mariana marin monteiro efeitos da elevada …

MARIANA MARIN MONTEIRO

EFEITOS DA ELEVADA CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE SOBRE

FIBROBLASTOS PERIODONTAIS HUMANOS – POTENCIAL REGULAÇÃO

POR MICRORNAS 221 e 222

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo para obtenção de título de Doutor em Ciências.

SÃO PAULO

2017

MARIANA MARIN MONTEIRO

EFEITOS DA ELEVADA CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE SOBRE

FIBROBLASTOS PERIODONTAIS HUMANOS – POTENCIAL REGULAÇÃO

POR MICRORNAS 221 e 222

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo para obtenção de título de Doutor em Ciências Área de Concentração: Biologia Celular e Tecidual Orientador: Profa. Dra. Marinilce Fagundes dos Santos Versão Original

SÃO PAULO

2017

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

_____________________________________________________________________________________________________

Candidato(a): Mariana Marin Monteiro

Título da Tese: Efeitos da elevada concentração de glicose sobre fibroblastos

periodontais humanos – potencial regulação por microRNAs 221 e 222

Orientador(a): Profa. Dra. Marinilce Fagunds dos Santos

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão

pública realizada a ................./................./................., considerou

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a): Assinatura: ...............................................................................................

Nome: .......................................................................................................

Instituição: ................................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................

Nome: .......................................................................................................

Instituição: ................................................................................................


Nome: .......................................................................................................

Instituição: ................................................................................................


Nome: .......................................................................................................

Instituição: ................................................................................................

Presidente: Assinatura: ................................................................................................

Nome: .......................................................................................................

Instituição: ................................................................................................

Dedico este trabalho a todos os pacientes que

participaram deste estudo assim como pacientes que

possam vir a usufruir destes resultados.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por ser meu alicerce desde o início de minha vida.

Agraço à minha família, meus pais Célia e Maurício pelo total apoio e confiança em mim,

mesmo não entendendo totalmente a razão da minha escolha acadêmica; aos meus irmãos

Alex, Hélio e Patrícia por acreditarem em mim, assim como aos meus sobrinhos por me

trazerem tanta alegria e cunhados, por torcerem sempre por mim.

Agradeço aos meus amigos que tanto me ampararam em momentos felizes, tristes; que

doaram ouvidos e ombros para meus desabafos.

Agradeço a todos os meus professores que me ensinaram desde o período pré-escolar até

hoje.

Á Professora Marinilce Fagundes dos Santos que me aceitou em seu laboratório durante

todos esses 8 anos e que me ensinou o que é pesquisa e vida acadêmica. Assim como

sempre me incentivou a me dedicar, não só à academia, mas também, à clinica.

Ao Professor Niels Olsen Camara que, de tanto mostrar sua paixão pela imunologia durante

suas aulas na graduação, me contagiou e me instigou a conhecer o mundo da pesquisa e à

Professora Maria Aparecida Borsatti por me ensinar a cuidar dos pacientes necessitados com

carinho e dedicação durante os anos que estagiei no setor de Urgências Odontológicas da

FOUSP.

Á Tânia Aparecida de Azevedo, dentista que me mostrou o que é ser apaixonado pela

profissão e que tanto me ensinou na arte de clinicar.

Agradeço à FAPESP pelo apoio financeiro para que este projeto pudesse ser desenvolvido -

processo: 2012/24508-0.

"Não se acomode com as primeiras conquistas. Quem

nunca pára de plantar, nunca deixará de colher."

(Autor Desconhecido)

"Antes de ser um excelente profissional, seja um bom ser

humano."

(Autor Desconhecido)

"O caminho que eu escolhi é o do amor. Não importam as

dores, as angústias, nem as decepções que vou ter que

encarar. Escolhi ser verdadeira. No meu caminho, o

abraço é apertado, o aperto de mão é sincero. Por isso,

não estranhe a minha maneira de sorrir e de te desejar

tanto bem. Eu sou aquela pessoa que acredita no bem,

que vive no bem e que anseia o bem. É assim que eu

enxergo a vida. E é assim que eu acredito que vale a pena

viver.."

(Clarice Lispector)

RESUMO

MONTEIRO, M. M. Efeitos da elevada concentração de glicose sobre fibroblastos

periodontais humanos - potencial regulação por microRNAs 221 e 222. 2017. 95 f. Tese

(Doutorado em Biologia Celular e Tecidual). Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade

de São Paulo, São Paulo, 2017.

O Diabetes Mellitus (DM) é caracterizado por hiperglicemia crônica (HG), que gera complicações em diferentes orgãos. Em odontologia, complicações frequentes do DM são o aumento de incidência e progressão da doença periodontal e deficiência na cicatrização de lesões orais. A função de fibroblastos, células muito importantes na cicatrização, é afetada pela HG. Dentre as funções alteradas está a migração celular, importante na fisiologia e regeneração periodontal. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da glicose elevada sobre funções (proliferação e migração) de células do ligamento periodontal humano, e esclarecer o papel de microRNAs (miRNAs) regulados pela glicose nas alterações observadas. As células foram obtidas de dentes pré-molares hígidos de crianças/adolescentes entre 8 e 14 anos, com indicação para extração por razões ortodônticas. Após o estabelecimento das culturas sob concentração fisiológica de glicose (5 mM), as células foram divididas em dois grupos: controle (LG, 5 mM de glicose) e glicose elevada (HG, 30 mM de glicose), mantidos por 7 dias nessas condições. Em células semeadas sobre fibronectina, a glicose elevada reduziu a adesão celular em 20%, reduziu o espraiamento celular em 35% e inibiu a migração celular em 54%, com redução da velocidade e direcionalidade celulares. As células apresentavam baixa polaridade e múltiplos processos simultâneos pouco estáveis. A glicose não alterou a proliferação celular, mas aumentou a morte celular por apoptose e a expressão de caspase 3 em cerca de 3x. A expressão de miRNAs 29a e 29ax não foi modulada pela glicose elevada, ao contrário da expressão de miRNAs 221 e 222, que mostrou-se reduzida em cerca de 40%. A inibição de miR-221 e miR-222 por transfecção transiente utilizando antagomiRs em células controle reduziu a migração e aumentou a morte celular, enquanto a superexpressão destes dois miRs utilizando miR mimics em células expostas à glicose elevada aumentou a migração celular e reduziu a morte por apoptose. Em conclusão, células do ligamento periodontal humano são sensíveis à elevada concentração de glicose em funções muito relevantes para a cicatrização e regeneração, como migração e sobrevivência. É possível que os efeitos da glicose sobre a migração e morte por apoptose nestas células seja mediado, pelo menos em parte, por miRNAs 221 e 222.

Palavras-chave: Hiperglicemia. Ligamento Periodontal. Migração. Apoptose. MicroRNAs.

ABSTRACT MONTEIRO, M. M. Effects of high glucose on human fibroblasts from periodontal ligament

– potencial regulation by microRNAs 221 and 222. 2017. 95 p. Ph.D. thesis (Cell and Tissue

Biology) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.

Diabetes Mellitus (DM) is characterized by chronic hyperglycemia (HG), which generates

complications in different organs. In dentistry, frequent complications of DM are the

increased incidence and progression of periodontal disease and deficient healing of oral

lesions. Hyperglycemia affects different functions of fibroblasts, cells very important in

wound healing. Among the altered functions is cell migration, important in physiology

and periodontal regeneration. The objective of this study was to evaluate the effects of

high glucose on functions (proliferation and migration) of human periodontal ligament

cells and to clarify the role of glucose - regulated microRNAs (miRNAs) in the observed

alterations. The cells were obtained from healthy pre-molar teeth of children /

adolescents between 8 and 14 years of age, with indication for orthodontic extraction.

After the establishment of the cultures under physiological glucose concentration (5

mM), cells were divided into two groups: control (LG, 5 mM glucose) and high glucose

(HG, 30 mM glucose), maintained for 7 days under these conditions. In cells seeded on

fibronectin, high glucose reduced cell adhesion by 20%, reduced cell spreading by 35%

and inhibited cell migration by 54%, with reduced cell velocity and directionality. The cells

had low polarity and multiple simultaneous unstable processes. Glucose did not alter cell

proliferation, but increased cell death by apoptosis and caspase 3 expression by about 3x.

Expression of miRNAs 29a and 29x was not modulated by high glucose, unlike the

expression of miRNAs 221 and 222, which was reduced by about 40%. Inhibition of miR-

221 and miR-222 by transient transfection using antagomiRs in control cells reduced

migration and increased cell death, while overexpression of these two miRs using miR

mimics in cells exposed to high glucose increased cell migration and reduced death by

apoptosis. In conclusion, cells of the human periodontal ligament are sensitive to the high

concentration of glucose in functions very relevant for healing and regeneration, such as

migration and survival. It is possible that the effects of glucose on migration and death by

apoptosis in these cells are mediated, at least in part, by miRNAs 221 and 222.

Keywords: Hyperglycemia. Periodontal Ligament. Cell migration. Apoptosis. MicroRNAs.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Primers utilizados para avaliação da diferenciação celular ............................................. 37

Tabela 2 Alvos validados e preditos para miR-221-3p e miR-222-3p, de acordo com

programas computacionais online ............................................................................................... 74

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Vias metabólicas intracelulares ativadas no DM ............................................................. 19

Figura 2 Esquema de perda de inserção do dente devido à doença periodontal .......................... 21

Figura 3 Esquema de movimentação ortodôntica ........................................................................ 23

Figura 4 Esquema de um dente inserido no alvéolo com lesão periapical por contaminação

endodôntica ................................................................................................................................. 24

Figura 5 Esquema de uma célula aderente migrando .................................................................. 26

Figura 6 Esquema de um fibroblasto migratório, apresentando os processos regulados pelas

GTPases RhoA, Rac1 e Cdc42 ....................................................................................................... 28

Figura 7 MiRNAs e GTPases Rho ................................................................................................... 30

Figura 8 Análise da expressão gênica de S100A4 em células de ligamento periodontal ................ 48

Figura 9 Análise da marcação em ER-TR7 em células do ligamento periodontal ........................... 49

Figura 10 Evidenciação do citoesqueleto de F-actina em células de ligamento periodontal

após exposição à elevada concentração de glicose ...................................................................... 50

Figura 11 Análise da circularidade de células de ligamento periodontal humano após

exposição à elevada concentração de glicose ............................................................................... 50

Figura 12 Efeitos da glicose elevada sobre a adesão de células do ligamento periodontal à

fibronectina ................................................................................................................................. 51

Figura 13 Efeitos da glicose elevada sobre o espraiamento de células de ligamento

periodontal. ................................................................................................................................. 52

Figura 14 Efeitos da glicose elevada sobre a migração de células do ligamento periodontal ....... 53

Figura 15 Efeitos da glicose elevada sobre a direcionalidade de células do ligamento

periodontal .................................................................................................................................. 54

Figura 16 Efeitos da glicose elevada sobre a velocidade de células do ligamento periodontal ...... 54

Figura 17 Efeitos da glicose elevada sobre o número de protrusões em células do ligamento

periodontal .................................................................................................................................. 55

Figura 18 Análise da dinâmica de formação e retração de protrusões em células do

ligamento periodontal após exposição à elevada concentração de glicose ................................... 56

Figura 19 Efeitos da glicose elevada sobre o crescimento de células do ligamento periodontal ... 57

Figura 20 Efeitos da elevada concentração de glicose sobre a proliferação de células do

ligamento periodontal ................................................................................................................. 58

Figura 21 Efeitos da glicose elevada sobre a morte por apoptose de células do ligamento

periodontal .................................................................................................................................. 59

Figura 22 Avaliação do papel da osmolaridade sobre a morte por apoptose de cálulas do


Figura 23 Imagem representativa de imunomarcação de caspase 3 em célula do ligamento

periodontal .................................................................................................................................. 61

Figura 24 Efeitos da glicose elevada sobre a expressão proteica de caspase 3 em células do


Figura 25 Expressão do miR-29a em células do ligamento periodontal após exposição à

elevada concentração de glicose .................................................................................................. 63

Figura 26 Expressão do miR-29ax em células do ligamento periodontal após exposição à


Figura 27 Expressão de miR-221 em células do ligamento periodontal após exposição à


Figura 28 Expressão de miR-222 em células do ligamento periodontal após exposição à


Figura 29 Supressão de miR-221 em células do ligamento periodontal ....................................... 65

Figura 30 Supressão de miR-222 em células do ligamento periodontal ........................................ 66

Figura 31 Avaliação da morte celular por apoptose após supressão de miR-221 e miR-222 em

células do ligamento periodontal ................................................................................................. 67

Figura 32 Avaliação da migração celular por ensaio de transwell após supressão de miR-221

e miR-222 em células do ligamento periodontal .......................................................................... 67

Figura 33 Avaliação da direcionalidade celular por ensaio de time-lapse após supressão de

miR-221 e miR-222 em células do ligamento periodontal ............................................................ 68

Figura 34 Avaliação da velocidade celular por ensaio de time-lapse após supressão de miR-

221 e miR-222 em células do ligamento periodontal .................................................................... 69

Figura 35 Superexpressão de miR-221 em células do ligamento periodontal ............................... 70

Figura 36 Superexpressão de miR-222 em células do ligamento periodontal ............................... 70

Figura 37 Avaliação da morte celular por apoptose após superexpressão de miR-221 e miR-

222 em células do ligamento periodontal .................................................................................... 71

Figura 38 Avaliação da migração celular por ensaio de transwell após superexpressão de


Figura 39 Avaliação da direcionalidade celular por ensaio de time-lapse após superexpressão

de miR-221 e miR-222 em células do ligamento periodontal ........................................................ 72

Figura 40 Avaliação da velocidade celular por ensaio de time-lapse após superexpressão de


Figura 41 Evidenciação do citoesqueleto de F-actina em células do ligamento periodontal

após exposição à elevada concentração de glicose e a um inibidor de Rho cinase (ROCK) ............ 75

Figura 42 Efeitos da glicose elevada e da inibição de ROCK sobre a migração de células do


Figura 43 Efeitos da glicose elevada e da inibição de ROCK sobre a direcionalidade de células

do ligamento periodontal............................................................................................................. 77

Figura 44 Efeitos da glicose elevada e da inibição de ROCK sobre a velocidade de células do


Figura 45 Avaliação do número de células do ligamento periodontal após exposição à

elevada concentração de glicose e ao inibidor de Rho cinase (ROCK) Y27632 .............................. 78

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AGEs – Advanced glycation end products

DM – Diabetes mellitus

EROs – Espécies reativas de oxigênio

FN – Fibronectina

GAP – GTPase-Activating Protein

GDI – Guanosine nucleotide dissociation inhibitor

GEF – Guanine nucleotide exchange factor

HG – High glucose

LG – Low glucose

MEC – Matriz extracelular

MMPs – Metaloproteinases de matriz

NEAA – Aminoácidos não essenciais

PFA – Paraformaldeído

Rac1 – Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1

RhoA – Ras homology gene family member A

RT-PCR – Reverse transcription polymerase chain reaction

SFB – Soro Fetal Bovino

TGF-β – Transforming growth factor β

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 17

1.1 Considerações Gerais sobre Diabetes Mellitus ....................................................................................17

1.2 Diabetes Mellitus e Periodonto ...........................................................................................................19

1.3 Diabetes mellitus e Cicatrização ........................................................................................................23

1.4 Hiperglicemia e Migração de Fibroblastos ..........................................................................................25

1.5 Hierglicemia, Migração Celular e MicroRNAs ......................................................................................28

1.6 MicroRNAs e Periodonto ....................................................................................................................31

2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 34

3 Materiais e Métodos ................................................................................................... 35

3.1 Obtenção e Cultivo de Células Primárias de Ligamento Periodontal Humano ......................................35

3.2 Substrato de Fibronectina ..................................................................................................................35

3.3 Caracterização das Células Primárias de Ligamento Periodontal Humano ...........................................36

3.3.1 Avaliação da expressão gênica de marcadores celulares ............................................................36

3.3.2 ...............Avaliação da expressão proteica do marcador ER-TR7 (Fibroblast Marker) por imunocitoquímica

.......................................................................................................................................................................36

3.4 Exposição de células primárias de ligamento Periodontal humano à elevada concentração de glicose.37

3.5 Análise da morfologia, adesão e espraiamento celulares ....................................................................37

3.5.1 Citoquímica para caracterização do citoesqueleto de F-actina ...................................................37

3.5.2 Análise da circularidade celular .................................................................................................38

3.5.3 Análise de protrusões celulares .................................................................................................38

3.5.4 Ensaio de adesão e espraiamento celular ..................................................................................38

3.6 Ensaios de migração celular ...............................................................................................................38

3.6.1 Ensaio de migração celular por Transwell ..................................................................................38

3.6.2 Ensaio de migração celular por time-lapse ................................................................................39

3.7 Crescimento celular: Proliferação celular X Morte celular....................................................................40

3.7.1 Ensaios de Proliferação celular ..................................................................................................40

3.7.2 Ensaio de marcação de células apoptóticas por método de TUNEL ............................................40

3.7.3 Imunocitoquímica para a análise de Caspase 3 ..........................................................................41

3.8 Análise da expressão gênica por PCR em Tempo Real .........................................................................41

3.8.1 Extração de RNA total ...............................................................................................................41

3.8.2 Síntese de cDNA .......................................................................................................................42

3.8.3 PCR em Tempo Real ..................................................................................................................43

3.9 Transfecção transiente de microRNAs ................................................................................................43

3.9.1 Supressão de miRNAs-221 e -222 em células de ligamento periodontal humano .......................43

3.9.2 Superexpressão de miRNA-221 e miRNA-222 células de ligamento periodontal humano ...........44

3.10 Análise de Alvos Potenciais dos miRNAs por Bioinformática ...........................................................45

3.11 Inibição de ROCK com Y27632 em células de ligamento periodontal humano .................................45

3.12 Análise estatística .........................................................................................................................46

4 RESULTADOS................................................................................................................ 47

4.1 Padronização das culturas primárias de células do ligamento periodontal ..........................................47

4.2 Morfologia Celular, adesão e espraiamento .......................................................................................49

4.3 Migração celular ................................................................................................................................52

4.4 Crescimento celular: proliferação celular X morte celular ....................................................................56

4.5 Análise da expressão gênica de miRNAs por PCR em tempo real .........................................................62

4.6 Estudos funcionais dos miR-221 e miR-222 em células do ligamento periodontal ................................65

4.6.1 Supressão de miR-221 e miR-222 ..............................................................................................65

4.6.2 Superexpressão de miR-221 e miR-222 .....................................................................................69

4.7 Busca por Alvos ..................................................................................................................................73

4.8 Inibição de ROCK por Y27632 .............................................................................................................74

5 Discussão ..................................................................................................................... 79

6 CONCLUSÃO................................................................................................................. 85

REFERÊNCIAS....................................................................................................................86

17

1 INTRODUÇÃO

1.1 Considerações Gerais sobre Diabetes Mellitus

Segundo a Organização Mundial de Saúde – OMS, o Diabetes Mellitus (DM) é

uma desordem metabólica caracterizada por defeitos na secreção ou função da insulina, ou

ambos, levando à hiperglicemia (HG) crônica e a distúrbios no metabolismo de carboidratos,

gorduras e proteínas. Segundo a Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD), há uma epidemia

de DM em curso, com uma estimativa de 387 milhões de pessoas portadoras desta

desordem no mundo, podendo atingir o número de 471 milhões até 2035. A Pesquisa

Nacional de Saúde – PNS estimou que, em 2013, no Brasil, 6,2% da população com 18 anos

ou mais de idade referiram diagnóstico médico de DM. A SBD aponta estudos que revelam

taxas de 33,7 mortes/100 mil habitantes para a população geral brasileira em 2011. A essa

epidemia pode-se relacionar mudanças gradativas no estilo de vida (aumento do

sedentarismo, por exemplo) e alimentação, ao longo das últimas décadas, que contribuem

para o aumento da prevalência do DM em adultos de diferentes faixas etárias. O DM

promove diversas complicações de longo prazo, a maioria associada à hiperglicemia crônica.

Dentre as mais relevantes estão a infertilidade masculina (MASCARENHAS et al., 2012),

disfunções na microvasculatura, neuropatia, retinopatia, insuficiência renal e cicatrização

deficiente (BROWNLEE, 2010; DANAEI et al., 2011).

Quanto maior a captação da glicose extracelular pelas células, maior é sua

susceptibilidade (Brownlee, 2001). Já foi demonstrado em células mesangiais e em alguns

outros tipos celulares, por exemplo, que a HG promove aumento de fluxo na via glicolítica e

na cadeia transportadora de elétrons mitocondrial. A atividade mitocondrial elevada gera

uma maior quantidade de espécies reativas de oxigênio (EROs), que podem superar as

defesas antioxidantes celulares e ocasionar um estresse oxidativo (BROWNLEE, 2001; 2010).

Estas moléculas reativas afetam a atividade de enzimas da via glicolítica, particularmente da

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), lentificando o fluxo na via e acumulando

diferentes metabólitos nas células. Este acúmulo, por sua vez, gera um aumento no fluxo de

vias paralelas à via glicolítica (figura 1), que resulta num aumento adicional do estresse

oxidativo e alterações significativas da expressão gênica, devido a modificações moleculares

e alteração da expressão de diferentes fatores de transcrição (BROWNLEE, 2010).

18

Figura 1 – Vias metabólicas intracelulares ativadas no DM.

Espécies reativas de oxigênio (O2-) inibem a atividade da enzima GAPDH, lentificando o

fluxo na via glicolítica e ativando, devido ao acúmulo de diferentes metabólitos, o fluxo em vias paralelas como a via dos polióis, via das hexosaminas, via da proteína cinase C e formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs). De maneira geral, a ativação destas vias resulta em depleção de defesas antioxidantes e aumento da geração de espácies reativas de oxigênio, aumentando o estresse oxidativo. Modificado de: (BROWNLEE, 2001).

Conforme mencionado, a hiperglicemia aumenta progressivamente a glicosilação

nao enzimática (glicação) de proteínas, devido à formação de produtos de glicação avançada

(AGEs). Estes compostos heterogêneos formam-se constantemente sob condições

fisiológicas (envelhecimento, por exemplo) e patológicas e, dentre outros efeitos, estimulam

a secreção de citocinas inflamatórias (BYUN et al., 2017). AGEs acumulam-se em proteínas

ligando-se aos grupos amina de maneira aleatória, podendo alterar sua função. No caso de

componentes da matriz extracelular (colágeno, por exemplo), este efeito é magnificado pelo

fato da maioria apresentar meia-vida longa; o depósito de AGEs pode afetar, por exemplo,

sítios de interação entre a matriz extracelular e as células (VOZIYAN et al., 2014).

Adicionalmente, o acúmulo de AGEs promove um aumento da geração de EROs, o que pode

impactar significativamente na sobrevivência e longevidade celular, levando à ativação de

19

caspases e, consequentemente, à morte celular programada por apoptose ou autofagia

(MAIESE, 2015).

Uma complicação comum do DM é a deficiência na cicatrização em pele e

mucosas. Em odontologia, o DM também aumenta significativamente a incidência e

velocidade de progressão da doença periodontal, condição multifatorial iniciada por

infecção com bactérias patogênicas, promovida pela inflamação e resposta imunológica

contra estas bactérias e modificada por diferentes fatores ambientais e genéticos. Além da

doença periodontal, o DM pode influenciar a movimentação ortodôntica e a regeneração de

lesões periapicais, mesmo após tratamento endodôntico. Complicando ainda mais este

quadro, o DM reduz significativamente o fluxo salivar, gerando inúmeras complicações

decorrentes da menor salivação: aumento de infecções oportunistas, atrofia da mucosa,

aumento de cáries e de doença periodontal (GONZALEZ-SERRANO et al., 2016).

1.2 Diabetes Mellitus e Periodonto

O ligamento periodontal (LP) é um tecido conjuntivo muito celular, que contém

feixes espessos de fibras colágenas que conectam dois tecidos mineralizados: o cemento que

recobre a raiz do dente e a superfície cortical do osso alveolar. Contém uma variedade de

populações celulares, como fibroblastos e todos os tipos celulares encontrados nos tecidos

conjuntivos propriamente ditos (p. ex. macrófagos e outras células de defesa, mastócitos),

osteoblastos, osteoclastos, cementoblastos, células endoteliais e células

tronco/progenitoras. Além disso, é muito inervado (principalmente inervação sensorial

aferente e vasomotora eferente) e vascularizado. De maneira geral, o LP exerce funções de

suporte e fixação do dente no alvéolo, sensorial, de nutrição e de homeostasia do

dente/periodonto (TEN CATE, 2013). Diferentemente de outros tecidos conjuntivos

propriamente ditos, o LP apresenta elevado metabolismo celular e sofre remodelação de

maneira bastante dinâmica (CARNEIRO; MORAES, 1965).

A origem das células indiferenciadas e fibroblastos do LP é o folículo dentário,

tecido de origem ectomesenquimal derivado da crista neural, que circunda o germe dental

durante o seu desenvolvimento (LUBBOCK et al., 1996; PALMER; LUMSDEN, 1987). Existe

uma população celular no LP com resposta imediata a forças de tensão e tração, com uma

20

habilidade única de levar a diferenciação celular a um estado fibroblástico ou osteogênico,

dependendo da posição que a célula ocupa no ligamento (BEERTSEN; MCCULLOCH; SODEK,

1997).

A doença periodontal é uma doença de origem infecciosa que leva à inflamação

progressiva dos tecidos periodontais, gerando dano tecidual e perda gradual da inserção do

dente no alvéolo. A destruição dos feixes de colágeno que inserem o dente no alvéolo em

fases avançadas da doença é irreversível, gerando grande complexidade para uma potencial

reconstituição terapêutica do periodonto de inserção. O aparecimento de bolsas

periodontais (figura 2), espaços que surgem entre a gengiva e o dente após a destruição do

ligamento periodontal e de parte do osso alveolar, impede a boa higienização pelo paciente

e acelera a progressão da doença devido ao acúmulo de cálculo e bactérias na superfície

radicular. Devido a este acúmulo, os tecidos periodontais não aderem ao dente e a bolsa

aumenta progressivamente. Em diversos aspectos, esta condição se assemelha a uma ferida

crônica que não cicatriza devido à permanência do agente agressor.

Figura 2 – Esquema de perda de inserção do dente devido à doença periodontal.

À esquerda observa-se um periodonto saudável e à direita alguns efeitos da doença periodontal, que leva à destruição do ligamento periodontal e do tecido ósseo, formação de bolsa periodontal e perda progressiva da inserção do dente. Fonte: Adaptado de (CODMED, 2016).

21

A terapia da doença periodontal consiste primariamente da remoção do agente

agressor e preparação da superfície radicular para uma nova aderência do periodonto ao

dente, eliminando bolsas periodontais. Etapas específicas relativas à eliminação das bolsas e

terapias de reconstituição dos tecidos de suporte são aplicadas de acordo com as indicações

de cada caso. A remoção de bactérias e cálculo permite ao tecido periodontal promover a

cicatrização, na qual a redução da reação inflamatória e a atividade dos fibroblastos são

fatores essenciais.

Uma diminuição da proliferação e do número de células cultivadas a partir do LP

após exposição a uma elevada concentração de glicose já foram observados (KATO et al.,

2016; KIM et al., 2006). Adicionalmente, quando expostas à elevada concentração de glicose

estas células podem sofrer alterações como a diminuição na expressão de proteínas de

adesão à matriz extracelular (NISHIMURA et al., 1996), o que prejudicaria a migração celular

e a cicatrização. Preshaw et al. (2012) demonstraram que a hiperglicemia pode alterar a

inflamação local causada pela periodontite, assim como a periodontite poderia alterar os

níveis de glicose no sangue. Da mesma forma, Sonnenschein e Meyle (2015) mostraram que

pacientes com DM apresentaram aumento de citocinas pró-inflamatórias, o que contribui

para o comprometimento do periodonto.

Conforme mencionado, o DM pode, também, prejudicar o tratamento

ortodôntico, que se baseia em uma resultante de forças de tensão X tração exercidas sobre

o LP, com a finalidade de movimentar os dentes na arcada dentária (figura 3). O movimento

dentário é realizado através do remodelamento do osso alveolar, frente a uma ação

mecânica. A reabsorção óssea é causada pela atividade de osteoclastos no lado de

compressão, enquanto os osteoblastos promovem a formação óssea no lado de tensão do

LP. Li et al. (2010) observaram, em ratos diabéticos, que o DM prolonga a degradação e

remodelamento do LP e aumenta a reabsorção do osso alveolar frente às forças mecânicas

exercidas durante tratamento ortodôntico. Aparentemente, o DM pode afetar o turnover

ósseo, resultando em uma diminuição da densidade de minerais no osso. Braga et al. (2011)

observaram que ratos diabéticos apresentaram maior movimentação ortodôntica em

comparação aos ratos normoglicêmicos, muito provavelmente por haver uma redução de

osteoblastos e um aumento de osteoclastos.

22

Figura 3 – Esquema de movimentação ortodôntica.

À esquerda no esquema, o lado esquerdo do dente mostra tração do ligamento periodontal com um alargamento do espaço onde encontra-se o LP, gerando um estímulo para a formação óssea, concomitantemente à pressão do LP no lado direito do dente, gerando um estimulo para a reabsorção óssea. Fonte: Adaptado de (BLOGGER, 2016).

Além da doença periodontal e da movimentação ortodôntica, o DM pode

também prejudicar a reparação de lesões periapicais causadas por contaminação

endodôntica. Nestas lesões há reabsorção do osso alveolar, formando uma cavidade que

engloba o forâme apical do dente (figura 4). Essa região, após tratamento endodôntico, deve

se regenerar, recompondo o osso alveolar e o LP locais. Pacientes portadores de DM do tipo

2 apresentam aumento da prevalência de lesões periapicais (SEGURA-EGEA et al., 2005;

SEGURA-EGEA et al., 2012), sendo observadas lesões osteolíticas de maior tamanho, maior

probabilidade de infecções periapicais assintomáticas e demora de reparo periapical. Além

disso, já foi demonstrado que a frequência de lesões periradiculares é maior em pacientes

com DM de longo prazo, quando comparados a pacientes com curto prazo de DM (FALK;

HUGOSON; THORSTENSSON, 1989; MESGARANI et al., 2014).

23

Figura 4 – Esquema de um dente inserido no alvéolo com lesão periapical por contaminação endodôntica.

Podemos observar um processo de cárie que se estende até a polpa. No ápice da raiz observa-se uma lesão periapical, que compromete todos os tecidos periodontais. Fonte: (DENTAZONE, 2016).

1.3 Diabetes mellitus e Cicatrização

Durante o reparo de lesões no tecido conjuntivo, a resposta inflamatória exerce

um papel fundamental, assim como a angiogênese, proliferação celular, deposição e

remodelação da matriz extracelular (principalmente colágenos fibrilares e fibronectina).

Estes processos envolvem diferentes tipos celulares, principalmente células inflamatórias,

fibroblastos, miofibroblastos (diferenciados a partir de fibroblastos, com função contrátil e

pró-fibróticos) e células epiteliais (queratinócitos e células endoteliais) (MARTIN, 1997).

Os fibroblastos são células funcionalmente muito importantes em tecidos

conjuntivos, sendo responsáveis pela síntese e degradação da matriz extracelular e secreção

de diversos fatores de crescimento que modulam o comportamento de outros tipos

celulares. Durante a cicatrização, especialmente nas fases mais tardias, os fibroblastos

proliferam, migram e sintetizam uma matriz extracelular provisória, que posteriormente

será substituída por uma matriz mais fibrosa e estável. A remodelação da matriz também é

função dos fibroblastos (TRACY et al., 2016).

24

Estudos prévios de nosso grupo de pesquisa mostraram um retardo na

cicatrização cutânea em camundongos diabéticos associado a uma redução do número de

células inflamatórias e da secreção de citocinas IL-6, IL-1 e TNF-α na fase aguda da

cicatrização (PESSOA, 2014). Em estágios mais avançados da cicatrização, no entanto, os

mesmos parâmetros demonstraram que a inflamação nos diabéticos foi persistente e houve

retardo na reepitelização e formação de novos anexos. Os diabéticos também apresentaram

maior quantidade de miofibroblastos em estágios tardios. Paralelamente, a peroxidação

lipídica, um indício de maior geração de EROs, estava 2.5 x aumentada na derme de

diabéticos (PESSOA et al., 2016).

A cicatrização da ferida periodontal segue os mesmos eventos da cicatrização de

outras feridas; no periodonto, no entanto, diferentemente de outras regiões, as margens

opostas da ferida não são vascularizadas. Estas margens compreendem uma superfície

dentária rígida, mineralizada e avascular, tecido conjuntivo e epitélio do retalho gengival e,

abaixo e/ou nas laterais (dependendo do formato da bolsa periodontal), ligamento

periodontal hígido. A pesquisa atual concentra-se na identificação de fatores biológicos que

favorecem a migração e proliferação dos tecidos periodontais (GRZESIK; NARAYANAN,

2002), principalmente de células do ligamento periodontal (fibroblastos e células

indiferenciadas).

Durante o tratamento periodontal, a raspagem da superfície radicular remove

cálculos e cemento contaminado, permitindo que células do ligamento migrem e povoem

esta superfície para a regeneração. Como as células epiteliais do epitélio juncional, na

gengiva, tendem a migrar rapidamente sobre a superfície radicular para formar um epitélio

juncional longo, técnicas de regeneração guiada utilizando células cultivadas (YOSHIDA et al.,

2012; ZHOU et al., 2012) e barreiras de biomateriais (XU et al., 2012) têm procurado barrar a

migração do epitélio e, simultaneamente, povoar a superfície radicular com células

mesenquimais. Apesar do epitélio juncional longo eliminar a bolsa periodontal, ele está

longe de corresponder a uma inserção ideal do dente no alvéolo. Acelerar a migração de

células do ligamento periodontal é, portanto, muito relevante na regeneração. Ademais,

entender o comportamento destas células frente à glicose elevada é de extrema importância

na regeneração do periodonto de diabéticos, já que estes pacientes apresentam uma maior

susceptibilidade aos efeitos da doença periodontal.

25

1.4 Hiperglicemia e Migração de Fibroblastos

A migração de fibroblastos consiste de quatro eventos cíclicos básicos (figura 5):

formação de uma protrusão na parte dianteira da célula (lamelipódio, formado graças à

polimerização de actina junto à membrana celular), adesão do lamelipódio à matriz

extracelular, amadurecimento das adesões, deslocamento do corpo celular para a frente e

retração da parte posterior da célula (PARSONS et al., 2010). Na etapa de adesão à matriz,

algumas adesões imaturas amadurecem tornando-se complexos focais e, posteriormente,

adesões ou contatos focais que ancoram feixes de filamentos de actina e miosina II (fibras de

estresse), servindo como pontos de ancoragem durante a migração (RIDLEY, 1999). Estas

adesões contêm diversos receptores para matriz extracelular, principalmente integrinas, que

são dinamicamente substituídas na medida em que a adesão amadurece. A fosforilação da

cadeia leve de miosina II também é um fenômeno importante na migração, resultando no

aumento da contratilidade das fibras de estresse e transmissão de tensão para os sítios de

adesão. O ciclo termina com a liberação das adesões que foram utilizadas na parte traseira

da célula, por diferentes mecanismos que envolvem proteólise e contratilidade, dentre

outros (PARSONS et al., 2010; DEVREOTES; HORWITZ, 2015).

Figura 5 – Esquema de uma célula aderente migrando.

O esquema apresenta eventos importantes na migração, como a formação do lamelipódio (protrusão), adesão ao substrato de matriz extracelular (MEC) e retração da parte traseira simultaneamente à contração do corpo celular. Fonte: Adaptado de (CYTOCHEMISTRY, 2016).

26

Todo este ciclo depende de modificações do citoesqueleto de actina e tubulina

(HORWITZ; WEBB, 2003), reguladas por proteínas de baixo peso molecular com atividade de

GTPases pertencentes à família Rho (de Ras-Homology), uma subfamília da grande família de

GTPases Ras. Estas GTPases ciclam entre um estado ativo (ligado ao GTP) e inativo (ligado ao

GDP), sendo ativadas por proteínas reguladoras denominadas GEFs (Guanine Nucleotide

Exchange Factors) e inativadas por proteínas denominadas GAPs (GTPase Activating

Proteins, que catalisam a hidrólise de GTP). Na forma ativa, as GTPases Rho interagem com

uma variedade de proteínas efetoras e exercem suas funções por intermédio destas

proteínas; na forma inativa, ficam complexadas no citoplasma com uma proteína inibitória

denominada GDI (Guanine Nucleotide Dissociation Inhibitor) (TAKAI; SASAKI; MATOZAKI,

2001; RIDLEY, 2013).

As Rho GTPases mais conhecidas e amplamente distribuídas são RhoA, Rac1 e

Cdc42, que regulam a polimerização de actina para formação de processos celulares como

fibras de estresse, lamelipódios e filopódios (prolongamentos finos de caráter exploratório,

que muitas vezes precedem a formação dos lamelipódios), respectivamente. Neste contexto,

uma das principais proteínas efetoras de RhoA é a Rho-cinase (ROCK), que apresenta duas

isoformas: ROCK-1 e ROCK-2. Estas cinases fosforilam a cadeia leve da miosina II presente

nas fibras de estresse, aumentando sua interação com a actina e, consequentemente, a

contratilidade celular (RIDLEY 1999; 2013).

Além da regulação do citoesqueleto de actina e migração celular, estas GTPases

também participam da regulação de microtúbulos, tráfego de vesículas, transcrição gênica,

adesão celular, progressão no ciclo celular e apoptose (ASPENSTRÖM; FRANSSON; SARAS,

2004; BELMONTE et al., 2006; HALL, 2005; HUANG; HE, 2010; NOBES; HALL, 1999; PATEL et

al., 2007; RIDLEY, 1999). A figura 6 mostra um fibroblasto migrando e os principais locais de

atuação destas três GTPases Rho.

27

Figura 6 – Esquema de um fibroblasto migratório, apresentando os processos regulados pelas GTPases RhoA, Rac1 e Cdc42.

A polimerização ramificada de actina é a base do lamelipódio, regulado por Rac1; os filopódios são regulados por Cdc42, enquanto as fibras de estresse, constituídas principalmente por actina e miosina II, ancoradas em adesões focais, são reguladas por RhoA. Fonte: Adaptado de (MBINFO, 2016).

Resultados prévios de nosso grupo de pesquisa mostraram que o estresse

oxidativo promovido pela glicose elevada afeta negativamente a migração de fibroblastos

sobre fibronectina e colágeno tipo I, com redução da velocidade e direcionalidade celulares

(ALMEIDA, 2011; LAMERS et al., 2011). Este efeito foi observado, com a mesma intensidade,

tanto em células expostas por vários dias à alta concentração de glicose in vitro, como em

células obtidas de animais diabéticos e mantidas sob elevada concentração de glicose

(LAMERS et al., 2011). Este resultado é muito importante porque demonstra que, em termos

de migração celular, os efeitos deletérios do DM sobre fibroblastos podem ser reproduzidos

in vitro pela exposição das células à glicose elevada. Observou-se também um aumento da

frequência de lamelipódios não produtivos, por serem instáveis e retrair com frequência. A

glicose não afetou a velocidade de formação dos lamelipódios, sugerindo que a

polimerização de actina não estava alterada, mas reduziu a maturação das adesões junto à

matriz e aumentou a atividade das GTPases Rac1 e RhoA (LAMERS et al., 2011). Todos estes

efeitos, com exceção da ativação de RhoA, foram revertidos na presença de um agente

antioxidante (LAMERS et al., 2011).

28

Demonstramos que a migração de fibroblastos em matriz tridimensional de

colágeno e fibronectina está igualmente prejudicada (cerca de 60% de redução da

velocidade de migração) (ALMEIDA, 2011). A migração numa matriz tridimensional envolve

não apenas o citoesqueleto (nesta matriz a contratilidade é particularmente importante),

mas também a atividade proteolítica celular. As células são capazes de remodelar a matriz,

dependendo de suas propriedades e das características físicas da mesma, e as integrinas são

os principais receptores que participam desta remodelação (DEMALI; WENNERBERG;

BURRIDGE, 2003; HUMPHRIES et al., 2004). A expressão de integrinas ligantes de

fibronectina mostrou-se reduzida em fibroblastos dérmicos derivados de ratos diabéticos,

assim como a síntese de fibronectina pericelular (ALMEIDA et al., 2016). A adição de

fibronectina extracelular, embora tenha acelerado a migração dos fibroblastos derivados de

diabéticos, não foi capaz de reverter a deficiência na migração.

Embora a regulação da função de GTPases Rho clássicas ocorra majoritariamente

via GDI/GEFs e GAPs, conforme já mencionado, em alguns tecidos e órgãos é possível que

esta regulação ocorra também por mecanismos transcricionais e pós-transcricionais (LIU et

al., 2012). Neste sentido, os microRNAs (miRNAs), pequenas moléculas de RNA que

hibridizam com moléculas de RNA mensageiro e afetam a expressão de determinadas

proteínas, têm trazido maior complexidade à compreensão desta via de sinalização. É

possível que alguns miRNAs sejam regulados pela hiperglicemia, participando assim das

alterações funcionais observadas em células de diabéticos.

1.5 Hiperglicemia, Migração Celular e MicroRNAs

Os microRNAs (miRNAs) são RNAs não-codificantes, cujo tamanho varia de 17 a

25 nucleotídeos. Estas moléculas regulam diversos mecanismos celulares, tais como

diferenciação, apoptose, adesão, proliferação e migração celular, além de contribuir

diretamente para o remodelamento da matriz extracelular (BARTEL, 2004; LIU et al., 2012).

Para exercer tal controle, interagem preferencialmente com a região 3’ UTR (untranslated

region) de um mRNA alvo, que tem sua expressão ou tradução suprimida (JASKIEWICZ;

FILIPOWICZ, 2008; MORSCZECK et al., 2005; SEO et al., 2004).

29

Evidências mostram que microRNAs (miRNAs) podem afetar a migração celular

por meio da regulação da expressão de GTPases Rho, seus efetores e seus reguladores

(GEFS, GAPs ou GDIs) – (SEONG-YEON et al., 2009; VALASTYAN; WEINBERG, 2011). A figura 7

exemplifica como os miRNAs poderiam regular as RhoGTPases (HUANG; HE, 2010).

Figura 7 – MiRNAs e GTPases Rho.

A cascata de sinalização das GTPases Rho desempenha um papel central na regulação da

adesão celular, migração e citoesqueleto. MiRNAs podem afetar a migração celular

através da regulação da expressão de GTPases, bem como de seus efetores (PAK, ROCK)

e reguladores (RhoGDIA, HOX10). Fonte: (HUANG; HE, 2010).

O papel de miRNAs sobre a migração celular, no entanto, parece ser tecido-

específico. Os miRNAs miR-221 e miR-222, por exemplo, aumentam a migração e invasão de

células de câncer coloretal, câncer de mama (BLBC - basal-like breast cancer) e câncer de

próstata (QIN; LUO, 2014; LI et al., 2014; YANG et al., 2014). Corroborando estes resultados,

He et al., (2015) observaram que a diminuição da expressão de miR-221 inibiu a migração e a

invasão de células de carcinoma epidermóide em humanos. Por outro lado, Li et al., (2009)

observaram que o miR-221 diminuiu a migração de células endoteliais umbilicais humanas -

HUVECs. Da mesma forma, em nosso grupo de pesquisa, observamos um papel inibitório do

miR-221 e miR-222 na migração e invasão de células de carcinoma de tireóide (resultados

não publicados).

30

Outro miRNA que afeta a migração celular é o miR-29; estudos mostraram que

este miRNA inibiu a migração e invasão de células de carcinoma epidermóide de cabeça e

pescoço - HNSCC e de adenocarcinoma (HAN et al., 2014; KINOSHITA et al., 2013;

YAMAMOTO et al., 2013).

Frequentemente, miRNAs que afetam a migração celular alteram também a

proliferação celular; isso ocorre, por exemplo, com o miR-221 e miR-222, que promoveram a

entrada na fase S de células de câncer de mama, e também com o miR-29 (HAN et al., 2014;

KINOSHITA et al., 2013; LI et al., 2014; YAMAMOTO et al., 2013).

Conforme já mencionado, a expressão alterada de miRNAs tem sido associada a

diferentes doenças, incluindo-se artrite, câncer e DM (MADHYASTHA et al., 2011; ASAHARA,

2016; KAWAGUCHI et al., 2016; LI et al., 2016). Em dermatites atópicas também foram

encontradas alterações em miRNAs, como o miR-223, miR-122 e miR-203 (ROZALSKI;

RUDNICKA; SAMOCHOCKI, 2016). De maneira geral, procura-se estudar miRNAs que possam

auxiliar num diagnóstico diferencial, fornecer um prognóstico ou até mesmo servir como um

alvo terapêutico.

Conforme descreveremos a seguir, a literatura tem demonstrado que a

expressão de miRNAs pode ser regulada pela hiperglicemia e hiperinsulinemia, e também

que miRNAs podem estar envolvidos na resistência à insulina e na etiologia do DM.

Madhyastha et al., (2011) mostraram que 14 miRNAs estavam diferencialmente expressos

na pele de camundongos diabéticos, sendo miR-146b e miR-21 os mais notáveis. Os níveis

basais dos miRNAs miR-20b, miR-10a, miR-10b, miR-96, miR-128, miR-452 e miR-541

apresentaram-se semelhantes entre animais controle e diabéticos, mas sua expressão foi

alterada durante a cicatrização cutânea. O miR-21, por sua vez, regulou positivamente a

migração de fibroblastos.

No DM tipo 2, Villard et al., (2015) observaram aumento da expressão de miR-

29a, miR-222 e miR-221. Constantino et al., (2016) relacionaram o aumento de miR-29a com

hiperglicemia, levando ao crescimento de cardiomiócitos. Li et al., (2009) observaram que o

aumento da glicemia gerava um aumento na expressão de miR-221 em HUVECs e uma

diminuição na migração destas células e, interessantemente, a inibição de miR-221 nessas

células restaurava a migração celular. YANG et al., (2014) mostraram que a glicose elevada

reduziu a expressão de miR-222 em artérias renais de ratos diabéticos, aumentando a

31

expressão de ROCK; este resultado sugere que ROCK é um dos alvos do miR-222 naquelas

células. Num estudo de expressão diferencial de miRNAs modulados pela DM tipo 2 em

tecidos alvo de insulina, o miR-222 mostrou-se alterado (HERRERA et al., 2010).

He et al., (2007) mostraram que miR-29a/b/c podem ser induzidos por glicose e

insulina elevadas, e a superexpressão desses miRNAs, por sua vez, leva à resistência à

insulina. O miR-29a também foi estudado por Zhao et al., (2011) em mulheres grávidas. Este

estudo mostrou que o miR-29a e o miR-222 estavam superexpressos em soro de mulheres

grávidas em estágio anterior à detecção do diabetes gestacional, no início do segundo

trimestre, retornando aos níveis normais após a comprovação do diabetes. Sendo assim,

estes dois miRNAs poderiam ser usados como biomarcadores para diagnóstico do diabetes

gestacional. Corroborando os resultados acima, Shi et al., (2014) também observaram que

miR-222 pode estar envolvido na resistência à insulina, possivelmente por efeitos de vias

regulatórias de receptor de estrógeno e, com isso, ser um candidato a biomarcador e alvo

terapêutico para o diabetes gestacional. Li, Pan e Qiu, (2016) mostraram que miR-221/222

podem participar do aparecimento e progressão do DM tipo 2 com complicação de câncer

de mama pós-menopausa, uma vez que estes miRNAs participam da resistência à insulina e

a combinação de miR-221/222 e estrógeno contribui para a incidência do DM tipo 2 com

estas complicações.

Outros estudos também mostraram não apenas uma relação entre DM e

expressão de miRNAs, mas também uma possível relação com algumas complicações do DM.

Neste sentido, WANG et al., (2012) observaram diminuição de miR-29 em camundongos

diabéticos com fibrose renal inicial. Torre et al., (2015) observaram um aumento maior de

miR-221 em pacientes diabéticos com retinopatia em relação aos pacientes diabéticos sem

esta patologia.

1.6 MicroRNAs e Periodonto

O estudo da expressão de miRNAs no periodonto e sua potencial relação com a

fisiologia e patologias é bastante recente. Stoecklin-Wasmer et al., (2012) fizeram um

screening de miRNAs em células de gengiva de pacientes sadios e com doença periodontal;

curiosamente, o miR-29 mostrou-se como um dos miRNAs mais alterados na doença

32

periodontal. Um estudo realizado por Kagiya (2016), apontou que miR-29a/b/c, miR-31 e

miR-223, entre outros, estão envolvidos na homeostase e patologia do periodonto, podendo

ser utilizados como biomarcadores e alvos terapêuticos para a perda de osso alveolar na

doença periodontal. Irwandi e Vacharaksa, (2016) consideram que miRNAs, como p.ex. o

miR-223, estão relacionados com a inflamação no periodonto e com a perda de osso

alveolar, sugerindo o potencial uso dessas moléculas como alvos terapêuticos. Da mesma

forma, Tomofuji et al., (2016) demonstraram que miR-207, miR-495 e miR-376b-3p

poderiam ser utilizados como biomarcadores para periodontite. De fato, alguns miRNAs,

como por exemplo o miR-126, miR-141, miR-210 e miR-146, regulam a expressão de

citocinas inflamatórias (IL-8 e CXCL1) em epitélio gengival humano (CHEN et al., 2016b).

Particularmente com relação ao metabolismo ósseo, a associação de miRNAs com a

osteoclastogênese induzida pelo ligante nuclear factor kappa B (RANKL), regulada por

mediadores inflamatórios, foi demonstrada m células do LP e fibroblastos gengivais

(IRWANDI; VACHARAKSA, 2016).

Na periodontite apical provocada por lesão endodôntica, 381 miRNAs estão

diferencialmente expressos, em comparação a tecido normal. Genes-alvo desses miRNAs

incluem mediadores da resposta inflamatória, como interleucina-6 (IL-6), a metaloproteinase

de matriz MMP-9 e o fator de crescimento pró-fibrótico TGF-β (CHAN et al., 2013). Embora a

idéia de miRNAs presentes na saliva serem utilizados para diagnóstico de periodontite seja

interessante, esta técnica ainda não está padronizada de maneira confiável (SCHMALZ et al.,

2016).

Com relação à diferenciação celular e terapias regenerativas, Hung et al., (2010)

demonstraram que o miR-146a regula a diferenciação de células do LP por meio da

regulação negativa da sinalização de NF-KB, um fator de transcrição que modula a expressão

de mediadores inflamatórios. Além disso, o miR-17 regula indiretamente a osteogênese, por

meio da via de sinalização de Wnt, que exerce papel importante na formação óssea (LIU et

al., 2013). MiR-21 e miR-101 também regulam a diferenciação osteogênica de células do

ligamento periodontal, tendo como principal alvo a proteína PLAP-1 (LI et al., 2012).

Vasanthan et al., (2015) mostraram que em células tronco de polpa dentária, miR-221 é

superexpresso quando comparado com células tronco mesenquimais de medula óssea,

33

sendo esta informação relevante com relação à escolha de fontes para possíveis

tratamentos.

Além da doença periodontal, miRNAs também têm sido relacionados à

movimentação ortodôntica. Chen et al., (2016a) observaram que miR-21 está relacionado

com a remodelação óssea durante a movimentação dentária, assim como o miR-221 e miR-

222 (WEI et al., 2014).

Em resumo, o estudo do papel de miRNAs na fisiopatologia periodontal é ainda

incipiente; embora alguns screenings tenham revelado uma expressão diferencial de miRNAs

na doença periodontal, a potencial modulação de miRNAs no DM e sua relação com a

doença periodontal não foram ainda estudados. O conhecimento adquirido nesta área será

benéfico para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas, especialmente aquelas

que eventualmente utilizem miRNAs para tratar a doença periodontal

.

34

2 OBJETIVOS

Considerando que a doença periodontal progride mais rapidamente em

pacientes diabéticos, que o DM modula a expressão de diferentes miRNAs e que há uma

correlação entre a expressão de miRNAs, perda óssea e doença periodontal, este estudo

teve como principais objetivos:

• Avaliar os efeitos da glicose elevada sobre a proliferação, migração e morte

por apoptose em células do ligamento periodontal de humanos

• Avaliar o potencial efeito modulatório da glicose elevada sobre a expressão

dos miRNAs miR-29a,miR-29aX, miR-221 e miR-222 em células do ligamento periodontal de

humanos

• Avaliar o envolvimento dos miRNAs nas funções celulares afetadas pela

glicose elevada em células do ligamento periodontal de humanos

35

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Obtenção e Cultivo de Células Primárias de Ligamento Periodontal Humano

Este estudo foi conduzido com aprovação do Comitê de Ética em

Experimentação em Humanos (documentação anexa) e todos os pacientes ou responsáveis

preencheram uma declaração de consentimento. Foram utilizados dentes provenientes de 3

pacientes, e os experimentos foram realizados individualmente para cada paciente.

Células de Ligamento Periodontal Humano foram obtidas de explantes de dentes

pré-molares saudáveis extraídos com indicação ortodôntica de crianças/adolescentes com

idade entre 8 e 14 anos. Logo após a extração, os dentes foram mantidos em meio de

cultura estéril DMEM-F12 suplementado com soro fetal bovino (20% SFB), aminoácidos não

essenciais - NEAA (glicina, L-alanina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-ácido glutâmico, L-

prolina, L-serina), antibióticos (penicilina 100 U/ml e estreptomicina 100 µg/ml) e

antifúngico (1% fungizona) para transporte. Após prévia lavagem em solução salina estéril

(PBS-1X) em condições de cultura, foi realizada a raspagem do terço médio da raiz dos

dentes e o tecido obtido foi fragmentado, estendido em placas de Petri de 35 mm, acrescido

de meio DMEM-F12 suplementado (como descrito acima) e mantido em estufa 8 % CO2 a

37◦ C. As células foram obtidas inicialmente após 20-30 dias em condições de cultura (após

migração para fora dos explantes), as culturas foram amplificadas e as células foram

congeladas nas passagens iniciais. Posteriormente, o meio usado no cultivo teve a

concentração de SFB reduzida para 10% e remoção de fungizona. Foram realizadas

passagens semanais. As células foram utilizadas por até 7 passagens.

3.2 Substrato de Fibronectina

Placas de Petri e lamínulas de vidro utilizadas nos experimentos realizados neste

estudo receberam uma cobertura de fibronectina (Sigma - Missouri, EUA) na concentração

de 1 µg/ml, diluída em PBS 1 X gelado. Após adição desta solução sobre placas e lamínulas,

estas foram colocadas em estufa 8 % CO2 a 37 ◦ C por 1 h para polimerização. Ao final, foram

lavadas três vezes com PBS 1 X a 37 ◦C e utilizadas.

36

3.3 Caracterização das Células Primárias de Ligamento Periodontal Humano

3.3.1 Avaliação da expressão gênica de marcadores celulares

Para avaliar a população celular obtida em cultura primária, analisamos a

expressão de um gene marcador de fibroblastos que codifica a proteína FSP1 (S100A4) e de

genes relacionados à diferenciação celular que incluíram neste estudo ALCAM, CD34 e

MCAM (genes codificadores das proteínas CD166, CD34 e CD146). Inicialmente, as células

foram cultivadas em placas sem e com fibronectina (1 µg/ml) e, posteriormente, a extração

de RNA, a síntese de cDNA e qPCR foram realizados conforme descrito no Item 3.9 em

Métodos. Primers para genes considerados clusters de diferenciação para verificar o

potencial de pluripotência das células foram utilizados (Tabela 1).

CÉLULAS GENES PRIMERS

CÉLULAS INDIFERENCIADAS

ALCAM FW: CTTACCAGGACAGCCCGAAG; RV: TGGCTGTTGAAGCAATCATGC – Exxtend R

MCAM FW: AAGCAGGAGATCACGCTACC; RV: GATTCGGGGCTAATGCCTCA – Exxtend R

CD34 FW: CAG GAG AAA GGC TGG GCG AA; RV: ATT CGG TAT CAG CCA CCA CG - IDT R

FIBROBLASTOS S100A4 FW: TCT TGG TTT GAT CCT GAC TGC T; RV: GTC CTT TTC CCC AAG AAG CTG IDTR

Tabela 1 - Primers utilizados para avaliar a diferenciação celular.

3.3.2 Avaliação da expressão proteica do marcador ER-TR7 (Fibroblast Marker) por

imunocitoquímica

Células (2 x 104) foram semeadas sobre lamínulas de vidro (Flaskette, Nalge

Nunc) sem e com cobertura de fibronectina (1 µg/ml) e mantidas em condições de cultura (8

% CO2, 37 ◦C) por 24 horas. Após este período, estas foram pré-fixadas e permeabilizadas

por 5 minutos em solução de paraformaldeído (PFA) 4%, 0,5 % Triton X- 100, 5 % de sacarose

em tampão PHEM (60 mM Pipes; 2 mM HEPES; 10 mM; EGTA e 2 mM MgCl2) e fixadas com

PFA 4% em PHEM por 30 minutos. Após lavagens com PHEM + glicina (100 mM) (3 X 10

minutos), sítios inespecíficos foram bloqueados com soro normal de cabra 20 % (NGS) + 3 %

37

albumina diluídos em PBS 1-X por 2 h à temperatura ambiente (TA) e, posteriormente,

incubadas overnigh a 4 ◦C com anticorpo primário anti-ER-TR7 (Santa Cruz R, California, EUA)

diluído 1:50 em PBS 1 X + Triton-X-100 0,2 % com 20 % NGS + 3 % albumina. Os controles

negativos não receberam o anticorpo primário. Após a incubação e um ciclo de lavagens, o

anticorpo secundário (Goat X Rat IgG 1:500) diluído em PBS 1 X + Triton 0,2 % foi adicionado

e mantido por 2 h à TA. A montagem da lamínula foi feita sobre lâmina de vidro utilizando

meio de montagem que contém DAPI Vectashield - Vector Laboratories (Burlingame, Ca).

3.4 Exposição de células primárias de ligamento Periodontal humano à elevada

concentração de glicose

Células primárias do ligamento periodontal foram previamente tratadas por 7

dias em diferentes condições e utilizadas em diferentes ensaios experimentais descritos a

seguir. Os grupos experimentais consistem de:

(1) Células Controle (Low Glucose ou LG): células cultivadas em meio DMEM F12 com

concentração fisiológica de glicose (5mM D-glicose) contendo 10% SFB, 1% NEAA,

penicilina 100 U/ml e estreptomicina 100 µg/ml;

(2) Células expostas à alta concentração de glicose (High Glucose ou HG): células

cultivadas em meio DMEM F12 com concentração elevada de glicose (30 mM D-

glicose) contendo 10% SFB, 1% NEAA, penicilina 100 U/ml e estreptomicina 100

µg/ml;

(3) Células cultivadas em presença de D-Mannitol (30 mM) Sigma (Missouri, EUA) -

controle osmótico – somente em alguns experimentos.

3.5 Análise da morfologia, adesão e espraiamento celulares

3.5.1 Citoquímica para caracterização do citoesqueleto de F-actina

As células foram semeadas em lamínulas de vidro (sem e com fibronectina, 1

µg/ml) por 24 horas, pré-fixadas e permeabilizadas (solução de PFA 4 %, 0,5 % Triton X-100,

5 % de sacarose em tampão PHEM) por 5 minutos. Após fixação com PFA 4 % em PHEM por

30 min seguida de sucessivas lavagens com PHEM + glicina (100 mM), as células foram

38

coradas com faloidina-Alexa 488 ou faloidina-rodamina (Molecular Probes) na concentração

1:500 por 45 minutos e o núcleo com DAPI Vectashield - Vector Laboratories (Burlingame,

Ca). As fotos foram obtidas em microscópio de epifluorescência (Zeiss Axiovision).

3.5.2 Análise da circularidade celular

Após evidenciação do citoesqueleto de actina, foram obtidas imagens em

microscópio de epifluorescência (Zeiss Axion). Utilizando o software Image J (Plugin

Circularity), a circularidade celular foi determinada a partir de um índice que varia entre zero

e um. Valores próximos de zero revelam células com morfologia alongada e índices mais

próximos de 1 mostram células com morfologia circular.

3.5.3 Análise de protrusões celulares

Após evidenciação do citoesqueleto de f-actina, imagens foram obtidas em

microscópio de epifluorescência (Zeiss Axion) e células que apresentavam mais de 3

protrusões foram contadas.

3.5.4 Ensaio de adesão e espraiamento celular

Células (1 X 104) foram plaqueadas em lamínulas de vidro (sem e com

fibronectina, 1μg/ml) e mantidas em estufa (8 % CO2, a 37 ◦C) por 20 minutos ou 1 hora.

Após estes períodos, foram lavadas com PBS 1 X, fixadas em PFA 4 % e incubadas com

faloidina (para observação da F-actina). Os núcleos foram corados com DAPI durante a

montagem com Vectashield R - Vector Laboratories (Burlingame, Ca). Imagens foram obtidas

em microscópio de fluorescência Nikkon (objetiva de 20X) para contagem celular e

mensuração de suas áreas. O programa Image J foi utilizado para estas análises.

3.6 Ensaios de migração celular

3.6.1 Ensaio de migração celular por Transwell

Para estes ensaios foram usados insertos de transwell com poros de 8 µm

(Corning Inc) cobertos com fibronectina 1 μg/ml. As células (5 x 104) previamente

39

ressuspensas em meio de cultura com 1% SFB foram plaqueadas (em triplicata) na câmara

superior do inserto e colocadas em contato com meio 10 % SFB, previamente adicionado na

câmara inferior. Após 6 horas em condições de cultura (8 % CO2, 37◦C), as células ainda

presentes na superfície interna da membrana na câmara superior foram removidas por

raspagem e as células que migraram para a superfície inferior da membrana foram fixadas,

coradas com cristal violeta 0,5% em água destilada e quantificadas utilizando microscópio de

luz.

3.6.2 Ensaio de migração celular por time-lapse

Células foram plaqueadas (1 X 104 células por poço) em placas de 24 poços (com

fibronectina 1 μg/ml) e foram mantidas em condições de cultura (8% CO2, 37 ◦C) por 24

horas. Após este período, os movimentos celulares foram monitorados, utilizando o sistema

de microscopia InCell Analyzer 2200 GE (CEFAP-USP), com controle de temperatura e pH.

Inicialmente, para análise de protrusões, imagens foram obtidas em um campo por poço a

cada 1 minuto (objetiva 40 X), durante 30 minutos. A seguir, para avaliar a velocidade e

direcionalidade das células, imagens (objetiva 10X) de 6 campos aleatórios por poço foram

obtidas a cada 10 minutos por 20 horas. As imagens foram organizadas em séries utilizando

o programa Image J (NIH, Bethesda, MD, USA) e convertidas em filmes.

A análise de protrusões consistiu na quantificação do número de novas

protrusões formadas e do número de retrações de protrusões por célula no período

observado. Já a velocidade e direcionalidade celulares foram avaliadas pelo

acompanhamento do comportamento individual por no mínimo 12 horas, sendo excluídas

células que tocaram em outras ou que entraram em divisão celular. As coordenadas X-Y e a

velocidade das células foram utilizadas para análise. Para o cálculo do índice de

direcionalidade, foi utilizada a seguinte fórmula:

√

Onde:

√ : resultante da soma vetorial do deslocamento da célula no plano

cartesiano;

Distância: distância total percorrida pela célula.

40

3.7 Crescimento celular: Proliferação celular X Morte celular

3.7.1 Ensaios de Proliferação celular

3.7.1.1 Curva de crescimento

Células (1 X 105) foram plaqueadas (em triplicatas) em placas de 6 poços (com

fibronectina, 1μg/ml) e mantidas em estufa 8 % CO2, 37 ◦C. Após 24 horas, estas foram

incubadas com marcador nuclear Hoescht Invitrogen (Califórnia, EUA) (2μl/ml) em meio

DMEM, 10 % SFB e suplementos por 20 minutos, lavadas com PBS 1X estéril e mantidas em

DMEM 10 % SFB com suplementos a 8 % CO2, 37 ◦C. Após 24 h, 48 h e 72 h, as células foram

contadas utilizando o aparelho InCell Analyzer 2200.

3.7.1.2 Ensaio de proliferação celular pelo método de incorporação de 5-bromo 2-

deoxyuridina (BrdU)

Células foram plaqueadas (1 X 104 células) em lamínulas (com fibronectina,

1μg/ml) até a semiconfluência, em triplicata, sendo uma para o controle negativo. A seguir,

foram adicionados ao meio de cultura BrdU (5 µM) Sigma Chemical Co. (Missouri, EUA)

overnight. As células foram fixadas em PFA 4 % em PBS 1X, seguido por incubação com 2 M

de HCl. Para a detecção do BrdU, as células foram submetidas a reação de

imunofluorescência com anticorpo primário monoclonal anti-BrdU (RPN 202, Amersham) e

secundário Dk X rat TRITC 1:200 Jackson’s Lab - (Bar Harbor, EUA) com contracoloração

nuclear. O controle negativo consistiu da ausência de incubação com o anticorpo anti-BrdU.

A porcentagem de células positivas foi determinada em função do número total de células,

por análise feita em InCell Analyzer 2200.

3.7.2 Ensaio de marcação de células apoptóticas por método de TUNEL

Células (1 X 104) foram plaqueadas em lamínulas de vidro (com fibronectina,

1μg/ml) em triplicata, em meio DMEM 10% SFB por 24 horas em estufa (8% CO2, 37◦C).

Posteriormente, estas foram fixadas em PFA 4% por 30 minutos, lavadas em PBS 1X e

incubadas por 2 minutos em citrato de sódio 0,1% + triton 0,1%. Após nova lavagem (PBS-

41

1X) foram incubadas com In Situ Cell Death Detection kit (Roche®) conforme instruções do

fabricante, por 1 hora a 37˚C, seguida de incubação com TrisHCL-EDTA (4mM-5mM) por 5

minutos. A montagem das lamínulas em lâminas de vidro foi feita com meio de montagem

Vectashield + DAPI (Vectashield - Vector Laboratories, Burlingame, Ca) e a análise de células

positivas foi determinada por meio do equipamento In Cell Analyzer (CEFAP-USP).

3.7.3 Imunocitoquímica para a análise de Caspase 3

Células (2 x 104) foram semeadas em lamínulas (com fibronectina, 1 µg/ml) e

mantidas por 24 horas em estufa (8 % CO2, 37 ◦C). A seguir foram pré-fixadas e

permeabilizadas com PFA 4 %, 0,5 % Triton X- 100, 5 % de sacarose em tampão PHEM (60

mM Pipes; 2 mM HEPES; 10 mM; EGTA e 2 mM MgCl2) por 5 minutos e posteriormente

fixadas com PFA 4 % em PHEM por 30 minutos. Os sítios inespecíficos de ligação foram

bloqueados com soro normal de burro 10 % (NDS) + 3 % albumina diluído em PBS1X por 2 h

a TA após lavagem (3 X 10 minutos) com PHEM + glicina (100 mM). As células foram

incubadas com anticorpos primários (anti-caspase3 Santa Cruz 1:500; Fibroblast Marker

Antibody ER-TR7) diluídos em PBS1X + Triton 0,2 % com 10 % NDS +3 % albumina overnight a

4 ◦C. Os controles negativos não receberam o anticorpo primário. Os anticorpos secundários

(TRITC Dk X Gt Jackson (Bar Harbor, EUA) 1:1000) diluídos em PBS 1 X + Triton 0,2 % foram

adicionados após prévio ciclo de lavagens com PBS 1X por 1 hora a TA. A montagem das

lamínulas sobre lâminas de vidro foi feita com meio de montagem Vectashield + DAPI

(Vectashield - Vector Laboratories, Burlingame, Ca). Imagens das imunomarcações para ER-

TR7 e Caspase 3 foram obtidas de campos aleatórios utilizando o equipamento In Cell

Analyzer (CEFAP-USP) (objetiva 10 X). O Programa Image J foi ulilizado para analisar o

número de células totais e de células marcadas.

3.8 Análise da expressão gênica por PCR em Tempo Real

3.8.1 Extração de RNA total

O RNA total de culturas celulares foi extraído pelo método do Trizol R Invitrogen

(Califórnia, EUA). Células (1 X 105) previamente semeadas sobre placas com fibronectina

(1μg/ml) por períodos determinados foram coletadas e homogeneizadas em 1 ml de Trizol.

42

Após 10 minutos em TA, clorofórmio (0,2 ml) (Merck (Darmstadt, Alemanha) foi adicionado

ao produto inicial, homogeneizado e submetido a centrifugação (15 minutos, 12000 RPM à 4

◦C). A seguir, o sobrenadante foi coletado em um novo tubo, isopropanol (0,5 ml) (Merck -

Darmstadt, Alemanha) foi adicionado a este produto e submetido a uma nova centrifugação

(10 min, 12000 RPM à 4 ◦C). O pellet formado foi resuspenso em álcool 75 % e centrifugado

(5 minutos, 7500 RPM à 4 ◦C), após descarte do sobrenadante. Ao final, o sobrenadante foi

descartado e o precipitado foi ressuspenso em 20 µl de água ultrapura e congelado a -80 ◦C.

3.8.2 Síntese de cDNA

Para síntese de cDNA referente à análise dos marcadores de células

indiferenciadas, fibroblastos e controle interno (gene RPL27), RNA total foi diluído até

concentração final de 3 µg em água ultrapura. A seguir, cada reação foi preparada com água

ultrapura (7 µl), Oligo DT (1 µl) e dNTPmix (1 µl) e RNA diluído (3 µl) e submetida a 70 ◦C por

10 minutos em termociclador. Posteriormente, tampão da enzima MMLV-RT (4 µl), enzima

MMLV-TR (1 µl), DTT 0,1 M (2 µl), RNase (1 µl) foram adicionados na solução inicial, mantida

em banho de gelo após o primeiro de ciclo de temperatura. Esta foi submetida a um ciclo a

25 ◦C por 10 minutos, 37 ◦C por 50 minutos e 70 ◦C por 15 minutos no termociclador

(Applied Biosystems, California, EUA). Ao final, as amostras foram armazenadas a -20 ◦C. Já

para síntese de cDNA referente à análise de microRNAs miR-29a, miR-29ax, miR-221, miR-

222 e controle interno RNU6B, RNA total foi diluído até a concentração final de 2 ng em água

ultrapura e o kit TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription (Applied Biosystems - California,

EUA) foi utilizado, conforme instruções do fabricante. Cada reação foi constituída por

oligoDNTP Mix (0,15 µl), buffer 5 X (1,5 µl), inibidor de RNAse (0,19 µl) e MRT Multiscribe

Transcriptase Reversa (1 µl). Após adição de sondas específicas para cada microRNA

(TaqMan R MicroRNA Assays), esta solução foi submetida a um ciclo de 16◦C por 30 minutos,

42◦C por 30 minutos, seguida de inativação da transcripase a 85◦C por 5 minutos em

termociclador (Applied Biosystems, California, EUA). O produto final foi armazenado a -20

◦C.

43

3.8.3 PCR em Tempo Real

Para a quantificação do produto formado durante a reação de qPCR para mRNA

foi utilizado o MasterMix SYBR-Green Dye (Life-Thermofisher). As reações foram realizadas

em triplicada com volume final de 20 μl cada, utilizando cDNA de cada amostra diluído 5 X (5

µl), primers específicos (5 µl) (FW + RV em 200 nM) e MasterMix SYBR-Green Dye (10 µl). Já

para as reações de qPCR para miRNA foi utilizado o Kit TaqMan R Universal PCR Master Mix,

No AmpErase R UNG (Applied Biosystem), conforme instruções do fabricante. Para cada

reação foi utilizado cDNA de cada amostra (1,33 µl), TaqMan R Universal PCR Master Mix, No

AmpErase R UNG (10 µl), água ultra-pura (7,67 µl) e primers específicos para os miRNAs

(TaqMan Assay 20X). As reações foram realizadas em termociclador ABI 7300 Sequence

Detection System (Applied Biosystem) nas seguintes condições: 1 ciclo de 50◦C por 2

minutos, 1 ciclo de 95◦C por 10 minutos e 40 ciclos de 95◦C por 10 segundos / 60◦C por 1

minuto.

Os resultados foram analisados utilizando o programa de análise qGENE

Software for QTL data exploration. Todos os experimentos foram realizados em triplicatas.

3.9 Transfecção transiente de microRNAs

3.9.1 Supressão de miRNAs-221 e -222 em células de ligamento periodontal humano

A supressão dos miR-221-3p and miR-221-3p em células de ligamento

periodontal humano previamente cultivadas em meio de cultura contendo concentração

fisiológica de glicose (5mM) foi realizada por transfecção transiente utilizando inibidores

sintéticos anti-miR-221 e anti-miR-222 (Anti-miRTM miRNA Inhibitor Product, Thermo Fisher

- Life Technologies), conforme instruções do fabricante. Para transfecção foi utlizada

Lipofectamine 2000 (Invitrogen®). Em cada ensaio, células (1X 105) foram semeadas em

placas de 60 mm em quatro grupos experimentais, sendo os três primeiros controles. Após

24 horas, as seguintes reações foram realizadas e as células foram mantidas em estufa ( 8 %

CO2, 37 ◦C) por 5 horas:

(1) LG: células em meio DMEM Low (5 mM D-glicose) com 10% SFB, antibióticos

(penicilina 100 U/ml e estreptomicina 100 µg/ml) e 1% de NEAA;

44

(2) AntimiR-controle negativo: célula em meio DMEM Low (5 mM D-glicose) com 10%

SFB, antibióticos (penicilina 10U/ml e estreptomicina 10 µg/ml) e 1% NEAA + meio de

transfecção OPTMEM + Lipofectamina 2000 (4 µl) + antimiR-controle negativo (30nM) (Life-

Thermofisher, Massachusetts, EUA).

(3) AntimiR-221: célula em meio DMEM Low (5 mM D-glicose) com 10% SFB, antibióticos

(penicilina 10U/ml e estreptomicina 10 µg/ml) e 1% NEAA + meio de transfecção OPTMEM +

Lipofectamina 2000 (4 µl) + antimiR-221 (30nM) (Life-Thermofisher, Massachusetts, EUA).

(4) AntimiR-222: célula em meio DMEM Low (5 mM D-glicose) com 10% SFB, antibióticos


Lipofectamina 2000 (4 µl) + antimiR-222 (30nM) (Life-Thermofisher, Massachusetts, EUA).

Após o período determinado, novo meio de cultura foi adicionado em todos os

grupos (T= 0 h) e após 48 horas de tranfecção, as células foram plaqueadas para confirmar a

inibição dos miRNAs por análise de expressão gênica (Item 3.9 em Métodos) e avaliar a

migração celular (Transwell e Time-lapse, conforme descrito no Item 3.6 em Métodos) e

morte celular (Método TUNEL, conforme item 3.7 em Métodos).

3.9.2 Superexpressão de miRNA-221 e miRNA-222 células de ligamento periodontal

humano

A superexpressão dos miR-221-3p and miR-221-3p em células de ligamento

periodontal humano previamente cultivadas em meio de cultura contendo alta

concentração de glicose (30 mM) foi realizada por transfecção transiente utilizando miRNAs

sintéticos miméticos mimics-miR-221 e mimics-miR-222 (mirVana® miRNA mimics, Thermo

Fisher - Life Technologies), conforme instruções do fabricante. Para transfecção foi utilizada

Lipofectamine 2000 (Invitrogen®). Em cada ensaio, células (1 X 105) foram semeadas em

placas de 60 mm em quatro grupos experimentais, sendo os dois primeiros controles. Após

24 horas, as seguintes reações foram realizadas e mantidas em estufa 8 % CO2, 37 ◦C por 5

horas:

(1) HG: Células em meio DMEM High (30 mM D-glicose) com 10% SFB, antibióticos

(penicilina 100 U/ml e estreptomicina 100 µg/ml) e 1% de NEAA;

45

(2) Mimics miRNA-control negativo: célula em meio DMEM High (30 mM D-glicose) com

10% SFB, antibióticos (penicilina 10U/ml e estreptomicina 10 µg/ml) e 1% NEAA + meio de

transfecção OPTMEM + Lipofectamina 2000 (4 µl) + mimics-controle negativo (30nM) (Life-

Thermofisher, Massachusetts, EUA).

(3) Mimics-221: célula em meio DMEM High (30 mM D-glicose) com 10% SFB, antibióticos


Lipofectamina 2000 (4 µl) + mimics miR-221 (30nM) (Life-Thermofisher, Massachusetts,

EUA).

(4) Mimics-222: célula em meio DMEM High (30 mM D-glicose) com 10% SFB, antibióticos


Lipofectamina 2000 (4 µl) + mimics-miR-222 (30nM) (Life-Thermofisher, Massachusetts,

EUA).

Após o período determinado, novo meio de cultura foi adicionado em todos os

grupos (T= 0 h) e após 48 horas de transfecção, as células foram plaqueadas para confirmar

a inibição dos miRNAs (Item 3.9, Métodos) e avaliar a migração celular (Transwell e Time-

lapse, conforme descrito no Item 3.6 em Métodos) e morte celular (Método TUNEL,

conforme item 3.7 em Métodos).

3.10 Análise de Alvos Potenciais dos miRNAs por Bioinformática

Os programas on-line miRBASE (Welcome Trust Sanger Institute,

http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/), o TargetScan (Whitehead Institute for Biomedical

Research, www.targetscan.org) e o PICTAR (http://pictar.bio.nyu.edu/) foram utilizados para

realizar análise in silico de alvos preditos dos miR-221 e miR- 222.

3.11 Inibição de ROCK com Y27632 em células de ligamento periodontal humano

Células (1 x 104 células/poço) foram semeadas em placas de 24 poços (com

fibronectina, 1μg/ml) em meio DMEM 10 % SFB e mantidas em estufa (8 % CO2, 37 ◦C) por

18 h. As seguir, o inibidor de ROCK Y27632 (30 µM, concentração final) foi adicionado ao

meio de cultura e mantido por 6 horas. Após este período, o meio com o inibidor removido e

46

as células foram novamente plaqueadas para análise do citoesqueleto de F-actina (Item 3.5

em Métodos) e ensaios de migração celular (Item 3.6 em Métodos).

3.12 Análise estatística

Para análise estatística foi utilizado o programa GraphPad Prism (versão 5.0) . Os

resultados foram submetidos ao teste t de Student ou análise de variância (ANOVA) com

pós-teste de Tukey. Diferenças foram consideradas estatisticamente significantes em P <

0.05.

47

4 RESULTADOS

4.1 Padronização das culturas primárias de células do ligamento periodontal

O modelo experimental deste estudo baseia-se em células do ligamento

periodontal. A obtenção das mesmas foi feita por explante de fragmentos do tecido retirado

do terço médio das raízes de pré-molares sadios de crianças/adolescentes entre 9 e 14 anos,

extraídos por indicação ortodôntica. Após 20-30 dias de incubação do explante, as células

atingiram uma confluência ótima (entre 65-75%) para que fossem realizadas as passagens.

Com as culturas estabelecidas, fizemos uma avaliação da presença de células

indiferenciadas, uma vez que o tecido conjuntivo do ligamento periodontal apresenta, além

de fibroblastos, células-tronco e outros tipos celulares. Para isso, a expressão de genes

relacionados à diferenciação como ALCAM, CD34 e MCAM (genes codificadores das

proteínas CD166, CD34 e CD146, respectivamente), foi avaliada. A expressão do gene que

codifica a proteína FSP1 (S100A4), presente em fibroblastos, também foi avaliada.

Como resultado, obtivemos ciclos indeterminados ou muito altos (com ct acima

de 35) de duplicação das fitas para os três clusters de diferenciação, o que implica em não

haver expressão significativa desses marcadores nas células cultivadas (o protocolo utilizado

recomenda até 35 ciclos). Este resultado não significa a ausência de células-tronco nas

culturas, já que células expressando outros marcadores de diferenciação poderiam estar

presentes.

Nas culturas observou-se a expressão do gene S100A4, conforme esperado. Estes

experimentos foram realizados na ausência e presença de fibronectina, uma glicoproteína da

matriz extracelular presente no ligamento periodontal. Os fibroblastos se diferenciam a

partir de células-tronco do tecido, e é possível que a fibronectina influencie este processo.

Conforme observado na Figura 8, a fibronectina não modulou a expressão de S100A4 nas

células cultivadas.

48

Figura 8 – Análise da expressão gênica de S100A4 em células de ligamento periodontal.

Células foram cultivadas em placas sem e com fibronectina (FN, 1 µg/ml) por 24 horas. Após este período, a expressão do gene marcador de fibroblastos que codifica a proteína FSP1 (S100A4) foi avaliada pelo método de PCR em Tempo Real, conforme descrito em Métodos. Foi utilizado o gene RPL27 como controle interno. (expressão x 10-5). Resultados obtidos de três experimentos independentes.

No intuito de avaliar a porcentagem de fibroblastos presentes nas culturas, a

distribuição da proteína ER-TR7 (marcador de fibroblastos) foi avaliada por

imunohistoquímica. Como controle positivo nos experimentos foram utilizados fibroblastos

de mama humana gentilmente cedidos pela Profa. Dra. Vanessa Freitas, ICB/USP. Nestes

experimentos, a presença de fibronectina aumentou a expressão de ER-TR7 (Figura 9),

demonstrando um papel para a fibronectina na diferenciação de fibroblastos. Diante deste

resultado, optamos por realizar todos os experimentos na presença de fibronectina, visando

obter o maior número possível de fibroblastos nas culturas.

49

Figura 9 – Análise da marcação de ER-TR7 em células de ligamento periodontal.

Células cultivadas em lamínulas sem e com fibronectina (FN, 1 µg/ml) por 24 horas foram imunomarcadas para ER-TR7 como descrito em Métodos. Imagens foram obtidas em microscópio de fluorescência (objetiva 20 X) para contagem das células. Os resultados em porcentagem apresentados no gráfico referem-se à razão obtida entre o número de células marcadas para a proteína ER-TR7 em relação ao número total de células por campo (núcleo corado com DAPI). Resultados obtidos de 6 experimentos independentes. Número de células analisadas: sem FN (860) e com FN (870) (Sem FN vs com FN, * p < 0,05).

4.2 Morfologia Celular, adesão e espraiamento

Após realizada a padronização das culturas, estas foram submetidas a

tratamentos com alta concentração de glicose. As células foram, então, expostas à

concentração fisiológica de glicose (5 mM, grupo LG) ou à concentração elevada de glicose

(30 mM, grupo HG). Como controle osmótico, em alguns experimentos utilizou-se 5 mM de

glicose acrescidos de 25 mM de D-Manitol – um açúcar não metabolizado pelas células.

O tempo de exposição das células à glicose elevada foi estabelecido em 7 dias,

uma vez que exposições mais longas resultavam em um grande número de células mortas.

Durante a manutenção das células, o meio foi substituído a cada 48 h, conforme descrito em

Métodos. Os experimentos foram realizados na presença de fibronectina.

Células controle (LG) apresentavam formato fusiforme (com comprimento do

eixo longitudinal maior que o comprimento do eixo transversal), enquanto células expostas à

glicose elevada (HG) apresentavam-se, em grande número, mais arredondadas, conforme

50

pode ser observado na Figura 10. Por conseguinte, células controle apresentavam maior

polarização que células HG, o que é muito relevante para a migração celular direcionada.

Figura 10 – Evidenciação do citoesqueleto de F-actina em células de ligamento periodontal após exposição à elevada concentração de glicose.

Células cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose, conforme descrito em Métodos, foram novamente plaqu eadas e após 24 horas, F-actina (verde) e núcleo (azul) foram corados. Imagens foram obtidas por microscopia de fluorescência (objetiva 20 X). Resultados obtidos de 3 experimentos independentes. LG: células cultivadas em 5 mM de glicose; HG: células cultivadas em 30 mM de glicose.

Confirmando a observação morfológica, a análise da circularidade a partir de

imagens obtidas por microscopia de fluorescência após evidenciação de F-actina

demonstrou um maior número de células cuja circularidade era mais próxima do valor 1,0

(que denota um círculo) no grupo exposto à glicose elevada, comparadas às células controle,

conforme Figura 11.

Figura 11 – Análise da circularidade de células de ligamento periodontal humano após exposição à elevada concentração de glicose.

51

Após evidenciação do citoesqueleto de F-actina, as imagens obtidas foram utilizadas para avaliar a circularidade celular utilizando o software Image J (NIH). Nesta análise, o índice de circularidade varia entre zero (baixa circularidade) a 1,0 (elevada circularidade). Resultados foram obtidos de 6 experimentos independentes. Número de células analisadas (LG: 150 e HG: 140).

Outros parâmetros observados através da evidenciação do citoesqueleto foram

adesão e espraiamento. A avaliação de adesão celular inicial foi realizada 20 minutos após as

células serem semeadas sobre fibronectina. Conforme resultados apresentados na Figura 12,

a glicose elevada reduziu em cerca de 30% o número de células aderidas ao substrato,

quando comparado ao grupo controle.

Figura 12 – Efeitos da glicose elevada sobre a adesão de células de ligamento periodontal à fibronectina.

Células cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose foram plaqueadas sobre fibronectina e, após 20 minutos, foram fixadas e coradas para obtenção de imagens (microscópio de fluorescência, objetiva 20 X) e contagem de células aderidas. Estes resultados foram obtidos de 9 experimentos independentes, realizados em triplicatas. Número de células analisadas (LG: 300 e HG: 200). (LG vs HG, * p<0,001).

Para a análise do espraiamento celular, as células foram fixadas 1 h após serem

semeadas. Observou-se que a glicose elevada reduziu em cerca de 35% a área ocupada pelas

células, como observado na Figura 13.

52

Figura 13 – Efeitos da glicose elevada sobre o espraiamento de células de ligamento periodontal.

Células previamente cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose, foram posteriormente plaqueadas sobre fibronectina, fixadas após 1 hora e coradas (F-actina – verde e núcleo - azul) para análise do espraiamento celular. O programa Image J foi utilizado para analisar a área de células aderidas neste período. Estes resultados foram obtidos de 9 experimentos independentes. Número de células analisadas (LG: 470 e HG: 340). (LG vs HG, * p<0,01).

4.3 Migração celular

Frente a alterações causadas pela concentração elevada de glicose sobre a

morfologia celular, avaliou-se a migração celular utilizando-se câmara bipartite (Transwell) e

vídeo microscopia (time-lapse). A partir dos vídeos avaliou-se a velocidade celular média e a

direcionalidade das células. Quanto mais direcional a célula, maior a efetividade da migração

(maior deslocamento / tempo).

Os experimentos com câmaras bipartite mostraram uma diminuição de 54% da

migração em células expostas à alta concentração de glicose em relação ao grupo controle,

conforme observado na Figura 14.

53

Figura 14 – Efeitos da glicose elevada sobre a migração de células de ligamento periodontal.

As células cultivadas em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose por 7 dias em placas. As células foram então submetidas ao ensaio de migração em câmara bipartite (transwell) por 8 horas, com fibronectina (1 μg/ml). As células que migraram para o lado inferior da membrana foram fixadas, coradas e contadas em toda a superfície da membrana, conforme descrito em Métodos. (A) Imagens representativas de células coradas com cristal violeta; (B) Resultado quantitativo do comportamento migratório de células controle e expostas à elevada concentração de glicose. Os resultados foram obtidos de 9 experimentos independentes. Número de células analisadas (LG: 1150 e HG: 529). (LG vs HG, * p<0,001).

Observou-se também uma redução significativa na velocidade (cerca de 20 %) e

direcionalidade (cerca de 25 %) das células expostas à glicose elevada, conforme observado

na Figura 15 e Figura 16. A direcionalidade foi calculada pela relação D/T, que consiste da

razão entre a menor distância entre a coordenada inicial e final / distância percorrida pela

célula. De acordo com este índice, o valor 1,0 (máximo) é muito direcional, já que a célula

percorreu a distância mínima entre um ponto e outro; quanto menor o valor, menor o

deslocamento celular em função da distância percorrida.

54

Figura 15 – Efeitos da glicose elevada sobre a direcionalidade de células de ligamento periodontal.

Células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose. Após 24 horas de um novo plaqueamento sobre fibronectina, imagens foram obtidas em intervalos de 10 minutos por 20 horas por vídeo-microscopia (time-lapse), com objetiva de 10 X no equipamento InCell Analyzer 2200 (CEFAP-USP). Direcionalidade (d/t): d corresponde à menor distância entre a localização incial e a final, enquanto t é a distância percorrida. Estes resultados foram obtidos de 6 experimentos independentes. Número de células analisadas (LG: 321 e HG: 338) (LG vs HG, *p<0,01).

Figura 16 – Efeitos da glicose elevada sobre a velocidade de células de ligamento periodontal.

Células foram cultivadas por 7 dias em presença de 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose e replaqueadas sobre fibronectina. Após 24 horas, imagens foram obtidas em intervalos de 10 minutos por 20 horas por vídeo-microscopia (time-lapse), com objetiva de 10 X no equipamento InCell Analyzer 2200 (CEFAP-USP). A velocidade foi calculada em μm/h. Estes resultados foram obtidos de 6 experimentos independentes. Número de células analisadas (LG: 321 e HG: 338) (LG vs HG, p<0,01).

55

Um parâmetro muito importante para a migração celular e direcionalidade é a

formação de protrusões celulares. Quanto maior o número de protrusões simultâneas, há

uma tendência à menor direcionalidade. Observamos que no grupo exposto à glicose

elevada um grande número de células apresentava mais de 3 protrusões simultâneas, em

comparação ao grupo controle (Figura 17).

Figura 17 – Efeitos da glicose elevada sobre o número de protrusões em células de ligamento periodontal.

Células cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose. Estas foram novamente plaqueadas sobre fibronectina e, após 24 horas, fixadas e submetidas à evidenciação de F-actina. A contagem de células com mais de 3 protrusões foi realizada em imagens obtidas em microscópio de fluorescência (objetiva de 20 X). Estes resultados foram obtidos de 6 experimentos independentes. Número de células analisadas (LG: 252 e HG: 221) (LG vs HG, * p<0,01).

A dinâmica das protrusões foi avaliada em filmes de time-lapse com duração de

30 minutos e intervalos de 1 minuto (objetiva de 40 X). Observou-se novas protrusões

formadas pelas células, assim como a persistência ou retração das mesmas. No grupo HG

houve aumento de 4 vezes na ocorrência de retrações de novas protrusões (Figura 18),

quando comparadas às protrusões formadas pelas células do grupo LG, o que sugere uma

instabilidade das protrusões.

56

Figura 18 – Análise da dinâmica de formação e retração de protrusões de células de ligamento periodontal após exposição à elevada concentração de glicose.

Células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose. Após 24 horas de novo plaqueamento sobre fibronectina, imagens foram obtidas em intervalos de 1 minuto durante 30 minutos por vídeo-microscopia (time-lapse), com objetiva de 40 X no equipamento InCell Analyzer 2200 (CEFAP-USP). Estes resultados foram obtidos de 3 experimentos independentes. Número de células analisadas (LG: 19 e HG: 15) (LG vs HG, * p<0,01).

4.4 Crescimento celular: proliferação celular X morte celular

Foi realizada uma curva de crescimento celular, na qual as células foram

contadas 24, 48 e 72 h após a semeadura. Conforme observado na Figura 19, houve uma

tendência de redução do crescimento promovida pela glicose elevada. Esta tendência pode,

potencialmente, ser atribuída a uma diminuição da proliferação celular, a um aumento da

morte celular ou ambos.

57

Figura 19 – Efeitos da glicose elevada sobre o crescimento de células de ligamento periodontal.

Células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose. A seguir, novo plaqueamento foi realizado sobre fibronectina e após 24 h, as células foram incubadas com marcador nuclear Hoescht Invitrogen (2 μl/ml) por 20 minutos conforme descrito em Métodos. Após incubação, as células foram contadas 24 h, 48 h e 72 h utilizando o aparelho InCell Analyzer 2200 (CEFAP-USP). Estes resultados foram obtidos de 3 experimentos independentes.

A taxa de proliferação celular foi avaliada por meio do ensaio de incorporação de

5-bromo-2‘deoxiuridina (BrdU), conforme descrito na metodologia. O BrdU é um análogo da

timidina, incorporado ao DNA durante a fase S da proliferação celular. A incorporação do

BrdU pelas células é visualizada posteriormente por meio de reação imunohistoquímica. A

glicose elevada não alterou a proliferação celular (Figura 20), sugerindo que a alteração

previamente observada no crescimento celular está principalmente relacionada ao aumento

da morte celular.

58

Figura 20 - Efeitos da elevada concentração de glicose sobre a proliferação de células do ligamento periodontal.

Células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose. A proliferação celular foi avaliada pelo método de incorporação de BrdU conforme descrito em Métodos. O BrdU incorporado foi detectado por reação de imunofluorescência com anticorpo anti-BrdU. A porcentagem de células positivas foi determinada em função do número total de células, por análise feita no InCell Analyzer 2200 (objetiva de 20 X). As células foram contadas utilizando o software Image J. Estes resultados foram obtidos de 3 experimentos independentes. Número de células analisadas (LG ~7 X 106 e HG ~9 X106).

Para análise da morte celular por apoptose utilizou-se o método de TUNEL, que

detecta o DNA fragmentado. O ensaio baseia-se no reconhecimento dos fragmentos

produzidos pela enzima desoxinucleotidil-transferase terminal, que catalisa a adição de UTP.

Os resultados mostraram que as células expostas à alta concentração de glicose

apresentaram um aumento de cerca de 3 vezes na apoptose, quando comparadas com as

células controle (Figura 21).

59

Figura 21 – Efeitos da glicose elevada sobre a morte por apoptose de células do ligamento periodontal.

Células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose. A morte celular foi avaliada pelo método de TUNEL (kit TUNEL, fluorescein - ROCHE), conforme descrito em Métodos. A análise de células positivas foi determinada por meio do equipamento In Cell Analyzer (objetiva 20 X). As células foram contadas com ajuda de software Image J. (A) Imagens representativas da marcação de TUNEL indicadas por flechas brancas; (B) Resultados quantitativos da marcação. Estes resultados foram obtidos de 9 experimentos independentes. Número total de células contadas com Image J (LG: 215 e HG: 166) e no In cell (LG: 9 X106 e HG: 11 X106). (LG vs HG, * p<0,0001).

Considerando que este aumento da morte celular poderia estar relacionado à

hiperosmolaridade promovida pela elevada concentração de glicose, o ensaio de TUNEL foi

realizado também em células cultivadas na presença de D-Manitol 25 mM (controle

osmótico), que não é metabolizado pelas células, mas exerce um efeito osmótico no meio de

cultura. A Figura 22 mostra que a morte celular promovida pela glicose elevada não teve

relação com a hiperosmolaridade do meio.

60

Figura 22 – Avaliação do papel da osmolaridade sobre a morte por apoptose de células do ligamento periodontal.

Adicionalmente aos grupos LG e HG, o grupo OC (controle osmótico) foi incluído. Este consistiu de células cultivadas por 7 dias em presença de meio de cultura contendo 5 mM de glicose + 25 mM de D-manitol. A seguir o ensaio de morte celular pelo método TUNEL foi realizado como descrito em Métodos. A análise de células positivas foi determinada por meio do equipamento In Cell Analyzer (objetiva 20 X) nos três grupos experimentais. As células foram contadas com ajuda de software Image J. OC: grupo controle osmótico. Estes resultados foram obtidos de 9 experimentos independentes. Número de células (LG: 1507; HG: 1074; OC: 929) (LG x HG, *p < 0,05; OC vs HG, ** p<0,05).

A morte celular foi também avaliada pela distribuição da enzima caspase-3,

envolvida na via de apoptose. Imagem representativa é apresentada na Figura 23.

61

Figura 23 – Imagem representativa de imunomarcação de caspase 3 em célula de ligamento periodontal.

Células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose. A seguir, novo plaqueamento foi realizado em lamínulas com fibronectina e as células foram mantidas por 24 horas. A seguir, a identificação de caspase 3 foi realizada por imunocitoquímica, conforme descrito em Métodos. Imagens da imunomarcação de caspase 3 foram obtidas de campos aleatórios utilizando o equipamento In Cell Analyzer (CEFAP-USP). N: núcleo (azul); C: caspase 3 (vermelho); A: F-actina (verde).

A análise dos dados obtidos da imunomarcação de caspase 3 nos grupos controle

(LG) e exposto à elevada concentração de glicose (HG) (Figura 24) mostrou que houve um

aumento de cerca de três vezes na marcação desta proteína em células expostas à glicose

elevada, em comparação às células controle.

62

Figura 24 – Efeitos da glicose elevada sobre a expressão proteica de caspase 3 em células de ligamento periodontal.

Células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose. A seguir, novo plaqueamento foi realizado em lamínulas com fibronectina e as células foram mantidas por 24 horas. A identificação de caspase 3 foi realizada por imunofluorescência, conforme descrito em Métodos. Imagens da imunomarcação foram obtidas de campos aleatórios utilizando o equipamento In Cell Analyzer (objetiva 20X). O Programa Image J foi ulilizado para analisar o número de células totais e de células marcadas. (A) Imagens representativas da marcação de caspase 3 indicadas por flechas brancas; (B) Resultado quantitativo em porcentagem referente à razão entre número de células marcadas pelo número total de células. Estes resultados foram obtidos de 9 experimentos independentes. Número de células analisadas (LG: 7046; HG: 6477). (LG X HG, * p < 0,05).

4.5 Análise da expressão gênica de miRNAs por PCR em tempo real

Observadas as alterações na migração e na morte celular, a etapa seguinte foi

averiguar o potencial envolvimento de miRNAs nos efeitos promovidos pela glicose elevada.

Pesquisamos na literatura miRNAs regulados pela glicose em diferentes tecidos e órgãos,

que teriam dentre seus principais alvos proteínas relacionadas a estes processos celulares.

Sendo assim, avaliamos a expressão do miR-29a e de seu braço 29ax, miR-221 e miR-222.

A escolha do miR-29a foi feita também com base em alvos relacionados à síntese

de colágeno e alvos pertencentes à família Rho de GTPases de baixo peso molecular,

63

reguladoras do citoesqueleto e da migração celular. Além disso, este miRNA é expresso em

células do ligamento periodontal, sendo modulado pela doença periodontal (KAGIYA, 2016).

A expressão do miR-29a e do seu braço complementar miR-29ax foi avaliada por

PCR em tempo real, utilizando-se kits específicos para estes miRNAs. O miR-29a apresentou-

se bastante expresso nas células do LP, não sendo modulado pela concentração extracelular

de glicose (Figura 25). O miR-29ax, comparativamente, não foi tão expresso e também não

foi modulado pela glicose (Figura 26).

Figura 25 – Expressão do miR-29a em células do ligamento periodontal após exposição à elevada concentração de glicose.

Células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose. A expressão do miR-29a foi avaliada por PCR em tempo real. (A) Expressão total normalizada por controle interno RNU6B e (B) Expressão relativa ao LG. Resultados obtidos de 6 experimentos independentes.

Figura 26 – Expressão do miR-29ax em células do ligamento periodontal após exposição à elevada concentração de glicose.

64

Células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose. A expressão do miR-29ax foi avaliada por PCR em tempo real. (A) Expressão total normalizada por controle interno RNU6B e (B) Expressão relativa ao LG. Resultados obtidos de 6 experimentos independentes.

Os miRNAs miR-221 e miR-222 são expressos em células do LP e foram relatados

na literatura como miRNAs envolvidos na regulação da migração e proliferação celular.

Neste estudo, a expressão desses genes em células do LP foi bastante representativa. Ambos

apresentaram uma redução da expressão promovida pela glicose elevada, em cerca de 40%

(Figuras 27 e 28).

Figura 27 – Expressão do miR-221 em células do ligamento periodontal após exposição à elevada concentração de glicose.

Células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose (placas com fibronectina 1 μg/ml). A expressão do miR-221 foi avaliada por PCR em tempo real. (A) Expressão total normalizada por controle interno RNU6B e (B) Expressão relativa ao LG. Resultados obtidos de 2 experimentos independentes. (LG vs HG, * p < 0,05).

65

Figura 28 – Expressão do miR-222 em células do ligamento periodontal após exposição à elevada concentração de glicose.

Células foram cultivadas por 7 dias (placas com fibronectina 1 μg/ml) em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose. A expressão do miR-222 foi avaliada por PCR em tempo real. (A) Expressão total normalizada por controle interno RNU6B e (B) Expressão relativa ao LG. Resultados obtidos de 2 experimentos independentes. (LG vs HG, * p < 0,05).

4.6 Estudos funcionais dos miR-221 e miR-222 em células do ligamento periodontal

4.6.1 Supressão de miR-221 e miR-222

Considerando que a glicose elevada reduziu a expressão de miR-221 e miR-222,

optou-se por estudar os efeitos da inibição destes miRNAs sobre a migração e morte por

apoptose em células controle (parâmetros alterados pela glicose). Para isso, foi realizada a

transfecção transiente de antagomiRs por meio de lipofectamina, a fim de diminuir a

expressão de miR-221 e miR-222 em células do grupo LG.

Após a transfecção dos antagomiRs, foi realizado RT-PCR em tempo real para

verificação da diminuição da expressão dos miRNAs e também ensaios funcionais de

migração celular (Transwell e Time Lapse) e morte celular (TUNEL). O RT-PCR em tempo real

revelou uma diminuição próxima a 65% na expressão de miR-221 e miR-222, conforme

mostrado nas Figuras 29 e 30.

Figura 29 – Supressão do miR-221 em células do ligamento periodontal.

Células cultivadas por 7 dias (placas com fibronectina 1 μg/ml) em meio de cultura com 5 mM (LG) de glicose foram transfectadas com sequências sintéticas complementares de miR-221-3p (antagomiR) conforme descrito em Métodos. A expressão do miR-221-3p foi avaliada por PCR em tempo real. (A) Expressão total normalizada por controle interno

66

RNU6B e (B) Expressão relativa ao LG. Resultados obtidos de 2 experimentos independentes. (LG vs antimiR-221 * p < 0,01; miR-control vs antimiR-221,* p < 0,01).

Figura 30 – Supressão do miR-222 em células do ligamento periodontal

Células cultivadas por 7 dias (placas com fibronectina 1 μg/ml) em meio de cultura com 5 mM (LG) de glicose foram transfectadas com sequências sintéticas complementares de miR-222-3p (antagomiR) conforme descrito em Métodos. A expressão do miR-222-3p foi avaliada por PCR em tempo real. (A) Expressão total normalizada por controle interno RNU6B e (B) Expressão relativa ao LG. Resultados obtidos de 2 experimentos independentes. (LG vs antimiR-222 * p < 0,01; miR-control vs antimiR-222,* p < 0,01).

O ensaio de morte celular por TUNEL (Figura 31) revelou um aumento na

marcação de células apoptóticas de cerca de 3,5 x para as células com miR-221 inibido e de 5

x para as células com miR-222 inibido. Já o ensaio de Transwell (Figura 32) mostrou uma

redução de 37% na migração das células com miR-221 inibido e 57% na migração de células

com miR-222 inibido.

67

Figura 31 – Avaliação da morte celular por apoptose após supressão de miR-221 e miR-222 em células do ligamento periodontal.

Células controle (LG) foram transfectadas com antagomiR-221 e -222 conforme descrito em Métodos. Após 24 horas de transfecção, o ensaio de morte celular foi realizado pelo Método de TUNEL. O resultado obtido ao final de 48 horas após a transfecção foi analisado no aparelho InCell Analyzer 2200 (CEFAP-USP). Resultado obtido de 2 experimentos independentes. Número de células analisadas (LG: 614; miR-control: 698; AntagomiR-221: 414; AntagomiR-222: 286 (LG vs miR-222 * p < 0,05; antimiR-control vs antimiR-221 e miR-222, * p < 0,01).

Figura 32 – Avaliação da migração celular por ensaio de transwell após supressão de miR-221 e miR-222 em células do ligamento periodontal.

Células controle (LG) foram transfectadas com antagomiR-221 e 222 conforme descrito em Métodos. Após 40 horas de transfecção, o ensaio de migração por transwell foi realizado. O resultado obtido ao final de 48 horas foi analisado. Resultado obtido de 2 experimentos independentes. (antimiR-control vs antimiR-221 e miR-222, * p < 0,05).

68

Os resultados para migração (time-lapse) mostraram uma diminuição de 33% na

direcionalidade das células com miR-221 inibido e 30% de diminuição na direcionalidade das

células com o miR-222 inibido, como podemos observar na Figura 33. Já a velocidade não foi

alterada diante da inibição destes miRNAs, conforme mostrado na Figura 34.

Figura 33 – Avaliação da direcionalidade celular após supressão de miR-221 e miR-222 em células do ligamento periodontal por ensaio de vídeo-microscopia (time-lapse).

Células controle (LG) foram transfectadas com antagomiR-221 e 222 conforme descrito em Métodos. Após 24 horas de transfecção, novo plaqueamento foi realizado. Posteriormente, as células foram submetidas ao ensaio de migração por time-lapse (40 horas após transfecção). Imagens foram coletadas a cada 10 minutos por 10 h (objetiva de 10 X) no aparelho InCell Analyzer 2200 (CEFAP-USP). O software image J foi utilizado para obtenção dos dados e posterior cálculo do índice de direcionalidade conforme descrito em Métodos. Resultado obtido de 2 experimentos independentes. Número de células (LG: 132; miR-controle: 129; AntimiR-221: 151; AntimiR-222: 138) (LG vs miR-221 e 222 * p < 0,01; antimiR-control vs antimiR-221 e miR-222, * p < 0,01).

69

Figura 34 – Avaliação da velocidade celular após supressão de miR-221 e miR-222 em células do ligamento periodontal por ensaio de vídeo-microscopia (time-lapse).

Células controle (LG) foram transfectadas com antagomiR-221 e 222 conforme descrito em Métodos. Após 24 horas de transfecção, novo plaqueamento foi realizado. Posteriormente, as células foram submetidas ao ensaio de migração por time-lapse (40 horas após transfecção). Imagens foram coletadas a cada 10 minutos por 10 h (objetiva de 10 X) no aparelho InCell Analyzer 2200 (CEFAP-USP). O software image J foi utilizado para obtenção dos dados e posterior cálculo da velocidade (μm/h). Resultado obtido de 2 experimentos independentes. Número de células (LG: 132; miR-controle: 129; AntimiR-221: 151; AntimiR-222: 138).

4.6.2 Superexpressão de miR-221 e miR-222

Além da inibição de miR-221 e miR-222, investigamos se os parâmetros de

migração e morte por TUNEL também eram alterados no grupo com glicose elevada quando

as concentrações de miR-221 e miR-222 eram aumentadas. Para isso, foi realizada

transfecção transiente nos grupos com glicose elevada, seguida de ensaio de morte celular

por TUNEL e ensaios de migração por transwell e time-lapse para verificação da velocidade e

direcionalidade celulares. A análise da expressão está apresentada nas Figuras 35 e 36.

70

Figura 35 – Superexpressão do miR-221 em células do ligamento periodontal

Células cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 30 mM (HG) de glicose foram transfectadas com sequências sintéticas que mimetizam miR-221-3p (mimics-miR-221) conforme descrito em Métodos. A expressão do miR-221-3p foi avaliada por PCR em Tempo Real. Resultado obtido de 2 experimentos independentes. (HG vs mimics-221 * p < 0,001; miR-control vs mimics-221, * p < 0,001).

Figura 36 – Superexpressão do miR-222 em células do ligamento periodontal

Células cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 30 mM (HG) de glicose foram transfectadas com sequências sintéticas que mimetizam miR-222-3p (mimics-miR-222) conforme descrito em Métodos. A expressão do miR-222-3p foi avaliada por PCR em tempo real. Resultado obtido de 2 experimentos independentes. (HG vs mimics-222 * p < 0,001; miR-control vs mimics-222, * p < 0,001).

71

O ensaio de TUNEL mostrou uma diminuição cerca de 30% no grupo com

aumento de miR-221 e diminuição de cerca de 40% no grupo com miR-222 aumentado,

conforme mostrado na Figura 37.

Figura 37 – Avaliação da morte celular por apoptose após superexpressão de miR-221 e miR-222 em células do ligamento periodontal.

Células HG foram transfectadas com mimics-miR-221 e 222 conforme descrito em Métodos. Após 24 horas de transfecção, o ensaio de morte celular foi realizado pelo Método de Tunel. O resultado obtido ao final de 48 horas após a transfecção foi analisado aparelho InCell Analyzer 2200 (CEFAP-USP). Resultado obtido de 2 experimentos independentes. (miR-control vs mimics-221 e mimics-222, * p < 0,001).

Nos ensaios de migração em Transwell, a superexpressão de miR-221 aumentou

em cerca 50% a migração de células expostas à glicose elevada, enquanto a superexpressão

de miR-222 aumentou em cerca de 30% a migração (Figura 38).

Figura 38 – Avaliação da migração celular por ensaio de transwell após superexpressão de miR-221 e miR-222 em células do ligamento periodontal.

72

Células HG foram transfectadas com mimics-221 e 222 conforme descrito em Métodos. Após 40 horas de transfecção, o ensaio de migração por transwell foi realizado. O resultado obtido ao final de 48 horas foi analisado. Resultado obtido de 2 experimentos independentes. (HG vs miR-221 e 222, * p < 0,05; miR-control vs mimics-221 e mimics-222, * p < 0,05).

O ensaio por time-lapse mostrou que a a superexpressão de miR-221 e miR-222

não alterou a direcionalidade e velocidade celulares, conforme mostrado nas figuras 39 e 40,

respectivamente.

Figura 39 – Avaliação da direcionalidade celular após superexpressão de miR-221 e miR-222 em células do ligamento periodontal.

Células HG foram transfectadas com mimics-miR-221 e 222 conforme descrito em Métodos. Após 24 horas de transfecção, novo plaqueamento foi realizado. Após 40 horas de transfecção, células foram submetidas ao ensaio de migração por time-lapse. Imagens foram coletadas a cada 10 minutos por 10 h (objetiva de 10 X) no aparelho InCell Analyzer 2200. O software image J foi utilizado para obtenção dos dados e posterior cálculo do índice de direcionalidade. Resultado obtido de 2 experimentos independentes.

73

Figura 40 – Avaliação da velocidade celular após superexpressão de miR-221 e miR-222 em células do ligamento periodontal.

Células HG foram transfectadas com mimics-miR-221 e 222 conforme descrito em Métodos. Após 24 horas de transfecção, novo plaqueamento foi realizado. Após 40 horas de transfecção, células foram submetidas ao ensaio de migração por time-lapse. Imagens foram coletadas a cada 10 minutos por 20 h (objetiva de 10 X) no aparelho InCell Analyzer 2200. O software Image J foi utilizado para obtenção dos dados e posterior cálculo da velocidade (µm/h) conforme descrito em Métodos. Resultado obtido de 2 experimentos independentes.

4.7 Busca por Alvos

A busca por possíveis alvos para miR-221 e miR-222 foi feita através de sites de

bioinformática como o TarBase; miRBase; microrna.org e miRTarBase. Em princípio,

buscamos como possíveis alvos proteínas integrantes da via de Rho GTPases, que estão

intimamente envolvidas na migração celular. Essa procura nos revelou como possível alvo a

Rho cinase (ROCK). A Tabela 2 mostra ROCK em uma lista de vários possíveis alvos para miR-

221 e miR-222, assim como Caspase 3, uma proteína da via de apoptose que está

aumentada em nosso modelo expreimental exposto à alta concentração de glicose.

74

MIRNA SÍMBOLO DESCRIÇÃO BANCOS VALIDAÇÃO M

iR-2

21

CASP3 Caspase 3 MIRTARBASE

TARBASE MICRORNA.ORG

VALIDADO E PREDITO

RHOA Ras homolog gene family,

member A

MIRTARBASE TARBASE

MICRORNA.ORG

VALIDADO E PREDITO

ROCK1 Rho-associated protein kinase 1 MICRORNA.ORG PREDITO


MiR

-222

CASP3 Caspase 3 MIRTARBASE

TARBASE MICRORNA.ORG

VALIDADO E PREDITO

RHOA Ras homolog gene family,

member A

MIRTARBASE TARBASE

MICRORNA.ORG PREDITO



Tabela 2 – Alvos validados e preditos para miR-221-3p e miR-222-3p, de acordo com programas computacionais online.

4.8 Inibição de ROCK por Y27632

Em virtude dos resultados obtidos na busca por possíveis alvos para miR-221 e

miR-222, foi realizada a inibição de ROCK (isoformas 1 e 2) com o inibidor Y27632. A inibição

de ROCK diminui a fosforilação da cadeia leve da miosina 2, reduzindo a contratilidade

celular. Conforme pode ser observado na Figura 41, após a inibição de ROCK as células (LG e

HG) apresentaram longos prolongamentos, principalmente na parte traseira, devido a

dificuldades na contração do corpo celular e retração da cauda.

75

Figura 41 – Evidenciação do citoesqueleto de F-actina em células de ligamento periodontal após exposição à elevada concentração de glicose e a um inibidor de Rho cinase (ROCK).

As células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose, conforme descrito em Métodos. Foram novamente plaqueadas sobre fibronectina 1 μg/ml na presença ou ausência de Y27632 30 μM e após 24 horas, foram fixadas, F-actina (verde) e núcleo (azul) foram corados. Imagens foram obtidas em aparelho InCell Analyzer 2200 na objetiva 20 X e analisadas em software ImageJ. Resultados obtidos de 2 experimentos independentes.

A Figura 42 mostra os efeitos da inibição de ROCK sobre a migração celular

(ensaio de transwell). Houve diferença entre LG e HG, conforme já observado

anteriormente, mas a inibição de ROCK não afetou a migração celular.

76

Figura 42 – Efeitos da glicose elevada e da inibição de ROCK sobre a migração de células do ligamento periodontal.

Células cultivadas em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose por 7 dias foram submetidas ao ensaio de migração em câmara bipartite (transwell) por 8 horas, com fibronectina, na presença do inibidor Y27632 30 μM. As células que migram para o lado inferior da membrana foram fixadas, coradas e contadas em toda a superfície da membrana conforme descrito em Métodos. Os resultados foram obtidos de 2 experimentos independentes. * p<0,01).

Em ensaios de time-lapse observou-se um aumento da direcionalidade celular

após a inibição de ROCK, conforme mostrado na Figura 43. Da mesma forma, a velocidade

das células também estava aumentada na presença do inibidor Y27632 (Figura 44).

77

Figura 43 – Efeitos da glicose elevada e da inibição de ROCK sobre a direcionalidade de células de ligamento periodontal.

As células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose, conforme descrito em Métodos. Foram novamente plaqueadas sobre fibronectina 1 μg/ml na presença ou ausência de Y27632 30 μM e após 24 horas, as células foram submetidas ao ensaio de migração por time-lapse. Imagens foram coletadas a cada 10 minutos por 20 h (objetiva de 10 X) no aparelho InCell Analyzer 2200. O software Image J foi utilizado para obtenção dos dados e posterior cálculo da direcionalidade conforme descrito em Métodos. Resultado obtido de 2 experimentos independentes. *, p<0,01).

Figura 44– Efeitos da glicose elevada e da inibição de ROCK sobre a velocidade de células de ligamento periodontal.

As células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose, conforme descrito em Métodos. Foram novamente plaqueadas sobre fibronectina 1 μg/ml na presença ou ausência de Y27632 30 μM e após 24 horas, as células foram submetidas ao ensaio de migração por time-lapse. Imagens foram coletadas a cada 10 minutos por 20 h (objetiva de 10 X) no aparelho InCell Analyzer 2200. O software Image J foi utilizado para obtenção dos dados e posterior cálculo da

78

velocidade (µm/h) conforme descrito em Métodos. Resultado obtido de 2 experimentos independentes. *p<0,01).

Uma observação interessante nos ensaios de time-lapse foi o aumento do

numero de células/campo após inibição de ROCK, conforme mostrado na Figura 45. Este

efeito do inibidor foi observado tanto em células LG quanto em células HG.

Figura 45 – Avaliação do número de células do ligamento periodontal após exposição à elevada concentração de glicose e ao inibidor de Rho cinase (ROCK) Y27632.

As células foram cultivadas por 7 dias em meio de cultura com 5 mM (LG) e 30 mM (HG) de glicose, conforme descrito em Métodos. Foram novamente plaqueadas sobre fibronectina 1 μg/ml na presença ou ausência de Y27632 30 μM e após 24 horas, foram fixadas e F-actina (verde) e núcleo (azul) foram corados. Imagens foram obtidas em aparelho InCell Analyzer 2200 na objetiva 20X e posteriormente contadas utilizando o software ImageJ. Resultados obtidos de 2 experimentos independentes.

79

5 DISCUSSÃO

Sabe-se que a hiperglicemia presente no DM potencializa a destruição do

periodonto de inserção causada pela doença periodontal (PRESHAW et al., 2012; IRWANDI;

VACHARAKSA, 2016) e, de maneira geral, exacerba processos osteolíticos presentes durante

a movimentação ortodôntica (BRAGA et al., 2011) ou em lesões periapicais causadas por

infecções pulpares (SEGURA-EGEA et al., 2005; SEGURA-EGEA et al., 2012). Zhang et al.

(2016) demonstraram que a glicose elevada aumentou a expressão do ligante RANKL

(importante para a osteoclastogênese) e reduziu a expressão de osteoprotegerina em

fibroblastos do ligamento periodontal humano. Vários estudos sugerem um importante

papel de miRNAs nesta regulação (IRWANDI; VACHARAKSA, 2016). Adicionalmente, estudos

mostraram que células derivadas do LP humano tiveram diferenciação em osteoblastos

reduzida pela glicose elevada (KIM et al., 2006; KATO et al., 2016; LI; LI, 2016), prejudicando

assim a osteogênese.

Neste estudo utilizamos como modelo experimental células de LP humano

expostas in vitro a uma elevada concentração de glicose, bastante utilizado na literatura.

Para estudos de migração celular, demonstramos previamente que diversas linhagens

celulares (inclusive de fibroblastos) expostas à glicose elevada in vitro migram de maneira

semelhante a fibroblastos dérmicos obtidos de ratos com diabetes induzido por

streptozotocina (LAMERS et al., 2011).

Presumivelmente, as culturas obtidas de explantes do LP não são homogêneas,

por conter tanto fibroblastos quanto células tronco do LP. Investigamos por RT-PCR a

expressão de genes de clusters de diferenciação, como o CD34, MCAM (CD146) e ALCAM

(CD166) (HALFON et al., 2011; NAKAJIMA et al., 2014; SAITO et al., 2015). A não expressão

desses marcadores não invalida a presença de células tronco nas culturas, já que células

expressando outros marcadores de diferenciação podem estar presentes. Também

avaliamos a expressão do gene S100A4, que codifica a proteína FSP1, presente em

fibroblastos (LO et al., 2010; STRUTZ et al., 1995; TAKENAGA; NAKAMURA; SAKIYAMA, 1997)

e o marcador ER-TR7, que é usualmente expresso por fibroblastos reticulares de

camundongos e humanos (PHAN-LAI et al., 2013). Para obter culturas mais homogêneas

ricas em fibroblastos, realizamos os experimentos na presença de fibronectina, uma

80

glicoproteína da matriz extracelular abundante no LP humano. Embora a fibronectina não

tenha alterado a expressão de S100A4, aumentou a distribuição da proteína ER-TR7 nas

células, detectada por imunohistoquímica.

Conforme observado anteriormente em fibroblastos dérmicos e de linhagem

(LAMERS et al., 2011; ALMEIDA, 2011), a morfologia das células expostas à glicose elevada

foi alterada, havendo aumento da circularidade derivada de menor polarização, com

consequências evidentes para a migração celular direcionada. Para migrar, o fibroblasto

precisa, primeiramente, polarizar-se na direção do movimento e emitir uma protrusão

predominante que se adere ao substrato para, posteriormente, utilizando as adesões como

pontos de ancoragem, contrair o citoesqueleto de actina, impulsionando o corpo celular

para a frente e retraindo a parte traseira. Neste estudo observou-se que a glicose promoveu

uma redução da adesão inicial em torno de 30%, e do espraiamento celular em cerca de

35%. Almeida (2011), estudando fibroblastos dérmicos derivados de ratos diabéticos,

observou resultado semelhante na presença de colágeno tipo 1 e fibronectina.

Adicionalmente, Almeida et al. (2016) demonstraram, em fibroblastos derivados de ratos

diabéticos, uma redução da expressão de integrinas contendo as suunidades αv e α5, que

formam diferentes receptores para fibronectina. É possível, portanto, que a menor adesão e

espraiamento sobre fibronectina observada por nós em células do LP esteja relacionada a

uma menor expressão de integrinas.

Um resultado muito importante e inédito obtido no presente estudo é a

demonstração de uma significativa inibição da migração direcional (em câmaras bipartite) de

células do LP após exposição à glicose elevada (54%). Verificou-se também uma redução da

velocidade e direcionalidade celulares. Embora resultados semelhantes tenham sido

observados com fibroblastos de diferentes origens (LAMERS et al., 2011; ALMEIDA et al.,

2016), este é o primeiro estudo utilizando células do LP humano. Também de maneira

similar à observada em outros fibroblastos, células do LP expostas à glicose elevada

apresentaram múltiplas protrusões simultâneas, em várias direções, que se retraíam com

rapidez, tornando-as improdutivas para a migração celular. LAMERS et al. (2011) atribuíram

a maior formação de protrusões à ativação da GTPase Rac1, que regula a formação de

lamelipódios. A retração frequente das protrusões estaria, por sua vez, relacionada a um

menor amadurecimento das adesões junto à fibronectina. É possível, novamente, que uma

81

menor expressão de integrinas esteja relacionada à deficiência na adesão (ALMEIDA et al.,

2016). De maneira interessante, este fenótipo foi revertido na presença de um agente

antioxidante, demonstrando que o estresse oxidativo gerado pela maior metabolização de

glicose é importante na inibição da migração.

Os ensaios de curva de crescimento revelaram uma tendência à redução do

número de células, que poderia estar associada à menor proliferação ou aumento de morte

celular promovidos pela glicose. O ensaio de proliferação não mostrou alteração significativa

após exposição à glicose, o que difere da literatura. Vários estudos mostraram que células

derivadas do LP humano tiveram sua taxa de proliferação reduzida pela glicose elevada

(OHGI; JOHNSON, 1996; KIM et al., 2006; LI; LI, 2016), por meio de um mecanismo que

envolvia a ativação de NFK-B e secreção de IL-6 e IL-8 (KATO et al., 2016).

Diferentemente dos resultados obtidos com fibroblastos dérmicos ou de

linhagens, as células do LP expostas à glicose elevada apresentaram aumento de cerca de 3 x

na morte celular por apoptose, acompanhado de um aumento de caspase 3 (cerca de 3x).

Observamos uma marcação perinuclear e nuclear da caspase 3, condizente com o estudo de

Feng et al., (2005), que mostrou que em células leucêmicas em apoptose a ativação de

caspase 3 gerou uma mudança de localização subcelular correlacionada com mudanças

morfológicas. Os efeitos observados por nós não podem ser atribuídos à hiperosmolaridade

do meio, já que o controle osmótico não apresentou morte celular significativa. Outros

estudos na literatura observaram efeitos semelhantes; Liu et al., (2013a; 2013b) mostraram

que a glicose elevada induz a apoptose em fibroblastos do LP humano de maneira

dependente de concentração e da ativação de caspase 3 e PARP, embora independente da

via de sinalização Fas/FasL. Li (2014) mostrou um aumento de apoptose em células do LP

frente ao aumento de AGEs, produtos aumentados pela hiperglicemia (BROWNLEE, 2001).

Analisados os parâmetros fisiológicos dos fibroblastos periodontais frente à

glicose elevada, foi avaliada a expressão de miRNAs potencialmente reguladores da

migração e da síntese de matriz extracelular, e que poderiam ser modulados pela glicose.

Foram selecionados o miR-29a e miR-29x, miR-221 e miR-222. O miR-29a e seu braço miR-

29ax são expressos por células do LP e modulados por forças mecânicas de estiramento,

alterando a síntese de proteínas da matriz extracelular (p.ex. diversos tipos de colágeno)

(CHEN et al., 2015). O miR-29 também está alterado em soro de grávidas pré-diabéticas

82

(previamente à hiperglicemia, portanto), mas tem sua expressão reduzida no diabetes

gestacional, sendo indicado como biomarcador para esta complicação (ZHAO et al., 2011). O

miR-29 também está menos expresso em camundongos diabéticos com fibrose renal inicial

(WANG et al., 2012). No entanto, em diferentes órgãos (cardiomiócitos, fígado e pâncreas,

p.ex.) este miRNA está aumentado no DM, associado à hiperglicemia e a citocinas

inflamatórias (ARNOLD et al., 2014; SLUSARZ; PULAKAT, 2014). De fato, os estudos sugerem

uma regulação de miRNAs da família miR-29 (a, b, c) tanto pela glicose quanto pela insulina.

Com relação à migração celular, o miR-29 inibiu a migração e invasão de células de

carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço e de adenocarcinoma (HAN et al., 2014;

KINOSHITA et al., 2013; YAMAMOTO et al., 2013) e, se estivesse aumentado, poderia estar

relacionado à menor migração dos fibroblastos. Neste estudo, no entanto, embora a

expressão de miR-29a em células do LP tenha sido confirmada (mas não de seu braço miR-

29ax), não foi observada modulação de sua expressão pela glicose elevada.

Diferentemente do observado com miR-29a, miR-221 e miR-222 apresentaram-

se menos expressos (cerca de 40%) em células expostas à glicose elevada. Estes miRNAs são

potencialmente modulados pela hiperglicemia (LI et al., 2009; CONSTANTINO et al., 2016;

VILLARD et al., 2015) e podem regular a migração e proliferação de células tumorais (LI et al.,

2014; QIN; LUO, 2014; YANG et al., 2014). A ativação transcricional destes miRNAs parece

estar envolvida na regulação do ciclo celular, apoptose, formação de metástases e aquisição

de um fenótipo resistente a quimioterápicos (TEIXEIRA et al., 2012). Múltiplos alvos foram

identificados, desde MMPs e seus inibidores (TIMPs), até moléculas sinalizadoras do

citoesqueleto e da migração celular (LI et al., 2014; QIN; LUO, 2014; YANG et al., 2014).

Em modelos experimentais de DM tipo 2, miR-222 está elevado no sangue

(sendo regulado também pela insulina) (ORTEGA et al., 2014) e no tecido adiposo,

juntamente com miR-29a (HERRERA et al., 2010). Por outro lado, assim como o miR-29a, o

miR-222 está reduzido no diabetes gestacional já estabelecido (ZHAO et al., 2011). De

maneira geral, pode-se afirmar que a regulação de miRNAs é tecido-específica e, no caso do

DM, depende também do tipo de diabetes, podendo ser regulados pela hiperglicemia, pela

insulina e por citocinas inflamatórias.

Para examinar uma possível participação de miR-221 e miR-222 nos efeitos

exercidos pela glicose em células do LP, células controle sofreram redução da expressão de

83

miR-221 e miR-222 por meio da expressão transiente de antagomiRs. Houve redução da

migração celular em 37% (miR-221) e 57% (miR-222) e redução da direcionalidade em 30%,

mas não houve alteração de velocidade (células HG apresentavam 20% de redução da

velocidade). Por outro lado, a superexpressão de miR-221 e miR-222 utilizando transfecção

transiente com miRmimics em células expostas à elevada concentração de glicose aumentou

a migração em 50% (miR-221) e 30% (miR-222), não alterando velocidade ou

direcionalidade. Sendo assim, fica claro que estes dois miRNAs podem participar da inibição

da migração celular promovida pela glicose em células do LP, mas apenas parcialmente, já

que alguns dos efeitos (alteração da velocidade, p.ex.) não foram reproduzidos nos estudos

funcionais. Curiosamente, Li et al. (2009) demonstraram, em células endoteliais, um

aumento da expressão de miR-221 promovido pela glicose elevada, provocando uma

inibição da migração celular. Por outro lado, Yang et al., (2014) mostraram que a inibição de

miR-221 e miR-222 reduziu a proliferação e migração de células tumorais de próstata, via

ativação da proteína SIRT 1, uma desacetilase que participa de alterações epigenéticas. Esta

última não foi validada como alvo direto, no entanto.

Diversos estudos relacionam positivamente a expressão alterada de miR-221

e/ou miR-222 e alterações da migração celular. Quintavalle et al., (2012) demonstraram a

fosfatase PTPμ como alvo direto de ambos os miRNAs em células de glioblastoma, por

exemplo. MiR-221 foi positivamente relacionado com migração e proliferação em carcinoma

papilífero de tireóide (DIAO; WANG, 2016), carcinoma renal (LU et al., 2015) e câncer

coloretal (QIN; LUO, 2014) tendo como alvos diretos TIMP3, TIMP2 e RECK, respectivamente.

Todos estes alvos são inibidores da atividade de metaloproteinases de matriz (MMPs). No

presente estudo houve também uma correlação direta com a migração celular, mas não com

a proliferação celular. A correlação observada por nós foi maior em ensaios em câmara

bipartite na presença de fibronectina do que em ensaios de time-lapse, sugerindo que uma

atividade proteolítica poderia estar envolvida, já que na migração livre em sistemas

bidimensionais as células utilizam menos as MMPs.

A análise de potenciais alvos utilizando ferramentas de bioinformática revelou

que as proteínas RhoA, assim como seu efetor ROCK, poderiam estar envolvidas.

Hipoteticamente, em células HG a expressão destas proteínas poderia estar aumentada.

Para verificar a importância de ROCK para a migração de células do LP, utilizamos o inibidor

84

Y27632, que atua sobre as duas isoformas de ROCK (KOMERS, 2013). Conforme já

mencionado, ROCK é uma cinase que aumenta a fosforilação de miosina 2, aumentando

assim a contratilidade celular. Sendo assim, a inibição de ROCK promoveu alterações

morfológicas significativas, sugestivas de uma dificuldade das células de retrair o corpo

celular (caudas longas) e de uma possível ativação compensatória da GTPase Rac1

(processos celulares simultâneos). A migração em câmaras bipartite não foi afetada, mas a

velocidade celular e a direcionalidade aumentaram; a glicose não alterou este resultado.

Outros estudos relataram aumento da migração e invasão celulares após inibição de ROCK,

como o de Vishnubhotla et al., (2012) com células SW620 em matriz 3D de colágeno tipo I e

o de Sun et al., (2015) em feridas de córnea. No presente estudo, os efeitos da inibição de

ROCK sobre a velocidade e direcionalidade de células do LP são indicadores de que ROCK

poderia ser alvo de miR-221 e miR-222 e regular estes parâmetros da migração, num papel

parcial. Provavelmente, outros alvos também estariam envolvidos, como por exemplo

inibidores de MMPs, conforme já mencionado.

Observou-se também que sob tratamento com Y27632 houve um aumento do

número de células do LP, um fato interessante. Esse efeito já havia relatado em outros

estudos com células de glioblastoma (TILSON et al., 2015) e astrócitos (YU et al., 2012), por

exemplo.

Um efeito relevante de miR-221 e miR-222 diz respeito à apoptose. O efeito da

glicose elevada em células do LP foi reproduzido pela inibição destes miRNAs (aumento de

3,5 x para miR-221 e 5 x para miR-222), enquanto a superexpressão de miR-221 e miR-222

reduziu a apoptose em 30% e 40%, respectivamente. Observou-se também uma elevação de

3x na caspase 3 em células HG, sugerindo que esta enzima poderia ser um alvo destes

miRNAs; esta informação foi confirmada em plataformas de bioinformática disponíveis

online. No entanto, outros alvos podem estar envolvidos, além da caspase 3. Yang et al.,

(2014) mostraram que a inibição de miR-221 e miR-222 aumentou a apoptose de células

tumorais de próstata; naquele estudo, a desacetilase SIRT1 estava envolvida neste efeito.

Recentemente, Zhou et al. (2016) mostraram que a inibição destes dois miRNAs aumentava

a apoptose de células de carcinoma epidermóide oral tendo como alvo a fosfatase PTEN. O

mesmo efeito já foi observado em outros tumores, tornando estes miRNAs potenciais alvos

terapêuticos (BROGNARA et al., 2016).

85

Em conclusão, observamos neste estudo que, em células do LP humano, a glicose

elevada inibe a migração e aumenta a morte celular, potencialmente desfavorecendo a

regeneração periodontal. MiRNAs miR-221 e miR-222 podem estar envolvidos nestes efeitos

da glicose, atuando sobre diferentes alvos, como por exemplo ROCK e caspase 3;

possivelmente, outros alvos estariam também envolvidos. A elevação de miR-221 e miR-222

durante a terapia periodontal poderia, por sua vez, reduzir a morte por apoptose e acelerar

a migração celular, criando uma perspectiva interessante de novos alvos terapêuticos na

odontologia.

6 CONCLUSÃO

Neste estudo concluímos que, em células do ligamento periodontal humano:

A glicose elevada não alterou a proliferação celular, mas inibiu

significativamente a migração celular e aumentou a morte celular por

uma via de apoptose que envolve a ativação de caspase 3

As células expressaram miR-29a (mas não miR-29ax), miR-221 e miR-222;

a expressão de miR-221 e miR-222 foi modulada negativamente pela

elevada concentração de glicose

MiR-221 e miR-222 estimularam a migração celular e reduziram a morte

celular por apoptose, e poderiam estar envolvidos nos efeitos

promovidos pela glicose elevada

86

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