marcio david bocelli estudo da atividade de chalconas no

Marcio David Bocelli

ESTUDO DA ATIVIDADE DE CHALCONAS NO

CONTROLE DE BIOFILMES BACTERIANOS

Dissertação apresentada ao Instituto de Química de São Carlos da

Universidade de São Paulo, como parte dos requisitos para

obtenção do título de mestre em Ciências.

Área de concentração: Química Orgânica e Biológica

Orientadora: Profa. Dra. Marcia Nitschke

São Carlos

2016

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL

OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER

MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA

A FONTE.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, que sempre esteve no controle de tudo.

À minha família que sempre me ensinou que trabalhar

honestamente é a melhor maneira de mudar as coisas, além de ser uma

dádiva divina; incluindo meus irmãos Júnior, Rebeca e Érica.

Ao meu irmão Júnior Bocelli que, desde que iniciei meus estudos

foi minha inspiração pra fazer Ciência.

À minha eterna namorada e esposa Lorena, que sempre me

apoiou; independente da direção que eu quis seguir.

À Professora Dra Marcia Nitschke que aceitou me orientar e

compartilhar comigo do seu conhecimento.

Aos alunos de Iniciação Científica Vinícius Lima e Gabriela

Carrega por aceitarem o desafio de trabalhar no projeto.

Aos técnicos Marília Peret e João Pedro por toda ajuda, esforço e

compreensão durante minha jornada no laboratório.

A todos os amigos do Laboratório de Biotecnologia Microbiana

pelos anos de companheirismo, amizade, diversão, desabafos e

cumplicidade.

Ao Professor Dr. André Porto e a todo o pessoal do seu

laboratório, os quais estiveram envolvidos direta e indiretamente neste

trabalho.

À CAPES e FAPESP pelo apoio financeiro.

Ao Instituto de Química de São Carlos pela minha vida acadêmica.

Porque o fim da lei é Cristo para justiça de todo aquele

que crê.

Romanos 10:4

Resumo

Os biofilmes constituem uma forma de crescimento que permite a maior

sobrevivência e resistência de microrganismos a agentes de controle como

antibióticos e desinfetantes. Apesar da grande disponibilidade de agentes

antimicrobianos no mercado, há escassez de produtos específicos e efetivos na

erradicação/inibição de biofilmes. Existe atualmente grande interesse na seleção de

moléculas capazes de inibir o crescimento dos biofilmes ou removê-los quando já

estabelecidos. Doenças como fibrose cística (P. aeruginosa) e cárie dentária (S.

mutans), são patologias intrinsecamente ligadas à formação de biofilmes. O principal

objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de chalconas sintéticas e derivados no

controle e erradicação de biofilmes. As chalconas foram testadas quanto à

capacidade de inibir a formação de biofilme e de remover biofilmes pré-

estabelecidos. Inicialmente foi realizada uma triagem com 21 moléculas, utilizando a

técnica de cristal violeta para quantificação de biomassa e resazurina para

quantificação da viabilidade celular. Os biofilmes de P. aeruginosa foram inibidos

pela presença da molécula (E)-1-(3-hidroxinaftalen-2-il)-3-fenilprop-2-em-1-ona (11),

mostrando redução de 48,8% na biomassa e 60,2% na viabilidade. A redução

máxima na biomassa atingiu 70,9%. Já para o tratamento de biofilmes pré-

estabelecidos, a molécula (1E,4E)-1,5-difenilpenta-1,4-dien-3-ona (10) mostrou

redução de 53,5% na biomassa do biofilme de P. aeruginosa. Na formação do

biofilme de S. mutans, a presença da molécula (1E, 4E)-1,5-bis(4-bromofenil)penta-

1,4-dien-3-ona (15) reduziu a biomassa em 67,4%. Em concentrações elevadas

essa redução chegou a 95,1%. Em biofilmes pré-estabelecidos de S. mutans, o

tratamento com a molécula (2E,4E)-1,5-difenilpenta-2,4-dien-1-ona (12) reduziu a

biomassa celular em 62,7%, e a viabilidade celular em 58,4%. Já a molécula (E)-3-

(2-hidroxifenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona (21), quando utilizada no tratamento de

biofilmes pré-estabelecidos, mostrou redução de 26,4% na biomassa e 91,6% na

viabilidade de S. mutans; além de evidenciar danos à estrutura celular do

microrganismo. Todas as moléculas supracitadas promoveram redução na

espessura dos biofilmes. Os antibióticos ampicilina e polimixina foram menos

eficientes na remoção de biofilmes comparativamente às moléculas testadas. As

moléculas não apresentaram CIM nas concentrações testadas para nenhuma das

bactérias, porém pôde-se verificar que estas afetaram a viabilidade celular. O

tratamento da superfície de poliestireno com as chalconas não impediu a adesão

das bactérias, e resultou na redução da hidrofobicidade do material. A superfície

celular de S. mutans apresentou predomínio de cargas negativas e forte caráter

hidrofóbico enquanto que P. aeruginosa apresentou baixa hidrofobicidade além de

caráter básico. Os resultados evidenciam a potencialidade do uso das chalconas e

seus derivados para o controle e erradicação de biofilmes Streptococcus mutans e

Pseudomonas aeruginosa.

Palavras-chave: biofilmes, P. aeruginosa, S. mutans, chalconas

Abstract

Biofilms constitute a growth mode which allows greatest survival and resistance of

microorganisms to antibiotics and disinfectants. Despite the wide availability of

antimicrobial agents in the market, there are few specific and effective products to

the eradication / inhibition of biofilms. Thus, there is a great interest in the search of

molecules able to inhibit biofilms or remove them once established. Diseases such

as cystic fibrosis (P. aeruginosa) and dental caries (S. mutans), are intrinsically linked

to the formation of biofilms. The aim of this study was to evaluate the potential of

chalcones and their synthetic derivatives to the control and eradication of biofilms.

The chalcones were tested for the ability to inhibit biofilm formation and also to

remove pre-established biofilms. Initially, a screening of 21 molecules was performed

using the crystal violet technique for quantification of biomass and resazurin for

quantification of cell viability. Biofilms of P. aeruginosa was inhibited by the presence

of the molecule (E) -1- (3-hydroxynaphthalen-2-yl) -3-phenylprop-2-en-1-one (11)

showing reduction of 48.8% biomass and 60.2% viability. The maximum reduction in

biomass reached 70.9%. For the treatment of pre-established biofilms, the molecule

(1E, 4E) -1,5-difenilpenta-1,4-dien-3-one (10) showed a 53.5% reduction in biomass

of P. aeruginosa biofilm. Biofilms of S. mutans, growing in the the presence of the

molecule (1E, 4E) -1,5-bis (4-bromophenyl) penta-1,4-dien-3-one (15) showed a

biomass reduction of 67.4 %. At higher concentrations this reduction reached 95.1%.

In pre-established biofilms of S. mutans, treatment with the molecule (2E, 4E) -1,5-

difenilpenta-2,4-dien-1-one (12) reduced cell biomass in 62.7%, and cell viability by

58.4%. The molecule (E) -3- (2-hydroxyphenyl) -1-phenylprop-2-en-1-one (21), when

used in the treatment of pre-established biofilms, showed 26.4% reduction in

biomass and 91.6% in the viability of S. mutans; furthermore, the chalcone 21

caused damage to the cellular structure of the microorganism. All the

aforementioned molecules promoted a reduction in the thickness of biofilms. The

antibiotics polymyxin and ampicillin were less efficient on removing biofilms

comparatively to the chalcones. The molecules did not present MIC at the

concentrations tested for any of the bacteria, but it was verified that these affected

the cellular viability.The molecules affected cell viability however, no MIC was

observed under the range of concentrations evaluated. The treatment of the

polystyrene surface with chalcones did not prevent bacterial adhesion moreover,

hydrophobicity of the material was reduced. S. mutans cell surface showed a

predominance of negative charges and strong hydrophobic character while P.

aeruginosa showed low hydrophobicity and basic character. The results demonstrate

that synthetic chalcones and derivatives are potential candidates to the control and

eradication of Streptococcus mutans and Pseudomonas aeruginosa biofilms.

Key-words: biofilms, P. aeruginosa, S. mutans, chalcones

Sumário

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 15

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................... 17

2.1 Características dos Biofilmes ........................................................................... 17

2.2 Biofilmes – Formação ...................................................................................... 19

2.3 Mecanismos de resistência em biofilmes ......................................................... 21

2.4 Chalconas ........................................................................................................ 22

2.5 Mecanismos de ação anti-biofilme ................................................................... 24

2.6 Métodos de avaliação da ação anti-biofilme .................................................... 25

2.7 Microrganismos ................................................................................................ 27

2.7.1 Streptococcus mutans ............................................................................... 27

2.7.2 Pseudomonas aeruginosa ......................................................................... 28

3 OBJETIVOS ........................................................................................................ 30

3.1 Geral ................................................................................................................ 30

3.2 Específicos ....................................................................................................... 30

4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 31

4.1 Microrganismos ................................................................................................ 31

4.2 Meios de cultivo ............................................................................................... 31

4.3 Chalconas e derivados ..................................................................................... 31

4.4 Formação biofilme ............................................................................................ 35

4.4.1 Preparo das culturas e condições de cultivo .............................................. 35

4.4.2 Ação sobre a formação de biofilmes .......................................................... 36

4.4.3 Ação sobre biofilmes pré-formados ........................................................... 36

4.5 Quantificação dos biofilmes ............................................................................. 36

4.5.1 Biomassa celular........................................................................................ 36

4.5.2 Viabilidade das células .............................................................................. 37

4.6 Efeito da concentração das moléculas na atividade anti-biofilme .................... 37

4.6.1 Curvas de crescimento .............................................................................. 38

4.7 Atividade anti-adesiva ...................................................................................... 38

4.8 Determinação da hidrofobicidade do biofilme e do poliestireno tratado ........... 38

4.9 Determinação da hidrofobicidade celular (células planctônicas) ...................... 39

4.10 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) .................................................. 39

4.11 Microscopia confocal ...................................................................................... 40

4.12 Análise estatística .......................................................................................... 41

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................................ 41

5.1 Efeito das moléculas na formação de biofilmes e em biofilmes pré-formados . 41

5.1.1 Triagem inicial na formação e remoção de biofilme de Pseudomonas

aeruginosa .......................................................................................................... 42

5.1.2 Triagem inicial na formação e remoção de biofilme de Streptococcus

mutans 47

5.1.3 Considerações sobre a triagem inicial ....................................................... 50

5.2 Efeito da concentração das moléculas sobre os biofilmes ............................... 51

5.2.1 Efeito da variação de concentração das moléculas na atividade antibiofilme

frente à Pseudomonas aeruginosa .................................................................... 52

5.2.2 Efeito da variação de concentração das chalconas na atividade antibiofilme

frente à S. mutans .............................................................................................. 57

5.2.3 Considerações sobre o efeito da concentração das moléculas no biofilme

............................................................................................................................ 62

5.3 Atividade anti-adesiva do poliestireno tratado com as chalconas e seus

derivados ............................................................................................................... 63

5.4 Determinação da hidrofobicidade do biofilme e do poliestireno tratado com as

chalconas e seus derivados ................................................................................... 65

5.5 Determinação da hidrofobicidade celular ......................................................... 68

5.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) .................................................... 69

5.6.1 Microscopia de P. aeruginosa .................................................................... 70

5.6.2 Microscopia de S. mutans .......................................................................... 71

5.7 Microscopia Confocal ....................................................................................... 76

5.7.1 Microscopia Confocal para P. aeruginosa ................................................. 76

5.7.2 Microscopia Confocal para S. mutans ....................................................... 78

5.8 Principais resultados ........................................................................................ 80

6 CONCLUSÕES ................................................................................................... 81

7 PERSPECTIVAS FUTURAS .............................................................................. 82

8 REFERÊNCIAS .................................................................................................. 83

Índice de Tabelas

Tabela 1 - Moléculas utilizadas no projeto ................................................................ 32

Tabela 2 - Percentual de redução da biomassa total e viabilidade celular de P.

aeruginosa................................................................................................................. 46

Tabela 3 - Percentual de redução da biomassa total e viabilidade celular de S.

mutans. ..................................................................................................................... 50

Tabela 4 - Efeito da concentração da molécula 11 na inibição da formação de

biofilme de P. aeruginosa. ......................................................................................... 53

Tabela 5 - Efeito da concentração da molécula 10 na remoção de biofilme de P.

aeruginosa................................................................................................................. 55

Tabela 6 - Efeito da concentração da molécula 15 na formação de biofilme de S.

mutans. ..................................................................................................................... 58

Tabela 7 - Efeito da concentração das moléculas 12 e 21 na remoção de biofilme de

S. mutans. ................................................................................................................. 62

Tabela 8 - Ângulo de contato das diversas superfícies tratadas com as moléculas.. 66

Tabela 9 - Teste de adesão microbiana à solventes. ................................................ 68

Tabela 10 - Espessura dos biofilmes de P. aeruginosa. ........................................... 78

Tabela 11 - Espessura dos biofilmes de S. mutans. ................................................. 79

Lista de Figuras

Figura 1 - Representação das etapas de formação de biofilme em uma superfície.

Bactéria na forma planctônica (livre) em contato inicial (1), adesão inicial (2),

crescimento e divisão das microcolônias (3), biofilme maduro (4), desprendimento de

célula. ........................................................................................................................ 20

Figura 2 - Estrutura básica de uma chalcona ............................................................ 22

Figura 3 - Micrografia eletrônica de Streptococcus mutans ...................................... 28

Figura 4 - Micrografia eletrônica de Pseudomonas aeruginosa ................................ 29

Figura 5 - Quantificação da massa total dos biofilmes formados por P. aeruginosa

em superfícies de poliestireno na presença das chalconas. As barras de erro

representam o desvio padrão. * redução estatisticamente significativa (p<0,05) em

relação ao controle (sem chalcona). ......................................................................... 42

Figura 6 - Viabilidade celular nos biofilmes formados por P. aeruginosa em

superfícies de poliestireno na presença das chalconas. As barras de erro



Figura 7 - Quantificação da massa de biofilme de P. aeruginosa pré-estabelecido em

superfície de poliestireno, após tratamento com chalconas. As barras de erro



Figura 8 - Viabilidade celular de biofilme de P. aeruginosa pré-estabelecido em

superfície de poliestireno após tratamento com chalconas. As barras de erro



Figura 9 - Quantificação da massa total dos biofilmes formados por S. mutans em

superfícies de poliestireno na presença das chalconas. As barras de erro



Figura 10 - Viabilidade celular nos biofilmes formados por S. mutans em superfícies

de poliestireno na presença das chalconas. As barras de erro representam o desvio

padrão. * redução estatisticamente significativa (p<0,05) em relação ao controle

(sem chalcona). ......................................................................................................... 48

Figura 11 - Quantificação da massa de biofilme de S. mutans pré-estabelecido em




Figura 12 - Viabilidade celular de biofilme de S. mutans pré-estabelecido em




Figura 13 - Percentual de redução da formação do biofilme de P. aeruginosa na

presença de diferentes concentrações da molécula 11. ........................................... 52

Figura 14 - Cinética de crescimento celular de P. aeruginosa na presença da

molécula 11. .............................................................................................................. 53

Figura 15 - Percentual de remoção do biofilme de P. aeruginosa na presença de

diferentes concentrações da molécula 10. ................................................................ 54

Figura 16 - Cinética de crescimento celular de P. aeruginosa na presença da

molécula 10. .............................................................................................................. 55

Figura 17 - Percentual de redução da formação do biofilme de S. mutans na

presença de diferentes concentrações da molécula 15. ........................................... 57

Figura 18 - Cinética de crescimento celular de S. mutans na presença da molécula

15. ............................................................................................................................. 58

Figura 19 - Efeito da concentração da molécula 12 na remoção de biofilme de S.

mutans. ..................................................................................................................... 59


12. ............................................................................................................................. 59

Figura 21 - Efeito da concentração da molécula 21 na remoção de biofilme de S.

mutans. ..................................................................................................................... 60


21. ............................................................................................................................. 61

Figura 23 - Cinética de adesão para P. aeruginosa e S. mutans em poliestireno . ... 64

Figura 24 - Placa de poliestireno utilizada nos ensaios do ângulo de contato. ......... 65

Figura 25 - Placa de poliestireno utilizada na MEV. .................................................. 70

Figura 26 - MEV do biofilme de P. aeruginosa formado na ausência (a) e na

presença da molécula 11 na concentração de 500 µM (b). ....................................... 70

Figura 27 - MEV do biofilme pré-formado de P. aeruginosa sem tratamento (a) e

após tratamento com a molécula 10 na concentração de 500 µM (b). ...................... 71

Figura 28 - MEV do biofilme de S. mutans formado na ausência (a) e na presença da

molécula 15 na concentração de 500 µM (b). ........................................................... 72

Figura 29 - MEV do biofilme pré-formado de S. mutans sem tratamento (a) e após

tratamento com a molécula 12 na concentração de 500 µM (b). Aumento de

2000X(acima) e aumento de 10000X(abaixo). .......................................................... 73

Figura 30 - Imagens de MEV de células do biofilme de S. mutans estabelecido em

superfície de poliestireno. a) Controle e b) biofilme após tratamento com molécula

21 na concentração de 500 µM (aumento 40.000X) c) células de S. mutans

apresentando alterações morfológicas indicadas pelas setas em vermelho (aumento

80.000X). ................................................................................................................... 74

Figura 31 - Molécula utilizada por WALLOCK-RICHARDS et al. (2015) para inibição

da formação de biofilme de S. mutans. ..................................................................... 75

Figura 32 - Estrutura da molécula 21. ....................................................................... 76

Figura 33 - Microscopia confocal do biofilme de P. aeruginosa formado na ausência

(a) e na presença da molécula 11 na concentração de 500 µM (b). ......................... 77

Figura 34 - Microscopia confocal do biofilme de S. mutans estabelecido em


12 na concentração de 500 µM. ................................................................................ 77

Figura 35 - Microscopia confocal do biofilme de S. mutans formado na ausência (a) e

na presença da molécula 15 na concentração de 500 µM (b). .................................. 78

Figura 36 - Microscopia confocal do biofilme de S. mutans estabelecido em


12 na concentração de 500 µM e c) biofilme após tratamento com a molécula 21 na

concentração de 500 µM ........................................................................................... 79

15

1 INTRODUÇÃO

Sabe-se hoje que a maioria dos microrganismos, em especial as bactérias,

são encontrados fixados à superfícies, em comunidades complexas denominadas

biofilmes. Quando associados à biofilmes, os microrganismos apresentam maior

resistência à agentes antimicrobianos, desinfetantes e sistemas de defesa do

hospedeiro se comparados à células livres (planctônicas), devido principalmente à

presença da matriz polimérica que confere maior proteção as células microbianas

(BRIDIER et al., 2011).

Na medicina, estima-se que os biofilmes estejam envolvidos em 65% dos

casos de infecções humanas de origem bacteriana. Além disso, doenças como a

fibrose cística (Pseudomonas aeruginosa) e a cárie dentária (Streptococcus mutans)

estão diretamente relacionadas à formação de biofilmes (HALL-STOODLEY et al.,

2004).

Desta forma, é fácil imaginar que muitos dos problemas de contaminação na

indústria; bem como dos problemas de infecções bacterianas, são causadas por

biofilmes que podem estar aderidos à superfícies bióticas e abióticas (VAN HOUDT;

MICHIELS, 2010).

Sendo assim, fazem-se necessários métodos de controle de infecções que

levem em consideração o fato de que as bactérias vivem nessas comunidades.

Esses métodos podem incluir tratamento de superfícies para dificultar o contato

inicial das bactérias, assim como também o tratamento de biofilmes já instalados;

suprimindo ou mitigando o poder de infecção das espécies em questão.

Apesar da diversidade de agentes antimicrobianos disponíveis no mercado,

há uma grande escassez de agentes considerados efetivos na erradicação de

biofilmes. Além disso, a maioria dos antibióticos interfere no crescimento microbiano,

o que leva ao surgimento de linhagens multirresistentes e de difícil tratamento.

Neste contexto, as chalconas naturais e seus derivados sintéticos se

mostraram promissores como compostos protótipos visando o controle de biofilmes.

Em estudo recente, chalconas e flavonas foram apontadas como moléculas com

16

potencial atividade anti-biofilme, através de estudos de modelagem in silico

(MANNER et al., 2013). À partir destas considerações este projeto propõe avaliar o

potencial de chalconas sintéticas e derivados no controle de biofilmes das bactérias

Streptococcus mutans e Pseudomonas aeruginosa.

17

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Características dos Biofilmes

Há muito tempo sabe-se que microrganismos como as bactérias podem aderir

à superfícies sólidas formando complexo sistema microbiológico. Os biofilmes

bacterianos são predominantes na maioria das superfícies úmidas na natureza. Em

1674, Anton van Leeuwenhoek observou sua própria placa dentária e descreveu

uma comunidade de “animáculos” (COSTERTON et al., 1999). Entretanto, mais de

60 anos após o primeiro artigo descrevendo um biofilme propriamente dito; estes

representam uma preocupação constante, mais especificamente nas áreas de

alimentos, ambiental e médica (MAUKONEN et al., 2003).

A maior parte do conhecimento sobre biofilmes foi obtida somente nos últimos

30 anos. O desenvolvimento de técnicas espectroscópicas mais modernas e com

maior poder de resolução, custos mais baixos dessas técnicas e a enorme

capacidade de geração e tratamento de dados por computadores mais eficientes,

revolucionaram o estudo da microbiologia (MEDINI et al., 2008).

As bactérias possuem praticamente dois modos de vida: a forma planctônica

ou livre e a forma séssil, na qual estão aderidas umas às outras e também à uma

superfície sólida (MEHOTRA, 2007). Biofilme é um termo utilizado para descrever a

forma séssil dos microrganismos, ou seja; quando estes estão fixos a uma superfície

na forma de agregados multicelulares e envoltos por uma matriz polimérica

(DONLAN, 2002).

Essa vida em comunidade é muito vantajosa, já que os microrganismos estão

menos suscetíveis a fatores externos como desidratação, radiação UV, variação de

temperatura, variação de pH, variação osmótica, fagocitose, antibióticos e agentes

antimicrobianos (HALL-STOODLEY et al., 2004).

A matriz do biofilme é composta de aproximadamente 97% de água

(SUTHERLAND, 2001). Essa característica permite a difusão de diversos outros

componentes do biofilme como polissacarídeos, nutrientes, células, metabólitos,

produtos de lise celular e detritos circundantes do ambiente. Assim, podem ser

observadas dentro de um biofilme todas as classes de macromoléculas:

18

carboidratos, proteínas, ácidos nucléicos e lipídeos (FLEMMING; WINGENDER,

2010).

Os biofilmes são estruturas de características espaciais e metabólicas

peculiares. Dentre os principais fatores envolvidos na formação de um biofilme

podem-se considerar: as características físico-químicas da superfície e do

microrganismo, a expressão de certas proteínas (adesinas), a sinalização celular,

fatores de virulência como produção de cápsulas e fímbrias e a produção de

polissacarídeos pelos microrganismos (SIMÕES et al., 2010).

Essas comunidades microbianas podem ser constituídas por múltiplas

espécies ou por apenas uma espécie de microrganismo. Nos casos de infecções

patológicas ao homem, por vezes um biofilme multi-espécie apresenta um

sinergismo que reflete tanto na distribuição bacteriana aderida no biofilme quanto na

quantidade de biomassa produzida. Essas interações entre diferentes bactérias na

comunidade podem afetar tanto a fisiologia como o próprio ambiente físico da

bactéria, levando a um aumento da resistência e virulência bacteriana e mudança na

degradação e geração de substratos. Assim, não são quaisquer espécies

bacterianas que podem conviver num mesmo biofilme, ou seja; tanto a competição

por nutrientes quanto o acúmulo de produtos tóxicos excretados por uma

determinada espécie podem limitar a diversidade de microrganismos em um biofilme

(RENDUELES; GHIGO, 2012). É muito comum ainda que nos biofilmes sejam

encontrados também outros tipos de microrganismos, como fungos e algas;

principalmente em ambientes mais úmidos (PALMER, 1997).

De fato, a grande capacidade de adaptação, a alta taxa de reprodução e a

capacidade de produção de substâncias extracelulares fazem das bactérias os

organismos com grande capacidade de produção de biofilmes (SUTHERLAND,

2001).

O principal componente dos biofilmes são exopolissacarídeos (EPS)

produzidos pelas bactérias. Essas substâncias variam muito na sua composição e,

portanto; nas suas características físico-químicas. Algumas dessas macromoléculas

são neutras, mas a maioria são polianiônicas devido à presença de ácidos urônicos,

sendo o ácido D-glucourônico o mais comum; embora também sejam encontrados

os ácidos D-galactourônico e D-manourônico. Resíduos inorgânicos como fosfato ou

19

raramente sulfato, podem também conferir ao EPS caráter aniônico (SUTHERLAND,

1990). Ainda, de acordo com (DONLAN, 2008), bactérias Gram-negativas

apresentam exopolissacarídeos neutros ou aniônicos. Essa característica permite

que se associem cátions divalentes de cálcio e magnésio, permitindo a formação de

ligações cruzadas com o polímero e consequente aumento da força de ligação;

conferindo ao biofilme maior rigidez. Já no caso de bactérias Gram-positivas, esses

exopolissacarídeos podem ter caráter catiônico.

2.2 Biofilmes – Formação

Os biofilmes são sistemas heterogêneos, tanto química como

fisiologicamente, pois o modo de difusão do oxigênio, água e nutrientes gera um

gradiente de concentração desses componentes. Assim, as bactérias se adaptam às

condições físico-químicas e nutricionais impostas pelo biofilme (STEWART, 2008).

Bactérias se comunicam através de um mecanismo chamado quorum

sensing. Esta habilidade se dá através da produção, secreção e detecção de

moléculas sinalizadoras chamadas de autoindutores. A concentração dessas

moléculas torna-se então dependente da quantidade de células e, quando atingem

uma concentração limite; a população como um todo responde coordenadamente,

podendo modular uma série de comportamentos fenotípicos que dependem da

população como um todo. Isso pode significar a produção de exopolissacarídeos, a

produção de biossurfatantes, esporulação, produção de antibióticos, expressão de

genes de virulência entre outros. Assim, o quorum sensing é um mecanismo

fortemente ligado à colonização bacteriana e consequente formação de biofilme

(NADELL, 2008).

Outra característica importante quando se trata de biofilmes, é que eles

podem ser considerados sistemas auto-regulatórios. Á medida em que vão

crescendo, partes vão se desprendendo para colonizar novas superfícies e novas

células podem se fixar ao biofilme original (HOOD, 1995).

Muitas teorias têm sido propostas com relação à dinâmica de formação de um

biofilme, porém algumas etapas fundamentais são concordantes em todas elas

(Figura1): contato, adesão, formação de micro-colônias, maturação e

desprendimento; sendo que estas etapas são dependentes da influência do meio

20

ambiente e das características genéticas das bactérias envolvidas (STOODLEY et

al,. 2002).

A primeira etapa é chamada fase de contato ou adesão reversível. Nesta

etapa, os microrganismos denominados colonizadores primários utilizam uma

variedade de organelas extracelulares e proteínas para detecção e fixação de

superfícies; incluindo pili, flagelos, fímbrias e proteínas de membrana chamadas

adesinas. Na segunda etapa, também chamada de adesão irreversível; essas

bactérias iniciam a adesão entre si e à superfície, que geralmente está imersa ou em

contato com fluidos contendo eletrólitos e macromoléculas (ácidos nucléicos,

proteínas, carboidratos, ácidos húmicos, entre outros). Na terceira etapa, as células

passam a se desenvolver e originar microcolônias, as quais sintetizam os

exopolissacarídeos que formam a matriz polimérica extracelular (MPE); que passa a

atuar como substrato para a adesão de microrganismos secundários (RENNER,

2011). Os colonizadores secundários podem aderir diretamente aos primários ou

promover a formação de co-agregados com outros microrganismos (SUTHERLAND,

2001). Na quarta etapa o biofilme cresce tridimensionalmente, replicando as células

e produzindo mais EPS; o que confere maior resistência física ao biofilme. É

chamado de biofilme “maduro”. Na quinta etapa, o biofilme pode desprender e

algumas células planctônicas colonizam outras superfícies (STOODLEY, 2004).

Assim, os biofilmes compreendem um processo de transição de uma forma livre

planctônica, onde os microrganismos comportam-se de forma independente; para

uma forma de vida séssil, onde vivem em uma comunidade multicelular

(MOLOBELA; LLUNGA, 2011).

Em relação à topografia, as bactérias formam microcolônias dispostas em

pilares, compostas por uma camada com cerca de 10 µm de espessura, podendo se

estender em até 200 µm acima da superfície. A forma de crescimento em pilares

favorece a fisiologia do biofilme como um todo, pois os pilares de biofilmes

apresentam canais por onde a água transporta os nutrientes para as células e

também os resíduos que delas saem, constituindo um tipo de sistema circulatório

simples (FLEMMING; WINGENDER, 2010).

Figura 1 - Representação das etapas de formação de biofilme em uma superfície. Bactéria na forma planctônica (livre) em contato inicial (1), adesão inicial (2),

21

crescimento e divisão das microcolônias (3), biofilme maduro (4), desprendimento de célula.

Fonte – Hall-Stoodley L, Costerton JW, Stoodley P. Nat Rev Microbiol. 2004; 2(2):95. [PubMed:15040259]

2.3 Mecanismos de resistência em biofilmes

Bactérias são seres hábeis em se adaptar às condições ambientais. Esse fato

tornou possível a elas se estabelecerem em quase todos os habitats na biosfera,

incluindo os seres humanos. Para sobreviver às condições diversas e variações do

ambiente externo, as células desenvolveram mecanismos de fixação às superfícies

e a convivência em comunidade; incluindo os biofilmes (RENNER, 2011). Desta

forma, as comunidades microbianas ficam protegidas de predadores e do sistema

imunológico, dividem certas funções específicas entre as espécies, possuem uma

barreira estrutural contra estímulos físicos e mecânicos e promovem a conservação

do genótipo. De fato, essas comunidades são persistentes e de difícil remoção uma

vez formados, o que torna o biofilme um mecanismo de resistência que atrai

esforços para sua compreensão nos campos da medicina, odontologia, ecologia,

agricultura e processamento industrial (DUNNE, 2002).

É importante salientar que alguns biofilmes são benéficos para os humanos,

pois têm impacto direto na fisiologia do corpo humano. Entretanto, são conhecidas

hoje muitas patologias às quais o biofilme bacteriano está diretamente ligado. Ainda,

a fixação de bactérias em dispositivos médicos, como por exemplo, implantes

cirúrgicos, cateteres ou lentes de contato; resultam em um foco para infecções

clínicas e o desenvolvimento de diversas enfermidades (BRYERS, 2008).

22

A capacidade de formar biofilmes é considerada um fator de virulência que

está diretamente relacionado à resistência das bactérias; pois se tornam menos

suscetíveis a tratamentos com antibióticos e outros agentes antimicrobianos, em

relação às células planctônicas (NIKOLAEV; PLAKUNOV, 2007). Além disso, as

células aderidas dispõem de um sistema de defesa coletivo (originada da

comunidade microbiana) contra fatores antagônicos.

O mecanismo de resistência aos biofilmes não é ainda totalmente

compreendido, entretanto; estudos mais recentes têm utilizado vários sistemas

modelo para elucidar como e por que os biofilmes são resistentes à agentes

antimicrobianos. Vale enfatizar que existem vários mecanismos, os quais variam

com a espécie de bactéria presente no biofilme e o agente antimicrobiano aplicado.

Estes mecanismos incluem barreiras físicas e químicas de difusão do antimicrobiano

no biofilme, crescimento lento do biofilme devido à limitação de nutrientes e

adaptação genética (O’TOOLE; THIEN-FAH; 2001).

2.4 Chalconas

As chalconas (Figura 2) são um grupo de substâncias naturais chamadas de

cetonas α, β-insaturadas, precursoras da biossíntese dos flavonóides e

isoflavonóides. São largamente encontradas em frutos, folhas, raízes de vegetais e

pétalas de flores. Possuem dois grupamentos aromáticos, um ligado à carbonila

outro ligado à porção olefínica, comumente designados como anel A e anel B,

provenientes da reação de condensação aldólica (NOWAKOWSKA, 2007).

Figura 2 - Estrutura básica de uma chalcona

O

(E)-chalcona

A B

Fonte: NOWAKOWSKA, 2007

23

A existência de um grupo cetona α,β-insaturada é uma característica

estrutural encontrada em um número muito grande de compostos biologicamente

ativos. Assim, derivados de chalconas tanto de origem natural como sintética;

podem exibir diversas propriedades farmacológicas como: antitumoral,

anticancerígena, anti-inflamatória, antifúngica, antibacteriana, antioxidante e inibidor

da topoisomerase (SUWITO et al., 2014). Sendo assim, reações de substituição no

anel A e/ou B podem resultar em compostos com propriedades totalmente distintas.

Portanto, as propriedades e possíveis efeitos desses substituintes têm despertado

grande interesse em estudos de atividade biológica (CHIRADIA et al., 2008).

Existem inúmeros relatos na literatura acerca da atividade antimicrobiana das

chalconas (NOWAKOWSKA, 2007; TRAN et al., 2012; SAHU et al., 2012), muitos

envolvendo microrganismos capazes de formar biofilme (SIVAKUMAR et al., 2010).

Entretanto, poucos trabalhos exploram de fato sua ação anti-biofilme. Como

exemplo, YANTI & HWANG (2010) relataram que a chalcona panduratina A foi

eficaz como agente antibiofilme eliminando a colonização inicial das bactérias

formadoras de placa dentária Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis e

Actinomyces viscosus. A di-hidro chalcona denominada floretina, encontrada em

maçãs e morangos, foi capaz de inibir a formação de biofilmes do patógeno

alimentar Escherichia coli O157:H7 sem entretanto, afetar o crescimento da bactéria

(LEE et al., 2011).

BOŽIĆ et al. (2014) testaram a ação de 3 chalconas sintéticas sobre 19 cepas

isoladas de Staphylococcus aureus resistente à meticilina e uma cepa de controle

ATCC 43300. Foi investigado o sinergismo dessas chalconas com antibióticos β-

lactâmicos: cefotaxima, ceftriaxona; e com os antibióticos não β-lactâmicos:

ciprofloxacino, gentamicina e trimetropina/sulfametoxazol. Como resultado, todas as

chalconas testadas exibiram significante ação antimicrobiana. Além disso, foi

evidenciado sinergismo com todos os antibióticos não β-lactâmicos testados.

Em outro trabalho relacionado à atividade de chalconas no controle do

crescimento microbiano, estudos demonstraram que a inclusão de grupos carboxila

na posição 4 do anel A em lugar da hidroxila aumentou a solubilidade em água

(NIELSEN et al., 2004) e a inclusão do grupamentos mais ácidos como 3,5-dibromo

e 3,5-di (trifluorometil) aumentaram a atividade da chalcona frente a bactéria Gram

24

positiva Staphylococcus aureus ATCC 29213. AVILA et al. (2008) avaliaram a ação

antimicrobiana de 31 chalconas substituídas frente a Bacillus cereus, Escherichia

coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus e concluíram que a

presença de hidroxilação do anel A na posição 2 assim como presença substituinte

oxigenado na posição 4 além de grupo isoprenóide na posição 3 favorecia a ação.

No anel B a presença de hidroxila na posição 4 também promoveu maior atividade.

Vale ressaltar que os autores observaram ação antimicrobiana significativa apenas

frente às bactérias Gram positivas. A ação antibacteriana de flavonoides em geral é

alvo de muitos trabalhos na literatura e os possíveis mecanismos de ação foram

revisados por CUSHNIE; LAMB (2011).

Em relação à ação anti-biofilme das chalconas, MANNER et al. (2013a)

relataram que chalconas que apresentaram hidroxila na posição 2 e 4 do anel A

reduziram a formação de biofilmes de Staphylococcus aureus quando adicionadas

ao meio de cultura; os autores atribuíram estes afeitos à ação antimicrobiana já

previamente relatada. Na posição 4 do anel B a hidroxilação e metoxilação também

parecem estar relacionadas à ação anti-biofilme, mas sempre em conjunto com as

alterações descritas para o anel A. Além de chalconas, outros produtos relacionados

têm sido alvo de estudos visando o controle de biofilmes tais como flavonas e

flavonóis; que demonstraram resultados promissores frente a biofilmes de

Staphylococcus aureus (MANNER et al., 2013 a).

Recentemente 498 plantas asiáticas foram avaliadas quanto à capacidade de

inibir biofilmes de Staphylococcus aureus. O estudo selecionou o extrato de Alnus

japonica como o mais ativo sendo atribuída sua atividade anti-biofilme à presença de

quercetina e ácido tânico (LEE et al., 2013).

2.5 Mecanismos de ação anti-biofilme

Os mecanismos envolvidos na inibição ou erradicação de biofilmes por

moléculas ativas que não atuam sobre o crescimento microbiano propriamente dito,

envolvem em geral um dos seguintes mecanismos (RENDUELES & GHIGO, 2012):

a) degradação de componentes da matriz polimérica: devido à ação de

enzimas como proteases, carbohidrases e nucleases específicas aos componentes

da MPE,

25

b) moléculas anti-adesivas: biossurfatantes, polissacarídeos e outras

moléculas capazes de alterar a interação das células com a superfície,

c) inibição de moléculas regulatórias de quorum sensing envolvidas no

estabelecimento de biofilmes,

d) inibição da síntese de fatores de virulência/adesão como pili, flagelos,

adesinas e componentes do MPE.

A Apigenina (4,5,7-trihidroxiflavona) encontrada em frutas e vegetais e o tt-

farnesol (3,7,11-trimethil-2,6,10-dodecatrien-1-ol), sesquiterpeno encontrado em

óleos essenciais de frutas cítricas; foram capazes de inibir a formação de biofilme de

Streptococcus mutans (KOO & JEON, 2009). O mecanismo de ação antibiofilme da

apigenina envolve a inibição da enzima glicosiltransferase (responsável pela síntese

de glucanas) presentes no EPS da bactéria e diretamente envolvidos na aderência e

colonização da superfície dentária (KOO et al., 2002). A ação do farnesol está

relacionada à alterações na permeabilidade da membrana devido à suas

propriedades lipofílicas e, além disto; pode aumentar a permeabilidade a prótons

gerando maior acidificação do citoplasma (KOO et al., 2005) e reduzindo a secreção

de glucanas (KOO & JEON, 2009).

As catequinas presentes no extrato de Combretum albiflorum inibiram

moléculas de quorum sensing em Pseudomonas aeruginosa PAO1 responsáveis

por fatores de virulência associados à formação de biofilmes, resultando na redução

da adesão bacteriana e formação de biofilmes (VANDEPUTTE et al., 2010). A di-

hidro chalcona floretina reprimiu a expressão de diferentes genes envolvidos na

virulência de E. coli 0157:H7 além de reduzir a produção de fímbrias, resultando na

inibição da formação do biofilme ( LEE et al., 2011).

2.6 Métodos de avaliação da ação anti-biofilme

Existem várias metodologias para análise de ação antimicrobiana de

compostos frente às células planctônicas tais como difusão em ágar, difusão em

disco, micro e macrodiluição. Entretanto, existem poucas tentativas de padronização

de ensaios anti-biofilmes. Muitas metodologias são descritas na literatura e podem

ser divididas em três grandes grupos (PEETERS et al., 2008):

26

1) quantificação da biomassa: quantificação da matriz, células totais ( vivas e

mortas),

2) quantificação da viabilidade: apenas células viáveis presentes,

3) quantificação da matriz: medida específica dos componentes do MPE.

Em relação à medida total de biomassa o ensaio mais utilizado é o cristal

violeta (STEPANOVIC et al., 2000), um corante básico que se liga às moléculas

negativamente carregadas na superfície da célula e nos polissacarídeos da matriz.

Devido à facilidade de execução e custos reduzidos, este é um método muito

utilizado. Porém como não diferencia células viáveis de células mortas, é em geral

associado à outras metodologias.

Para quantificação da viabilidade celular são utilizados métodos como os sais

de tetrazólio, tais como o XTT (2,3-bis(2- methoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolium-

5-carboxanilida) que é reduzido ao composto corado formazan quando na presença

de atividade enzimática no meio reacional (PEETERS et al., 2008). Outro ensaio de

viabilidade envolve o corante redox resazurina (azul), também reduzido através de

enzimas microbianas à sua forma resofurina (rosa) que é fluorescente (O´BRIEN ET

AL., 2000). A transformação de (FDA) fluoresceína diacetato (não fluorescente) até

fluoresceína (fluorescente), por esterases intracelulares; também é utilizado como

método para determinar viabilidade em biofilmes (PRIETO et al., 2004).

Medidas para a quantificação da matriz envolvem o uso do corante DMMB

(1,9 dimetil metilene blue), cujo princípio se baseia na formação de complexos

insolúveis com polissacarídeos sulfatados da matriz polimérica do biofilme. Este

teste foi adaptado para medida de biofilmes de Staphylococcus aureus (TOTÉ et al.,

2007). Outro método utilizado é o WGA (Wheat germ agglutinin – Alexa flúor 488

conjugado), que se baseia na ligação específica da lectina conjugada e marcada

com a N-acetilglicosamina presente nos biofilmes de algumas bactérias. O método

proposto apresentou alta correlação com o método do cristal violeta para biofilmes

de Escherichia coli e Staphylococcus epidermidis (BURTON et al., 2007). Devido à

diversidade de metodologias disponíveis, a busca por moléculas com potencial

atividade anti-biofilme deve envolver o uso combinado destas técnicas de

27

quantificação, permitindo assim maior abrangência na varredura (SKOGMAN et al.,

2012) .

Paralelo aos testes de quantificação, técnicas de microscopia tais como

microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia de força atômica (MFA),

microscopia à laser confocal (MLC), microscopia confocal raman (MCR) e

microscopia de (epi)fluorescência entre outras, são exemplos de técnicas utilizadas

para avaliação dos biofilmes (PANTANELLA et al., 2013).

Visto que a adesão bacteriana é o primeiro estágio da formação de biofilmes,

as moléculas capazes de impedir ou reduzir essa adesão podem,

consequentemente; reduzir a formação de biofilmes e são comumente chamadas de

moléculas anti-adesivas. O tratamento de superfícies com moléculas anti-adesivas

antes da exposição do material aos microrganismos é a principal estratégia utilizada

para avaliar esta atividade. O condicionamento de superfícies sólidas com

moléculas tensoativas (GOMES & NITSCHKE, 2012), polissacarídeos (SAYEN et al.,

2011), a incorporação de moléculas anti-adesivas na formulação de materiais

(NOWATZKI et al., 2012), em tintas (SIVAKUMAR et al., 2010a) e filmes poliméricos

(SIVAKUMAR et al., 2010b) são exemplos citados na literatura. Nestes casos, são

utilizados para análise de superfícies métodos tais como ângulo de contato,

hidrofobicidade celular, microscopia eletrônica de varredura e difração de raios-x;

visando caracterizar a superfície do material antes e após o tratamento com as

moléculas anti-adesivas de modo a elucidar os prováveis mecanismos envolvidos na

redução da adesão.

2.7 Microrganismos

2.7.1 Streptococcus mutans

Streptococcus mutans é uma bactéria Gram-positiva com formato

normalmente esférico ou oval, com diâmetro um pouco menor que 2 μm.

Apresentam arranjo característico em cadeias, não formam endósporos e seu

metabolismo é anaeróbio facultativo, com bom crescimento em ambiente com

presença em torno de 5% de CO2 na atmosfera de crescimento. São

quimiorganotróficas fermentativas, onde carboidratos presentes no meio são

fermentados produzindo principalmente ácido lático. Sua temperatura comum de

28

crescimento é de 37°C e convivem como parasitas em homens e animais, sendo

uma bactéria patogênica formadora de biofilme (RYAN; KLEINBERG, 1995).

A microbiota oral presente nos humanos representa um biofilme muito

diversificado, visto que 25 espécies do gênero Streptococcus habitam esse biofilme.

Nessa perspectiva, a bactéria Streptococcus mutans é a espécie mais fortemente

associada à cárie dentária, e essa patologia está diretamente ligada ao fato de sua

capacidade de adesão e formação de biofilme (NICOLAS; LAVOIE, 2011).

Figura 3 - Micrografia eletrônica de Streptococcus mutans.

FONTE: adptado de KORMENDY; WAYMAN (1971)

2.7.2 Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa com formato de

bacilo reto ou levemente curvado, que se locomove por meio de flagelos. Seu

comprimento varia entre 1,5 e 5 μm e não são formadoras de endósporos . São

comumente encontradas em uma diversidade muito grande de ambientes como

solo, água, plantas e animais. Crescem muito bem nos meios NA (Nutrient Agar)

e TSYEA (Triptic Soy Yeast Extract Agar) e seu metabolismo é estritamente

aeróbio, exceto na presença de nitrato no meio e não são fermentativas. Sua

temperatura ótima de crescimento varia de 30 à 37°C, mas pode crescer em

temperaturas de até 44°C (POLLACK, 1995).

Biofilmes formados por Pseudomonas aeruginosa também têm sido

extensivamente estudados devido à sua importância etiológica e o fato de facilmente

29

aderir às superfícies nas condições mais variadas. É o terceiro patógeno mais

comum associado às infecções hospitalares, principalmente como patógeno

oportunista. A fibrose cística é uma patologia que está intrinsicamente ligada à sua

capacidade de colonizar superfícies e consequentemente se estabelecer formando

biofilmes (KAYSER et al, 2005).

Figura 4 - Micrografia eletrônica de Pseudomonas aeruginosa.

FONTE: adaptado de MU et al, (2016)

30

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Estudar a ação de chalconas e derivados sintéticos no controle de biofilmes

de Streptococcus mutans e Pseudomonas aeruginosa

3.2 Específicos

Avaliar a atividade de chalconas e derivados sobre a formação e

dispersão de biofilmes de S. mutans formados em superfícies de

poliestireno

Avaliar a atividade de chalconas e derivados sobre a formação e

dispersão de biofilmes de P. aeruginosa formados em superfícies de

poliestireno

Determinar o efeito da concentração das moléculas na ação anti-

biofilme

Determinar a ação anti-adesiva e propriedades superficiais do

poliestireno e biofilmes tratados com chalconas e derivados

Relacionar a estrutura das moléculas testadas com a atividade anti-

biofilme

31

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Microrganismos

Como modelo de estudo foram selecionadas duas bactérias envolvidas na

formação de biofilmes cujo controle é de grande importância. A bactéria Gram

positiva Streptococcus mutans ATCC 25175 e a bactéria Gram negativa

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

4.2 Meios de cultivo

Para a bactéria P. aeruginosa, o meio sólido utilizado foi o AN (Ágar

Nutriente) e o meio líquido foi o CN (Caldo Nutriente); ambos da Accumedia

(VICKERY et al., 2009).

Para a bactéria S. mutans, o meio sólido utilizado foi o TSYEA (Triptic Soy

Yeast Extract Agar) e o meio líquido foi o TSYEBS (Triptic Soy Yeast Extract Broth –

0,5% sucrose); ambos da HiMedia (NASSAR; LI; GREGORY, 2012).

4.3 Chalconas e derivados

As chalconas e derivados listadas na Tabela 2 foram fornecidas pelo grupo de

Química Orgânica e Biocatálise – IQSC, dirigido pelo Prof. Dr. André Luiz Meleiro

Porto; que tem como foco a triagem de enzimas de microrganismos marinhos

visando reações de síntese orgânica. As chalconas sintéticas são utilizadas como

ferramenta para identificação de enoato redutases através de reduções

quimiosseletivas da ligação dupla C-C das chalconas. As moléculas foram obtidas

pela reação mais simples e comum: a condensação de Claisen-Schmidt, em que um

derivado escolhido da acetofenona reage com os aldeídos aromáticos apropriados,

usando metanol ou etanol como solvente e hidróxido de sódio ou de potássio como

catalisador (VOGEL, 2004). Essa metodologia é considerada muito simples e

versátil, embora em alguns casos resulte em baixos rendimentos (GO; WU; LIU,

2005). Importante frisar que a massa molar de cada molécula foi corrigida segundo a

pureza determinada através da técnica de cromatografia líquida.

32

Tabela 1 - Moléculas utilizadas no projeto

Código Estrutura/Nome Massa

molar/pureza

1

3-(3-fluorofenil)-1-(2-hidroxifenil)prop-2-en-1-ona

242,07/91%

2

3-(4-fluorofenil)-1-(2-hidroxifenil)prop-2-en-1-ona

242,07/88%

3

3-(3-bromofenil)-1-(2-hidroxifenil)prop-2-en-1-ona

301,99/80%

4

3-(4-bromofenil)-1-(2-hidroxifenil)prop-2-en-1-ona

301,99/91%

5

(E)-3-(4-bromofenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona

286,90/98%

6

1-(2-hidroxifenil)-3-(4-metoxifenil)prop-2-en-1-ona

254,09/96%

7

(E)-3-(4-fluorofenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona

226,09/95%

33

8

(E)-3-(3-nitrofenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona

253,07/99%

9

(E)-3-(4-metoxifenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona

238,10/93%

10

(1E,4E)-1,5-difenilpenta-1,4-dien-3-ona

234,10/91%

11

(E)-1-(3-hidroxinaftalen-2-il)-3-fenilprop-2-em-1-ona

274,10/93%

12

(2E,4E)-1,5-difenilpenta-2,4-dien-1-ona

234,10/99%

13

(2E,4E)-5-fenil-1-(tiofen-2-il)penta-2,4-dien-1-ona

240,06/88%

14

(2E, 4E)-5-fenil-1-(p-toluil)penta-2,4-dien-1-ona

248,12/93%

34

15

(1E, 4E)-1,5-bis(4-bromofenil)penta-1,4-dien-3-ona

389,93/99,5%

16

2-fenilcroman-4-ona

224,25/99%

17

2-(4-metoxifenil)croman-4-ona

254,28/99%

18

(E)-3-fenil-1-(tiofen-3il)prop-2-en-1-ona

214,28/100%

19

2-fenilcroman-4-ona

226,27/98%

20

(E)-3-(2-(trifluor-metilfenil)-1-(2,4,5-trifluor-fenil)prop-2-en-1-ona

330,22/90%

21

(E)-3-(2-hidroxifenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona

224,25/85%

35

4.4 Formação biofilme

4.4.1 Preparo das culturas e condições de cultivo

As culturas de S. mutans e P. aeruginosa foram mantidas em estoques à -

20°C e transferidas para placas contendo o respectivo meio sólido. Em seguida

foram incubadas em estufa a 37°C por 24 h repetindo-se a incubação novamente

por mais 24h. Posteriormente, nas placas foram adicionados 5 mL de solução salina

(NaCl 0,86%) esterilizada e as colônias removidas com auxílio de alça de

inoculação. A suspensão bacteriana obtida foi submetida a diluições sucessivas e o

número de células viáveis foi determinado pelo método da gota. O número de

células viáveis foi relacionado com a medida de densidade óptica (DO) em

espectrofotômetro UV-Vis (modelo Genesys 10UV da Thermo Scientific ) à 610 nm

visando padronizar o inóculo. A concentração celular foi ajustada para 108 UFC/mL

estabelecendo-se a DO correspondente a este valor para proceder os testes de

formação de biofilmes. Este procedimento foi realizado com cada uma das bactérias

a serem testadas. A DO correspondente para P. aeruginosa foi de 0,25 e para S.

mutans foi de 0,85.

Foi realizado um teste prévio com os microrganismos para saber qual seria

concentração de DMSO utilizada para solubiulizar as moléculas, visando usar uma

concentração segura a ponto de não afetar o crescimento bacteriano. Assim, depois

de padronizado os inóculos; estes foram crescidos em meio de cultura líquido com

várias concentrações de DMSO e posteriormente realizada contagem para

comparação com crescimento sem DMSO. Assim, a concentração que não afetou o

crescimento das duas bactérias foi a de 1%. Portanto essa foi a concentração de

DMSO final utilizada nos testes, sendo esse o controle de crescimento para

comparação com o teste utilizando as moléculas.

A estratégia do estudo avaliou as moléculas em duas situações distintas:

1) efeito das moléculas na formação de biofilmes;

2) efeito das moléculas na destruição de biofilmes pré-formados.

36

As metodologias para formação de biofilme foram adaptadas segundo

GOMES; NITSCHKE (2012).

4.4.2 Ação sobre a formação de biofilmes

As moléculas obtidas foram dissolvidas em DMSO (1%) e posteriormente no

meio de cultura correspondente à cada bactéria, na concentração inicial de 500 μM.

Preencheu-se então os orifícios da microplaca com 180 μL do respectivo caldo de

cultivo contendo chalcona e 20 μL de inóculo bacteriano, procedendo-se então a

formação do biofilme em presença das moléculas no meio de cultura. Assim, após

as 24h de incubação o meio foi removido e o biofilme lavado duas vezes com

solução salina para posteriormente ser quantificado.

4.4.3 Ação sobre biofilmes pré-formados

O biofilme foi formado conforme descrito no item 4.4.2. Após as 24 horas de

crescimento o meio de cultura foi removido e o biofilme lavado duas vezes com

solução salina para remover as células não aderidas. Posteriormente, foi adicionado

à microplaca 200μL de caldo de cultivo contendo 500μM de cada molécula a ser

testada e a placa foi incubada novamente por 24h à 37°C. Após o período de

incubação o meio foi removido e lavado duas vezes com solução salina para

posterior quantificação.

4.5 Quantificação dos biofilmes

4.5.1 Biomassa celular

Foi avaliada segundo metodologia descrita por MIRELES et al. (2001). O

biofilme aderido foi fixado com 200 μL de metanol por 15 minutos. Após esse tempo,

o metanol foi retirado e os poços da microplaca preenchidos com 200 μL de solução

aquosa de cristal violeta 0,5%. Após duas lavagens com água destilada para

remover o excesso de cristal violeta, o corante foi extraído com 200 μL com ácido

acético glacial (33%). Procedeu-se então a leitura da densidade ótica da solução a

630nm em leitora automática de microplacas (Enspire 2300 – Perkin Elmer). A

quantidade de biofilme foi comparada com ensaio controle sem adição das

moléculas, controle contendo DMSO 1% além de controle positivo com antibiótico:

Polimixina B (INLAB) para P. aeruginosa e Ampicilina (Sigma-Aldrich) para S.

mutans. A concentração de cada antibiótico utilizada também foi de 500 μM. Foram

então obtidos gráficos de barras expressos em DO (Densidade Óptica).

37

4.5.2 Viabilidade das células

Para a quantificação das células viáveis no biofilme foi utilizado o ensaio do

corante redox resazurina (Sigma-Aldrich) como indicador da atividade metabólica

segundo metodologia descrita por SANDBERG et al. (2009). Após crescimento do

biofilme (ou tratamento para remoção) os orifícios da microplaca foram lavados com

água destilada para remoção de células não aderentes e adicionados de 190 μL de

água destilada e 10 μL de solução de resazurina (0,1 g.L-1). A placa foi incubada no

escuro por 30 minutos à 37°C. A leitura da fluorescência (λexcitação: 570 nm e λemissão:

590 nm) foi realizada em leitora automática de microplacas comparando-se com

controle sem adição de moléculas, controle contendo DMSO 1% e controle positivo

(antibiótico). Assim, pode-se obter gráficos de barras expressos em RFU (Reference

Fluorescence Unit).

4.6 Efeito da concentração das moléculas na atividade anti-biofilme

O ensaio do efeito da concentração foi realizado apenas para as chalconas e

derivados que apresentaram redução de biomassa e/ou viabilidade celular nos

ensaios de formação e/ou remoção de biofilmes (adaptado de BALOUIRI; SADIKI;

IBNSOUDA, 2012). A partir do ensaio inicial de triagem, as moléculas que

apresentaram maior atividade foram avaliadas em diferentes concentrações. A

solução inicial de 2000 μM foi diluída sucessivamente em microplaca de poliestireno

variando-se a concentração de 2000 μM até 15,6 μM. Após 24h de incubação à

37°C foi realizada a leitura e determinada a concentração mínima necessária para

inibir/remover os biofilmes através da técnica do cristal violeta. Este dado foi também

comparado com a CIM necessária para inibir as células planctônicas.

A CIM de células planctônicas foi realizada do mesmo modo, ou seja;

variando-se a concentração de cada chalcona de 2000 μM até 15,6 μM. Porém,

após as 24h de incubação a 37°C, foi feita leitura visual para determinar se houve

crescimento celular. O controle positivo dos ensaios foi realizado com cada

respectivo antibiótico à partir da concentração de 500 μM.

Os ensaios para determinação da concentração inibitória mínima (CIM) das

chalconas e derivados foram adaptados segundo metodologia estabelecida pelo

Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI M7-A6 2005.

38

4.6.1 Curvas de crescimento

Para avaliar o efeito da concentração das chalconas no crescimento celular,

foi realizada cinética de viabilidade variando-se a concentração de cada molécula

que, na triagem inicial; apresentou redução da viabilidade. Assim, em uma

microplaca diluiu-se a chalcona variando sua concentração de 2000 μM até 15,6 μM.

Após inoculação da microplaca, essa foi coberta com um filme de poliéster

esterilizado (Platemax), o qual permitiu incubar a microplaca na própria leitora e

fazer leituras sucessivas variando-se o tempo de 0 à 24h, com intervalo de 1 hora

entre cada leitura. Assim, pôde-se construir um gráfico de crescimento x tempo; o

qual permitiu avaliar mais profundamente a influência das chalconas na morte

celular observada nos ensaios com resazurina. (Adaptado de VERMA, 2007)

4.7 Atividade anti-adesiva

A presença de atividade anti-adesiva foi avaliada a partir do tratamento

(condicionamento) prévio da superfície de poliestireno com as moléculas e posterior

contato com suspensão das bactérias seguindo-se a metodologia descrita por

SAITO et al. (2012). As moléculas selecionadas após a triagem inicial foram diluídas

em etanol na concentração de 500 μL. Foram então adicionados 200 μL à

microplaca e mantidas por aproximadamente 4h em câmara de fluxo laminar para

evaporação do solvente. Suspensões de P. aeruginosa e S. mutans foram

preparadas conforme padronização já descrita e adicionadas (200 μL) nos orifícios

da microplaca previamente tratados com as chalconas, deixando-se em contato por

2 horas à 37 °C para ocorrer a adesão celular. O material foi então removido dos

orifícios e estes lavados duas vezes com solução salina. As células aderidas foram

quantificadas pela metodologia do cristal violeta. Como controle foram utilizados

orifícios tratados previamente apenas com etanol puro (efeito residual do solvente) e

também orifícios sem tratamento.

4.8 Determinação da hidrofobicidade do biofilme e do poliestireno tratado

Para evidenciar se as moléculas modificaram a hidrofobicidade do material

(ensaio anti-adesivo) e dos biofilmes (ensaio de formação e remoção) foram

realizadas medidas de ângulo de contato da água, no poliestireno condicionado com

chalconas e nos biofilmes pré-estabelecidos (antes e após o tratamento).

(Adaptação da técnica descrita por RODRIGUES et al. 2006). Neste caso, tanto o

tratamento prévio do poliestireno com as moléculas quanto os ensaios com biofilmes

39

foram realizados em placas retangulares (40 mm X 20 mm) de poliestireno. O

tratamento das placas de poliestireno com as chalconas foi realizado da mesma

maneira como descrito no item 4.6, ou seja; utilizando-se as chalconas em solução

de etanol na concentração de 500 μM. Já os ensaios de formação e remoção de

biofilmes, foram realizados como descrito nos itens 4.3.3 e 4.3.4; porém nas placas

de poliestireno retangulares. Após remoção do meio de cultura as placas foram

lavadas duas vezes com solução salina (0,86%) para remover as células não

aderidas e então foram levadas à estufa para secagem por 40 minutos (40ºC).

Assim, tanto para os biofilmes quanto para as placas tratadas com as chalconas,

foram realizadas medidas do ângulo de contato da água em goniômetro (modelo

CAM 200 - KSV- Finlândia) pela técnica da gota séssil utilizando gotas de 4,0 μL a

25°C. Os resultados foram expressos como a média de pelo menos nove gotas em

três amostras de poliestireno.

4.9 Determinação da hidrofobicidade celular (células planctônicas)

Com o objetivo de caracterizar a natureza hidrofílica/ hidrofóbica da superfície

celular das bactérias foi realizado teste de adesão a solventes (MATS), que consiste

na avaliação da afinidade das células bacterianas a solventes polares e apolares

(MEYLHEUC et al., 2001). Foram utilizados quatro solventes: clorofórmio (polar e

aceptor de elétrons), hexadecano (apolar), acetato de etila (polar e doador de

elétrons) e decano (apolar). Alíquotas de 2,4 mL de suspensão bacteriana (109

UFC/mL em NaCl 0,86%) foram adicionadas de 0,4 mL de cada solvente. A mistura

então foi submetida a agitador tipo vortex (modelo Vortex 1 – IKA) por 2 minutos e

deixada em repouso por 15 minutos para separação de fases. A leitura de

absorbância da fase aquosa foi realizada a 400 nm e a percentagem de células

aderidas, calculada conforme a equação abaixo: % Adh = 1- (A/A0) x 100 , onde

A0 = absorbância da suspensão bacteriana antes da mistura e A= absorbância da

fase aquosa depois da mistura.

4.10 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Para avaliar qualitativamente a arquitetura e a presença de MPE (SIMÕES et

al., 2006) antes e após o tratamento com as chalconas, os biofilmes foram

observados em microscópio eletrônico de varredura. Placas retangulares (5 mm X 5

mm) de poliestireno foram utilizadas para a formação e tratamento dos biofilmes pré-

formados conforme metodologia descrita anteriormente no item 4.3.3 e 4.3.4. As

40

placas contendo os biofilmes foram removidas do meio de cultivo, lavadas duas

vezes com solução salina para remoção de células não aderidas e submetidas à

desidratação com concentrações crescentes de etanol, 10%, 25%, 40%, 50%, 70%,

80%, 90% e 95%; deixando os biofilmes por 15 minutos em cada solução. Em

seguida as amostras foram mantidas em dessecador. As amostras foram então

visualizadas após metalização com ouro em microscópio eletrônico modelo 440 LEO

(Zeiss).

4.11 Microscopia confocal

Com o intuito de observar a arquitetura dos biofilmes e verificar possíveis

diferenças entre os controles e os biofilmes tratados com chalconas, foi realizada

análise por CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy). Os controles e

tratamentos de biofilmes, tanto na formação quanto remoção; foram feitos em placas

retangulares de poliestireno do mesmo modo descrito no item 4.7. As medidas foram

realizadas em duplicata.

Após as 24h horas de incubação, o biofilme foi retirado do meio de cultivo em

câmara de fluxo laminar e lavado com 200 μM de solução salina para remover as

células não aderidas. Em seguida, em cada placa com biofilme foi adicionada 200

μM de solução do corante preparado através do kit LIVE/DEAD Biofilm Viability

(Thermofisher) . Nessa solução preparada através do kit há uma mistura com dois

marcadores: o marcador verde fluorescente SYTO 9 (λexcitação480 nm e λemissão: 500

nm) e o marcador vermelho fluorescente iodeto de propídeo (λexcitação: 490 nm e

λemissão: 635 nm). O corante SYTO 9 marca todas as células bacterianas presentes

no biofilme, tanto as viáveis como as não viáveis. Já o corante iodeto de propídeo,

penetra apenas as bactérias cuja membrana celular está danificada (inviáveis),

causando a redução do corante SYTO 9 quando ambos os corantes estão

presentes. Assim, quando há uma mistura adequada dos dois marcadores, as

bactérias que apresentam membrana celular intacta (viáveis) são marcadas em

verde fluorescente, enquanto que as células que apresentam danos na membrana

celular (não viáveis) são marcadas em vermelho fluorescente.

Após a adição do corante, o biofilme foi colocado em repouso na estufa à

37°C por 30 minutos no escuro. Em seguida, foram obtidas as imagens das

amostras em microscópio invertido modelo LSM 780 (Zeiss), do Instituto de Física de

41

São Carlos da Universidade de São Paulo; microscópio obtido através do projeto

FAPESP 2009/54035-4. A região espectral utilizada para o canal 1 (verde) foi de

499 nm à 602 nm e para o canal 2 (vermelho) foi de 605nm à 735 nm (metodologia

adaptada de DRAGO et al. 2016).

4.12 Análise estatística

Os ensaios de formação e remoção de biofilmes em microplaca foram

realizados em quintuplicata e expressos como a média de no mínimo três repetições

independentes. Os dados obtidos foram comparados através de análise de variância

(ANOVA) com nível de confiança de 95% utilizando o software Origin 9.0 (Origin Lab

Corporation).

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Efeito das moléculas na formação de biofilmes e em biofilmes pré-

formados

A triagem inicial foi realizada com 21 moléculas de chalconas e seus

derivados, as quais estão listadas na Tabela 2. A partir desta triagem preliminar,

pretendeu-se escolher somente as moléculas que mostraram melhores resultados

frente aos ensaios de formação e/ou remoção de biofilme, exibindo atividade na

redução de biomassa e/ou na viabilidade celular; tornando possível que outros

testes posteriores permitissem investigar mais com maior profundidade a ação das

moléculas frente às bactérias selecionadas. Cada molécula recebeu um número

para sua identificação, objetivando maior facilidade na sua identificação.

A seguir, são mostrados os resultados da triagem inicial com as 21 moléculas

na concentração de 500 μM, onde C representa o controle de crescimento na

presença de DMSO, P representa o crescimento na presença do antibiótico

polimixina B e A o crescimento na presença do antibiótico ampicilina. Os dados

marcados com * foram os que mostraram diferença significativa em relação ao

controle (ANOVA confiabilidade de 95%). Seja na formação ou remoção de biofilmes

pré-formados, é importante lembrar que nesta fase inicial de triagem foram

42

consideradas aptas para a próxima fase somente moléculas que apresentaram

resultado significativo em relação ao controle.

5.1.1 Triagem inicial na formação e remoção de biofilme de Pseudomonas

aeruginosa

Como se pode observar na Figura 5, para a formação de biofilme de P.

aeruginosa na presença das moléculas, os ensaios de quantificação da biomassa

através da coloração do cristal violeta indicaram que os melhores resultados foram

obtidos com as moléculas 10 e 11 e 12, onde a redução da biomassa total em

relação ao controle foi de 54,4%, 48% e 71,1% respectivamente.

Figura 5 - Quantificação da massa total dos biofilmes formados por P. aeruginosa em superfícies de poliestireno na presença das moléculas. As barras de erro representam o desvio padrão. * redução estatisticamente significativa (p<0,05) em relação ao controle (sem chalcona).

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 P

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

DO

(63

9n

m)

Chalconas

*

*

*

*

*

* *

* *

* * * * *

* *

*

43

Figura 6 - Viabilidade celular nos biofilmes formados por P. aeruginosa em superfícies de poliestireno na presença das moléculas. As barras de erro representam o desvio padrão. * redução estatisticamente significativa (p<0,05) em relação ao controle (sem chalcona).

Na Figura 6, o ensaio de formação de biofilmes para quantificação de células

viáveis com a resazurina mostrou que o melhor resultado foi obtido com a molécula

11, indicando uma redução de células viáveis em relação ao controle de 60,2%.

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 P

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

RF

U

Chalconas

*

* * *

*

44

Figura 7 - Quantificação da massa de biofilme de P. aeruginosa pré-estabelecido em superfície de poliestireno, após tratamento com as moléculas. As barras de erro representam o desvio padrão. * redução estatisticamente significativa (p<0,05) em relação ao controle (sem chalcona).

Para os ensaios de remoção de biofilmes pré-formados de P. aeruginosa,

observa-se na Figura 7 que os melhores resultados obtidos foram com as moléculas

2, 10 e 21, sendo que a redução de biomassa em relação ao controle foi de 34,4%,

53,5% e 35% respectivamente.

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 P

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

DO

(63

0n

m)

Chalconas

*

*

*

* *

* * * *

*

* * *

*

45

Figura 8 - Viabilidade celular de biofilme de P. aeruginosa pré-estabelecido em superfície de poliestireno após tratamento com as moléculas. As barras de erro representam o desvio padrão. * redução estatisticamente significativa (p<0,05) em relação ao controle (sem chalcona).

Para os ensaios de remoção onde se avaliou a redução do número de células

viáveis após tratamento do biofilme pré-formado com as moléculas; observou-se que

o melhor resultado obtido foi com a molécula 4, indicando uma redução em relação

ao controle de 39,3% (Figura 8).

Para melhor visualização dos resultados obtidos nos ensaios de triagem para

P. aeruginosa, os dados obtidos foram expressos em termos de porcentagem e são

mostrados na Tabela 2.

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 P

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

RF

U

Chalconas

*

*

*

* *

* *

* * * *

46

Tabela 2 - Percentual de redução da biomassa total e viabilidade celular de P. aeruginosa.

Formação Remoção

Moléculas Biomassa (%) Viabilidade (%) Biomassa (%) Viabilidade (%) 1 10,6 - 12,8 15,4 2 24,8 - 34.4 0,3 3 4,3 - - 5,9 4 28,5 - 7,1 39,3 5 4,7 - 4,5 12,9 6 9,8 - - 0 7 - - 10,9 5,1 8 34,2 - 11,4 - 9 26,3 - - -

10 54,4 3,1 53,5 9,7 11 48,9 60,2 - 9,7 12 71,1 3,6 12,2 - 13 45,5 3,0 15,5 12,3 14 51,3 1,1 11,8 12,6 15 1,0 5,0 9,0 - 16 - 1,3 27,7 - 17 18,6 7,5 7,1 - 18 26,6 - 13,5 - 19 16,6 5,7 - 12,5 20 17,2 0,2 3,0 14,3 21 16,0 9,6 35,0 4,4

Antibiótico 94,9 97,9 0,0 15,4

Assim, para os próximos ensaios foram selecionadas para o tratamento na

formação de biofilmes as moléculas 11 e 12. A molécula 11 apresentou redução

tanto na biomassa quanto na viabilidade do biofilme de P. aeruginosa. Já a molécula

12 apresentou boa redução somente na biomassa do biofilme.

Já para a remoção de biofilme, a quantificação de biomassa mostrou que a

melhor atividade ocorreu com a molécula 10; e nos ensaios de viabilidade celular a

molécula 4. Assim, estas foram selecionadas para as próximas etapas.

47

5.1.2 Triagem inicial na formação e remoção de biofilme de

Streptococcus mutans

Os ensaios de formação de biofilmes de S. mutans na presença das moléculas

(Figura 9), indicam que os melhores resultados foram obtidos com as moléculas 2 e

15; as quais apresentaram uma redução na biomassa total de 60% e 67,4%

respectivamente.

Figura 9 - Quantificação da massa total dos biofilmes formados por S. mutans em superfícies de poliestireno na presença das moléculas. As barras de erro representam o desvio padrão. * redução estatisticamente significativa (p<0,05) em relação ao controle (sem chalcona).

Para a quantificação de células viáveis no biofilme de S. mutans, o melhor

resultado obtido foi com a molécula 2, como mostra o gráfico da Figura 10. A

redução em relação ao controle foi de 77,2%.

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 A

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

DO

(630nm

)

Chalconas

*

*

*

*

*

* * *

* *

48

Figura 10 - Viabilidade celular nos biofilmes formados por S. mutans em superfícies de poliestireno na presença das moléculas. As barras de erro representam o desvio padrão. * redução estatisticamente significativa (p<0,05) em relação ao controle (sem chalcona).

Figura 11 - Quantificação da massa de biofilme de S. mutans pré-estabelecido em superfície de poliestireno após tratamento com as moléculas. As barras de erro representam o desvio padrão. * redução estatisticamente significativa (p<0,05) em relação ao controle (sem chalcona).

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 A

0

2000

4000

6000

8000

10000

RF

U

Chalconas

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 A

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

DO

(63

0n

m)

Chalconas

*

* *

*

*

*

* * *

* *

* *

*

* *

* *

*

* *

*

*

49

Já para a remoção de biofilme, a Figura 11 mostra que os melhores

resultados obtidos foram com as moléculas 11, 12 e 15; onde a redução da

biomassa total em relação ao controle foi de 47%, 42,5% e 49%, respectivamente.

Figura 12 - Viabilidade celular de biofilme de S. mutans pré-estabelecido em superfície de poliestireno após tratamento com as moléculas. As barras de erro representam o desvio padrão. * redução estatisticamente significativa (p<0,05) em relação ao controle (sem chalcona).

Para os ensaios de viabilidade celular dos biofilmes após tratamento com as

moléculas (Figura 12) observa-se que os melhores resultados foram obtidos com as

moléculas 11, 12 e 21. A redução em relação ao controle foi de 66,8%, 58,4 e 91,6%

respectivamente.

Para melhor visualização dos resultados obtidos nos ensaios de triagem para

S. mutans, os dados obtidos foram expressos em termos de porcentagem e são

mostrados na Tabela 3.

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 A

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

RF

U

Chalconas

*

* *

*

* *

* * *

*

*

*

50

Tabela 3 - Percentual de redução da biomassa total e viabilidade celular de S. mutans.

Formação Remoção

Moléculas Biomassa (%) Viabilidade (%) Biomassa (%) Viabilidade (%) 1 - 4,8 - 6,1 2 60,0 77,2 - 3,7 3 - 10,4 7,1 - 4 22,1 13,2 4,4 3,5 5 26,3 46,7 - 30,4 6 11,3 57,4 - 7,9 7 26,1 - - 58,8 8 0,0 - - 66,3 9 - 6,2 - 62,3

10 - 12,9 - 25,9 11 6,0 58,5 47,0 66,8 12 - 52,4 42,5 58,4 13 - 0,8 - - 14 5,9 - 43,3 - 15 67,4 - 49,0 - 16 5,1 9,7 16,2 - 17 - - 20,5 9,1 18 13,7 13,3 36,7 - 19 18,1 8,1 31,2 6,3 20 38,4 - 37,2 18,9 21 - 26,4 26,4 91,6

Antibiótico 92,5 95,3 8,3 84,1

Para a próxima etapa, no tratamento da formação do biofilme de S. mutans

foram escolhidas as moléculas 2 e 15. A molécula 2 apresentou, nos ensaios de

formação, boa redução tanto na formação de biomassa quanto na viabilidade

celular. Em relação ao controle de crescimento, essa redução foi de 60% e 77,2%,

respectivamente. A molécula 15 apresentou redução somente na biomassa, a qual

foi de 67,4%.

Já para os ensaios de remoção de biofilme, as moléculas 11, 12 e 21

apresentaram redução na biomassa celular cerca de 47%, 42,5% e 26,4%,

respectivamente. Nos ensaios de viabilidade celular, essas mesmas moléculas

apresentaram uma redução de 66,8%, 58,4% e 91,6%, respectivamente.

5.1.3 Considerações sobre a triagem inicial

Importante frisar que quanto à viabilidade celular nos ensaios de remoção de

biofilme, quando comparadas aos antibióticos polimixina B e ampicilina; as

51

moléculas testadas mostraram menor efeito bactericida sobre as células no biofilme;

exceto pela molécula 21 no ensaio de remoção de S. mutans. As moléculas

escolhidas para a próxima etapa mostraram-se efetivas tanto reduzindo a formação

do biofilme quanto na destruição do biofilme pré-formado. Mais especificamente nos

ensaios sobre biofilmes pré-formados, observa-se que o antibiótico não mostrou o

efeito de remoção comparativamente às moléculas testadas. É importante utilizar

moléculas capazes de interferir na estabilidade do biofilme sem promover a morte

celular do microrganismo, pois esta característica reduz a possibilidade do

surgimento de resistência bacteriana (ROGERS et al., 2009).

5.2 Efeito da concentração das moléculas sobre os biofilmes

Primeiramente, as moléculas selecionadas para esta fase foram diluídas

sucessivamente em microplaca a partir da concentração de 2000 μM até a

concentração de 3,9 μM e posteriormente adicionado o inóculo. Após 24h de

incubação a 37°C foi realizada leitura visual para determinação da CIM de cada

molécula para cada respectiva bactéria testada e também seus respectivos

antibióticos. A CIM de polimixina B encontrada para P. aeruginosa foi de 0,39 μM.

Este valor está em concordância com o descrito na literatura, pois; segundo GALES

et al (2001) a CIM para a cepa ATCC 27853 de P. aeruginosa é < 2 μg.mL-1. Já para

a S. mutans, o valor de CIM para ampicilina foi de 0,49 μM em conformidade com

CHA et al (2013) que descreveram que a CIM para a cepa 25175 de S. mutans é de

0,125 μg/mL. Tanto para S. mutans quanto para P. aeruginosa, não foi observada

CIM para as 21 moléculas testadas. Embora não se tenha observado CIM, notou-se

que algumas moléculas reduziram o crescimento das células planctônicas quando

em presença dessas moléculas. Este dado sugere que provavelmente o mecanismo

de ação antibiofilme das moléculas não esteja somente relacionado à ação

antimicrobiana.

Para verificar o efeito da concentração das moléculas na formação e remoção

do biofilme foram realizados os mesmos testes à partir da concentração de 2000 μM

das moléculas que foram diluídas sucessivamente, porém visando a verificação da

biomassa celular através da técnica do cristal violeta.

52

5.2.1 Efeito da variação de concentração das moléculas na atividade

antibiofilme frente à Pseudomonas aeruginosa

Para P. aeruginosa, foram testadas as moléculas 11 e 12 na formação de

biofilme e 4 e 10 na remoção de biofilme.

Figura 13 - Percentual de redução da formação do biofilme de P. aeruginosa na presença de diferentes concentrações da molécula 11.

A Figura 13 mostra que a molécula promoveu redução na formação de

biomassa celular e seu efeito em geralmaumentou de acordo com o aumento da

concentração. À partir da concentração de 1000 μM houve redução do efeito

possivelmente devido a saturação e insolubilidade da molécula no meio.

REJINIEMON et al (2014), também testaram a ação antibiofilme e antimicrobiana de

uma quinona, um metabólito extraído de uma planta medicinal chamada Aegle

marmelos. As atividades foram testadas para as bactérias E. coli, S. typhii e P.

aeruginosa. Além de mostrar efeito antibiofilme e antimicrobiano, os autores também

verificaram que a ação antibiofilme é dependente da concentração, ou seja;

aumentando-se a concentração da quinona de 2 à 10 μg.mL-1, o efeito antibiofilme

também aumentou. VELOZ et al (2015) obtiveram um resultado semelhante,

testando a ação antibiofilme de uma amostra de própolis. Sabe-se que a própolis é

um composto com muitas moléculas bioativas como terpenos, flavonoides e

polifenóis. Os autores evidenciaram inibição da formação do biofilme de S. mutans.

2000 1000 500 250 125 62,5 31,2 15,6 7,8 3,9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Re

duçã

o (

%)

Concentração (uM)

53

Tabela 4 - Efeito da concentração da molécula 11 na inibição da formação de biofilme de P. aeruginosa.

Concentração (μM) Molécula 11

Redução (%)

2000 51,2

1000 70,9

500 52,8

250 21,6

125 33,4

62,5 21,0

31,2 12,5

15,6 8,4

7,8 4,8

3,9 6,9

A Figura 14 mostra o crescimento celular de células planctônicas de P.

aeruginosa na presença de diferentes concentrações da molécula 11.

Figura 14 - Cinética de crescimento celular de P. aeruginosa na presença da molécula 11.

0 5 10 15 20 25

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

DO

(61

0n

m)

t(h)

2000

1000

500

250

125

CTRLDMSO

54

Pode-se observar na Figura 14, que a viabilidade celular foi reduzida

principalmente nas concentrações de entre 500 μM e 2000 μM. Assim, a redução da

biomassa mostrada pela molécula 11 pode estar relacionada com a morte celular do

microrganismo, o qual diminui a taxa de reprodução celular resultando em um

biofilme menos denso tanto em número de células quanto em MPE. Porém, para a

molécula 12, não foi observado efeito de redução da biomassa e da viabilidade

dependente da concentração.

Figura 15 - Percentual de remoção do biofilme de P. aeruginosa na presença de diferentes concentrações da molécula 10.

A Figura 15 mostra que dentro de certo intervalo de concentrações, o efeito

antibiofilme da molécula 10 mostrou ser dependente da concentração. Novamente,

observa-se uma diminuição do efeito antibiofilme da molécula em maiores

concentrações. Provavelmente, acima de 500 μM pode ocorrer redução da

solubilidade da molécula, o que diminui o seu efeito na remoção do biofilme.

2000 1000 500 250 125 62,5 31,2 15,6 7,8 3,9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Re

duçã

o (

%)

Concentração (uM)

55

Tabela 5 - Efeito da concentração da molécula 10 na remoção de biofilme de P. aeruginosa.


Redução (%)

2000 -

1000 40,1

500 51,2

250 24,5

125 25,0

62,5 7,1

31,2 -

15,6 -

7,8 -

3,9 -

Figura 16 - Cinética de crescimento celular de P. aeruginosa na presença da molécula 10.

Como mostrado na Figura 16, o crescimento celular também é afetado pela

molécula 10. Porém no gráfico, é mostrada como concentração máxima a de 500

0 5 10 15 20 25

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

DO

(61

0n

m)

t(h)

500

250

125

CTRLDMSO

56

μM, já que as curvas para 1000 μM e 2000 μM foram omitidas porque apresentaram

sinal de leitura mais alto que o controle provavelmente devido à insolubilidade da

molécula 10 nessas concentrações. Inclusive por esse mesmo motivo é provável

que em concentrações maiores que 500 μM, a molécula 10 não tenha apresentado

maior efeito de remoção sobre o biofilme. Pela estrutura da molécula 10 não é

surpreendente que esta apresente insolubilidade; já que não há nenhum substituinte

presente nos anéis da molécula. Alguns autores, como JORNADA et al (2015);

relataram que certos substituintes aumentam a solubilidade de chalconas. Contudo,

nota-se pelo perfil das curvas que apesar de a DO final do controle ser praticamente

a mesma do tratamento com a molécula 10; a curva do tratamento exibe um pico

máximo mais baixo. Neste caso, é possível que a molécula 10 cause certo atraso na

multiplicação celular das bactérias. Assim, uma hipótese é a de que com menos

células presentes se forma menos MPE; justificando a remoção da biomassa

verificada na triagem inicial. A molécula 10 pode também ter penetrado e agido

diretamente na desestruturação da arquitetura do biofilme, causando rompimento de

ligações e desprendimento celular; ocasionando assim a redução de biomassa.

Para a molécula 4, não foi observado efeito de redução da biomassa nem da

viabilidade dependente da concentração.

Na Tabela 4 temos o resumo para os ensaios de formação de biofilmes de P.

aeruginosa variando a concentração da molécula 11. Como o resultado obtido

mostrou que o efeito de redução da biomassa é dependente da concentração,

apenas a molécula 11 será utilizada para os próximos testes na formação do

biofilme.

Para os ensaios de remoção de biofilme de P. aeruginosa, o resumo dos

resultados obtidos com a molécula 10 foi mostrado na Tabela 5. Como se pode ver,

a molécula 10 demonstrou boa correlação da concentração com a remoção de

biofilme.

Assim, as moléculas 11(formação) e 10(remoção) foram escolhidas para a

continuidade dos testes; na tentativa de elucidar quais os mecanismos presentes

que justifiquem os resultados observados até aqui.

57

5.2.2 Efeito da variação de concentração das chalconas na atividade

antibiofilme frente à S. mutans

Para S. mutans, foram testadas as moléculas 2 e 15 na formação e 11, 12 e

21 na remoção dos biofilmes.

Figura 17 - Percentual de redução da formação do biofilme de S. mutans na presença de diferentes concentrações da molécula 15.

Na Figura 17 observa-se a dependência direta entre concentração e efeito na

redução da biomassa celular do biofilme de S. mutans. Nota-se que nas

concentrações mais altas o percentual de redução após lavagem e coloração com

cristal violeta aproximou-se de 100%. Para a viabilidade, o crescimento celular não

foi afetado variando-se a concentração da molécula 15, como pode ser visto na

Figura 18.

2000 1000 500 250 125 62,5 31,2 15,6 7,8 3,9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Re

duçã

o (

%)

Concentração (uM)

58

Figura 18 - Cinética de crescimento celular de S. mutans na presença da molécula 15.

Como se observa, nenhuma concentração utilizada da molécula 15 afetou

significativamente o crescimento celular de S. mutans, apesar da presença de um

átomo de bromo em cada anel em sua estrutura.

Tabela 6 - Efeito da concentração da molécula 15 na formação de biofilme de S. mutans.


Redução (%)

2000 95,1

1000 94

500 77,8

250 71,9

125 65,8

62,5 24

31,2 12,8

15,6 29,8

7,8 16,7

3,9 6,8

4 9 14 19

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

DO

(61

0n

m)

t(h)

2000

1000

500

250

125

ControleDMSO

59

Para a molécula 2, não foi observado efeito de redução da biomassa ou da

viabilidade dependente da concentração.

Figura 19 - Efeito da concentração da molécula 12 na remoção de biofilme de S. mutans.


2000 1000 500 250 125 62,5 31,2 15,6 7,8 3,9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Re

duçã

o (

%)

Concentração (uM)

4 9 14 19 24

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

DO

(61

0n

m)

t (h)

2000

1000

500

250

Controle

60

Na Figura 19 pode-se ver a boa correlação que a molécula 12 mostrou entre

variação da concentração e redução de biomassa celular. Entretanto, não foi

observada alteração no crescimento celular com o aumento da concentração da

molécula 12, como evidencia a Figura 20.

Como evidencia a Figura 20, o crescimento celular não é afetado pela

presença da molécula 12. Assim, a hipótese mais clara é a de que a molécula 12

penetra no biofilme e causa desprendimento de biomassa; o que explicaria a

redução observada tanto na viabilidade quanto na biomassa.

Figura 21 - Efeito da concentração da molécula 21 na remoção de biofilme de S. mutans.

A molécula 21 mostrou que sua ação sobre biofilmes pré-formados é

dependente da concentração. Entretanto, observou-se na triagem inicial que ela

apresentou bom efeito na viabilidade celular. Esta interferência na viabilidade foi

também observada na curva de crescimento mostrada na Figura 22.

2000 1000 500 250 125 62,5 31,2 15,6 7,8 3,9

0

20

40

60

80

100

Re

duçã

o (

%)

Concentração (uM)

61


A Figura 22 evidencia que as concentrações que mostraram maior efeito

sobre o crescimento celular foram de 1000 μM e 500 μM. JIANG et al (2011)

relataram alguns problemas com limite de detecção utilizando resazurina para

biofilmes de duas espécies formados por S. mutans e E. faecalis. Segundo os

autores, o limite de detecção foi observado entre 105 UFC/mL e 107 UFC/mL.

Assim, especificamente para a molécula 21, optou-se por realizar uma

contagem no biofilme tratado e seu controle; a fim de realizar uma comparação para

melhor quantificar a redução da viabilidade celular. Os resultados mostraram

redução de 1 log, ou seja; o controle apresentou 3,2 x 107 UFC/mL e o biofilme

tratado com a molécula 21 apresentou 2,6 x 106 UFC/mL.

0 5 10 15 20 25

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

DO

(61

0n

m)

t(h)

2000uM

1000uM

500uM

250uM

125uM

ControleDMSO

62

Tabela 7 - Efeito da concentração das moléculas 12 e 21 na remoção de biofilme de S. mutans.


Redução (%)

Molécula 21

Redução (%)

2000 62,7 47,5

1000 49,4 41,6

500 48,0 22,7

250 41,5 25,6

125 16,8 23,7

62,5 4,7 17,0

31,2 5,1 4,0

15,6 5,7 -

7,8 2,9 -

3,9 0,7 -

Na Tabela 6 é mostrado o resumo do desempenho da molécula 15 na

formação do biofilme de S. mutans. Como evidenciado, a molécula 15 mostrou bom

resultado e dependência da concentração assim, ela foi selecionada para a

continuidade do trabalho.

Para a remoção do biofilme de S. mutans, os resultados obtidos variando a

concentração das moléculas 12 e 21 estão resumidos na Tabela 7. Obteve-se bom

resultado variando a concentração, confirmando os dados obtidos na triagem inicial.

Assim, foram também selecionadas para dar continuidade aos próximos testes.

5.2.3 Considerações sobre o efeito da concentração das moléculas no biofilme

Até o momento, com as moléculas 11 para P. aeruginosa e 21 para S.

mutans; a redução da biomassa parece estar acompanhada de interferência na

viabilidade celular, como observado na Figura 14 e Figura 23 respectivamente.

Semelhantemente, CHOI & LEE (2012) evidenciaram o efeito antibiofilme de um

peptídeo chamado Pleurocidina, extraído da pele de peixes do gênero Pleuronectes

com conhecida atividade antimicrobiana. Os autores verificaram também a

existência de sinergismo entre o antibiótico ampicilina e a Pleurocidina frente a

várias bactérias como E. coli, S. aureus, P. acnes, P. aeruginosa e E. coli O157: H7.

63

Através da técnica de citometria de fluxo, os autores mostraram que quando os

compostos são usados em conjunto, aumentam a quantidade de radical hidroxila

formado; o qual é conhecido por ser danoso à membrana celular dos

microrganismos causando stress oxidativo. Assim, os danos aos microrganismos

prejudicam a produção de MPE e consequentemente resultam em prejuízo à

formação do biofilme.

A molécula 15 parece inibir a produção de MPE por S. mutans.

KUNTHALERT et al (2014) também obtiveram um resultado semelhante, porém

utilizando uma chalcona sintética chamada 3-hydroxichalcona (Figura 19) para inibir

a formação de biofilme de Haemophilus influenzae. Através da uma curva de

crescimento, os autores verificaram que a chalcona não causava efeito sobre a

viabilidade celular, mas reduzia a formação de biofilme, evidenciada através da

técnica de cristal violeta e por MEV. Assim, os autores sugeriram que a 3-

hidroxichalcona afetava a expressão de algum fator de virulência do microrganismo.

Através da comparação de vários análogos com diferentes substituintes, os autores

concluíram que uma hidroxila na posição 3 do anel B da chalcona foi crucial para a

atividade antibiofilme demonstrada.

A molécula 12 também parece não influenciar a viabilidade celular de S.

mutans como mostra a Figura 21; sugerindo a hipótese de que a molécula penetra

no biofilme pré-formado e desestabiliza sua arquitetura. Além disso, o efeito das

moléculas selecionadas para a próxima fase demonstra ser concentração-

dependente. Assim, seria uma boa estratégia a utilização das moléculas em

conjunto com um antibiótico; já que o combate ao biofilme atuaria em duas frentes

distintas: o antibiótico agindo na morte celular e as moléculas na sua capacidade de

prejudicar o estabelecimento de biofilmes e também a remoção de biofilmes já

estabelecidos.

5.3 Atividade anti-adesiva do poliestireno tratado com as chalconas e seus

derivados

Inicialmente foi feita uma cinética para se chegar ao tempo adequado de

contato entre a célula e o poliestireno, mostrada na Figura 23. Como já nas

primeiras 2 horas houve células aderidas, esse foi o tempo de contato escolhido

para os testes. Ainda, para garantir que haveria células viáveis, após 2 horas de

64

contato foi realizada uma contagem para se certificar da presença de células viáveis

aderidas ao poliestireno. A contagem mostrou uma concentração de 4,9 x 107

UFC/mL para P. aeruginosa e 1,2 x 10 107 UFC/mL para S. mutans.

Figura 23 - Cinética de adesão para P. aeruginosa e S. mutans em poliestireno.

A curva obtida evidencia a diferença de adesão variando-se o tempo de

contato. O tempo de 2 h foi também utilizado por outros autores visando estudo de

atividade anti-adesiva para P. aeruginosa (ZERAIK & NITSCHKE, 2012).

A atividade anti-adesiva das moléculas foi avaliada, sendo que nenhuma das

21 moléculas testadas mostrou atividade. Sabe-se que bactérias como P.

aeruginosa exibem preferencia em aderir à superfícies hidrofóbicas como

poliestireno em comparação à superfícies mais hidrofílicas como o vidro (ZAMEER

et al, 2012).

A adesão inicial é muito importante no processo de formação do

biofilme e está dividida em dois processos: adesão reversível e adesão irreversível.

Na adesão reversível o microrganismo pode ser facilmente removido (KUMAR;

ANAND, 1998). A aproximação nessa fase ocorre a distâncias um pouco maiores

que 50 nm e nela atuam apenas forças fracas de interação entre a célula e a

superfície, como forças de Van der Waals e interações eletrostáticas, ou seja; são

interações de longo alcance. Já na adesão irreversível, a aproximação ocorre à

distâncias de 20 nm, onde ocorrem também interações de curto alcance como

2 3 4 5 6

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

DO

(63

0n

m)

tempo (h)

Paeruginosa

Smutans

65

ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas, forças dipolo-dipolo, ligações iônicas

e covalentes (PALMER; FLINT; BROOKS, 2007; DE ARAUJO; FREIRE; NITSCHKE,

2013). Assim, as propriedades físico-químicas da superfície celular do

microrganismo e da superfície do material são muito importantes nesta etapa; como

também a disponibilidade de nutrientes (HOOD; ZOTTOLA, 1995).

Para explicar a ausência de ação anti-adesiva procedeu-se o ensaios de

hidrofobicidade da superfície do poliestireno e dos biofilmes; além do estudo das

características físico-químicas da superfície celular.

5.4 Determinação da hidrofobicidade do biofilme e do poliestireno tratado com

as chalconas e seus derivados

Placas de poliestireno como as mostradas abaixo na Figura 24 foram

utilizadas para as medidas de ângulo de contato.

Figura 24 - Placa de poliestireno utilizada nos ensaios do ângulo de contato.

Para P. aeruginosa as moléculas escolhidas para continuidade dos estudos

foram a 10 e a 11. Já para S. mutans, foram as moléculas 12, 15 e 21. Assim

medidas do ângulo de contato foram realizadas em placas de poliestireno sem

tratamento e placas também tratadas com as moléculas selecionadas. Também

foram feitas medidas em placas contendo biofilmes sem tratamento; de placas

contendo biofilme formado na presença das moléculas (formação) e placas contendo

biofilme tratado (remoção). Os dados do ângulo de contato estão dispostos na

Tabela 8.

66

Tabela 8 - Ângulo de contato das diversas superfícies tratadas com as moléculas

Superfície Ângulo de contato em graus

Poliestireno 84,98 ± 0,08

Biofilme de S. mutans em poliestireno < 10

Biofilme de P. aeruginosa em poliestireno < 10

Poliestireno tratado com molécula 10 38,73 ± 0,13





Biofilme de P. aeruginosa formado com molécula 11 < 10

Biofilme de P. aeruginosa tratado com molécula 10 < 10

Biofilme de S. mutans tratado com molécula 21 < 10

Biofilme de S. mutans tratado com molécula 12 <10

Biofilme de S. mutans formado com molécula 15 < 10

Segundo VOGLER (1998), medidas de ângulo de contato entre água e

superfície são consideradas hidrofílicas se esse ângulo for menor que 65° e

hidrofóbicas se for maior que 65°. Como se pode observar nos dados obtidos, todos

os biofilmes; tanto o controle como os biofilmes formados e tratados com as

respectivas moléculas; são muito hidrofílicos. Isso é evidenciado pelo ângulo de

contato menor que 10° em todos eles. Sendo assim, evidencia-se que a presença

das moléculas utilizadas não alterou a característica dos biofilmes em relação à sua

hidrofobicidade.

Já para a superfície do poliestireno, inicialmente pode-se notar que sua

característica é hidrofóbica, com ângulo de contato superior a 65°. Entretanto, todas

as placas tratadas com as moléculas mostraram redução de sua hidrofobicidade,

algumas inclusive mostrando ângulo de contato abaixo dos 65°; permitindo serem

67

caracterizados como superfície hidrofílica, ou seja, a presença das moléculas

modificou a característica do material.

Mesmo que a hidrofobicidade tenha sido reduzida com o tratamento prévio;

uma hipótese é que o condicionamento com as moléculas atrasou a adesão

reversível das moléculas, mas não impediu que ela ocorresse. Assim é possível que,

mesmo que com dificuldade; os microrganismos testados conseguiram chegar à

fase de adesão irreversível.

Sabe-se também que as chalconas e seus derivados são em sua maioria

hidrofóbicas, apesar da possibilidade de inserção de grupos hidrofílicos nas

moléculas. Assim, o revestimento do poliestireno com esses compostos pode não ter

modificado suficientemente o caráter hidrofóbico da superfície para que impedisse a

adesão.

O tratamento da superfície com as moléculas não impediu a adesão inicial

das células. Porém, sabe-se que após a adesão irreversível, a capacidade de

formação do biofilme depende do microrganismo produzir EPS. O EPS possui

polímeros adesivos; e provavelmente a interação entre esses polímeros adesivos e

a superfície tenha sido prejudicada pelo tratamento com as moléculas; mas não

impediu por completo o estabelecimento do biofilme.

Segundo, MAYER et al (1999), algumas das principais forças físico-químicas

de coesão que podem conectar as cadeias poliméricas da matriz do biofilme são:

interações eletrostáticas de cadeias poliméricas de cargas opostas, interações

eletrostáticas entre contra-íons ligados às cadeias poliméricas, entrelaçamento físico

dos polímeros, ligações covalentes e ligações de hidrogênio. Ainda, segundo CHEN

& SSTEWART (2002) essas forças são muito importantes para o desenvolvimento

de estratégias de ação antibiofilme, principalmente quando o objetivo é destruir o

biofilme sem interferir na viabilidade celular.

Nesse sentido, ALVES et al (2012) investigaram 4 substâncias naturais:

farnesol, xilitol, lactoferrina e ácido salicílico. No estudo, evidenciaram que uma

combinação específica das substâncias foi eficaz em remover biofilmes de E.

faecalis e S. epidermidis.

68

Então uma hipótese é que o tratamento do poliestireno com as moléculas não

impede a adesão celular inicial, mas os ensaios que utilizam chalconas na formação

do biofilme podem dificultar a formação da MPE. Na remoção de biofilmes a

hipótese é a mesma: as chalconas penetram no biofilme já estabelecido e perturbam

sua estrutura; tornando-os mais “frouxos” e consequentemente fazendo com que se

desintegrem parcialmente.

5.5 Determinação da hidrofobicidade celular

O teste MATS é baseado na comparação entre a afinidade da célula

microbiana por um solvente polar e a afinidade por um solvente apolar. Nesse teste,

a afinidade celular do microrganismo é considerada a somatória entre interações

eletrostáticas, interações ácido-base de Lewis e interações de Van der Waals

(PALMER; FLINT; BROOKS, 2007). Assim, podem-se obter as propriedades

hidrofóbicas e ácido-base da superfície celular dos microrganismos utilizados.

Se a afinidade pelo solvente aceptor de elétrons for maior que pelo solvente

apolar, a superfície apresenta características básicas. Caso a afinidade seja maior

pelo solvente doador de elétrons que pelo solvente apolar, então a superfície

apresenta características ácidas. Além disso, quanto maior for a afinidade da célula

pelo solvente apolar, maior será a hidrofobicidade de sua superfície

(PROKOPOVICH; PERNI, 2009). No caso do presente trabalho, a comparação foi

realizada entre os pares acetato de etila e decano; e clorofórmio e hexadecano. Os

dados obtidos são mostrados na Tabela 9.

Tabela 9 - Teste de adesão microbiana à solventes.

Acetato de etila

(%)

Clorofórmio

(%)

Hexadecano

(%)

Decano

(%)

P. aeruginosa 11,4 ± 0,03 69,7 ± 0,01 16,1 ± 0,02 30,1 ± 0,06

S. mutans 13,6 ± 0,03 85,7 ± 0,002 96,8 ± 0,005 93,3 ± 0,005

A bactéria P. aeruginosa apresentou maior afinidade pelo clorofórmio do que

pelo hexadecano, sugerindo que sua superfície celular tem predominância de

caráter básico, ou seja; o predomínio de cargas negativas. Também demonstrou

baixa afinidade pelo acetato de etila ou seja, fraco caráter ácido. Além disso, é

69

possível observar baixa interação com os solventes apolares; exibindo fraca

hidrofobicidade.

Já a bactéria S. mutans, apresentou alta afinidade pelo clorofórmio, sugerindo

que sua superfície celular tem predominância de cargas negativas. Também

demonstrou alta afinidade pelos solventes apolares, permitindo serem

caracterizadas como fortemente hidrofóbicas.

Considerando que o tratamento com as moléculas reduziu a hidrofobicidade

do material (Tabela 8) mas não impediu a adesão das bactérias, pode-se inferir que

as características superficiais das células (carga negativa e caráter hidrofóbico)

foram suficientes para permitir a aproximação e a adesão ao material tratado.

Entretanto a redução da hidrofobicidade pode interferir nas interações hidrofóbicas,

que são importantes na interação célula-superfície e assim retardar o

estabelecimento do biofilme. KWIECINSKI et al (2016) mostraram que o tratamento

da superfície de poliestireno com plasminogênio tecidual resultou no atraso do

estabelecimento de biofilme de S. aureus por até 32 horas.

A atividade anti-biofilme observada neste trabalho não foi associada

diretamente à ação anti-adesiva, mas pode estar também relacionada ao

retardardamento da adesão celular e consequente redução da biomassa.

5.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Com o intuito de observar como as moléculas utilizadas interferiram na

estrutura física do biofilme de S. mutans e P. aeruginosa, foi utilizada a técnica de

MEV dos biofilmes formados e tratados com as moléculas selecionadas assim como

também dos seus respectivos controles. Para esta técnica, os biofilmes foram

formados em placas de poliestireno (10 mm x 10 mm) como mostrado na Figura 25.

70

Figura 25 - Placa de poliestireno utilizada na MEV.

5.6.1 Microscopia de P. aeruginosa

Abaixo na Figura 26, é mostrada a microscopia do biofilme de P. aeruginosa

formado na presença da molécula 11.

Figura 26 - MEV do biofilme de P. aeruginosa formado na ausência (a) e na presença da molécula 11 na concentração de 500 µM (b). Aumento de 10.000X.

Nota-se que o biofilme formado em presença da molécula 11 (b) possui

menor quantidade de MPE que o biofilme controle (a); consequentemente há

também menor número de células aderidas. Estes fatos justificam os resultados

obtidos na triagem inicial, onde foi evidenciada uma redução na biomassa de 48,9%

e uma redução na viabilidade de 60,2%. Assim, o observado na microscopia sugere

(a) (b)

71

que a molécula 11 interfere nos mecanismos de estabelecimento do biofilme de P.

aeruginosa, provavelmente interferindo na viabilidade celular e consequente

produção de MPE.

Figura 27 - MEV do biofilme pré-formado de P. aeruginosa sem tratamento (a) e após tratamento com a molécula 10 na concentração de 500 µM (b). Aumento de 10.000X.

Na Figura 27 também se evidencia uma redução significativa do MPE,

tornando o biofilme mais fino e também com cavidades, ou seja; a molécula 10 de

fato promoveu a remoção física de parte do biofilme. A microscopia também

confirma os resultados da triagem inicial, onde a molécula 10 removeu 53,5% da

biomassa em relação ao controle.

5.6.2 Microscopia de S. mutans

Abaixo na Figura 28 é mostrada a microscopia eletrônica do biofilme de S.

mutans formado na presença da molécula 15.

(a) (b)

72

Figura 28 - MEV do biofilme de S. mutans formado na ausência (a) e na presença da molécula 15 na concentração de 500 µM (b). Aumento de 10.000X.

Observa-se no controle (a) um biofilme espesso que foi inibido

significativamente na presença da molécula 15 (b). Neste caso não é clara a

presença de MPE se comparado ao ensaio de P. aeruginosa (Figura 26 e 27). A

molécula 15 reduziu a biomassa total em 67,4% nos ensaios de triagem o que pode

ser evidenciado na Figura 28.

A atividade da molécula 15 pode estar relacionada à inibição tanto do

crescimento como na expressão de proteínas relacionadas à formação de biofilmes

(BOŽIĆ et al., 2014). Como não foi evidenciada ação anti-adesiva para nenhuma

molécula testada, é possível que ocorra também um retardamento na maturação do

biofilme resultando em menor quantidade de MPE.

(a) (b)

73

Figura 29 - MEV do biofilme pré-formado de S. mutans sem tratamento (a) e após tratamento com a molécula 12 na concentração de 500 µM (b). Aumento de 2000X(acima) e aumento de 10000X(abaixo).

O perfil mostrado na Figura 29 corrobora com o evidenciado na triagem inicial,

onde a molécula 12 reduziu a biomassa total em 42,5% no protocolo de remoção. É

clara a redução de MPE e consequentemente das células viáveis. A redução de

viabilidade na triagem inicial foi de 58,4%.

Abaixo na Figura 30 é mostrada a MEV do controle de remoção e seu

tratamento utilizando a molécula 21. Para a molécula 21, vale lembrar que a triagem

inicial mostrou um perfil curioso: uma redução da biomassa total de apenas 26,4%,

mas uma redução de viabilidade celular de 91,6%.

(a) (b)

74

Figura 30 - Imagens de MEV de células do biofilme de S. mutans estabelecido em superfície de poliestireno. a) Controle com aumento de 2000X (acima) e 10000X (abaixo). b) biofilme após tratamento com molécula 21 na concentração de 500 µM com aumento de 2000X (acima) e 10000X (abaixo). c) células de S. mutans apresentando alterações morfológicas indicadas pelas setas em vermelho (aumento 80.000X).

(a) (b)

(c)

75

Na Figura 30 observa-se também redução de biomassa total, entretanto a

molécula 21 mostrou na triagem inicial grande redução na viabilidade celular. Assim,

decidiu-se investigar as células de S. mutans para verificar possíveis danos que a

molécula 21 possa ter causado à estrutura celular do microrganismo. Para isso,

observaram-se as células em maior aumento.

Como se pode ver, a membrana celular do microrganismo parece não estar

totalmente íntegra. Esse fato pode ser mais bem constatado na Figura 30 (c).

Em um estudo recente, WALLOCK-RICHARDS et al. (2015) mostraram que a

formação de biofilme de S. mutans foi inibida utilizando uma chalcona natural. A

molécula utilizada no estudo é mostrada abaixo na Figura 31.

Figura 31 - Molécula utilizada por WALLOCK-RICHARDS et al. (2015) para inibição da formação de biofilme de S. mutans.

FONTE: WALLOCK-RICHARDS et al. (2015)

Neste estudo, os autores obtiveram bons dados referentes à redução da

biomassa celular do biofilme de S. mutans utilizando a chalcona em questão.

Posteriormente, dados de espectrometria de massa evidenciaram uma interação da

chalcona com a enzima Sortase A, a qual era inibida por um aduto de Michael

formado entre uma região da chalcona e uma região da enzima.

No caso da molécula 21, há grande semelhança estrutural com a trans-

chalcona (Figura 32). As imagens obtidas na MEV sugerem fortemente que a

diminuição da biomassa se deve à danos na parede celular do microrganismo, ou

seja, é possível que ocorra mecanismo semelhante ao descrito por WALLOCK-

RICHARDS et al. (2015).

76

Figura 32 - Estrutura da molécula 21.

5.7 Microscopia Confocal

A microscopia confocal foi realizada com o intuito de ilustrar a ação das

moléculas em termos de arquitetura do biofilme e viabilidade celular. Assim, foi

possível principalmente observar como o tratamento com as moléculas na

concentração de 500 µM afetou a viabilidade celular presente no biofilme. Também

foi possível evidenciar as diferenças entre a espessura do biofilme.

5.7.1 Microscopia Confocal para P. aeruginosa

A Figura 33 evidencia e confirma o que foi observado na triagem inicial e na

MEV. Além do fato de haver mais células mortas no biofilme formado na presença

da molécula 11, esse biofilme também apresentou menor espessura em relação ao

controle; o que pode ser visto na Tabela 10.

77

Figura 33 - Microscopia confocal do biofilme de P. aeruginosa formado na

ausência (a) e na presença da molécula 11 na concentração de 500 µM (b).

Na Figura 34 também se pode observar a presença de mais células mortas

em relação ao controle. Como a principal ação da molécula 10 foi a de remover o

biofilme, também se evidencia aqui um perfil menos espesso que o controle. A

espessura pode ser comparada abaixo na Tabela 10.

Figura 34 - Microscopia confocal do biofilme de P. aeruginosa estabelecido em superfície de poliestireno. a) Controle e b) biofilme após tratamento com molécula 10 na concentração de 500 µM.

(a) (b)

(a) (b)

78

Tabela 10 - Espessura dos biofilmes de P. aeruginosa.

Biofilme de P. aeruginosa Espessura média (µm)

Controle de formação 45,7 Formação na presença da molécula 11 33,7

Controle de remoção 54 Tratamento com a molécula 10 42

5.7.2 Microscopia Confocal para S. mutans

A microscopia confocal observada na Figura 35 também confirma o que foi

obtido com a molécula 15 para a formação do biofilme de S. mutans. Há menor

quantidade de MPE no biofilme formado com a molécula 15 (b) do que seu controle

sem tratamento (a). Os dados de espessura estão na Tabela 11.

Figura 35 - Microscopia confocal do biofilme de S. mutans formado na ausência (a) e na presença da molécula 15 na concentração de 500 µM (b).

Na Figura 36 é mostrado o controle sem tratamento (a), o biofilme tratado

com a molécula 12(b) e o biofilme tratado com a molécula 21 (c). O biofilme tratado

com a molécula 12 mostra cavidades presentes, o que resulta num biofilme menos

denso e com menor número de células viáveis; o que mais uma vez justifica os

resultados obtidos na triagem inicial e na MEV. Já o biofilme tratado com a molécula

21 mostra um perfil onde há um número grande células mortas, o que também foi

observado na triagem inicial e posteriormente na MEV; que mostrou danos à

integridade celular do microrganismo.

(a) (b)

79

Figura 36 - Microscopia confocal do biofilme de S. mutans estabelecido em superfície de poliestireno. a) Controle e b) biofilme após tratamento com molécula 12 na concentração de 500 µM e c) biofilme após tratamento com a molécula 21 na concentração de 500 µM

Tabela 11 - Espessura dos biofilmes de S. mutans.

Biofilme de S. mutans Espessura média (µm)

Controle de formação 60,4 Formação na presença da molécula 15 39,5

Controle de remoção 57 Tratamento com a molécula 12 45,2 Tratamento com a molécula 21 44,1

(a) (b)

(c)

80

5.8 Principais resultados

Os biofilmes formados por P. aeruginosa foram inibidos pela presença

da molécula 11, resultando na redução de 48,8% de biomassa e 60,2%

de viabilidade. Em concentrações superiores, a redução da biomassa

chegou a 70,9%.

No tratamento de biofilmes pré-estabelecidos, a molécula 10 mostrou

redução de 53,5% de biomassa do biofilme de P. aeruginosa.

Na formação do biofilme de S. mutans, a presença da molécula 15

reduziu a biomassa em 67,4%. Em concentrações superiores essa

redução chegou a 95,1%.

Em biofilmes pré-estabelecidos de S. mutans, o tratamento com a

molécula 12 reduziu a biomassa celular em 42,5%, e a viabilidade

celular em 58,4%. Em maiores concentrações a redução da biomassa

foi de 62,7%.

A molécula 21, no tratamento de biofilmes pré-estabelecidos, mostrou

redução de 26,4% da biomassa e 91,6% da viabilidade de S. mutans.

Os antibióticos removeram menor quantidade de biofilmes

comparativamente às moléculas testadas.

As moléculas não apresentaram CIM frente às linhagens de bactérias

até a concentração máxima de 2000 μM

As chalconas não apresentaram atividade anti-adesiva.

O tratamento de poliestireno com as chalconas resultou na redução da

hidrofobicidade do material.

A superfície celular de S. mutans mostrou a presença de cargas

negativas e forte caráter hidrofóbico. Já P. aeruginosa mostrou também

a presença de cargas negativas, porém baixa hidrofobicidade.

81

6 CONCLUSÕES

O trabalho realizado permitiu selecionar chalconas sintéticas com potencial

para o controle e erradicação de biofilmes de P. aeruginosa e S. mutans. A partir

dos resultados obtidos, será possível desenvolver novas estratégias de tratamento

visando futuro controle de biofilmes.

82

7 PERSPECTIVAS FUTURAS

As moléculas selecionadas podem ser testadas em conjunto para

verificar a presença de sinergismo.

É necessário testar a citotoxicidade das moléculas selecionadas para

assegurar sua futura aplicação.

Avaliar a combinação das moléculas com antibióticos já conhecidos

como estratégia de controle dos biofilmes, atuando assim em duas

frentes distintas.

Combinar as moléculas com tensoativos, como os biossurfatantes.

A partir das moléculas selecionadas, podem-se variar os grupos

funcionais presentes em diferentes posições dos anéis; permitindo

estudo mais profundo da relação estrutura-atividade.

Os mesmo testes podem ser realizados em biofilmes mais maduros.

83

8 REFERÊNCIAS

ALVES, F. R. F.; SILVA, M. G.; RÔÇAS, I. N.; & Siqueira, J. F. Biofilm biomass disruption by natural substances with potential for endodontic use. Brazilian Oral Research, v. 27, n. 1, p. 20–5, 2013. AVILA, H.P.; SMÂNIA, E.F.A.; MONACHE, F.D.; SMÂNIA, A. Structure-activity relationship of antibacterial chalcones. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 16, p. 9790-9794, 2008. BALOUIRI, M.; SADIKI, M.; IBNSOUDA, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis, v. 6 n. 2, p. 71–79. 2012. BOŽIĆ, D. D.; MILENKOVIĆ, M.; IVKOVIĆ, B.; ĆIRKOVIĆ, I. Antibacterial activity of three newly-synthesized chalcones & synergism with antibiotics against clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Indian Journal of Medical Research, v. 140, p. 130–137, 2014. BRIDIER, A.; R. BRIANDET, R.; THOMAS, V.; DUBOIS-BRISSONNET, F. Resistance of bacterial biofilms to disinfectants: a review. Biofouling, v. 27, p. 1017-1032, 2011. BURTON, E.; YAKANDAWALA, N.; LOVETRI, K.;MADHYASTHA, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, v. 34, p 1-4, 2007. BRYERS, J. D. Medical biofilms. Biotechnology and Bioengineering, v. 100, n. 1, p. 1–18, 2008. CHA, J.; JEONG, M.; CHOI, K.; PARK, J.; CHA, S.; LEE, K. Synergistic effect between cryptotanshinone and antibiotics in oral pathogenic bacteria, Advances in Bioscience and Biotechnology, p. 283–294, 2013. CHEN, X.; STEWART, P. S. Role of electrostatic interactions in cohesion of bacterial biofilms. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 59, n. 6, p. 718–720, 2002. CHIARADIA, L.D.; DOS SANTOS, S.; VITOR, C.E; VIEIRA, A. A.; LEAL, P. C.; NUNES, R. J.; CALIXTO, J. B.; YUNES, R. A. Synthesis and pharmacological activity of chalcones derived from 2,4,6-trimethoxyacetofenone in Raw 264.7 cells stimulated

84

by LPS: quantitative structure-activity relationships. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 16, p. 658-667, 2008. CHOI, H.; LEE, D. G. Antimicrobial peptide pleurocidin synergizes with antibiotics through hydroxyl radical formation and membrane damage, and exerts antibiofilm activity. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, v. 1820, n. 12, p. 1831–1838, 2012. CUSHNIE, T.P.; LAMB, A.J. Recent advances in understanding the antibacterial properties of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents, v. 38, p. 99-107, 2011. DE ARAUJO, L. V.; FREIRE, D. M. G.; NITSCHKE, M. Biossurfactantes: Propriedades anticorrosivas, antibiofilmes e antimicrobianas. Quimica Nova, v. 36, n. 6, p. 848–858, 2013. DONLAN, R. M. Biofilms on central venous catheters: is eradication possible? In: Romeo T, ed. Bacterial biofilms. Current Topics in Microbiology and Immunology, p. 133–61. 2008 DONLAN, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases, v. 8, p. 881-890, 2002. DRAGO, L.; AGRAPPI, S.; BORTOLIN, M.; TOSCANO, M.; ROMANÒ, C. L.; DE VECCHI, E. How to study biofilms after microbial colonization of materials used in orthopaedic implants. International Journal of Molecular Sciences, v. 17, n. 3, p. 293, 2016. DUNNE, W. M.; DUNNE, W. M. Bacterial Adhesion: Seen Any Good Bio lms Lately? Clinical Microbiology Reviews, v. 15, n. 2, p. 155–166, 2002. FLEMMING, H.; WINGENDER, J. The biofilm matrix. Nature Reviews, 8: 623-633, 2010. FURNISS B. S.; HANNFORD A. J.; SMITH P. W. G.; TATCHELL A. R. Vogel’s Textbook of practical organic chemistry, 5th ed., by Funiss B. p. 1032-1035, 2004. GABRIELSON, J.; HART, M.; JARELÖV, A.; KÜHN, I.; MCKENZIE, D.; MÖLLBY, R. Evaluation of redox indicators and the use of digital scanners and spectrophotometer for quantification of microbial growth in microplates. Journal of Microbiological Methods, v. 50, n. 1, p. 63–73, 2002.

85

GALES, A. C.; REIS, A. O.; JONES, R. N. Contemporary Assessment of Antimicrobial Susceptibility Testing Methods for Polymyxin B and Colistin : Review of Available Interpretative Criteria and Quality Control Guidelines Contemporary Assessment of Antimicrobial Susceptibility Testing Methods for P. Journal of Clinical Microbiology, v. 39. N. 1, p. 183–190, 2001. GO, M. L.; WU, X.; LIU, X. L. Chalcones: an update on cytotoxic and chemoprotective properties. Current Medicinal Chemistry, v. 12, p. 481–499, 2005. GOMES, M.Z.V., NITSCHKE, M. Evaluation of rhamnolipid and surfactin to reduce the adhesion and remove biofilms of individual and mixed cultures of food pathogenic bacteria. Food Control, v. 25, p. 441-447, 2012. HALL-STOODLEY, L.; COSTERTON, J. W.; STOODLEY, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology, v. 2, p. 95-108, 2004. HOOD, S. K.; ZOTTOLA, E. A. Biofilms in food processing. Food Control, v. 6, n. 1, p. 9–18, 1995. VAN HOUDT, R.; MICHIELS, C. W. (2010). Biofilm formation and the food industry, a focus on the bacterial outer surface. Journal of Applied Microbiology, v. 109, n. 4, p. 1117–1131, 2010. JORNADA, D.; DOS SANTOS F. G.; CHIBA, D.; DE MELO, T.; DOS SANTOS, J.; CHUNG, M. The Prodrug Approach: A Successful Tool for Improving Drug Solubility. Molecules, v. 21, n. 1, p. 42, 2015. KAYSER, F.H. Bacteria as Human Pathogens. In: Kayser, F.H.; Bienz, K.A.; Eckert, J.; Zinkernagel, R. M. Medical Microbiology. p. 229-345, 2005 KOO, H.; JEON, J.G. Naturally occurring molecules as alternative therapeutic agents against cariogenic biofilms. Advances in Dental Research, v. 21, p. 63-68, 2009. KOO, H.; PEARSON, S.K.; SCOTT-ANNE, K.; ABRANCHES, J.; CURY, J.A.; ROSALEN, P.L.; PARK, Y.K.; MARQUIS, R.E., BOWEN, W.H. Effects of apigenin and tt-farnesol on glucosyltransferase activity, biofilm viability and caries development in rats. Oral Microbiology & Immunology, v. 17, p. 337-343, 2002.

86

KOO, H.; SCHOBEL, B.; SCOTT-ANNE, K.; WATSON, G.; BOWEN, W.H.; CURY, J.A.; ROSALEN, P.L.; PARK, Y.K. Apigenin and tt-farnesol with fluoride effects on S. mutans biofilms and dental caries. Journal of Dental Research, v. 84, p. 1016-1020, 2005. KORMENDY, A. C.; WAYMAN, M. Scanning electron microscopy of microorganisms. Journal of Bacteriology, v. 3, n. 1, p. 33–47, 1971. KUMAR, C.G.; ANAND, S.K. Significance of microbial biofilms in food industry: a review. International Journal of Food Microbiology, v. 42, p. 9-27, 1998. KUNTHALERT, D.; BAOTHONG, S.; KHETKAM, P.; CHOKCHAISIRI, S.; SUKSAMRARN, A. A chalcone with potent inhibiting activity against biofilm formation by nontypeable haemophilus influenzae. Microbiology and Immunology, v. 58, n. 10, p. 581–589, 2014. KWIECINSKI, J.; NA, M.; JARNEBORN, A.; JACOBSSON, G.; PEETERMANS, M.; VERHAMME, P.; JIN, T. Tissue plasminogen activator coating on surface of implants reduces Staphylococcus aureus biofilm formation. Applied and Environmental Microbiology, v. 82, n. 1, p. 394-401. 2015. LEE, J.H.; PARK, J.H.; CHO, H. S. ; JOO, S.W.; CHO, M.H.; LEE, J. Anti-biofilm activities of quercetin and tannic acid against Staphylococcus aureus. Biofouling, v. 29, p. 491-499, 2013. LEE, J.H.; REGMI, S.C.; KIM, J.; CHO,M.H.; YUN, H.; LEE, C.; LEE, J. Apple flavonoid phloretin inhibits Escherichia coli O157:H7 biofilm formation and ameliorates colon inflammation in rats. Infection and Immunity, v. 79, p. 4819-4827, 2011. MAH, T. F. C.; O’TOOLE, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in Microbiology, v. 9, n. 1, p. 34–39, 2001. MANNER, S. ; SKOGMAN, M.; VUORELA, P.; FALLARERO, A. Exploring flavonoids, the extensive known natural compounds class, for anti-biofilm effects utilizing high throughput screening and in silico modeling. In Abstract Book -Third European Congress on Microbial Biofilms- Basic and Clinical Aspects - Guent - Belgium, p. 65, 2013.

87

MANNER, S.; SKOGMAN,M., GOERES, D., VUORELA, P.; FALLARERO, A. Systematic exploration of natural and synthetic flavonoids for the inhibition of Staphylococcus aureus biofilms. International Journal of Molecular Sciences, v. 14, p. 19434-19451, 2013a. MAUKONEN, J.; MÄTTÖ, J., WIRTANEN, G.; RAASKA, L.; MATTILA-SANDHOLM, T.; SAARELA, M. Methodologies for the characterization of microbes in industrial environments: A review. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, v. 30, n.6, p. 327–356, 2003. MAYER, C.; MORITZ, R.; KIRSCHNER, C.; BORCHARD, W.; MAIBAUM, R.; WINGENDER, J.; FLEMMING, H. C. The role of intermolecular interactions: studies on model systems for bacterial biofilms. International Journal of Biological .Macromolecules, v. 26, n. 1, p. 3–16, 1999. MEDINI, D.; SERRUTO, D.; PARKHILL, J.; RELMAN, D. A; DONATI, C.; MOXON, R.; RAPPUOLI, R. Microbiology in the post-genomic era. Nature Reviews. Microbiology, v. 6, n. 6, p. 419–430, 2008. MEYLHEUC, T.; VAN OSS, C. J.; BELLON-FONTAINE, M.N. Adsorption of biosurfactant on solid surfaces and consequences regarding the bioadhesion of Listeria monocytogenes LO 28. Journal of Applied Microbiology, v. 91, p. 822-832, 2001. MIRELES II, J.P.; TOGUCHI, A.; HARSHEY, R.M. Salmonella enterica serovar typhimurium swarming mutants with altered biofilm-forming abilities: surfactin inhibits biofilm formation. Journal of Bacteriology, v. 183; p. 5848-5854, 2001. MOLOBELA, I. P.; LLUNGA, F. M. Impact of bacterial biofilms: The importance of quantitative biofilm studies. Annals of Microbiology, v. 62, p. 461-467, 2012. MU, H.; TANG, J.; LIU, Q.; SUN, C.; WANG, T.; DUAN, J. Potent Antibacterial Nanoparticles against Biofilm and Intracellular Bacteria. Scientific Reports, 6(Nov. 2015), 18877, 2016. NADELL, C. D.; XAVIER, J. B.; LEVIN, S. A.; Foster, K. R. The evolution of quorum sensing in bacterial biofilms. PLoS Biology, v. 6, n. 1, p. 0171–0179, 2008. NASSAR, H. M.; LI, M.; GREGORY, R. L. Effect of honey on Streptococcus mutans growth and biofilm formation. Applied and Environmental Microbiology, v. 78, n. 2, p. 536–540, 2012.

88

NICOLAS, G. G.; LAVOIE, M. C. Streptococcus mutans et les streptocoques buccaux dans la plaque dentaire. Canadian Journal of Microbiology, v. 57. n. 1, p. 1–20, 2011. NIELSEN, S.F.; BOESEN, T.; LARSEN, M.; SCHONNING, K.; KROMANN, H. Antibacterial chalcones-bioisosteric replacement of the 4-hydroxy group. Bioorganic & Medicinal Chemistry v. 12, p. 3047-3054, 2004. NIKOLAEV, Y. A.; PLAKUNOV, V.K. Biofilm -“City of Microbes” or an analogue of multicellular organisms? Microbiology, v. 76, p. 149-163, 2007. NOWAKOWSKA, Z.; WYRZYKIEWICZ, E.; KEDZIA, B. Synthesis and antimicrobial properties of N-substitutd derivatives of (E)-azachalcones. Il Farmaco, v. 56, p. 325-329, 2007. NOWATZKI, P.J.; KOEPSEL, R.R.; STOODLEY, P.; MIN, K.; HARPER, A.; MURATA, H.; DONFACK, J.; HORTELANO, E.R.; EHRLICH, G.D.; RUSSELL, A.J. Salicylic acid-releasing polyurethane acrylate polymers as anti-biofilm urological catheter coatings. Acta Biomaterialia, v. 8, p. 1869-1880, 2012. O'BRIEN, J.; WILSON, I.; ORTON, T.; POGNAN, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cytotoxicity. European Journal of Biochemistry, v. 267, p. 5421-5426, 2000. PALMER, J.; FLINT, S.; BROOKS, J. Bacterial cell attachment, the beginning of a biofilm. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, v. 34, p. 577-588, 2007. PALMER, R. J.; WHITE, D. C. Developmental biology of biofilms: implications for treatment and control. Trends in Microbiology, v. 5, n. 11, p. 435–440, 1997. PANTANELLA, F.; VALENTI, P.; NATALIZI, T.D.; PASSERI, D.; BERLUTTI, F. Analytical techniques to study microbial biofilm on abiotic surfaces: pros and cons of the main techniques currently in use. Annali di Igiene, v. 25, p. 31-42, 2013 PEETERS, E.; NELIS, H.J.; COENYE, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods, v. 72, p. 157-165, 2008.

89

POLLACK, M. Pseudomonas aeruginosa. In: Mandell, D.; Benneths, J.; Dolin, R. (eds.). Principles and practice of infectious diseases, 1995. PRIETO, B.; SILVA, B.; LANTES, O. Biofilm quantification on stone surfaces: comparison of various methods. Science of the Total Environment, v. 333, p. 1-7, 2004. PROKOPOVICH, P.; PERNI, S. An investigation of microbial adhesion to natural and synthetic polysaccharide-based films and its relationship with the surface energy components. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, v. 20, n. 1, p. 195–202, 2009. REJINIEMON, T. S.; ARASU, M. V.; DURAIPANDIYAN, V.; PONMURUGAN, K.; AL-DHABI, N. A.; AROKIYARAJ, S.; CHOI, K. C. In-vitro antimicrobial, antibiofilm, cytotoxic, antifeedant and larvicidal properties of novel quinone isolated from Aegle marmelos (Linn.) Correa. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, v. 13, n. 1, p. 48, 2014. RENDUELES, O.; GHIGO, J. M. Multi-species biofilms: How to avoid unfriendly neighbors. FEMS Microbiology Reviews, v. 36, p. 972-989, 2012. RENNER, L. D.; WEIBEL, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bulletin / Materials Research Society, v. 36, n. 5, p. 347–355, 2011. RODRIGUES, L. R.; BANAT, I. M.; VAN DER MEI, H. C.; TEIXEIRA, J. A.; OLIVEIRA, R. Interference in adhesion of bacteria and yeasts isolated from explanted voice prostheses to silicone rubber by rhamnolipid biosurfactants. Journal of Applied Microbiology, v. 100, n. 3, p. 470–480, 2006. RYAN, C.S.; KLEINBERG, I. Bacteria in human mouths involved in the production and utilization of hydrogen peroxide. Archives of Oral Biology, v. 40, n. 8, p.753-63, 1995. SAHU, N.K.; BALBHADRA, S.S.; CHOUDHARY, J.; KOHLI, D.V. Exploring pharmacological significance of chalcone scaffold: a review. Current Medicinal Chemistry, v.19, p. 209-225, 2012. SAITO, S.T.; TRENTIN, D.S.; MACEDO, A.J.; PUNGARTNIK, C.; GOSMANN,G.; SILVEIRA, J.D.; GUECHEVA, T.N.; HENRIQUES, J.A.P.; BRENDEL, M. Bioguided fractionation shows Cassia alata extract to inhibit Staphylococcus epidermidis and Pseudomonas aeruginosa growth and biofilm formation. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, v. 2012, p. 13, 2012.

90

SANDBERG, M. E.; SCHELLMANN, D.; BRUNHOFER, G.; ERKER, T.; BUSYGIN, I.; LEINO, R.; VUORELA, P. M.; FALLARERO, A. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. Journal of Microbiological Methods, v. 78, p. 104-106, 2009. SAYEM, S.M.; MANZO, E.; CIAVATTA, L.; TRAMICE, A.; CORDONE, A. ; ZANFARDINO, A.; DE FELICE, M.; VARCAMONTI, M. Anti-biofilm activity of an exopolysaccharide from a sponge-associated strain of Bacillus licheniformis. Microbial Cell Factories, v. 10, p. 74, 2011. SIMÕES, M.; SIMÕES, C.; MACHADO, I.; PEREIRA, M. O.; VIEIRA, M. J. Control of flow-generated biofilms with surfactants: evidence of resistance and recovery. Institute of Chemical Engineers (AIChE), v. 84, p. 334-345, 2006. SIMÕES, M.; SIMÕES, L.C.; VIEIRA, M.J. A review of current emergent biofilm control strategies. Food Science and Technology, v. 43, p. 573-583, 2010. SIVAKUMAR, P.M.; PRABHAWATHI, V.; Doble, M. Antibacterial activity and QSAR of chalcones against biofilm-producing bacteria isolated from marine waters. AR and QSAR in Environmental Research, v. 21, p. 247-263, 2010. SIVAKUMAR, P.M.; PRABHAWATHI, V.; DOBLE, M. 2-Methoxy-2,4-dichloro chalcone as an antimicrofoulant against marine bacterial biofilm. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 81, p. 439-446, 2010a. SIVAKUMAR, P.M., IYER, G.; NATESAN, L.; DOBLE, M. 3′-Hydroxy-4-methoxychalcone as a potential antibacterial coating on polymeric biomaterials. Applied Surface Science, v. 256, p. 6018–6024, 2010b. SKOGMAN, M.E.; VUORELA, P.M.; FALLARERO, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. Journal of Antibiotics, v. 65, p. 453-459, 2012. STEPANOVIC, S.; VUKOVIC, D.; DAKIC, I.; SAVIC, B.; SVABIC-VLAHOVIC, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. Journal of Microbiological Methods, v.40, p. 175-179, 2000. STEWART, P. S.; FRANKLIN, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology, v. 6, n. 3, p. 199–210, 2008.

91

STOODLEY, P.; SAUER, K.; DAVIES, D.G.; COSTERTON, J.W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual Reviews in Microbiology, v. 56, p. 187-209, 2002. SUTHERLAND, I.W. The biofilm matrix-an immobilized but dynamic microbial environment. Trends in Microbiology, v. 9, p. 222-227, 2001. SUWITO, H.; KRISTANTI, A. N.; NYOMAN, N.; PUSPANINGSIH, T. Review Article Chalcones : Synthesis , structure diversity and pharmacological aspects. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, v. 6, n. 5, p. 1076–1088, 2014. TRAN,T.D.; NGUYEN,T.T.N.; DO, T.H.; HUYNH,T.N.P.; TRAN,C.D.; THAI,K.M. Synthesis and antibacterial activity of some heterocyclic chalcone analogues alone and in combination with antibiotics. Molecules, v. 17, p. 6684-6696, 2012. TOTÉ, K.; VANDEN BERGHE, D.; MAES, L.; COS, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Letters in Applied Microbiology, v. 46, p. 249-254, 2008. VANDEPUTTE, O.M.; KIENDREBEOGO, M.; RAJAONSON, S.; DIALLO, B.; MOL, A.; EL JAZIRI, M.; BAUCHER, M. Identification of catechin as one of the flavonoids from Combretum albiflorum bark extract that reduces the production of quorum-sensing-controlled virulence factors in Pseudomonas aeruginosa PAO1. Applied and Environmental Microbiology, v. 76, p. 243-253, 2010. VELOZ, J. J.; SAAVEDRA, N.; LILLO, A.; ALVEAR, M.; BARRIENTOS, L.; SALAZAR, L. A. Antibiofilm Activity of Chilean Propolis on Streptococcus mutans Is Influenced by the Year of Collection. BioMed Research International, p. 1–6, 2015. VERMA, P. Methods for determining bactericidal activity and antimicrobial interactions: synergy testing, time-kill curves, and population analysis. In SCHWALBE, R.; STEELE-MOORE, L.; GOODWIN, A. C. Antimicrobial Susceptibility Testing Protocols. Boca Raton: Taylor & Francis, 2007. p. 275-299. VICKERY, K.; NGO, Q. D.; ZOU, J.; COSSART, Y. E. The effect of multiple cycles of contamination, detergent washing, and disinfection on the development of biofilm in endoscope tubing. American Journal of Infection Control, v. 37, n. 6, p. 470–475, 2009. VOGLER, E.A. Structure and reactivity of water at biomaterial surfaces. Advances in Colloid and Interface Science, v. 74, p. 69-117, 1998.

92

WALLOCK-RICHARDS, D. J.; MARLES-WRIGHT, J.; CLARKE, D. J.; MAITRA, A.; DODDS, M.; HANLEY, B.; CAMPOPIANO, D. J. Molecular basis of Streptococcus mutans sortase A inhibition by the flavonoid natural product trans-chalcone. Chemical Communications, v.51, n. 52, p. 10483–10485, 2015. WORTHINGTON R.J.; RICHARDS, J.J.; MELANDER, C. Small molecule control of bacterial biofilms. Current Medicinal Chemistry, v.19, p. 209-225, 2012. YANTI, Y.; HWANG, J. Dual antibiofilm and antimetalloproteinase-9 activities of panduratin A in experimental periodontal disease models: a potent natural periodontotherapeutic. Planta Medica, v. 12, n. 76, p. 13, 2010. ZAMEER, F.; MS, R.; CHAUHAN, J. B.; KHANUM, S. A. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology, v. 8, n. 2, p. 108–119, 2016. ZERAIK, A. E.; NITSCHKE, M. Influence of growth media and temperature on bacterial adhesion to polystyrene surfaces. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 55, n. 4, p. 569–576, 2012.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Worthington%20RJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22733439

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Richards%20JJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22733439

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Melander%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22733439

marcio david bocelli estudo da atividade de chalconas no

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