lutzomyialongipalpis (diptera: psychodidae) do estado do
TRANSCRIPT
Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Genética
Nádia Consuelo Aragão
Estudo de Lutzomyialongipalpis (Diptera: Psychodidae) do Estado do Ceará, Brasil, por meio demorfometria
geométrica alar e do marcador nuclear period
Recife
2017
16
Nádia Consuelo Aragão
Estudo de populações de Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) do Estado do Ceará, Brasil, por meio
demorfometria geométrica alar e do marcador nuclear period
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Genética da Universidade Federal de
Pernambuco como parte dos requisitos exigidos para
obtenção do título de Doutora em Genética.
Orientador: Carlos Brisola Marcondes
Coorientador: Valdir de Queiroz Balbino
Recife 2017
i
Catalogação na fonte Elaine Barroso
CRB 1728
Aragão, Nádia Consuelo
Estudo de Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psycodidae) do Estado do Ceará, Brasil, por meio de morfometria geométrica alar e do marcador nuclear period / Nádia Consuelo Aragão- Recife: O Autor, 2017. 93 folhas: il., fig., tab.
Orientador: Brisola Marcondes Coorientador: Valdir de Queiroz Balbino Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de
Biociências. Genética, 2017. Inclui referências e anexos
1. Lutzomyia 2. Filogenia 3. Ceará I. Marcondes, Brisola (orientador)
II. Balbino, Valdir de Queiroz (coorientador) III. Título
595.77 CDD (22.ed.) UFPE/CB-2017-231
ii
Nádia Consuelo Aragão
Estudo de Lutzomyialongipalpis (Diptera: Psychodidae) do
Estado do Ceará, Brasil, por meio demorfometriade geométrica alar e do marcador nuclear period
Aprovado em _23_/_02_/_2017_
Banca Examinadora:
____________________________________________
Dr. Carlos Brisola Marcondes
Universidade Federal de Santa Catarina
____________________________________________ Dr. Valdir de Queiroz Balbino
Universidade Federal de Pernambuco
____________________________________________
Dr. Filipe Dantas Torres Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
____________________________________________
Dr. Sinval Pinto Bradão Filho
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
____________________________________________ Dr. Carlos Alberto Santiago Figueirêdo Júnior
Instituto Brasileiro de Gestão e Marketing
Recife 2017
i
Dedico este trabalho a minha tia avó e madrinha
Maria de Lourdes Aragão (in memoriam). O meu
amor por você é infinito.
i
Agradecimentos
Agradeço, primeiramente, a Deus, pois sem Ele nada seria possível.
Aos meus familiares, especialmente a minha sobrinha Mariana, por todo
amor, orações e paciência: eu os amo!
Aos professores Carlos Brisola Marcondes e Valdir de Queiroz Balbino, pela
oportunidade, confiança, apoio e por todo auxílio na realização deste projeto.
Aos professores e pesquisadores: Eunice Bianchi Galati; Priscila Sábio;
Márcia Bicudo; CecíliaLavitschka; Lincolhn Suesdek; e Camila Lorenz, que
disponibilizaram sua atenção e o seu tempo em estágio e curso para que eu
pudesse aprender sobre as ferramentas necessárias à concretização da pesquisa.
Ao LABBE, que me acolheu durante os anos deste curso.
Aos colegas de trabalho Lidiane, Kláudia, Moisés,Sérgio,Abigail, Carlos,
Marcos Sergipe, Beatriz, Lucas, César,Marcos, Elaine,Karla,Wilson e demais
colegas, pelo apoio, ajuda e amizade.
Aos amigos que fiz nos Estados do Ceará, Pernambuco e São Paulo, onde
fui muito bem recebida durante o meu doutorado. Também agradeço àquelas
pessoas que, mesmo sem nos conhecer, permitiram a instalação de armadilhas em
suas residências e/ou facilitaram o nosso trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Genética da Universidade Federal de
Pernambuco, por todo o apoio recebido.
Ao Centro de Pesquisa Aggeu Magalhaes, pela disponibilização da
infraestrutura para realização de algumas etapas deste trabalho.
À FACEPE, pelo apoio financeiro.
A minha madrinha,Ir. Ana Márcia V.O.T.C.R., agradeço pelo carinho, ajuda,
paciência,incentivo e orações.
ii
Aos Amigos da UBS Cajueiro Seco – Jaboatão/PE, por toda ajuda e apoio.
Aos amigos para sempre: Salomé e familiares, Lindalva, Lorena,
Celita,Maria José, Sarah e João, Hilka, Hercylio, Izabel e Antonio,Vania e equipe do
Laboratório de Entomologia da Prefeitura do Recife, Evellyn,Celeste,Rafaely,
Edson,Lucas,equipes do castramóvel e da Secretaria de meio ambiente de Jaboatão
dos Guararapes, Amanda, Marluce, Sueleide, Cláudia,Geiza, Nelson, Eneida,
Severina, Hozana e àmadrinha,Ir.Maria Faustina O.C.D., agradeço por toda
ajuda,orações e palavras de incentivoe ânimo. Vocês moram em meu coração.
i
“O que eu faço é uma gota no meio de um oceano,
mas sem ela, o oceano seria menor.”
Madre Teresa de Calcutá
ii
Resumo
Lutzomyia longipalpis, vetor da leishmaniose visceral americana, está inserido em um complexo de espécies e diversas análises tem sido desenvolvidas para melhorar o conhecimento acerca desse vetor. Nesse trabalho, avaliou-se o uso da morfometria geométrica alar, da estruturação genética e da análise filognética do gene period na separação de machos das morfoespécies (1S e 2S) do Estado do Ceará. No primeiro estudo, foram analisados, 78 exemplares coletados em Sobral, em março/2012, e, 111 coletados em setembro/2012, em Caririaçu. Uma avaliação morfométrica geométrica para 12 landmarks com análises de tamanho centróide, componentes principais, variáveis canônicas e discriminantes conferiram uma distância de Mahalanobis entre 1S e 2S de 2,0198 e reclassificação com acertos de 80% dos 1S e 73,21% dos 2S. Dados do Genbank foram usados para construção de uma árvore filogenética por inferência bayesiana de um fragmento de 525 pb do gene period que separou corretamente os grupos 1S e 2S com 53% e 48% de suporte dos ramos. No segundo estudo, foram analisados 58 espécimes de Sobral, 59 de Caririaçu e 54 de Bodocó. O DNA foi sequenciado e anáilises estruturação e, filogenética, por máxima verossimilhança, para o gene period, foram feitas. Uma estruturação com K=2 correspondente aos morfotipos analisados e suporte de 55% foram obtidos. Todas as análises aplicadas, demonstraram tendência de separação das espécies crípticas de Lu. longipalpis do Estado do Ceará, conforme o padrão de manchas abdominais proposto por Mangabeira em 1969. Palavras-chave: Lutzomyia longipalpis. Morfometria Geométrica. Gene period.
iii
Abstract
Lutzomyia longipalpis, a vector of American visceral leishmaniasis, is inserted in a complex of species, and several analyses have been developed to improve the knowledge about this vector. In this work, the use of the geometric morphometry, the genetic structuring and the phylogenetic analysis of the period gene in the males of morphospecies 1S and 2S from the state of Ceará was evaluated. In the first study, 78 specimens collected in Sobral, in March / 2012, and 111 collected in September / 2012, in Caririaçu, were analyzed. A geometric morphometric evaluation for 12 landmarks with centroid size analysis, main components, canonical and discriminant variables gave a Mahalanobis distance between 1S and 2S of 2.0198 and reclassification with 80% of the 1S and 73.21% of the 2S. Genbank data were used to construct a phylogenetic tree by Bayesian inference from a 525-bp fragment of the period gene that correctly separated the 1S and 2S groups with 53% and 48% support from the branches. In the second study, 58 Sobral, 59 Caririaçu and 54 Bodocó specimens were analyzed. The DNA was sequenced, and structure analysis and phylogenetic analysis for the period gene by maximum likelihood were generated. A structuring with K = 2, corresponding to analyzed morphotypes and support of 55% was obtained. All the applied analyses showed a tendency of separation of the cryptic Lu.longipalpisspecies of the State of Ceará, according to the pattern of abdominal spots proposed by Mangabeira in 1969.
Keywords:Lutzomyia longipalpis. Geometric Morphometry. Gene period.
iv
Lista de ilustrações
Revisão da literatura
Figura 1: Genitália dos machos de Lutzomyia longipalpis. 23
Figura 2: Machos de Lutzomyialongipalpis. (a) fenótipo 1S (b) fenótipo 2S. 24
Figura 3: Resumo das informações disponíveis para os sons de cortee dos tipos
de feromônio deLutzomyialongipalpis em 14 diferentes populações do Brasil.
26
Figura 4: Divergências nas genitálias dos machos de Lutzomyia longipalpis e
Lutzomyiacruzi
28
CapítuloI
Figura 1:Localização dos 12 landmarks na asa de Lutzomyia longipalpis 45
Figura 2:Gráficos das variáveis canônicas sem alometria demonstrando a
separação dos morfotipos de Lu. longipalpiscom duas e uma mancha
abdominal
47
Figura 3: Árvore filogenética por inferência Bayesiana das sequencias do gene
periodde Lu. longipalpis de Sobral e Caririaçu-CE.
48
Capítulo II
Figura 1: Representação esquemática de polimorfismos de um fragmento de
525 pb do gene period usando Weblogo
61
Figura 2:Mapa de elevação e análise de atribuição genética. A: Mapa de relevo
do Brasil (inserir) ea distância entre as localidades de Bodocó, Caririaçu e
Sobral, que apresenta uma topografia muito robusta que varia de 63 m a 900 m
de altitude. As parcelas de barras geradas pelo software STRUCTURE
inferiram a estrutura genética de populações de Lu. longipalpis de cada local
62
v
estudado. B: Atribuição genética de todas as localidades, os espécimes 1S
fenótipo foram atribuídos ao grupo vermelho, e 2S espécimes foram atribuídos
ao grupo azul. C: Delta K método [35], indicando a presença de duas
populações genéticas.
Figura 3: Árvore AMOVA UPGMA para populações de Lu. longipalpis. UPGMA
construída a partir dos valores de Fst para cada fenótipo e respectivas
localidades. As populações de Sobral e Caririaçu 1S e 2S (SOB1S, SOB2S,
CAR1S e CAR2S) são populações distintas de Bodocó (BOD1SE BOD2S).
64
Fugura 4: Árvore de máxima verossimilhança obtida do modelo TVM + I + G
mostrou os resultados da utilização de 525 pb do marcador period para
Lutzomyia longipalpis. As localidades de Bodocó (BOD), Estado de
Pernambuco e Caririaçu (CAR) e Sobral (SOB), Estado do Ceará, Brasil. A
topologia mostrada (55% de suporte de bootstrap) separa consistentemente as
duas variantes morfológicas conhecidas para os morfotipos 1S e 2S de Lu.
longipalpis, bem como coloca em evidência a posição monofilética derivada do
grupo 2S.
65
i
Lista de Tabelas
Capítulo I
Tabela 1:Percentagem de identificação correta no teste de reclassificação
comparando populações de Lu. longipalpis de Sobral e Caririaçu-CE
48
Capítulo II
Tabela 1:Testes de neutralidade e medidas de diversidade genética intra-
populacional para cada amostra
61
Tabela 2:Diferenciação genética entre amostras 63
Tabela 3:Resultados AMOVA para populações de Lu. longipalpis 64
ii
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos
Item Definição
LVA Leishmaniose Visceral Americana
1S Fenótipo de Lutzomyia longipalpis com uma mancha no 3º tergito
abdominal
2S Fenótipo de Lutzomyia longipalpis com uma mancha no 3º e no 4º
tergito abdominal
IPI Intervalo Interpulso
COI Cytochrome oxidase
PAS-A PER-ARNT-SIM (PAS) Domínio de interação Proteína-proteína A
CLD Domínio de localização citoplasmática
Thr-Gly Região repetitiva dos aminoácidos treonina e glicina
Kb Quilobase
Pb Pares de base
MCMC Cadeia de Markov Monte Carlo
RAPD Bandas de Diagnóstico Aleatórias de DNA polimórfico amplificado
16
Sumário
1. Introdução 16
2. Revisão da Literatura 18
2.1 Leishmaniose Visceral Americana 18
2.2 Lutzomyia longipalpis 21
2.3 Complexo de espécies Lutzomyia longipalpis 24
2.4 Morfometria Geométrica 28
2.5 Gene Period 31
2.6 Inferencia Bayesiana e Máxima Verossimilhança para análise filogenética
33
2.7 Estruturação populacional com o software structure 35
3. Objetivos 38
3.1 Objetivo geral 38
3.2 Objetivos específicos 38
4. Capítulo I 39
5. Capítulo II 58
6.Discussão Geral 68
7. Conclusões 72
Referências Bibliográficas 73
Anexo 1: Regras submissão de pesquisa no periódico Systematic Entomology
78
Anexo 2: Comprovante de Submissão do Artigo 86
Anexo 3: Currículo Lattes 88
16
1. Introdução
O flebotomíneoLutzomyia longipalpis(Lutz e Neiva, 1912)é um díptero
pertencente à família Psychodidae, subfamília Phlebotominae, encontrado na
América Centrale América do Sul. É considerado o principal vetor da Leishmania
infantum,agente etiológico da Leishmaniose Visceral Americana
(LVA),apresentando variações que levam a suspeitar que este inseto constitua
um complexo de espécies crípticas.
O caráter morfológico tem sido um impasse para a separação das
espécies crípticas que compõem o complexo Lu.longipalpis. No entanto, já foi
nominada, até o momento, na Venezuela, Lutzomyia
pseudolongipalpis(Arrivillaga e Feligiangeli, 2001)caracterizada por estudos que
envolveram várias abordagens biológicas, entre elas, agenética e a morfológica.
Uma segunda espécie, Lutzomyiacruzidescrita por
Mangabeira(1938),posteriormente redescrita por Martins et al. (1984), foi
considerada, desde a sua descrição, espécie distinta de Lu.longipalpis. No
entanto,foi lançadamais recentemente a hipótese de sua participação no
complexo Lutzomyia longipalpis.
Ainda tratando sobre abordagem morfológica, temos que a morfometria
geométrica alar é uma técnica que vem sendo bastante utilizada na entomologia
para ajudar a resolver problemas relacionados à identificação de espécies
próximas, populações geográficas de vetorese alguns complexos de espécies.
Baseada na análise da diferença de forma,orienta os estudos que buscam
elucidar a causa dessa diferença, e quando associada a outros testes, tem
maiorconfiabilidade, oferecendo um suporte aos resultados obtidos.
17
A análise de alguns genes foi importante para o atual conhecimento do
complexo Lu.Longipalpis eestudos realizados empopulações simpátricas e
alopátricas do mesmo insetoratificou a qualidade do geneperiod como marcador
de especiação para resolver o problema dessas espécies do complexo
Lu.longipalpis, no Brasil.
O presente estudo,por meio das análises morfométricageométrica
alar,filogenética do gene periode estruturação populacional
buscaevidenciarpossíveis divergências entre as morfoespécies simpátricas de
Lu. longipalpisdoEstado do Ceará,conforme o padrão de manchas abdominais
proposto por Mangabeira em 1969, e caracterizaram a divisão das populações
de Lu. longipalpis, dos municípios de Sobral e Caririaçu, no Ceará, em grupos
populacionais com diferentes padrões morfológicos de uma ou duas manchas
abdominais,sugerindo a extensão dessa condição para o município de Bodocó,
em Pernambuco.
18
2. Revisão da Literatura
2.1 LeishmanioseVisceral Americana
A Leishmaniose Visceral Americana (LVA) é uma doença parasitária com
grande importância para a saúde pública mundial e com alta incidência no Brasil.
Para as Américas, no período de 2001 a 2014 foram registrados de 48.720
casos de leishmaniose visceral com uma média anual de 3.480 casos, dos quais
que 96,42% (46.976), estão concentrados no Brasil (OPAS/OMS, 2016).
Inicialmente, no Brasil, essa enfermidade tinha um caráter rural, no
entanto, vem se expandindo para as áreas urbanas de médio e grande porte,
principalmente associada a ambientes de baixo nível socioeconômico e pobreza
(Brasil, 2003).
A LVA caracteriza-se como uma enfermidade cujo período de incubação
no homem é 10 dias a 24 meses, com média entre 2 a 6 meses, e no cão é
bastante variável, de 3 meses a vários anos com média de 3 a 7 meses (Brasil,
2003), sendo a LV caracterizada em humanos principalmente por febre de longa
duração, emagrecimento, anemia, fraqueza e pode evoluir para óbito em mais
de 90% dos casos quando não tratada; enquanto no cão (principal reservatório
urbano) desde a falta de sintomas até febre irregular, apatia, emagrecimento,
crescimento exagerado das unhas, descamação furfurácea, úlceras, conjuntivite,
paresia do trem posterior e fezes sanguinolentas são os sintomas mais
característicos; as raposas e os marsupiais são os principais reservatórios da LV
silvestre (Brasil, 2016).
19
Os vetores da LVA são os flebotomíneos, insetos conhecidos
popularmente como mosquito palha, birigui, cangalhinhas etc. (Marcondes et al.,
2011) e No Brasil, Lu.longipalpis (vetor principal) e Lu.cruzi são as duas
espécies relacionadas com a transmissão dessa enfermidade.
O hospedeiro vertebrado é infectado com promastigotas quando picado
pelo vetor, assim, as promastigotas penetram nos macrófagos circulantes e
multiplicam-se como amastigotas depois rompem os macrófagos, quando são
liberadas e infectam outros macrófagos. Dessa forma, a transmissão ocorre
enquanto houver o parasitismo na pele ou no sangue periférico do hospedeiro;
depois, o vetor ingere macrófagos infectados durante o repasto sanguíneo e as
amastigotas são liberadas no intestino do mosquito e multiplicam-se como
promastigotas (Brasil, 2003).
As promastigotas, no vetor são denominadas, em procíclicas,
haptomonadas, nectomonadas, paramastigotas e metacíclicas, conforme o seu
desenvolvimento, e somente as últimas são consideradas formas infectantes
para os hospedeiros vertebrados, quando transmitidas durante a alimentação
sanguínea do vetor; mas, observou-se, que o próprio vetor é capaz de se
infectar experimentalmente com as formas promastigotas da leishmania, sendo
esta uma forma mais fácil de infecção para condições de laboratório(Freitas et
al., 2012).
As estratégias de controle dessa endemia estão centradas no
diagnosticoe no tratamento precoce dos casos humanos, na redução da
população de flebotomíneos, na eliminação dos reservatórios e nas atividades
de educação em saúde (Brasil, 2016).
20
Para os casos humanos, o diagnóstico é rotineiramente realizado com
base em parâmetros clínicos e epidemiológicos, mas ainda existem o
diagnóstico imunológoco pela técnica da reação de imunofluorescência indireta
(RIFI) e da Enzyme Linked Immunossorbent Assay (ELISA), e principalmente o
último é usado em inquéritos populacionais; também ocorre o diagnóstico
molecular por métodos de hibridização com sondas específicas e técnicas de
amplificação de ácidos nucléicos, incluindo a reação em cadeia da polimerase -
transcriptase reversa (RTPCR) para detecção de RNA e PCR para detecção de
DNA, além do diagnóstico com base no exame parasitológico, que é definitivo,
(Contijo e Melo, 2004).
O levantamento, a investigação e o monitoramento entomológico dos
vetores é feito de acordo características epidemiologicas e entomologicas da
localidade analisada, por meio de coleta manual com tubo de sucção ou
capturador motorizado, coletas com armadilha adesiva, armadilhas luminosas e
armadilhas com animais ou com feromônios, para melhor conhecer a presença,
dispersão e sazonalidade desses vetores; já o controle químico é feito utilizando
deltametrina, cypermetrina, lambdacyalotrina entre outros produtos inseticidas
de ação residual (Brasil 2003). Para os cães a eutanásia é recomendada a
todos os animais com sorologia positiva ou parasitologico positivo, enquanto
para os humanos, a medida de controle é o tratamento que é feito com
Antimoniais e anfotericina B, sendo usada, também, as pentamidinas (isotionato
e mesilato) principalmente na Europa e África (Brasil 2003, Brasil, 2016).
As medidas de prevenção para LV em humanos estão ligadas a evitar a
exposição em horários de atividade do vetor, proteção química pelo uso de
repelentes e mecânica, com o uso de telas e mosquiteiros, por exemplo, e a
21
educação ambiental e em saúde; já para os cães, o uso de coleiras impregnadas
de deltametrina e de telas nos canis são indicados; enquanto para os vetores,
manejo e saneamento ambiental que reduzam o número de ambientes propícios
para sua proliferação, até o momento, são a melhor alternativa para a evita-los.
(Brasil, 2016).
2.2 Lutzomyia longipalpis
Identificado por Lutz e Neiva, no ano de 1912, em uma localidade incerta
no Brasil, o flebotomíneoLu. longipalpis foi associado à transmissão da
leishmaniose visceralna década de 1930 (Chagas, 1936). No entanto, apenas
em 1977, foi provado, por meio de infecção experimental e pela análise das
capacidades de infecção e transmissão, assim como da distribuição geográfica,
que este inseto era o principal vetor do parasito causador da LVA (Lainsonet al.,
1977).
O ciclo de desenvolvimento desse insetoacontece em um a dois meses ou
até mais, e passa pelas fases de ovo, larva com quatro ínstares(em que as do
gênero Lutzomyiaapresentam duas cerdas na parte posterior do corpo durante
primeiro instar e quatro cerdas, nos três últimos),que se desenvolveno soloúmido
e se alimentada matéria orgânica ali depositada, posteriormente pupa e emerge
o adultoquese alimenta de açúcares de plantas e secreção de afídeose apenas a
fêmea precisa da alimentação sanguínea para maturar seus ovos. (Marcondes,
2011).
Ostroncosocos e raízes tubulares de árvores, as grutas e fendas, nas
rochas, os criatórios dos animais domésticos além das paredes externas e
22
internasdos domicílios são os principaiscriadouros/abrigos do Lu.
longipalpis(Deane e Deane,1957, Aguiar e Medeiros,2003).
Esse vetorjá foi encontrado em diversos biomas, comoos associados à
Floresta Amazônica, com áreas de transição para o Cerrado e o Pantanal;
Cerrado, Floresta Atlântica e Caatinga (Missawa e Lima, 2006, Cutolo e Von-
Zuben, 2008, Dantas-Torres et al., 2010).
Inicialmente, existia uma natureza rural na distribuição do Lu.longipalpis e,
consequentemente, da LVA no Brasil. No entanto, ao longo dos anos, o número
crescente de casos autóctones, nos grandes centros urbanos (Costa,
2008,Rangel e Vilela, 2008)e a recente descoberta desse inseto e de cães
infectados no entorno de um cemitério em área urbana no Rio de Janeiro (Brasil,
2013)demonstram uma crescente adaptação desse inseto ao ambiente
antropizado. Logo, Lu.longipalpisé uma espécie em adiantado processo de
domiciliação e com grande adaptação aos ambientes modificados pelo homem
(Aguiar e Medeiros, 2003).
A presença deste inseto é relatada nas Américas Central e do Sul, do
México até a Argentina, e o mesmo possui uma ampla distribuição no território
brasileiro(Young e Duncan, 1994,Aguiar e Medeiros, 2003).
Lu. longipalpis é caracterizado, morfologicamente, por apresentar, nos
exemplares machos, quatro espinhos nos gonóstilos e cerdas dorsais curvas em
forma de chifre de antílope que estão inseridas em seus parâmeros. Já nas
fêmeas, as espermatecas são pequenas, cilíndricas e levemente enrugadas, e
apresentam um comprimento cerca de quatro vezes maior que sua
largura(Figura 1) (Young e Duncan, 1994).
23
Figura 1: Genitália dos machos e fêmeas de Lutzomyia longipalpis. Destaque em vermelho para as cerdas em forma de “chifre de antílope”. Fonte:Young e Duncan, 1994.
Os machos dessa espécie trazem uma ou duas manchas claras nos
tergitos abdominais, por isso, são considerados fenótipos 1S (uma mancha no
terceiro tergito) ou 2S (duas manchas, uma no terceiro e outra no quarto tergito),
respectivamente. As fêmeas são indistinguíveis de algumas outras do mesmo
gênero, sendo necessária a presença do macho para uma correta diagnose da
espécie, a exemplo do que ocorre com Lu. cruzi(Young e Duncan, 1994).
Quanto a sua classificação taxonômica, considerava-se que na subfamília
Phlebotominae, ordem Diptera, estavam agrupados seis gêneros de
flebotomíneos:Phlebotomus; Sergentomyia e Chinius,Brumptomyia, Lutzomyia e
Warileya. (Young e Duncan, 1994).
Com o avançar das pesquisas, ao longo dos anos, uma nova distribuição,
em 31 gêneros, foi proposta (RISPAIL et al., 1998, Galati, 2003) e vem sendo
paulatinamente aceita pelos especialistas (Marcondes, 2011).
24
No Continente Americano, são reconhecidas atualmente 520 espécies e
17 fósseis. O gênero Lutzomyiapossui 82 espécies e dessas, 21estão
classificadas no subgênero de mesmo nome (Galati, 2016).
2.3 O complexo de espécies Lutzomyia longipalpis
Divergências no número de manchasclaras observadasnos tergitos
abdominais (Figura 2) de populações de Lu. longipalpisencontradas nos Estados
do Ceará e do Pará (Mangabeira, 1969)foram as primeiras evidências
sugestivasda existência de um possível complexo de espécies envolvendo esse
flebotomíneo.
Figura 2: Machos de Lutzomyia longipalpis. (a) fenótipo 1S (b) fenótipo 2S.Fonte: LABBE-UFPE.
25
Inicialmente, testes sobre o isolamento reprodutivo entre diferentes
populações brasileiras(Wardet al., 1983), investigações micromorfológicas das
manchas(Lane e Ward, 1984),distribuição dos morfotipos (Wardet al.,
1985)isoenzimas (Mutebi et al., 1999) foram realizados a fim de aprofundar o
conhecimento sobre este vetor econfirmar a existência do complexo de
espécies, no Brasil. Dos resultados deses estudos, apenas as isoenzimas
indicaram que as populações analisadas pertenciam uma única espécie.
Outras formasde abordagemtambém foram utilizadas, entre elas
amorfometria tradicional que foi, de uma forma geral, inconclusiva(Azevedo et
al., 2000), os tipos de feromônios produzidos, em que foram reconhecidos quatro
diferentes tipos (3- Methil-a-himachalene, 9-methilgermacrene-B, Cembrene-1 e
Cembrene-2) (Hamiltonet al., 1999a; Hamiltonet al., 1999b; Hamiltonet al.,
2005), e quando associados aos love songs de populações brasieliras (Souza et
al., 2004) burse ou pulse (em seus quatro tipos), caracterizam bem essas
populações que estãosinalizadas por distribuição geográfica na Figura 3 (Araki
et al., 2009).
Nos estudos genéticos, os microssatélites sinalizaram a separação das
morfoespécies 1S e 2S de Sobral, no Ceará(Maingon et al., 2003), os genes
nucleares também apresentaram tais divergências, primeiramente com retenção
de polimorfiso ancestralno gene period (Bauzer et al., 2002) e com o avançar
das pesquisas, paralytic e, mais recentemente, period, apresentaram fixações de
polimorfismos (Arakiet al., 2009,Araki et al, 2013,Costa Jret al,. 2015)enquanto
os outros genes, nas demais populações brasileiras já analisadas, apontaram
para a separação das espécies, porém, ainda apresentando introgressãoe a
ausência de polimorfismos fixados (Araki, 2015).
26
Figura 3. Resumo das informações disponíveis para os sons copulatórios e dos tipos de feromônio deLutzomyia longipalpis em 14diferentes populações do Brasil. Fonte: ARAKI et.al.,2009.
Na América do Sul, são reconhecidos quatro grupos genéticos do
complexo Lu.longipalpis identificados por meio do marcador mitocondrial
Citocromo oxidase(COI). No entanto, sob essas condições, as populações
brasileiras analisadas foram agrupadas como uma única espécie (Arrivillaga et
al., 2002).
A primeira espécie do complexo a ser nominada foiLu. pseudolongipalpis,
da Venezuela, em estudos que envolveram, por exemplo, isoenzimas, genes
mitocondriais (cox1),feromônios (9-methyl-himacaleno) e caracteres
morfológicos (diferenças nas larvas L4 e, para as fêmeas adultas, discrepâncias
nos dentes verticais do cibário, cercos e valvíferos)(Arrivillaga e Feligiangeli,
2001).Hoje, já estão identificadas três populações endêmicas dessa espécie,
nesse país (Arrivillaga e Marrero, 2009).
Araki et al. (2009) revisaram os dados a respeito das populações
brasileiras do complexo Lu. longipalpise, reunindoos resultados da análise de um
27
fragmento do gene period, padrões de sons de corte e os tipos de feromônio
produzidos, sugeriram que aseparação das espécies crípticas está basicamente
associada aos padrões de sons de corte (Figura 3), e sob esta óptica, sugerem
que no Brasil existem, pelo menos,dois principais grupos elecionados por esses
loves songs.
A espécie Lu.cruzi descrita por Mangabeira(1938), e redescrita por Martins
et al. (1984),também foi indicada a fazer parte do complexo Lu. longipalpis após
as análises de feromônios, pois apresenta o tipo 9-methilgermacrene-B (Watts
et al., 2005), sons de corte(tipo Burst) e de polimorfismosdo gene
period(Vigoderet al., 2010). Nas análises de microssatélites,a divergência
encontrada é similar a das espécies-irmãs do complexo (Watts et al., 2005).As
fêmeas desses flebotomíneos são,até o momento, morfologicamente
indistinguíveis dasde Lu. longipalpis e os machos apresentam, apenas,
pequenas disparidades na genitália(Figura 4) (Young e Duncan,
1994).Epidemiologicamente, esse inseto é considerado um vetor secundário da
LVA, pois está relacionado a sua transmissão,no Brasil,pelo menos, em áreas
onde o Lu. longipalpis não foi encontrado (Wattset al., 2005).
28
Figura 4: Divergências na genitália dosmachos de A- Lu.longipalpis e B- Lu. cruzi.Em azul,tufo basal de cerdas do gonocoxito. Em A- Cerdas espiniformes. Em B- Cerdas foliáceas.Em vermelho, cerdas em forma de “chifre de antílope”.Fonte:Young e Duncan, 1994.
Elucidar esta antiga questão taxonômica que envolve o complexo Lu.
lngipalpis é primordial para mudar o cenário epidemiológico da LVA, indicando
possíveis vetores principais e secundários, além de suportar estudos ecológicos
para um mais claro conhecimento a respeito desses vetores.
2.4 Morfometria Geométrica
A morfometria geométrica compara indivíduos da mesma espécie ou de
espécies filogeneticamente próximas e transforma marcos anatômicos em
coordenadas cartesianas que simbolizam formas geométricas sem os efeitos de
tamanho, posição e orientação para estudar as causas das diferenças das
formas nestes organismos (Monteiro e Reis, 1999).Baseada em análises
29
estatísticas, esta técnica combina ferramentas de geometria, gráficos de
computadore dados biométricos para proceder a uma análise multivariada,a fim
de detectar variação na forma biológica (Bookstein, 1997).
O uso de marcos anatômicospermite a comparação quantitativa das formas
dos organismos. Quando aplicada à sistemática, a morfometria geométrica é
capaz de sinalizar mudanças de forma que, muitas vezes, são indetectáveis pela
morfometria tradicional(Dujardin et al., 2010)
Na entomologia médicaessa técnica tem sido aplicada comouma
ferramenta bastante útil para estudar, por exemplo, problemas que envolvem
populações geográficas de vetores (Dujardin et al., 2008) e espécies próximas
(Gurgel et al., 2011, Vidal et al., 2011).
Duas espécies próximas de triatomíneos, vetores da doença de Chagas,
tiveram seus nichos ecológicos avaliados por meio da morfometria geométrica
das asas e cabeças e, apesar das análises discriminantes apresentarem
sobreposição,evidenciou-se que uma das espécies avaliadas, Triatoma
garciabesi, ocupaáreas mais frias e secas do que a outra, Triatoma sordida,
melhorando os critérios operacionais na delimitação dessas espécies
fenotipicamente semelhantes(Gurgel et al., 2011).
Bastante aplicada aos insetos, a morfometria alar se utiliza da estrutura
praticamentebidimensional da asa para reduzir o erro e permitir comparações
válidas de um determinadofenótipo entre indivíduos, populações locais e/ou
espécies, desde que haja homologia entre os pontos de referência (Dujardin,
2008).
Estudos que buscaram identificar, com precisão, espécies de mosquitos de
três gêneros epidemiologicamente bastanteimportantes, usando morfometria
30
alar, tiveram sucesso na correta diagnose dos gêneros: Aedes, Culex e
Anopheles peloformato daasa, demonstrando quepara os níveis hierárquicos
inferiores (subgêneros e espécies), a morfometria geométrica das asas também
foi eficiente, resultando em altas pontuações de reclassificação (Wilke et al.,
2016). O mesmo ocorreu com diferentes linhagens de Aedes aegyptida
Tailândia, mantidas em laboratório, que foram corretamente diagnosticadas por
meio da morfometria geométrica alar (Jirakanjanakit e Dujardin et al., 2005).
A morfometria geométrica alar, também,mostrou-se eficazna separação de
espécies co-genéricasCulex,uma vez que, Culex quinquefasciatus,principal vetor
da filariose broncofitiana,e Culex nigripalpus, vetor de arboviroses e encefalites,
podem conviver em simpatria em ambientes urbanos e peri-urbanos e
apresentam uma difícil diagnose quando danificados(Vidal et al., 2011)
Complexos de espécies foram avaliados por meio da morfometria
geométrica sugerindo que este método pode ser utilizado para espécies crípticas
por utilizar parâmetros matemáticos derivados de coordenadas originais,
cuidando para que alguns critérios sejam observados, como por exemplo, que o
mesmo usuário proceda a tomada dos marcos anatômicos para evitar erros
estatísticos do tipo um,rejeitando-se uma hipótese nula verdadeira(Dujardin,
2010).
Os machos das espécies crípticas das abelhas de orquídeas Euglossa
viridissima eEuglossa dilema são morfologicamente crípticos, com exceção do
número e forma dos dentes mandibulares epor meio da morfometria geométrica
das interseções de veias alares, as duas espécies foram separadas (em menor
grau, os morfotipos da espécie E. viridissimaque apresentam variação na forma
dos dentesmandibulares) (Quezada-Euán et al., 2015). Poruma análise
31
discriminanteda forma da célula radial,demonstrou-seque há separação entre os
três grupos, embora com maior erro de classificação entre E. viridissima e E.
dilema, identificando,pela morfometria geométrica alar,as espécies e morfotipos,
contribuindo para a taxonomia infragenérica para abelhas com sua aplicação
apoiadapor outros métodos (Quezada-Euán et al., 2015).
Por ser uma técnica de rápida execução e baixo custo, a morfometria
geométricapode ser associada a outras técnicas explorando melhor os
resultados obtidos e aumentando a confiabilidade das informações
geradas(Lorenz et al., 2012).
2.5 Gene period
O gene nuclear period está localizado no cromossomo X de Drosophila
melanogaster, codificando um cofator de transcrição envolvido no relógio
biológico e foi identificado por Konopka e Benzer (1971) a partir da detecção dos
mutantes perº¹, pers e perL que alteram a duração do ritmo
circadiano,caracterizado por ser o ciclo de atividade locomotora em 24 horas
(Konopka e Benzer,1971, Müller, 2009).
A transcrição da proteína period, codificada pelo gene de mesmo nome, é
regulada por retroalimentação. O referido gene possui regiões bem conservadas
(PAS-A, CLD e C-Domain) euma região altamente variável Thr-Gly, que está
relacionada à termoestabilidade do comportamento circadiano e mudanças no
intervalo interpulso(IPI).As mutaçõesocorridas nas regiões PAS-A ocasionam os
ritmos longos 29h, na C-Domain ciclos curtos de 16h e 19h e em Thr-Gly podem
32
provocar alterações no ritmo dos sons de corte,pois podem afetar o IPI (Konopka
e Benzer,1971, Müller, 2009).
Em Drosophila melanogaster, esse gene tem um tamanho aproximado de
3,6 quilobase (Kb), apresenta apenas um íntron com mais de 50 pares de
bases(pb) e transcreve um polipeptídeo com aproximadamente 1200
aminoácidos. Esse genetem evolução rápida, uma altataxa de substituições e
essas características o destacam em relação a outros genes nucleares para um
bom marcador nuclear com uso indicado na reconstrução filogenética de táxons
abaixo do nível de família (Regier et al.,1998).
Uma vez que a separação das espécies crípticas brasileiras do complexo
Lu.longipalpis, de acordo com Araki et al. (2009), estão basicamente associadas
aos padrões de sons de corte, o gene period torna-se um bom marcador para
tratar de diferenças espécie-específicas entre essas espécies.
Recentemente, uma análise realizada com o gene period, envolvendo três
populações de Nyssomyiaumbratilisde duas regiões brasileiras (Norte e
Nordese), resultou na separação de dois grupos, em que duas populações de
regiões distintas (Recife e Rio Preto da Eva) foram geneticamente associadas e,
a partir desses resultados, sugeriu-se a existência de um complexo de espécies
entre essas populações (Freitas et al., 2015).
A análise de um fragmento de 266 pbdeste gene também detectou
variações de polimorfismos que caracterizaram a divisão da população de Lu.
longipalpis encontrada em Sobral em duas populações, 1S e 2S (Bauzer et al.,
2002, Araki et al., 2013), e para um fragmento com 525 pares de bases,existeo
relato de fixação de polimorfismos para estas mesmas morfoespécies, além de
33
ampliar a exitência do complexo para o município de Bodocó, em Pernambuco
(Costa Jret al., 2015).
2.6 Inferencia Bayesiana e Máxima Verossimilhança para análise
filogenética
A a nálise filogenética estuda a relação antepassado-
descendenteestimada a partir dos caracteres estudados,cuja relação é
representada em árvores filogenéticas. A InferenciaBayesiana e a Máxima
Verossimilhança são méodos baseado em modelos estatísticos de evolução
molecular,comumente empregados nessa análise, onde se leva em conta o
conhecimento a priori que se tem sobreos dadosanalisados (Peña, 2011).
InferênciaBayesiana
A abordagem bayesiana ébastante útil quando o número de hipóteses
alternativas é extenso. Os estatísticos bayesianos evitam o padrão de
abordagem em que se especifica uma hipótese como hipótese nula, mas
procuram verificar se os dados são ou não robustos o suficiente para serem
rejeitados, uma vez que o output dessaanálise é a probabilidade a posteriori de
qualquer solução, e as regras da probabilidade podem ser usadas para testar se
a hipótese deve ser acreditada e o quão fortemente e,como resultado, milhões
de ciclos são geralmente necessários, enquanto que muito menos (da ordem de
1.000) repetições são suficientes no método de agrupamento por bootstrap, para
34
a resolução da maioria dos problemas (Holder e Lewis, 2003).(Holder e
Lewis,2003).
Na metodologia da Cadeia de Markov Monte Carlo (MCMC) para a
filogenia, é a partir de uma árvore inicial que uma nova árvore é proposta. Os
passos que mudam a árvore devem envolver uma escolha aleatóriaque satisfaça
várias condições e uma amostra para cada ciclo é produzida, em que as árvores
sejam altamente autocorrelacionadas. (Holder e Lewis, 2003).
Três populações de Nyssomyia umbratilis, principal vetor de Leishmania
guyanensis, foram filogeneticamente analisadas por meio do marcador
nuclearperiod. A análise de inferência bayesiana, pela metodologia de MCMC,
indicou diferença, revelando dois clados distintos e bem suportados, com valores
de probabilidade de 0,98 ou 98%,em queum clado estava composto pelas
amostras de Recife (PE) e Rio Preto da Eva (AM), e o outro, pelas amostras de
Manacapuru (AM). Isso demonstra que as populações de Recife e Rio Preto da
Eva estão mais estreitamente relacionadas evolutivamente e reforça a
possibilidade de que os indivíduos de Recife estejam ligados ancestralmente a
indivíduos de Rio Preto da Eva (Freitas et al.,2015).
Para o complexo Lu. longipalpis, a análise do gene COI, usando a
metodologia da MCMC na inferência bayesiana para a filogenia, não indicou o
usodesse gene como um bom marcador molecular, uma vez que a árvore obtida
sugeriu um único grupo genético associado aos tipos de morfologia 1S e 2S de
Sobral e Caririaçu, e não foi capaz de caracterizar a relação ancestral ea origem
geográfica das populações (Freitas et al.,2016).
35
Máxima Verossimilhança
No método da Máxima Verossimilhança, verifica-se a probabilidadeda
matriz decaracteres estar melhor explicada pelas árvores geradas,calculando-se
cada árvore possível,conforme o modelo de
evoluçãoselecionado(Felsenstein2004, Peña, 2011).
Nesse método procura-se encontrar a árvore evolutiva que produza a
mais alta probabilidade de evolução observando-se os dados, de forma que a
probabilidade de uma árvore é aprobabilidade dos dados em função da hipótese
segundo o modelo escolhido, considerando-se que a hipótese (a árvore) é a que
melhor explica os dados. Isto significa que a probabilidades paradiferentes
árvores não somam à unidade e que aprobabilidade de uma árvore não é a
probabilidade de que a árvoreé a correta (Peña, 2011).
Em flebotomíneos, estudo realizado, no Sri Lanka, analisando os genes
COI, cytochrome oxidase b, internal transcribed spacer 2, e as regiões do DNA
ribossonal 18s e 28s de Phlebotomus (Euphlebotomus) argentipes sensu lato, a
análise genética usando o método da máxima virossimilhança suporta a
existência de dois grupos de espécies crípticas (A e B) da espécie em questão,
ao invés de três, conforme anteriormentedetectado (Gajapathy, 2013)
2.7 Estruturação populacional com o software structure
A definição das populações é de grande importância para se verificar a
estruturação genética das mesmas e, geralmente, essa definição é feita
36
considerando-se a origem geográfica das amostras ou fenótipos (Evanno et al.,
2005).
O software structure usa o método de análise bayesiana e MCMC para a
identificação de grupos geneticamente homogêneos de indivíduos, dessa forma,
atua numa questão de genética populacional pela estatística ad hok ΔK, com
base na taxa de mudança na probabilidade log de dados entre sucessivos
valores K, que são os números de agrupamentos encontrados (Evanno et al.,
2005).
Foley et al. (2013) relatam queem Arequipa,no Peru, Triatoma
infestans,está distribuídodentro e ao redor do centro urbano e essas populações
compartilham uma história evolutiva recente,emborao fluxo genético esreja
restrito mesmo entre os locais proximos.Segundo a análise populacional
realizada, a diferença entre os distritos na distribuição de freqüência de alelos foi
evidente,embora a maioria dasClusters foram encontrados na maioria dos
distritos. Os distritos localizados no centro da cidade(Paucarpata e Mariano
Melgar) foram semelhantes entre si a todos os valores de K. Osdistritos
periurbanos(Sachaca, Cayma e Characato) diferiram pouco na composição
eFreqüência de clusters populacionais das áreas do centro da cidade,
especialmente a valores baixos de K.Os distritos rurais são os mais distintos do
centro da cidade (La Joya e Quequeña), embora La Joya fosse muito mais
semelhante aos distritos urbanos.
A análise de estruração populacional realizada por Freitas et al.
(2015) com o software structure, demonstrou pela estatística de ΔKquea
formação mais provável era de dois grupos (K) homogêneos para as três
populações de Lu. umbratilis analisadas,e sob essa perspectiva, a população de
37
Manacapuru (sul do rio Amazonas) formou um grupo e as populações de Rio
Preto da Eva (norte do rio Amazonas) e Recife representou o outro
agrupamentopopulacional,l e esses resultados, apoiados pelas outras
metodologias utilizadas, fizeram com que os autores sugerissem que este inseto
deveria ser melhor investigado a fim de desvendar se essas populações não
pertenceriam, na verdade, a um complexo de espécies.
38
3. Objetivos
3.1 Objetivo geral
Oferecer informações extraídas, a partir de caracteres morfológicos das asas e
análise filogenética do gene period, por inferência bayesiana eMáxima
Verossimilhança e verificar a estrutura populacional a fim de contribuir para a
separação das espécies crípticas de Lu. longipalpisencontradas no Estado do
Ceará.
3.2 Objetivos específicos
1. Desenvolvera uma análise de morfometria geométrica alar nos espécimes
do complexo Lu. longipalpisencontrados no Estado do Ceará.
2. Proceder a uma análise filogenética por inferência bayesiana eMáxima
Verossimilhança utilizando o marcador nuclear period.
3. Analisar a estrutura genética das três localidades (Caririaçu, Sobral-CE e
Bodocó-PE) para cada fenótipo (1S e 2S) e verificar a extensão do
complexo longipalpis para a cidade de, Bodocó em Pernambuco.
4. Verificar se o critério de separação por manchas abdominais proposto por
Mangabeira et al. (1969)é aplicável para a identificação das espécies
crípticas de Lu. longipalpis do Ceará.
39
4. Capítulo I
40
Wing morphometry and period gene phylogenetic analysis of Lutzomyia longipalpis sand flies from Ceará, Brazil
Nádia Consuelo Aragão1
E-mail: [email protected]
Sérgio de Sá Leitão Paiva Júnior¹
E-mail: [email protected]
Moises Thiago de Souza Freitas1
E-mail: [email protected]
César Raimundo Lima Costa Jr1
E-mail: [email protected]
Abigail Marcelino dos Santos Silva¹,
Email:[email protected]
Lidiane Gomes da Silva1
E-mail: [email protected]
Valdir de Queiroz Balbino1
E-mail: [email protected]
Carlos Brisola Marcondes2* *Corresponding author
E-mail: [email protected]
1 Departamento de Genetica, Universidade Federal de Pernambuco, Avenida
Professor Moraes Rego S/N, Cidade Universitaria, 50732-970 Recife,
Pernambuco, Brazil
41
2 Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Universidade
Federal de Santa Catarina, Campus Reitor João David Ferreira Lima, 88040-900
Florianopolis, Santa Catarina, Brazil
ABSTRACT
Lutzomyia longipalpis, a vector of Leishmania infantum in the American continent,
is constituted by a species complex, with two recognized species. In the present
study, wing morphometry was evaluated for the differentiation of cryptic species in
Brazilian state of Ceará, previously defined by the period nuclear gene and the
pattern of abdominal spots in males (1S and 2S), as proposed by Otávio
Mangabeira in 1969. Specimens were collected in Sobral and Caririaçu
municipalities, in Ceará State, Brazil. Right wings of males were photographed
and 12 landmarks were digitalized. Analyses of centroid size, Procrustes
superimposition, principal components, canonical variate analysis, regression,
discriminant analysis, were developed. Genbank data were utilized for the
construction of a Bayesian phylogeny from a 525 bp fragment of the period gener.
Mahalanobis distance between specimens 1S and 2S was 2.0198 with p<0.001.
Even being observed a certain overlap in the canonic space observed, Lu.
longipalpis groups correctly clusterized in crossed reclassification in 80% of 1S
and 73.21% of 2S. The period gene separated these groups adequately by the
analysis utilizing Bayesian inference. Geometric morphometry demonstrated a
tendency to separate cryptic species of Lutzomyia longipalpis from the state of
Ceará, agreeing to the analysis of the period gene and the pattern of abdominal
spots proposed by Mangabeira in 1969.
Keywords: American Visceral Leishmaniasis Vector; Phlebotomine Sand Flies;
Wing Morphometry; Period Nuclear Marker.
42
Introduction
The sand fly Lutzomyia longipalpis is distributed from Mexico to Argentina and is
considered as the major vector of Leishmania infantum, the etiologic agent of
visceral leishmaniasis in the American continent (Lainson et al., 1977).
Otávio Mangabeira (Mangabeira, 1969) firstly reported the presence of one
or two pairs of abdominal white spots in males of Lu. longipalpis, inducing the
suspicion of the existence of a species complex in this "species". Several
approaches have been utilized to investigate this taxonomic question, including,
for example, reproductive isolation between Brazilian populations with different
pattern of spots (Ward et al., 1983), association between morphology of spots and
pheromones (Lane & Ward, 1984), distribution of morphotypes (Ward et al., 1885),
isoenzyme analysis (Mutebi et al., 1999), lovesongs (Souza et al., 2004, Vigoder
et al., 2015), pheromone identification (Hamilton et al., 2005) and genetic analysis
(Bauzer et al., 2002, Costa Jr et al., 2015, Lins et al., 2008).
Four genetic groups have been recognized in South America by the
utilization of Cox1 mitochondrial marker, and analyzed brazilian populations were
grouped in one clad (Arrivillaga et al., 2002). Additional studies suggested the
existence of two groups, mostly differentiated by lovesongs (Souza et al., 2004). In
this context, Sobral municipality, in Ceará, is a particular case, due to the
presence of two different taxonomic groups, separated by the number of
abdominal spots, types of pheromones, lovesongs and genetic markers, even
being sympatric (Araki et al., 2009).
Two sister species in Lu. longipalpis complex have already been named,
the first one in Venezuela, Lu. pseudolongipalpis, caracterized by mitochondrial
genes, morphology of females, ethologic and reproductive differences (Arrivillaga
& Feligiangelli, 2001). It was afterwards incriminated as a vector of visceral
leishmaniasis in that country (Agrela et al., 2002). A second species, Lutzomyia
cruzi (Mangabeira, 1938), was redescribed (Martins et al., 1984) and its
participation on the complex was hypothesized after analysis of period gene and
lovesongs, when similarities compatible to those found in the sister species were
43
seen (Vigoder et al., 2010). The females of these sand flies could not yet be
differentiated from those of Lu. longipalpis, and males presented small differences
in external genitalia (Young & Duncan, 1994). Additionally, analysis of
microsatellites, pheromones (Watts et al., 2005), lovesongs and period gene
demonstrated levels of divergence similar to those of sister species (Vigoder et al.,
2010). Lu. cruzi has been associated to transmission of visceral leishmaniasis in
the absence of Lu. longipalpis in the Brazilian state of Mato Grosso do Sul-Brasil
(Santos et al., 2013).
The period nuclear marker, a gene known to be involved in the circadian
cycle, has been indicated as useful for the phylogenetic reconstruction below the
family level (Regier et al.,1998). The utilization of a fragment of this gene has
detected polymorphism variation permitting the separation of the population of Lu.
longipalpis from Sobral into two subpopulations (1S and 2S) (Lins et al., 2008,
Araki et al., 2013), reporting fixation of polymorphisms for these species (Costa Jr
et al., 2015).
Geometric morphometry analyses differences among forms of organisms in
the same species or phylogenetically related species (Monteiro & Reis, 1999). In
medical entomology, it has been utilized to study, for example, questions on
geographic populations of vector species (Dujardin et al., 2008), related species
(Gurgel et al., 2011, Vidal et al., 2011) and species complexes, obtaining very
interesting results. Being a rapid and low-cost technique, it may be associated to
other techniques, enhancing the reliability, and better exploring the obtained
results (Lorenz et al., 2012).
The present study analyzed by wing morphometry two cryptic species of Lu.
longipalpis obtained from the municipalities of Sobral and Caririaçu, in Ceará,
defined by the abdominal spots, and a phylogenetic analysis by the period gene.
44
Methods
Biological material
Insects were collected from Sobral (3°41'15" S; 40°21'5" W, 70 m a.s.l.), in March
2012, and Caririaçu (07°02'31"S; 39°17'02" W, 713 m a.s.l.), in September 2012.
Mean temperatures fluctuated from 23°C to 36°C and annual rainfall from 936 to
1100 mm. Both localities are in BSw‘h’ climate in accordance to the Köppen
climate classification and are inserted in highly xerophillous caatinga (Peel et al.,
2007, Pennington et al., 2000). Male specimens of Lu. longipalpis were identified
by morphology (Young & Duncan, 1994) and separated considering the quantity of
abdominal spots (1S or 2S), individually preserved in 96% ethanol and maintained
at -20oC. One-hundred sixteen specimens were utilized for the geometric analysis
and voucher specimens were deposited into the Reference Entomological
Collection of Department of Microbiology, Immunology and Parasitology of Federal
University of Santa Catarina.
Special abbreviations (Marcondes, 2007) for genera of sand flies were utilized.
Acquisition of data for geometric morphometry
Right wings of 30 1S sand flies from each locality and 30 2S from Sobral and 26
2S from Caririaçu were photographed, utilizing a MOTIC 2.0 camera, coupled to a
trinocular microscope, MOTIC 168, with 2X objective and 3X zoom. Twelve
landmarks (Fig. 1) were digitalized and transformed into coordinates in the
cartesian plane utilizing TpsDig software v.1.40 (QSC - James Rohlf). All
digitalizations were developed by the same user, to reduce the error level
(Dujardin et al., 2010).
45
Figure 1 Location of the 12 landmarks in Lu. longipalpis wing
Geometric morphometry analysis
Analyses of centroid size, Procrustes superimposition, principal components,
canonical variate analysis, regression, discriminant analysis, and Accuracy test
(classification and reclassification test) were developed. TpsUtil 1.29, TpsRelw
1.39 (QSC - James Rohlf), MorphoJ 1.02, GraphPad InStat softwares were
utilized. Graphs were generated by MorphoJ 1.02 software (Klingenberg, 2011).
Phylogenetic analysis
Seventy-three sequences of Lu. longipalpis males, 18 from Sobral and 55 from
Caririaçu-CE, already available in Genbank (Costa Jr et al., 2015) from specimens
obtained in the same collections of samples utilized for geometric morphometry,
were analyzed. Sequence alignment using the Clustal W integrated in the
Software Package MEGA v. 6.0 (Tamura et al., 2013). The phylogenetic tree was
generated by Mr. Bayes v 3.2.0[35] with 4000000 generations, using the evolutive
model HKY+I+G, obtained by JModelTest v 2.1.4 [36]. Phlebotomus dubosqi
sequence (AY071913) was utilized as an outgroup to give more support to groups
(Delavi et al., 2001; Roung et al., 2010).
46
Results
Analysis by geometric morphometry
Kolmogorov-Smirnov was initially utilized to check statistic normality of centroids
for measuring the size in pixels of right wings of both morphospecies (1S and 2S).
Considering only the pattern of abdominal spots and disregarding the locality, a
median of 963.35 (Max 1072.4 – Min 814.41) was obtained for 1S insects and
967.66 (Max 1070.1 – Min 799.07) for 2S. T test indicated a non-significant
difference, with a p-value of 0.8459.
In the analysis for localities, the median of centroid size for Sobral 1S was 978.24
px (Max 1072.4 – Min 895.1) and for 2S was 988.09 px (Max 1070.1 – Min 892). In
Caririaçu, medians were 950.8 px (Max 1047.5– Min 814.1) for 1S and 937.98 px
(Max 1022.5 – Min 799.07) for 2S. Analysis of variance (ANOVA) indicated a very
significant difference between the isometric size of populations analyzed by
locality and pattern of abdominal spots (p-value = 0.0002). Tukey-Kramer test of
multiple comparisons was developed and indicated significant difference between
populations with a value of q greater than 3.692 (p-value <0.05). So, differences
between Caririaçu 1S and Sobral 1S (q=4.048, P<0.05), Caririaçu 1S e Sobral 2S
(q=4.336 e P<0.05) and principally between Caririaçu 2S and Sobral 1S (q=4.973,
P<0.01) and between Caririaçu 2S and Sobral 2S (q=5.250, P<0.01). No
significant difference between variances in populations 1S and 2S of the same
localities were observed.
In Principal Component Analysis (MorphoJ), a correlation between variables was
obtained, and three first principal components totaled 67.88% of total variance of
samples (PC1 34.81%;PC2 22.35%; PC3 10.72%), not differentiating
morphospecies.
Including allometry (influence of size on shape) on canonic variables Mahalanobis
distance between specimens 1S and 2S was 1.8572 with p<0.001. Between
groups, greater Mahalanobis distance value was 3.0069 for Caririaçu 1S and
Sobral 2S specimens and the smaller was 1.8276 for Caririaçu 1S and 2S
specimens (p-value <0.001) for the permutation test with 10000 repeats.
47
Analyzing canonical variables without allometry (Fig. 2) between morphotypes, a
canonical variable corresponded to all the observed variation. On the other hand,
populations analyzed by locality, the first variable constituted 55.17% of the total
variation of shape, the second 31.38% and the third 13.45%. Mahalanobis
distance of 2.0198 with p<0,001 between morphotypes. Higher Mahalanobis
distance between groups was 2.9416 for specimens of 1S from Caririaçu and 2S
from Sobral and lower was 2.0325, between specimens 1S from Sobral and 1S
from Caririaçu (p-value <0.001) for the permutation test with 10000 repeats.
Fig. 2 Graphs of canonical variations without alometry, demonstrating separation of
morphotypes with two and one abdominal spots (A) and between populations of
Lu.longipalpis from Sobral and Caririaçu-CE (B).Populations: Caririaçu 1S, Caririaçu 2S, Sobral 1S and Sobral
2S. Morfospecies 1S (Caririaçu 1S e Sobral 1S) and 2S (Caririaçu 2S and Sobral 2S).
48
In discriminant analysis of morphotypes, 80% of individual insects 1S and 73.21%
of 2S were correctly reclassified. Between groups in localities, the best proportions
of reclassifications were those between Caririaçu 1S and Sobral 2S, in which 80%
of 1S individuals and 76.66% of 2S were correctly reclassified. The worst
proportions in the cross-validation test were between Caririaçu 2S and Sobral 2S,
whose proportions of individuals correctly reclassified for 1S and 2S were
respectively 61.54% and 60% (Table1).
Table 1 Percentage of correct identification in the reclassification test comparing populations of Lu. longipalpis from Sobral and Caririaçu-CE.
Populations Reclassification hits (%)
Caririaçu 1S X Caririaçu
2S
70 73,33
Caririaçu 1S X Sobral 1S 70 56,66
Caririaçu 1S X Sobral 2S 80 76,66
Caririaçu 2S X Sobral 1S 65,38 66,66
Caririaçu 2S X Sobral 2S 61,54 60
Sobral 1S X Sobral 2S 73,33 70 Populations: Caririaçu 1S, Caririaçu 2S, Sobral 1S and Sobral 2S.
Phylogenetic analysis
Phylogenetic analysis identified two monophyletic clades in Lu. longipalpis with
support de 0.5301 for 1S morphotypes and 0.4855 for morphotypes 2S. Even not
indicating a geographic separation between taxa, phenotypic groups1S e 2S were
adequately separated (Fig. 3).
49
Figure 3 Phylogenetic tree – Bayesian inference of Lu. longipalpis sequences from
Sobral and Carriaçu-CE, utilizing fragment525bp of period gene
andPhlebotomusdubosqi sequence as a outgroup.
Discussion
Sister species of Lutzomyialongipalpis complex found in Sobral-CE are considered
as "sympatric cryptic species", and most genetic, biochemical, and behavioral
(courtship sounds and reproductive isolation) tests applied to these populations
can separate them or indicate a separation according to the criterion of abdominal
spots proposed by Mangabeira in 1969.
50
Morphological characterization has always been an impasse for the nomination of
these species. Azevedo et al. (2000) investigated by classical morphometry and
biochemistry populations of Lu. longipalpis from five Brazilian states, including
Ceará (municipality of Canindé), and could not characterize one and two spots
populations evaluating structures of head, thorax, and abdomen of insects. For the
population from Ceará, only the length of a flagellomere (F14) was significantly
different.
In the present study, no isometric size of morphospecies was significantly
different, but when populations from two localities separated by 553,3 km and with
an altitudinal difference of 643 m, a great difference between Caririaçu and Sobral
populations was shown. Altitudinal variations may influence the size of structures
(Dujardin, 2008, Lorenz et al. 2014), and previous studies on Lu. longipalpis (De la
Riva et al., 2001) and Nyssomyia intermedia (Marcondes et al., 1999) have also
shown significant variations associated to altitude and other factors.
When the shape was analyzed eliminating the effect of size in the canonical
variables without allometry, the result was very significant and the Mahalanobis
distance between morphotypes was 2.0198, indicating a proximity between them.
Godoy et al. (2014) analyzed 13 landmarks among three previously described
species of Lutzomyia involved in the transmission of Leishmania braziliensis: Ny.
intermedia , Ny. neivai and Ny. whitmani, and found Mahalanobis distance of 1.64
between Ny. intermedia and Ny. neivai, considered as "cryptic species", and of
2.83 between Ny. neivai and Ny. whitmani. Vector insects of other groups difficult
to differentiate by morphology also were successfully separated by geometric
morphometry. Lorenz et al. (Lorenz et al., 2012), utilizing 18 landmarks, found
Mahalanobis distance of 3.50 entre Anopheles cruzii and A. homunculus, whose
females are morphologically similar. The distance between A. cruzii and A. bellator
was 4.58, and 4.32 between A. homunculus and A. bellator.
In the analysis by localities, Mahalanobis distances were a little greater (2.9416 for
specimens 1S from Caririaçu and 2S from Sobral) and smaller distance was
2.0325, between Sobral 1S and Caririaçu 1S.
51
Genetically distinct populations of Lutzomyialongipalpis complex from Toro Toro
(T) and Yuncas (Y), in Bolivia, to new populations from Bolivia (U and R) and
Nicaragua (N), considering origin, behavior, pattern of abdominal spots and
reports of Leishmania infantum transmission were compared by geometric
morphometry, utilizing five landmarks. Mahalanobis distances between
populations varied from 6.4 (N and Y/Re Y) to 22.1 (R and U) and discriminant
analysis separated samples in two groups, N Y R and U T. The values of
reclassification varied from 60% (N) to 76% (T), and the first group included
samples with one or two abdominal spots, from localities in low and high altitudes
and insects related or not to active transmission of Leishmania. While those in the
second group had two spots, came from high altitude localities, and had no known
epidemiological role, being less conflicting the genetic diagnosis for these
populations (De la Riva et al., 2001).
The superposition of canonical morphospace in our graphs for morphospecies and
populations of Lu. longipalpis also was observed for species previously studied
(Lorenz et al., 2012, Godoy et al., 2014). However, in the accuracy analysis,
groups analyzed by reclassification indices through cross validation for
morphospecies were between 70% and 83.33%, which are values near those
observed for species recognized as distinct in Anopheles (Lorenz et al., 2012),
even with some superposition of canonical morphospace. This demonstrates that,
even being very similar, as observed by Mahalanobis distances, these groups may
be separated. Nyssomyia intermedia and Ny. neivai were wrongly identified
(29/104), that is, only 73.12% were correctly identified after cross validation, while
six and 11 of 104, respectively between Ny. whitmani and Ny. neivai and between
Ny. whitmani and Ny. intermedia were wrongly identified after cross validation
(Godoy et al., 2014). Our values of reclassification could demonstrate similar or
greater values than those for recognized of sand fly species of the same genus.
In Colombia, GM was unsuccessfully utilized to separate Anopheles spp. of
albitarsis complex, since there were no significant results for allometry (P-value =
0.070) or to shape variation (P-value = 0.144 after Bonferroni correction). Groups
were separated only through COI gene analysis, which evidenced two groups (I an
52
F) in different localities and both in sympatry in only one municipality (Gomez et
al., 2013).
The genetics analysis using 525 bp of period marker and Bayesian inference
method showed a good differentiation between cryptic species of Lu. longipalpis in
Sobral, with a better resolution than that previously obtained which used 266 bp
and the Neighbor-joining method that was not capable to solve the separation of
different genotypic groups (Bauzer et al., 2002). As occurs with the paralytic gene
(Lins et al., 2008), period gene presents fixed polymorphisms differentiating two
cryptic species found in Sobral-CE and Bodocó-PE (Costa Jr et al., 2015).
Study using 21 nuclear loci involving sympatric (Sobral 1S and 2S) and allopatric
populations of Lu. longipalpis ratified the quality of period gene as a marker of
speciation to morphotypes from Ceará in what introgression was observed, and an
association to environmental factors could be inferred, with possible
epidemiological consequences, and the authors considered that visceral
leishmaniasis has a tendency to urbanization (Araki et al., 2013).
Based on clustering analysis results obtained in this study, the geometric
morphometry was shown to corroborate results obtained in previous studies that
indicate differences between cryptic species of sand flies from Ceará, as the
molecular analysis.
Conclusion
Wing geometric morphometry showed, after clusterization analysis, a
tendency to differentiation of sympatric cryptic species of Lutzomyialongipalpis
complex found in municipalities of Sobral and Caririaçu, agreeing to phenotypic
pattern of abdominal spots proposed by Mangabeira in 1969. This result
emphasizes the relevance of pattern of spots as morphological markers of these
and the importance of the relatively non-expensive technique of geometric
morphometry as a good tool for their recognition, corroborating the analysis of the
fragment of nuclear gene period.
53
Ethical approval
Ethical approval was not required for the current study
Competing interests
The authors declare that they have no competing interests. Authors’ contributions:
VQB and CBM designed and supervised the study; NCA, MTSF collected and
identified the specimens; NCA and SSLPJ developed the GM and statistical
analyses; MTSF,AMSS, NCA and LGS performed the bioinformatics analyses;
NCA and CBM wrote the manuscript; CBM translated it to English; CBM and VQB
revised the final version of the manuscript. All authors read and approved the final
manuscript.
Acknowledgments
This study was supported by Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do
Estado de Pernambuco (IBPG1165-2.02/11), and Ministério da Saúde, Brazil (TC
300/2013). VQB was supported by CNPq, Grant Number 309124/ 2012-3. We are
also grateful to the Secretaria de Saúde dos Municípios de Sobral and Caririaçu
for assistance and logistic support.
Author details
1 Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Avenida da
Engenharia S/N, Cidade Universitária, 50.740-600 Recife, Pernambuco, Brazil. 2
Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Universidade Federal
de Santa Catarina, Campus Reitor João David Ferreira Lima, 88040-900
Florianópolis, Santa Catarina, Brazil.
References Agrela, I., Sanchez, E., Gómez, B., Feliciangeli, M.D. (2002) Feeding behavior of Lutzomyia pseudolongipalpis (Diptera: Psychodidae), a putative vector of visceral leishmaniasis in Venezuela. Journal of Medical Entomology, 39:440-45.
54
Araki, A.S., Ferreira, E.M., Mazzoni, C.J., Souza, N.A., Machado, R.C., Bruno, R.V., Peixoto, A.A. (2013) Multilocus analysis of divergence and introgression in sympatric and allopatric sibling species of theLutzomyia longipalpiscomplex in Brazil. PLoS Neglected Tropical Disease, 7: e245.
Araki, A.S., Vigoder, F.M., Bauzer, L.G.S.R., Ferreira, G.E.M., Souza, N.A., Araújo, I.B., Hamilton, J.G.C., Brasil, R.P., Peixoto, A. (2009) Molecular and behavioral differentiation among brazilian populations of Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae). PLoS Neglected Tropical Disease, 3:e365. doi: 10.1371/journal.pntd.0000365
Arrivillaga, J.C., Feligiangelli, M.D. (2001) Lutzomyia pseudolongipalpis: The first new species within the longipalpis (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) complex from La Rinconada, Curarigua, Lara State, Venezuela. Journal of Medical Entomology, 38:783-90.
Arrivillaga, J.C., Norris, D.E., Feliciangeli, M.D., Lanzaro, G.C. (2002) Phylogeography of the neotropical sand fly Lutzomyia longipalpis inferred from mitochondrial DNA sequences. Infection Genetics and Evolution,2:83-95.
Azevedo, A.C., Monteiro, F.A., Cabello, P.H., Souza, N.A., Rosa-Freitas, M.G., Rangel, E.F. (2000) Studies on populations of Lutzomyia longipalpis (Lutz&Neiva,1912) (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) in Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 95:305-22.
Bauzer, L.G., Gesto, J.S., Souza, N.A., Ward, R.D., Hamilton, J.G., Kyriacou, C.P., Peixoto, A.A. (2002) Molecular divergence in the period gene between two putative sympatric species of the Lutzomyia longipalpis complex. Molecular Biology and Evolution, 19:1624-27.
Costa Jr, C.R.L., Freitas, M.T.S., Figueirêdo Jr, C.A.S., Aragão, N.C., Silva, L.G., Marcondes, C.B., Dias, R.V., Leal-Balbino, T.C., Souza, M.B.R., Ramalho-Ortigão, M., Balbino, V.Q. (2015) Genetic structuring and fixed polymorphisms in the gene period among natural populations of Lutzomyia longipalpis in Brazil. Parasites & Vectors, doi 10.1186/s13071-015-0785-6.
Dalevi, D., Hugenholtz, P., Blackall, L.L. (2001) A multiple-outgroup approach to resolving division-level phylogenetic relationships using 16S rDNA data. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51: 385-91.
De la Riva, J., Le Pont, F., Ali, V., Matias, A., Mollinedo, S., Dujardin, J.P. (2001) Wing geometry as a tool for studying the Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) complex. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 96: 1089-94.
Dujardin, J.P. (2008) Morphometrics applied to medical entomology. Infection Genetic and Evolution, 8:875–890.
Dujardin, J.P., Kaba, D., Henry, A.B. (2010) The exchangeability of shape. BMC Research Notes, 3:266; doi: 10.1186/1756-0500-3-266.
55
Godoy, R.E., Galati, E.A., Cordeiro Estrela, P., Souza, N.A., Santos, T.V., Sousa, L.C., Rangel, E.F. (2014) Comparative study of the phlebotomine sand fly species (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) of the genera Nyssomyia Barretto, 1962, Bichromomyia Artemiev, 1991, and Migonemyia Galati, 1995, vectors of American cutaneous leishmaniasis in Brazil. Zootaxa, 3838:501-17. doi: 10.11646/zootaxa.3838.5.1.
Gómez, G., Jaramillo, L., Correa, M.M. (2013) Wing geometric morphometrics and molecular assessment of members in the Albitarsis Complex from Colombia. Molecular Ecology Research, 13:1082-92. doi: 10.1111/1755-0998.12126.
Gurgel-Gonçalves, R.,Ferreira, J.B.,Rosa, A.F.,Bar, M.E.,Galvão. C. (2011) Geometric morphometrics and ecological niche modelling for delimitation of near-sibling triatomine species. Medical and Veterinary Entomology, 25:84-93; doi: 10.1111/j.1365-2915.2010.00920.x.
Hamilton, J.G., Maingon, R.D., Alexander, B., Ward, R.D., Brazil, R.P. (2005)Analysis of the sex pheromone extract of individual male Lutzomyia longipalpis sandflies from six regions in Brazil. Medical and Veterinary Entomology, 4:480-8.
Klingenberg, C.P. (2011) MORPHOJ: an integrated software package for geometric morphometrics. Molecular Ecology Resourch, 11: 353-357.
Lainson, R., Ward, R.D., Shaw, J.J. (1977) Experimental transmission of Leishmania chagasi, causative agent of neotropical visceral leishmaniasis, by the sandfly Lutzomyia longipalpis. Nature, 266: 628-30.
Lane PR, Ward RD. The morphology and possible function of abdominal patches in males of two forms of the leishmaniasis vector Lutzomyia longipalpis (Diptera: Phlebotominae). Cah ORSTOM, Série Entomologia médica et Parasitolgia. 1984; 22:245-9.
Lins, R.M.M.A., Souza, N.A., Peixoto, A.A. (2008) Genetic divergence between two sympatric species of the Lutzomyia longipalpis complex in the paralytic gene, a locus associated with insecticide resistance and lovesong production. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 103: 736-40.
Lorenz, C., Marques, T.C., Sallum, M.A.M., Suesdek, L. (2014) Altitudinal population structure and microevolution of the malaria vector Anopheles cruzii (Diptera: Culicidae). Parasites & Vectors, 7:581. doi:10.1186/s13071-014-0581-8.
Lorenz, C., Marques, T.C., Sallum, M.A.M., Suesdek, L. (2912) Morphometrical diagnosis of the malaria vectors Anopheles cruzii, An. homunculus and An. bellator. Parasites & Vectors, 5:257.
Mangabeira O. (1969) Sobre a sistemática e biologia dos Phlebotomus do Ceará. Revista Brasileira de Malariologia e Doenças Tropicais, 21:3-26.
56
Mangabeira, O. (1938) Sobre duas novas especies de Flebotomus (Diptera: Psychodidae). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 3:349-56.
Marcondes, C.B. (2007) A proposal of generic and subgeneric abbreviations for phlebotomine sandflies (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) of the world. EntomologicalNews,118:351–356.
Marcondes, C.B., Lozovei, A.L., Falqueto, A., Brazil, R.P., Galati, E.A.B., Aguiar, G.M., Souza, N.A. (1999) Influence of altitude, latitude and season of collection (Bergmann’s rule) on the dismensions of Lutzomyia intermedia (Lutz & Neiva, 1912). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 94:693-700.
Martins, A.V., Falcão, A.L., Silva, J.E., Dias, E.S. (1984) Nota sobre Lutzomyia (Lutzomyia) cruzi (Mangabeira, 1938) com a descrição da fêmea (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 4:439-42.
Monteiro, L.R. & Reis, S.F. (1999) Princípios de morfometria geométrica. Ribeirão Preto: Holos. pp189.
Mutebi, J.P., Alexander, B., Sherlock, I., Wellington, J., Souza, A.A., Shaw, J., Rangel, E.F., Lanzaro, G.C. (1999) Breeding structure of the sand fly Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva) in Brazil. Am J Trop Med Hyg 61:149-57.
Peel, M.C., Finlayson, B.L., McMahon, T.A. (2007) Updated world map of the Koppen-Geiger climate classification. Hydrolgy and Earth Systm Sciences, 11:1633-44.
Pennington, R.T., Prado, D.E., Pendry, C.A. (2000) Neotropical seasonally dry forests and Quaternary vegetation changes. Journal Biogeography, 27:261-273.
Posada, D. (2008) jModel test: phylogenetic model averaging. Molecular Biolog and Evolution, 25:1253–56.
Reigier, J.C., Fang, Q.Q., Mitter, C., Peigler, R.S., Friedlander, T.P., Solis, M.A. (1998) Evolution and phylogenetic utility of the period gene in Lepidoptera. Molecular Biology and Evolution, 15:1172-82.
Rong, L.A., Yan-Zhou, Z., Hui-Jie, Q.,Wei-Feng, S.H.I., Murphy, R.W., Chao-Dong, Z.H.U. (2010) Outgroup selection in tree reconstruction: a case study of the family Halictidae (Hymenoptera: Apoidea).Acta Entomologica Sinica, 53:192-201.
Ronquist, F. & Huelsenbeck, J.P. (2003) Mr. Bayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics, 19:1572–1574.
Santos, M.F.C., Ribolla, P.E.M., Alonso, D.P., Andrade-Filho, J.D., Casaril, A.E., Ferreira, A.M., Fernandes, C.E., Brazzil,. R.P., Oliveira, A.G. (2013) Genetic Structure of Lutzomyia longipalpisPopulations in Mato Grosso do Sul, Brazil, based on microsatellite markers. PLoS One, 9:e74268. doi:10.1371/journal.pone.0074268.
57
Souza, N.A.,Vigoder, F.M., Araki, A.S., Ward, R.D., Kyriacou, C.P., Peixoto, A.A. (2004) Analysis of the copulatory courtship songs of Lutzomyia longipalpis in six populations from Brazil. Journal of Medical Entomology; 5:906-13. doi: http://dx.doi.org/10.1603/0022-2585-41.5.906.
Tamura, K., Stecher, G., Peterson, V.,Filipski, A., Kumar, S. (2013) MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Molecular Biology and Evolution, 12:2725-2729.doi: 10.1093/molbev/mst197.
Vidal, P.O., Rocha, L.S., Peruzin, M.C. (2011) Wing diagnostic characters for mosquitoes Culex quinquefasciatus and Culex nigripalpus (Diptera: Culicidae). Revista Brasileira de Entomologia, 55: 134-37.
Vigoder, F.M., Araki, A.S., Bauzer, L.G.S.R., Souza, N.A., Brazil, R.P., Peixoto, A.A. (2010) Lovesongs and period gene polymorphisms indicate Lutzomyia cruzi (Mangabeira, 1938) as a sibling species of the Lutzomyia longipalpis (Lutz and Neiva, 1912) complex. Infection Genetic and Evolution, 6:734-39.
Vigoder, F.M., Souza, N.A., Brazil, R.P., Bruno, R.V., Costa, P.L., Ritchie, M.G., Klaczko. L.B., Peixoto, A. (2015) Phenotypic differentiation in love song traits among sibling species of the Lutzomyia longipalpis complex in Brazil. Parasites & Vectors, 8:290. doi: 10.1186/s13071-015-0900-8.
Ward, R.D., Ribeiro, A.L., Ready, P.D., Murtagh, A. (1983) Reproductive isolation between different forms of Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva), (Diptera: Psychodidae), the vector of Leishmania donovani chagasi Cunha & Chagas and its significance to kala-azar distribution in South America. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 78:269-280.
Ward, R.D., Ribeiro, A.L., Ryan, L., Falcão, A.L., Rangel, E.F. (1985) The distribution of two morphological forms of Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva) (Diptera: Psychodidae). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 2:145-148.
Watts, P.C., Hamilton, J.G.C., Ward, R.D., Noyes, H.A., Souza NA, Kemp SJ, Feligiangelli, M.D., Brazil, R., Maingon, R.D. (2005) Male sex pheromones and the phylogeographic structure of the Lutzomyia longipalpis species complex (Diptera: Psychodidae) from Brazil and Venezuela. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 73:734-43.
Young, D.G. & Duncan, M.A. (1994) Guide to the identification and geographic distribution of Lutzomyia sand flies in Mexico, the West Indies, Central and South America (Diptera:Psychodidae). Memories of the American Entomological Institute, 54:1-881.
58
5. Capítulo II
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
6. Discussão geral
O uso exclusivo da taxonomia tradicional,não permite a correta identificação
das espécies formadoras do complexoLu. longipalpis(Araki et al., 2009), apesar
das diferentes populações brasileirasapresentarem um bom isolamento
reprodutivo (Wardet al., 1983).
As espécies crípticassão, em geral, propostas pelo reconhecimento de
linhagens geneticamente distintas de espécies que foram tradicionalmente
definidasa partir de caracteres morfológicos.Dessa forma, abordagens
multidisciplinaresem que dados morfológicos, bioquímicos, etológicos e genéticos
pudessem ser avaliados conjuntamente, melhorariam o entendimento a respeito
do confuso status taxonômico dasespécies analisadas e apoiariam a
confiabilidade dos resultados apresentados (Tan et al., 2009).
A primeira espécie do complexo Lu. longipalpis descrita, Lu.
pseudolongipalpis, da Venezuela, foi caracterizada por divergência na genitália
dos exemplares do sexo feminino.Embasaram também esta descrição pesquisas
que envolveram genes mitocondriais e caracteres morfológicos, etológicos e
reprodutivos(Arrivillaga e Feligiangeli, 2001).
Para o Brasil, em função dos estudos,até o momento, desenvolvidos, a
literatura aponta para a existência de uma alta complexidade na divergência eum
possível fluxo gênico entre as populações de Lu. longipalpis. As espécies irmãs
que produzemsons de corte tipo Burst e feromôniocembrene-1estão distribuídas
principalmente nas regiões costeiras doNordeste eaté Pancas, no
Sudeste;enquanto as populações que produzem diferentes tipos de sons dePulse
69
e diferentes feromônios são muito mais heterogêneas, e, provavelmente,
representam cinco espécies incipientes com diferentes níveis de divergência
(Araki et al., 2009).
A morfologia sempre foi um impasse para a descrição das espécies crípticas
brasileiras de Lu. longipalpis e informações extraídas a partir de caracteres
morfológicos das asas tem sido bastante úteispara a entomologia médica
(Dujardin et al. 2008, Gurgel et al. 2011, Vidal et al. 2011). Nesse contexto,o
presentetrabalho demonstrou, pela análise de clusterização dos resultados da
análise morfométrica alar, que existe uma forte tendência de separação das
espécies crípticas simpátricas do complexo Lu. longipalpisdos municípios de
Sobral e Caririaçu, emconcordância com o critério de separação pelo mesmo
padrão de manchas abdominais proposto pela literatura (Mangabeira, 1969).
Amostras populacionais de exemplares 1S e 2S provenientes do município
de Sobraldemonstram, pelas análises já realizadas, que as duas espécies-irmãs
simpátricasque lá se encontrampodem ser discernidas pelos caracteres
fenotípicosdas manchas abdominais primariamente diagnosticados nos machos
(Mangabeira, 1969), por meios moleculares (genes period e paralytic),
bioquímicos (tipos de feromônios) e pelo padrão dos sons de corte, além de
demonstrarem um importante isolamento reprodutivo (Wardet al. 1983,Bauzeret
al. 2002, Lins et al, 2008, Araki, 2009).
Pesquisas demonstram, inclusive, que a situação do complexoLu. longipalpis
no Brasil é mais bemdefinida nos locais onde esses exemplares se encontram em
simpatria (Araki, 2009, Araki et al., 2013) e ratificam a eficiência do marcador
period como marcador de especiação(Araki, 2009, Araki et al., 2013, Freitas et al.
2015).
70
Nossas pesquisas ampliaram o conhecimento das epécies simpátricas de
Lu. longipalpis demontrando fixação de polimorfimos SNP’s(124 e 424) nos
exemplares de Sobral e Caririaçu-CE e ampliando essa condição aos
encontrados no município de Bodocó-PE.
Em recente análise multilocos realizada por Araki et al. (2015) os valores de
FST alcançados com 266 pb do gene period para as morfoespécies de Sobral foi
de 0, 395 e não encontra sítios fixados. Em nossa pesquisa, com 525 pb, para os
morfotipos simpátricos, esse valor aumenta para 0.50016 e são apresentados
dois polimorfismos fixados, fato que também se repete para as localidades de
Caririaçu e Bodocó informando um maior nível de estruturação genética entre os
morfotipos, e nesta última, o valor de FST é de 0,66122.Para as populações de
Lu. umbratilis avaliadas por Freitas et al. (2015) os valores de FST entre as
populações analisadas é de 0.89677 entre Manacapuru e Rio Preto da Eva
(separadas geograficamente pelo rio Amazonas), com 17 polimorfismos fixados, e
0.89357 entre Manacapuru e Recife, com 16 polimorfismos fixados. Já entre
Recife e Rio Preto da Eva este valor diminui para 0.00261 e nenhum polimorfismo
fixado. Nesse último trabalho, existe isolamento geográfico entre as populações
analisadas e a existência de um complexo de espécies para Lu. umbratilis é
sugerida.
A eficiência do gene period também foi confirmada por nossos trabalhos,
além de uma moderada resolução da máxima verossimilhança e da inferência
bayesiana para geração de árvoresfilogenéticasem que os grupos analisados
foram individualizados conforme o padrão de manchas abdominais proposto.
Além disso, o software Structure também demonstrou que essas espécies estão
geneticamente bem estruturadas.
71
Pesquisadores, entomólogos especializados em flebotomíneos e outros
insetos vetores defendem que já existem evidências suficientes para nominar
essas espécies irmãs (Brandão-Filhoet al., 2009) e os trabalhos publicados já
demonstram que essas espécies foram submetidas a abordagem multidisciplinar
com resultados satisfatórios.
A distinção entre as espécies do complexoLu. Longipalpisexistentes no
Brasil viabilizará a análise de possíveis diferenças biológicas, como as
constatadas para Lu. longipalpis e Lu. pseudolongipalpis, além da eficiência
vetorial dessas espécies na transmissão da leishmaniose visceral, a exemplo do
que ocorre com os membros do complexo Anopheles gambiae em que apenas
Anopheles gambiae s.s. e Anophelesarabiensis, entre sete espécies crípticas
reconhecidas,são importantes vetores de Plasmodium na África (White, 1974).
72
7. Conclusões
• A análise morfométrica geométrica realizada a partir dos caracteres
morfológicos das asas, demonstra, por meio da análise de clusterização,
uma tendência de separação das espécies crípticas simpátricas do
complexo Lu.longipalpis, encontradas nos municípios de Sobral e
Caririaçu-CE, confirmando, portanto, a importância dessa técnica como
ferramentade apoio na solução desses impasses morfológicos.
• O fragmento do gene nuclear periodcom 525pb, por meio de inferência
bayesiana e da máxima verossimilhança, apresenta-se como um bom
marcador taxonômico para caracterizar estas espécies crípticas do
complexo Lu. longipalpis.
• As análises realizadas com o software Structure demostraram uma boa
estruturação genética entre as amostras dos municípios do Ceará e de
Pernambuco, evidenciando uma boa distinção entre as morfoespécies analisadas.
• As metodologias empregadas em nossos estudos coneguiram demonstrar
tendência de separação dos morfotipos avaliados pelo padrão fenotípico de
manchas abdominais proposto por Mangabeira, em 1969, demontrando
que este é um critério importante para a separação morfológica das
espécies crípticas simpátricas analisadas.
73
Referências Bibliográficas
Aguiar GM and Medeiros VM (2003) Distribuição regional e habitats das
espécies de flebotomíneos do Brasil. In: Rangel E F and Lainson R (eds) Flebotomíneos do Brasil, Fiocruz, Rio de Janeiro, pp 207-255.
Araki AS, Vigoder FM, Bauzer LGSR, Ferreira GEM, Souza NA, Araujo IB, Hamilton JGC, Brazil RP and Peixoto AA (2009) Molecular and Behavioral Differentiation among Brazilian Populations of Lutzomyialongipalpis (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae). PLos Negl Trop Dis 3:1-12.
Araki AS, Ferreira EM, Mazzoni, CJ, Souza NA, Machado RC, Bruno RV and and Peixoto AA (2013) Multilocus analysis of divergence and introgression in sympatric and allopatric sibling species of the Lutzomyia longipalpis complex in Brazil. PLos Negl Trop Dis. 7: e245
Arrivillaga JC and Feliciangeli MD (2001) Lutzomyia pseudolongipalpis: the first new species within the longipalpis (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) complex from La Rinconada, Curarigua, Lara State, Venezuela. J Med Entomol 38: 783-790.
Arrivillaga JC, Norris DE, Feliciangeli MD and Lanzaro GC (2002) Phylogeography of the neotropical sand fly Lutzomyia longipalpis inferred from mitochondrial DNA sequences. Infec Genet Evol 2: 83-95.
Arrivillaga JC e Marrero, R. (2009) Dos Nuevas Poblaciones de Lutzomyia pseudolongipalpis Arrivillaga y Feliciangeli (Diptera: Phlebotominae) Vector de Leishmaniasis Visceral en Venezuela. Neotrop Entomol, 38: 56-559.
Azevedo ACR, Monteiro FA, Cabello PH, Souza, NA, Rosa-Freitas MG and Rangel EF (2000) Studies on populations of Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva, 1912) (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz95: 305-322.
Bauzer LG, Gesto JS, Souza NA, Ward RD, Hamilton JG, Kyriacou CP and Peixoto AA (2002) Molecular divergence in the period gene between two putative sympatric species of the Lutzomyia longipalpis complex. Mol Biol Evol 19: 1624-1627.
Bauzer LGSR, Souza NA, Maigon RDC and Peixoto AA (2007) Lutzomyia longipalpis in Brazil: a complex or a single species? A mini-review. Mem Inst Oswaldo Cruz 102: 1-12.
Bonnefoy S, Tibayrenc M, Le Pont F, Dujardin J, Desjeux P, Ayala F (1986) An isozymic study of Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) the vector of visceral leishmaniasis in the Yungas (Bolivia). Cah ORSTOM Ser Entomol Med Parasitol 24:213-217
Bookstein, FL. (1997) Landmark methods for forms without landmarks: morphometrics of group differences in outline shape. Med Image Anal 1: 225–243.
Brandão-Filho SP, Balbino VQ, Marcondes CB, Brasil RP, Hamilton JG, Shaw JJ. (2009) Should reproductively isolated populations of Lutzomyia longipalpis sensu lato receive taxonomically valid names? Mem Inst Oswaldo Cruz 104: 1197-1200.
Brasil RP (2013) The dispersion of Lutzomyia longipalpis in urban areas. Rev Soc Bras Med Trop 46:263-264.
74
Brasil (2003) Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral. Brasília: Ministério da Saúde pp122.
Brasil (2016) Manual de vigilância, prevenção e controle de zoonoses: normas técnicas e operacionaisBrasília: Ministério da Saúdepp121
Chagas E (1936) Primeira verificação em individuo vivo da leishmaniose visceral no Brasil. Nota prévia. Brasil med 50: 221-222.
Gontijo CMF e Melo MN (2004) Leishmaniose Visceral no Brasil: quadro atual, desafios e perspectivas. Rev Bras Epidemiol 7:338-349.
Costa Júnior CRL, Freitas MTS, Santiago Figueirêdo CA, Aragão NC, da Silva, LG, Marcondes CB, Dias RV, Balbino TCL, Souza MBR, Ortigão MR and Balbino VQ (2015) Genetic structuring and fixed polymorphisms in the gene period among natural populations of Lutzomyialongipalpis in Brazil. Parasit Vectors 8:193
Costa CHN, (2008). Characterization and speculations on the urbanization of visceral leishmaniasis in Brazil, Cad. Saúde Pública 24: 2959-2963.
Cutolo AA and Von-Zuben CJ. Flebotomíneos (Diptera, Psychodidae) de área de cerrado no município de CorumbataÍ, centro-leste do estado de São paulo, BRASIL. Rev Bras.Parasitol Vet 17: 45-49, 2008.
Dantas-Torres F, Andrade AJ, Tenório KER, Andrade Filho JD, Balbino VQ, Brandão-Filho SP (2010) Phlebotomine sand flies (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) in the State of Pernambuco Rev Soc Bras Med Trop 43:733-736.
Deane LM and Deane MP (1957) "Observações sobre abrigos e criadouros de flebótomos no noroeste do Estado do Ceará." Rev Bras Malar Doen Trop 9: 225-246.
Dujardin JP (2008) Morphometrics applied to medical entomology. Infect Genet Evol. 8:875–890.
Dujardin JP, Kaba D, Henry AB (2010) The exchangeability of shape. BMC Res Notes. 3:266.
Evanno G, Regnaut S, Goudet J (2005) Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Mol Ecol 14: 2611–2620.
Freitas MTS, Ríos-Velasquez CM, Silva LG, Costa CRJr, Marcelino A, Leal-Balbino TC, Balbino VQ, Pessoa FA (2015a) Analysis of the genetic structure of allopatric populations of Lutzomyia umbratilis using the period clock gene. Acta Trop 154:149-54. doi: 10.1016/j.actatropica.2015.11.014.
Freitas MTS, Costa Jr CRL, Silva LG, Leal-Balbino TC, Balbino VQ (2016)Cytochrome Oxidase I as Tool to Evaluate the Lutzomyia longipalpis Complex: Useful Molecular Marker or Not?. Vector Biol J 1:3.
Freitas VC, Parreiras KP, Duarte APM, Secundino NFC, Pimenta PFP (2012) Development of Leishmania (Leishmania) infantum chagasi inIts Natural Sandfly Vector Lutzomyia longipalpis. Am J Trop Med Hyg.86:606-612. doi:10.4269/ajtmh.2012.11-0386
Gajapathy A, Peiris LBS, Goodacre LS, Silva A, Pavilupillai J Jude and Surendran NS (2013) Molecular identification of potential leishmaniasis vector species within the Phlebotomus (Euphlebotomus) argentipes species complex in Sri Lanka. Parasit Vectors DOI: 10.1186/1756-3305-6-302.
75
Galati EAB (2003) Classificação de Phlebotominae. In: Rangel E F and Lainson R (eds) Flebotomíneos do Brasil, Fiocruz, Rio de Janeiro, pp 23-52.
Galati EAB. (2016) Apostila de Bioecologia e Identificação de Phlebotominae (Diptera, Psychodidae). Departamento de Epidemiologia, Faculdade de Saúde Pública da USP, São Paulo, Brasil, pp 127. Available from: http://www.fsp.usp.br/~egalati/ApostilaPhlebotominae_2016_VOL_I.pdf (September 10, 2016).
Gurgel-Gonçalves R, Ferreira JB, Rosa AF, Bar ME, Galvão C (2011) Geometric morphometrics and ecological niche modelling for delimitation of near-sibling triatomine species. Med Vet Entomol 25: 84-93; doi: 10.1111/j.1365-2915.2010.00920.x.
Hamilton JG, Hooper AM, Mori K, Pickett JA, Sano A (1999a) 3-Methyl-a -himachalene confirmed, and the relative stereochemistry defined, by synthesis as the sex pheromone of the sandfly Lutzomyia longipalpis from Jacobina, Brazil. Chem Commun pp 355–356.
Hamilton JG, Hooper AM, Ibbotson HC, Kurosawa S, Mori K, Mutoc S and Picket JA (1999b) 9-Methylgermacrene-B confirmed by synthesis as the sex pheromone of the sandfly Lutzomyia longipalpis from Lapinha, Brazil, and the absolute stereochemistry defined as 9S. Chem Commun pp 2335–2336.
Hamilton JG, Maingon RD, Alexander B, Ward RD, Brazil RP( 2005) Analysis of the sex pheromone extract of individual male Lutzomyia longipalpis sandflies from six regions in Brazil. Med Vet Entomol. 19:480-8.
Holder M, Lewis PO (2003) Phylogeny estimation: traditional and Bayesian approaches. Nat Rev Genet 4:275-284.
Jirakanjanakit N and Dujardin JP (2005) Discrimination of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) laboratory lines based on wing geometry. Southeast Asian J Trop Med Public Health 36: 858-61.
Konopka J and Benzer S (1971) Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A 68: 2112–2116.
Lainson R, Ward RD and Shaw JJ (1977) Experimental transmission of Leishmania chagasi, causative agent of neotropical visceral leishmaniasis, by the sandfly Lutzomyia longipalpis. Nature 266: 628-30.
Lane PR, Ward RD (1984) The morphology and possible function of abdominal patches in males of two forms of the leishmaniasis vector Lutzomyia longipalpis (Diptera: Phlebotominae). Cah ORSTOM, Ser Entomol med Parasitol 22:245-249.
Lins RMMA, Souza NA, Peixoto AA (2008) Genetic divergence between two sympatric species of the Lutzomyia longipalpis complex in the paralytic gene, a locus associated with insecticide resistance and lovesong production. Mem Inst Oswaldo Cruz 103: 736-40.
Lorenz C, Marques TC, Sallum MAM, Suesdek L (2012) Morphometrical diagnosis of the malaria vectors Anopheles cruzii, An. homunculus and An. bellator. Parasit Vectors 5:257.
Mangabeira, O. (1938) Sobre duas novas especies de Flebotomus (Diptera: Psychodidae). Mem Inst Oswaldo Cruz 33: 349-356.
Mangabeira, O. (1969) Sobre a sistemática e biologia dos Phlebotomus do Ceará. Rev Bras Malar Doenç Trop 12: 3-26.
76
Maingon RD, Ward RD, Hamilton JG, Noyes HA, Souza N, Kemp SJ and Watts PC (2003) Genetic identification of two sibling species of Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) that produce distinct male sex pheromones in Sobral, Ceará State, Brazil. Mol Ecol 12: 1879-1894.
Marcondes CB (2011) Entomologia médica e veterinária. São Paulo: Atheneu pp 526.
Martins AV, Falcão AL, Silva JE, Dias ES (1984) Nota sobre Lutzomyia (Lutzomyia) cruzi (Mangabeira, 1938) com a descrição da fêmea (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae). Mem Inst Oswaldo Cruz 79:439-42
Missawa NA, Lima GBM, (2006) Distribuição Espacial de Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva, 1912) e Lutzomyia cruzi (Mangabeira, 1938) no Estado de Mato Grosso. Rev Soc Bras Med Trop 39: 337-340.
Monteiro LR, Reis SF (1999) Princípios de morfometria geométrica. Ribeirão Preto: Holos pp 189.
Müller MJ (2009) Caracterização do comportamento sexual, do som de corte e de um fragmento do gene period (per) de populações de Zaprionusindianus (Gupta) (Diptera: Drosophilidae). http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/17821/000722201.pdf?sequence=1 (september 2, 2016).
Mutebi JP, Alexander B, Sherlock I, Wellington J, Souza AA, Shaw J, Rangel EF, Lanzaro GC (1999) Breeding structure of the sand fly Lutzomyialongipalpis (Lutz & Neiva) in Brazil. Am J Trop Med Hyg 61:149-57.
Peña C (2011) Métodos de inferencia filogenética. Rev peru biol 18: 265-267.
OPAS/OMS Informe Leishmanioses Nº 4 - Julho de 2016(Acesso, 23/11/2016) file:///C:/Users/Fam%C3%ADlia/Downloads/2016-cha-leish-informe-epi-das-americas%20(1).pdf
Quezada-Euán JJG, Sheets HD, De Luna E (2015) Identification of cryptic species and morphotypes in male Euglossa: morphometric analysis of forewings (Hymenoptera: Euglossini). Apid 46: 787.
Rangel EF and Vilela ML (2008) Lutzomyia longipalpis (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) and urbanization of visceral leishmaniasis in Brazil. Cad Saude Publica 24: 2948-2952.
Regier JC, Fang QQ, Mitter C, Peigler RS, Friedlander, TP and Solis MA (1998) Evolution and phylogenetic utility of the period gene in Lepidoptera. Mol Biol Evol 15: 1172–1182.
Rispail P, Léger N (1998) Numerical taxonomy of the Old World Phlebotominae (Diptera: Psychodidae). 1. Considerations of morphological characters in the genus Phlebotomus Rondani & Berté 1840. Mem Inst Oswaldo Cruz 93: 773-785.
Souza NA, Vigoder FM, Araki AS, Ward RD, Kyriacou CP, et al. (2004) Analysis of the copulatory courtship songs of Lutzomyialongipalpis in six populations from Brazil. J Med Entomol 41: 906–913.
Tan DSH, Ang Y, Lim GS, Bin Ismail MR, Meier R (2010) From “cryptic species‟ to integrative taxonomy: an iterative process involving DNA sequences, morphology, and behaviour leads to the resurrection of Sepsis pyrrhosoma (Sepsidae: Diptera). Zoologica Scripta 39: 51–61.
77
Vidal PO, Peruzin MC, Suesdek, L. (2011) Wing diagnostic characters for Culex quinquefasciatus and Culex nigripalpus (Diptera, Culicidae). Rev Bras Entomol 55:134-137.
Vigoder FM, Araki AS, Bauzer LGSR, Souza, NA, Brazil RP and Peixoto AA (2010) Lovesongs and period gene polymorphisms indicate Lutzomyiacruzi (Mangabeira, 1938) as a sibling species of the Lutzomyialongipalpis (Lutz and Neiva, 1912) complex. Infect Gen Evol 10: 734–739.
Ward RD, Ribeiro AL, Ready, PD, Murtagh A. (1983) Reproductive isolation between different forms of Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva), (Diptera: Psychodidae), the vector of Leishmania donovani chagasi Cunha & Chagas and its significance to kala-azar distribution in South America. Mem Inst Oswaldo Cruz. 78 :269-80.
Ward RD, Ribeiro AL, Ryan L, Falcão AL and Rangel EF (1985) The distribution of two morphological forms of Lutzomyia longipalpis (Lutz e Neiva) (Diptera: Psychodidae). Mem Inst Oswaldo Cruz 80: 145-148
Watts PC, Hamilton JGC, Ward RD, Noyes HA, Souza NA, Kemp SJ, Feliciangeli MD, Brazil R and Maingon RDC (2005) Male sex pheromones and the phylogeographic structure of the Lutzomyia longipalpis species complex (Diptera: Psychodidae) from Brazil and Venezuela. Am J Trop Med Hyg 73: 734-743.
White GB (1974) Anopheles gambiae complex and disease transmission in Africa. Trans R Soc Trop Med Hyg 68: 278-301.
Wilke ABB, Christe RDO, Multini LC, Vidal PO, Wilk-da-Silva R, de Carvalho GC, Marreli MT (2016) Morphometric Wing Characters as a Tool for Mosquito Identification. PLos One 11: e0161643. doi:10.1371/journal.pone.0161643
Young DC and Duncan NA (1994) Guide to the identification and geographic distribution of Lutzomyia sandflies in Mexico, the West Indies, Central and South America (Diptera: Psychodidae). Mem Amer Entomol Inst 54: 1-881.
78
Anexo 1: Regras submissão de pesquisa no Systematic
Entomology
79
80
81
82
83
84
85
86
Anexo 2: comprovação da submissão do artigo
87
88
Anexo 3: Currículo Lattes
89
Nádia Consuelo Aragão Curriculum Vitae _______________________________________________________________________________ Dados pessoais Nome Nádia Consuelo Aragão Nome em citações bibliográficas ARAGÃO, N. C.;Aragão, Nádia Consuelo _______________________________________________________________________________ Formação acadêmica/titulação 2012 Doutorado em Genética. Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Recife, Brasil Título: Estudo de populações de Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae)
do Estado do Ceará, Brasil, por meio de morfometria geométrica alar e do marcador nuclear period
Orientador: Carlos Brisola Marcondes Co-orientador: Valdir de Queiroz Balbino Bolsista do(a): Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de
Pernambuco 2010 - 2012 Mestrado em Genética. Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Recife, Brasil Título: Padrões de Divergência do Gene period em populações de Lutzomyia
longipalpis (DIPTERA:PSYCHODIDAE) do Estado do Ceará Brasil, Ano de obtenção: 2012
Orientador: Carlos Brisola Marcondes Bolsista do(a): Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de
Pernambuco Áreas do conhecimento : Genética 2009 - 2012 Graduação em Licenciatura em Ciências Agrícolas. Universidade Federal Rural de Pernambuco, UFRPE, Recife, Brasil 2002 - 2009 Graduação em Medicina Veterinária. Universidade Federal Rural de Pernambuco, UFRPE, Recife, Brasil Título: Avaliação do monitoramento do Aedes aegypti por meio de ovitrampas e
uso de aspirador de mosquitos alados no Palácio do Campo das Princesas Recife-PE
Orientador: Jean Carlos Ramos Silva e Ridelane Veiga Acioli ______________________________________________________________________________________ Formação complementar 2012 - 2012 Curso de curta duração em I Workshop de Morfometria Geométrica Alar.
(Carga horária: 35h). Instituto Butantan, IBU, Sao Paulo, Brasil Palavras-chave: Morfometria Geométrica, Insetos Vetores, Diptera, Culicidae 2010 - 2010 III Curso de Gen. e Biol. Mol. de Insetos Vetores. . (Carga horária: 75h). Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, FIOCRUZ - CPQAM, Brasil Palavras-chave: Insetos Vetores, Doenças Tropicais, Genética 2007 - 2007 Curso de curta duração em Mini-Cursos de Saúde Pública. (Carga horária:
24h). Conselho Regional de Medicina Veterinária de Pernambuco, CRMV/PE, Recife,
Brasil _______________________________________________________________________________
90
Atuação profissional
1. Departamento de Genética - UFPE - CCB/UFPE
____________________________________________________________________________
Vínculo institucional 2012 - Atual Vínculo: Bolsista , Enquadramento funcional: Pesquisa e
desenvolvimento , Carga horária: 40, Regime: Dedicação exclusiva
Outras informações: Estudo de genética de populações em populações de "Lutzomyia longipalpis" (Diptera: Psychodidae)
isoladas pela Chapada do Araripe, Nordeste do Brasil, utilizando os marcadores cyt b, cox 1, period e paralytic.Uso de ferramentas de Biologia Molecular no estudo dos padrões de transmissão vetorial da leishmaniose visceral canina em uma área de transmissão ativa no Sertão do Estado de Pernambuco, Brasil
2009 - 2009 Vínculo: Estágio Extra Curricular , Enquadramento funcional:
Médica Veterinária , Carga horária: 20, Regime: Parcial Outras informações: Atividade nos Projetos de Genética de Populações de "Lutzomyia longipalpis" (Diptera: Psychodidae) vetor
da Leishmania infantum chagasi na Região Neotropical, financiado pela Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE), e variabilidade genética de genes que codificam proteínas salivares de "Lutzomyia longipalpis" (Diptera: Psychodidae) vetor da Leishmania infantum chagasi.
6. Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo - FSP/USP
____________________________________________________________________________
Vínculo institucional 2014 - 2014 Vínculo: Estagiária , Enquadramento funcional: Estagiária , Carga
horária: 40, Regime: Integral Outras informações: Estágio Extra-curricular realizado no Laboratório de Flebotomíneos da FSP/USP para aprendizagem de
técnicas de montagem e identificação de flebotomíneos e morfometria tradicional sob a orientação da Profª Drª Eunice Aparecida Bianchi Galati.
______________________________________________________________________________________________ Áreas de atuação 1. Entomologia Médica 2. Genética de Populações 3. Saúde Coletiva _______________________________________________________________________________ Produção bibliográfica Artigos completos publicados em periódicos 1. LIMA COSTA, CÉSAR RAIMUNDO; FREITAS, MOISES THIAGO DE SOUZA; SANTIAGO FIGUEIRÊDO, CARLOS ALBERTO; Aragão, Nádia Consuelo; DA SILVA, LIDIANE GOMES; Marcondes, Carlos Brisola; DIAS, RAIMUNDO VIEIRA; BALBINO, TERESA CRISTINA LEAL; SOUZA, MANUELA BARBOSA RODRIGUES; ORTIGÃO, MARCELO RAMALHO; BALBINO, VALDIR DE QUEIROZ
91
Genetic structuring and fixed polymorphisms in the gene period among natural populations of Lutzomyia longipalpis in Brazil. Parasites & Vectors. , v.8, p.8:193 - , 2015. Referências adicionais : Inglês. Meio de divulgação: Meio digital. Home page: [doi:10.1186/s13071-015-0785-6] 2. DE SOUZA FREITAS, MOISES THIAGO; RÍOS-VELASQUEZ, CLAUDIA MARIA; COSTA, CÉSAR RAIMUNDO LIMA; FIGUEIRÊDO, CARLOS ALBERTO SANTIAGO; Aragão, Nádia Consuelo; DA SILVA, LIDIANE GOMES; DE ARAGÃO BATISTA, MARCUS VINICIUS; BALBINO, TERESA CRISTINA LEAL; PESSOA, FELIPE ARLEY COSTA; DE QUEIROZ BALBINO, VALDIR Phenotypic and genotypic variations among three allopatric populations of Lutzomyia umbratilis, main vector of Leishmania guyanensis. Parasites & Vectors. , v.8, p.448 - , 2015. Referências adicionais : Inglês. Meio de divulgação: Meio digital. Home page: [doi:10.1186/s13071-015-1051-7] 3. ARAGÃO, N. C.; Müller, Gerson Azulim; Balbino, Valdir Queiroz; Costa Junior, César Raimundo Lima; Figueirêdo Júnior, Carlos Santiago; Alencar, Jerônimo; Marcondes, Carlos Brisola A list of mosquito species of the Brazilian State of Pernambuco, including the first report of Haemagogus janthinomys (Diptera: Culicidae), yellow fever vector and 14 other species (Diptera: Culicidae). Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical (Impresso). , v.43, p.458 - 459, 2010. Referências adicionais : Inglês. Meio de divulgação: Meio digital. Home page: [doi:10.1590/s0037-86822010000400024] Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo) 1. ARAGÃO, N. C.; ROCHA, P. K. L.; SANTOS, M. A. O.; SILVA, L. G.; MARCONDES, C. B.; BALBINO, V. Q. Primeira parte do genoma mitocondrial de 'Psorophora ferox' (Diptera: Culicidae) In: XXIV Congresso Brasileiro de Entomologia, 2012, Curitiba. Anais do XXIV Congresso Brasileiro de Entomologia. , 2012. Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Meio digital. Home page: [http://Primeira parte do genoma mitocondrial de Psorophora ferox (Diptera: Culicidae)] 2. SILVA, L. G.; Costa Junior, César Raimundo Lima; ARAGÃO, N. C.; Freitas, M. T. S.; OKUYAMA, F. Y. U.; VELASQUEZ, C. M. R.; PESSOA, F. A. C.; BALBINO, V. Q. Using Molecular Marker for the Determination of Taxonomic Status of Lutzomyia umbratilis. In: Simposio Brasileiro de Identificação Molecular de espécies, 2012, Foz do Iguassu. 58º Congresso Brasileiro de Genética. , 2012. Referências adicionais : Brasil/Português. 3. ARAGÃO, N. C.; MULLER, G. A.; SANTOS, H. M. B.; Freitas, M. T. S.; LIMA, T. L. D.; BALBINO, V. Q.; MARCONDES, C. B. NOVOS RELATOS DE CULICÍDEOS (DIPTERA: CULICIDAE) NO ESTADO DE PERNAMBUCO In: X Congresso de Ecologia do Brasil, 2011, São Lourenço-MG. Anais do X Conbresso de Ecologia do Brasil. , 2011. Referências adicionais : Brasil/Português. . Home page: [http://www.seb-ecologia.org.br/xceb/resumos/1711.pdf] 4. NUNES, V. M. N.; ARAGÃO, N. C.; FERREIRA, V. M. H.; SILVA, J. C. R. LEVANTAMENTO AMOSTRAL DE IMÓVEIS COM CRIATÓRIOS POSITIVOS O GÊNERO AEDES, ENCONTRADOS EM 94 BAIRROS DA CIDADE DO RECIFE In: XX Congresso Brasileiro de Parasitologia, 2007 Anais do XX Congresso Brasileiro de Parasitologia. , 2007. Palavras-chave: AEDES, Criatórios, Recife Áreas do conhecimento : Saúde Pública,Epidemiologia Setores de atividade : Atividades de atenção à saúde humana Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários Apresentação de trabalho e palestra 1. ARAGÃO, N. C. Estudo Genético de Populações de 'Lutzomyia longipalpis' Isoladas pela Chapada do Araripe, Nordeste do Brasil, utilizando os Marcadores 'cyt b', 'cox 1', 'period' e 'paralitic', 2012. (Congresso,Apresentação de Trabalho) Áreas do conhecimento : Genética de Populações,Entomologia Médica
92
Setores de atividade : Pesquisa e desenvolvimento científico Referências adicionais : Brasil/Português; Local: Auditório do Departamento de Genética; Cidade: Recife; Evento: II Jornada de Pós-graduação em Genética; Inst.promotora/financiadora: UFPE 2. ARAGÃO, N. C.; ROCHA, P. K. L.; SANTOS, M. A. O.; SILVA, L. G.; MARCONDES, C. B.; BALBINO, V. Q. Primeira Parte do Genoma Mitocondrial de 'Psorophora ferox' (Diptera: Culícidae), 2012. (Congresso,Apresentação de Trabalho) Palavras-chave: Entomologia Médica, Mitocôndria, "Psorophora ferox" Áreas do conhecimento : Genética de Populações,Entomologia Médica Setores de atividade : Pesquisa e desenvolvimento científico Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Impresso. Home page: http://www.cbe2012.com.br/_apps/trabalhos/1643/1643_1.pdf; Local: Expo Unimed Curitiba; Cidade: Curitiba; Evento: XXIV Congresso Brasileiro de Entomologia; Inst.promotora/financiadora: Sociedade Brasileira de Entomologia 3. ARAGÃO, N. C.; BALBINO, V. Q.; MARCONDES, C. B. Padrões de Divergência do gene 'period' de 'Lutzomyia longipalpis' (diptera:Psychodidae) no Município de Caririaçú-CE, 2011. (Conferência ou palestra,Apresentação de Trabalho) Palavras-chave: Genética de Populações, Lutzomyia longipalpis Áreas do conhecimento : Genética de Populações,Entomologia Médica Setores de atividade : Pesquisa e desenvolvimento científico Referências adicionais : Brasil/Português; Local: Auditório do CCSA/UFPE; Cidade: Recife; Evento: I Jornada de Pós-graduação em Genética; Inst.promotora/financiadora: UFPE 4. ARAGÃO, N. C. Ordem Diptera - Morfologia e Classificação, 2009. (Conferência ou palestra,Apresentação de Trabalho) Palavras-chave: Ordem Diptera, Morfologia , Dipteros de Importância Médica Áreas do conhecimento : Entomologia Setores de atividade : Educação Referências adicionais : Brasil/Português; Local: Laboratório de Entomologia da Área de Zoologia/UFRPE; Cidade: Reife; Inst.promotora/financiadora: Área de Zoologia/UFRPE Educação e Popularização de C&T Apresentação de trabalho e palestra 1. ARAGÃO, N. C.; ROCHA, P. K. L.; SANTOS, M. A. O.; SILVA, L. G.; MARCONDES, C. B.; BALBINO, V. Q. Primeira Parte do Genoma Mitocondrial de 'Psorophora ferox' (Diptera: Culícidae), 2012. (Congresso,Apresentação de Trabalho) Palavras-chave: Entomologia Médica, Mitocôndria, "Psorophora ferox" Áreas do conhecimento : Genética de Populações,Entomologia Médica Setores de atividade : Pesquisa e desenvolvimento científico Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Impresso. Home page: http://www.cbe2012.com.br/_apps/trabalhos/1643/1643_1.pdf; Local: Expo Unimed Curitiba; Cidade: Curitiba; Evento: XXIV Congresso Brasileiro de Entomologia; Inst.promotora/financiadora: Sociedade Brasileira de Entomologia 2. ARAGÃO, N. C.; BALBINO, V. Q.; MARCONDES, C. B. Padrões de Divergência do gene 'period' de 'Lutzomyia longipalpis' (diptera:Psychodidae) no Município de Caririaçú-CE, 2011. (Conferência ou palestra,Apresentação de Trabalho) Palavras-chave: Genética de Populações, Lutzomyia longipalpis Áreas do conhecimento : Genética de Populações,Entomologia Médica Setores de atividade : Pesquisa e desenvolvimento científico Referências adicionais : Brasil/Português; Local: Auditório do CCSA/UFPE; Cidade: Recife; Evento: I Jornada de Pós-graduação em Genética; Inst.promotora/financiadora: UFPE 3. ARAGÃO, N. C. Ordem Diptera - Morfologia e Classificação, 2009. (Conferência ou palestra,Apresentação de Trabalho) Palavras-chave: Ordem Diptera, Morfologia , Dipteros de Importância Médica Áreas do conhecimento : Entomologia Setores de atividade : Educação Referências adicionais : Brasil/Português; Local: Laboratório de Entomologia da Área de Zoologia/UFRPE; Cidade: Reife; Inst.promotora/financiadora: Área de Zoologia/UFRPE Eventos
93
Participação em eventos 1. V Workshop de Genética e Biologia Molecular de Insetos Vetores de Doenças Tropicais, 2012. (Encontro) . 2. Apresentação de Poster / Painel no(a) XXVI Congresso Brasileiro de Entomologia, 2012. (Congresso) Primeira Parte do Genoma Mitocondrial de "Psorophora ferox" (Diptera: Culícidae). 3. I Workshop Pernambucano de Bioinformática, 2010. (Encontro) . 4. II Simpósio Satélite Sobre o Status Taxonômico de "Lutzomyia longipalpis", 2010. (Simpósio) . 5. IV Workshop de Genética e Biologia Molecular de Insetos Vetores de Doenças Tropicais, 2010. (Encontro) . 6. Concepções e Práticas do Educador e Ciências Agrícolas, 2009. (Outra) . 7. I Seminário de Saúde Pública Veterinária, 2009. (Seminário) .