorrinal). O CA2 forma conexões

independentes com o EC (Cui, 2012).

Embora o hipocampo exerça um papel essencial na formação das memórias

(O’Keefe e Nadel, 1978; Morris et al., 2003; Leutgeb et al., 2005), à medida que as

memórias vão sendo amadurecidas vão se tornando, em parte ou totalmente,

independentes dessa estrutura (Teng and Squire, 1999; Rosenbaum et al., 2000). O

cortex pré-frontal tem sido identificado como tendo uma provável importância na

expressão de memórias remotas (Frankland and Bontempi, 2005). O cortex medial

pré-frontal, incluindo o cortex anterior cingulado, e cortex prelímbico e infralímbico

são conectados às regiões sensoriais motoras e ao cortex límbico (Uylings et al.,

2003) e estão envolvidos com memórias antigas (Takehara et al., 2003), sendo o

cortex cingulado anterior diretamente relacionado com a formação e recuperação da

memória espacial remota (Teixeira et al, 2006).

13

Figura 8: Representação da formação hipocampal e região parahipocampal no cérebro de rato.

A visão lateral (painel à esquerda) e caudal (painel à direita). Para orientação na formação hipocampal (consistindo de giro denteado (DG; marrom escuro), CA2 (não indicado); CA1 (laranja) e subiculum (Amarelo)). Três eixos são indicados: O longo ou eixo septo-temporal (também referido como eixo dorsoventral); o transverso ou eixo próximo-distal, que corre em paralelo à camada celular e inicia no giro denteado; e o radial ou eixo superficial-profundo, que é definido como sendo perpendicular ao eixo transversal. Na região parahipocampal (verde, azul, rosa e roxo, utiliza-se um eixo similar ao superficial-profundo). Adicionalmente, o pré-subiculum (PrS: azul intermediário) e parasubiculum (PaS; azul escuro) são descrito por um eixo septotemporal e próximo-distal. O córtex entorrinal, que tem um aspecto lateral (LEA; verde escuro) e medial (MEA; verde claro), é descrito por um gradiente dorso lateral a ventro medial e eixo rostro caudal. O córtex perirhinal (consistindo de áreas de Brodmann (A) 35 (rosa) e 36 (roxa) e córtex pósrhinal (POR; verde azulado) dividem o último eixo com o córtex entorrinal e são definidos adicionalmente por uma orientação dorso ventral). As linhas tracejadas no painel esquerdo indicam os níveis das duas seções horizontais (a, b) e duas seções coronais (c, d), que são mostradas na parte B. Um corte horizontal, corado por Nissl (da parte Bb) mostra as camadas corticais e eixos tridimensionais. Os números romanos indicam as camadas corticais CA, cornus ammonis; dist. Diastais; dl, parte dorso lateral do córtex enthorhinal; encl. Lâmina fechada do DG; exp. Lâmina exposta do DG; gl. Camada de células granulares; luc, Stratum lucidum; ml, camada molecular; or, stratum oriens; prox, proximal; pyr, camada de células piramidais; rad, stratum radiatum; sim, stratum lacunosum-moleculare; vm, parte ventro medial do córtex entorrinal. (van Strien et al, 2009). Autorização para uso: 3173621137091.

14

Figura 9: Visão lateral e medial do córtex cerebral humano.

Visão lateral e medial do córtex cerebral humano, mostrando a localização do córtex, mostrando as áreas do córtex pré-frontal que participam na memória de trabalho, o hipocampo que é importante na consolidação da memória de curta duração em memória de longa duração, e amígdala que participa no armazenamento das memórias relacionadas a eventos emocionais. A seção coronal através da parte rostral do lobo temporal mostra a relação do hipocampo com o córtex entorhinal e paraentorhinal que são parte do lobo temporal medial (Robertson, 2002).

Processos de aprendizado e memória têm recebido grande ênfase em seus

estudos. Os pesquisadores têm produzido muitas linhagens mutantes para examinar

os papéis de determinados genes no comportamento (Cairns et al, 1983), com

grande avanço na identificação dos mecanismos moleculares, responsáveis pelo

comportamento desses animais (Provost et al, 1993).

Para o estudo de memória associativa, geralmente utilizamos os paradigmas

de condicionamento clássico onde dois estímulos prévios não contíguos são

pareados. Nestes testes um estímulo é designado como não condicionado (UCS), e

a apresentação deste estímulo não condicionado leva a medição da resposta a

15

estes estímulos. Um segundo estímulo, agora condicionado (CS), geralmente

aversivo é apresentado juntamente como o não condicionado e desencadeia uma

resposta chamada de resposta condicionada (CR) (Kandel et al, 2000). Outro

importante paradigma para o estudo de memória e aprendizado é o instrumental

para o condicionamento. O que difere do condicionamento clássico no

comportamento dos animais é o instrumental para a produção da recompensa e da

punição (Kimble e Marquis, 1961). Estes testes e o instrumental para avaliá-los são

comumente usados para investigar os mecanismos que se relacionam com

aprendizado e memória em roedores.

Embora diferentes tipos de condicionamento clássico ou instrumentais tenham

sido utilizados em camundongos para examinar vários aspectos do aprendizado e

memória, como memória de curta duração (STM) e LTM (Grove et al, 2004),

memória de trabalho (Wietrzych et al, 2005), consolidação (Frankland et al, 2004) ou

memória emocional (Laxmi et al, 2003), fica claro que cada paradigma requer o uso

de vários componentes de várias memórias simultaneamente (Frankland et al,

2004).

Cérebro e Envelhecimento

A alteração cognitiva é uma das grandes ameaças à saúde do século vinte e

um. Como já vimos, a expectativa de vida da população tem aumentado e junto com

ela aumenta o declínio cognitivo e a demência, principalmente na forma da DA. O

grande fator de risco para o declínio cognitivo e DA em adultos idosos é, portanto, a

idade por ela mesma (Lindsay et al, 2002). É muito importante o entendimento do

16

processo de envelhecimento como um todo e especificamente do envelhecimento

cerebral.

Estudos funcionais de imagem do cérebro humano têm revelado que regiões

separadas do cérebro que interagem como um sistema de alta organização das

funções cognitivas mostra menor coordenação da ativação com a idade (Andrews-

Hanna et al, 2007). A atividade neural se torna também menos localizada se

espalhando pelo córtex pré-frontal de ambos os hemisférios como um sistema de

compensação contra as modificações neurodegenerativas da idade (Park e Reuter-

Lorenz, 2009). Isso ocorre, provavelmente, devido a uma perda da substância

branca do cérebro ou desmielinização (Head et al, 2004).

A perda neuronal é mínima com a idade, mas existem mudanças importantes

na fisiologia sináptica, com alterações significativas dos genes sinápticos, cuja

expressão está reduzida e esta redução se correlaciona com os danos dependentes

da idade do DNA dos promoters desses genes (Lu et al, 2004).

O envelhecimento normal está associado com redução da atividade metabólica

no subiculum e giro denteado, enquanto a atividade metabólica reduzida no córtex

entorrinal, pode ser um indicador de patologia (Small et al, 2000, Small et al, 2002).

A maioria dos estudos evidencia uma redução da função mitocondrial com a idade.

Além disso, a redução da expressão dos genes envolvidos no metabolismo

energético mitocondrial pode se tornar mais acentuada em humanos com declínio

cognitivo e DA (Zhan et al, 2007). Existe um aumento da expressão dos genes

envolvidos com as reações de resposta ao stress.

Em um estudo de perfil transcricional do envelhecimento em córtex de

camundongos, macacos rhesus e humanos, a mudança mais conservada era o

aumento dependente da idade dos genes da Apolipoproteina D (Loerch et al, 2008),

17

proteína sintetizada no SNC (Sistema Nervoso Central) por astrócitos e

oligodendrócitos que está aumentada no liquor de pacientes de DA, e outras

doenças neurodegenerativas, que pode estar associada ao reparo do SNC (Rassart

et al, 2000).

Um gene que parece ter uma influência no envelhecimento em geral e no risco

de doenças degenerativas relacionadas com a idade é o da Apolipoproteina E

(Roses, 1996). Está relacionado com diminuição da longevidade (Cauley et al, 1993)

e doenças neurodegenerativas (Schneider et al, 1995). Outros genes relacionados

com a expectativa de vida podem influenciar o envelhecimento do cérebro, os que

codificam as proteínas do hormônio do crescimento (Sonntag et al, 2000) e do

complexo maior de histocompatibilidade (Hu et al, 2000), e estão relacionados com

LTP da transmissão sináptica no hipocampo (Hu et al, 2000). O envelhecimento

altera também a capacidade do sistema colinérgico em responder aos processos

prejudiciais relacionados a ele, com forte relação entre o envelhecimento no sistema

colinérgico cortical a as funções cognitivas mediadas por este sistema neuronal

(Seeger et al, 2004).

Existem mudanças importantes na fisiologia sináptica, com alterações

significativas dos genes sinápticos, cuja expressão está reduzida e esta redução se

correlaciona com os danos dependentes da idade do DNA dos promoters desses

genes (Lu et al, 2004).

Doença de Alzheimer

Aloysius Alzheimer, um psiquiatra que buscava estudar a psiquiatria através da

análise histopatológica do cérebro (Maurer et al, 1997), estudou o caso de uma

18

paciente, Auguste D, com grave deficiência de memória e quadros de alucinações,

que morreu em 1906. Esta paciente apresentava em seu cérebro lesões

características de depósitos miliares (placas senis) segundo descrição do próprio

Alzheimer (Jellinger, 2006).

Os sintomas da DA podem incluir perda gradual de memória, perda da fala e

da linguagem, dificuldade de julgamento e de tomar decisões, dificuldade de

abstração, perda das habilidades espaciais, mudanças de personalidade,

desorientação temporal e espacial (Werner, 2003).

Definição

No momento do diagnóstico a doença é definida como (Mckhann et al, 1984):

A. Provável DA – Demência estabelecida por testes neurofisiológicos, por

exemplo: Mini Exame de Estado Mental. Aparecimento entre 40 e 90 anos.

Alterações de linguagem, habilidades motoras e percepção. Alterações das

atividades do dia a dia. Alterações de padrões de comportamento e,

frequentemente, tomografia computadorizada do cérebro normal para a idade.

B. Possível DA – Síndrome demencial, na ausência de outras doenças

neurológicas, psiquiatras ou sistêmicas que possa causar demência. Variações no

curso da apresentação clínicas das deficiências cognitivas sem aparecimento de

comorbidades que possa justifica-las.

C. Diagnóstico definitivo da DA – São os critérios de Provável DA mais as

evidências histopatológicas obtidas por biópsia ou necropsia.

19

Existem grupos de estudos avaliando atualizações para o diagnóstico da

doença, associando os conhecimentos de biomarcadores e de imagem atuais aos

sintomas clínicos (Jack Jr et al, 2011).

Classificação da DA (Brickel, 2006):

A. DA de Aparecimento Precoce: é uma forma rara da doença, que

geralmente acomete pacientes com menos de 65 anos e é encontrada em menos de

10% dos pacientes.

B. DA de Aparecimento Tardio: é a forma mais comum da doença, seus

sintomas usualmente começam a aparecer após os 65 anos de idade. Pode ou não

ter origem genética e é também chamada Doença de Alzheimer esporádica porque

não necessariamente aparece em famílias.

C. DA Familiar (FAD): também é uma forma rara da doença, inteiramente

hereditária e que ocorre em menos de 5% dos indivíduos diagnosticados com a

doença. Geralmente, possuem menos de 40 anos de idade e existe uma história

familiar clara da doença de Alzheimer, tem um aparecimento precoce (Mckhann,

2011).

Existem vários testes validados para o diagnóstico da doença em humanos,

como ADAS-Cg (Alzheimer's Disease Assessment Scale-cognitive); MEEM (Mini

Exame do Estado Mental); CAMDEX (Cambridge Examination for Mental Disorders

of the Elderly); CASI-S (Cognitive Abilities Screening Instrument-short); CERAD

(Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease); WAIS-R (Weschler

Adult Intteligence Scale) (Nitrini et al, 2005).

20

Critérios clínicos

A. Aparecimento insidioso de meses a anos.

B. História de progressão do declínio cognitivo.

C. Apresentação de amnésia evidente. Principalmente a memória

episódica ou apresentação não amnésica com envolvimento inicial de outros

domínios cognitivos como linguagem e funções executivas.

D. Diagnóstico diferencial com outras doenças que possam comprometer

a cognição.

A DA apresenta uma evolução insidiosa e implacável levando a morte em 10 a

15 anos (Jost e Grossberg, 1995). Existe uma atrofia evolutiva na matéria cinzenta

dos pacientes da DA, reflexo da morte neuronal causada pelas alterações micro

estruturais do cérebro do paciente (Raji et al, 2009).

Estudos mostram que um paciente típico de DA é diagnosticado, em média, 32

meses depois do aparecimento de sintomas, com a idade de 75 anos de idade. A

sobrevida média destes pacientes, desde o diagnóstico da doença, é de 8,5 anos

(Jost e Grossberg, 1995).

A DA é uma doença multifatorial, na qual a idade é o fator de risco mais

importante, sugerindo que processos biológicos relacionados ao envelhecimento

possam estar implicados na patogênese da doença. Este fator, o envelhecimento,

pode refletir também o efeito cumulativo de riscos diversos sobre o estilo de vida,

incluindo o efeito de interações complexas da suscetibilidade genética, fatores

psicossociais, fatores biológicos e exposições ambientais ao longo da idade. Existem

fortes evidências epidemiológicas do papel genético, vascular e psicossociais, no

desenvolvimento da doença de Alzheimer (Qiu et al, 2009).

21

Tabela 2: Resumo dos fatores de risco e protetores para doença de Alzheimer por várias hipóteses

epidemiológicas.

Hipóteses etiológicas Fatores de risco e de

proteção Evidências

Epidemiológicas

Suscetibilidade genética Alelo ApoԐ4 e agregação

familiar Forte

Hipótese de reações vasculares

Fatores de risco – hipertensão na meia idade, massa corpórea alta, diabetes, doenças cérebro vasculares e fumo.

Fatores de proteção – consumo de álcool de leve a moderado, e terapia anti-hipertensiva.

Moderada ou suficiente

Hipótese psicossocial

Fatores protetores: educação, atividades mentalmente estimulantes, atividade social e atividade física.

Moderada ou suficiente

Hipótese nutricional e dietética

Fatores de risco: deficiência de folato, vitamina B12, antioxidantes (vitamina A, E e C).

Fatores protetores: Peixe (ômega 3) e consumos de vegetais.

Insuficiente ou limitada

Outros (tóxicos, inflamatórios)

Fatores de risco: Traumatismo craniano, exposição ocupacional às toxinas, campos eletromagnéticos, depressão, terapia de reposição hormonal.

Fatores protetores: drogas anti-inflamatórias não esteroides.

Insuficiente ou limitada

Tabela das hipóteses etiológicas para DA, com seus fatores de risco e proteção os graus de evidências epidemiológicas. A suscetibilidade genética, principalmente do Alelo ApoԐ4, é a maior evidência epidemiológica (Qiu et al, 2009).

Ainda não está completamente estudada a influência genética na DA. Na

doença de Alzheimer de aparecimento precoce, existem 3 genes amplamente

conhecidos relacionados com o aparecimento da doença, cujos portadores têm 50%

de risco de apresentarem a doença. As mutações ocorrem no cromossomo 21 (APP

anormal), 14 (Presenilina1 anormal) e 1 (Presenilina2 Anormal) (Vilatela, 2010).

22

Na doença de Alzheimer de aparecimento tardio, não parece haver uma

mutação apenas, responsável pelo aparecimento de doença. Entretanto, o fator de

risco mais importante estudado, até agora, está relacionado ao gene da

apolipoproteina E no cromossomo 19. APOE (Apolipoproteina E) contém as

instruções para fazer a proteína que ajuda a carrear o colesterol e outros tipos de

gorduras da corrente sanguínea. Os alelos mais frequentes da APOE são APOE ε2,

APOE ε3, and APOE ε4. O alelo APOE ε2 parece ser protetor da doença, o APOE

ε3 é o mais frequente e não conseguiram relacioná-lo com aumento ou diminuição

do risco e o APOE ε4 que está presente em aproximadamente 40% dos pacientes

com DA (Vilatela, 2010).

Acredita-se que haja uma interação epigenética entre fatores genéticos e

ambientais que sejam predisponentes da doença, inclusive originando diferentes

tipos da doença, que poderiam ativar ou não genes que levem à predisposição da

doença (Cacabelos, 2008).

Lesões ultraestruturais básicas da DA

Placas amiloides, acúmulos do peptídeo β-amiloide na parte externa dos

neurônios (Busciglio et al, 1993; Gearing et al, 1993, Masters et al, 1985) e os

emaranhados neuro-fibrilares (ENF), que ficam na parte interna da célula neuronal e

de suas projeções ramificadas, axônios e dendritos (Gorevic et al, 1986, Alonso et al,

1996) são as principais lesões ultraestruturais para a DA.

23

Proteína βAmiloide

É um peptídeo curto, ou fragmento de proteína, isolado e descrito pela primeira

vez em 1984 por George G. Glenner e Caine W. Wong. Esta proteína é derivada de

uma proteína maior chamada de Proteína Precursora de Amiloide (APP) que

consiste de uma proteína com 695-770 aminoácidos, codificada por um gene

localizado no cromossomo 21 (Wong, 1985; Suh, 2002).

As moléculas de APP ancoram-se na membrana celular, com uma parte da

proteína dentro da célula e outra para fora. Essa molécula sofre clivagem proteolítica

por três enzimas diferentes: α, β e γ secretases (Sisodia, 1992; Yamazaki et al,

1996) (Figura 10).

Figura 10: Diagrama esquemático da produção do peptídeo βAmiloide a partir da Proteína Precursora Amiloide (APP)

APP é sequencialmente processada por ao menos 3 proteinases, chamadas α, β e γ-secretases nos domínios luminais e extracelulares. A clivagem pela α-secretase ou β-secretase nestes domínios resulta no desprendimento quase do ectodomínio inteiro para originar derivados APP solúveis, chamados de APPsα e APPsβ respectivamente, e a geração de fragmentos terminais fixos à membrana α ou β- carboxil (CTFs). A principal β-secreatase neuronal é uma aspartil protease transmembrana, chamada BACE1(enzima de clivagem do sítio β da APP) (Yan et al, 1999). Muitas zinco-metaloproteinases incluindo TACE/ADAM17, ADAM9, ADAM10 e MDC-9 e uma aspartil protease BACE2 podem clivar a APP no sítio α-secretase localizado no domínio Aβ, impedindo a geração de Aβ intacta. Seguindo a clivagem extracelular, a γ-secretase processa a APP no terminal carboxil da Aβ, produzindo tanto um produto de 3kDa (p3 em combinação com a α-secretase) ou Aβ (em combinação com a clivagem pela BACE1), respectivamente e o domínio intracelular da APP (AICD). (Yamazaki et al, 1996) A atividade da γ-secretase é primariamente executada por um complexo de alto peso molecular contendo pelo menos presenilina, nicastrina, anterior pharynx

24

defective (APH1) e potenciador da presenilina (PEN2) (Evin et al, 1994). EC – extracelular. TM – Transmembrana. IC - Intracelular. (Zheng, 2006). Tabela 3 – Expressão celular da APPβ, RNAms e proteínas.

Tecido/tipo celular Isoforma da APPβ RNAm Proteína

Baço APP751/770 ++ ND

Timo APP751/770 + ND

Musc. Esq. APP751/770 + ND

Rim APP751/770 +++ ND

Fígado APP751/770 + ND

Pulmão APP751/770 + ND

Intest delg. APP751/770 + ND

Coração APP751/770 ++ ND

Adrenal APP751/770 + ND

Plaquetas APP751 - +++

Cérebro APP695 +++

+++

APP751/770 +++ +++

Células glia APP751/770 ++ ++

Neurônios APP695 +++ +++

Isoformas predominantes da APPβ expressas em uma variedade de tipos celulares em todo o organismo. Expressão de RNAm da APP e suas concentrações e proteínas codificadas identificadas nestes tecidos. ND =- Não determinada. (Matson et al, 1993).

Funções fisológicas da APP em células não neuronais:

A. Atividade mitogênica da APPsα (Roch et al, 1992; 1993).

B. Atividade de quimiotaxia para fagócitos mononucleares (Davis et al, 1992).

Funções fisiológicas da APP nos neurônios:

A. Atividades neurotróficas: Estudos mostram que a βAPP, ou seus metabólitos

podem promover aumento da sobrevivência dos neurônios (Whitson et al, 1989).

25

B. Promover crescimento neurítico e atividade sinapatogênica: Existem

evidências de que a βAPP tem atividades promotoras de crescimento neurítico in

vitro (Milward et al, 1992). Também, existem evidências de que a APPα promove

crescimento neurítico dos neurônios do hipocampo (Clarris et al, 1994).

C. Modulação da excitabilidade neuronal e plasticidade sináptica (Mattson et al,

1993).

D. Proteção contra Excitotoxicidade, danos metabólicos e oxidativos (Mattson et

al, 1993; Schubert et al, 1995).

E. Função de receptor e transdução de sinal – estudos revelam que a sequência

de aminoácidos transmembrana pode agir como receptor de superfície (Kang et al,

1987).

Evidências mostram que Aβ (Peptídeo βAmiloide) deve ter um papel em

controlar a atividade sináptica (Kamenetz et al, 2003) devido à produção dos

fragmentos AICD. Em níveis fisiológicos de expressão, este fragmento provê um

feed back negativo, já que a Aβ deprime a atividade sináptica. Sem essa depressão,

a atividade sináptica poderia se tornar excessiva, levando à excitotoxicidade. Um

papel para o peptídeo Aβ poderia ser o de proteger a atividade sináptica contra a

liberação excessiva de glutamato (Pearson e Peers, 2006).

A hipótese central para a causa da DA é a da cascata amiloide que se baseia

em um desbalanço entre a produção e o clearance de Aβ no cérebro, iniciando o

evento que termina com degeneração neuronal e demência (Figura 14).

A variabilidade no sítio de clivagem da γ-secretase cria muitas formas do

peptídeo Aβ, com comprimentos variando de 39 a 43 aminoácidos (Kang et al,

1987). Entre eles os de 40 resíduos de aminoácidos (Aβ(1-40)) e de 42 aminoácidos

(Aβ(1-42)) são as formas mais comuns (Vigo-Pelfrey et al, 1993; Suzuki et al, 1994).

26

Ambas Aβ(1-40) e Aβ(1-42) estão presentes nas placas amiloides (Saido et al,

1995). O Aβ(1-40) é mais abundante, mas, o Aβ(1-42) é muito mais amiloidogênico,

oligomeriza e forma fibrilas com mais facilidade (Harper e Lansbury, 1997).

27

Figura 11: Mecanismo de formação da placa βAmiloide a partir do peptídeo βAmiloide.

Clivagem da APP no caminho amiloidogênico e não amiloidogênico, clivagens posteriores, mostrando as enzimas e cofatores envolvidos no processo que culmina com a formação das placas amiloides.

28

Reações hipotéticas que levam as proteínas monoméricas de normalmente estruturadas até conjuntos multiméricos como pequenos oligômeros, protofibrilas e fibrilas amiloides. Neste caso, um oligômero βAmiloide assume uma estrutura atípica iniciando o evento. Esta proteína corrompida então impele a formação inadequada do modelo e consequente auto agregação das proteínas endogenamente produzidas. Agregados multiméricos de proteínas podem existir em várias conformações tridimensionais consistindo de vários números de monômeros. Estes monômeros podem retro iniciar a cascata (Walker, 2006). Licença de uso número 3174800288629.

Peptídeos Aβ Individuais, que são produzidos normalmente pelos neurônios, podem se organizar por dois caminhos. Um caminho leva a formação de βfibrilas insolúveis que formam placa. Outro caminho leva aos oligômeros solúveis que são pequenos o suficiente para entrar nas sinapses. Estes oligômeros são, provavelmente, a forma mais tóxica na DA (Schnabel, 2011). Licença de uso 3178260837078.

Figura 12: Formação de Fibrilas Amiloides.

Figura 13: Formação da placa Amiloide

29

Proteína tau

As proteínas tau constituem um grupo de proteínas neuronais que estabilizam

os microtúbulos (Weingarten et al, 1975), em circunstâncias normais. A proteína tau

exerce um papel chave na regulação dinâmica do microtúbulo (Friedhoff et al, 1998),

do transporte axonal (Spittaels et al, 2000) e do crescimento neurítico (Biernat e

Mandelkow, 1999). Todas as funções da tau são moduladas por fosforilação em

sítios específicos (Hirokawa, 1994). Cada isoforma da proteína tau é fosforilada em

um sítio diferente, sob condições fisiológicas (Ávila et al, 2004).

Os emaranhados neurofibrilares (ENF) de proteínas tau são a segunda

característica histopatológica da Doença de Alzheimer. Ocorrem intracelularmente

ao neurônio, enquanto que os depósitos de peptídeo Aβ (ou placas senis) são

extracelulares.

Na Doença de Alzheimer a formação dos filamentos helicoidais pareados

(FHP) parece não se dever a mutações no gene da proteína tau, mas a uma cascata

disparada pelo peptídeo Aβ que resulta na hiperfosforilação da proteína tau (Geula

et al, 1998).

Os FHP são filamentos intracelulares compostos em sua maior parte por

proteína tau associada ao microtúbulo em um estado hiperfosforilado anormal (Brion

et al, 1991).

30

Fosforilação fisiológica: essencial para o crescimento neuronal, transporte axonal e dinâmica do microtúbulo. Fosforilação patológica ou hiperfosforilação: Leva à formação de filamentos de proteína tau – emaranhados – que leva a uma disfunção dos microtúbulos e finalmente à morte celular. Fonte: Johnson et al, 2004.

Fisiológico Patológico

Crescimento neurítico Formação de

filamentos de tau.

Transporte axonal

Disfunção do microtúbulo

Dinâmica do microtúbulo

Morte celular

Fosforiação

de tau.

Figura 14: Fosforilação normal e patológica da proteína tau

31

Figura 15: Mecanismo de formação dos filamentos helicoidais pareados

32

O acúmulo gradual dos ENF formados como resultado da hiperfosforilação

anormal da proteína do citoesqueleto tau, a deposição de proteína β-Amiloide em

placas senis, e a morte neuronal maciça; representam, como vimos anteriormente,

as características histopatológicas mais características da DA (Hardy, 2002). Estas

alterações são evidentes em áreas vulneráveis específicas do cérebro e uma das

primeiras áreas atingidas é o hipocampo (Braak, 1993).

GSK-3

Glicogênio Sintase Kinase-3 (GSK-3) é uma enzima regulatória, altamente

expressa em todo o organismo e em grande quantidade no cérebro, especialmente

no hipocampo. Está envolvida na fosforilação de numerosos substratos (Figura 20 e

21) e regula diversos processos fisiológicos como o metabolismo de glicogênio, a

expressão gênica, a apoptose, a transdução de sinal, e a especificação do destino

celular através do estímulo de neurotrofinas (Haar et al, 2001) e participação das

reações da proteína Wnt. Atua na sinalização metabólica, em proteínas estruturais

como as proteínas tau e nos fatores de transcrição (Martinez et al, 2006).

Existem duas isoformas de GSK-3 que são altamente expressas no cérebro, a

GSK-3α de aproximadamente 51kDa e a GSK-3β de 47 kDa (Liang e Chuang,

2006). Elas têm um alto grau de homologia em seus domínios cinases, mas

divergem em seus terminais N e C. Ambas as isoformas são constitutivamente

fosforiladas em Tirosina no domínio cinase e sua fosforilação é necessária para sua

ativação (Cohen e Frame, 2001). A GSK-3 é rapidamente fosforilada em serina 21

na GSK-3α e serina 9, no N-terminal, na GSK-3β, resultando na inibição da atividade

cinase (Stambolic e Woodgett, 1994).

33

Figura 16: Mecanismo molecular pelo qual a fosforilação inibe a GSK-3

A GSK-3 é constitutivamente ativada. Substratos que tenham sofrido uma fosforilação prévia se liga a uma bolsa específica, se alinhando de tal forma que a GSK-3 possa fosforilar a serina ou treonina localizada quatro resíduos aminoterminais ao fosfato inicial. Após a estimulação agonista, a GSK-3 se torna fosforilada no resíduo de serina próximo ao seu terminal amina, que é a serina 21 (Ser 21) na GSK3α e Ser9 na GSK3-β. Isto transforma o terminal amina em um pseudo substrato inibidor, a fosfoserina ocupando o mesmo sítio ligante do fosfato inicial do substrato, e bloqueando o acesso ao sítio ativo. A GSK-3 não fosforila seu próprio sítio terminal amina, porque o resíduo 17 na GSK-3α e resíduo 5 na GSK-3β não são serina ou treonina. Como resultado da fosforilação pela PKB/AKT, a atividade da GSK-3 é inibida, e seus substratos são então desfosforilados por fosfatases de proteínas. O fosfato inicial tende a ser relativamente resistente à desfosforilação, as proteína cinases que fosforilam esses sítios frequentemente não são reguladas por sinais extra celulares. Então, os substratos continuam inicialmente fosforilados e disponíveis para a fosforilação pela GSK-3 quando ela se torna reativada depois que a estimulação agonista cessa. R96 = Arginina 96. R180 = Arginina 180. K205 = Lisina 205. São resíduos chaves envolvidos na ligação do fosfato inicial e do terminal amina fosforilado. PKN/AKT = proteína cinase B (Cohen e Frame,2001). Autorização 3176041001454

34

Figura 17: GSK-3 na fosforilação dos fatores de transcrição.

35

Figura 18: GSK-3 na fosforilação das proteínas estruturais.

36

Lítio

O papel neuroprotetor do lítio (Li) foi confirmado em vários estudos. Foi

comprovado que pacientes bipolares em uso de lítio apresentavam menor

prevalência da Doença de Alzheimer (Nunes et al, 2006) e, possivelmente, o lítio em

doses terapêuticas, usado no Transtorno Bipolar, pode ser uma poderosa arma para

o tratamento da Doença de Alzheimer (Mendes et al, 2009).

O lítio protege os neurônios hipocampais da apoptose causada pela irradiação

dos cérebros em camundongos (Yazlovitskaya et al, 2006) e reduz o stress

oxidativo, especialmente via sistema da glutationa (Machado-Vieira et al, 2007). Na

doença bipolar, o lítio evitou a perda de matéria cinzenta cortical que ocorre como

parte da cascata neurodegenerativa desta doença (Serap et al, 2005).

As células-tronco neurais e células progenitoras respondem positivamente ao

tratamento com lítio em condições basais (Chen, 2000) e em modelos de danos

cerebral (Yan et al, 2007).

Foi identificada a proteção do lítio contra a excitotoxicidade do influxo de Cálcio

pela ação do receptor NMDA (Nonaka et al, 1998). Uma das principais ações

neuroprotetoras do lítio se dá através da inibição da enzima GSK3β e GSK3α.

Em condições basais, não estimuladas, a GSK-3, uma enzima com as

isoformas α e β que é pró-apoptótica e parece ser um grande regulador da

inflamação, é considerada constitutivamente ativa (Beurel et al, 2010). A disfunção

dessa enzima tem sido relacionada com doenças de humor, principalmente a

doença bipolar, Diabetes, câncer, doenças inflamatórias e autoimunes e doenças

neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (Jope et al, 2007). As ações

neurogênicas, neurotróficas, neuroprotetoras e anti-inflamatórias do lítio se devem,

37

em parte, a sua habilidade em inibir a atividade da GSK-3 (Rowe e Chuang, 2004;

Beurel et al, 2010).

O lítio atravessa a membrana celular com facilidade, através dos canais de

sódio, o que leva a uma distribuição ubíqua, com grande atuação intracelular

(Schloesser et al, 2012). No meio intracelular ele irá competir com o magnésio no

sítio de atuação na das enzimas, provavelmente por possuir o mesmo raio iônico

deste íon, sendo o do lítio de 0,065 nm e do magnésio de 0,06 nm (Beaulieu et al,

2008); isto Inibe a formação de complexos da enzima com proteínas a serem

fosforiladas (Martinez et al, 2006).

Ao atravessar a membrana e passar com facilidade para o meio intracelular o

lítio tem também grande facilidade para fosforilar a enzima GSK-3β em seu sítio

inibitório (Serina 9) e GSK3α (Serina 21), o que amplifica a ação inibitória do lítio na

enzima GSK3 (Martinez et al, 2006).

Existe um grande número de mecanismos que contribuem para este efeito

inibitório, incluindo a ativação de PKA dependente de AMPc (Jope, 1999), a ativação

de PKC dependente de Fosfatidil Inositol Cinase 3 (PI3K) (Lenox et al, 1998;

Kirshenboim et al, 2004) e PKB/AKT (Chalecka-Franaszek e Chuan, 1999) e a

autoregulação envolvendo a atividade do complexo inibidor que aumenta a inibição

das proteína-fosfatases (Zhang et al, 2003).

Outro mecanismo neuroprotetor é o aumento da Enolase, uma enzima

antioxidante com o uso de lítio (Machado-Vieira et al, 2007).

O fator de transcrição β-Catenina é um substrato da GSK-3 e é parte dos

mecanismos de ação da Wingless (Wnt). Seu nível citoplasmático é regulado

negativamente pela GSK-3 constitutivamente ativa. Depois de ser fosforilada a β-

Catenina sofre degradação pelo proteossoma (Jope et al, 2004). O aumento no

38

acúmulo citoplasmático da β-Catenina facilita sua translocação até o núcleo,

aumenta os fatores de transcrição dos fatores de crescimento (Sinha et al, 2007;

Silva et al, 2005), e aumenta os genes envolvidos na inibição apoptótica (Huelsken e

Behrens, 2002). Estes mecanismos de ação são muito importantes no papel

neuroprotetor do lítio.

Figura 19: Resumo dos efeitos neuroprotetores do lítio.

As linhas com setas sólidas representam as conexões estimulatórias; as linhas com fins em pontos representam as conexões inibitórias. As reações químicas com atividade reduzida como resultados do tratamento com lítio estão representadas por linhas pontilhadas. A interação do Lítio com a maquinaria de sobrevivência/apoptose da célula ocorre em 3 pontos: indiretamente no fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e receptores NMDA, e diretamente através da GSK3β.

A) O lítio induz o BDNF, que em troca ativa a (Cinase B relacionada à Tropomiosina) TrkB e as reações químicas secundárias PI3K/Akt e MEK/ERK. Ambas fortemente associadas com efeitos neuroprotetores. As reações PI3/Akt inibem o nível e/ou a atividade da GSK-3β.

B) Segundo, o lítio é um grande fator estimulador de um grande número de fatores antiapoptóticos, incluindo CREB, HSF-1, NF-Iβ e a βCatenina, por remover sua inibição pela GSK3β.

C) Terceiro, o lítio modula o influxo de Cálcio induzido pelo receptor NMDA. O stress do Influxo de Cálcio nas células ativa as reações MAPK, incluindo os fatores pró apoptóticos p38 e JNK. O lítio, inibindo o influxo do Cálcio, suprime estes fatores pró apoptóticos. Juntas estas mudanças

39

trocam a relação dos membros da família Bcl2, por mecanismos antiapoptóticos da inibição da liberação do citocromo c e inibe a ativação das caspases.

D) O lítio atua diretamente na GSK3β, competindo com o Magnésio ou ativando proteínas inibitórias como PKB, PKA e PKC.

Abreviações: AP-1(Proteína Ativadora 1); BDNF (Fator neurotrófico derivado DO Cérebro); CREB (proteína ligadora do elemento de resposta ao AMP cíclico); ERK (cinase regulada por sinal extracelular); GSK3β (glicogênio Sintase Quinase 3β)HSF1 (Heat Shock Factor); JNK (cinase c-Jun terminal); MAPK (proteína cinase ativada por mitógeno); MEK (proteína cinase ativada por mitógeno); NMDA (N-Metil-D-Aspartato); PI3K/Akt (fosfatidil Inositol 3 cinase/ Proteína cinase B); RSK (cinase Ribossomal S6); TrkB (Receptor tirosina cinase B) (Rowe et al, 2004). Autorização 3178350470882.

O uso do lítio por 4 semanas aumentou o conteúdo de matéria cinzenta (Moore

et al, 2000) e volume do hipocampo (Folland et al, 2008) em humanos. Entretanto, o

lítio nas doses ponderais pode ser tóxico, principalmente para os pacientes idosos

(Sanches et al, 2000), o que limitaria seu uso na Doença de Alzheimer. Daí nosso

interesse no estudo da eficácia deste mineral em microdoses no tratamento de

pacientes portadores da doença.

Toxicidade do Lítio

As manifestações clínicas mais comuns da toxicidade pelo lítio é a alteração do

estado mental (Okusa e Crystal, 1994). Pode haver sintomas gástricos, incluindo

náusea, vômito, diarréia e dor epigástrica (Okusa e Crystal, 1994). Existem

evidências de que o lítio inibe a adenilciclase tireo estimulante hormônio sensível

possivelmente levando a um hipotireoidismo.

A neurotoxicidade do lítio pode levar a sequelas neurológicas reversíveis como

lesão cerebelar, demência, Pakinsonismo, coreoatetose, síndromes do tronco

cerebral e neuropatias periféricas (Netto e Phutane, 2012) e irreversíveis como

Síndrome cerebelar persistente, Síndromes extrapiramidais persistentes, disfunção

40

persistente do tronco cerebral, demências com vários graus de síndromes orgânicas

mentais (Manshi e Thampi, 2005).

Os efeitos renais adversos do lítio incluem Diabetes Insipidus nefrogênico,

acidose metabólica, nefropatia crônica e hipercalcemia. Diabetes Insipidus

Nefrogênica e a acidose metabólica tende a ocorrer semanas ou meses após o início

do uso do lítio, a nefropatia crônica e a hipercalcemia costumam aparecer após anos

do uso do lítio (Bendz et al, 1996).

Existem evidências de que a célula principal do ducto coletor é o alvo principal

dos efeitos nefrotóxicos do lítio e que estes efeitos estão caracterizados por

desregulação do aquaporin 2 (Marples et al, 1995). O lítio entra via canal epitelial de

sódio (CES) na membrana apical e leva a inibição das reações de sinalização que

envolvem a GSK-3β (Slater, 1984).

O lítio deve ser ministrado com atenção em populações especiais, como

gestantes, crianças, pacientes com comorbidades cardiovasculares, alterações

endócrinas, dermatológicas, pulmonares e renais. Também em pacientes idosos

(Mohandas e Rajmohan, 2007).

Indivíduos idosos requerem menores doses de lítio para adquirir concentrações

séricas similares do que as de adultos jovens. Pacientes idosos com a idade entre

70 e 79 anos necessitam doses 31% menores que os de menos de 50 anos de

idade (Slater et al, 1984).

A biodisponibilidade do lítio não deve ser diferente em idosos, comparados com

adultos jovens, já que o lítio não está sujeito à primeira passagem (Sproule et al,

2000). A distribuição do lítio em idosos é influenciada por modificações fisiológicas

relacionadas à composição corporal, particularmente à água corporal total. Existe

uma diminuição da água corporal total com a idade, que resulta em um menor

41

volume de água por quilograma de peso. Portanto, a mesma dose de lítio em idosos

poderia ter menos água para que o lítio se distribuísse, resultando em concentrações

séricas maiores (Novak, 1972).

A desidratação nos idosos devida à deficiência no mecanismo da sede e da

ingestão de água também aumenta o nível sérico de lítio (Finley et al, 1995).

Existe também o declínio da taxa de filtração glomerular com a idade

resultando numa queda do clearance ou filtração do lítio e um aumento do nível

sérico do metal (Sproule et al, 2000). A associação com outras drogas utilizadas por

idosos pode ser outro fator interferente (Timmer e Sands, 1999).

O lítio, em microdoses, já é utilizado para tratamento de pacientes com

depressão na França (Abou-Saleh e Coppen, 1989) e com eficácia comprovada

nessas doses baixas (Allain et al, 1994). Mais recentemente foi demonstrada a ação

do lítio em baixas doses em doença de Huntington (Poulladi et al, 2012).

Resultados recentes do nosso grupo demonstraram que o tratamento com lítio,

em microdoses, foi eficiente em impedir o declínio cognitivo de pacientes com

diagnóstico clínico para a doença de Alzheimer (Nunes et al, 2013). Nessa pesquisa,

acompanhamos 115 pacientes do Ambulatório de Alzheimer do Hospital Geriátrico e

de Convalescentes, Dom Pedro II da Irmandade de Misericórdia da Santa Casa de

São Paulo por um período de 15 meses. Os pacientes foram separados, de forma

randomizada, em dois grupos. Tratados com lítio na dose de 0,240 mg ao dia e não

tratados. Os resultados obtidos nos permitiram observar que o lítio, em microdose,

preservou a memória desse grupo de pacientes portadores de DA e que esse efeito

pareceu ser mais expressivo em pacientes acima de 70 anos de idade (Nunes et al,

2013).

42

Este papel neuroprotetor foi o que nos incentivou a identificar em nosso modelo

a ação do lítio, em microdoses.

BDNF

Neurotrofinas são famílias de proteínas que são essenciais para o

desenvolvimento, diferenciação e sobrevivência dos neurônios. O BDNF é a

neurotrofina mais distribuída pelo SNC (Tapia-Arancibia et al, 2008). Ele exerce um

papel muito importante na regulação do crescimento axonal e dendrítico, na LTP e

na liberação de neurotransmissores (Chao, 2003). Além desse efeito local na função

sináptica, o BDNF está implicado no controle da transcrição (NFκβ e JNK, pela

interação com os receptores p75 de neurotrofinas), ativação das cascatas de

sinalização celular, incluindo Ras/MAPK, PI3K, Akt, PLC; pela ativação da TrKB,

com estimulação da neurogênese e proliferação neuronal (Reichardt, 2006).

Esses efeitos implicam na ação do BDNF em vários processos do SNC,

incluindo plasticidade sináptica, diferenciação e sobrevivência neuronal,

neuroproteção, resiliência neuronal e recuperação contra vários danos celulares (Hu

e Russek, 2008).

Estudos post mortem têm documentado que há uma queda nos níveis de

BDNF e RNA mensageiro de BDNF (BDNF mRNA) nos cérebros de pacientes

diagnosticados com DA e Comprometimento Cognitivo Leve (MCI) (Peng et al,

2005). Tem sido sugerido que níveis séricos de BDNF também estão diminuídos

(Yasutake et al, 2006).

O BDNF, no SNC, aparece em grande concentração no hipocampo, córtex

cerebral e amígdala (Murer et al., 2001), regiões que são extensamente afetadas

43

pela deposição das placas amiloides e filamentos helicoidais pareados (Arnold et al,

1991).

Já é conhecido o efeito do lítio, aumentando o nível de BDNF no cérebro de

pacientes com DA (Leyhe et al, 2009). Existem pesquisas mostrando a eficácia do

lítio em baixas doses e inclusive mostrando que doses de 6.1mg/L de água em

pacientes foi suficiente para elevar os níveis séricos de BDNF (Shiotsuki et al, 2008).

Densidade de corpos neuronais

A perda neuronal é um fator comum para um grande número de processos

degenerativos na DA (van de Pol et al, 2006; Spires et al, 2006) e, como visto

anteriormente pode ser desencadeada por vários fatores como placas βAmiloides,

alterações da regulação do cálcio, isquemia, processos inflamatórios, stress

oxidadtivo, etc (Baloyannis, 2006; Padurariu et al, 2010; Ciobica et al, 2011).

A descoberta da produção de novos neurônios no DG do hipocampo e na

parte anterior da zona subventricular em adultos de várias espécies, inclusive

humanos introduziu a possibilidade de uma nova forma de plasticidade que pode

sustentar os processos de memória. Foi verificado que o estímulo da neurogênese

do hipocampo adulto melhora a memória espacial (Stone, 2011). Ao contrário, o

prejuízo da neurogênese pode levar às deficiências cognitivas associadas com

envelhecimento e doenças como a DA (Lazarov, 2010).

Evidências mostram que as alterações na neurogênese hipocampal, ocorrem

antes mesmo do aparecimento das lesões características da DA e da morte neuronal

(Lazarov e Marr, 2010).

44

No cérebro de mamíferos, a neurogênese ocorre, principalmente, em duas

áreas: DG do hipocampo e parte anterior da zona subventricular (Eriksson et al.

1998; Curtis et al. 2007). No DG, os neurônios recém-formados na zona subgranular

(SGZ) migram para a camada granular, onde se diferenciam em células granulares e

estendem projeções axonais para a região CA3 (Cameron et al, 1993).

A neurogênese no hipocampo adulto é modulada por drogas utilizadas para o

tratamento de DA e depressão e, também, é modulada em cérebros de modelos

animais de doenças neurológicas, como DA, epilepsia, Huntington, etc (Galvan e Jin,

2007).

A marcação dos corpos neuronais (soma) de neurônios adultos, é feita

utilizando a marcação da proteína nuclear Neuronal (NeuN) que é um marcador

precoce de diferenciação neuronal, específico para neurônios, fundamentalmente,

expresso nos núcleos neuronais (Mullen, 1992).

Sinaptofisina

A disposição de peptídeo Aβ solúvel pode causar problemas cognitivos por

prejuízo da função sináptica, mesmo na ausência de neurodegeneração significativa.

Muitos mecanismos celulares são responsáveis por essa alteração sináptica, como o

papel tóxico do peptídeo resultante da autoassociação que permite a associação

com novas estruturas capazes de levar ao prejuízo da sinapse. Existe ainda o

prejuízo do papel fisiológico do Aβ (Marcello et al, 2012).

O acúmulo de oligômeros de proteínas tau hiperfosforiladas nas sinapses de

pacientes de doença de Alzheimer também está associado com o aumento da

45

disfunção sinaptica, provavelmente, devido a uma disfunção do sistema da

ubiquitina-proteossomab (Tai et al, 2012).

As terminações nervosas dos neurônios são repletas de pequenas vesículas,

que são organelas secretórias especializadas, envolvidas no armazenamento e

liberação de neurotransmissores (Couteaux, 1974).

Sinapsinas são uma família de fosfoproteínas, especialmente associada com

a superfície citoplasmática das membranas das vesículas sinápticas (Huttner et al,

1983). Em vertebrados, elas são codificadas por três genes distintos (sinapsina I,

sinapsina II e sinapsina III) (Südhof et al, 1989).

A Sinaptofisina (proteína p38) é uma glicoproteína intrínseca transmembrana

também das vesículas pré-sinapticas (Jahn et al, 1985). Tem como função a

regulação, de pelo menos duas fases, da endocitose das vesículas pré-sinapticas,

para garantir sua disponibilidade durante e depois da atividade neuronal sustentada

(Kwon e Chapman, 2011). É uma das proteínas de vesícula sináptica mais

abundante, aproximadamente, 7% dessas proteínas, formam complexos

mutiméricos, originando canais na membrana bilipídica, sugerindo um papel na

fusão e exocitose.

A sinaptofisina também interage com outras proteínas da membrana da

vesícula regulando o nível de fusão entre as vesículas e a membrana plasmática

(Valtorta t al, 2004). Tem sido usada como um valioso marcador para estudar a

distribuição de sinapses no cérebro e descobrir as características básicas do ciclo de

vida das vesículas sinapticas (Valtorta et al, 2004).

46

Objetivos

Considerando os fatores acima descritos, nosso estudo tem como objetivos:

Geral

Avaliar o papel do lítio em microdoses na prevenção da Doença de Alzheimer e no

envelhecimento.

Específicos

1) Avaliar as modificações comportamentais decorrentes do tratamento.

2) Avaliar a neuroproteção do lítio nesses animais.

3) Avaliar possíveis alterações moleculares decorrentes do tratamento

com o lítio.

4) Correlacionar os dados obtidos.

47

Material e Métodos

Delineamento experimental

Os animais genotipados por PCR para transgenia APPSwInd foram divididos

em grupos de animais transgênicos e não transgênicos que foram tratados com

água ou lítio. Um grupo de animais foi tratado desde os 2 meses de idade (TG Li2 e

WT Li2) e o outro tratado desde os 10 meses de idade (TG Li10 e WT Li10) e dois

grupos controle não tratados (TG Ctr e WT Ctr).

Aos 6 meses de idade estes animais foram todos submetidos à avaliação de

mobilidade em caixa de atividade motora e de memória espacial no Labirinto

Terrestre de Barnes. O teste de memória espacial foi repetido a cada 3 meses.

Aos 18 meses todos os grupos foram submetidos novamente aos testes de

mobilidade e Memória Espacial e à avaliação de Ansiedade no Labirinto em Cruz

Elevado, de comportamento Compulsivo pelo teste de Marble. A memória aversiva

foi avaliada na Esquiva Inibitória.

Após a realização dos testes finais os animais foram eutanasiados e seus

cérebros extraídos para análise de plasticidade neuronal e sináptica, deposição de

placas amiloidais e proporção de GSK-3β fosforilada e de BDNF.

48

Figura 20: Delineamento Experimental.

Legenda – Durante a pesquisa os animais foram tratados com o lítio aos 2 e 6 meses de idade e comparados com animais não tratados. Testes realizados aos 6, 9, 12, 15 e 18 meses. AM (Atividade Motora), LB (Labirinto de Barnes), LCE (Labirinto em Cruz Elevado), EI (Esquiva Inibitória). A seta vermelha mostra o início do tratamento com lítio.

Animais

Escolhemos utilizar camundongos transgênicos hemizigóticos (B6.Cg-Tg

(PDGFB-APPSwInd)), que expressam uma forma mutante da proteína precursora

amiloide, transportando as mutações “Swedish” (K670N/M671L) e a “Indiana”

(V717F). Como controles foram utilizados animais da mesma ninhada nascidos sem

a inserção transgênica. Essa linhagem é derivada de camundongos C57Bl/6J. Os

animais foram criados no biotério do Departamento de Ciências Fisiológicas da

Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, a partir de matrizes

importadas do “The Jackson Laboratories”, EUA (modelo 06293). (Mucke et al,

2000).

49

Entre 5 e 7 meses de idade esses animais apresentam deposição difusa de

peptídeos beta amiloides no giro dentado e neocórtex. A deposição amiloide é

progressiva, com os animais exibindo placas entre 8 e 10 meses (Mucke et al, 2000).

Esse modelo apresenta o fenótipo com poucos meses de vida, o suficiente

para que possamos acompanhar o processo de envelhecimento destes animais (Karl

et al, 2012).

Os animais foram genotipados em nosso próprio laboratório baseado no

protocolo descrito pelo Jackson Laboratory.

Tratamento

O papel neuroprotetor do lítio foi confirmado em vários estudos (Mendes et al,

2009). Resultados recentes do nosso grupo demonstraram que o tratamento com

lítio em microdoses foi eficiente em impedir o declínio cognitivo de pacientes com

diagnóstico clínico para a doença de Alzheimer (Nunes et al, 2013).

Entretanto, o lítio nas doses ponderais pode ser tóxico, principalmente para os

pacientes idosos (Sanches et al, 2000), o que limitaria seu uso na Doença de

Alzheimer. Daí nosso interesse no estudo da eficácia deste mineral em microdoses

no tratamento de pacientes portadores da doença.

Este papel neuroprotetor, e a maior segurança da dose, foi o que nos

incentivou a identificar em nosso modelo a ação do lítio em microdoses.

A administração do lítio foi feita através da ingestão ad libidum de água e para

o cálculo da concentração do lítio na água dos animais, acompanhamos por 8

semanas a ingestão de água de animais de nosso biotério. Os animais estavam

acondicionados em seis caixas. A água era pesada 1 vez por semana e o peso total

50

dividido pelo número de animais dentro da caixa e pelos 7 dias da semana. Os

dados foram analisados pela análise das médias das estatísticas das colunas pelo

Software GraphPad 5. Verificamos também a perda de água pela troca e colocação

do bebedouro da caixa, e houve uma perda desprezível de 2 a 5 ml por semana.

O lítio foi administrado na forma de Carbonato de Lítio, na dose proporcional à

dose administrada em humanos na pesquisa anterior, ajustada para o índice de

distribuição em camundongos que foi de 1,2 mg do Carbonato de Lítio/kg/dia que

corresponde a 0,006mEq li/Kg. Essa dose foi ajustada para o camundongo que tem

uma farmacocinética diferente para o lítio em relação aos humanos (Rouaud et al,

1993; Wood et al, 1986). Os animais foram divididos em três grupos experimentais

vezes duas linhagens (Transgênico e não transgênico). Os grupos são: controle;

tratado com lítio a partir dos 2 meses de idade (Li2) e; tratado com lítio a partir dos

10 meses de idade (Li10). Cada grupo foi composto por 8 animais. Os animais foram

tratados até os 18 meses de idade.

Em humanos utilizamos 1,5mg por dia. Ao cálculo médio de 1,5mg/70Kg ou

0,02mg/Kg que é igual a 0,004 mg de lítio metal/kg ou 0,0006mEq/kg. O índice de

correção para camundongo (Wood et al, 1986) é multiplicar por 10 a dose em

humanos, o que corresponde a 0,2mg/kg ou 0,00075 mEq ou 0,005mg por dia para

um camundongo de 25 gramas. Acompanhamos seis grupos de animais por 8

semanas antes do início da pesquisa a fim de calcularmos a quantidade de água

ingerida por cada animal em nosso biotério (média de 6.04 ± 1,14), portanto a

concentração final foi de 1µg de Carbonato de Lítio por ml de água.

A ingestão de água foi medida a cada semana e calculada dividindo o volume

total ingerido por caixa, dividido pelo número de animais na caixa. Os animais

51

mantiveram, aproximadamente, a ingestão utilizada para o cálculo da dose do lítio a

ser administrada.

Testes Comportamentais

Avaliação da atividade motora

A avaliação da atividade Motora foi realizada em Caixa de Atividade Motora

Hugo Basili 7420, que consiste de um cubículo de Perspex claro e transparente um

bloco gravando a atividade motora horizontal e outro a atividade motora vertical,

impressa via Impressora multifuncional 2600.

Os dados obtidos foram analisados por Análise de Variância de duas vias

ANOVA (ANOVA), pós-teste de Bonferroni, pelo Software StatSoft Statistic versão

7.0.

Avaliação do comportamento de ansiedade

Para avaliarmos o comportamento de ansiedade realizamos o teste do

Labirinto em Cruz elevado. Este labirinto consiste de dois braços abertos opostos

com 50X10 cm, cruzados com dois braços fechados com as mesmas dimensões

com paredes de 40cm de altura. Os braços são conectados com um quadrado

central de 10cmX10cm que dão uma aparência de cruz ao labirinto. O labirinto é

mantido a 50cm acima do chão.

O labirinto em cruz elevado tem sido descrito como um método simples para

avaliar respostas de ansiedade de roedores (File, 1993).

52

Foi, inicialmente, desenvolvido como um labirinto em Y com um braço elevado

aberto e dois braços fechados, o que leva a um forte conflito entre se aproximar e

evitar (Belzung e Griebel, 2001). Esta tarefa foi modificada para um labirinto elevado

com quatro braços (2 abertos e 2 fechados) que são organizados em forma de cruz

(Handley e Mithani, 1984).

Os parâmetros de interesse avaliados foram tempo de permanência no braço

aberto, tempo de permanência no braço fechado e número de entradas em cada

área (aberta ou fechada). O teste foi filmado e analisado pelo SMART (versão 1) da

Polyvalent Video-Tracking System da Panlab Harvard Apparatus.

Os dados obtidos foram tempo de permanência no braço aberto/tempo total do

experimento, tempo de permanência no braço fechado/tempo total do experimento,

número de entradas no braço aberto/ número total de entradas e número de

entradas no braço fechado/número total de entradas.



7.0.

Avaliação do Comportamento Compulsivo

Para avaliação do comportamento compulsivo utilizamos o teste de Marble-

Burying/Digging que se baseia no comportamento inato de enterrar dos roedores,

utilizando o focinho e as patas dianteiras (Pinel et al, 1989).

Deixamos os animais, em suas próprias gaiolas, ambientando na sala do

experimento por 1 hora. Em gaiolas limpas, com 27X16,6X12,5 cm, forramos com 4

a 5 cm de maravalha (aparas de madeira, próprias para forração). Colocamos 1

animal por gaiola e os deixamos ambientar por meia hora com o contexto.

53

Retiramos o animal e cobrimos a maravalha com 20 bolinhas de gude (15 mm

de diâmetro) equidistantes em um arranjo de 4X5. Colocamos a seguir o animal e o

deixamos por meia hora. Após este tempo retiramos o animal e contamos as

bolinhas enterradas, com mais de 50% enterrada. Em seguida retornamos os

animais para a gaiola e contamos o tempo que o animal escava a maravalha.

Os dois dados de interesse, bolinhas enterradas e tempo de escavação foram

analisados pelo Teste de Análise de Variância de Uma Via (One Way ANOVA) e

Análise das estatísticas de colunas, do Software GraphPad 5.

Avaliação da memória espacial

Para o estudo da memória e aprendizado espacial dos animais, optamos pelo

Labirinto Terrestre de Barnes que se mostra uma ferramenta apropriada e de

característica pouco aversiva para esta avaliação (Pompl et al, 1999). O teste

também se mostra mais apropriado para o acompanhamento dos animais ao longo

do envelhecimento, por não envolver a necessidade de nadar.

O labirinto Terrestre de Barnes foi desenvolvido por Carol Barnes em 1979,

como alternativa ao Labirinto aquático de Morris. A princípio, utilizado para ratos,

tendo sido adaptado para camundongos (Pompl et al, 1999).

O protocolo foi realizado a cada 3 meses, iniciando aos 6 meses de idade até

os 18 meses, quando os animais foram sacrificados para avaliação da plasticidade

neuronal.

O animal colocado na plataforma iluminada, com o ventilador ligado, teve até 5

minutos para encontrar a caixa de escape. Quando não a encontrava

espontaneamente, era conduzido até o buraco acima dela. Ao adentrar na caixa,

esta era coberta por uma tampa escura, as luzes eram apagadas e ele permaneceria

54

nesta caixa por 1 minuto no escuro. Após 1 minuto ele era retirado e levado para sua

gaiola de armazenamento. Este protocolo foi repetido duas vezes ao dia, com

intervalo de 4 horas, no mínimo, durante 5 dias seguidos. Aos seis meses, no início

dos testes o protocolo foi repetido 7 dias após o último protocolo.

O labirinto de Barnes permite avaliar a memória espacial e o aprendizado da

tarefa. “Aprendizado é o processo pelo qual nós adquirimos o conhecimento sobre o

mundo e a memória é o processo pelo qual estes conhecimentos são codificados,

armazenados e recuperados.” (Kandel et al, 2000).

No labirinto de Barnes, aprendizado é medido pela diminuição da latência a

cada execução da tarefa de encontrar a caixa de escape a cada teste a cada dia.

Memória é medida pela diminuição desta latência quando a tarefa for executada

mais de 24 horas após a execução anterior.

Os parâmetros de interesse foram o tempo e o número de erros ao encontrar a

caixa de escape, chamados de Tempo1 e Erro1. Tempo inicial (Tempo 1) é a

latência do animal para encontrar a caixa de escape e Erro inicial (Erro 1) é o

número de vezes que o animal introduz a cabeça até o nível das orelhas nos

buracos que não contêm a caixa de escape.

Analisamos os Tempo1e Erro1 da manhã do dia inicial do primeiro teste (6

meses de idade), o tempo 1 da manhã do Dia 6 (7 dias após o quinto dia do primeiro

teste) e o Tempo1 da manhã do primeiro dia dos testes realizados aos 9, 12, 15 e 18

meses.

Utilizamos ainda o labirinto terrestre de Barnes para avaliarmos a distância

percorrida pelos animais durante o tempo do experimento e o tempo de permanência

nop quadrante da caixa de escape.Estes testes foram filmados com uma

55

videocâmera JVC Everio e analisados com Smart Software, version 2.5.21, Panlab

Hervard Apparatus.



7.0.

Avaliação da memória aversiva

Para a avaliação da memória aversiva ou de medo, utilizamos o teste da

Esquiva Inibitória. A resposta do medo condicionado clássico é uma forma básica de

memória não declarativa (não consciente) que mede tanto as respostas normais

quanto patológicas a um estímulo aversivo (Rescorla, 1988).

Aos 18 meses de idade no dia anterior ao sacrifício, realizamos a avaliação da

memória aversiva através da caixa de esquiva inibitória.

No dia do treino, um animal foi colocado na metade esquerda aberta e bem

iluminada e explora este lugar por 2 segundos, depois do qual a porta guilhotina

entre as metades se abre. Um segundo após o camundongo entrar no lado escuro

da caixa a porta se fecha, e o animal recebeu um leve estímulo elétrico nas patas de

0,5mA com 2 segundos de duração. Depois de 30 segundos o animal é recolocado

em sua gaiola, chamamos de treino ao protocolo deste dia. Após 24 horas o teste foi

repetido, apenas que neste dia o animal não recebeu o choque, chamamos de Teste

este segundo dia. A variável de interesse nesta tarefa foi a diferença das latências

para entrar na câmara escura no primeiro versus o segundo dia. O protocolo foi

desenvolvido de forma que o animal deve estar inteiramente no lado escuro por um

segundo para que a porta se feche e somente após o fechamento da porta o animal

receba o choque. Animais que não entraram no lado escuro foram registrados com

56

uma latência de 298 segundos, já que a eles foi permitido permanecer 5 minutos na

câmara clara até que o teste termine.

Análises Estereológicas

Estereologia é o estudo das distribuições tridimensionais dos objetos de seções

ou cortes. Olhando para uma amostra das partes, os estereologistas podem estimar

o todo. Tendo um volume reconstruído da porção do cérebro estudada podemos

realizar uma análise esterológica nas distribuições ultraestruturais para contagem,

seja de células, seja de sinápses (Fiala e Harris, 2001). Em nossa pesquisa a

esterologia virtual será realizada por densitometria óptica, usando-se um sistema

MCID de análise de imagens (Interfocus Europe, UK).

Obtenção das amostras de cérebro

Ao final dos testes, os animais foram anestesiados com CO2 e decapitados

para a extração dos cérebros. As amostras foram imediatamente congeladas em

dimetilbutano resfriado em gelo-seco (-45 a -55°C) e armazenadas a -80°C até a

data de preparo dos cortes histológicos. A preservação das amostras por

congelamento e não por fixação química permite a utilização em outros tipos de

análises (Ex: radioautografia e western-blot).

Obtenção dos cortes histológicos

57

Cortes histológicos congelados (20 μm) de um dos hemisférios cerebrais

foram obtidos utilizando-se um criostato (Micron-Zeiss, Alemanha). Foram utilizados

quatro hemisférios direitos e quatro esquerdos de cada linhagem e para cada

tratamento. Os cortes transversais seriados, abrangendo toda a extensão no sentido

rostro-caudal, foram coletados diretamente em lâminas de vidro, previamente

gelatinadas para evitar-se o desprendimento dos cortes. Os conjuntos de cortes

histológicos foram mantidos a -80°C até a data do processamento histológico.

BDNF

O BDNF é a neurotrofina de maior distribuição no SNC (Tapia-Arancibia

et al,2008), é estimulada com o uso do lítio, tanto em doses ponderais (Leyhe et al,

2009) como em microdoses (Shiotsuki et al, 2008). Exerce um papel chave na

plasticidade cerebral, regulando o crescimento, manutenção e sobrevivência de

neurônios em animais (Alonso et al, 2002).

O BDNF foi analisado por ELISA Sandwich (BDNF Emax® ImmunoAssay

System, Promega). As placas são cobertas overnight, à temperatura ambiente, com

o anticorpo monoclonal anti BDNF a 10µL em Tampão Fosfato Salina (PBS). Então,

as placas são lavadas 3 vezes com tampão de lavagem e bloqueadas por 1 hora a

temperatura ambiente com PBS contendo leite em pó desnatado a 5%. Depois de

lavadas, as placas são cobertas overnight, a 4oC com as amostras diluídas 1:200 em

diluente de amostra (PBS 1% BSA) e a curva padrão varia de 7,8 a 500 pg/mL. As

amostras são lavadas outra vez e adicionado o anticorpo anti-BDNF a 0,2 µg/mL em

PBS, que foi incubado por 2 horas a temperatura ambiente. Depois de lavado, foi

realizada a incubação com peroxidase-streptavidina conjugada (diluída 1:100 em

58

diluente de amostra) por 1 hora a temperatura ambiente. Depois as placas são

lavadas e incubadas com o substrato a temperatura ambiente, por 20 minutos.

Finalmente a solução de parada foi adicionada e a quantidade de BDNF

determinada por absorvância a 450nm. A curva padrão demonstrou uma relação

direta entre a densidade ótica e a concentração de BDNF.

Avaliação das alterações do número de corpos celulares e de sinapses

NeuN

O lítio estimula a proliferação dos neurônios, neurogênese, entre outros

mecanismos descritos acima, pela inibição da enzima GSK-3β e subsequente

ativação da sinalização Wnt/β-Catenina, promovendo a neurogênese (Fiorentini et

al, 2010). Para a marcação de neurônios adultos, iremos utilizar a proteína nuclear

neuronal chamada NeuN (Neuronal Nuclei) (Mullen et al, 1992). Este estímulo da

neurogênese culmina com o aumento do número de neurônios.

O número de corpos celulares foi avaliado utilizando-se anticorpos contra a

Anti-NeuN (Milipore ABN78) feitos em coelho.

O hipocampo tem um papel limitado pelo tempo da memória, no seu

armazenamento e recuperação. Na visão atual da maioria dos pesquisadores do

sistema de consolidação, o hipocampo funciona como armazenamento temporário

para novas informações e o armazenamento permanente depende de uma rede de

distribuição cortical (Frankland, 2005).

Analisamos o número de corpos celulares nas regiões do DG, CA1, CA2 e

CA3 do hipocampo, e Cortex pré frontal.

59

Os cortes foram aquecidos à temperatura ambiente e mantidos dessa forma

até que a condensação que se forma nessa temperatura desapareça (aprox. 5 min.).

Após secarem, os cortes foram fixados (5 min) por imersão em acetona gelada (-

20°C), em temperatura ambiente. Após a fixação, os cortes foram rapidamente

lavados em PBS por 3 vezes, o excesso de tampão retirado e os cortes imersos por

20 minutos em solução de metanol e peróxido de hidrogênio a 0,6%, para inativação

da peroxidase endógena.

Em seguida as lâminas foram rapidamente lavadas em PBS por 3 vezes,

sendo o excesso retirado; novamente os cortes foram incubados por 30 minutos com

o soro normal de cabra para bloquear ligações inespecíficas do anticorpo primário

utilizado na sequência. O excesso de soro bloqueador foi retirado e os cortes

incubados por 6 horas com o anticorpo primário Anti-NeuN (1:2000). Cortes

controles foram processados simultaneamente omitindo-se o anticorpo primário, a

fim de obter-se o background.

Ao término do período de incubação os cortes foram imersos por 5 minutos

em PBS e incubados por 30 minutos com a solução contendo o anticorpo secundário

biotinilado anticoelho feito em cabra. Após a incubação os cortes foram processados

pelo método do Complexo Avidina Biotina- Peroxidase (Vectastain elite ABC Kit –

Vector laboratories, USA) por 30 min seguido de lavagem em PBS por 5 min. Após a

lavagem os cortes foram mergulhados em solução de Diaminobenzidina (DAB) por 4

minutos e 30 segundos seguido de lavagem rápida em água para remover o

excesso de DAB. A partir deste instante executamos o procedimento normal para

colocação de lamínulas. Os cortes não foram submetidos à coloração histoquímica

(Ramos-Vara, 2005).

60

Sinaptofisina

Segundos pesquisas anteriores (Kim e Thayer, 2009), o lítio induziu um

aumento da sinaptofisina, um marcador proteico pré sináptico.

A sinaptofisina foi a primeira proteína de vesícula sináptica a ser isolada

(Valtorta et al, 2004).

A avaliação da densidade das sinapses foi feita utilizando o mesmo protocolo

de Weatern Blotting utilizado para a quantificação da atividade da enzima GSK-3β,

descrito acima substituindo o anticorpo primário anti-GSK-3β pelo anticorpo contra

sinaptofisina-2 (Anti-Synaptophysin abcam ab68851), incubado overnight.

Avaliação das placas amiloides

Tioflavina-S

Os depósitos Aβ têm uma variedade de morfologias, refletindo quantias

diferentes de β-fibrilas e diferentes arranjos na conformação da proteína que forma

núcleos que podem ser corados com o método da Tioflavina-S (Urbanc et al, 2002).

A Tioflavina T é um corante benzotiazólico catiônico, que mostra aumento da

fluorescência após ligação com o tecido amiloide (Vassar e Culling,1959). A

superioridade da Tioflavina T para a detecção amiloide foi confirmada quando

comparada com outros métodos para coloração de placas amiloides (Saeed e Fine,

1967). A ligação das miscelas de ThT às fibrilas amiloides muda o espectro de

excitação e aumenta a emissão de fluorescência (Khurana et al,2005).

61

Este método foi adaptado para o método da Tioflavina S, que resulta da

metilação da dehidrotoluidina com o ácido sulfônico e cora fibrilas amiloides e não

oligômeros. Ao se ligar às fibrilas elas mostram uma fluorescência esverdeada.

As lâminas congeladas, preparadas como anteriormente descritas, foram

lavadas em PBS 5 vezes e incubadas em solução de Tioflavina S (Thioflavine S,

Sigma), 0,1% em PBS com 0,1% em Triton por 5 minutos. Após foram lavadas em

PBS por 2 vezes, incubadas em etanol 70%, por 5 minutos e lavadas novamente em

PBS por 3 vezes. Ao término os cortes foram cobertos com lamínula utilizando-se

Fluoromount + DAPI (Fluoroshield with DAP, Sigma). Todo o processo foi realizado

no escuro (penumbra).

A análise foi feita com microscópio ótico Nikon Eclipse E-600 e as placas

fotografadas logo após a coloração.

As placas forma contadas manualmente, duas lâminas por animal e analisadas

dividindo o número de placas pelo número de cortes analisados.

Avaliação da atividade das enzimas GSK-3α e GSK-3β

A família GSK-3 é uma família cinase altamente conservada através da

evolução. Em humanos são codificadas por 2 genes distintos GSK-3α (51kDa) e

GSK-3β (47 kDa) (Jope e Johnson, 2004). Elas exercem um papel preponderante

nas reações de sobrevivência e apoptose celular (Beurel e Jope, 2006).

O lítio é o principal inibidor destas enzimas, fosforilando-as nos sítios serina

inibitórios (Beaulieu et al, 2008, Martinez et al, 2006) e a avaliação da atividade

destas enzimas é fundamental na análise do efeito do lítio no tratamento dos

animais.

62

As áreas cerebrais relacionadas a memória foram separadas e

homogeneizadas em tampão de lise contendo 50 mM de TrisHCl (pH 7,4), 0,1%

Triton X100, 4 mM EGTA, 10 mM EDTA e um tablete de coquetel de inibidores de

proteases e fosfatases. Os homogenatos foram centrifugados a 12.000 rpm, por 15

min, a 4ºC. A partir do sobrenadante foi feita a dosagem da concentração de

proteínas, em cada fração, utilizando-se o método de Bradford (1976). Quantidades

equivalentes de proteínas foram separadas por gel de poliacrilamida (SDSPAGE a

10%) a 100v por aproximadamente 1 2 h. Após a corrida eletroforética, as proteínas

foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose em tampão Tris 25mM pH

8,3, glicina 192 mM e SDS 0,1%metanol 20%, a 400350 mA por 2h a 4ºC.

Terminada a transferência das proteínas, a membrana foi incubada com tampão

Trisfosfato contendo Tween20 0,1% e leite desnatado 5% (Tampão de bloqueio) por

1 h a temperatura ambiente, sob agitação constante, para o bloqueio das reações

não especificas do anticorpo primário. Após lavagem, o material foi incubado com o

anticorpo primário, anti-GSK-3β (ab-18893) 1:5000; anti-pGSK-3β (Phospho-GSK-

3β– D8-5E12) 1:1000 ou βtubulina (diluído 1:5000) por 16h a 4ºC. Em seguida, as

membranas foram lavadas conforme descrito anteriormente e incubadas com o

anticorpo secundário anti-IgG conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP, de

HorseRadish Peroxidase) e diluído 1:5000 em tampão de bloqueio por 1 hora a

temperatura ambiente. As marcações foram detectadas por quimioluminescência,

usando o sistema de imagem digital ImageQuant™ LAS 500 GE e as imagens foram

quantificadas usando o Software ImageJ1 versão 47 do National Institutes of

Health (NIH). Os dados foram analisados estatisticamente por ANOVA de duas vias

com pós teste de múltiplas comparações de Bonferroni realizado com o Software

Statistic (Statistic) versão 10. Os dados foram considerados significativos se ρ<0.05.

63

Análises estatísticas

Os dados de comportamentro, filmados com uma videocâmera JVC Everio e

analisados com Smart Software, version 2.5.21, Panlab Hervard Apparatus, foram

analisados pelos testes de Variância de duas vias ANOVA (ANOVA), pós-teste de

Bonferroni, ou Varância de Uma Via (Caixa de atividade motora, Teste do labirinto

terrestre de Barnes, Labirinto em cruz elevado, Marble ) ou teste não paramétrico de

Kruskal Walllis, pós teste de múltiplas comparações de Tuckey (Memória aversiva)

executados pelo software StatSoft (Statistic versão 7).

Os dados histopatológicos foram analisados pelos testes de Variância de duas

vias ANOVA (ANOVA), pós-teste de Bonferroni executados pelo software StatSoft

(Statistic versão 7).

Os gráficos foram executados no GraphPad Prism versão 5.01.

64

Resultados

Avaliação da ingestão de água para cálculo da concentração de lítio

Para se determinar a concentração de lítio a ser utilizada na água dos animais

durante o tratamento, a ingestão de água dos camundongos C57Bl6 foi avaliada

durante 8 semanas. Os bebedouros dos animais foram pesados semanalmente e o

valor encontrado foi dividido pelo número de animais em cada caixa. Com isso, foi

verificado que a ingestão de água de cada animal por dia foi de 6,632ml (Figura 21).

A quantidade de água perdida pelo movimento do bebedouro na troca do conteúdo

ou com o moviemento das caixas também foi avaliada, mostrando ser irrelevante (2

a 3 mL/semana).

Figura 21: Ingestão de água para cálculo de concentração do lítio.

cx1

cx2

cx 3

cx 4

cx 5

cx 6

0

2

4

6

8

10

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml)

/ d

ia/

an

imal

Em observação feita por 8 semanas foi verificado que os animais ingeriram, em média 6,6 ml de água ao dia e que a variação foi pequena entre os animais. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. Estatísticas de coluna: ingestão de água para cálculo da concentração de lítio na água.

65

Comparação da ingestão de água entre animais tratados e não tratados

Durante todo o projeto, os bebedouros foram pesados semanalmente para se

verificar se haveria necessidade de ajuste da concentração do lítio na água. Não

houve diferença significativa na ingestão de água entre os dois grupos, tratado e não

tratado com lítio (ρ=0.002) (Figura 22).

.

Figura 22: Ingestão semanal de água dos animais tratados com água e lítio.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

20

40

60

80

100Água

Lítio

Ingestão de água

Semanas de tratamento

Vo

lum

e d

e á

gu

a in

ge

rid

o (

ml)

Avaliação da diferença entre a ingestão de água calculada por dia, comparando animais tratados e não tratados com lítio, observados por um período de 7 bimestres, a partir dos 4 meses de idade. Não houve diferença entre os animais tratados e não tratados. Os símbolos e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias, seguida do teste de Bonferroni: ρ=0,0020; F(5,56) = 10,10.

Mortalidade

Para avaliar uma possível toxicidade com o uso crônico de lítio em microdose,

os índices de mortalidade (número de óbitos/número total de animais) durante o

tempo de tratamento foram comparados em todos os grupos observados e não

66

houve diferença entre eles (ρ = 0,2349, Figura 23). Com o mesmo intuito, a idade

dos animais na data do óbito foi comparada, não havendo diferença entre os grupos

(Figura 24).

Figura 23: Mortalidade dos animais entre 15 e 18 meses.

Mortalidade

WT Ctr WT Li2WT Li10TG Ctr TG Li2 TG Li100.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Ób

ito

s/t

ota

l d

o g

rup

o

Não houve diferença na avaliação da mortalidade dos animais comparando número de óbitos dividido pelo número total de animais de cada grupo. Os histogramas são os valores totais de óbitos por grupo. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni. ρ = 0,2349

Figura 24: Média de idade do óbito dos animais.

Idade do óbito

WT Ctr WT li2 WT Li10 TG Ctr TG Li2 TG Li 100

5

10

15

20

Idad

e e

m m

eses

Avaliação da média de idade dos animais na data do óbito, por grupo de tratamento e transgenia. Não houve diferença na média de idade dos óbitos. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni.ρ>0,05

67

Avaliação da atividade motora

Uma vez que os testes comportamentais dependem de boa atividade motora

dos animais, a deambulação e exploração vertical foram avaliadas quando os

animais atingiram 6 e 18 meses de idade. Aos 6 meses de idade, não houve

diferença estatística quanto à deambulação dos animais WT. Por outro lado, os

animais WT Li2 apresentaram menor mobilidade horizontal que os animais dos

grupos TG Ctr (< 0,0001) e TG Li10 (< 0,05) (Figura 25). Aos 18 meses de idade,

apenas o grupo WT Li2 apresentou menor deambulação que o grupo WT Ctr

(<0,05, Figura 25), porém essa redução na deambulação não alterou o

desempenho nos testes de memória, como será mostrado à frente.

Figura 25: Atividade Motora Horizontal aos 6 e 18 meses.

Mobilidade Horizontal

0

500

1000

6 months

18 months

***

*

*

WTCtr WT Li2 WT Li10 TGCtr TG Li2 TG Li10

Deam

bu

lação

(u

nid

ad

es)

Avaliação da atividade motora horizontal (deambulação) aos 6 e aos 18 meses de idade. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias: Interação ρ=0.0063,F(5,56)=3.449. Tratamento ρ<0.0001, F(5,56)=9.827. *: ρ < 0.05; ***: ρ < 0.0001.

68

Com relação à exploração vertical, aos 6 meses de idade os animais do grupo

TG Ctr apresentaram maior deambulação que os camundongos do grupo WT Ctr

(<0,05) e que os do grupo TG Li2 (<0,05). Nessa mesma idade, os animais do

grupo WT Li10 também apresentaram maior deambulação que os animais do grupo

WT Li2 (<0,05) (Figura 26).

Figura 26: Atividade Motora Vertical aos 6 e 18 meses.

Mobilidade Vertical

0

50

100

150

6 months

18 months

**

*

WT Ctr WT Li2 WT Li10 TG Ctr TG Li2 TG Li10

Deam

bu

lação

(u

nid

ad

es)

Avaliação da exploração vertical. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias: fator tempo ρ=0,0008, F(5,56)=4,597. *:ρ<0,05.

Avaliação da Memória Espacial

Para avaliação da memória espacial foi utilizado o labirinto terrestre de

Barnes. Os animais foram submetidos ao equipamento duas vezes ao dia por cinco

dias consecutivos. A primeira avaliação, considerada a aprendizagem da tarefa, foi

realizada aos 6 meses de idade, onde foi observado que todos os animais,

independentemente da linhagem ou tratamento, apresentaram redução da latência

69

para achar a caixa de escape, o que demonstra que aprenderam a tarefa (Figura

27).

Figura 27: Aprendizado dos animais em labirinto de Barnes

a) b)

c) d)

Tempo inicial registrado na primeira exposição dos animais ao labirinto de Barnes aos 6 meses de idade. Todos os animais, independentemente da linhagem ou tratamento, aprenderam a tarefa. a) Desempenho de todos os animais juntos; b) desempenho dos grupos TG; c) desempenho dos grupos WT; d) comparação do desempenho dos grupos WT Ctr e TG Ctr. Os símbolos e barras verticais são

as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni. > 0,05.

Durante a aprendizagem, o número de erros que os animais cometeram até

encontrarem a caixa de escape também foi quantificado. Foi observado que esse

número foi sendo reduzido ao longo dos cinco dias de exposição dos animais ao

equipamento, reforçando que os animais aprenderam a tarefa (Figura 28).

Aprendizado (latência)

Inicio Dia1 Dia2 Dia3 Dia4 Dia50

50

100

150

TG Li10

TG Li2

WT Li10

WT Li2

TG Ctr

WT Ctr

La

tên

cia

(s

)

Aprendizado (latência) TG

Início Dia1 Dia2 Dia3 Dia4 Dia50

50

100

150

TG Li10

TG Li2

TG Ctr

La

tên

cia

(s

)

Aprendizado (latência) WT


50

100

150

WT Li10

WT Li2

WT Ctr

La

tên

cia

(s

)

Aprendizado (latência)

WT X TG


50

100

150

TG controle

WT controle

La

tên

cia

(s

)

70

a) b)

c) d)

Erros cometidos pelos animais na fase de aprendizagem da tarefa em labirinto de Barnes, aos 6 meses de idade. O número de erros foi sendo reduzido ao longo dos cinco dias de exposição ao equipamento, indicando o aprendizado da tarefa. a) Número de erros de todos os animais juntos; b) Número de erros dos grupos TG; c) Número de erros dos grupos WT; d) Comparação do número de erros dos grupos WT Ctr e TG Ctr. Os símbolos e barras verticais são as médias ± erros-padrão.

ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni. > 0,05.

A cada três meses a memória espacial dos animais foi avaliada no mesmo

equipamento. Foi verificado que tanto os grupos WT quanto os grupos TG tratados

com lítio desde os 2 ou 10 meses de idade mantiveram a memória da tarefa, pois a

latência de todos os grupos foi semelhante à observada no grupo WT Ctr (38,3 ±

Figura 28: Números de erros cometidos pelos animais no labirinto de Barnes.

Aprendizado (erros iniciais) Teste 5

Dia1 Dia2 Dia3 Dia4 Dia50

2

4

6

8 TG Li10

TG Li2

WT Li10

WT Li2

TG Ctr

WT Ctr

Nú

me

ro d

e e

rro

s

Aprendizado (erros iniciais) Teste 5 TG

Dia 1 Teste 2 Teste 3 Teste 4 Teste 50

2

4

6

8 TG Li10

TG Li2

TG Ctr

Nú

me

ro d

e e

rro

s

Aprendizado (erros iniciais) Teste 5 WT

Dia 1 Teste 2 Teste 3 Teste 4 Teste 50

2

4

6

8

WT Li10

WT Li2

WT Ctr

Nú

me

ro d

e e

rro

s

Aprendizado (erros iniciais) Teste 5

TG X Ctr

Dia1 Dia2 Dia3 Dia4 Dia50

2

4

6

8

TG Ctr

WT Ctr

Nú

me

ro d

e e

rro

s

71

10,4 seg). Por outro lado, o grupo TG Ctr não manteve a memória do teste

apresentando latência para encontrar a caixa de escape significativamente maior

que o grupo TG Li2 aos 12 (70,9 ± 9,0 seg, < 0,01), 15 (66,7 ± 8,4 seg, < 0,05) e

18 meses de idade (74,0 ± 8,4 seg, < 0,01) (Figura 29). Portanto, o tratamento do

grupo TG com Li a partir dos 2 meses de idade foi efetivo em manter a memória dos

animais. As diferenças estatísticas foram observadas com relação aos fatores

tratamento (ρ<0.0001, F(5,56)=7,32) e tempo (ρ<0.0001, F(5,56)=9,57).

a) b)

c) d)

Memória avaliada a cada três meses, ao longo de todo o período de tratamento. Todos os grupos mantiveram a memória do teste a não ser pelo grupo TG Ctr que apresentou latência significativamente maior que os outros grupos. a) Comparação da memória espacial de todos os grupos juntos; b) Comparação da memória espacial dos grupos TG; c) Comparação da memória espacial dos grupos WT; d) Comparação da memória espacial dos grupos WT Ctr e TG Ctr. Os símbolos e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias, seguida de

Bonferroni. *: < 0,05; **: < 0,01; *** < 0,001.

Figura 29: Memória Espacial avaliada em labirinto de Barnes - Tempo inicial.

Memória Espacial (latência)

0

50

100

150

TG Li 10

TG Li 2

WT Li 10

WT Ctr

TG Ctr

WT Li 2

Início 6m 9m 12m 15m 18m

***

** ***

La

tên

cia

(s

)

Memória Espacial (latência) TG

Início 6m 9 m 12m 15m 18m0

50

100

150 TG Li10

TG Li2

TG Ctr

***

*

***

Latê

ncia

(s)

Memória Espacial (latência) WT

0

50

100

150

WT Li10

WT Li2

WT Ctr

Inìcio

6m 9m 12m 15m 18m

La

tên

cia

(s

)

Memória espacial (latência)

WT X TG

Inícial 6m 9 m 12m 15m 18m0

50

100

150

TG Ctr

WT Ctr

** **

**

La

tên

cia

(s

)

72

Em relação à avaliação do número de erros cometidos pelos grupos ao longo

do tempo de tratamento, não foi observada diferença estatística entre os grupos WT

e os TG tratados com lítio. Na última avaliação, aos 18 meses, os grupos

experimentais apresentaram erros semelhantes ao grupo WT Ctr (2,7 ± 1,2 erros,

Figura 30). Por outro lado, o grupo TG Ctr apresentou um número significativamente

maior (< 0,05) de erros na última avaliação (Figura 30).

a) b)

c) d)

Todos os grupos apresentaram erros semelhantes ao grupo WT Ctr, com exceção do grupo TG Ctr, que apresentou aumento significativo do número de erros. a) Comparação do número de erros de todos os grupos juntos; b) Comparação do número de erros dos grupos TG; c) Comparação do número de erros dos grupos WT; d) Comparação do número de erros dos grupos WT Ctr e TG Ctr. Os símbolos e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias, seguida de

Bonferroni. *: < 0,05; **: < 0,01.

No último teste, aos 18 meses de idade, a distância total percorrida pelos

animais no labirinto de Barnes foi medida. Foi verificado que os animais TG Ctr

Figura 30: Erros iniciais cometidos em labirinto de Barnes.

Memória Espacial (erros iniciais)

Início 6m 9m 12m 15m 18m0

5

10

15

TG Li10

TG Li2

WT Li10

WT Li2

TG Ctr

WT Ctr

*

Nú

me

ro d

e e

rro

s

Memória Espacial (erros iniciais) TG


5

10

15

TG Li10

TG Li2

TG Ctr

*N

úm

ero

de

err

os

Memória Espacial (erros iniciais) WT


5

10

15

WT Li10

WT Ctr

WT Li2

Nú

me

ro d

e e

rro

s

Memória Espacial (erros iniciais)

WT X TG


5

10

15 TG Ctr

WT Ctr**

Nú

mero

de e

rro

s

73

percorreram uma distância significativamente maior (1551 ± 695,2 cm, < 0,05) que

os animais WT Ctr (366,3 ± 81,5 cm) e TG Li2 (324,2 ± 65,4 cm), confirmando que

esses animais não mantiveram a memória do local da caixa de escape e que os

animais TG Li2 apresentaram desempenho semelhante aos animais não-

transgênicos (Figura 31).

A avaliação da distância percorrida durante o teste mostrou que os animais TG Ctr não se lembraram da localização da caixa de escape e que os animais TG Li2 apresentaram memória semelhante aos grupos não-transgênicos. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias seguida do pós-teste de Bonferroni. F(5,56)=5.864 *: ρ<0,05.

Figura 31: Distância percorrida - Labirinto terrestre de Barnes.


500

1000

1500

2000

2500*

*

Distância Percorrida

Labirinto de Barnes

Dis

tân

cia

(cm

)

74

Da mesma forma, foi avaliado o tempo despendido pelos animais no

quadrante alvo, onde estava a caixa de escape. Foi observado que o grupo TG Ctr

permaneceu uma porcentagem de tempo significativamente menor no quadrante

alvo (20,5 ± 3,1%, <0,001), quando comparado com o grupo Wt Ctr (44,5 ± 4,0%) e

com o grupo TG Li2 (52,3 ± 6,8%) (Figura 32), confirmando que não memorizou o

local da caixa de escape. O grupo TG Li2, por sua vez, manteve o desempenho

semelhante aos grupos WT e ao grupo TG Li10 (Figura 32).

Avaliação do tempo de permanência no quadrante da caixa de escape, no labirinto de Barnes. TG Li2 apresentou desempenho semelhante aos grupos WT e significativamente maior que o grupo TG Ctr. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias, seguida do

teste de Bonferroni. F(5,56)=4.51. *: <0,001.

Figura 32: Tempo de permanência no quadrante alvo em labirinto de Barnes.


20

40

60

80

***

***

Tempo no Quadrante Alvo

Te

mp

o d

isp

en

did

o n

o q

ua

dra

nte

alv

o (

%)

75

Avaliação da memória relacionada a estímulo aversivo

A memória relacionada a estímulo aversivo foi avaliada ao final do tratamento,

quando os animais completaram 18 meses de idade. Durante a sessão de aquisição

da tarefa (treino) em equipamento de esquiva inibitória, os animais TG Ctr levaram

tempo significativamente maior 103,3 [76,4/174,3] seg, <0,05) para entrar na câmara

escura do aparelho em comparação aos animais TG Li2 (36,3 [22,3/41,5] seg) e TG

Li10 (31,1 [24,0/48,6] seg). O desempenho destes grupos foi semelhante aos grupos

WT com ou sem tratamento com lítio (WT Ctr: 46,2 [16,0/69,2] seg) (Figura 33).

Figura 33: Comparação do desempenho dos animais na sessão de aquisição (treino) em esquiva inibitória.

Esquiva Inibitória Treino

WT ctrl WT Li2 WT Li10 TG Ctr TG Li2 TG Li100

50

100

150

200 *

*

Latê

ncia

(s)

Os animais TG Ctr apresentaram latência significativamente maior que os animais TG Li2 e TG Li10. Os histogramas e barras verticais são medianas e intervalos interquartis. Análise de variância não-

paramétrica (Kruskall-Wallis) seguido do teste de Dunn.*: < 0,05.

Com exceção do grupo Tg Ctr, todos os grupos apresentaram diferença de

latência entre a sessão de treino e a sessão de teste no equipamento de esquiva

76

inibitória, sugerindo que apenas o grupo TG Ctr não aprendeu a tarefa. Não houve,

porém, diferença entre os testes dos diferentes grupos (Figura 34).

Figura 34: Memória aversiva em Esquiva Inibitória aos 18 meses.

0

100

200

300

** *** ** ** *

Esquiva Inibtória

Treino

Teste

WT Ctr WT Li2 WT Li10 TGCtr TG Li2 TG Li10

La

tên

cia

(s

)

Com exceção do grupo TG Ctr, todos os grupos apresentaram memória da tarefa, uma vez que as latências (em segundos) no teste (histogramas lisos) foram significativamente maiores que as latências dos treinos (histogramas quadriculados). Os histogramas e barras verticais são medianas e

intervalos interquartis. Teste pareado de Mann-Whitney para dados não-paramétricos. *: < 0,05; **:

< 0,01; ***: < 0,001.

Avaliação do comportamento de ansiedade

Para avaliar uma alteração no comportamento de ansiedade dos animais,

todos foram submetidos ao labirinto em cruz elevado aos 18 meses de idade. Na

análise de Variância de duas vias, com pós-teste de múltiplas comparações de

Bonferroni, não se observou diferença entre os grupos, quanto ao tempo de

77

permanência nos braços abertos do labirinto em relação ao tempo total nos dois

braços (Figura 35). Porém, o grupo TG Li2 apresentou um aumento significativo de

entradas nos braços abertos/ total de entradas nos dois braços, comparado ao TG

Ctr e G Li10, sugerindo um possível efeito ansiolítico do tratamento (Figura 36).

Análise do tempo total de permanência nos braços abertos em relação ao tempo total nos dois braços. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. Análise de Variância de duas vias (ANOVA) pós testes de Bonferroni ρ=0.1183, F(5,45)=1, 22.

Figura 35: Avaliação da ansiedade em Labirinto em Cruz Elevado – Tempo nos braços abertos.

Tempo Braço aberto

WT Ctr WT Li2 WT Li10 TG Ctr TG Li2 TG Li100.0

0.2

0.4

0.6

Te

mp

o b

raç

o a

be

rto

/to

tal

78

O grupo TG Li2 apresentou aumento do número de entradas nos braços abertos em relação aos grupos TG Ctr e TG Li10, indicando possível efeito ansiolítico. Não houve diferença entre os grupos WT e os grupos TG L2 e TG Li10. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. Análise de Variância de duas vias (ANOVA) pós testes de Bonferroni **: ρ < 0,01 F(5,45)= 7,885.

Outros fatores observados nesse ensaio foram o tempo despendido nos braços

fechados e o número de entradas nos mesmos, em relação ao número total de

entradas.

Não foram observadas diferenças estatísticas no tempo de permanência nos

braços fechados, como pode ser observado na figura 35. Por outro lado, todos os

grupos apresentaram menor número de entrada nos braços fechados em relação ao

grupo WT Ctr, o que pode sugerir uma redução de comportamento ansioso (Figura

37).

Figura 36: Avaliação da ansiedade em labirinto em cruz elevado – número de entradas nos

braços abertos.

Entradas braço aberto

WT Ctr WT Li2 WT Li10 TG Ctr TG Li2 TG li100.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

****

En

tra

da

Bra

ço

ab

ert

o/t

ota

l

79

Não houve diferença no tempo total de permanência nos braços fechados em relação ao tempo total de permanência nos dois braços. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. Análise de Variância de duas vias (ANOVA) pós testes de Bonferroni ρ=0.1104, F(5,45)= 0,3137.

Houve diferença entre o número de entradas nos braços fechados em relação ao número total de entradas entre os grupos WT Ctr e os outros grupos. Análise de Variância de duas vias (ANOVA) pós

testes de Bonferroni. *: ρ <0,01; **: < 0,001. F(5,45) = 22,18.

Figura 37: Avaliação da ansiedade em labirinto em cruz elevado – tempo de permanência

nos braços fechados.

Figura 38:Avaliação da ansiedade em labirinto em cruz elevado – número de entradas nos

braços fechados.

Tempo Braço Fechado


0.2

0.4

0.6

0.8

Te

mp

o b

raç

o a

be

rto

/to

tal


0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Entradas braços fechados

***

****

**

En

tra

da

s B

raç

os

fe

ch

ad

os

/to

tal

80

Avaliação do Comportamento Compulsivo

O teste de enterrar e escavar esferas foi realizado para se determinar a

presença de um comportamento obsessivo-compulsivo. Não houve diferença

estatística entre os grupos observados com relação a esses parâmetros como pode

ser observado nas figuras 39 e 40.

Figura 39: Avaliação de comportamento obsessivo-compulsivo. Teste de enterrar esferas.

Esferas Enterradas


5

10

15

Un

idad

es

Não houve diferença no número de esferas enterradas nos diferentes grupos. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni. Ρ > 0,05; F(5,45) = 0,8994.

Figura 40: Avaliação de comportamento obsessivo-compulsivo. Tempo de escavação.

0

50

100

Tempo de escavação


Tem

po

de e

scavação

(s)

81

Não houve diferença quanto ao tempo de escavação entre os grupos de animais. Análise de Variância de duas vias (ANOVA) pós testes de Bonferroni ρ=0.7751, F(5,45)=0.4992.

Análises Estereológicas

BDNF

A neurotrofina BDNF foi quantificada em homogenato de hipocampo e córtex

dos animais dos diferentes grupos. Conforme mostrado na figura 40, não houve

diferença estatística com relação à densidade de BDNF no hipocampo dos animais,

permanecendo todos semelhantes ao observado no grupo WT Ctr (0,83 ± 0,22

pg/mg) (Figura 41). Por outro lado, foi observado um aumento significativo dessa

neurotrofina no córtex dos animais TG Li2, quando comparados com o mesmo tecido

dos animais WT Li2 e TG Ctr (Figura 42).

Figura 41: Concentração de BDNF (pg/mg) no hipocampo.

Hipocampo

WT Ctrl WT Li 2m WT Li 10m TG Ctrl TG Li 2m TG Li 10m0

1

2

3

BD

NF

(p

g/m

g)

Não houve diferença estatística na concentração de BDNF entre os diferentes grupos. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni. ρ > 0,05; F(5,45)=1,025.

82

Figura 42: Concentração de BDNF (pg/mg) no córtex.

Cortex

WT Ctrl WT Li 2m WT Li 10m TG Ctrl TG Li 2m TG Li 10m0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

* **

BD

NF

(p

g/m

g)

O grupo TG Li2 apresentou desidade de BDNF maior que os grupos WT Li2 e TG Ctr. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias seguida do teste

de Bonferroni. *: < 0,05; **: < 0,01; F(5,45)=6,024.

Placas amiloides

A densidade de placas senis foi avaliada no hipocampo dos animais

transgênicos tratados ou não com lítio desde os 2 ou 10 meses de idade. Foi

observada uma redução significativa da densidade proporcional de placas amiloides

nos animais do grupo TG Li 2 (0,49 ± 0,04 placas/corte/animal) quando comparadas

com os animais dos grupos TG Ctr (31,02 ± 7,04 placas/corte/animal) e TG Li10

(11,37 ± 4,70 placas/corte/animal) (Figura 43 e 45). Os animais WT tratados ou não

com lítio em microdoses não apresentaram placas senis (Figura 44).

83

Figura 43: Número de placas amiloides todos os animais


10

20

30

40

***

***

*

Nú

me

ro d

e p

lac

as

/co

rte

/an

ima

l

Avaliação do número de placas amiloides por Fluorescência com Tioflavina-S. Os histogramas e barras verticais são as médias erros-padrão. ANOVA de duas vias, Pós teste de Bonferroni *: ρ <

0,05; **: < 0,01.

Figura 44: Número de placas amiloides animais TG.

Avaliação do número de placas amiloides por Fluorescência com Tioflavina-S. Comparação entre TG Ctr, TG Li2 e TG Li10. Os histogramas e barras verticais são as médias erros-padrão. ANOVA de

uma via, Pós teste de Bonferroni *: ρ < 0,05; **: < 0,01.

84

Figura 45: Fotos placas amiloides por Tioflavina-S :

Fotos de imagens ao microscópio de placas coradas pelo método de fluorescência com Tioflavina-S.

Densidade Neuronal

A densidade neuronal foi determinada pela quantificação por

imunohistoquímica da proteína neuronal NeuN no hipocampo. Não houve diferença

significativa da densidade dessa proteína entre os grupos nas áreas em CA1, CA2,

CA3 e camada polimórfica do giro denteado (PoDG), apesar da redução observada

no grupo TG Ctr (Figura 46). Entretanto, na camada granular do giro denteado

(GrDG) foi observado uma redução significativa da densidade de NeuN no grupo TG

Ctr (0,53 ± 0,05), em relação ao grupo WT Ctr (0,75 ± 0,03, < 0,05). Ademais, foi

85

observado um aumento significativo da densidade de NeuN no grupo TG Li2 (0,79 ±

0,03, < 0,01) em relação ao grupo TG Ctr (Figura 46 e 47).

Figura 46: NeuN no hipocampo

Densidade de NeuN por área proporcional no hipocampo dos animais dos diferentes grupos. Houve diferença significativa entre o grupo TG Ctr e os grupos WT Ctr e TG Li2. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni. *: ρ

<0,05; **: < 0,01; F(5,45) = 13,92.

86

Figura 47: Fotos corpos neuronais Hipocampo NeuN

Fotos das marcações de corpos neuronais por imunohistoquímica da proteína neuronal NeuN. Regiões do hipocampo Cornus Armonis (CA1, CA2, CA3) camada molecular polimórfica do Giro Denteado (PoDG), Cama Granular do Giro denteado (GrDG).

A densidade de NeuN também foi avaliada no córtex dos animais, onde foi

observado aumento significativo dessa proteína no grupo TG Li2 (0,268 ± 0,025,

<0,01), quando comparado com o grupo TG Ctr (0,064 ± 0,008) (Figura 48).

87

Figura 48: NeuN no cortex

Densidade de NeuN por área proporcional no córtex dos animais dos diferentes grupos. Houve diferença significativa entre o grupo TG Ctr e o grupo TG Li2. Os histogramas e barras verticais são

as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni.*= <0,05 **= < 0,005; F(5,45) = 3,28.

88

Figura 49: Fotos corpos neuronais cortex NeuN

Fotos das marcações de corpos neuronais por imunohistoquímica da proteína neuronal NeuN, no córtex pré-frontal. Regiões do córtex pré-frontal: CG (CinguladoAnterior), PL (Pré Límbico), IL (Infra límbico).

Avaliação da atividade da enzima GSK-3β

Foi feita a avaliação da atividade da enzima GSK-3β em hipocampo e córtex dos

animais, uma vez que a fosforilação dessa enzima constitui um dos mecanismos de

ação mais aceitos para o lítio. A atividade da enzima foi medida pela proporção entre

a densidade da enzima fosforilada inativa (pGSK-3β) e a densidade total da enzima

ativa (GSK3β). Em hipocampo de animais tratados ou não com a microdose do íon,

não foi observada diferença estatística entre os grupos (Figura 50). Houve diferença

estatística na atividade da enzima GSK-3β no córtex dos animais estudados (Figura

51).

89

Figura 50: Atividade da enzima GSK-3β no hipocampo.

Atividade de GSK-3

no hipocampo

WT Ctr WT Li2 WT Li10 TG Ctr TG Li2 TG Li 100

1

2

3

PG

SK

3/G

SK

3

Atividade da enzima GSK-3β no hipocampo. A atividade foi determinada pela relação da densidade das enzimas pGSK-3β e GSK-3β. Não houve diferença entre os grupos. Teste de Variância de duas Vias (ANOVA) com pós teste de múltiplas comparações de Bonferroni. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni.

Figura 51: Atividade da enzima GSK-3β no cortex.

Atividade de GSK-3

Cortex


1

2

3

4 *

pG

SK

3

/GS

K3

Atividade da enzima GSK-3β no córtex. A atividade foi determinada pela relação da densidade das enzimas pGSK-3β e GSK-3β. Não houve diferença entre os grupos. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni.

90

Densidade de terminais pré-sinápticos

A densidade de terminais pré-sinápticos foi determinada por western-blot da

proteína sinaptofisina em hipocampo e córtex dos animais de todos os grupos. No

hipocampo, houve aumento significativo dessa proteína nos animais do grupo TG Ctr

(13,63 ± 4,40 U.A., < 0,05) quando comparados com animais do grupo TG Li10

(4,25 ± 0,62 U.A.) (Figura 49). Por outro lado, não foi observada diferença

significativa na densidade de sinaptofisina no córtex dos animais (Figura 50).

Figura 52: Densidade de terminais pré-sinápticos em hipocampo.

Sinaptofisina Hipocampo

WT Ctrl WT Li2 WT Li 10 TG Ctrl TG Li2 TG Li100

5

10

15

20

Syn

-2/b

tub

(U

A)

Não houve diferença entre os grupos. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni.

91

Figura 53: Densidade de terminais pré-sinápticos em córtex.

Sinaptofisina Cortex


5

10

15S

yn

-2/b

tub

(U

A)

Não houve diferença estatística entre os grupos TG Ctr e TG Li10. Os histogramas e barras verticais são as médias ± erros-padrão. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni.

92

Discussão

Baseado nos mecanismos neuroprotetores do lítio (Jope et al, 2004), na

toxicidade do lítio em doses ponderais (Okusa e Crystal, 1994), principalmente nos

idosos, e em nossos resultados positivos no uso de microdose do lítio (1,5mg/dia),

como neuroprotetor da perda cognitiva em pacientes portadores da DA (Nunes et al,

2013); decidimos investigar o efeito preventivo e terapêutico dessa dose em animais

e seus efeitos moleculares.

As vantagens do uso dos camundongos para o estudo da doença de

Alzheimer incluem a manutenção relativamente barata; as características inatas dos

animais, por serem fecundos e possuírem uma expectativa de vida curta; são

animais fáceis de manipular geneticamente e respondem bem aos testes cognitivos

já padronizados. A sua curta expectativa de vida é ao mesmo tempo uma

desvantagem, pois não é possível acompanhar um tratamento durante anos, além

dos camundongos terem grande resistência a algumas neurotoxinas (Provost et al,

1993). Por exemplo, camundongos que super expressam APP mutante tem que ter 8

vezes maiores níveis endógenos para desenvolver placas, enquanto humano com

50 por cento de aumento na APP, como na síndrome de Down, desenvolve Doença

de Alzheimer rapidamente (Reeves’ et al, 1995). Nos animais transgênicos,

normalmente construídos com um promotor de espécie diferente, a doença,

normalmente, segue padrões espaciais e temporais diferentes dos humanos (Duff e

Sulleman, 2004).

Não existe um modelo animal ideal que permita um melhor entendimento do

mecanismo que leva ao início e progressão da doença de Alzheimer ou identifique

alvos terapêuticos potenciais in vivo para justificar um ensaio clínico em humanos.

93

Os modelos roedores existentes não demonstram todos os aspectos da

Doença de Alzheimer em um único animal. Existem fatores adicionais, que exercem

um papel desencadeador da doença e sua progressão. Entre eles estão fatores

como dieta e ambiente aos quais os modelos não estão expostos e cujo impacto no

desencadeamento da doença ainda não está avaliado.

Mas, os modelos criados são de grande valor para o entendimento dos

mecanismos moleculares e genéticos in vivo da doença de Alzheimer.

Escolhemos utilizar camundongos transgênicos hemizigóticos B6.Cg-Tg

(PDGFB-APPSwInd), que expressam uma forma mutante da proteína precursora

amiloide. Como controles foram utilizados animais da mesma ninhada nascidos sem

a inserção transgênica. Essa linhagem é derivada de camundongos C57Bl/6J. Estes

camundongos transgênicos expressam uma forma mutante da proteína precursora

amiloide (APP), com aproximadamente 400kbp, que transporta tanto a mutação

Sueca - k670N/M671L com a substituição de asparagina por lisina nos códons 670 e

671; quanto a Indiana – V717F com a substituição de Isoleucina por FAD Valina no

códon 717 (Lamb et al, 1997). O constructo transgênico, direcionado pelo gene

promotor do fator de crescimento derivado de plaqueta subunidade B (PDGFB)

humano, foi injetado em embriões unicelulares de camundongos C57BL/6 X DBA/2

F1. O camundongo transgênico resultante foi então retrocruzado por 12 gerações

com C57BL/6J. Esta cepa foi distribuída como B6.Cg-Tg(PDGFB-

APPSwInd)20Lms/1J (Duff,2004).

Os hemizigotos, com a presença de somente uma única cópia do gene,

expressam o produto transgene imunodetectável em neurônios cerebrais, com o

nível mais alto da expressão no neocórtex e hipocampo. A análise por Ensaio

Imunoenzimático (ELISA) revela peptídeos beta-amiloide totais e peptídeos beta

94

amilóides de 42 aminoácidos no tecido neocortical e de hipocampo do camundongo

mutante (Mucke et al, 2000). Entre 5 e 7 meses de idade esses animais apresentam

deposição difusa de peptídeos beta-amiloides no giro dentado e neocórtex. A

deposição amiloide é progressiva, com os animais exibindo placas entre 8 e 10

meses (Mucke et al, 2000).

Segundo a base de dados do Laboratório Jax Mice, o animal começa a

apresentar alterações fenotípicas entre 4 e 7 meses de idade. Apresentando déficit

na memória espacial no labirinto aquático de Morris, menor nível de ansiedade no

Labirinto em Cruz Elevado e Hiperatividade no labirinto em Y. Essa alteração

precoce do fenótipo nos permite acompanhar a doença ao longo do envelhecimento.

Observamos todas essas alterações em nossos animais TG Ctr: Prejuizo da

memória espacial no labirinto terrestre de Barnes, menor ansiedade no LCE, com

menor número de entradas nos braços fechados e Hiperatividade na caixa de

atividade motora e no labirinto terrestre de Barnes. Estes dados demonstram que o

APPSwInd é um bom modelo para a DA.

Também segundo a base de dados do laboratório Jackson (EUA), a

mortalidade precoce deveria ser alta, com óbito em torno dos seis meses de idade.

Entretano, não observamos esse fenômeno durante o desenvolvimento deste

estudo. Os animais não apresentaram índices de mortalidade diferentes entre si

(ρ>0,05).

O lítio foi administrado na forma de Carbonato de Lítio na concentração

de 1µg de Carbonato de Lítio/ml de água.

Anotamos semanalmente o volume ingerido de água de cada animal, para

avaliar a necessidade ou não de correção da concentração do lítio na água, (o que

não foi necessário) e também para detecção da possível diferença entre o volume

95

ingerido pelos animais tratados e não tratados, com a finalidade de avaliar possível

toxicidade renal, que levaria a uma maior ingestão de água (Oliveira et al, 2010).

Não observamos diferença entre os grupos tratados e não tratados, quanto ao

volume de água ingerido.

Os nossos testes para avaliação de memória e ansiedade, podem ser

influenciados por alteração na capacidade motora dos animais. Para evitar uma

possível interferência, fizemos a avaliação da atividade motora dos nossos animais,

no início e no término da pesquisa.

Como sabemos, os animais transgênicos para doença de Alzheimer

apresentam maior atividade motora no campo aberto e tarefas de reconhecimento

de objeto (Gerlai et al, 2002), refletindo uma hiperatividade motora (Morgan,2003),

esta hiperatividade pode ser devida a uma atrofia cortical e hipocampal observada

em alguns animais transgênicos para DA (Gil-Bea et al, 2007).

Observamos maior deambulação horizontal, quando comparamos o grupo TG

e WT não tratados e o grupo tratado com lítio desde os dez meses de idade, com os

tratados com lítio desde os dois meses de idade. Sabemos que a deambulação

horizontal mede atividade locomotora e é um bom teste de comportamento para

avaliar hiperatividade (Crawley, 1999), podemos inferir que o lítio pode ter inibido o

comportamento hiperativo característico do animal transgênico. Quanto à exploração

vertical, que mede comportamento exploratório (Gao, 2011) observamos que há

diferença no primeiro teste, aos seis meses de idade, entre os grupo TG não tratado

comparado ao grupo Tg tratado com lítio desde os dois meses de idade;

observamos ainda diferença, também aos seis meses de idade, entre os não

transgênicos não tratatados e os tratados com lítio desde os dois meses de idade.

Podemos inferir que o lítio dimuiu o número de movimentos verticais exploratórios,

96

provavelmente por melhorar o reconhecimento do contexto, o que levaria a uma

menor atividade motora após a exploração inicial.

A ansiedade é um distúrbio comum nos pacientes portadores da DA (Ferreti

et al, 2001), por isso avaliamos o comportamento de ansiedade dos animais pelo

teste do Labrinto em Cruz Elevado, que se fundamenta no forte conflito entre se

aproximar e evitar (Belzung e Griebel, 2001), com a tendência do roedor em ir para

áreas escuras e fechadas (aproximação), e um medo não condicionado de fugir de

áreas altas e abertas (ato de evitar) (Walf e Fryel, 2007). Os dados avaliados foram

tempo de permanência e número de entradas no braço aberto e fechado. Quanto

maior o tempo e/ou o número de entradas no braço fechado, maior o nível de

ansiedade do animal. Quanto menor o número de entradas e/ou o tempo de

permanência nos braços abertos maior o nível de ansiedade do animal. Os modelos

animais TG para a DA, inclusive o APPSwInd, apresentam aumento na ansiedade e

na atividade locomotora (Harris et al, 2010). O padrão de ansiedade está

normalmente aumentado nos modelos transgênicos para a doença de Alzheimer

(España et al, 2010), isso se repete em nosso modelo, quando observamos o

número de entradas tanto em braços abertos quanto fechados. Pesquisas anteriores

(Ferreira, 2009), mostraram que o tratamento com o lítio foi eficaz no controle da

ansiedade em ratos, avaliados pelo teste do Labirinto em Cruz Elevado. Em nossa

pesquisa, observamos uma redução da ansiedade, na avaliação do número de

entradas em braços fechados, tratados, quando comparamos os animais WT com

todos os outros grupos, inclusive o grupo TG Ctr. Podemos inferir que o lítio exerceu

uma ação ansiolítica no grupo de animais WT tratados e não teve ação nos animais

TG tratados. Ao observarmos o número de entradas nos braços abertos vemos que

97

todos os grupos mantêm o mesmo padrão, com exceção do grupo TG Ctr, que se

apresenta com comportamento de menor exploração, comparados aos TG tratados.

Vários pesquisadores têm utilizado o teste de Marble Burying para

avaliar a resposta de ansiedade ao tratamento com ansiolíticos (Broekamp et al,

1986). Embora existam questões quanto à especificidade do teste de “Esconder

esferas” (Marble Burying) e alguns pesquisadores presumam que os camundongos

enterrem as bolas por causa da novidade, verificou-se que isto não é

necessariamente verdade (Broekamp et al, 1986), existe também uma associação

entre o comportamento de escavar e o comportamento obsessivo/compulsivo

(Thomas et al, 2009), também definido como comportamentro perseverativo. Para

avaliarmos os parâmetros anteriores, utilizamos o teste de “Esconder esferas e

escavar” que já foi padronizado para avaliação do comportamento obsessivo-

compulsivo em camundongos (Deacon, 2006). Há diferença, na comparação entre o

grupo TG Ctr e WT Ctr. Com o tratamento, não observamos mais a diferença entre

os grupos, com os animais tratados mostrando comportamento perseverativo similar

aos não tratados com Lítio.

Para o estudo da memória e aprendizado espacial dos animais, optamos pelo

Labirinto Terrestre de Barnes, um paradigma comportamental apropriado para esta

avaliação (Pompl et al, 1999), e que apresenta baixo nível de aversividade. O teste

também é mais apropriado para o acompanhamento dos animais ao longo do

envelhecimento, por não envolver a necessidade de nadar, tendo sido padronizado e

utilizado extensivamente como alternativa ao labirinto aquático de Morris (Pompl et

al, 1999).

A memória espacial envolve o uso do hipocampo e áreas definidas do córtex

cerebral, sendo que roedores com lesões de hipocampo apresentam prejuízo no

98

labirinto de Barnes (Fox et al, 1998) e esta área é uma das mais acometidas pela

doença de Alzheimer (Small et al, 2000).

Carol Barnes desenvolveu este teste onde os animais procuram escapar de

uma plataforma circular com 18 buracos ao redor do perímetro, iluminada com uma

luz forte, colocada acima do labirinto. Uma pequena câmara de escape, escura é

colocada abaixo de um dos buracos (Barnes, 1979). O modelo é baseado na

aversão dos roedores por espaços abertos, que motiva o animal a encontrar a caixa

de escape mais rapidamente a cada teste (Koopmans et al, 2003).

Os testes foram realizados com o labirinto de Barnes a cada 3 meses, para

acompanhamento da evolução não só da memória, mas também do aprendizado

(aquisição) da tarefa pelos animais, ao longo do envelhecimento.

Existem pesquisas mostrando que para avaliação do aprendizado, o número

de Erros é importante para a avaliação da memória espacial no labirinto de Barnes

(Harrison et al, 2006). Portanto, para a avaliação do aprendizado foram avaliadas as

latências e os erros dos animais até encontrarem a caixa de escape. No primeiro

teste, aos 6 meses, todos os animais aprenderam a tarefa, apresentando menor

latência e número de erros nos dias subsequentes ao primeiro dia do teste. Aos

dezoito meses de idade Foi observado que os animais não mantêm a memória do

testes, porém ainda possuem capacidade de aprendizagem, pois a latência e

número de erros para achar a caixa de escape foram reduzidos ao longo dos 5 dias

de observação.

Para a avaliação da memória espacial ao longo do tratamento os valores

obtidos de latência e erros para encontrar a caixa de escape no primeiro dia dos

testes foram realizados com 6, 12, 15 e dezoito meses de idade. Pudemos, assim,

observar a memória remota dos animais, avaliadas pelo resultado obtido no primeiro

99

dia do teste, comparado ao resultado do teste executado 3 meses antes. Houve

diferença entre os grupos TG Ctr e WT Ctr aos 12 e 15 meses de idade, com relação

ao tempo 1. Não há diferença aos 18 meses, provavelmente devido ao

envelhecimento dos animais controle. Também foi observada diferença entre os

animais dos grupos TG Li2 ou TG Li10 e os tratados com água. Esta diferença não

foi observada entre os grupos WT tratados e não tratados e os grupos TG tratados, o

que nos leva a inferir que o lítio exerceu sua ação protetora na memória espacial nos

animais transgênicos, que apresentariam déficit cognitivo. A memória espacial dos

animais transgênicos tratados com lítio,parece ter sido preservada da deterioração,

característica do modelo.

Utilizando o mesmo paradigma do Labirinto Terrestre de Barnes, com a

análise do trempo de permanência no quadrante da caixa de escape, observamos

diferença, com os animais TG Li2 apresentando maior tempo de permanência que o

tratado com água. O lítio corrigiu o tempo de permanência aos níveis dos animais

não transgênicos. Isso reforça os resultados obtidos com relação à memória espacial

utilizando os tempos iniciais. Ainda, observamos que à distância percorrida no

primeiro dia do teste para memória espacial no labirinto Terrestre de Barnes difere

significativamente entre o grupo TG e o WT não tratado e que os animais tratados

desde os dois meses de idade retornaram aos níveis dos animais WT; podendo

portanto nos levar a inferir que há uma diminuição da hiperatividade característica

dos animais TG. Esses dados mostram ainda que, apesar da maior deambulação

dos animais TG não tratados, esses apresentavam maior déficit cognitivo.

Outro tipo de memória estudado foi aquela relacionada ao medo

condicionado. Essa é uma forma básica de memória associada a um estímulo

aversivo (Rescorla, 1988). Depende da amígdala que, frequentemente sofre

100

modificações patológicas com a doença de Alzheimer (Hamann et al, 2002). Essa

alteração da amígdala acarreta prejuízo na memória não declarativa, além da

declarativa, na doença de Alzheimer.

Diversos modelos de testes em animais, baseados na memória de medo, têm

sido utilizados para investigar alterações no aprendizado e na memória. No presente

estudo foi utilizado o teste da esquiva inibitória que se baseia na preferência do

roedor em permanecer em áreas escuras e fechadas (Koopmans et al, 2006),

fugindo de áreas bem iluminadas e abertas.

Nas primeiras avaliações, foi observado que todos os grupos apresentavam

diferença entre o treino e o teste, mostrando que se lembravam do estímulo

aversivo, com exceção do grupo transgênico controle que não apresentava esta

diferença. Este grupo já iniciava o primeiro dia (Treino) com maior latência para

entrar no lado escuro da caixa, sugerindo que não apresentavam mais a preferência

característica dos roedores pelo escuro e fechado. Portanto, é possível sugerir que o

tratamento com lítio preservou, até a velhice, as vias de sinalização moleculares

envolvidas no condicionamento de medo.

Os animais transgênicos para doença de Alzheimer apresentaram

características de comportamento esteriotipado típicas de modelos animais

transgênicos para Doença de Alzheimer, como hiperatividade (Ambrée, 2006),

menor ansiedade (Gortz, 2008). Estes comportamentos abeerantes são compatíveis

com comportamentros aberrantes de pacientes de doença de Alzheimer (Reyle,

2011).

Foi observada uma diferença na densidade da proteína marcadora de corpo

neuronal (NeuN) na área do Giro denteado (GRDG) e CA3 do hipocampo, com os

animais TG Ctr apresentando menor densidade neuronal que os WT. Nas regiões

101

CA1/CA2 do hipocampo, não observamos essa diferença. Nos animais transgênicos

tratados com lítio a densidade neuronal foi semelhante aos níveis dos WT. Esta

diferença pode estar relacionada com a diferença na memória espacial apresentada

pelos animais TG Li2 em realação aos demais grupos. O hipocampo está associado

com o performance da memória em ratos na versão sem o estímulo aversivo

(Kubbie, 1999). O GRDG parece estar envolvido com eventos da memória que

possam ser previstos (Tsetsenis, 2007), para que o animal navegue por uma

ambiente que estimule a memória espacial, as células granulares do GRDG

recebem como input, a atividade da rede entorrinal (EC) pela via Perforante. O

GRDG age como uma rede de aprendizado competitivo que remove as

redundâncias dos inputs (conjunção de inputs sensoriais como vestibular, olfatório,

visual, auditivo e somatosensorial), gerando outputs mais categorizados, para serem

usados em CA3 (Rolls,1996). Isto sugere, portanto, que esta competição no GRDG

permite aos indivíduos resolver padrões de separação de pistas espaciais (Gilbert,

1998). O GRDG exerce um papel importante na codificação da informação, ajudando

a construir representações espaciais para a rede CA3 posterior.

O aumento da densidade neuronal no GRDG e CA3, pode também estar

associado à menor ansiedade apresentada pelos animais tratados com lítio no

paradigma do Labirinto em cruz elevado. O estímulo no GRDG pode reduzir a

ansiedade, sem afetar o aprendizado (Kheirbek, 2013).

A análise da densidade dos corpos celulares no córtex pré-frontal, mostra um

diferença entre os animais WT e TG Ctr, com menor densidade dos corpos

neuronais no grupo TG Ctr. Com o tratamento com lítio desde os dois ou dez meses

de idade corrigiu esta alteração. Isto pode justificar a diferença na recuperação da

102

memória remota que pudemos observar no teste do Labirinto Terrestre de Barnes,

visto ser esta estrutura fundamental nesse processo (Frankland, 2005).

Com o intuito de iniciar um esclarecimento das vias moleculares que

possivelmente foram preservadas com o tratamento crônico com lítio, a quantidade

da neurotrofina BDNF foi avaliada. O BDNF apresenta-se diminuído nos modelos

animais para DA (Bournouf et al, 2012), e o lítio em doses mais altas

comprovadamente, eleva os níveis de BDNF no córtex e hipocampo destes animais

(Fukumoto et al, 2001).

Observamos que os animais TG Ctr, apresentaram menor densidade da

neutrofina (BDNF) no córtex, comparados com os animais WT. Essa menor

densidade foi revertida nos animais TG tratados com lítio desde os dois meses de

idade.

Não observamos diferença na densidade do BDNF no hipocampo dos animais

TG tratados. A manutenção dos corpos neuronais no córtex , talvez tenha se dado

por efeito neuroprotetor do BDNF, atrvés de vias moleculares que envolvem PI3K,

também envolvidas no mecanismo de ação do lítio (Almeida, 2005). No hipocampo,

podemos inferir que a neuroproteção foi proporcionada pelo lítio por outras vias

moleculares, que não envolveriam o BDNF.

Uma das possíveis vias moleculares de neuro proteção, com o tratamento

crônico com lítio é a proteção da excitotoxicidade induzida pelo glutamato, mediada

pelos receptores NMDA (Hashimoto et al, 2002), em parte devido a habilidade do

lítio em inibir o influxo de cálcio, que media a atividade no receptor NMDA. O

tratamento crônico com lítio também induz moléculas de sobrevivência no cérebro

no córtex frontal (Chen et al,1999); como a Bcl-2, uma proteína antiapoptótica que

inibe a liberação do citocromo c da mitocôndria regulando a permeabilidade da

103

membrana mitocondrial externa (Youle e Strasser, 2008); além de manter a

homeostase no Retículo Endoplasmático, que é um outro mecanismo de

citoproteção (He e Mccormick, 1997). Pode ocorrer um aumento dos os níveis da

neurotrofina BDNF, em várias regiões do cérebro (Fukumoto et al, 2001), talvez por

aumentar os níveis do m-RNA exon IV contendo mRNA de BDNF e a atividade do

promotor IV do BDNF (Yasuda et al, 2009). O tratamento crônico com lítio ainda é

capaz de induzir a neurogênese, por inibir a GSK-3 e ativar as reações da ERK,

além de aumentar o BDNF (Yan et al, 2007).

As placas amiloides, ou placas senis, são uma das principais características

da Doença de Alzheimer. A densidade das placas nos cérebros humanos analisados

pós morten são correlacionados com a severidade dos sintomas demenciais

medidos em vida (Blessed, 1968). As placas senis, algumas com 50µ de diâmetro,

são constituídas de um depósito central de fibrilas amiloides circundadas por

dendritos e axônios terminais distróficos e por micróglia ativada (Duyckaerts et al).

Em nosso modelo, nos animais transgênicos não tratados, observamos

placas em grande quantidade, coradas por Tioflanina-S. Nos animais tratados com

lítio desde os 2 meses de idade o número de placas foi quase igualado ao dos

animais não transgênicos que não apresentaram placas.

Como vimos anteriormente, as placas se originam primariamente de

agregados fibrilares de polipeptídeos à partir de oligômeros dos peptídeos β

Amiloide (Finder, 2007). O peptνdeo Aβ é produzido nas regiões ricas em colesterol

no espaço extracelular das membranas neuronais e secretado para o espaço

extracelular (Simons, 1998). Este peptídeo pode variar em seu tamanho, sendo que

o mais abundante no cérebro é o peptídeo Aβ(1-40), seguido do peptídeo Aβ(1-42)

(Finder, 2007). Estes peptídeos podem, adotar formas diferentes de agregados,

104

como fibrilas amiloides (Meinhardt et al, 2009) ou agregados neurofibrilares

chamados de oligômeros (Glabe, 2008). Os peptídeos βAmilodes, assim como as

placas ocorrem principalmente no espaço extra-celular (Meyer-Luehmann et al,

2003). Mas, existem evidências da importância do peptídeo intracelular Aβ(16-20). O

processo de formação das placas amiloides é, em parte, dependente de um

processo que envolve a endocitose ou a fagocitose do peptídeo Aβ, dentro das

vesículas de fagocitose as fibrilas se formam e penetram a membrana vesicular. As

placas formadas no espaço intracelular levam a morte das células e as estruturas

amiloides são liberadas no espaço extra celular. Esse mecanismo é reforçado por

pesquisas que mostram a perda da integridade das membranas

lisossomo/endossômicas como um evento precoce da patogênese do Aβ e a ligação

das vesículas intracelulares de Aβ com a morte celular (Yang et al, 1998).

Várias são as vias de neurotoxicidade das placas amiloides. Uma das vias

mais conhecidas na formação e patogenicidade das placas amiloides é a via da

GSK3, já abordada anteriormente. A enzima GSK3 é altamente expressa em todo o

organismo. Possui duas isoformas a GSK-3α e a GSK-3β (Liang e Chuang, 2006)

ambas relacionadas com a DA (Pei et al, 1999) por seus mecanismos de

hiperfosforilaçao da proteína Tau, estímulo da cascata inflamatória, produção do

peptídeo Aβ, além de outras vias ativadas por essas enzimas (Hooper, 2008). Em

nosso estudo, no entanto, não houve diferença na concentração da enzima GSK-3β

no hipocampo ou no córtex dos animais TG tratados, comparados com os não

tratados.

Provavelmente a redução importante do número de placas nesses animais,

deva-se a outro mecanismo da ação do lítio. Um pode ser a inibição da GSK-3α,

também envolvida na formação da placas (Phiel, 2003). A autofagia, um processo

105

fisiológico de degradação de proteínas citoplasmáticas ou organelas, é um processo

de resposta ao stress e um dos principais reguladores da função e sobrevivência

neuronal, por controlar as proteínas mal formadas que se agregam, e é regulada

negativamente pelo mTOR e positivamente por inibição da inositol monofosfatase;

ambos regulados pelo tratamento crônico com lítio (Sarkar e Rubinsztein, 2006). O

stress oxidativo, diretamente associado ao aumento da produção do peptídeo Aβ

(Goldsbury et al, 2008), é uma outra via inibida pelo lítio (Khairova et al, 2012), que

poderia ser responsável pela redução das placas amiloides.

A inibição da formação das placas parece ter sido fundamental para as

alterações comportamentais encontradas. A deposição das placas amiloides no

hipocampo está associada com alterações do comportamento em camundongos

(Couch, 2013) e humanos (Villemagne, 2013).

Houve um aumento da densidade da Sinaptofisina no hipocampo dos animais

TG Ctr, comparados com os animais TG Li10. Existem estudos que mostram

aumento da reatividade da sinaptofisina em hipocampo de camundongos

transgênicos para a DA, associadas a uma maior concentração das placas

amiloides, provavelmente relacionado a um aumento de neurônios distróficos com

liberação destas proteínas de seus terminais sinápticos (Takeushi, 2000). O

tratamento com lítio parece ter protegido os neurônios de uma maior degeneração.

106

Conclusão

Após a análise dos animais por um período de 18 meses, pudemos concluir

que:

Os animais tratados com lítio apresentaram uma atividade motora

menor que os não tratados, podendo significar que o lítio controlou

esse comportamento de hiperatividade comum nos animais

transgênicos para APP.

O lítio melhorou o comportamento de ansiedade medido pelo Labirinto

em Cruz Elevado.

O lítio protegeu a memória espacial e aversiva dos animais tratados,

que se mantiveram iguais aos seus controles.

O tratamento crônico com lítio preservou a memória espacial e a

relacionada a um estímulo aversivo durante todo o processo de

envelhecimento.

O aumento do BDNF no córtex parece ser parte de um sistema

compensatório da agressão hipocampal, com aumento da densidade

neuronal.

O aumento da densidade neuronal tanto nas regiões GRDG como

CA1/CA2 do hipocampo, provavelmente se deve a um mecanismo de

neuroproteção do lítio.

O aumento da densidade neuronal no córtex pré-frontal, provavelmente

está relacionado com a manutenção da e recuperação da memória

consolidada, observada nos animais transgênicos tratados.

107

Houve uma redução importante das placas amiloides nos animais

tratados cronicamente com lítio, que pode refletir seu grande papel

neuroprotetor.

Não houve alteração nas enzimas GSK-3β total ou fosforilada, no

hipocampo. Isso nos direciona para novos estudos das ações

moleculares protetoras do lítio nessa estrutura, nesse modelo.

Houve menutenção da atividade da enzima GSK-3β no córtex dos

animais tratados com lítio desde os dois meses de idade.

108

Aprovação da Comissão de Ética no uso de animais

109

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129

Resumo

A doença de Alzheimer (DA), uma doença neurodegenerativa progressiva,

leva a uma deterioração da memória e outras funções cognitivas, culminando com a

morte dos pacientes 3 a 9 anos após o início dos sintomas. Os tratamentos que

existem atualmente não modificam as características da doença, atuando apenas

nas suas manifestações sintomáticas. Recentemente, nosso grupo mostrou que o

tratamento com microdoses de lítio foi capaz de estabilizar o déficit cognitivo de

pacientes portadores da DA. O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade do

tratamento crônico com lítio, em microdoses, na prevenção do prejuízo da memória

observado em camundongos transgênicos que expressam a proteína precursora

amiloide humana e seus controles não transgênicos da mesma ninhada, ao longo do

envelhecimento. Os camundongos transgênicos (Cg-Tg (PDGFB-APPSwInd)

20Lms/2J) e seus controles não transgênicos foram tratados com Carbonato de Lítio

(1,2mg/Kg/dia na água do bebedouro) por 16 ou 8 meses, iniciando aos 2 ou aos 10

meses de idade, respectivamente. A memória espacial foi avaliada no labirinto de

Barnes inicialmente aos 6 meses de idade e ao longo do tratamento (a cada 3

meses) até os animais atingirem 18 meses de idade. Após a última sessão do

labirinto de Barnes, os animais foram submetidos à caixa de atividade motora, ao

teste de Marble-burying, ao labirinto em cruz elevado e à esquiva inibitória para

avaliar, respectivamente, a atividade motora, comportamento compulsivo, ansiedade

e memória relacionada ao estímulo aversivo. Os dados foram submetidos à análise

estatística por ANOVA de duas vias e as diferenças foram consideradas

significativas quando ρ<0.05. Aos 6 meses de idade, todos os grupos estavam aptos

a aprender e memorizar as tarefas no labirinto de Barnes (ρ=0.002, F(5,56) = 14.87).

130

Ao final do tratamento, todos os grupos transgênicos tratados com lítio não

apresentaram prejuízo da memória como observado no grupo transgênico tratado

com água (ρ<0.0001; F(5,63) =7.32). Todos os grupos não transgênicos não

apresentaram alteração da memória ao final do tratamento. Na esquiva inibitória, no

teste da memória aversiva, tanto os grupos transgênicos como os não transgênicos

tratados com lítio, mostraram manutenção da memória, enquanto os camundongos

transgênicos apresentaram prejuízo da memória. Não observamos diferença entre

os grupos nos outros testes, mostrando que a melhora da memória não era devida a

outras alterações comportamentais.

A análise estereológica do BDNF, uma neurotrofina envolvida na plasticidade

neuronal mostrou maior concentração no córtex cerebral dos animais do grupo

transgênico que usavam lítio desde os 2 meses de idade, quando comparados ao

grupo transgênico que usavam água e aos não transgênicos que usavam lítio desde

os 2 meses de idade.

A análise da densidade neuronal, feita pela quantificação imunhistoquímica da

proteína neuronal NeuN, mostrou aumento da densidade em área proporcional nos

animais tratados com lítio desde os 2 meses de idade comparados com os animais

transgênicos não tratados.

Quanto ao número de placas amiloides, uma das alterações ultraestruturais

características da doença de Alzheimer, houve diferença nos animais tratados com

lítio desde os 2 meses de idade comparados com os animais não tratados e tratados

com lítio desde os 10 meses de idade (ρ<0.0001).

A análise da Sinaptofisina ou proteína 38, uma proteína das vesículas

sinápticas, um aumento nos animais TG Ctr, comparados com os animais TG Li10.

Concluindo, nossos dados comprovam o papel terapêutico do lítio em microdose, na

131

manutenção do processo de memória ao longo do envelhecimento, no processo

neurodegenerativo esperado na doença de Alzheimer.

132

Abstract

Alzheimer´s disease (AD), a progressive neurodegenerative disease, leads to

deterioration of memory and other cognitive domains culminating with patient’s death

frequently within 3 to 9 years after diagnosis. Nowadays, treatment options have no

disease modifying properties, targeting only the relief of symptoms. Recently, our

group showed that microdose lithium treatment was able to stabilize the cognitive

deficit observed in AD patients. Therefore, the aim of this study was to evaluate the

effectiveness of chronic lithium treatment, in microdose, in prevention of memory

disruption observed in transgenic mice expressing human amyloid precursor protein

as well as in their non-transgenic littermate mice along aging. Transgenic mice (Cg-

Tg(PDGFB-APPSwInd)20Lms/2J) and their non-transgenic littermate genetic controls

were treated with lithium carbonate (1.2 mg/Kg/day in drinking water) for 16 or 8

months starting at two and ten months of age, respectively. Barnes Maze evaluated

spatial memory, initially at six months-old and along the treatment (at each three

months intervals) until the animals reach 18 months-old. After the last Barnes maze

session, we submitted the animals to an activity box; to marble and digging test; to

the elevated plus-maze and to inhibitory avoidance shuttle box in order to evaluate,

respectively, motor activity, compulsive behavior, anxiety and memory related to

aversive stimulus. Two-way ANOVA were used to analyze the data and the

differences were considered significant when ρ <0.05. At 6 months of age, all groups

were able to learn and memorize the task in Barnes maze (ρ =0.002 F(5,56))= 14.87).

At the end of treatments, both transgenic lithium treated groups showed no memory

disruption as observed in the transgenic water treated group (ρ <0.0001; F(5,56)=7.32).

Also, all the non-transgenic mice showed no memory disruption at the end of the

133

treatment. Additionally, in aversive memory test, both transgenic and non-transgenic

groups treated with lithium showed memory stabilization, whereas transgenic mice

treated with water showed memory disruption. We have not observed significant

differences among groups in other behavioral tests, suggesting that memory

improvements were not due to other behavioral changes.

BDNF stereology analysis showed higher concentration of this neurotrophin in

cortex of transgenic mice that use lithium since 2 months-old group compared to

control transgenic mice and no transgenic mice that use lithium since 2 months-old

group.

Neuron density analysis, perfformed by imunohistochemistry quantification of

NeuN neuron protein, showed proportional area density increase in transgenic

treated animals since age 2 months compared to untreated transgenic mice.

The amyloid plaques, one of the major neuropathologic characteristic of

Alzheimer’s disease, were quantified by the Thioflavin Fluorescence method and

showed difference if we compared untreated and treated animals since 2 and 10

months age transgenic animals (ρ<0.0001).

In conclusion, our data support the therapeutic role of lithium in microdoses in

maintenance of memory process along aging of memory process, in the expected

neurodegenerative process in Alzheimer’s disease.

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