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MARCELLE MARIE BUSO RAMOS
ATIVIDADE ANTICANDIDA E CITOTOXICIDADE DO ÓLEO
ESSENCIAL DE PSIDIUM CATTLEYANUM (ARAÇÁ-AMARELO).
Piracicaba
2017
Universidade Estadual de Campinas
Faculdade de Odontologia de Piracicaba
MARCELLE MARIE BUSO RAMOS
ATIVIDADE ANTICANDIDA E CITOTOXICIDADE DO ÓLEO
ESSENCIAL DE PSIDIUM CATTLEYANUM (ARAÇÁ-AMARELO).
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia
de Piracicaba da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos exigidos
para a obtenção do título de Doutora em Biologia
Buco-Dental, na Área de Microbiologia e
Imunologia.
Orientador: Prof. Dr. José Francisco Höfling
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÂO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
MARCELLE MARIE BUSO RAMOS, ORIENTADA
PELO PROF. DR. JOSÉ FRANCISCO HÖFLING.
Piracicaba
2017
EPÍGRAFE
“Porque Dele, e por meio Dele, e para Ele são todas as coisas.
A Ele, pois, a glória eternamente. Amém!”
Rom. 11: 36
“Não há acaso, sina, destino, que possa limitar, impedir ou controlar a firme
resolução de uma alma determinada”
Ella Wheeler Wilcox
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À Aquele que está acima de todas as coisas, Deus, que em sua infinita bondade
me concedeu o dom da vida, me protegeu e permitiu a superação de desafios,
me indicando sempre um caminho de Paz.
À minha família que amo muito, minha irmã Emmanuelle, meu cunhado André,
meu sobrinho João Paulo e meu pai Manoel, que suportam a distância e sem os
quais não poderia eu ter chegado onde estou. Muito obrigada!
Aos que a saudade é eterna e eterno será nosso reencontro: minha mãe Neusa,
minha irmã Michelle e meu avô João Buso. Morre a matéria mas o espírito vive.
Obrigada pela proteção e constante exemplo.
Ao companheiro e marido que aceitou o desafio de ser o par de uma
pesquisadora/professora, Marcos Rosse. Obrigada por sempre me apoiar na vida
da academia e suportar minha ausência! Obrigada pela paz, pelo seu amor tão
gratuito, pelos “puxões de orelha” que me tiram do computador. Quão bom é
compartilhar a vida com você!
Ao orientador e amigo José Francisco Höfling, por ter aceitado o desafio de me
orientar em um momento tempestuoso. Admiro sua coragem e conhecimento.
Obrigada pela confiança a mim dada, pelo incentivo científico e pelo crescimento
humano proporcionado, os quais me deram suporte para superar os obstáculos.
Obrigada por sempre se importar com o futuro de seus orientados!
AGRADECIMENTOS
À Universidade de Campinas- UNICAMP - Faculdade de Odontologia de Piracicaba
e ao Programa de Pós-graduação em Biologia Buco-Dental na pessoa de sua
coordenadora, Profa. Dra. Maria Beatriz Duarte Gavião, pela oportunidade de
realização do Curso de Doutorado em Biologia Buco-Dental, área de Microbiologia e
Imunologia.
À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP - Faculdade de
Odontologia de Araçatuba por minha formação e ao Laboratório de Microbiologia,
em particular aos exemplares Prof. Elerson Gaetti Jardim Júnior e Profª. Ana Cláudia
Okamoto pela confiança e parceria na doação das cepas clínicas utilizadas neste
estudo.
Ao Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas –
CPQBA/UNICAMP, na pessoa da Profª. Drª. Mary Ann Foglio, pela análise
cromatográfica do óleo essencial de P. cattleyanum.
Ao Prof. Jacks Jorge Júnior, obrigada pela disponibilidade, paciência e pelas
orientações na confecção do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) com a
implementação do Biorrepositório, assim como todos da equipe do CEP-FOP.
À equipe da Coordenadoria de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de
Piracicaba - UNICAMP, especialmente à coordenadora Profa. Cínthia Pereira
Machado Tabchoury e à funcionária Ana Paula Carone.
Aos professores membros efetivos da banda examinadora, José Francisco Höfling,
Elerson Gaetti Jardim Júnior, Marcelo Fabiano Gomes Boriollo, Priscilla de Laet
Sant'ana e Janaína de Cassia Orlandi Sardi, e aos membros suplentes Ana Cláudia
Okamoto, Natália Leal Vizoto e Karina Cogo Müller. Obrigada pela parceria
científica, disponibilidade e pelos preciosos ensinamentos e correções deste
trabalho.
Às amigas e pós-graduandas da área de Microbiologia e Imunologia, Simone Nataly
Busato de Feiria, Giovana Cláudia Boni e Thaís Oliveira Rossini, que vivenciaram de
perto meus momentos no doutorado, sempre me incentivando e me dando suporte.
Agradeço em especial à Simone, pelo sentimento de irmã de coração construído
neste período e que levarei para a vida toda!
Aos pós-graduandos e demais pesquisadores da Área de Microbiologia e Imunologia
pela amizade compartilhada durante o período de pós-graduação principalmente ao
Jeferson da Silva Júnior, Janaína Priscila Barbosa, Natália Leal Vizoto, Paula
Cristina Anibal, Lívia de Araújo Alves, Felipe Joia, Talita Graziano, Danielle Puppin,
Rodrigo Bassi e Prof. Rafael de Nobrega Stipp.
Aos amigos e técnicos do Laboratório de Microbiologia e Imunologia da Faculdade
de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP, Anderson Laerte Teixeira e Valéria
Franco, e à secretária da Área de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de
Odontologia de Piracicaba – UNICAMP, Ivete Ribeiro. Ao amigo e técnico do
Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Odontologia e Araçatuba - UNESP,
Robson Varlei Ranieri. Obrigada pelo companheirismo e suporte à pesquisa.
Aos tios queridos e participativos em meu crescimento Irani Buzzo e José Carlos
Vidotto, obrigada pelo apoio e incentivo de sempre!
Aos parentes amados que se acostumaram com a ausência mas que sempre
estão presentes: minha sogra Dirce e meu sogro Aristides, meus cunhados
Silvia, Wilson, Marcelo e Tamires, além de meus sobrinhos Lucas, Artur e Pedro.
Obrigada por todo o apoio!
Aos amigos que Deus preparou para convivermos como família em minha nova
morada: Adelaide, Paulo e Júlia; Keiti, Karen, Davi e Kléber; Noemia e Leones.
Obrigada por todos os momentos de descontração, pelo companheirismo, pelos
desabafos e pela amizade. Somos uma grande família!
À irmã na fé e mãe de coração Teresa Nunes, que juntamente com os demais
irmãos da Sã Doutrina Espiritual do Sétimo Dia de Rio Claro - SP e de Piracicaba
- SP, acolheram eu e meu esposo com um amor incondicional.
Ao cãozinho Bob, cuja a inocência e amor são sempre presentes. Até mesmo
nos momentos mais difíceis seu companheirismo é balsamo e sândalo para o
espírito.
À Microbiologia e à Imunologia, ciências apaixonantes que completam minha
existência e que situam minha função neste mundo.
À Odontologia que me ofereceu a base profissional e realização pessoal, além de
me dar oportunidade de exercer o amor ao próximo a cada paciente.
A CAPES e ao CNPq pela concessão de Bolsa de Estudo, suporte à pesquisa e
financiamento para participação em congressos.
À Prefeitura Municipal de Araçatuba, pela colaboração na localização da espécie
Psidium cattleyanum var. lucidum e por conceder a coleta de folhas para estudos
preliminares.
Aos pacientes envolvidos na pesquisa, mesmo que indiretamente, pela participação
e contribuição com o desenvolvimento da ciência.
E aos que de alguma forma contribuíram e me auxiliaram na realização dessa tese
de doutorado.
Minha sincera gratidão, hoje e sempre!
RESUMO
Psidium cattleyanum apresenta efeitos antibacterianos demonstrados na
literatura, porém pouco se sabe sobre sua ação antifúngica e citotóxica. O
objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antifúngica do óleo essencial de
folhas de Psidium cattleyanum var. lucidum Hort em cepas padrão de Candida
spp. e cepas clínicas de C. albicans, C. krusei e C. tropicalis. O óleo essencial
estudado foi caracterizado por Cromatografia Gasosa (CG) e sua concentração
inibitória mínima (CIM) foi determinada por microdiluição seriada (CLSI, 2008)
nas cepas padrão, espécimes clínicos e grupos controles, dos quais três
concentrações acima das CIMs foram plaqueadas para se obter a concentração
fungicida mínima (CFM). Os antifúngicos comerciais Nistatina e Fluconazol como
parâmetros de susceptibilidade para MIC e MFC. O óleo de P. cattleyanum foi
testado nos biofilmes de C. albicans SC5314 em formação e maduro e suas
respectivas viabilidades celulares foram obtidas pelo corante XTT e leitura em
Espectrofotômetro de Microplaca. Imagens dos biofilmes testados e tratados com
o óleo foram capturadas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A
atividade antiproliferativa do óleo em células HaCaT foi realizada. Todos os
ensaios foram feitos em três experimentos independentes. As análises
estatísticas foram feitas pelo teste ANOVA um critério, variação Dunnett. Os
compostos mais encontrados pela CG foram 1,4 - cineol (33,19%), tricicleno
(27,05%) e o cariophileno (18,94%). P. cattleyanum apresentou CIMs nas cepas
padrão de C. albicans 90028 e C. albicans SC5314 de 16 mg/ml e 8 mg/ml,
respectivamente, porém em C. albicans 562 apresentou CIM de 8 mg/ml e CFM
de 16 mg/ml. Nas demais espécies padrão, com exceção de C. lusitaniae 06 com
CIM e CFM de 4 mg/ml, o óleo apresentou as CFMs superiores às CIMs. Nas
cepas clínicas P. cattleyanum apresentou em C. albicans CIM e CFM de
16mg/ml, enquanto que em C. krusei e C. tropicalis as CIMs foram de 8 mg/ml e
as CFMs de 16 mg/ml. As concentrações de CIMs para o antifúngico Nistatina
variaram nas cepas padrão entre 0,5 a 8 µg/ml e apresentou CFMs entre 4 e 8
µg/ml, enquanto que nas cepas clínicas as CIMs foram de 2 a 4 µg/ml e as CFMs
de 4 a 8 µg/ml. Nos testes com o Fluconazol as CIMs nas cepas padrão foram
0,03125 a 2 µg/ml, enquanto nos espécimes clínicos as CIMs foram de 0,03125
a 0,5 µg/ml. P. cattleyanum mostrou ação antibiofilme no biofilme em formação de
C. albicans melhor a 0,250 mg/ml com 9,5% de viabilidade celular (p<0,01)
enquanto que, no biofilme maduro, P. cattleyanum apresentou a 1 mg/ml com
viabilidade celular de 18,9% (p<0,01). O MEV revelou nos biofilmes testados de C.
albicans desestruturação do biofilme, diminuição da densidade de hifas, morfologia
anormal de hifas e, no biofilme em formação, rupturas do envelope celular. A
atividade antiproliferativa de P. cattleyanum não apresentou IC50 nas HaCat em
todas concentrações, sugerindo baixa citotoxicidade. P. cattleyanum é
biologicamente ativo contra as Candida spp. e apresenta atividade antifúngica,
antibiofilme de Candida e baixa citotoxicidade, constituindo assim um potencial
agente antimicrobiano de uso clínico.
Palavras-chave: Candida; Antifúngicos; Plantas Medicinais; Psidium cattleyanum.
ABSTRACT
The antibacterial effects of Psidium cattleyanum are widely described; however,
few investigations characterize its antifungal and cytotoxic action. The aim of this
study was to verify the antifungal activity of the essential oil from leaves of
Psidium cattleyanum var. lucidum Hort against Candida spp. Gas
Chromatography (GC) characterized the essential oil and the its minimum
inhibitory concentration (MIC) was determined by serial microdilution (CLSI,
2008) in the standard strains, clinical specimens and control. Oil concentrations
above the MICs were plated to obtain minimum fungicidal concentration (MFC).
Nystatin and Fluconazole were used to check the fungal susceptibility for MIC
and MFC. The essential oil of P. cattleyanum was tested on early and mature C.
albicans SC5314 biofilms stained with XTT; their cellular viability was determined
using Reader Microplate Spectrophotometer. Early and mature biofilms images
were captured by Scanning Electron Microscopy (SEM). The anti-proliferative
activity of the oil in HaCaT cells was tested. Data were submitted to one-way
ANOVA test, Dunnett variation. The most prevalent compounds (GC) were 1,4-
cineole (33.19%), tricyclene (27.05%) and cariophilene (18.94%). In the standard
strains, P. cattleyanum presented MICs of 16 mg/mL and 8 mg/mL for C. albicans
90028 and C. albicans SC5314, respectively. C. albicans 562 showed a MIC of 8
mg/mL and MFC of 16 mg/mL. The others standard species, except C. lusitaniae
06, showed MFC values above those of MIC. In clinical specimens, P.
cattleyanum presented a MIC and MFC of 16 mg/mL for C. albicans, whereas C.
krusei and C. tropicalis showed a MIC of 8 mg/mL and MFC of 16 mg/mL. In the
standard strains, the MIC and MFC for Nystatin varied from 0.5 to 8 μg/mL and 4
to 8 μg/mL, respectively, while in the clinical specimens, the MIC ranged from 2
to 4 μg/mL and the MFC from 4 to 8 μg/mL. In the standard strains, Fluconazole
showed MIC values between 0.03125 μg/mL and 2 μg/mL, while the clinical
specimens showed MICs between 0.03125 μg/mL and 0.5 μg/mL. P. cattleyanum
oil at 0.250 mg/mL showed the best antibiofilm activity for C. albicans with 9.5%
cell viability (p <0.01) in the early biofilm. In the mature biofilm, P. cattleyanum oil
at 1 mg/mL disrupted the biofilm structure, with cell viability of 18.9% (p <0.01). In
early and mature biofilms of C. albicans, SEM revealed biofilm disorganization,
reduction in hyphae density, abnormal morphology of the hyphae, and, in early
biofilms, ruptures in the cell wall. The oil anti-proliferative assay on HaCat cells
showed low cytotoxicity. P. cattleyanum oil has antifungal and anti-biofilm activity
against Candida spp. and could be used as a potential clinical antimicrobial
agent.
Keywords: Candida; Antifungics; Medicinal Plants; Psidium cattleyanum.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS - Acquired Immunodeficiency Syndrome
ATC – Ácido Triclocoacético
CBS - Centraal Bureau voor Schimmelcutures
CDC - E.U.A - Centers for Disease Control and Prevention – Estados Unidos da América
CEP – Comitê de Ética em Pesquisa
CFM - Concentração Fungicida Mínima
CG/EM - Cromatografia Gasosa com Espectrometria De Massas
CiBio – Comitê Interno de Biossegurança
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLSI - Clinical Laboratorial Standart Investigation
CPQBA - Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas
DMSO - Dimetil sulfóxido
DO - Densidade Óptica
ECM – Extracellular Matriz
ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay
h - horas
HIV - Human Immunodeficiency Virus
IZ - Instituto Zimotécnico-ESALQ/USP
KPC – Klebsiella pneumoniae resistente a Carbapenemicos
LSD - Dietilamida do Ácido Lisérgico
MEC – Matriz Extracelular
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
mg - miligramas
ml – mililitros
MRSA – Staphilococcus aureus resistente a Meticilina
OE – Óleo essencial
OMS – Organização Mundial da Saúde
PBS - Phosphate Buffered Saline
PGA – Fosfoglicerato
PMA - Polimetilmetacrilato
RMS - Reader Microplate Spectrophotometer
RPMI–1640 - Meio de cultura desenvolvido por Roswell Park Memorial Institute
SAP - Secreted Aspartyl Proteinase
SDA - Sabouraud Dextrose Agar
SEM - Scanning Electron Microscopy
SFB - Soro Fetal Bovino
SIDA - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
SRB - Sulforrodamina B
TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
µg – microgramas
var. – variedade
VRSA – Staphilococcus aureus resistente a Vancomicina
WHO – World Healthy Organization
XTT - 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide
YPD - Yeast Peptone Dextrose
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Araçá-amarelo (Psidium cattlyanum var. lucidum). 24
Figura 2 - Esquema de Formação de biofilme por Candida spp. 35
Gráfico 1 - Viabilidade celular do biofilme em formação de C. albicans SC5314
tratados com óleo essencial de P. cattleyanum. 48
Gráfico 2 - Viabilidade celular do biofilme maduro de C. albicans SC5314
tratados com óleo essencial de P. cattleyanum. 49
Figura 3 - Imagens de M.E.V. do biofilme em formação de C. albicans SC5314
tratados com óleo essencial de P. cattleyanum. 50
Figura 4 - Imagens de M.E.V. do biofilme maduro de C. albicans SC5314
tratados com óleo essencial de P. cattleyanum. 51
Gráfico 3 - Atividade antiproliferativa do óleo essencial de P. cattleyanum em
células HaCat. 52
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Compostos do óleo essencial de Psidium cattleyanum identificados por
CG/EM. 46
Tabela 2 - Concentração mínima inibitória e concentração fungicida mínima do óleo
essencial de P. cattleyanum, Nistatina e Fluconazol em Candida spp. 47
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 20
2 REVISÃO DA LITERATURA 23
3 PROPOSIÇÃO 36
4 MATERIAL E MÉTODOS 37
5 RESULTADOS 46
6 DISCUSSÃO 53
7 CONCLUSÃO 59
REFERÊNCIAS 60
ANEXOS 70
ANEXO 1 – Comitê de Ética Em Pesquisa – FOP/UNICAMP. 70
ANEXO 2– Declaração de Autorização para Uso de Cepas de Microrganismos
– FOA/UNESP. 75
ANEXO 3 - Picos cromatográficos (CG/EM) do óleo essencial de Psidium
cattleyanum var. lucidum. 76
ANEXO 4 - Compostos, Índices de Retenção e suas porcentagens identificados
no óleo essencial de Psidium cattleyanum através de Cromatografia Gasosa em
aparelho com Espectrometria de Massas (CG/EM). 77
20
1 INTRODUÇÃO
Os efeitos das plantas medicinais no tratamento de doenças/infeções
são culturalmente apreciados e aplicados por diversas civilizações. A vasta
biodiversidade de espécies e os diferentes biomas pertencentes ao território
brasileiro transforma o Brasil em um verdadeiro celeiro de plantas medicinais
que, associadas a uma rica diversidade étnico-cultural, compõem um valioso
conhecimento tradicional e popular do uso das plantas medicinais (Bakkali et al.,
2008).
A Organização Mundial da Saúde (OMS), desde 1979, incentiva que
seus países membros estabeleçam políticas públicas para o desenvolvimento da
chamada medicina tradicional incentivando o uso de plantas medicinais
localmente e popularmente utilizadas na atenção à saúde primária e preventiva
(WHO,1079a). Em 2002, um novo documento da OMS relata que um terço da
população mundial não tem acesso periódico a medicamentos essenciais, sendo
necessário que se invista na medicina tradicional como forma de ajudar a
melhorar o status sanitário, reafirmando a necessidade do emprego das plantas
medicinais na atenção básica à saúde (WHO, 2002b).
As plantas medicinais culturalmente associadas à um efeito curativo ou
paliativo são estudas pela etnobotânica, que trabalha em estreita cumplicidade com
a etnofarmacologia, a qual consiste na exploração científica de compostos e agentes
biologicamente ativos, tradicionalmente empregados ou observados pelo homem
(Amoroso, 1996). Estudos envolvendo a investigação de princípios oriundos de
plantas medicinais popularmente empregadas avançaram nas últimas décadas
na tentativa de se caracterizar cientificamente os possíveis efeitos benéficos e
efeitos colaterais, bem como a determinação de uma dose de uso segura de
produtos derivados das plantas medicinais (Bakkali et al., 2008).
Dentre as famílias de plantas com propriedades medicinais, destaca-
se a família Myrtaceae, cujo gênero Psidium agrega espécies frutíferas
populares com efeitos medicinais como a Psidium guajava, a popular goiaba.
Contudo, a espécie Psidium cattleyanum, conhecido como Araçá-amarelo, vem
21
sendo estudada nas últimas décadas por deter efeitos medicinais analgésicos
(Alvarenga et al., 2013), antiproliferativos (Medina et al., 2011; Jun et al., 2011;
Faleiro et al., 2016), antioxidantes (Medina et al., 2011; Faleiro et al., 2016),
anticâncer (Faleiro et al., 2016) e antimicrobianos (Brighenti et al., 2012). Na
medicina popular P. cattleyanum é conhecido por sua atuação frente a diabetes,
dores de barriga, doenças das vias urinárias e diarréia, onde recomenda-se o
uso de brotos, folhas e a casca do tronco (Vendruscolo e Mentz 2006) (Boscolo e
Senna Valle, 2008).
O aumento das investigações sobre a ação de plantas medicinais como
agente antimicrobianos está altamente relacionado com o surgimento das chamadas
superbactérias da família Enterobacteriaceae resistentes a Carbapenemicos
(Klebsiella pneumoniae - KPC) e a ocorrência de infecções por Staphylococcus
aureus resistentes a Meticilina/Vancomicina (MRSA/VRSA) (Hiramatsu, 2001) A
multirresistência à drogas apresentadas por essas superbactérias marcam o início
da era Pós-antibiótica no mundo, onde a escassez de fármacos eficazes e o
aumento da resistência aos antimicrobianos existentes no mercado levou a indústria
farmacêutica a pesquisar novas fontes de moléculas antimicrobianas (CARS, et al.,
2013). Em microrganismos eucariotos, o surgimento de resistência aos
antifúngicos por espécies de Candida é relacionado com a prescrição de altas
doses de antifúngicos (Johnson et al., 1995) e pela administração de
antifúngicos por longos períodos de internação do paciente (Ruhnke et al.,
2000).
Espécies do gênero Candida, principalmente Candida albicans, estão
presentes na boca, estômago e intestino de maneira comensal e oportunamente
causam a Candidose quando o hospedeiro demostra debilidade imunológica
associada ou não ao tratamento de uma doença base. (Nobile & Johnson, 2015).
Modificações ambientais na boca podem também favorecer a proliferação e
estabelecimento das Candidoses. Pacientes portadores de próteses bucais totais
e parciais são propícios a desenvolverem Candidose bucal, pois a idade e baixa
imunidade dos pacientes usuários de prótese aliada a uma má higienização da
prótese/boca passam a favorecer a proliferação fúngica, tornando as próteses
bucais verdadeiros reservatórios de fungos (Barbeau et al., 2003)
22
Em pacientes portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
(SIDA) não medicados por antirretrovirais é frequente a ocorrência da
Candidíase Pseudomembranosa, sendo este um estabelecido sinal clínico
indicativo do estágio avançado de imunocomprometimento e alta carga viral do
paciente soro positivo (Cavassani et al., 2002). Outra parcela de pacientes
imunologicamente debilitados susceptíveis a desenvolveram Candidíase se
encontra entre pacientes hospitalizados, os quais recebem a administração de
agentes polienos (nistatina e anfotericina B) e de triazóis (fluconazol) na forma
tópica, por via oral e até mesmo endovenosa. Contudo, em pacientes
hospitalizados já foram relatados o isolamento de cepas do gênero Candida
resistentes ao fluconazol (Ruhnke et al., 2000).
Neste cenário, a utilização de plantas medicinais com efeitos
popularmente conhecidos para tratamento de infecções passou a ganhar
protagonismo em estudos que envolvam extratos e óleos essenciais extraídos de
plantas medicinais, na tentativa da descoberta e aplicação de novas moléculas
antimicrobianas e/ou moléculas coadjuvantes aos antimicrobianos existentes no
mercado (Gibbons, et al, 2005).
Os efeitos antimicrobianos da folha de Araçá-amarelo (Psidium
cattleyanum var. lucindum Hort) recentemente foram avaliados por Gaetti-Jardim
et al (2009) e Brighenti et al (2008 e 2012), os quais demonstraram, em estudos
“in vitro”, a ação antibacteriana dos extratos aquoso e hidroalcoólico de folhas de
Araçá-amarelo contra microrganismos orais. Entretanto, estudos envolvendo a
susceptibilidade de microrganismos orais, principalmente do gênero Candida, ao
óleo essencial extraído das folhas de Psidium cattleyanum var. lucindum Hort
(Araçá-amarelo), bem como estudos que contemplem a indicação dos compostos
químicos que possam estar relacionados com a ação antimicrobiana oriundos
desse óleo essencial se encontram em escassez na literatura, necessitando de
maiores caraterizações da ação antifúngica deste óleo essencial sobre a biologia
do gênero Candida e sua possível citotoxicidade celular sobre o indivíduo.
23
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Origem e efeitos medicinais do Psidium cattleyanum (Araçá-amarelo).
O gênero Psidium tem sua distribuição nativa percorrendo o sul do
México até a Argentina, incluindo as Ilhas do Caribe e os arquipélagos de
Galápagos e Revillagigedo ao longo do Oceano Pacífico. Fruto do sucesso
adaptativo do gênero em variados habitats, a diversidade de espécies de
Psidium se apresenta em centros geográficos que se estendem das Ilhas de
Cuba e Hispaniola passando pelo norte da América do Sul (Peru, Venezuela e
Guianas) até chegar ao Sul do Brasil e Paraguai, caracterizando assim o gênero
como Neotropical (Frazon et al., 2009).
Pertencente à família das Myrtaceae (que inclui Eugenia, Acca e
Myrciaria), o gênero Psidium apresenta espécies frutíferas de importância
comercial como a goiabeira (Psidium guajava) e os araçás ou araçazeiros
(Psidium cattleyanum e Psidium guineense). O nome araçá vem do tupi ara’as,
ou do guarani ara (céu) e aza (olho), que significa fruta com olhos ou olhos
voltados ao céu, característica que remete ao formato do fruto (Foto 1)
(Biegelmeyer et al.,2011).
O Psidium cattleyanum apresenta frutos de cor amarela ou vermelha
(Correa, 1926), porém alguns autores o descreve como produtora de frutos
somente amarelos (Mattos, 1978). Em recente estudo, Rocha et al., 2008,
demonstrou diferenças estruturais na organização do caule da planta definindo
assim duas variedades botânicas (dois táxons) a serem consideradas: o Psidium
cattleyanum variedade cattleyanum como produtora de frutos vermelhos e
Psidium cattleyanum var. lucidum como produtora de frutos amarelos
(Biegelmeyer et al.,2011).
24
Figura 1: Araçá-amarelo, P. catteyanum var. lucidum.
Fonte: http://www.floriculturaursula.com.br/
Em ambas as variedades, a floração estende-se de setembro a março,
podendo entrar em até três períodos de floração dependendo da região em que
se encontra (quanto menos rigoroso o outono, maior possibilidade da terceira
floração e frutificação). As flores hermafroditas apresentam coloração branca e
as folhas são simples e opostas, de superfície lisa e brilhosa (Frazon et al.,
2009).
Dentre as propriedades medicinais, o Araçá é uma fruta rica em
minerais como o cálcio, o ferro e o fósforo. Possui ainda um alto teor de
vitaminas A, B, C, antioxidantes, carboidratos e proteínas, sendo indicado para
tratamentos contra a gripe e resfriados (Wille et al., 2004). É uma fruta
mucilaginosa e adstringente, constituídas por compostos bioativos, como
carotenoides e antocianinas (Fetter et al., 2010).
Devido aos seus minerais e propriedades medicinais, plantas de
Psidium spp. são utilizadas pela medicina popular como anti-hemorrágica e anti-
inflamatória na China, para o tratamento de escorbuto na Ásia e África, para
tratamento de tosse e doenças pulmonares na Bolívia e Egito, como calmante e
antidiarreico no México (Lozoya, et al., 1994) (Jaiarj et al., 1999) e para doenças
gastrointestinais no Brasil (Giraldi & a Hanazaki, 2010).
25
2.2 Constituição fitoquímica e ação antimicrobiana do Psidium cattleyanum.
As plantas medicinais são consideradas úteis na cura e prevenção de
uma grande parcela de doenças, principalmente as infecciosas, por conter uma fonte
rica de agentes antimicrobianos em sua composição (Holetz et al., 2002). Devido a
um aumento rápido da taxa de infecções, aumento da resistência aos antibióticos
por microrganismos antes susceptíveis e os efeitos secundários dos antibióticos
sintéticos, as plantas medicinais estão ganhando popularidade como precursoras de
compostos bioativos em medicamentos nas diversas áreas da saúde (Smullen, et
al., 2007) (Jebashree et al., 2011).
Os recursos vegetais para fins medicinais é usado em todas as
civilizações e culturas e, portanto, as plantas têm desempenhado um papel
fundamental nos sistemas de saúde em todo o mundo. Na Odontologia, por
exemplo, é comum o emprego de compostos bioativos como a Benzoína derivada
da planta Estoraque (Styrax tonkinensis) que exibe ação desinfetante em cremes
dentais e do Eugenol que é derivado do Cravo-da-india (Syzygium aromaticum) e
comumente utilizado no dia a dia na prática clínica juntamente com o Óxido de Zinco
no capeamento pulpar, na obturação temporária de cavidades, na cimentação
provisória de peças protéticas, como cimento cirúrgico e para aliviar a dor (Kabra et
al., 2012).
Os compostos bioativos secundários em plantas são oriundos do
metabolismo secundário, o qual não está envolvido nas vias metabólicas essenciais
para a vida da planta, porém desempenham o papel de defesa nas plantas, ou seja,
são metabólitos secundários que constituem um meio de defesa contra bactérias,
fungos, vírus, estresse ambiental e ataque de herbívoros (Müller et al., 2012), além
de participarem na atração de agentes polinizadores. Estes compostos bioativos
secundários se dividem basicamente em três tipos: terpenos, compostos fenólicos e
alcaloides os quais são oriundos do metabolismo do Piruvato 3PGA e da Via do
Mevalonato, da Via do Mevalonato e Via do Ácido Chiquímico, e da Via do Ácido
Chiquímico, respectivamente (Simões et al, 2004).
Os compostos fenólicos são os maiores responsáveis pela atividade
antioxidante em frutos, fazendo destes uma fonte natural de antioxidantes. Estes
26
compostos são substratos para enzimas responsáveis pelo escurecimento dos
vegetais frescos e alimentos processados. Suas moléculas possuem ao menos um
grupo hidroxila ligado diretamente a um anel aromático, podendo formar compostos
fenólicos simples até estruturas mais complexas. Esse grupo compreende os
flavonoides, ácidos fenólicos, estilbenos e polifenóis (Angelo e Jorge, 2007). Em
relação a atividade antimicrobiana, os compostos fenólicos atuam na degradação da
parede celular bacteriana, danos à membrana citoplasmática, extravasamento de
material celular, coagulação do citoplasma e à desregulação do sistema de
transporte de íons e elétrons no sistema membranário, sendo que o rompimento da
membrana citoplasmática leva a saída de elementos vitais e a entrada de
substâncias nocivas a célula bacteriana (Burt, 2004) (Tavares, 1999).
Os compostos secundários alcalóides são compostos orgânicos que
apresentam um átomo de Nitrogênio em seu anel e exibem um caráter alcalino, com
excessão da colchinina. São famosos pela presença de atividade sobre o Sistema
Nervoso Central, sendo utilizados desde a antiguidade como venenos e
alucinógenos, e dos dias atuais, de forma benéfica (como a cafeína e morfina) e de
forma maléfica (cocaína e base para drogas sintéticas como LSD) (Simões et al.,
2004).
Nos óleos essenciais, o grupo de compostos com atividades medicinais
encontrados são os terpenóides. Os óleos essenciais, ou essências são princípios
aromáticos encontrados em diferentes órgãos vegetais. Por evaporarem quando
expostos ao ar em temperatura ambiente, são também chamados óleos voláteis ou
óleos etéreos e esta característica é que confere o odor característico dos vegetais,
tanto para atração dos polinizadores como repelente de insetos e herbívoros.
Quimicamente, são misturas de diversos compostos, os quais podem ser divididos
em dois grandes grupos: os derivados terpênicos (mentol e citronelol) e os derivados
do fenilpropano (anetol e eugenol). As principais características farmacológicas dos
terpenos nos óleos essenciais estão relacionadas ao emprego como antisséptico,
anti-inflamatório e antipirético (Simões, et al., 2004).
Os terpenóides mais encontrados em óleos esseciais são os
monoterpenos e os sesquiterpenos. Segundo Zore et al, 2011, os mecanismos
antimicrobianos apresentados pelos compostos terpenóides envolvem a fluidificação
27
da membrana, desestabilização das proteínas de ligação à membrana envolvidas
em sinalização e ancoragem, estacionamento do ciclo celular e consequente
apoptose, porém estudos mais aprofundados devem ser realizados para se
caracterizar detalhadamente esses mecanismos.
Os principais substratos das plantas utilizados para a obtenção do óleo
essencial e de extratos alcoólicos e hidroalcoólicos são as folhas, fruto, casca,
caules, raízes/tubérculos e flores. Na família das Myrtaceae, o óleo essencial está
geralmente concentrado nas folhas, tornando-as alvo principal da técnica de
hidrodestilação para obtenção do óleo essencial (Siani et al., 2000).
Em 2007, Paroul et al. identificaram por Cromatografia Gasosa acoplada
à Espectrometria de Massas (CG/EM) como principais componentes do óleo
essencial de folhas de Psidium cattleyanum (Araçá-Amarelo) os compostos
pertencentes aos grupos funcionais de sesquiterpenos (63%), sesquiterpenos
oxigenados (15,1%) e monoterpenos oxigenados (12,5%), sendo que, dentre as 25
substâncias identificadas, as marjoritárias foram o 1,8-cineol e o trans-cariofileno
com 11,9% e 20,2%, respectivamente.
No trabalho de Marques et al. (2011), a comparação da composição do
óleo essencial de folhas de P. cattleyanum oriundas de Cuba com a variante do
Brasil demonstraram diferenças de composição através da análise por CG/EM. Na
variante brasileira, foram obtidos 33 componentes que correspondiam a 96,9% do
óleo. Os principais constituintes do óleo essencial foram α-thujene (25,2%), seguido
pelo 1,8-cineole (16,4%) e β-caryophyllene (10,2%). Em contrapartida, a variante
cubana apresentava diferentes compostos, sendo Epi-α-muurolol (21,9%) o mais
abundantes, seguido por α-cadinol (20%) e Epi-α-cadinol (16,7%). Portanto, fica
evidente que P. cattleyanum produz diferentes metabólitos voláteis em resposta a
diferentes caraterísticas físicas e atmosféricas de cada tipo de ecossistema, região
de crescimento e período do ano que foram feitas as coletas.
Na literatura, P. cattleyanum teve seu óleo essencial estudado quanto a
sua propriedade antimicrobiana não apresentando os efeitos desejados, no entanto,
o extrato produzido com acetato de etila apresentou ação moderada contra bactérias
Gram positivas com CIM igual a 62,5 μg/ml (Desoti et al., 2011) (Prestes et al.,
28
2011). Estes resultados opostos podem estar relacionados com o método extrativo e
o solvente utilizado no processo, já que os autores utilizaram solventes e métodos
extrativos distintos, o que pode ter influenciado no isolamento dos compostos
bioativos e na determinação das propriedades dos vegetais (KOBA et al., 2007).
Alterações climáticas, temporais ou ambientais como sazonalidade,
desenvolvimento, altitude, ritmo circadiano, temperatura, disponibilidade hídrica,
nutrientes, radiação ultravioleta, poluição atmosférica e ataque de patógenos são
alguns fatores que podem modificar a produção de compostos bioativos e influenciar
na resposta esperada, produzindo assim uma diversidade de resultados observados
nos estudos conduzidos por outros pesquisadores (Gobbo-Neto e Lopes, 2007).
2.3 Características do gênero e infecções oportunistas por Candida spp.
As infecções bucais costumam ter caráter multimicrobiano devido a
cavidade bucal albergar uma ampla variedade de microrganismos comensais e
transitórios em variados habitats ecológicos com diferentes desafios ambientais
limitantes (atmosfera, pH, agentes oxidantes, imunoglobulina e saliva), os quais
exercem uma pressão seletiva das espécies nos diferentes habitats bucais
(Jenkinson & Lamont, 2005). Espécies altamente adaptadas colonizam as
superfícies de dentes, mucosas, dorso da língua e sulco gengival causando
infecções bacterianas como a Cárie, Doença Periodontal, bem como infecções
fúngicas oportunistas causadas principalmente por fungos do gênero Candida
(Ghannoum et al., 2010).
As 200 espécies do gênero Candida pertencem ao Reino Fungi,
divisão Eumycota, subdivisão Deuteromycotina, classe Blastomycetes e família
Cryptococcaceae, embora algumas espécies estejam agrupadas na subdivisão
Ascomycotina. O gênero Candida compreende microrganismos eucarióticos não
produtores de pigmentos fotossintetizantes que possuem envoltório celular rígido
formado pela parede celular composta por quitina e membrana plasmática
fosfolipídica contendo esteróis, com predomínio do ergosterol (Santana et al.,
2013).
29
As Candida spp. utilizam como fonte nutricional a degradação de
proteínas e carboidratos para a captação de Carbono e Nitrogênio provenientes
dos mais variados ecossistemas que o gênero pode habitar, como o solo,
alimentos, água, superfícies abióticas, além de fazer parte da microbiota da pele
e mucosas de homens e animais. São microrganismos comensais, que habitam
primariamente o trato gastrointestinal, fazendo parte também da microbiota
vaginal, da uretra e dos pulmões (Santana, et al., 2013).
As espécies de Candida fazem parte da microbiota comensal nas
superfícies das mucosas e pele de seres humanos e apenas 10% destas
leveduras são reconhecidas como agentes etiológicos em infecções humanas
(Alonso-Valle et al., 2003). Atualmente estima-se que de 20 a 50% da população
alberga microrganismos do gênero Candida na cavidade bucal, sendo C.
albicans identificada entre 60 a 90% dos isolamentos, C. tropicalis cerca de 7%,
outras espécies como C. krusei, C. guillermondii, C. glabrata e C. parapsilosis
são evidenciadas em menor frequência (Valle et al., 2010).
Candida spp. colonizam a superfícies de mucosas e pele de maneira
comensal, contudo podem se tornar patogênicas caso ocorra um desequilíbrio
em sua relação com o hospedeiro, por isso são consideradas oportunistas sendo
responsáveis por 80% dos casos de infecção fúngica sistêmica (Candidemias).
Essa modificação do perfil patogênico do gênero Candida ocorre devido ao
comprometimento dos mecanismos de defesa do hospedeiro (extremos de idade,
doença de base, imunossupressão) ou rompimento das barreiras anatômicas,
como queimaduras, cateteres ou cirurgias invasivas (Calderone et al., 2001).
Candida albicans é a espécie de maior relevância em função da sua
prevalência tanto em hospedeiros hígidos como aqueles com algum
comprometimento imune (Valle et al., 2010). C. albicans é uma levedura
comensal facilmente encontrada na mucosa bucal, trato gastrointestinal, trato
urogenital e pele de seres humanos desde o nascimento, mas em circunstâncias
excepcionais quando ocorre uma ruptura do equilíbrio biológico devido a fatores
predisponentes - patológicos, fisiológicos, imunológicos e mecânicos – pode
haver um aumento na multiplicação e invasão dos tecidos por estes
30
microrganismos, ocasionando infecções denominadas candidoses (Vandeputte et
al., 2012).
Em infecções fúngicas provocadas por Candida, a identificação de sua
espécie é essencial, uma vez que a patogenicidade e o perfil de sensibilidade a
um determinado antifúngico são variáveis entre as diferentes espécies. Apesar
de a Candida albicans ser a espécie mais comumente isolada nas infecções
superficiais ou invasivas, a incidência de infecções provocadas por Candida não-
albicans é crescente e, em alguns casos, associada a altas taxas de mortalidade
(Urizar et al., 2002). Estudos recentes apontam as espécies de C. tropicalis, C.
parapsilosis, C. glabrata e C. krusei como as espécies não-albicans mais
frequentes em processos infecciosos (Valle et al., 2010) (Urizar et al., 2002).
Nos últimos 10 anos, alguns estudos relataram uma mudança na
etiologia das candidemias. Enquanto C. albicans ainda é considerada a espécie
mais comum causando candidemia, taxas crescentes de candidemias causadas
por C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C. krusei têm sido relatadas em
todo o mundo. As razões para o aumento de infeções por espécies não-albicans
não são completamente compreendidas, mas algumas condições médicas
podem impactar de forma consistente o risco de desenvolver candidemia por
espécies não-albicans. A fungemia por C. parapsilosis tem sido associada com
cateteres vasculares e nutrição parenteral, a candidemia por C. tropicalis está
associada ao câncer e neutropenia, e as fungemias de C. krusei e C. glabrata
estão associadas à exposição prévia a azóis (Hinrichsen et al., 2008).
A Vigilância e Controle Brasileiro de Patógenos de Importância
Epidemiológica (BrSCOPE) realizou um estudo multicêntrico de vigilância em 16
hospitais distribuídos em cinco regiões do Brasil para avaliar a incidência,
distribuição de espécies de Candida, susceptibilidade antifúngica e fatores de risco
para infecções de corrente sanguínea. De junho de 2007 a março de 2010, foram
um total de 2.563 episódios de infecção nosocomial da corrente sanguínea. Candida
spp. foi o sétimo agente mais prevalente na maioria dos pacientes que,
marjoritariamente, eram do sexo masculino, com idade média de 56 anos, sendo
que um total de 64 pacientes (46,7%) já estavam na UTI quando ocorreu a
candidemia. As espécies não-albicans de Candida foram prevalentes em 65,7% dos
31
137 isolados de levedura, sendo Candida parapsilosis (24,1%), Candida tropicalis
(15,3%) e Candida glabrata (10,2%) as espécies mais encontradas. Contudo, C.
albicans (34,3%) ainda é a leverua mais prevalente isoladas. Apenas 47 dos 137
isolados de Candida foram enviados ao laboratório de referência para o teste de
sensibilidade aos antifúngicos. Todos os isolados de C. albicans, C. tropicalis e C.
parapsilosis foram suscetíveis aos 4 antifungicos testados (anfotericina B,
fluconazol, variconazol e anidulafungina). Entre os 11 isolados de C. glabrata, 36%
eram resistentes ao fluconazol e 64% sucesptíveis dose dependente, sendo que
todos foram suscetíveis à anidulafungina e à anfotericina B, assim C. glabrata está
emergindo como um importante fungo entre as Candida spp não-albicans e é
preocupante sua resistência ao fluconazol, assim como apresentada por C. krusei. A
resistência de Candida spp. as equinocandinas e anfotericina B ainda permanece
rara no Brasil (Doi et al., 2016)
2.4 Patogenicidade e fatores de virulência de Candida albicans.
C. albicans é um dos microrganismos mais frequentemente
identificados em infecções nosocomiais devido sua capacidade de invadir
variados locais do hospedeiro humano, desde tecidos e órgãos profundos até
locais superficiais (Verstrepen, et al.,2004). Mais significativamente, a C.
albicans é capaz de aderir-se a cateteres, próteses bucais e implantes médicos
internos, sendo atualmente classificada pelo Centers for Disease Control and
Prevention – CDC/E.U.A. como o terceiro patógeno mais comumente isolado em
pacientes hospitalizados com uma taxa de mortalidade de até 50% (Mathé e Van
Dijck 2013).
A levedura C. albicans apresenta ótima adaptação ao corpo humano
podendo colonizá-lo comensalmente sem produzir sinais de doença. Este
equilíbrio entre C. albicans e o hospedeiro é propiciada pela manutenção da
integridade das barreiras teciduais, pela relação harmônica com a microbiota
autóctone e pelo funcionamento adequado do sistema imunológico humano. Por
ser um fungo pleomórfico, a capacidade de transição de C. albicans de comensal
para sua forma patogênica é diretamente relacionada à sua aptidão de realizar a
32
mudança morfológica de levedura para sua forma invasiva com a formação de hifas
(Tsui et al., 2016).
As células de Candida albicans possuem a parede celular composta
de aproximadamente 80 a 90% de polissacarídios de glicose (Glucanos) com
ramificações e ligações β-1,6 e β-1,3. Moléculas de N-acetil-D-glicosamina
ligadas a quitina contendo ligações β-1,4 e polímeros de manose ligados
covalentemente as manoproteínas, também são encontradas na composição
desta estrutura, além de proteínas (6 a 25%) e pequenas quantidades de
lipídios. Sabe-se que o arranjo molecular está disposto em camadas, entretanto,
ainda não há consenso sobre a quantidade de camadas existentes (Verstrepen
et al., 2004).
Os fatores de virulência das Candida spp. propiciam o sucesso no
estabelecimento de Candidoses e Candidemias dependendo do estágio e também
da natureza da resposta do hospedeiro. Geralmente, estes processos infecciosos
são favorecidos pela ruptura do equilíbrio parasita-hospedeiro. Aderência,
polimorfismo, variabilidade fenotípica, produção de enzimas extracelulares que
degradam os tecidos, toxinas que causam lesão celular, formação de biofilmes
sobre células e superfícies inanimadas, produção de tubo germinativo por
algumas espécies de Candida, produção de hemolisinas, hidrofobicidade da
superfície celular e resistência ao peróxido de hidrogênio constituem os principais
fatores descritos deste gênero que lhe conferem a habilidade de colonizar e
oportunamente causar infecção (Calderoni e Fonzi, 2001).
A maioria das infecções produzidas por Candida albicans está
relacionada pela sua capacidade de diferenciação morfológica (de levedura para
hifas) e consequente adesão e desenvolvimento do biofilme em superfícies
bióticas ou abióticas. O crescimento das hifas é um mecanismo de virulência
importante na invasão de tecidos e na resistência a fagocitose (Jayatilake et al.,
2006). Os biofilmes são comunidades biológicas com um alto grau de
organização, em que os microrganismos se coagregam de maneira estruturada,
coordenada e funcional, os quais se apresentam embebidos por uma matriz
extracelular (MEC) (Figura 1) (Chandra et al., 2001).
33
O fator primário na colonização fúngica de tecidos e superfícies abióticas
é a capacidade de adesão às superfícies, que passa a ser induzida pela percepção
da modificação do ambiente (ambiente favorável) o qual ativa várias cascatas de
sinalização celular no fungo. O estabelecimento inicial da adesão é preconizada
inicialmente pela ligação das células de Candida às superfícies por fatores não-
específicos (hidrofobicidade e forças eletrostáticas) formados entre as proteínas do
tipo adesinas presentes na superfície das células fúngicas que se ligam a proteínas
presentes no ambiente como o fibrinogênio e fibronectina e também em aminoácidos
e açúcares de superfície presentes em outras células. (Verstrepen e Klis, 2006).
A invasão e a destruição dos tecidos hospedeiros são promovidas por
enzimas hidrolíticas (fosfolipases e proteases - proteínas SAP) que constituem
um grupo de isoenzimas de proteinase aspártica (Sap) com massas moleculares
entre 35 e 50 kDa e são codificados por um conjunto de genes que vão do SAP1
ao SAP10. O papel de genes SAP1 a SAP6 estão relacionados com a aderência,
lesão tecidual e mudanças na resposta imune (Sardi et al., 2013).
Ramage e López-Ribot (2005), relataram que são quase inexistentes
infecções causadas por Candida em sua forma planctônica nos tecidos do
hospedeiro. Portanto, é o biofilme que constitui o fator de virulência mais
importante pois protege a comunidade microbiana de mecanismos imunológicos
do hospedeiro, promove a resistência contra o tratamento antifúngico e a
resistência à competição com a microbiota autóctone, além de facilitar o
desenvolvimento das relações simbióticas e sinalizações entre as células da
comunidade do biofilme, conferindo maior proteção contra radiações UV e
desidratação, permitindo assim melhora na adaptação e sobrevivência à
ambientes hostis.
In vitro, a camada de biofilme basal é composta por células de
leveduras a partir das quais as células filamentosas emanam (hifas), sendo estas
células envolvidas por uma densa camada de matriz extracelular (MEC) (Figura
2), a qual é composta por β-glucano que tem a capacidade de se ligarem a
antifúgicos como o fluconazol e à anfotericina-B, impedindo a penetração destas
drogas no biofilme (Finkel & Mitchell, 2011). Além disso, a MEC contém DNA
34
extracelular (eDNA), que também contribui para a integridade estrutural dos
biofilmes de Candida spp. (Tobudic et al., 2011).
Estudos recentes sugerem que o desenvolvimento primário, a
maturação e o envelhecimento de um biofilme são regulados pela expressão de
genes ativados pela transmissão de sinais entre as células (Khan et al., 2009)
(Albuquerque et al., 2012). Uma das propriedades do biofilme é promover a
sinalização celular (quorum sensing - sensor de quorum) que corresponde a um
processo de comunicação intra e interespécies microbianas e é fundamental na
formação de biofilmes microbianos mono e multiespécies. Esta comunicação
através de moléculas sinalizadoras e autoreguladoras tem como principal
objetivo impedir a superpopulação desnecessária e controlar a competição por
nutrientes, além de exibir implicações importantes no processo infeccioso,
particularmente para disseminação e estabelecimento de sítios de infecções
(Ramage et al., 2005).
Analisando composto bioativos oriundos de óleos e extratos de plantas
medicinais e compostos vindo de produtos naturais, estudos recentes verificaram
que esses compostos naturais atuam como moléculas quorum sensing
(moléculas autoreguladoras do biofilme) como o farnesol (Jeon et al., 2011)
(Albuquerque et al., 2012) e dodecanol (Hall et al., 2011), que exibem a ação de
inibir a filamentação (hifamento) no biofilme de C. albicans e que tem sido
associado à hidrofobicidade de superfície celular. Em contrapartida, outros
compostos bioativos naturais como o tirasol desempenha ação no crescimento e
na morfogênese de C. albicans, estimulando a produção de hifas em condições
permissivas para a formação do tubo germinativo, apesar do seu papel não estar
ainda esclarecido em biofilmes (Ramage et al., 2005).
35
Figura 2 – Representação esquemática do crescimento do biofilme de Candida
albicans em uma superfície de tiras de Polimetilmetacrilato (PMA).
Legenda: Early – inicial; Intermediate – intermediário; Mature – Maduro;
Irregular PMA surface - Superfície irregular de PMA; ECM – Matriz
(polissacarídeo) extracelular;
Fonte: Adaptado de Chandra et al., 2001.
36
3 PROPOSIÇÃO
3.1 Objetivo Geral
Avaliar os efeitos antimicrobianos em Candida spp e no biofilme de Candida
albicans SC5314 e antiproliferativo em células HaCat do óleo essencial das
folhas de Psidium cattleyanum var. lucidum.
3.2 Objetivos Específicos
1) Avaliar a composição do óleo essencial de folhas de Psidium cattleyanum;
2) Determinar a mínima concentração inibitória do óleo essencial das folhas
de Psidium cattleyanum sobre microrganismos do gênero Candida (cepas padrão
e espécimes clínicos);
3) Determinar a ação fungicida/fungistática do óleo essencial das folhas de
Psidium cattleyanum sobre sobre microrganismos do gênero Candida (cepas
padrão e espécimes clínicos);
4) Avaliar a atividade antibiofilme de Candida albicans (SC5314) do óleo
essencial das folhas de Psidium cattleyanum exposto a diferentes
concentrações;
5) Avaliar as modificações morfológicas microscópicas do biofilme de
Candida albicans SC5314 ocasionadas pelo óleo essencial das folhas de
Psidium cattleyanum através de Microscopia Eletrônica de Varredura;
6) Avaliar a capacidade antiproliferativa do óleo essencial de folhas de
Psidium cattleyanum sobre células epiteliais humanas (HaCat).
37
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local de Realização da Pesquisa
Este estudo foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
(CEP) da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – FOP/UNICAMP (CAAS:
60614316.5.0000.5418) (ANEXO A).
As análises experimentais do presente projeto foram feitas utilizando-se a
estrutura do laboratório de cultura, laboratório de biologia molecular e laboratório de
cultura de células da Área de Microbiologia e Imunologia – Departamento de
Diagnóstico Oral – FOP/UNICAMP. Telefone: (019) 2106-5321 / 2106-5322;
Endereço para correspondência: Faculdade de Odontologia de Piracicaba -
UNICAMP. Área de Microbiologia e Imunologia. Avenida Limeira, 901. CEP:13414-
018, Piracicaba, SP, Brasil.
O Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas –
CPQBA/UNICAMP forneceu a estrutura para análises cromatográficas do óleo
essencial, como instituição co-participante.
O Laboratório de Microbiologia da Universidade Estadual “Júlio de
Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araçatuba – F.O.A/UNESP, forneceu
os espécimes clínicos (ANEXO B), realizando o isolamento e identificação das
mesmas, como instituição co-participante.
4.2 Material vegetal
O material vegetal comercial utilizado foi do gênero Psidium e pertence a
espécie Psidium cattleyanum var. lucidum Hort (TreeTech® Óleos Essencias), o qual
foi extraído o óleo essencial a partir de suas folhas.
38
4.3 Cromatografia
O óleo essêncial de P. cattleyanum passou por uma análise de
qualificação e quantificação dos compostos presentes nas amostras por
cromatografia gasosa.
4.3.1 - Cromatografia Gasosa (CG)
Foi utilizado cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 5890 Serie II,
equipado com detector seletivo de massas Hewlett40 Packard 5971, injetor
split/splitless, utilizando-se uma coluna capilar HP-5 (25m x 0,2mm x 0,33μm).
Temperaturas: injetor = 220°C, detector = 280°C, coluna = 60°C, 3°C.min-1, 240°C
(7 minutos). A vazão do gás de arraste (He super seco) foi igual a 1,0 ml.min-1.
A análise dos dados da CG foi levada a efeito de acordo com a equação
de Van den Dool e Kratz para a obtenção do Índice de Retenção seguida de
comparação dos índices de retenção e picos cromatográficos dele obtidos com os
encontrados na literatura.
IR= [(Ts-Tcn-1)/Tcn-Tcn-1)x100 + 100cn-1, onde:
IR= índice de retenção;
Ts= tempo de retenção da substância analisada;
Tcn= tempo de retenção do n-alcano que elui após a substância
analisada;
Tcn-1= tempo de retenção do alcano que elui antes da substância
analisada;
Cn-1= número do alcano que elui antes da substância analisada.
39
4.4 Cepas de Candida spp.
Para as análises foram utilizadas cepas de diferentes espécies de
Candida spp. descritas a seguir:
Cepas padrão adquiridas de bancos de microrganismos (CBS-
Centraalbureau voor Schimmelcultures; IZ-Instituto Zimotécnico-ESALQ/USP):
Candida albicans (CBS 562), C. albicans (ATCC 90028), C. utilis (CBS 560), C.
lusitaniae (IZ 06); C. parapsilosis (CBS 604), C. dubliniensis (CBS 7987), C.
guilliermondii (CBS 566), C. krusei (CBS 573), C. tropicalis (CBS 94), C. rugosa (IZ
12), C. glabrata (IZ 07) e a cepa C. albicans SC5314.
Os espécimes clínicos de Candida spp. provenientes de pacientes
imunodeprimidos, em estágio avançado da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
(HIV), foram coletadas de amostras de aspirados brônquicos e, a partir delas,
isoladas 5 espécimes clínicos da espécie Candida albicans, 5 espécimes clínicos de
Candida krusei e 5 espécimes clínicos de Candida tropicalis, as quais estão
depositadas em Biorrepositório no Laboratório de Microbiologia e Imunologia da
Faculdade de Odontologia de Araçatuba - F.O.A, as quais foram gentilmente cedidas
pelo Prof. Titular Elerson Gaetti Jardim Júnior. Estes espécimes clínicos foram
coletadas de pacientes adultos, capazes, sem distinção de gênero, com faixa etária
de 22 a 37 anos, sob tratamento na Santa Casa de Misericórdia de Araçatuba - SP
que fizeram parte de uma pesquisa científica sob responsabilidade do Prof. Titular
Elerson Gaetti Jardim Júnior e da Profª. Drª. Ana Cláudia Okamoto da Faculdade de
Odontologia de Araçatuba - F.O.A.- UNESP (Projeto Aprovado pelo Comitê de Ética
em Pesquisa Humana - F.O.A. - UNESP com o título “Microbiota bucal e sua relação
com infecções oportunistas em pacientes mantidos em unidades de terapia
intensiva”, número CAAES: 14982313.1.0000.5420). Todos os pacientes ou seus
responsáveis assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) do
Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - F.O.A.-
UNESP permitindo a coleta de material. A coleta do material foi feita por
procedimento de aspiração brônquica, onde parte do material aspirado foi
imediatamente colocado em meio de cultura de transporte e, no laboratório, parte do
material foi inoculado em meio de cultura seletivos para Candida spp. Quando houve
o crescimento de leveduras, as mesmas foram isoladas por meios específicos e
40
armazenadas em Skim milk em criogenia. Todas os espécimes clínicos foram
mantidos em meio líquido à -70ºC no Laboratório de Microbiologia e Imunologia da
Faculdade de Odontologia de Araçatuba - F.O.A.- UNESP.
Microrganismos do gênero Candida são pertencentes microbiota
endógena humana de maneira comensal e oportunamente ocasionam doença
quando o hospedeiro apresenta imunidade debilitada, sendo então classificadas
como tendo baixo risco biológico (Classe 2). Todas as técnicas de cultivo e
manutenção destes microrganismos seguiram os padrões de biossegurança
requeridos e instituídos na área de Microbiologia e Imunologia da FOP/UNICAMP
em conformidade com a CiBio/F.O.P.
4.5 Grupos testes utilizados nos ensaios com P. cattleyanum var. lucidum.
Para os ensaios os grupos controles e testes foram os seguintes:
Grupo controle (CG) positivo: para o crescimento dos fungos sem a
presença do óleo;
GC negativo: somente meio de cultura sem inóculo;
GC negativo do óleo essencial: verificar contaminação do óleo
essencial de P. cattleyanum var. lucidum Hort;
GC negativo do Tween: verificar contaminação do diluente estoque;
Grupo teste: presença da espécie de Candida testada exposta a
diferentes concentrações do óleo testado ou antifúngico comercial.
41
4.6 Avaliação da atividade antifúngica em células planctônicas (Concentração
Inibitória Mínima - CIM).
As amostras de Candida spp. foram testadas quanto a sua
susceptibilidade ao óleo essencial de Psidium cattleyanum, e, como padrão
comparativo, foram testadas também pela Nistatina e Fluconazol. Foi utilizada a
técnica de microdiluição em caldo seguindo a padronização descrita no documento
M27-A3 (CLSI, 2008).
Em uma microplaca estéril de 96 poços foram depositados 100µl de meio
RPMI-1640 e em seguida, 100 µl do óleo essencial na concentração inicial de 16
mg/ml, diluído em Tween 80 a 0,025% + RPMI. Em seguida, foram feitas diluições
seriadas do óleo (16 mg/ml à 0,015625 mg/ml). Posteriormente foram adicionados
100 µl de inóculo da levedura em solução salina ajustando-se a turbidez
correspondente a 0,5 na escala McFarland, a uma absorbância de 0,08 a 0,10A em
530nm (5,0 x 106 UFC/ml) no espectrofotômetro. O inóculo ajustado posteriormente
foi diluído em RPMI para a fim de se obter 2,5x103 UFC/ml que foi acrescentado à
placa com o óleo essencial em diferentes concentrações. As placas foram incubadas
em estufa de aerobiose por 48h a 37°C, e após a concentração inibitória mínima
(CIM) foi determinada por leitura visual. Os antifúngicos Nistatina e Fluconazol,
foram preparados ressuspendidos com DMSO e as soluções de trabalho foram
feitas com RPMI-1640, sendo acrescentados na placa com concentração de 16
µg/ml e diluído seriadamente até 0,015625 µg/ml para Nistatina e para Fluconazol foi
acrescentado em concentração de 64 µg/ml e diluído seriadamente até 0,015625
µg/ml.
A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi definida a partir da
concentração onde não se observa crescimento das leveduras. Para a identificação
da concentração fungicida mínima (CFM), 20 µl da suspensão da CIM, CIM-1 e
CIM+1 foram plaqueadas em Ágar Saboraud Dextrose (SDA) e incubadas por 24h
em aerobiose. A CFM foi identificada a partir do não crescimento de colônias a partir
da CIM. Foram realizados três experimentos independentes de cada teste.
42
4.7 Análise da viabilidade celular de biofilmes de Candida albicans (SC5314)
4.7.1 Preparo e ajuste do inóculo.
O óleo essencial de Psidium cattleyanum foi testado em biofilme de C.
albicans (SC5314) em formação (biofilme com 2 horas de crescimento) conforme
descrito por Silva et al. (2010) com algumas adaptações e testado em biofilme
maduro (biofilme com 24 horas de crescimento) conforme descrito por Pierce et al.
(2008).
Para ambos os tipos de biofilmes, a cultura overnight foi preparada em
YPD e incubada sob agitação a 30 rpm em 37°C. Uma alíquota de 7 ml do inóculo
foi centrifugada e lavada em 14 ml de PBS por 2x, e ao pellet obtido, foram
adicionados 7 ml de RPMI-1640. Desta suspensão celular resultante foi preparada a
diluição de 1:100 e as células foram contadas em hemocitômetro em microscópio
óptico (aumento de 400x), proporcionando a contagem celular, a qual foi utilizada
para o cálculo do volume necessário para o ajuste do inóculo de trabalho com uma
suspensão final de 1,0 x 106 células/ml, em RPMI- 1640.
4.7.2 Formação e análise do Biofilme em formação (pré-incubação por 2 horas) e
Biofilme maduro (pré-incubação de 24 horas).
Para o biofilme em formação, na microplaca estéril de 96 poços tipo PS
(fundo U) foram depositados 100 μl de inóculo, o qual que foi incubado por 2h sob
agitação (100 rpm a 37°C) em incubador de microplaca. Em seguida, a placa foi
lavada 3x com NaCl a 0,9% e foi adicionado 100 μl do óleo essencial diluído em
cada concentração testada (32 mg/ml a 0,03125 mg/ml). A placa contendo o inóculo
e óleo foi incubada por 24h a 37°C em estufa de aerobiose. Para o biofilme maduro,
na microplaca de 96 poços com fundo U foram depositados 100 μl de inóculo o qual
foi incubado por 24h. Posteriormente, a placa foi lavada 3x com NaCl a 0,9% e
foram adicionados 100 μl do óleo essencial diluído em cada concentração testada
(16 mg/ml a 0,0156 mg/ml). A placa foi incubada por 24h a 37°C em estufa de
aerobiose.
Para a análise da ação do óleo essencial sobre os tipos de biofilme, as
placas de biofilme em formação e de biofilme maduro foram, posteriormente à
43
incubação, lavadas 3x com solução salina a 0,9%, a fim de remover as células
planctônicas presentes e o óleo essencial. Os biofilmes aderidos às placas foram
então corados com 80 μl de XTT (2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-
tetrazolium-5-carboxanilide) em cada poço para se determinar a viabilidade celular
dos biofimes tratados, devido ao XTT modificar sua coloração de amarela para
laranja em resposta à uma oxirredução sofrida na respiração celular. Após
incubação por 4h a 37ºC sobre abrigo da luz, os poços com atividade celular
adquiram coloração mais alaranjada, podendo ser quantificada a viabilidade celular
pela mensuração de sua densidade óptica em Espectrofotômetro de Microplaca a
490nm. Os ensaio foram feitos em três experimentos independentes.
4.8 Microscopia Eletrônica de Varredura dos tipos de biofilmes de C. albicans.
4.8.1 Preparo do inóculo
Os microrganismos cultivados em microtubos tipo eppendorf e ajustados
a 1x106 céls/ml foram préincubados conforme o biofilme em formação (2h) e o
biofilme maduro (24h) juntamente com seus respectivos grupos controles (sem
tratamento com o óleo essencial) como descrito anteriormente, sob aerobiose em
lâminas de vidro para MEV (BD Culture Slide) em duplicata.
4.8.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Após a incubação prévia, as placas foram lavadas duas vezes com NaCl
0,9% e depois foram adicionados 300 ul de óleo essencial em 3 concentrações
distintas foram adicionadas ao biofilme em formação (1 mg/ml, 0,5 mg/ml e 0,250
mg/ml) e ao biofilme maduro (0,5 mg/ml, 1 mg/ml e 2 mg/ml). As lâminas com os
grupos testes (concentrações de óleo essencial) e o grupo controle (sem a ação do
óleo essencial) foram incubadas por 24h em aerobiose a 37ºC. Após 24h de
incubação, os poços das lâminas foram lavados com PBS (2x) e, em seguida, foi
adicionado 100 ul de glutaraldeído a 2% (v/v), por 30 minutos. As amostras foram
então desidratadas com banhos sequenciais de etanol, nas concentrações de 50%,
70%, 90% e etanol absoluto (2X). Posteriormente, as lâminas passaram pelo
processo de metalização com ouro, por 120s, em metalizador BAL-TEC SCD 050
44
(Balzers Liechtensteis). A análise das imagens das amostras foi feita em Microscópio
Eletrônico de Varredura JSM-5600 Lv da JEOL (Tóquio, Japão), com aceleração de
15KV.
4.9 Ensaio de atividade antiproliferativa em células HaCat.
As células epiteliais utilizadas para este estudo são da linhagem celular
de queratinócitos normais humanos imortalizada, mas não transformada,
denominada HaCat. Estas células foram gentilmente doadas pelo Prof. Dr. Ricardo
Della Coletta, da Área de Patologia (FOP/UNICAMP), as quais foram cultivadas na
presença do óleo essencial testado para determinar se o mesmo apresenta efeito
antiproliferativo e até mesmo tóxico sobre elas.
Após serem reativadas e atingirem a confluência de 90%, as células
foram cultivadas com RPMI + 10% de SFB em placas de 96 poços e incubadas a
37ºC em estufa de CO2 (5%) por 24h. Após 24h, 100 ul de óleo essencial de P.
cattleyanum foi adicionado em concentrações de 32 mg/ml a 0,5 mg/ml e incubadas
por 48h a 37°C em estufa de CO2 (5%). Após esse período, as células foram fixadas
com 50 ul de Ácido Tricloroacético (TCA) a 50% e incubadas por 1h a 4ºC. Na
sequência, as placas foram lavadas com PBS (3x) e secas em temperatura
ambiente, para serem coradas com 50 ul da solução de Sulforrodamina B (SRB)
0,4% com ácido acético 1% por 60min a 4ºC, onde as proteínas da superfície celular
de células HaCat aderidas e biologicamente ativas se ligam à solução que passa a
corar as células.
Após a incubação as placas foram lavadas com Ácido Acético 1% para
retirada de ligações inespecíficas do corante e celular não aderidas e foi adicionado
100 ul de Trizma Base para a ressuspensão do corante anteriormente ligado às
proteínas de superfície celular. A leitura das placas foi feita em Espectrofotômetro de
Microplaca (530nm) para medir a densidade óptica. Foi utilizado como parâmetro
Dose Letal 50, como descrito previamente por Endo et al. (2010). Os ensaio foram
feitos em três experimentos independentes.
45
4.10 Análise estatística
Para as avaliações comparativas foi utilizada a análise estatística ANOVA
um critério, variação Dunnett, bilateral (p<0,05), (Programa Biostat 5.0), onde a
porcentagem de crescimento do grupo controle (sem tratamento com óleo) foi
comparada individualmente com as porcentagens de crescimento dos grupos testes
representados pelas diferentes concentrações testadas do óleo essencial de P.
cattleyanum.
46
5 RESULTADOS
5.1 Cromatografia Gasosa (CG)
A análise cromatográfica do óleo essencial das folhas de P. cattleyanum
detectou uma relação de compostos diversos e seus percentuais em uma amostra
de 100 ul de óleo (ANEXO C) (ANEXO D). Os compostos mais abundantes foram os
monoterpenos 1,4 - Cineol (33,19%) e Triciclene (27,05%), e o sesquiterpeno
Cariofileno (Z) (18,94%) (Tabela 1).
Tabela 1. Compostos do óleo essencial de Psidum cattleyanum var. lucidum
identificados por CG/EM.
Compostos de Psidium cattleyanum
var. lucidum
IR* %
1,4 – Cineol 1016 33.19%
Tricicleno 926 27.05%
Cariofileno (Z) 1404 18.94%
β - Pineno 980 5.49%
Butirato de Linalol 1422 4.41%
Ledol 1565 3.87%
β - Felandreno 1031 3.83%
α - Terpineol 1189 3.23%
PMR1 e outros2 - -
*Índice de Retenção;
1- Compostos sem identificação;
2- Compostos identificados, porém sem porcentagem definida: Sabineno,
Isosilvestreno, β - Ocimeno (Z), α - Acetato de Terpineol, β - Ocimeno (E) e α
– Cubeno.
47
5.2 Atividade antifúngica do óleo essencial de P. cattleyanum, Nistatina e
Fluconazol em Candida spp. padrão e espécimes clínicos.
Tabela 2 - Concentração mínima inibitória e concentração fungicida mínima do óleo
essencial de P. cattleyanum, Nistatina e Fluconazol em Candida spp.
a: cepa padrão
b: cepas oriundas de amostras clínicas;
c: Fluconazol tem ação fungistática (CLSI, 2008);
* Intrisicamente resistente ao Fluconazol;
1 a 5: número de amostras clínicas testadas.
CIM: concentração inibitória mínina;
CFM: concentração fungicida mínima.
Candida spp.
Padrãoa e Clínicasb
P. cattleyanum Nistatina Fluconazolc
CIM CFM CIM CFM CIM
mg/ml µg/ml µg/ml
C. albicans 90028a 16 16 2 4 1,0
C. albicans 5314a 8 8 2 4 0,125
C. guilliermondi 566a 4 8 2 2 0,125
C. krusei 573a* 4 8 2 4 64
C. utilis 560a 0,5 2 0,5 4 0,5
C. rugosa 12a 4 8 0,5 4 0,5
C. lusitaniae 06a 4 4 2 4 0,125
C. glabrata 07a 8 16 2 4 0,125
C. dubliniensis 7987a 4 8 4 4 4
C. tropicalis 94a 8 16 2 8 0,250
C. albicans 562a 8 16 2 8 0,250
C. parapsilosis 604a 2 8 1 4 0,5
C. albicans 1b a 5b 16 16 4 8 0,06125
C. krusei 1b a 5b 8 16 4 4 2 1ª4 e 0,1255
C. tropicalis 1b a 5b 8 16 4 4 0,125
48
O óleo essencial de P. cattleyanum apresentou ação antimicrobiana nas
espécies de Candida em estado planctônico, tanto nas espécies de referência
quanto nas espécies clínicas, entretanto, o desempenho antimicrobiano do óleo
essencial de P. cattleyanum não se mostrou superior aos antifúngicos Nistatina e
Fluconazol testados.
5.3 Análise de viabilidade celular nos tipos de biofilmes de Candida albicans
(SC5314) tratados com óleo essencial de P. cattleyanum.
Gráfico1 - Viabilidade celular do biofilme em formação.
*Significância estatística p<0,01 Teste ANOVA 1 critério, variação de Dunnett.
Comparado ao grupo não tratado, o biofilme de C. albicans em formação
submetido às diferentes concentrações do óleo essencial de P. cattleyanum (Gráfico
1) mostrou melhor controle da progressão do biofilme até a concentração de 0,250
mg/ml com 9,5% de viabilidade celular. A retomada de formação do biofilme é
observada a partir da concentração de 0,125 mg/ml onde ocorreu um aumento de
29,7 % de células viáveis em relação ao grupo controle, porém a progressão do
49
biofilme se mostra ainda estatisticamente controlada até a última concentração
testada (p<0,01).
Gráfico2 - Viabilidade celular do biofilme maduro
*Significância estatística p<0,01 Teste ANOVA 1 critério, variação de Dunnett.
O biofilme maduro tratado com as diferentes concentrações do óleo
essencial de P. cattleyanum (Gráfico 2) apresentou controle do biofilme de Candida
albicans até a concentração de 1 mg/ml com viabilidade celular de 18,9% (p<0,01)
comparado ao controle, entretanto, uma baixa desorganização do biofilme maduro
foi observada a partir de 0,5 mg/ml com o aumento da viabilidade celular para
64,7%, sem diferença estatística ao controle.
50
5.4 Microscopia Eletrônica de Varredura (M.E.V.)
5.4.1 Biofilme em formação
Figura 3. Imagens de MEV do biofilme em formação de C. albicans SC5314 tratados com
diferentes concentrações do óleo de P. cattleyanum var. lucidum.
1Controle sem tratamento em aumento de 500x e 5000x (A);
2Concentrações testadas de P. cattleyanum no biofilme de C. albicans SC5314 em
aumento de 500x e 5000x em B (1mg/ml), C (0,5mg/ml) e D (0,250mg/ml).
Entre as concentrações testadas (1 mg/ml (B); 0,5 mg/ml (C); 0,250 mg/ml
(D)), as imagens da microscopia eletrônica em aumento de 500x do biofilme em
formação de C. albicans SC5314 exibem na coluna B (1 mg/ml) a maior diminuição
da densidade de hifas comparada ao grupo controle (A). Em aumento de 5000x, a
imagem com tratamento de 1 mg/ml (B) exibe a desorganização de hifas, ruptura do
A – Controle1
B – 1 mg/ml2 C – 0,5 mg/ml2 D – 0,250 mg/ml2
51
envelope celular e extravasamento de conteúdo intracelular. Na imagem com
tratamento de 0,250 mg/ml (C) há desorganização de hifas e alteração da morfologia
das mesmas, mesmo com o restabelecimento da densidade de hifas do biofilme
(Figura 3).
5.4.2 Biofilme Maduro
Figura 4. Imagens de MEV do biofilme maduro de C. albicans SC5314 tratados
com diferentes concentrações do óleo de P. cattleyanum var. lucidum.
1Controle sem tratamento em aumento de 500x e 5000x (A);
2Concentrações testadas de P. cattleyanum no biofilme de C. albicans SC5314 em
aumento de 500x e 5000x em B (2mg/ml), C (1mg/ml) e D (0,5mg/ml).
No biofilme maduro (Figura 4), entre as concentrações testadas do
óleo de P. cattleyanum (2mg/ml (B); 1mg/ml (C); 0,5mg/ml (D), as imagens das
A - Controle1
C – 1 mg/ml2 D – 0,5 mg/ml2 B – 2 mg/ml2
52
colonas B e C apresentaram colapso, estiramento e ruptura de hifas,
características essas pouco evidentes em D no aumento de 5000x, porém de
maneira geral, no aumento de 5000x ocorreu uma reestruturação do biofilme na
concentração de 0,5 mg/ml.
3.5 Ensaio de atividade antiproliferativa
Gráfico 3 - Atividade antiproliferativa do óleo de P. cattleyanum sobre
células HaCat.
# Sem diferença estatística ao grupo controle não tratado.
O ensaio de atividade antiproliferativa realizado em células HaCat
(Gráfico 3) incubadas nas concentrações do óleo essencial de P. cattleyanum
(32 mg/ml a 0,5 mg/ml) apresentaram proliferação celular das células HaCat
acima de 50% em todas as concentrações testadas (não apresentou IC50),
indicando baixa citotoxicidade.
53
6 DISCUSSÃO
Devido aos efeitos colaterais dos compostos antimicrobianos sintéticos
e o aumento da resistência microbiana frente aos antimicrobianos comerciais
atuais, pesquisas com produtos naturais que incentivam a descoberta de
compostos ativos com propriedades antimicrobianas têm aumentado nas últimas
décadas, haja visto a ausência ou baixos efeitos tóxicos à saúde humana
(Bakkali et al., 2008) (Duarte et al., 2005).
O metabolismo secundário das plantas promove a produção de
compostos ativos que estão envolvidos em seu sistema defensivo a fim de se obter
adaptação a meios inóspitos, conferindo defesa contra insetos nocivos,
microrganismos e parasitas ambientais, além da atração de agentes polinizadores
para perpetuação das características da espécie. Estes metabólitos são extraídos de
diferentes modos e de diferentes partes da planta, mas compõem principalmente os
óleos essenciais e extratos produzidos com diferentes veículos.
A cromatografia gasosa do óleo das folhas de P. cattleyanum revelou
principalmente, quanto a sua constituição fitoquímica, a presença de três
terpernóides: 1,4 Cineol, Tricicleno e Cariofileno. A literatura relata que o 1,4 Cineol
e Tricicleno oriundos do óleo de P. cattleyanum apresentam ação antioxidante
(Faleiro et al.,2016), 1,4 Cineol e Cariofileno apresentam atividade analgésica
(Chavan et al., 2010). O Cariofileno, além de suas propriedades analgésicas
apresenta, atividade antitumoral (Park et al., 2011) e atividade antifúngica contra
dermatófitos (Yang et al., 2000).
Os demais compostos terpenóides encontrados, β –Pinene, Butirato de
Linalol, Ledol, β – Felandreno e α – Terpineol, foram identificados em baixa
porcentagem individualmente, totalizando 20,72% da amostra, de maneira que suas
atividades medicinais não possam ser consideradas tão efetivas, contudo, de
maneira geral, todos os compostos terpenóides são considerados agentes com
potencial antimicrobiano, pois apresentam baixo peso molecular e características
hidrofóbicas, permitindo assim, a incorporação desses composto à membrana
celular e, consequentemente, seu rompimento (Dalleau et al., 2008) (Zore et al.,
2011).
54
Diferentes de nossos resultados onde o 1,4 Cineol e Tricleno foram os
mais abundantes compostos identificados, Chalannavar et al. (2012), em estudo que
caracterizou a constituição fitoquímica do Psidium cattleyanum var. lucidum por
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS), demonstrou
que o principal composto terpenóide encontrado na planta cultivada na África do Sul
foi o Cariofileno que apresenta efeitos antitumorais e antimicrobianos em potencial.
O Cariofileno é presente em outras espécies do gênero Psidium, porém a sua
abundância em Psidium cattleyanum var. lucidum torna a espécie um alvo para mais
estudos de extração e purificação do Cariofileno, além de aumentar seu interesse
comercial.
Essa variação de resultados de constituição fitoquímica no teor e
composição do óleo podem ser atribuído a fatores relacionados ao ecotipo, fenófase
de coleta e ambiente de cultivo, incluindo temperatura, umidade relativa, irradiância
e fotoperíodo. No presente estudo, encontramos diferentes resultados ao
apresentados na literatura, podendo ser oriundas de diferentes fatores ambientais e
genéticos, diferentes quimiotipos e o estado nutricional das plantas, bem como
outros fatores que podem influenciar a composição. Estes resultados mostram que
P. cattleianum var. lucidum é uma espécie com notável variação fitoquímica
(Chalannavar et al., 2012).
Os extratos das folhas de Psidium cattleyanum são relatados na
literatura como detentores de ação antibacteriana bem caracterizada (Menezes et
al., 2010) (Brighenti et al., 2008), contudo o óleo essencial das folhas de Psidium
cattleyanum, tanto sua variedade de fruto amarelo (P. catteyanum var. lucidum
Hort.) e sua variedade vermelha (P. cattleyanum var. cattleyanum Sabine),
encontram seus efeitos antifúngicos relatados de maneira escassa na literatura,
sem parâmetros ideais para comparação de resultados, o que indica a
necessidade de maiores estudos que venham ampliar os conhecimentos em
relação a esses óleos.
A concentração inibitória mínima (CIM) do óleo essencial de P.
cattleyanum sobre as células planctônicas nas cepas padrão de Candida testadas e
nas espécies clínicas de C. albicans, C. krusei e C. tropicalis ocorreu entre 2 mg/ml a
16 mg/ml, com exceção da espécie ambiental C. utilis (0,5 mg/ml). Segundo os
55
critérios que avaliam o potencial de aplicação sistêmica de drogas e fitoterápicos
descrito por Duarte et al. (2005) e Aligiannis et al. (2001) - que propõem que
concentrações inibitórias mínimas de drogas com até 0,5 mg/ml são consideradas
com portencial forte, de 0,55 a 1,5 mg/ml são consideradas com potencial
moderado e acima de 1,5 mg/ml são consideradas com potencial fraco - nossos
resultados demonstram um fraco potencial antifúngico para a aplicação sistêmica do
óleo P. cattleyanum sob células planctônicas de Candida spp. padrão, assim como
nos espécimes clínicos de C. albicans (16 mg/ml), C. krusei e C. tropicalis (ambas
8mg/ml), com exceção da espécie ambiental C. utilis cujo o CIM de 0,5 mg/ml é
considerado moderado. Portanto uma utilização sistêmica do óleo P. cattleyanum
nas altas concentrações de CIM apresentadas se demonstra inviável, porém não se
pode descartar sua utilização tópica como colutórios e sob o tratamento
antimicrobiano de próteses e superfícies.
A concentração fungicida mínima (CFM) do óleo essencial de P.
cattleyanum nas cepas padrão de Candida testadas apresentou-se entre 2 mg/ml a
16 mg/ml, sendo expressa em concentração superior ao CIM, com exceção das
cepas de C. albicans 90028 e C. albicans SC5314 cujo a concentração fungicida
mínima se iguala à mínima concentração inibitória (16 mg/ml e 8 mg/ml,
respectivamente). Nas cepas de origem clínica C. krusei e C. tropicalis apresentaram
CFM de 16 mg/ml e apenas C. albicans apresentou o CFM igual ao CIM (16 mg/ml).
Quando comparado ao antifúngico comercial testado, os resultados de
CIM do óleo essencial de P. cattleyanum foram menos eficientes aos demonstrados
pela Nistatina (0,5 µg/ml a 4 µg/ml) nas Candida spp. testadas, onde o perfil
fungicida (CFM) variou de 2 µg/ml a 8 µg/ml entre as cepas de referência e de 4
µg/ml a 8 µg/ml entre as espécies clínicas. O antifúngico Fluconazol apresentou
menores CIMs nas cepas padrão (0,0125 µg/ml a 4 µg/ml) e nas cepas clínicas
(0,06125 µg/ml e 0,125 µg/m) comparadas às CIMs do óleo de P. cattleyanum e
Nistatina nas cepas padrão e cepas clínicas.
Mesmo apresentando valores de CIMs em concentrações acima aos
valores de CIMs do antifúngico comercial, o óleo essencial das folhas de P.
cattleyanum não pode ser descartado como fonte de moléculas com atividade
antimicrobiana, visto que muitos de seus compostos constituintes podem agir de
56
maneira sinérgica e até mesmo antagônicas entre si, diminuindo sua ação
antimicrobiana. Em estudos com compostos oriundos de plantas medicinais, outro
aspecto a ser levantado é que um composto ou óleo que apresente atividade
antimicrobiana fraca sobre células planctônicas possa ser utilizado como
componente adjuvante à antimicrobianos comercias (GIbbons, et al, 2005), além
também de poder apresentar ação contra fatores de virulência, como por exemplo,
combater a capacidade de formar biofilmes em superfícies bióticas e abióticas, ação
essa diretamente relacionada à resistência a antifúngicos (Aligiannis et al., 2001).
Biofilmes são um habitat protegido para microrganismos, onde eles estão
seguros do tratamento antimicrobiano, criando assim uma fonte de infecção
persistente e muitas vezes refratárias ao tratamento. Ramage et al., 2001, em
estudo que avaliou a capacidade de formação de biofime de C. albicans, verificou
que um biofilme em suas etapas iniciais de estruturação (biofilme em formação) se
estabele em 2h de incubação e que em 24h de incubação um biofilme maduro já se
encontra estabelecido, porém as propriedades adesivas de C. albicans e,
consequentemente sua virulência, se apresentam diferentes entre as cepas (Vargas
et al., 1994).
Nos ensaios de viabilidade celular do biofilme em formação e do biofilme
maduro de Candida albicans SC5314, mesmo baixas concentrações do óleo testado
alteraram a estrutura de ambos os tipos de biofilmes (0,250 mg/ml para o em
formação e 1 mg/ml para o maduro) indicando que o óleo das folhas de P.
cattleyanum apresenta atividade antibiofilme de Candida. Esta atividade antibiofime
foi observada por Brighenti et al., 2012, porém em ensaio com o extrato
hidroalcoólico de P. catteyanum sob o biofilme de S. mutans - no qual ocorreu a
redução da produção de polissacarídeos extracelulares causando assim, a redução
da matriz extracelular do biofilme de S. mutans - essa redução, segundo os autores,
sugere ser proveniente da inibição da ação de glicosiltransferases.
Ao analisarmos as imagens de MEV que apresentaram modificações da
estrutura do biofilme causadas pelo tratamento com o óleo de P. cattleyanum, foram
observadas rupturas do envoltório celular, deformidades na superfície das hifas e
diminuição da densidade do biofilme (diminuição do hifamento) nas concentrações
do óleo em que houve melhor controle da progressão/estruturação do biofilme. Esta
57
desestruturação do biofilme apresentada nas imagens de MEV sugerem que o óleo
essencial de P. cattleyanum possa atingir estruturas da superfície celular pela
inibição da ação de glucosiltransferases e até mesmo pela redução de expressão de
genes de fatores de virulência ligados à produção de glucanos e matriz extracelular
de leveduras, assim como o extrato hidroalcoólico apresentou atividade antibiofilme
de S. mutans (Brighenti et al., 2012).
É sábido pelos conhecimentos já obtidos em relação ao desenvolvimento
da estrutura do biofilme, que após a fase de adesão às células do hospedeiro ou
superfícies, a Candida albicans prolifera formando microcolônias e começam a
produzir a matriz extracelular. Neste momento, a fim de se evitar uma
superpopulação e modular a formação do biofilme, surge a ação de mecanismos de
comunicação intercelulares (Quorum sensing) que promovem a expressão
diferencial de genes. Esses genes são responsáveis na transição de leveduras para
hifas, na arquitetura da parede celular e na coesividade do biofilme dada pela matriz,
promovendo um crescimento tridimensional da comunidade (Santana et al., 2013).
O biofilme confere à comunidade microbiana maior resistência às drogas,
contudo em nosso estudo o óleo essencial das folhas de P. cattleyanum apresentou
melhor eficácia contra o biofilme de C. albicans comparado ao seu efeito
antimicrobiano considerado fraco sob células planctônicas de C. albicans. A esse
fato consideramos que o desempenho antimicrobriano superior do óleo de P.
cattleyanum sobre os tipos de biofilmes testados, sugere que a ação antimicrobiana
conhecida dos terpenos (Zore et al., 2011) presentes no óleo possivelmente foi
potencializada por um ação de compostos autoreguladores do biofilme, que
passaram a interferir na comunicação intercelular no mesmo, promovendo a
diminuição de sua densidade.
Além da ação antimicrobiana e antibiofilme, o óleo de Psidium
cattlleyanum no ensaio de atividade antiproliferativa das células epiteliais humanas
HaCat, em todas as concentrações testadas (32 mg/ml a 0,5 mg/ml), não apresentou
IC50, ou seja, foi identificado um aumento na proliferação celular em todas as
concentrações acima de 50%, o que sugere que adicionalmente à atividade
anticandida o óleo das folhas de P. cattleyanum var. lucidum apresente também uma
atividade proliferativa em queratinócitos, caracterizando uma baixa citotoxicidade.
58
Baghla et al., 2013, estudando o poder de cicatrização e reparação
tecidual do extrato aquoso de Psidium quajava, uma outra espécie do gênero
Psidium, verificaram que Psidium quajava apresenta atividade antioxidante potente
por inibir a peroxidação lipídica e aumentar a atividade da Superóxido Dismutase
(SOD) e Catalase, além de diminuir o período o de re-epitelização de feridas em
ratos ao promover contração da ferida e aumento da resistência à tração. Assim, a
atividade de cicatrização de feridas pode ser devido à potente atividade de
eliminação de radicais livres causada pelos compostos de Psidium guajava, poder
esse que sugere estender-se aos compostos com ação antioxidante de Psidium
cattleyanum, que sobre as células HaCat podem estar atuando como agentes
antioxidantes a ponto de favorecer o aumento de proliferação celular, contudo
estudos que verifique o potencial antioxidante do óleo testado ainda são
necessários.
Os resultados da presente investigação vão de encontro aos efeitos
relatados pela medicina popular descrita para o Araçá-amarelo (Psdium cattleyanum
var. lucidum), assim como corroboram com os estudo científicos que comprovam
seus efeitos antimicrobianos. Portanto, estudos com óleos essenciais e extratos de
plantas medicinais que caracterizem cientificamente seus efeitos medicinais e sua
composição fitoquímica devem ser incentivados com o intuito de se propor futuras
alternativas clínicas de substâncias/compostos para o combate clínico de infeções,
bem como para o controle de crescimento de microrganismos e tratamento de
superfície como ação preventiva e profilática ao desenvolvimento de biofilme, com o
objetivo de que no futuro, possam ser aplicados na área da saúde de maneira
economicamente viável.
59
7 CONCLUSÃO
O OE das folhas de Psidium cattleyanum é biologicamente ativo de
maneira dose dependente contra as Candida spp. testadas em estado
planctônico.
O OE das folhas de Psidium cattleyanum é biologicamente ativo nos
biofilmes em formação e maduro de C. albicans, controlando a progressão do
biofilme e causando a desestruturação do mesmo, respectivamente.
O OE das folhas de Psidium cattleyanum atua em C. albicans,
rompendo a integridade do envoltório celular e modulando a produção de hifas
nos biofilmes testados, sugerindo potencial ação regulatória quorum sensing.
O OE das folhas de Psidium cattleyanum é considerado de baixa
citotoxicidade em células HaCat por não ter apresentado IC50.
60
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70
ANEXO 1
71
72
73
74
75
Anexo 2
76
ANEXO 3 - Representação dos Picos cromatográficos do óleo essencial de Psidium cattleyanum. Análise realizada através de Cromatografia gasosa em aparelho com espectrometria de massas.
77
ANEXO 4 - Compostos, Índices de Retenção e suas porcentagens identificados no óleo essencial de Psidium cattleyanum através de Cromatografia Gasosa em aparelho com Espectrometria de Massas (CG/EM).