LUIZ ALBERTO BANDEIRA FERREIRA

“CITOTOXICIDADE, ENDOCITOSE E PROCESSAMENTO CELULAR DE

NANOPARTÍCULAS BIOSSINTÉTICAS DE PRATA EM MACRÓFAGOS

PERITONEAIS”

CAMPINAS

2015

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Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972

Ferreira, Luiz Alberto Bandeira, 1984- F413c Citotoxicidade, endocitose e processamento celular de

nanopartículas biossintéticas de prata em macrófagos peritoneais / Luiz Alberto Bandeira Ferreira. – Campinas, SP: [s.n.], 2015.

Orientador: Marcelo Bispo de Jesus. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.

1. Nanomedicina. 2. Nanopartículas de prata. 3. Citotoxicidade. 4. Macrófagos peritoneais. I. Jesus, Marcelo

Bispo de. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Cytotoxicity, endocytosis and cell processing of biogenic silver

nanoparticles in peritoneal macrophages

Palavras-chave em Inglês: Nanomedicine Silver nanoparticles Cytotoxicity Macrophages, Peritoneal Área de concentração: Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde

Titulação: Mestre em Ciências

Banca examinadora: Marcelo Bispo de Jesus [Orientador] Paulo César Pires Rosa Juliana Minardi Nascimento Data da defesa: 13-02-2015 Programa de Pós Graduação: Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos

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RESUMO

A nanomedicina se tornou uma promessa de profundos impactos para a saúde humana através da

utilização de nanopartículas, nanorobôs e outros nanomateriais para prevenir, diagnosticar ou curar

doenças. Um dos exemplos de nanomateriais empregados na medicina são as nanopartículas de

prata, que podem ser adquiridas por métodos químicos ou biossintéticos. As nanopartículas de

prata apresentam alta atividade antimicrobiana, propriedade essa de grande interesse científico-

industrial. Em vista disso, cresce também a preocupação em relação ao uso, manipulação e

eliminação desse nanomaterial, visando uma aplicação mais segura. Diante dessas informações, o

presente trabalho teve como objetivo investigar mecanismos moleculares envolvidos na

citotoxicidade e processamento das nanopartículas biossintéticas de prata em macrófagos

peritoneais obtidos de camundongos C57BL/6. Inicialmemte, demonstrando que as nanopartículas

atingiram o IC50 de 25 µM em 6h de tratamento por redução do MTT. A análise de microscopia

de fluorescência revelou alterações na integridade de membrana a partir de 3 h, que foram

agravadas após 6 h de tratamento. Esse mesmo perfil foi observado por microscopia eletrônica de

varredura, no qual revelou que após 3 h de tratamento as células já apresentavam perda de

projeções celulares, e após 6 h início de fragmentação celular. Além disso, as nanopartículas

causaram aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio e demonstramos que este é um fator

determinante para os efeitos citotóxicos. Com a inibição da fagocitose e endocitose mediada por

caveolina evidenciamos a reversão parcial da citotoxicidade das nanopartículas. Por outro lado, o

aumento do efeito citotóxico das nanopartículas também foi observado com a inibição da

autofagia, o que sugere que esses processos estejam envolvidos no processamento das

nanopartículas. Por fim, concluímos que as nanopartículas biossintéticas de prata apresentaram um

efeito citotóxico semelhante aqueles descritos em literatura pelas nanopartículas de síntese

química.

Palavras-chave: nanomedicina, nanopartículas de prata, citotoxicidade, macrófagos peritoneais.

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ABSTRACT

Nanomedicine became a promise of profound impacts on human health through the use of

nanoparticles, nanorobots and other nanomaterials to prevent, diagnose or cure diseases. One

example of nanomaterials used in medicine is silver nanoparticles, which can be produced by

chemical or biosynthetic methods. Silver nanoparticles have high antimicrobial activity; this

property is of great scientific and industrial interest. Consequently, there is growing concern about

the use, handling and disposal of nanomaterials, aiming more secure application. Hence, the

present study aimed to investigate the molecular mechanisms involved in cytotoxicity and

intracellular processing of biogenic silver nanoparticles in peritoneal macrophages from C57BL/6

mice. We began showing that the nanoparticles have reached the IC50 of 25 µM after 6 hours of

treatment determined by MTT reduction. Fluorescence microscopy analysis showed changes in

membrane integrity after 3 h, which has been intensified after 6 h of treatment. A similar profile

was observed by scanning electron microscopy, which showed loss of cellular projections after 3

h of treatment and after 6 h was observed cellular fragmentation. In addition, the nanoparticles

treatment increased levels of reactive oxygen species and this response seems to be determining

for the cytotoxic effects. The inhibition of phagocytosis and caveolin-mediated endocytosis led to

a reduction in cytotoxicity of nanoparticles. On the other hand, an increase in the cytotoxic effect

was observed upon inhibition of autophagy, suggesting that this response is part of the intracellular

processing of the nanoparticles in peritoneal macrophage. Finally, we concluded that the biogenic

of silver nanoparticles exhibited cytotoxic effects similar to that described for silver nanoparticles

chemically synthesized.

Keywords: nanomedicine, silver nanoparticles, cytotoxicity, peritoneal macrophages.

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................................ 1 1.1 Nanotecnologia e suas aplicações médicas ................................................................................................ 1 1.2 Química verde e a biossíntese de nanopartículas de prata ......................................................................... 2 1.3 As nanopartículas de prata e seus aspectos toxicológicos .......................................................................... 5 1.4 Surgimento da nanotoxicologia.................................................................................................................. 6 1.5 Endocitose de nanomateriais ...................................................................................................................... 8 1.6 Papel da autofagia no processamento de nanomateriais........................................................................... 11 1.7 Avaliação da toxicidade de nanopartículas em macrófagos ..................................................................... 13

2 OBJETIVOS ................................................................................................................................................... 15 2.1 Objetivos gerais ....................................................................................................................................... 15 2.2 Objetivos específicos ............................................................................................................................... 15

3 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................................................... 16 3.1 Obtenção das nanopartículas biossintéticas de prata ................................................................................ 16 3.2 Caracterização das AgNP biossintéticas .................................................................................................. 16 3.3 Extração de macrófagos peritoneais elicitados ........................................................................................ 16 3.4 Caracterização de macrófagos Peritoneais ............................................................................................... 18

3.4.1 Caracterização por citometria de fluxo ......................................................................................... 18 3.4.2 Caracterização por microscopia confocal ..................................................................................... 18

3.5 Ensaios de viabilidade celular por MTT .................................................................................................. 19 3.6 Avaliação da integridade de membrana plasmática ................................................................................. 20

3.6.1 Microscopia de Fluorescência ...................................................................................................... 20 3.6.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ............................................................................... 21

3.7 Avaliação do estresse oxidativo ............................................................................................................... 21 3.8 Avaliação da citotoxicidade na presença de antioxidante ........................................................................ 22 3.9 Determinação do mecanismo de internalização ....................................................................................... 22 3.10 Microscopia eletrônica de transmissão (MET) ........................................................................................ 24 3.11 Avaliação da expressão de citocinas inflamatórias. ................................................................................. 24 3.12 Forma de análise dos resultados ............................................................................................................... 25

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................................................... 26 4.1 Caracterização físico-química das nanopartículas biossintéticas de prata ............................................... 26 4.2 Pureza de extração de macrófagos peritoneais ......................................................................................... 27 4.3 Determinação do IC50 em macrófagos peritoneais por MTT .................................................................. 29 4.4 Viabilidade em função da variação do tempo .......................................................................................... 30 4.5 Avaliação da integridade da membrana em macrófagos peritoneais ....................................................... 32 4.6 Avaliação da geração de espécies reativas de oxigênio após tratamento com AgNP biossintéticas ........ 36 4.7 Avaliação da endocitose na citotoxicidade das AgNP biossintéticas em macrófagos peritoneais ........... 39 4.8 Avaliação de inibidores de fagocitose na citotoxicidade das AgNP ........................................................ 42 4.9 Estudo da pinocitose na citotoxicidade das AgNP ................................................................................... 45 4.10 O papel da autofagia na citotoxicidade causada pelas AgNP ................................................................... 50

5 CONCLUSÃO ................................................................................................................................................ 52

6 PERPECTIVAS .............................................................................................................................................. 54

7 REFERÊNCIAS ............................................................................................................................................. 55

8 ANEXO 1 - Avaliação do fluxo autofágico por MET em macrófagos tratados com as AgNP ....................... 65

9 ANEXO 2 - Avaliação in vivo da resposta imune inata em camundongos tratados com as AgNP .................. 67

10 ANEXO 3 - Congresso Internacional .............................................................................................................. 69

11 ANEXO 4 - Artigo de Revisão ........................................................................................................................ 70

12 ANEXO 5 - Comitê de Ética ............................................................................................................................ 71

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DEDICATÓRIA

“Agradeço а Deus, pois sеm ele еu nãо teria

forças pаrа percorrer essa longa jornada.

À minha amada mãe, meu maior exemplo de

vida e superação que possuo”

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente, a Deus por me iluminar, me fortalecer nas horas mais difíceis e guiar minhas

escolhas;

À minha família, principalmente minha mãe Marcia, por incentivar a minha profissão e dar todo o

amparo nesta caminhada;

Ao meu orientador Dr. Marcelo Bispo de Jesus, por ter acreditado no meu potencial, pelos

ensinamentos e paciência durante esses anos, e por ter me dado todo suporte possível nesta

caminhada;

Ao Prof. Dr. Nelson Durán e Profa. Dra. Priscyla D. Marcato por terem cedido a matéria-prima,

fonte para o desenvolvimento deste estudo e contribuído com seus conhecimentos.

À Profa. Dra. Eneida de Paula, por todos ensinamentos, apoio e suporte junto ao programa de Pós-

Graduação;

À Profa. Dra. Carmem Veríssima Ferreira, pela paciência e suporte estrutural para o

desenvolvimento deste trabalho;

À Profa. Dra. Leonilda Maria Barbosa dos Santos e ao Dr. Alessandro dos Santos Farias, por me

oferecer todo o suporte científico e estrutural possível para o desenvolvimento deste trabalho;

Ao Prof. Dr. Marco Aurélio Ramirez Vinolo, pelos ensinamentos na extração de cultura primária

de macrófagos;

Ao Me. Fernando Padrella, pelo suporte técnico para em algumas metodologias desenvolvidas

neste trabalho;

Aos técnicos Daniel Razzo, Rosimeire Florença e Sílvio Roberto Consonni, que me auxiliaram na

prática de técnicas de grande importante para realização deste estudo;

A todos os amigos do Instituto de Biologia, Departamento de Bioquímica e Imunologia;

À Fundação de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo

apoio financeiro;

Ao Programa de Pós-Graduação em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos pela

oportunidade de desenvolver este trabalho científico.

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LISTA DE ABREVIATURAS

AgNP Nanopartícula de Prata

APC (Allophycocyanin) Aloficocianina

CLQ Cloroquina

CPZ Clorpromazina

DAPI 4',6-diamidino-2-fenilindol

DCF-DA 2',7'-diacetato de dicloro-fluoresceína

EIPA (5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride) Amilorida 5-(N-etil-N-isopropil)

FSC-H (Forward scatter Height) Dispersão de Luz Frontal que mede a altura

GSH Glutationa Reduzida

INFABIC Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fotônica aplicada a Biologia Celular

LC3- I/II (Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3) Forma I e II da cadeia leve 3 das proteínas

associadas a microtúbulos

MβCD Metil Beta-Ciclodextrina

MΦ Macrófago

MEV Microscopia Eletrônica de Varredura

MET Microscopia Eletrônica de Transmissão

MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio

NAC N-Acetil-L-Cisteína

NTA (Nanoparticle Tracking Analysis)Análise de Rastreamento de Nanopartículas

p62 Nucleoporina 62

PBS Tampão Fosfato-Salino

PDI Polidispersividade

PI (Propidium Iodide) Iodeto de Propídio

PFA Perfluoroalcoxi

PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) Forbol 12-Miristato 13-Acetato

ROS (Reactive Oxygen Species) Espécies Reativas de Oxigênio

RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Meio de cultura do Instituto Memorial Parque Roswell

SMF Sistema Mononuclear Fagocitário

SFB Soro Fetal Bovino

SSC-H (Side Scatter Height) Dispersão de Luz lateral que mede a altura

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Biossíntese das nanopartículas de prata. Ilustração do processo de biossíntese das

AgNP. ............................................................................................................................................... 4

Figura 2 – Microscopia eletrônica de Transmissão das AgNP biossintéticas.. .............................. 4

Figura 3 – Número de periódicos com a palavra nanotoxicology de 2000 até 2014.. .................... 7

Figura 4 – Principais vias de endocitose de nanopartículas em células eucarióticas.. .................. 10

Figura 5 – Mecanismo de Autofagia. Ilustração do processo de autofagia.. ................................ 13

Figura 6 – Seletividade de extração de macrófagos peritoneais.. ................................................. 28

Figura 7 – Marcação de glicoproteínas da família EGF-TM7 em macrófagos peritoneais elicitado

........................................................................................................................................................ 29

Figura 8 – Determinação do IC50 em macrófagos peritoneais ..................................................... 30

Figura 9 – Citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais em função do tempo.. ............. 31

Figura 10 – Porcentagem de permeabilidade celular em macrófagos peritoneais ........................ 33

Figura 11 – Imagens representativas da avaliação da permeabilidade celular em macrófagos por

microscopia de fluorescência ......................................................................................................... 34

Figura 12 – Avaliação da morfologia de macrófagos peritoneais tratados com AgNP ................ 35

Figura 13 – Avaliação dos níveis de ROS em macrófagos peritoneais. ....................................... 37

Figura 14 – Avaliação da viabilidade celular na presença de N-Acetilcistena. ............................ 39

Figura 15 – Citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob variação da temperatura. 40

Figura 16 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor

de Dynasore .................................................................................................................................... 42

Figura 17 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor

de fagocitose Citocalasina D .......................................................................................................... 44

Figura 18 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor

de fagocitose Nocodazol. ............................................................................................................... 44

Figura 19 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor

de Macropinocitose EIPA .............................................................................................................. 46

Figura 20 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor

de endocitose mediada por clatrina Clorpromazina ....................................................................... 47

Figura 21 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor

de endocitose mediada por caveolina Metil-beta-ciclodextrina ..................................................... 49

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Figura 22 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor

de endocitose mediada por caveolina Filipina ............................................................................... 49

Figura 23 – Estudo da autofagia na avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos

peritoneais ...................................................................................................................................... 51

Figura 24 –Citotoxicidade e processamento celular de nanopartículas biossintéticas de prata em

macrófagos peritoneais ................................................................................................................... 53

Figura 25 – Indução da formação de vesículas típicas de autofagia por AgNP ............................ 66

Figura 26 – Avaliação in vivo da expressão de RNAm de citocinas pró e anti-inflamatórias em

macrófagos extraídos de camundongos tratados com AgNP ......................................................... 68

xxi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Determinação da concentração dos inibidores de endocitose e autofagia ............. 23

Tabela 2 - Características físico-químicas das nanopartículas biossintéticas de prata ............ 27

xxii

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1 INTRODUÇÃO

1.1 Nanotecnologia e suas aplicações médicas

A nanotecnologia consiste no desenvolvimento e controle da matéria em escala nanométrica,

para aplicação em diversas áreas do conhecimento humano (ALBRECHT; EVANS; RASTON,

2006). No final do século XX, iniciativas ligadas à nanotecnologia receberam incentivos de várias

agências de fomento em todo o mundo, tal que esta área da ciência logo se tornou uma promessa

de rápidos avanços e profundos impactos na sociedade moderna (JONES, 2011). Uma das áreas

da nanotecnologia das quais se espera grandes avanços é a nanomedicina (FORTINA et al., 2005;

MCNEIL, 2005), que utiliza nanomateriais com o intuito de prevenir, diagnosticar ou curar

doenças (FERNANDEZ-FERNANDEZ; MANCHANDA; MCGORON, 2011).

Atualmente, uma ampla gama de nanomateriais são utilizados na nanomedicina, alguns já

em fase de testes clínicos, como os quantum dots, lipossomas, dendrímeros, nanopartículas

poliméricas, nanopartículas de sílica, nanopartículas lipídicas, nanopartículas metálicas, entre

outros (CHOU; MING; CHAN, 2010; FERNANDEZ-FERNANDEZ; MANCHANDA;

MCGORON, 2011; PETROS; DESIMONE, 2010; RAJENDRAN; KNÖLKER; SIMONS, 2010;

TORCHILIN, 2006). Esses nanomateriais podem apresentar atividades terapêuticas, ou então,

serem utilizados como carreadores de fármacos, proteínas, DNA recombinante e diferentes tipos

de RNAs, no qual apresentam um papel terapêutico coadjuvante (MARCHESAN; PRATO, 2012).

Além disso, alguns nanomateriais funcionam como biosensores, auxiliando no diagnóstico de

doenças (YAN et al., 2011).

2

1.2 Química verde e a biossíntese de nanopartículas de prata

Dentre os tipos de nanomateriais supracitados encontram-se as nanopartículas metálicas, que

podem ser originadas a partir de diversos metais, como por exemplo, óxido de ferro e prata (AgNP)

(DURÁN et al., 2011). Entre as nanopartículas metálicas, destacamos as nanopartículas de prata

que são muito conhecidas pela sua atividade antimicrobiana, e que têm sido utilizadas para uma

variedade de aplicações e incorporados em diversos produtos de aplicações médicas (CHENG et

al., 2013; GE et al., 2014; MANEEWATTANAPINYO et al., 2011).

As nanopartículas produzidas a partir da prata podem ser sintetizadas por processos químicos

(DE LIMA; SEABRA; DURÁN, 2012) ou biológicos (DURÁN et al., 2011; JEYARAJ et al.,

2013). A obtenção das AgNP por métodos químicos pode ser dispendiosa, cara e gerar resíduos

tóxicos (ROSCHANGAR; SHELDON; SENANAYAKE, 2014). Desta forma, o desenvolvimento

de métodos mais simples, seguros, que geram pouco ou nenhum resíduo tóxico, tem despertado

maior interesse na síntese de nanopartículas inorgânicas, como as de prata (DURÁN et al., 2010).

Para tentar minimizar os efeitos tóxicos que os nanomateriais podem ocasionar vem sendo

desenvolvidos protocolos de síntese de nanopartículas com bases limpas, biocompatíveis e não

tóxicos,utilizando princípios da “Química Verde” (Green Chemistry) (ALBRECHT; EVANS;

RASTON, 2006).

Também conhecida como química sustentável, a Química verde visa desenvolver produtos

e processos químicos mais seguros, procurando reduzir ou eliminar o uso e a geração de

substâncias nocivas à saúde humana e ao ambiente (CLARK et al., 2013; ROSCHANGAR;

SHELDON; SENANAYAKE, 2014). É uma filosofia que se aplica em diversas áreas da química,

inclusive no desenvolvimento de produtos nanotecnológicos. Princípios da Química Verde têm

sido aplicados à produção de AgNP com método biológico, utilizando, por exemplo, fungos

3

(DURÁN et al., 2005; KOWSHIK et al., 2003), bactérias (SINTUBIN et al., 2009), ou até mesmo

plantas (KRISHNARAJ et al., 2010), para a síntese de nanopartículas biossintéticas de prata. As

principais vantagens da utilização desse método é que ele pode ser realizado em condições

ambiente de temperatura, pressão e no pH fisiológico do organismo utilizado para a síntese

(DHILLON et al., 2011).

A nanopartícula utilizada neste estudo foi desenvolvida por Durán e col., através da redução

da prata por enzimas e substratos obtidos após a filtração da biomassa do fungo Fusarium

oxysporum (DURÁN et al., 2005). Nesse método, o nitrato de prata é adicionado numa solução de

extrato fúngico contendo redutases e outros substratos, onde os íons prata (Ag+) são reduzidos à

prata metálica (Ag0) (fig. 1) (DURÁN et al., 2005; ERENO; MARCATO; RODRIGUES, 2013).

Este método de biossíntese possibilita obter AgNP esféricas (fig. 2), com alto potencial

antimicrobiano, faixa estreita de raio hidrodinâmico (i.e. monodispersas), já estabilizadas por

proteínas do próprio microrganismo, não sendo necessário a adição de surfactantes (DURÁN et

al., 2007; MOHANPURIA; RANA; YADAV, 2008). Além disso, essas AgNP biossintéticas

apresentam muitas vantagens, como: alta biodisponibilidade, baixo custo de produção, baixa

tendência de auto agregação (DURÁN et al., 2011).

4

Figura 1 – Biossíntese das nanopartículas de prata. Ilustração do processo de biossíntese das AgNP. 1- Preparação

do extrato fúngico: após o Fusarium oxysporum crescer ele é solubilizado em água e filtrado, assim formando uma

solução contendo componentes extracelulares do fungo. 2- Produção das AgNP biossintéticas: Nitrato de prata é

adicionado ao extrato fúngico, no qual os íons prata (Ag+) serão reduzidos por redutases contidas no filtrado fúngico,

assim dando origem a prata metálica (Ag0) que precipita na forma de nanopartículas revestidas por proteínas fúngicas.

Adaptado: ERENO; MARCATO; RODRIGUES, 2013.

Figura 2 – Microscopia eletrônica de Transmissão das AgNP biossintéticas. Nanopartículas de prata

biossintetizadas pelo fungo Fusarium oxysporum apresentado o formato esférico de tamanho médio 40.3

nm ±3.5 nm (escala de 200 nm) (LIMA et al., 2013).

5

1.3 As nanopartículas de prata e seus aspectos toxicológicos

A prata é conhecida por sua potente ação antimicrobiana, na qual seus efeitos biológicos são

descritos tanto na forma nanoparticulada, quanto na forma livre (Ag+) (RAI et al., 2012). Devido

a essa propriedade, produtos utilizando AgNP são amplamente utilizados em equipamentos

eletrônicos, roupas, alimentos, tintas, bloqueadores solares, cosméticos (AHAMED; ALSALHI;

SIDDIQUI, 2010). Na área médica, as AgNP têm sido usadas no tratamento e diagnóstico de

doenças, bem como no revestimento de dispositivos médicos, curativos, têxteis médicos e

contraceptivos (CHEN; SCHLUESENER, 2008; GALIANO et al., 2008; GE et al., 2014;

MOORE, 2006; ZHOU et al., 2011). Portanto, toda essa exposição aos produtos contendo AgNP

leva a uma concomitantemente crescente na preocupação sobre os efeitos adversos que esses

materiais podem proporcionar, por isso uma avaliação mais detalhada dos efeitos tóxicos desses

nanomateriais e suas implicações em seres vivos e meio ambiente se faz necessária.

As AgNP têm atraído muita atenção por parte de pesquisadores para uma avaliação mais

criteriosa sobre seus efeitos danosos. Muitos estudos em diversas linhagem celulares relatam que

as AgNP podem induzir uma série de eventos citotóxicos, incluindo o comprometimento da

membrana celular (ZHORNIK et al., 2014), resposta inflamatória (YANG et al., 2012), danos ao

DNA, causando genotoxicidade e aberrações cromossômicas (ASHARANI et al., 2009; EOM;

CHOI, 2010), indução de morte celular por apoptose ou necrose (FOLDBJERG et al., 2009; HSIN

et al., 2008). Muitos desses danos celulares citados também são descritos por decorrência da

produção de espécies reativas de oxigênio induzidas pelas AgNP (ARORA et al., 2008; MANKE;

WANG; ROJANASAKUL, 2013).

Os mecanismos de toxicidade das AgNP estão ligados aos íons de prata liberados, que podem

intercalar com bases nitrogenadas de ácidos nucleicos, interagir com o grupamento tiol de

6

proteínas, tais como glutationa (GSH), tioredoxina, superóxido dismutase e tiorredoxina

peroxidase, que são conhecidos por regular de modo inibitório o estresse oxidativo (ARORA et

al., 2008; RAI et al., 2012; ZHANG et al., 2014). Existem muitas moléculas que contêm os tióis

no citoplasma, membrana celular e membrana interna de mitocôndrias, que servem como alvos de

íons de prata ou AgNP (ALMOFTI et al., 2003).

A incorporação de produtos com AgNP é cada vez mais frequente, aliado a isso cresce o

número de trabalhos descrevendo os efeitos citotóxicos das AgNP. Existem muitos estudos sobre

os efeitos tóxicos causados por AgNP adquiridas por métodos químicos ou biossintéticos (ZHANG

et al., 2014). Entretanto, estudos da citotoxicidade de nanopartículas biossintéticas pode trazer

particularidades. Um exemplo disso é a obtenção de AgNP pelo fungo Fusarium oxysporum, que

leva a formação de nanopartículas com características únicas (corona de proteínas fúngicas)

(DURÁN et al., 2005, 2007). Desta forma, as AgNP biossintéticas apresentam-se como uma

alternativa promissora e pouco explorada em literatura, o que garante a originalidade do presente

trabalho. Ainda há poucos relatos sobre o seu efeito citotóxico, principalmente sobre os estudos

do processamento celular e efeitos no metabolismo dessas partículas.

1.4 Surgimento da nanotoxicologia

Nos dias atuais é crescente uso de nanopartículas nas mais variadas aplicações, em paralelo

cresce também a preocupação sobre possíveis efeitos colaterais desses materiais, fazendo

necessária uma avaliação mais rigorosa dos seus potenciais efeitos tóxicos e critérios de controle

associados (OBERDÖRSTER; OBERDÖRSTER; OBERDÖRSTER, 2005; SOENEN et al.,

2012). Nos últimos anos, essa preocupação ganhou dimensões globais e uma nova área do

conhecimento foi estabelecida e denominada nanotoxicologia, que se propõe em avaliar os efeitos

7

toxicológicos de nanomateriais. Alguns eventos foram fundamentais para o estabelecimento dessa

nova área, como por exemplo a publicação do artigo intitulado “Nanotoxicology: an emerging

discipline evolving from studies of ultrafine particles” de Oberdörster e colaboradores em 2005 e

o lançamento da revista científica internacional e indexada Nanotoxicology, em 2007 pela editora

Informa Healthcare. Depois disso, mais atenção vem sendo dada a essa área, além da criação de

novas revistas científicas sobre o tema e até o presente momento totalizam-se 1251 artigos no

portal PubMed e 941 artigos no portal Web of Science sobre o tema (fig. 3).

Figura 3 – Número de periódicos com a palavra nanotoxicology de 2000 até 2014. Pesquisa de artigos científicos

contendo a palavra nanotoxicology na base de dados dos portais Pubmed e Web of Science, pelo período entre 2000 à

2014. Pesquisa realizada em 17/12/2014.

Através dos avanços na área de nanotoxicologia será possível compreender mecanismos

ainda inexplorados causados pelas nanopartículas. Para estudarmos as bases moleculares da

toxicidade de nanomateriais é necessário entender como o nanomaterial é internalizado,

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Nú

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Pubmed Web of Science

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metabolizado, eliminado e as consequências desses processos para o microambiente celular (DE

JESUS; KAPILA, 2014; SOENEN et al., 2012). Estudos sobre a degradação intracelular de

nanopartículas e a correlação entre localização intracelular, concentração local de nanopartículas

e o seu efeito citotóxico podem fornecer pistas importantes sobre os efeitos das nanopartículas em

células animais (BRANDENBERGER et al., 2010; LEHMANN et al., 2010; SOENEN et al.,

2010). Composição química, forma, estrutura de superfície, carga de superfície, agregação e

solubilidade também podem influenciar na toxicidade de nanomateriais (SHINDE et al., 2012).

Essas propriedades têm forte influência na biodistribuição, opsonização e endocitose desses

nanomateriais e, por consequência, podem modular seus efeitos biológicos. As propriedades

físico-químicas podem influenciar também a toxicidade de nanomateriais, cujos mecanismos

moleculares podem, por exemplo, resultar do aumento de estresse oxidativo, da produção de

citocinas inflamatórias, ou até mesmo levar à morte celular (GARNETT, 2006; SAHAY;

ALAKHOVA; KABANOV, 2010; SHINDE et al., 2012; ZHAO et al., 2011).

O comportamento de nanopartículas no interior das células ainda é um enigma e algumas

respostas metabólicas e imunológicas induzidas por estas nanopartículas até hoje não são

compreendidas. Neste cenário, a nanotoxicologia assume o desafio de decifrar os eventos

moleculares que regulam a bio-acumulação e toxicidade das nanopartículas (CANTON;

BATTAGLIA, 2012; SAHAY; ALAKHOVA; KABANOV, 2010; ZHAO et al., 2011).

1.5 Endocitose de nanomateriais

O principal mecanismo responsável pela internalização de nanomateriais em células

eucarióticas é a endocitose, que fisiologicamente está envolvida com diversos processos

biológicos, como: absorção de nutrientes extracelulares, regulação dos receptores de superfície

9

celular, manutenção homeostática do colesterol e apresentação de antígenos (CANTON;

BATTAGLIA, 2012; DE JESUS; KAPILA, 2014; DOHERTY; MCMAHON, 2009). A

endocitose (fig. 4) pode ser dividida em fagocitose e pinocitose, na qual a fagocitose é

desempenhada por células do sistema imunológico, principalmente por fagócitos profissionais,

como os monócitos, macrófagos, neutrófilos e células dendríticas (DOHERTY; MCMAHON,

2009; ZHAO et al., 2011). Nesse processo, as células prolongam a membrana celular para

internalizar materiais exógenos e formar o fagossomo, que será processado no interior da célula,

com objetivo de degradar o material endocitado no lisossomo (fig. 4) (CANTON; BATTAGLIA,

2012; ZHAO et al., 2011). A pinocitose (fig. 4) é responsável pela internalização de materiais

menores que aqueles endocitados pela fagocitose. A pinocitose pode ser classificada em

macropinocitose, endocitose mediada por clatrina, endocitose mediada por caveolina e endocitose

clatrina-caveolina independentes, representadas por Flotilina e GLIC/GEEC (fig. 4) (FERREIRA

et al., 2014; SAHAY; ALAKHOVA; KABANOV, 2010).

Vários aspectos são importantes para a internalização de um nanomaterial, como o tipo de

interação que ele estabelece com a membrana plasmática, sua forma e composição, além de seu

tamanho e revestimento (CANTON; BATTAGLIA, 2012; SAHAY; ALAKHOVA; KABANOV,

2010; ZHAO et al., 2011). O processo de endocitose de nanomateriais, simplificadamente, inicia-

se com a projeção ou invaginação de uma porção da membrana plasmática, envolvendo o

nanomaterial; em seguida, a fração de membrana é liberada no interior da célula formando uma

vesícula, denominada de fagossomo (na fagocitose) ou endossomo (na pinocitose).

Posteriormente, a vesícula contendo o nanomaterial é processada pela célula, sendo direcionada

para os lisossomos, onde o conteúdo intravesicular é degradado com o objetivo de fornecer

nutrientes para síntese de proteínas ou geração de energia para a célula (fig. 4) (CANTON;

10

BATTAGLIA, 2012; SAHAY; ALAKHOVA; KABANOV, 2010). O ambiente hostil gerado para

a degradação dos nanomateriais nos lisossomos pode ter desdobramentos para a célula, com

geração de espécies reativas de oxigênio, ou até mesmo uma resposta biológica como a autofagia,

muitas vezes esses processos estão relacionados com as bases moleculares da toxicidade de

nanomateriais (STERN; ADISESHAIAH; CRIST, 2012). De modo geral, o estudo da endocitose

de nanomateriais é uma importante ferramenta para se começar a entender os efeitos citotóxicos

intracelulares de nanomateriais (DE JESUS; KAPILA, 2014; ZHAO et al., 2011).

Figura 4 – Principais vias de endocitose de nanopartículas em células eucarióticas. A etapa inicial representa

principais vias de endocitose usadas para o estudo da internalização de partículas, que tem como consequência a

formação de vesículas intracelulares - fagocitose, macropinocitose, endocitose mediada por clatrina, endocitose

mediada por caveolina e endocitose clatrina e caveolina independentes (flotilina e CLIC/GEEC). A segunda etapa

representa a via clássica de tráfego intracelular que envolve o processamento das nanopartículas a partir do

amadurecimento do endossomo precoce, com destino à degradação lisossomal do material endocitado (FERREIRA

et al., 2014).

11

1.6 Papel da autofagia no processamento de nanomateriais

A autofagia é um mecanismo fisiológico que contribui para a sobrevivência temporária da

célula, uma vez que a reciclagem de componentes celulares serve como fonte de energia diante de

uma condição de estresse, como inanição (privação de aminoácidos e outros nutrientes), hipóxia e

estresse metabólico (STERN; ADISESHAIAH; CRIST, 2012). Sendo assim, este processo é

evolutivamente conservado e altamente regulado que envolve a degradação lisossomal de

macromoléculas, ribossomos e organelas (por exemplo, retículo endoplasmático, aparelho de

Golgi e mitocôndrias) (ESKELINEN; SAFTIG, 2009). Resumidamente, a autofagia inicia-se

através da formação de uma membrana de camada dupla denominada autofagossomo, no qual irão

envolver proteínas e organelas danificadas destinados à degradação. Posteriormente, o

autofagossomo se funde com o lisossomo, onde enzimas hidrolíticas irão degradar o conteúdo,

dando a origem ao autofagolisossomo (fig. 5). Durante a autofagia, uma proteína citosólica

denominada LC3-I é conjugada com fosfatidiletanolamina, para formar LC3-fosfatidiletanolamina

(LC3-II), que é recrutada na membrana de autofagossomos e posteriormente degradada por

hidrolases lisossômicas após a fusão de autofagossomos com lisossomos (DJAVAHERI-

MERGNY; BOTTI; CODOGNO, 2007).

Outra proteína citosólica que participa desse processo é a p62, que tem fundamental

importância na degradação autofágica seletiva de muitas proteínas e organelas disfuncionais. Esta

proteína adaptadora atua como seletor de substratos, sendo uma proteína reguladora da entrega de

organelas disfuncionais, proteínas agregadas e proteínas ubiquitinadas, para a eliminação através

da autofagia (ITAKURA; MIZUSHIMA, 2011). No final deste processo, a p62 é degradada no

lisossomo juntamente com os substratos de autofagia, o que promove a diminuição do nível

intracelular desta proteína livre (FILOMENI; DE ZIO; CECCONI, 2014; RUSTEN;

12

STENMARK, 2010). Sendo assim, o aumento dos níveis de LC3 II e a diminuição da p62 livre

são muito utilizadas como marcadores celulares para determinação de fluxo autofágico

(TASDEMIR et al., 2008).

Como citado anteriormente, a autofagia é um mecanismo fisiológico para a sobrevivência

da célula, porém a indução da autofagia tem sido descrita quando um estímulo contínuo ou potente

de estresse é dado, por exemplo, por ação de xenobióticos. Nanomateriais também são descritos

como indutores de autofagia (STERN; ADISESHAIAH; CRIST, 2012), por exemplo, alguns

nanomateriais podem ativar autofagia através da produção de espécies reativas de oxigênio, tal

como a acumulação de proteínas oxidadas não funcionais e subsequente estresse do retículo

endoplasmático, ou ainda por dano mitocondrial (HE; KLIONSKY, 2009; STERN;

ADISESHAIAH; CRIST, 2012). Portanto, o estudo da autofagia é uma ferramenta importante para

elucidar mecanismo citotóxicos causados pelos nanomateriais, onde é possível visualizar o

crescente número de publicações evidenciando o envolvimento deste fenômeno nas bases

moleculares da toxicidade de nanomateriais (STERN; ADISESHAIAH; CRIST, 2012;

ZABIRNYK; YEZHELYEV; SELEVERSTOV, 2007).

13

Figura 5 – Mecanismo de Autofagia. Ilustração do processo de autofagia. 1- Início da formação do Autofagossomo.

2 - O Autofagossomo funde com o lisossomo, dando origem ao Autofagolisossomo, 3- Degradação de organelas e

macromoléculas no Autofagolisossomo. As proteínas LC3-II estão envolvidas no processo autofágico,

respectivamente auxiliando na formação do autofagossomo e no recrutamento de substratos para degradação (p62 -

agregação com ubiquitinas e substratos autofágicos).

1.7 Avaliação da toxicidade de nanopartículas em macrófagos

Os macrófagos pertencem ao Sistema Mononuclear Fagocitário (SMF) e são oriundos de

células precursoras do sistema hematopoiético (VAN FURTH et al., 1972). Essas células podem

ser encontradas em diversos tipos de tecidos devido a sua grande diversidade funcional. Dessa

forma, papéis importantes são atribuídos para essas células em vários aspectos biológicos de um

organismo, como por exemplo desenvolvimento, homeostase, reparação e resposta imunológica a

patógenos (WYNN; CHAWLA; POLLARD, 2013).

14

Os macrófagos são equipados com uma ampla variedade de receptores que permitem a célula

reconhecer objetos desconhecidos (não opsnisados) de um organismo, e muitas vezes constituem

a primeira linha de defesa, sendo capazes de fagocitar e processar detritos celulares e agentes

invasores, como vírus, bactérias e partículas (BUZEA; PACHECO; ROBBIE, 2007; GORDON,

2002). Por essas características, são considerados “fagócitos profissionais” devido a sua alta

capacidade de realizar fagocitose (WYNN; CHAWLA; POLLARD, 2013). Sendo assim, são

muito utilizados para avaliar os efeitos de patógenos como bactérias (TAYABALI; SELIGY,

2000) ou efeitos citotóxicos de nanopartículas, como exemplo as AgNP (LOCHT et al., 2011;

PRATSINIS et al., 2013; SHAVANDI; GHAZANFARI; MOGHADDAM, 2011; WANG; WU;

REINHARD, 2012).

Muitas linhagens de macrófagos são comumente utilizadas como modelos para estudos de

vários aspectos de captação de nanomateriais e seus potenciais efeitos tóxicos relacionados

(CANNON; SWANSON, 1992; WANG; WU; REINHARD, 2012). No presente trabalho,

utilizamos macrófagos peritoneais extraídos de camundongos C57BL6 como modelo celular para

estudos dos efeitos citotóxicos e processamento celular de AgNP biossintéticas. Como dito

anteriormente, os macrófagos constituem a primeira linha de defesa contra nanomateriais em seres

humanos e outros mamíferos (PRATSINIS et al., 2013), fato esse relevante para escolha do modelo

celular. Além disso, o uso do modelo com cultura de células primárias se aproxima mais da

realidade in vivo, pois esses nanomateriais também podem ser eliminados pela circulação sistémica

via sistema fagócito mononuclear (BERTRAND; LEROUX, 2012).

15

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivos gerais

Avaliar os mecanismos moleculares desencadeados por AgNP biossintéticas em macrófagos

peritoneais elicitados de camundongos C57BL/6, através de ensaios ex vivo estabelecendo relação

entre (i) as vias de internalização das AgNP e seu efeito citotóxico e a (ii) determinação da resposta

biológica (e.g. autofagia e estresse oxidativo).

2.2 Objetivos específicos

Para alcançar os objetivos gerais supracitados estabelecemos os seguintes objetivos

específicos:

a. Determinar a citotoxicidade das AgNP biossintéticas em macrófagos peritoneais em

função de concentração e de tempo.

b. Avaliar a integridade de membrana celular de macrófagos tratados com AgNP

biossintética em função do tempo.

c. Verificar a contribuição da endocitose (i.e. fagocitose e pinocitose) para a

citotoxicidade das AgNP biossintéticas em macrófagos peritoneais.

d. Investigar os mecanismos moleculares em resposta ao tratamento com as AgNP

biossintéticas, através da avaliação da:

produção de espécies reativas de oxigênio;

indução do processo autofágico.

16

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Obtenção das nanopartículas biossintéticas de prata

As AgNP biossintéticas utilizadas nesse projeto foram obtidas através da colaboração com

os grupos de pesquisas da Dra. Priscyla D. Marcato (FCFRP/USP) e Dr. Nelson Durán

(IQ/UNICAMP). A biossíntese das nanopartículas ocorre a partir da reação do AgNO3 com

solução de filtração da biomassa do fungo Fusarium oxysporum, doado pelo laboratório de

Genética e Biologia Molecular de Piracicaba (ESALQ-USP), SP, Brasil, na qual a formação da

prata metálica ocorre através a redução da prata por enzimas e outros substratos contidos no

filtrado fúngico. As nanopartículas foram sintetizadas na concentração de 10 mM (1,4 mg/mL de

Ag) apresentando formato esférico, com diâmetro de ±100 nm e carga superficial negativa (ζ = -

29 mV) (DURÁN et al., 2005, 2007).

3.2 Caracterização das AgNP biossintéticas

O raio hidrodinâmico médio, potencial zeta e o índice de polidispersividade das suspensões

coloidais foram determinados utilizando um Zetasizer Nano Series (Malvern Instruments,

Worcestershire, UK). As medidas foram realizadas a 25 ºC, após diluição de 1:100 da solução

estoque em água destilada.

3.3 Extração de macrófagos peritoneais elicitados

Para a obtenção de macrófagos peritoneais elicitados administrou-se, por via intraperitoneal

em camundongos C57BL/6 machos (6 a 8 semanas de vida), 1 mL de tioglicolato 4%. Após 72

horas, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e a pele da região abdominal foi

removida e pulverizada com álcool 70% para diminuir as chances de contaminação por micro-

17

organismos. Após este procedimento, 4 mL de meio RPMI sem soro foram injetados por via

intraperitoneal no camundongo e as células da parede interna na cavidade peritoneal foram

removidas por massageamento do abdômen do animal por aproximadamente 30 s. Em seguida, o

volume injetado foi coletado com a mesma seringa utilizada para injetar o meio de cultura. Para

finalizar o procedimento de extração, a cavidade abdominal foi aberta para extração do excesso de

fluido contendo as células com uma pipeta Pasteur. Todo fluido peritoneal foi transferido para tubo

falcon e centrifugado em 1200 RPM por 10 minutos, no qual o sobrenadante foi descartado e as

células ressuspendidas em meio de cultura RPMI (Roswell Park Memorial Institute – 1640)

(Biomol, Brasil), suplementado com 10% de soro fetal bovino inativo (Biomol, Brasil), 100 U/mL

de penicilina (Biomol, Brasil), 100 μg/mL de estreptomicina (Biomol, Brasil) e 1% glutamina. Em

todos os ensaios utilizando cultura de macrófagos, as células foram plaqueadas em densidade

celular e placas de cultura apropriadas para cada procedimento, e depois incubadas por 24 h a 37

ºC, em atmosfera de 5% de CO2 em incubadora REVCO Ultima II (Biomol, Brasil), para a adesão

dos macrófagos em placas de culturas.

Este procedimento de extração de macrófagos peritoneais elicitados possui a aprovação do

comitê de ética (protocolo CEUA 3004-1A) e foi feito em colaboração com o Dr. Alessandro dos

Santos Farias (jovem pesquisador do Instituto de Biologia/UNICAMP - Proc. FAPESP_nº

JP#2011/18728-5), que vem estudando o efeito de nanomateriais nesse modelo animal (GRECCO

et al., 2011; MORAES et al., 2013).

18

3.4 Caracterização de macrófagos Peritoneais

3.4.1 Caracterização por citometria de fluxo

Para caracterização dos macrófagos peritoneais as células foram plaqueadas em placas de 12

poços na concentração de 6,0 x 105 células/poço, de acordo com o item 3.3. Após este

procedimento, as células foram desprendidas das placas de cultura por raspagem com o espalhador

de células e ressuspendidas na concentração de 1,0 x 106 células em 100 µL de PBS, e transferidas

para tubos de citometria de fluxo. A seguir, as amostras foram marcadas com 3 µL da solução de

anticorpo monoclonal APC anti-mouse F4/80 (BioLegend, San Diego, CA, USA) de concentração

0,2 mg/mL por 30 minutos, em temperatura ambiente e protegidas da luz. Após o processo de

marcação, foram adicionados mais 200 μL de PBS e as amostras foram analisadas (10.000 eventos

por amostra) em citômetro de fluxo FACSCalibur (Beckton Dickinson), usando-se o programa

CellQuest 2.8. A análise da porcentagem das diferentes populações marcadas foi feita utilizando-

se o programa FlowJo V10 (Copyright FlowJo, LCC).

3.4.2 Caracterização por microscopia confocal

Os Macrófagos peritoneais foram plaqueados em placas de 12 poços contendo lamínula de

18 mm na concentração de 6,0 x 105 células/poço, de acordo com o item 3.3. Após a incubação

por 24 h e a adesão dos macrófagos peritoneais nas lamínulas, as células foram lavadas com PBS,

fixadas por 20 minutos com paraformaldeído (PFA) 4% em PBS à temperatura ambiente, após a

fixação as células foram lavadas por 3 vezes com PBS. Em seguida, as células foram incubadas

com glicina 0,1 M em PBS por 20 minutos, permeabilizadas com triton X-100 0,2% por 2 minutos

e bloqueadas com solução de SFB 10% por cinco minutos. Subsequentemente, as amostras foram

marcadas com 0,6 µg/lâmina de anticorpo monoclonal APC anti-mouse F4/80 (BioLegend, San

19

Diego, CA, USA) por 30 minutos a 37°C e para marcação dos núcleos utilizou-se DAPI (4',6-

diamidino-2-fenilindol) (Enzo Life Sciences), que é marcador de DNA. Após três lavagens com

PBS, as lamínulas foram montadas em lâminas de vidro, utilizando meio de montagem líquido

Faramount (DAKO). As lâminas foram feitas no Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de

Fotônica aplicada a Biologia Celular (INFABIC), na Universidade Estadual de Campinas –

UNICAMP. As amostras foram analisadas usando um confocal Zeiss LSM 780-NLO em um

microscópio Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG, Alemanha) equipado com lentes de imersão 60X.

As imagens foram adquiridas sob airy-unity 1, garantindo a confocalidade. Foram adquiridos 1024

por 1024 pixels e os arquivos foram salvos em formato próprio (lsm) sem perda de qualidade,

sendo posteriormente analisadas utilizando o software ImageJ (NIH).

3.5 Ensaios de viabilidade celular por MTT

Para a avaliação da viabilidade celular utilizou-se o ensaio de redução do MTT (3-(4,5-

dimetiltiazol2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina), no qual o princípio consiste na captação deste

corante e sua redução à formazan (um composto de cor púrpura) pelas desidrogenases

mitocondriais, resultando em acúmulo desse composto em células viáveis. A lise das células

possibilita a liberação do formazan, que pode ser, então, quantificado em 570 nm (MOSMANN,

1983). Os macrófagos peritoneais foram plaqueados na densidade celular de 1,0 x 104 células/poço

em placas de 96 poços, de acordo com o item 3.3. Posteriormente, as células foram submetidas ao

tratamento com as AgNP biossintéticas diluídas em meio RPMI sem soro e incubadas à 37 °C, na

qual as medições dose e tempo dependentes do tratamento com as AgNP biossintéticas foram

obtidas através dos resultados definidos através deste ensaio. Após o tratamento, os poços foram

lavados com PBS e adicionados a solução de MTT (0,5 mg/mL) (Sigma-Aldrich, EUA) diluída

20

em meio RPMI sem soro, na qual as células foram incubadas por mais 2 horas à 37 °C. No final

do procedimento, o meio foi removido cuidadosamente e foram adicionados 100 μL de etanol

absoluto para solubilização do formazan. As placas foram agitadas por 10 minutos e a absorbância

correspondente a cada poço foi lida no leitor de placas (ELx 800 BIO-TEK) em λ = 570 nm. Os

valores foram expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao controle.

3.6 Avaliação da integridade de membrana plasmática

3.6.1 Microscopia de Fluorescência

Para avaliar a permeabilidade da membrana plasmática os macrófagos peritoneais foram

extraídos e plaqueados em placas de 12 poços na densidade celular de 6,0 x 105 células/poço, de

acordo com o item 3.1. Posteriormente, as células foram submetidas ao tratamento com as AgNP

biossintéticas ou saponina 0,25% (controle positivo) por 1, 3 e 6 horas (tempo determinado de

conforme item 5.4). Após o tratamento, os macrófagos foram lavados 3 vezes com PBS e

incubados com Iodeto de Propídio (PI) + Hoechst 33342 (PI 1:1000 e Hoechst 33342 1:1000) (500

µL/poço) em meio RPMI sem soro e incubadas por 10 min a 37°C. Em seguida, as células foram

lavadas 1 vez com PBS e fixadas com 500 µL de PFA 4% por 20 min. Finalizando esta etapa, as

células foram lavadas 3 vezes com PBS e mantidas em 1 mL da própria solução de lavagem. Para

quantificação das amostras, as imagens foram adquiridas em 6 campos diferentes por poço, pelo

microscópio Zeiss Cell Observer Z1, acoplado a uma câmara Axio Cam MRm, para

posteriormente serem analisadas através do software ImageJ (NIH).

21

3.6.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Para avaliação morfológica da integridade da membrana plasmática por microscopia

eletrônica de varredura, os macrófagos peritoneais foram plaqueados em placas de 12 poços

contendo lamínula de 18 mm na densidade celular de 6,0 x 105 células/poço de acordo com o item

3.1. Após as células serem submetidas ao tratamento com as AgNP biossintéticas e saponina 0,25%

(controle positivo) por 1, 3 e 6 horas as células foram fixadas com glutaraldeído 2.5% (500

µL/poço) em PBS e incubadas por 2 h a 4 °C. Posteriormente, as células foram lavadas com PBS

e desidratadas gradualmente com etanol (25%, 50%, 75%, 90% e 100%). Em seguida, o ponto

crítico foi realizado de acordo com os protocolos experimentais e as lamínulas aderidas com fitas

de carbono nos stubs previamente limpos para que sejam cobertas com ouro. Por final, as lâminas

foram observadas e as imagens adquiridas no microscópio de Varredura JEOL JSM 6360-LV no

laboratório de microscopia eletrônica – Instituto de Química – UNICAMP.

3.7 Avaliação do estresse oxidativo

Os macrófagos peritoneais foram plaqueados em placas pretas de 96 poços na concentração

de 1,0 x 104 células/poço, de acordo com o item 3.1. A geração de espécies reativas de oxigênio

foi monitorada empregando-se a sonda 2',7'-diacetato de dicloro-fluoresceína (DCF-DA, Sigma

Aldrich, cod. D6883), que é desacetilada por estearases intracelulares gerando o produto 2, 7-

diclorofluoresceina (DCF), e na presenta de algumas espécies, tais como •H2O2, •NO2, •HO-, •ROO

(GOMES; FERNANDES; LIMA, 2005; KALYANARAMAN et al., 2012), se torna um composto

altamente fluorescente e pode ser detectado por espectroscopia de fluorescência, com um

comprimento máximo de excitação de 495 nm e um comprimento máximo de emissão de 529 nm.

Neste ensaio, utilizamos como controle positivo de ROS 20 nM de Forbol 12-Miristato 13-Acetato

22

(PMA) (Sigma Aldrich), e como controle negativo utilizamos 10 mM de N-acetilcisteina (NAC)

(Sigma Aldrich). As células foram tratadas com as 25 µM de AgNP biossintéticas e s geração de

espécies reativas de oxigênio foi analisada a cada minuto, pelo tempo total de 60 min, no leitor de

placas Synergy HT Biotec utilizando uma excitação em 490 nm e emissão em comprimentos de

onda de 530 nm.

3.8 Avaliação da citotoxicidade na presença de antioxidante

Para a determinação da citotoxicidade na presença de antioxidantes, os macrófagos

peritoneais foram extraídos e plaqueados em placas de 96 poços na densidade celular de 1,0 x 104

celulas/poço, de acordo com o item 3.3. Antes das células serem submetidas aos protocolos de

tratamento com as AgNP, os macrófagos peritoneais foram previamente incubados com 10 mM

de N-Acetilcisteína (NAC) por 30 min diluídos em meio RPMI sem soro. Logo em seguida, as

células foram tratadas com as AgNP biossintéticas e incubadas por 6 h. A viabilidade celular foi

medida conforme descrita no item 3.5.

3.9 Determinação do mecanismo de internalização

Os macrófagos peritoneais foram plaqueados na concentração de 1,0 104 células/poço em

placas de 96 poços, conforme descrito no item 3.3. Antes das células serem submetidas aos

protocolos de tratamento com as AgNP biossintéticas, os macrófagos peritoneais foram

previamente incubados com inibidores diluídos por 30 min em meio RPMI sem soro. Todas as

concentrações dos inibidores foram otimizadas de acordo com os testes de citotoxicidade por

MTT, descritos no item 3.5. Uma vez que as concentrações utilizadas não poderiam apresentar

23

efeitos tóxico, foi determinado que concentrações de inibidores que reduziam a viabilidade em

mais de 20% não seriam utilizadas, como demonstrado na tabela abaixo:

Tabela 1 - Determinação da concentração dos inibidores de endocitose e autofagia. As concentrações dos

inibidores foram avaliadas através dos ensaios de viabilidade celular por redução de MTT.

Via de ação Inibidores Mecanismo de inibição Conc.

testada

Conc. *

Viabilidade

Viabilidade

celular (%)

Fagocitose

Nocodazol Inibe polimerização de microtúbulos 1 5 - 20

µM 20 µM 97,7

Citocalasina D Despolimerização de F-Actina 2 3,75 - 15

µM 15 µM 100,0

Macropinocitos

e EIPA Inibidor de bomba de sódio/próton

3

6,25 - 25

µM 6,25 µM 86,2

Clatrina Clopromazina Perda de clatrina e do complexo adaptor

AP2 da membrana plasmática 4

2,5 - 10

µg/mL 2,5 µg/mL 86,0

Caveolina

Metil-β-Ciclodextrina

Solubilização de dominios ricos em

colesterol 5

2,5 - 10 µM

10 µM 91,8

Filipina II Sequestro de colesterol da membrana 6 5 - 20 µM

20 µM 91,0

Dinamina

dependentes Dynasore

Inibição de dinamina-1, dinamina-2 e

Drp17

25 - 100

µM 100 µM 93,6

Autofagia Cloroquina Inibição da acidificação lisossomal 8 12,5 - 50

µM 50 µM 100,0

* Concentração viabilidade- é a concetração que, neste trabalho, apresentou efeito mais relevante de inibição de

endocitose com menor citotoxicidade.

Referências da tabela: 1 (CANNON; SWANSON, 1992; DELOID et al., 2009), 2 (DELOID et al., 2009; ELLIOTT;

WINN, 1986), 3 (HASHIMOTO et al., 2014; WEST; BRETSCHER; WATTS, 1989), 4(MARINA-GARCÍA et al.,

2009; WANG; WU; REINHARD, 2012; YUMOTO et al., 2006), 5 (RODAL et al., 1999; AURIAC; WILLEMETZ;

CANONNE-HERGAUX, 2010), 6(AURIAC; WILLEMETZ; CANONNE-HERGAUX, 2010; SCHNITZER et al.,

1994), 7 (MACIA et al., 2006; MARINA-GARCÍA et al., 2009), 8(EGGER et al., 2013).

A inibição das vias de endocitose utilizadas neste trabalho foram baseadas de acordo com

publicações referentes a este efeito em macrófagos (vide referências Tabela 1). Além disso,

também utilizamos como inibidor de endocitose a incubação de macrófagos peritoneais em

temperatura de 10 °C, pois reduz a produção de ATP a níveis basais, que impossibilita a formação

deste evento dependente de energia.

24

3.10 Microscopia eletrônica de transmissão (MET)

Os macrófagos peritoneais foram plaqueados em placas de 12 poços contendo lamínula de

18 mm na densidade celular de 6,0 105 células/poço de acordo com o item 3.1. Após as células

serem submetidas ao tratamento com as AgNP biossintéticas e saponina 0,25% (controle positivo)

por 1, 3 e 6 horas, os macrófagos foram lavados duas vezes com PBS e fixadas com glutaraldeído

2.5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M e CaCl2 3 mM por 5 minutos no banho de gelo. Após

a fixação, as células foram lavadas em tampão cacodilato 0.1 M pH 7,2 e CaCl2 3 mM por 2 minuto

no gelo, e pós-fixadas com ósmio 1% em tampão cacodilato 0,1M e CaCl2 3mM e 0,8% de

ferrocianeto de potássio por 30 minutos no banho de gelo. Em seguida, foram realizadas as

desidratações seriadas das amostras em gradiente crescente de etanol (20%, 50%, 70%, 80%, 90%

e 2 vezes 100%). Em seguida, as amostras foram embebidas em resina Epon e etanol 1:1 à

temperatura ambiente por 30 min sob agitação e depois 4 a 5 trocas completas (1 hora cada, sendo

uma delas overnight, pelo menos) de resina Epon pura à temperatura ambiente. Em seguida, as

amostras foram polimerizadas à 60 ºC em estufa controlada por 60-72 horas. Os cortes ultrafinos

foram obtidos em um ultramicrótomo e coletados em grades de cobre com 200 mesh, as amostras

foram contrastadas com acetato de uranila e citrato de chumbo e as imagens foram obtidas em

microscópio eletrônico de transmissão JEOL JM 1400 pertencente ao Instituto de Biologia da

UNICAMP.

3.11 Avaliação da expressão de citocinas inflamatórias.

Os macrófagos peritoneais foram extraídos de acordo com o item 3.1, entretanto, 24 horas

que precedem a extração das células, as AgNP foram administradas por via intraperitoneal em

camundongos C57BL/6 para avaliação da resposta imune inata, na qual as concentrações de AgNP

25

foram relativamente estimadas a partir dos resultados obtidos pelos ensaios de citotoxicidade por

MTT. Sendo assim, após a extração, os macrófagos peritoneais foram colocados em tampão de lise

do kit RNAeasy (Qiagen, USA) adicionado de 1% de β-mercaptoetanol, para a extração do mRNA.

O mRNA extraído de todas as amostras foi convertido a cDNA usando-se o kit de conversão High

Capacity cDNA (APPLIED BIOSYSTEMS), de acordo com as instruções do fabricante. Os

cDNAs foram colocados junto a conjuntos de primers e sonda marcada com FAM- MGB (IL-6,

IL-12, IL-10, TNFα) SYBR Green (APPLIED BIOSYSTEMS). Foram utilizados como house

keeping GAPDH (IL-12, IL-6, TNFα) e B2M (IL-10). As análises foram feitas usando Real-time

PCR system 7500 fast (APPLIED BIOSYSTEMS). Os ciclos e as temperaturas, já determinadas

pelo fabricante, são os seguintes: 2 minutos a 50ºC, 10 minutos a 95ºC, e 45 ciclos de 15 segundos

a 95ºC/1 minuto a 60ºC.

3.12 Forma de análise dos resultados

Os resultados apresentados foram analisados pelo software Graphpad Prism 6.0 (GraphPad

Softwares, EUA), cujos resultados foram expressos como média ± desvio padrão da média de três

experimentos independentes realizados em triplicata. A análise estatística foi realizada utilizando

um nível de significância foi de 5% (P < 0,05) para o teste “t” de Student, para análises com dois

grupos, ou ANOVA, para análises com três ou mais grupos, seguida do pós teste de Tukey.

26

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Caracterização físico-química das nanopartículas biossintéticas de prata

Para iniciarmos os nossos estudos ex vivo dos efeitos citotóxicos causados pelas AgNP

biossintetizadas, avaliamos algumas características físico-químicas das nanopartículas para

confirmar se suas propriedades estavam semelhantes com aquelas descritas em literatura (DURÁN

et al., 2005, 2007; MARCATO; DURÁN, 2008). Durante este estudo foram utilizados 3 lotes de

sínteses distintas que foram avaliados quanto a suas propriedades físico-químicas e efeito

biológico, no qual, analisamos o raio hidrodinâmico, índice de polidispersão e potencial zeta das

AgNP biossintéticas pela técnica de espalhamento de luz dinâmico e análise de rastreamento de

nanopartículas (Tabela 2).

A técnica de espalhamento de luz (Tabela 2) demonstrou-se que as AgNP biossintéticas

possuem um raio hidrodinâmico médio de 103,1 nm 3,7 e um PDI de 0,250 0,003, índice que

mede a variação do tamanho da população de partículas (varia de 0, como suspensão totalmente

homogênea, até 1 em suspensão totalmente heterogênea, ISO 13321:1996 e ISO 22412:200),

resultado esse que garante as distribuições de faixa estreita de tamanho (baixa polidispersão). Além

disso, o resultado da média do potencial Zeta de -29,1 mV ±0,9 mV sugere uma baixa tendência

para agregação, pois em módulo, a presença de fortes cargas elétricas na superfície das partículas

impedem a aglomeração de partículas devido diferença eletroestática. (HEBEISH et al., 2013), o

que é de grande importância tanto para possíveis aplicações biológicas, quanto para prosseguir

com os estudos dos efeitos citotóxicos causados por essas nanopartículas em macrófagos

peritoneais. Os lotes testados apresentaram uma reprodutibilidade precisa, demonstrado pelo baixo

desvio padrão inter-amostra, o que possibilitou o intercâmbio entre as amostras de AgNP

biossintéticas. Além disso, os lotes eram validados quanto a sua atividade biológica, utilizando-se

27

testes de MTT e comparando os valores de IC50. Em um outro ensaio complementar utilizamos a

Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA), no qual obtivemos a média de partículas com

tamanho de 97 34 nm e concentração de 4,88 x 108 partículas/mL. Este resultado nos confirma o

raio hidrodinâmico obtido no primeiro ensaio, além de estimar a concentração de nanopartículas.

Tabela 2 - Características físico-químicas das nanopartículas biossintéticas de prata. Análise

do raio hidrodinâmico, polidispersão e potencial zeta pelo equipamento ZetaSizer (Malvern).

Resultados apresentados em forma de média e desvio padrão de 3 experimentos independente.

.

Lote 1 Lote 2 Lote 3 Média Desv. Pad.

Tamanho (nm) 107,6 98,6 103,2 103,1 3,7

PDI 0,250 0,254 0,246 0,250 0,003

Zeta (mV) -29,9 -29,5 -27,8 -29,1 0,9

4.2 Pureza de extração de macrófagos peritoneais

Para iniciar os ensaios ex vivo, avaliamos a pureza de extração de macrófagos peritoneais

utilizando a marcação com o anticorpo monoclonal APC anti-mouse F4/80, que reconhece

glicoproteínas da família EGF-TM7 presentes na membrana de macrófagos (AUSTYN;

GORDON, 1981; MCKNIGHT et al., 1996; MCKNIGHT; GORDON, 1998). A análise por

citometria de fluxo determinou que 98,5% das células extraídas eram positivas para a marcação

do anticorpo, demonstrando que o método de extração foi significativamente seletivo para

macrófagos (fig. 6).

28

Figura 6 – Seletividade de extração de macrófagos peritoneais. As células extraídas do peritônio de camundongos da

linhagem C57BL/6 elicitadas com tioglicolato, marcadas com o anticorpo APC anti-mouse F4/80 e depois analisadas

por citometria de fluxo (GATE: /FL4-H: MΦ APC). A avaliação das porcentagens das diferentes populações foi obtida

pelo programa FlowJo V. 10 (Copyright FlowJo, LCC), no qual obteve-se 98,5% da população de macrófagos

peritoneais. A Gráfico de granulosidade do Controle (SSC-H x FSC-H); B Histograma do controle (Número de

eventos x FL4-H: MΦ APC); C Gráfico de granulosidade das células marcadas com anti-F4/80 (SSC-H x FSC-H);

D Histograma das células marcadas com anti-F4/80 (Número de eventos x FL4-H: MΦ APC).

Os resultados obtidos a partir da técnica de citometria foram confirmados pela microscopia

confocal, no qual os macrófagos peritoneais foram marcados com APC anti-mouse F4/80 e DAPI

para marcação dos núcleos. A marcação em vermelho (fig. 7) demonstra a interação entre o

anticorpo F4/80 e as glicoproteínas da família EGF-TM7 presentes na membrana de macrófagos,

onde virtualmente não foram observados outros tipos celulares. Portanto, confirmamos através de

duas metodologias que o processo é seletivo para extração de macrófagos peritoneais elicitados, a

partir daí estabelecemos a utilização desse modelo celular para estudos ex vivo sobre a interação

com as AgNP biossintéticas.

29

Figura 7 – Marcação de glicoproteínas da família EGF-TM7 em macrófagos peritoneais elicitado. As lâminas para

a microscopia confocal foram preparadas utilizando lamínulas em placas de 12 poços onde 6,0 x 105 células foram

plaqueadas por poço, após 6 h o material foi fixado e, subsequentemente, marcado com anticorpo monoclonal anti-

mouse F4/80 acoplado ao fluoróforo APC (vermelho) e DAPI (azul) (Barra de escala: 20 µm).

4.3 Determinação do IC50 em macrófagos peritoneais por MTT

Com a caracterização das AgNP biossintéticas e do modelo celular de macrófagos

peritoneais elicitados, iniciamos a avaliação dos efeitos citotóxicos causados pelas AgNP

biossintéticas, para isso utilizamos o ensaio de viabilidade por redução de MTT. Após a extração

dos macrófagos peritoneais, as células foram incubadas por 24 h com crescentes concentrações de

AgNP biossintéticas para a determinação da dose responsável pela redução em 50% da viabilidade

celular (IC50). A regressão sigmoidal dos dados resultou em um alto coeficiente de determinação

(R2 = 0,9935, Graphpad Prism 6.0), determinando a faixa de IC50 entre 23,65 µM – 26,81 µM de

30

AgNP (fig. 8). A determinação do IC50 é uma ferramenta importante de citotoxicidade aguda, pois

nos permite trabalhar com uma concentração inicial para seguir com os demais experimentos em

macrófagos peritoneais, desta forma, fixamos a concentração de 25 µM de AgNP para representar

o valor de IC50.

Figura 8 – Determinação do IC50 em macrófagos peritoneais. As células foram tratadas com concentrações

crescentes de AgNP (0 – 100 μM) por um período de 24 h e a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. A

viabilidade de células não tratadas foi considerada como 100%. Cada valor representa a média ± S.D. de três

experimentos independentes (n = 4).

4.4 Viabilidade em função da variação do tempo

Após determinarmos o valor de IC50 pelo período de 24 h, avaliamos o perfil de

citotoxicidade das AgNP biossintéticas em menores intervalos de tempo. A citotoxicidade de

AgNP biossintéticas em tempos menores (fig. 9) mostrou que nos tratamentos de 30 min e 1, 2 e

4 h não foram observados efeitos citotóxicos para todas as concentrações testadas (10, 25 e 50

μM). Contudo, após 6 h de tratamento, o perfil de citotoxicidade é bastante similar àquele

observado após 24 h de tratamento. Outra observação é que, mesmo com a utilização de uma

concentração superior de AgNP (50 μM) em 4 h de tratamento, não foi obtido o mesmo perfil de

31

citotoxicidade em 6 h e 24 h de incubação na concentração de 25 μM de AgNP. Portanto,

demonstrando que a citotoxicidade das AgNP é dose dependende (fig. 8) e tempo dependente

(fig.9) nas condições testadas de incubação e de tipo celular. Desta forma, decidimos realizar as

análises subsequentes em tempos de até 6 h, pois acreditamos que ensaios dentro desse intervalo

de tempo são fundamentais para a determinação de detalhes moleculares da interação entre AgNP

biossintetizadas e macrófagos peritoneais. Somado a isso, como não observamos alteração na

viabilidade após 6 h, provavelmente o macrófago inicia um processo de recuperação ao tratamento.

Portanto, análises em 24 h ou tempos maiores trariam detalhes sobre o processo de recuperação e

não sobre os efeitos citotóxicos das nanopartículas.

Figura 9 – Citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais em função do tempo. As células foram tratadas com

10, 25 e 50 M de AgNP durante 30 min, 1 h, 2h, 4h, 6h e 24 h. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de

MTT. A viabilidade de células não tratadas foi considerada como 100%. Cada valor representa a média ± S.D. de três

experiências independentes (n = 4). Foram encontradas diferenças significativas entre os valores de IC50 para 30 min,

1, 2 e 4 h quando comparado com 24 h, somente o tratamento de 6 h não apresentou diferença estatística (p < 0,05).

ANOVA seguida por teste de Tukey (24h vs 30 min, 1h, 2h,4h e 6h).

32

4.5 Avaliação da integridade da membrana em macrófagos peritoneais

Como descrito anteriormente, as AgNP podem promover danos à membrana celular

(ASHARANI et al., 2009; ZHANG et al., 2014; ZHORNIK et al., 2014). Sendo assim, avaliamos

a integridade da membrana de macrófagos peritoneais tratadas com AgNP biossintéticas, para isso

utilizamos o corante Iodeto de Propídio (PI), que é impermeável à membranas intactas, entretanto,

quando a célula apresenta algum dano à membrana, este corante pode penetrar na célula e se ligar

ao DNA intercalando-se com as bases nitrogenadas (SUZUKI et al., 1997). Também utilizamos

neste experimento o marcador de núcleo Hoechst 33342, no qual se liga preferencialmente de

adenina e timina (A-T), e que é permeável a membrana plasmática utilizado para determinar o

total de núcleos presentes (CHAZOTTE, 2011).

Na fig. 10 e 11 demonstramos o comprometimento da integridade de membrana dos

macrófagos peritoneais incubados com AgNP em função do tempo (1h, 3h, 6h). No grupo controle

(fig. 10 e fig. 11 A) dificilmente foi possível observar núcleos positivos para PI, indicando que as

condições de tratamento não alteraram a integridade da membrana dos macrófagos. Após 1 h de

tratamento observamos apenas 1,4% ±3,0% de núcleos positivos para PI (fig. 10 e fig. 11 B), em

relação aos núcleos marcados com Hoechst 33342, isso demonstra que a integridade da membrana

ainda está mantida durante esse período. Já após 3 horas de tratamento (fig. 10 e fig. 11 C), quase

a metade das células eram positivas para a marcação com PI (44,4% ±10,0%), indicando que pouco

menos da metade das células tiveram a integridade de suas membranas comprometidas. Após 6 h

de tratamento, esse valor chega em 99,1% ±0,9%, onde praticamente visualizamos todos os

núcleos positivos para PI (fig. 10 e fig. 11 D). De acordo com os resultados obtidos pelo ensaio

em microscópio de fluorescência (fig. 10 e fig. 11), a alteração na permeabilidade de membrana

33

se inicia a partir da primeira hora de tratamento, chegando a 50% em 3 h e levando a

permeabilização de praticamente todas as células após 6 h.

Figura 10 – Porcentagem de permeabilidade celular em macrófagos peritoneais. Tramento com 25 µM de AgNP em

placas de 12 poços de concentração 6,0 x 105 células/poço, nos períodos de 1h, 3h e 6h, no qual foi avaliado a

porcentagem da permeabilidade celular utilizando o número de núcleos positivos para PI dividido pelo número de

células totais, positivos para Hoechst 33342, multiplicado por 100. O grupo controle representa o tempo de 6h de

incubação (tempos inferiores também não houveram marcações positivas para PI). Cada valor representa a média ±

S.D. de três experiências independentes (n = 3) * p < 0,05. ANOVA seguida por teste de Tukey.

34

Campo Claro Hoechst 33342 PI Hoechst 33342 + PI

Figura 11 – Imagens representativas da avaliação da permeabilidade celular em macrófagos por microscopia de

fluorescência. Imagens obtidas no aumento de 200 x (Barra de escala: 100 µm). Linhas: A – grupo controle; B -

tratamento de 1h com 25 µM de AgNP; C - tratamento de 3h com 25 µM de AgNP; D - tratamento de 6h com 25 µM

de AgNP. Colunas: 1- imagem de campo claro; 2 - marcação com Hoechst 33342 (azul); 3- marcação com PI

(vermelho); 4 - Sobreposição da marcação com Hoechst 33342 com PI (rosa).

A partir da constatação de que as AgNP causam danos a membrana das células, decidimos

investigar alterações de morfologia em macrófagos intraperitoneais tratados com AgNP por

microscopia eletrônica de varredura (MEV) em função do tempo (1h, 3h e 6h) (fig. 12), onde

observamos no controle, não tratado (fig. 12 A), uma morfologia típica de macrófagos peritoneais,

apresentando estruturas de membranas íntegras com protrusões. Após 1 h de tratamento é possível

observar que as células começam a perder sua morfologia original apresentando uma leve

diminuição do volume celular, além da diminuição das protrusões de membrana, aparência “lisa”

(fig. 12 B). Após 3 h os macrófagos apresentaram uma morfologia menos fusiforme, com o volume

citoplasmático ainda menor e mais arredondados (fig. 12 C). Por fim, após 6 h já é possível

35

evidenciar uma alteração considerável da morfologia, com início de fragmentação celular (fig. 12

D). Portanto, esses resultados estão de acordo com aqueles observados pelo teste de

permeabilidade de membrana, pois a partir de 3 h de tratamentos os macrófagos apresentam

alterações mais visíveis em sua morfologia, o que poderia justificar o aumento da permeabilidade

celular do fluoróforo (fig. 11 e fig. 12 C). Além disso, no tratamento de 6 h com as AgNP é possível

visualizar uma evolução ainda maior do dano à membrana, fato que também justifica o aumento

da permeabilidade apresentada (fig. 11 e fig. 12 D).

Figura 12 – Avaliação da morfologia de macrófagos peritoneais tratados com AgNP. Imagens representativas das

micrografias obtidas no aumento de 5000 x, barra escala de 5 µm. A - Grupo controle; Macrófagos tratados com 25

μM de AgNP pelo período de: B - tratamento de 1h; C - tratamento de 3h; D - tratamento de 6h.

36

4.6 Avaliação da geração de espécies reativas de oxigênio após tratamento com AgNP

biossintéticas

Devido às alterações de permeabilidade de membrana causadas após o tratamento com

AgNP em macrófagos peritoneais, uma das prováveis causas seria por meio de peroxidação

lipídica, que é formada através de uma cascata de eventos bioquímicos resultantes da ação de

espécies reativas de oxigênio (ROS) sobre os lipídios insaturados de membranas celulares

(GUTTERIDGE, 1995; LIMA; ABDALLA, 2001; NIKI et al., 2005). A peroxidação lipídica

desencadeia uma sequência de lesões celulares, levando ao comprometimento estrutural da

membrana, falência dos mecanismos de troca de metabólitos, transtornos da permeabilidade e no

fluxo iônico, perda da seletividade para entrada e saída de nutrientes ou substâncias tóxicas,

comprometimento dos componentes da matriz extracelular, entre outros danos que, numa situação

extrema, pode ocasionar a morte celular (BARBER; BERNHEIM, 1967; BENZIE, 1996; LIMA;

ABDALLA, 2001; VACA; WILHELM; HARMS-RINGDAHL, 1988).

Em vista disso, decidimos investigar a produção de ROS em macrófagos quando submetidos

ao tratamento com AgNP na presença da sonda DCF-DA, que emite fluorescencia na presença de

espécies como tais como •H2O2, •NO2, •HO-, •ROO (GOMES; FERNANDES; LIMA, 2005;

KALYANARAMAN et al., 2012). Além disso, utilizamos PMA como controle positivo (agente

indutor de ROS) e NAC como controle negativo (agente supressor de ROS). A produção de ROS

foi avaliada por 1 h, onde observamos um aumento da produção de ROS no grupo tratado com

PMA e uma diminuição dos níveis de ROS quando em presença de NAC. O grupo tratado com

AgNP apresentou um aumento significativo em relação ao controle (p< 0.05, fig. 13), indicando

uma indução na produção de ROS semelhante ao grupo tratado com o PMA. Além disso, o efeito

inibitório da produção de ROS por NAC foi observado, da mesma forma quando associado ao

37

tratamento com as AgNP (fig. 13), revertendo a produção de ROS pelos macrófagos frente o

tratamento com as nanopartículas.

Figura 13 – Avaliação dos níveis de ROS em macrófagos peritoneais. As células foram submetidas ao tratamento

com 25 µM de AgNP, onde utilizou-se controle negativo para formação de ROS – N-Acetilcisteina (NAC, 10 mM);

e controle positivo para formação de ROS – Forbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA, 20 nM). A geração de espécies

ROS foi analisada empregando-se a sonda 2´,7´ diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCF-DA). O eixo y corresponde

à intensidade de fluorescência obtida através da integração de todos os valores adquiridos pelo período 1h (leituras a

cada minuto). Cada valor representa a média ± S.D. (n = 4). * p < 0,05 diferença significativa em relação ao controle.

ANOVA seguida por teste de Tukey.

Com base nos resultados obtidos na avaliação dos níveis de ROS, principalmente quando

observamos a reversão do efeito das AgNP em presença antioxidante de NAC, decidimos avaliar

o impacto desse efeito na citotoxicidade causada pelas AgNP biossintéticas. Para isso, utilizamos

o ensaio de redução do MTT e tratamentos em presença e ausência de NAC. Observamos que a

concentração NAC testada (10 mM) não apresentou efeito citotóxico, contudo, em amostras pré-

tratadas com NAC quando tratadas com AgNP, observamos a reversão completa da citotoxicidade

das AgNP em macrófagos peritoneais (fig. 14).

Esse resultado demonstra que efeito citotóxico causado pelas AgNP em macrófagos

peritoneais está intimamente envolvido com a produção de ROS induzido pelas nanopartículas, o

38

que poderia acarretar em diversas lesões celulares, como por exemplo a peroxidação lipídica, que

explicaria as alterações de permeabilidade de membrana e morfologia celular descritos

anteriormente (fig. 11 e fig. 12). É importante ressaltar que os efeitos observados nesse modelo

experimental incluem a produção de ROS intracelular; portanto, até o presente momento nossos

dados ainda não nos permite distinguir se o efeito citotóxico das AgNP teria como mecanismo a

produção de ROS na membrana, no interior celular ou ainda a somatória dos dois efeitos.

Estudos mostram que as AgNP podem induzir estresse oxidativo através de diversos eventos.

Uma das possibilidade é através do dano mitocondrial, pois quando internalizadas e destinadas aos

lisossomos, as AgNP podem desestabilizar a membrana do lisossomo, levando a sua ruptura, e

consequentemente a liberação das AgNP e enzimas proteolíticas (e.g. catepsinas), que irão gerar

danos mitocondriais e induzir a produção de superóxidos (SINGH; RAMARAO, 2012; YANG et

al., 2012). Outros estudos evidenciaram que as AgNP e seus íons são capazes de fazer ligações

com grupamento tiol de proteínas antioxidantes, tais como GSH. A depleção de GSH e redução

da atividade de enzimas antioxidantes podem aumentar o estresse oxidativo em células animais

(ARORA et al., 2008; PIAO et al., 2011).

39

Figura 14 – Avaliação da viabilidade celular na presença de N-Acetilcistena. As células foram tratadas com 25 µM

de AgNP, por um período de 6 h e a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. A viabilidade de células não

tratadas foi considerada como 100%. Cada valor representa a média ± S.D. de três experiências independentes (n =

4). * p < 0,05 diferença significativa AgNP vs AgNP+NAC. ANOVA seguida por teste de Tukey.

4.7 Avaliação da endocitose na citotoxicidade das AgNP biossintéticas em macrófagos

peritoneais

Como já descrito anteriormente, as AgNP podem desencadear danos à membrana dos

macrófagos peritoneais, alterando sua permeabilidade seletiva, entretanto, será que essas

nanopartículas são internalizadas e promovem danos intracelulares? Para responder essa pergunta

investigamos o papel da endocitose no efeito citotóxico causado pelas AgNP. Inicialmente

avaliamos se a inibição da endocitose pode acarretar alterações nos efeitos citotóxicos causados

pelas nanopartículas. Dessa forma, utilizamos duas abordagens experimentais para avaliar a

endocitose de uma maneira geral e inespecífica. A primeira consiste na diminuição da temperatura,

que é usada para diminuir a produção de ATP das células a níveis basais e desta forma inibir a

endocitose (DOS SANTOS et al., 2011; IACOPETTA; MORGAN, 1983; JIN; EL-DEIRY, 2005;

SELVI et al., 2012; STEINMAN et al., 1983; WILEMAN et al., 1984). Para isso, os macrófagos

40

peritoneais foram submetidos ao tratamento com as AgNP em duas condições de incubação (10

°C e 37 °C) e depois avaliado a viabilidade celular pelo teste de redução do MTT. Observamos

que o tratamento em baixa temperatura (10 °C) leva a um aumento do efeito citotóxico (9,4%

±10,8%) em relação ao tratamento a 37 °C (48,1% ±6,5%) (fig. 15). Entretanto, o grupo controle

10 °C apresentou diminuição significativa na viabilidade celular (72,2% ±13,2%), resultado esse

que possivelmente potencializou o efeito citotóxico causados pelas AgNP. Não podemos

desconsiderar também que a baixa da temperatura leva a produção de ATP para níveis basais, o

que poderia comprometer mecanismos de reparo de membrana e o metabolismo das nanopartículas

(e.g. autofagia) (STERN; ADISESHAIAH; CRIST, 2012).

Figura 15 – Citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob variação da temperatura. As células foram

tratadas com 25 µM de AgNP durante um período de 6 h e um grupo foi incubado a 37 °C e outro a 10 °C. A viabilidade

celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. O grupo controle 37 °C foi considerado como 100% das células da viabilidade

celular. Cada valor representa a média ± S.D. de três experiências independentes (n = 4).

a - Controle 37 °C vs Controle 10 °C. b - AgNP 37 °C vs AgNP 10 °C a e b = p < 0,05 diferença significativa por

ANOVA, seguida por teste de Tukey.

41

Já na segunda abordagem utilizamos Dynasore, que inibe as proteínas dinamina-1,

dinamina-2 e Drp1 (essa última uma versão mitocondrial da dinamina) (MACIA et al., 2006;

THOMPSON; MCNIVEN, 2006), uma família das proteínas dinamina são responsáveis pela

constrição da membrana plasmática durante a endocitose e consequente liberação da vesícula no

interior da célula (FERREIRA et al., 2014; SAHAY; ALAKHOVA; KABANOV, 2010). Portanto,

foram utilizadas concentrações crescentes de Dynasore (25, 50 e 100 μM) (fig. 16), onde não

foram observados efeitos citotóxicos significativos para nenhuma das concentrações testadas. Já o

grupo pré-tratado com o inibidor e posteriormente tratado com as AgNP apresentou uma tendência

de diminuição da viabilidade, quando comparado ao tratamento sem o inibidor. A maior

concentração de inibidor utilizada (100 μM) apresentou diferença estatística (*p < 0,05: 18,9%

±5,3%) em relação ao grupo tratado somente com AgNP.

Os resultados com o Dynasore demonstraram o aumento da citotoxicidade das AgNP através

da utilização de 100 μM do inibidor. A dinamina é uma importante proteína que está envolvida na

endocitose mediada por clatrina/caveolina. Essas duas vias de internalização são fundamentais

para a obtenção de nutrientes vitais para a célula (FERREIRA et al., 2014; SAHAY;

ALAKHOVA; KABANOV, 2010). Sendo assim, além da possibilidade de existir um efeito

citotóxico sinérgico da nanopartícula com o inibidor, uma outra alternativa seria que, ao inibir vias

dependentes de dinamina, as nanopartículas poderiam ser endocitadas por uma via compensatória,

42

como por exemplo fagocitose, que favoreceria a internalização desse nanomaterial e,

consequentemente, proporcionaria o aumento de efeitos citotóxicos.

Figura 16 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de Dynasore.

As células foram tratadas com 25 µM de AgNP durante um período de 6 h. A viabilidade celular foi avaliada pelo

ensaio de MTT. Foi considerado como 100% as células que foram isentas de tratamento com as AgNP e inibidor de

endocitose. Cada valor representa a média ± S.D. de três experiências independentes (n = 4). *p < 0,05 diferença

estatística entre AgNP Vs AgNP + Dynasore. Análise estatística por ANOVA seguida por teste de Tukey.

4.8 Avaliação de inibidores de fagocitose na citotoxicidade das AgNP

A endocitose pode ser classificada em fagocitose e pinocitose, como abordamos a endocitose

de forma inespecífica, no qual promovemos a inibição da endocitose através da redução da

temperatura (10 °C) e utilizamos um inibidor de várias vias (Dynasore), resolvemos investigar em

detalhes o papel de cada uma das vias que poderiam contribuir para citotoxicidade das AgNP.

Iniciamos estudando o papel da fagocitose, uma vez que os macrófagos são denominadas fagócitos

profissionais, pois são células altamente especializadas com papel fundamental no reparo de

43

tecidos e no sistema imune, além disso, poucos estudos abordam o efeito da fagocitose para a

citotoxicidade de nanopartículas (KIM; CHOI, 2012; SAHAY; ALAKHOVA; KABANOV, 2010;

WEISSLEDER; NAHRENDORF; PITTET, 2014). Com base nessas informações, investigamos

se a fagocitose está relacionada com a citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais

utilizando dois inibidores, a Citocalasina D (inibidor da polimerização da actina, ELLIOTT;

WINN, 1986) e o Nocodazol (inibidor da formação de microtúbulos) (SWANSON; BUSHNELL;

SILVERSTEIN, 1987), utilizando o teste de redução de MTT. Observamos que as concentrações

utilizadas para a Citocalasina D (3,75; 7,5 e 15 μM, fig. 17) e Nocodazol (5, 10 e 20 μM, fig. 18)

não apresentaram efeitos citotóxicos significativos para os macrófagos peritoneais. Já o pré-

tratamento com Citocalasina D (fig. 17) e Nocodazol (fig. 18) levou a uma redução da

citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais para todas as concentrações testadas (*p

<0,05). A reversão parcial da citotoxicidade por ambos inibidores sugere que, ao menos

parcialmete, a inibiçao da fagocitose afeta o efeito citotóxico das AgNP biossintéticas. Além disso,

ausência de uma tendência à reversão total em ambos inibidores sugere que a fagocitose teria uma

contribuição parcial para citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais.

44

Figura 17 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de fagocitose

Citocalasina D. As células foram tratadas com 25 µM de AgNP durante um período de 6h e um grupo foi incubado a

37 °C. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. Foi considerado como 100% as células que foram

isentas de tratamento com as AgNP e inibidor de endocitose. Cada valor representa a média ± S.D. de três experiências

independentes (n = 4). *p < 0,05 diferença estatística entre AgNP Vs AgNP + Citocalasina D. Análise estatística por

ANOVA seguida por teste de Tukey.

Figura 18 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de fagocitose

Nocodazol. As células foram tratadas com 25 µM de AgNP durante um período de 6h e um grupo foi incubado a 37

°C. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. Foi considerado como 100% as células que foram isentas

de tratamento com as AgNP e inibidor de endocitose. Cada valor representa a média ± S.D. de três experiências

independentes (n = 4). *p < 0,05 diferença estatística entre AgNP Vs AgNP + Nocodazol. Análise estatística por

ANOVA seguida por teste de Tukey.

45

4.9 Estudo da pinocitose na citotoxicidade das AgNP

Diante da diminuição da citotoxicidade das AgNP biossintéticas em presença de inibidores

de fagocitose, decidimos investigar se a pinocitose também contribui para o efeito citotóxico. Em

vista disso, avaliamos a citotoxicidade das AgNP em macrófagos através da inibição das vias

clássicas de pinocitose: endocitose mediada por clatrina, endocitose mediada por caveolina e

macropinocitose (FERREIRA et al., 2014; SAHAY; ALAKHOVA; KABANOV, 2010).

Para avaliar a contribuição da endocitose por macropinocitose para o efeito citotóxico das

AgNP utilizamos o inibidor EIPA (HASHIMOTO et al., 2014) (Fig 19) nas concentrações 6,25

µM, 12,5 µM e 25 µM. Entretanto, para esse inibidor as duas concentrações maiores apresentaram

um efeito citotóxico significativo (*p<0,05; para a concentração de 12,5 µM obtivemos uma

viabilidade de 72,1% ±9,6% e para 25 µM, 66,7% ±6,9% de viabilidade). A concentração de 6,25

µM de EIPA não apresentou efeito citotóxico significativo, e quando associada às AgNP não

houve alterações significativas na viabilidade celular quando comparado ao tratamento sem o

inibidor (AgNP + Eipa 6,25 µM x AgNP). Apesar da concentração mais citotóxica de 25 µM de

EIPA (66,7% ±6,9%) promover a diminuição da viabilidade celular em macrófagos quando

tratados com as AgNP (*p<0,05: 6,8% ±4,7%) esse dado não tem relevância biológica, pois nessa

concentração não é possível diferenciar o efeito inibitório do efeito citotóxico do inibidor. Através

dos resultados obtidos com a utilização do inibidor de macropinocitose EIPA, podemos afirmar

que a concentração não citotóxica de EIPA (6,25 µM) não alterou os efeitos citotóxicos causados

pelas AgNP, o que nos leva a concluir que aparentemente a via de macropinocitose não tem relação

com o efeito citotóxico das AgNP biossintéticas.

46

Figura 19 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de

Macropinocitose EIPA. As células foram tratadas com 25 µM de AgNP durante um período de 6h e um grupo foi

incubado a 37 °C. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. Foi considerado como 100% as células que

foram isentas de tratamento com as AgNP e inibidor de endocitose. Cada valor representa a média ± S.D. de três

experiências independentes (n = 4). p < 0,05 “a” = AgNP vs AgNP + EIPA. “b” = Controle vs EIPA. Análise estatística

por ANOVA seguida por teste de Tukey.

Já para avaliar a contribuição da endocitose por clatrina para o efeito citotóxico das AgNP

utilizamos o inibidor Clorpromazina (CPZ) (fig. 20), no qual foi observado que concentrações de

5 µg/mL e 10 µg/mL apresentaram efeitos citotóxicos em macrófagos peritoneis (*p<0,05: 5

µg/mL= 64,7% ±15,6%; e 10 µg/mL= 8,7% ±3,0%). CPZ na concentração de 2,5 µg/mL não

apresentou efeito citotóxico significativo (* p<0,05). Quando os macrófagos foram pré-tratados

com CPZ e posteriormente tratadas com as AgNP biossintéticas observamos que a concentração

de 2,5 µg/mL de CPZ (CPZ + AgNP) não promoveu alterações significativas na citotoxicidade em

relação as tratadas somente com as AgNP (*p<0,05). Por outro lado, as concentrações de CPZ que

apresentaram efeito citotóxico (5 µg/mL e 10 µg/mL) quando tratadas com as AgNP a viabilidade

celular em macrófagos foi reduzida consideravelmente (*p<0,05: 5 µg/mL= 7,5% ±7,2%; e 10

47

µg/mL= 3,1% ±3,3%). Estes resultados indicam um perfil similar ao encontrado na inibição da

macropinocitose (fig. 20), onde a concentração não citotóxica de CPZ (de 2,5 µg/mL) não alterou

a citotoxicidade das AgNP, e quando utilizou-se a concentração mais citotóxica de CPZ (5 µg/mL

e 10 µg/mL) o efeito junto com as nanopartículas foi sinérgico. Estes resultados ainda não nos

permite concluir sobre o efeito dessas vias (endocitose mediada por clatrina e macropinocitose)

com a toxicidade das AgNP em macrófagos. Portanto, serão necessários mais testes com outros

inibidores dessas vias para chegar em uma conclusão mais definitiva.

Figura 20 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de endocitose

mediada por clatrina Clorpromazina. As células foram tratadas com 25 µM de AgNP durante um período de 6h e um

grupo foi incubado a 37 °C. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. Foi considerado como 100% as

células que foram isentas de tratamento com as AgNP e inibidor de endocitose. Cada valor representa a média ± S.D.

de três experiências independentes (n = 4). p < 0,05 “a” = AgNP vs AgNP + CPZ. “b” = Controle vs CPZ. Análise

estatística por ANOVA seguida por teste de Tukey.

Para o estudo da endocitose mediada por caveolina, avaliamos a citotoxicidade das AgNP

na presença dos inibidores: Metil-beta-ciclodextrina (MβCD) e Filipina (Fig 21 e Fig 22). As

48

concentrações testadas dos inibidores sozinhos não apresentaram redução da viabilidade

significativa (* p<0,05) em macrófagos peritoneais. Já para as células pré-tratadas com MβCD

(fig. 21), o tratamento com AgNP biossintéticas tem uma diminuição do efeito citotóxico nas três

concentrações utilizadas do inibidor (*p<0,05: 2,5 µM= 62,7% ±12,5%; 5 µM= 61,8% ±5,0%; e

10 µM= 70,5% ±14,5%). Um resultado similar foi observado em experimentos em presença do

inibidor Filipina (5, 10 e 20 µM) que também promoveu uma diminuição do efeito citotóxico

causado pelas AgNP biossintéticas (fig. 22); entretanto, para esse último inibidor foi possível

observar um efeito dose-dependente, ou seja, quanto maior a concentração de Filipina utilizada,

maior foi o aumento da viabilidade celular. Portanto, com a inibição da endocitose mediada por

caveolina observamos uma redução da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais,

resultado esse similar ao obtidos com a inibição da fagocitose. Uma possível explicação para esses

resultados seria que as AgNP são internalizadas por outras vias compensatórias, que favoreceriam

a seu o metabolismo. Estudos demonstram que as nanopartículas de prata podem ser metabolizadas

e conjugar com sulfetos (H2S, HS-) e proteínas, assim tornando-as, de certa forma, mais favoráveis

para sua eliminação e/ou menos citotóxicas para bactérias e células mamárias (CHOI et al., 2009;

LEVARD et al., 2013; LIU; PENNELL; HURT, 2011; VON GOETZ; BACHLER;

HUNGERBÜHLER, 2013). Entretanto, esta teoria é apenas sugestiva para a ocorrência deste

efeito, que futuramente deverá ser mais estudado através da avaliação do tráfego intracelular das

AgNP biossintéticas.

49

Figura 21 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de endocitose

mediada por caveolina Metil-beta-ciclodextrina. As células foram tratadas com 25 µM de AgNP durante um período

de 6h e um grupo foi incubado a 37 °C. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. Foi considerado como

100% as células que foram isentas de tratamento com as AgNP e inibidor de endocitose. Cada valor representa a média

± S.D. de três experiências independentes (n = 4). *p < 0,05 AgNP Vs AgNP + MβCD. Análise estatística por ANOVA

seguida por teste de Tukey.

Figura 22 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de endocitose

mediada por caveolina Filipina. As células foram tratadas com 25 µM de AgNP durante um período de 6h e um grupo

foi incubado a 37 °C. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. Foi considerado como 100% as células

que foram isentas de tratamento com as AgNP e inibidor de endocitose. Cada valor representa a média ± S.D. de três

experiências independentes (n = 4). *p < 0,05 AgNP vs AgNP + Filipina. Análise estatística por ANOVA seguida por

teste de Tukey.

50

4.10 O papel da autofagia na citotoxicidade causada pelas AgNP

A autofagia pode ser induzida por nanopartículas em diversas linhagens celulares (EIDI et

al., 2012; STERN; ADISESHAIAH; CRIST, 2012), partindo desse princípio resolvemos

investigar se a autofagia é desencadeada em macrófagos quando submetidos ao tratamento com as

AgNP biossintéticas. Para este estudo utilizamos a Cloroquina (CLQ), agente lisotrópico que evita

a acidificação endossomal (SMIT et al., 1987). O acúmulo da CLQ no interior de compartimentos

ácidos da célula, incluindo os endossomos tardios e lisossomos, resulta na alteração do pH

intraluminal e leva a uma inibição de enzimas lisossomais que necessitam de um pH ácido para o

seu funcionamento. Como consequência, a fusão de endossomos e lisossomos fica impossibilitada.

Sendo assim, a CLQ funciona como um inibidor do processo autofágico, pois a inibição da

acidificação dos lisossomos e o impedimento da sua fusão com o autofagossomo são passos

indispensáveis para a degradação de substratos autofágicos (EGGER et al., 2013; POOLE;

OHKUMA, 1981; YOON et al., 2010).

Com base nessas informações, avaliamos a citotoxicidade das AgNP na presença de CLQ,

na qual as concentrações testadas foram 12,5 μM, 25 μM e 50 μM. Nenhuma das concentrações

de CLQ apresentou efeitos citotóxicos significativos em macrófagos peritoneais (fig. 23).

Contudo, o tratamento com AgNP em presença de CLQ apresentou um perfil mais citotóxico,

sendo significativamente potencializado quando associados à maior concentração de CLQ

(*p<0,05 - 50 μM, 15,6% ±7,8%).

Esse resultado indica que as AgNP levam os macrófagos a uma situação de estresse celular,

na qual teria estimulado o processo de autofagia. Além disso, o aumento na citotoxicidade

observado no pré-tratamento com CLQ sugere que o fluxo autofágico estaria sendo utilizado pelas

51

células para a metabolização e possivelmente a neutralização do efeito citotóxico das AgNP

biossintéticas.

Figura 23 – Estudo da autofagia na avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais. As células

foram tratadas com o inibidor de autofagia Cloroquina e AgNP durante um período de 6h e um grupo foi incubado a

37 °C. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. Foi considerado como 100% as células que foram

isentas de tratamento com as AgNP e inibidor de endocitose. Cada valor representa a média ± S.D. de três experiências

independentes (n = 4). *p < 0,05 AgNP vs AgNP + CLQ. Análise estatística por ANOVA seguida por teste de Tukey.

Os resultados obtidos através da utilização do inibidor CLQ deixa claro que o ambiente ácido

de vesículas intracelulares (endossomos tardios e lisossomos) tem papel fundamental na

metabolização das AgNP, possivelmente essa análise se estenda para o processo autofágico.

Entretanto, essa conclusão ainda precisa ser confirmada através de mais dados moleculares, como

a quantificação da proteína p62 e a conversão da proteína LC3-I em LC3-II presentes no processo

autofágico. Além disso, para a complementaridade de dados, utilizamos a técnica de MET para

observar estruturas relacionadas à autofagia, entretanto os dados estão apresentados na forma de

ANEXO 1, pois ainda não são conclusivos.

52

5 CONCLUSÃO

A partir dos dados apresentados neste trabalho, concluímos que:

Macrófagos intraperitoneais tratados com AgNP biossintéticas apresentam uma

citotoxicidade concentração- e tempo-dependentes.

As AgNP biossintéticas são capazes de promover alterações na integridade da membrana

de macrófagos a partir de 3 h de tratamento.

A citotoxicidade das AgNP biossintéticas está diretamente relacionada com o estresse

oxidativo, fato este evidenciado através da quantificação dos níveis de ROS e do ensaio de

citotoxicidade frente ao pré-tratamento com N-Acetilcisteina, onde observou-se a reversão

total da morte celular causada pelas AgNP.

O efeito citotóxico desencadeado pelas AgNP biossintéticas é dependente da via pela qual

as partículas são endocitadas pelas células. A inibição da fagocitose e endocitose mediada

por caveolina levou a uma redução do efeito citotóxico das nanopartículas em macrófagos

peritoneais.

Possivelmente o tratamento de macrófagos intraperitoneais com AgNP biossintéticas

estimula o fluxo autofágico, além disso, esse processo parece estar envolvido na

metabolização das nanopartículas.

Desta forma concluímos que as AgNP biossintéticas apresentam um perfil citotóxico similar

aos descritos em literatura com nanopartículas obtidas por métodos de síntese convencionais

(químicas). Entretanto, ainda é necessária cautela e mais estudos para a aplicação dessas

nanopartículas em seres vivos.

53

Figura 24 –Citotoxicidade e processamento celular de nanopartículas biossintéticas de prata em macrófagos

peritoneais. Citotoxicidade: 1- Internalização das AgNP por endocitose mediada por caveolina, na qual a inibição

desta via de endocitose proporcionou o aumento da viabilidade celular; 2- Internalização das AgNP por fagocitose, na

qual a inibição desta via de endocitose proporcionou o aumento da viabilidade celular; 3- Danos à membrana celular

através da produção e ROS. Processamento das AgNP: 4-Possível estímulo do fluxo autofágico pela indução das

AgNP ou pela decorrência de eventos citotóxicos causados pelas nanopartículas.

54

6 PERPECTIVAS

Com os resultados iniciais dos mecanismos moleculares envolvidos na citotoxicidade das

AgNP biossintéticas em macrófagos peritoneais, propomos dar continuidade nos seguintes

assuntos para o encerramento deste trabalho:

i. Estresse Oxidativo: Avaliar a atividade mitocondrial para determinar se a produção de ROS

está envolvida com danos mitocondriais em macrófagos induzidos pelas AgNP

biossintéticas. Além disso, avaliar a peroxidação de lipídios para determinar se os danos em

membrana são decorrentes do estresse oxidativo.

ii. Endocitose: Avaliar a toxicidade das AgNP utilizando outros inibidores de endocitose

mediada por clatrina e macropinocitose, para confirmar se estas vias não influenciam na

citotoxicidade das AgNP. Utilizar combinações entre inibidores de endocitose para

determinar reduções ainda maiores da citotoxicidade, como por exemplo inibidores de

fagocitose e caveolina juntos.

iii. Autofagia: Quantificar as proteínas envolvidas no processo autofágico, como por exemplo a

p62 e a conversão da LC3-I em LC3-II, através de técnicas como Western Blotting e

Microscopia Confocal;

iv. Avaliação da resposta imune inata dos níveis de expressão de RNAm de citocinas pró ou

anti-inflamatórias, e depois fazer a confirmação através da quantificação dessas proteínas já

expressas por ELISA.

55

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65

8 ANEXO 1 - Avaliação do fluxo autofágico por MET em macrófagos tratados com as

AgNP

Através da utilização da técnica de MET avaliamos o fluxo autofágico em macrófagos

peritoneais tratados com as AgNP, onde foi possível visualizar nas micrografias o aumento de

vesículas intracelulares de diferentes tamanhos nos macrófagos tratados com as nanopartículas

(fig. 25 C e D) em relação ao controle não tratado (Fig 25 A e B). Além disso, podemos visualizar

estruturas sugestivas para a presença de autofagossomo (AF) e autofagolisossomo (AL) em

macrófagos tratados com as AgNP (fig. 25 D – AF e AL), sendo fenômenos sugestivos para

autofagia. Esses resultados sugestivos para a indução do fluxo autofágico, que futuramente poderia

ser confirmado através quantificação da proteína p62 e a conversão da proteína LC3-I em LC3-II

presentes no processo autofágico.

66

Figura 25 – Indução da formação de vesículas típicas de autofagia por AgNP. A/B - Controle; C/D - tratamento de

1h com 25 µM de AgNP em macrófagos peritoneais. AF - Autofagossomo; AL - Autofagolisossomo. A As imagens

foram obtidas através de microscopia eletrônica de transmissão (MET), na qual A foi obtida em aumento de 2900x

(barra de escala 2 µm), C obtida em aumento de 1900x (barra de escala 5 µm) e B/D foram obtidas em aumento de

4800x (barra de escala 1 µm).

67

9 ANEXO 2 - Avaliação in vivo da resposta imune inata em camundongos tratados com

as AgNP

Além dos efeitos citotóxicos demostrados pelas AgNP, procuramos avaliar como o sistema

imune reage à presença dessas partículas. Para isso, investigamos os níveis de expressão de

citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias quando camundongos foram submetidos ao

tratamento com as AgNP. Sendo assim, diante dos resultados obtidos nos testes de viabilidade

celular, optamos por administrar três concentrações próximas ao IC 50 (fig. 8) que pudessem

promover alteração na resposta imune de camundongos C57BL/6, a saber 10 µM (7 µg/Kg), 30

µM (21 µg/Kg) e 50 µM (35 µg/Kg). Através do estudo feito sobre a expressão de RNAm de

citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-12, TNFα) e anti-inflamatória (IL-10) por RT-PCR, a fig. 26

ilustra que não foram encontrados níveis de expressão significativamente relevantes (*p<0,05) de

RNAm de citocinas (IL-6, IL-12, IL-10, TNFα).

68

Figura 26 – Avaliação in vivo da expressão de RNAm de citocinas pró e anti-inflamatórias em macrófagos extraídos

de camundongos tratados com AgNP. Este estudo foi feito a partir de 24 horas após a administração das AgNP, no

qual os macrófagos foram extraídos e a expressão de citocinas quantificadas por RT PCR. As AgNP (10 µM, 30 µM

e 50 µM) foram administradas via intraperitoneal em camundongos C57BL/6 após 48 horas de aplicação do

Tioglicolato 4%. No grupo controle foi administrado solução salina 0,9%. Os dados são apresentados como médias ±

erro padrão da média para n = 6 e a estatisticamente diferença significativa indicada por * (p <0,05). Não foram

obtidos dados estatisticamente significativos (Anova – Tukey)

69

10 ANEXO 3 - Congresso Internacional

XII International Conference on Nanostructured Materials (NANO 2014)

July 13-18, 2014 Moscow, Russia

Biogenic Silver Nanoparticles as Potential Antitumor Against Prostate Cancer

1Nelson Duran, 2Luiz AB. Ferreira, 3Piscyla D. Marcato, 2Patrick V. Garcia, 2Wagner J. Favaro, 4Marcelo Bispo de Jesus

1 Institute of Chemistry, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, Brazil, IQ-UNICAMP-SP, Brazil 2 Depart. Struct. Funct. Biol. UNICAMP-SP, Brazil., IB-UNICAMP, SP, Brazil

3 FCF-USP-Riberão Preto, Brazil, USP-RP-SP, Brazil 4 Department of Biochemistry, IB-UNICAMP, SP, Brazil

duran@iqm.unicamp.br

Even after years of research and development, prostate cancer still is a public health burden. Mainly in advanced stages, when chemotherapy hardly extend life expectancy. Therefore, we evaluated the biogenic silver nanoparticles (AgNP) as a potential antitumor against prostate cancer. Prostate cancer was induced in 10 Fischer 344 male rats aged 6 to 8 weeks, injecting in capsule prostatic ventral lobe 0.2 mL dose (1.5 mg/kg) N-methyl-N-nitrosourea (MNU), dissolved in 0.3 ml sodium citrate (1 M, pH 6.0) every 15 days, with 2 doses. One week after the last dose of MNU, animals received subcutaneous injections of testosterone cypionate 5 mg/kg twice a week for 120 days. After chemical induction of prostatic lesions, the animals were divided into 4 groups: control group (four rats) and three groups (two rats per group) treated with AgNP (15, 30, 70 µM). The treatment was administered intraperitoneally once weekly for five weeks. In the control group, the AgNP was replaced by 0.9% saline. In control group we found macroscopic tumor in both lobes of the prostate, bladder and tumor adhered to the pelvic floor, in addition to metastatic tumor nodules. In the group treated with AgNP 15 µM we found macroscopic tumor in both lobes of the prostate, non-adherent and tumor metastatic to the bladder, kidney, liver, and lung. In the group treated with AgNP 35 µM, the animals showed atrophic tumor decreased in the other groups, no nodules and unattached. Finally, in the group treated with AgNP 70 µM we found macroscopic tumor nodules present and not adhered. Thus, although these are preliminary results, biogenic silver nanoparticles are a promising candidate for treatment of prostate cancer in vivo.

Supported by FAPESP numbers: 2012/11002-1; 2012/16880-7; 2012/01038-9 CAPES, INOMAT (MCTI/CNPq), NanoBioss (MCTI) and Brazilian Network on Nanotoxicology (MCTI/CNPq).

Section 8: Biological and Biomedical Nanomaterials (Poster)

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11 ANEXO 4 - Artigo de Revisão

Acta Farmacêutica Portuguesa

2014, vol. 3, n. 2, pp. 149-166

Endocitose e tráfego intracelular de nanomateriais

Endocytosis and intracellular trafficking of nanomaterials

Ferreira L.A.B.1, Radaic A. 1, Pugliese G.O. 1, Valentini M.B. 1, Oliveira M.R. 1, Jesus Correio M.B.1

RESUMO

Os avanços recentes da nanotecnologia têm aumentado a utilização de nanomateriais e nanodispositivos para diagnose,

terapias e outros fins tecnológicos. O conhecimento da interação entre nanomateriais e meios biológicos permite a

descoberta de aplicações mais racionais, podendo ajudar a entender e antever seus efeitos adversos e citotóxicos. A

endocitose é um processo biológico dependente de energia que está envolvida na internalização de nanopartículas pelas

células, e depende de eventos orquestrados que requerem o funcionamento coordenado dos lipídios e proteínas da membrana

plasmática. Estudos que visam investigar em detalhes a endocitose e o tráfego intracelular de nanopartículas são

indispensáveis para compreensão de mecanismos celulares ainda inexplorados e permitem projetar novas funções, que

consequentemente auxiliam na escolha de aplicações biomédicas da nanotecnologia. Nesse contexto, esta revisão visa

conceituar as principais vias de endocitose utilizadas no estudo da internalização de nanomateriais em células eucarióticas.

Além disso, alguns destinos intracelulares de nanomateriais serão discutidos para auxiliar nos estudos do processamento

celular de nanopartículas e desenvolvimento de novas ferramentas terapêuticas. Palavras-chave: Endocitose, nanopartícula, tráfego intracelular

ABSTRACT

Recent advances in nanotechnology have increased the use of nanomaterials and nanodevices for diagnostic, therapeutic

and other technological applications. The knowledge about the interaction between nanomaterials and biological media

allows the development of more rational applications, as well understand and anticipate adverse and toxic effects resulting

from this interaction. Endocytosis is an energy-dependent biological process responsible for internalization of nanoparticles,

which depends on orchestrated events that require lipids and plasma membrane proteins functioning. Studies that aim to

investigate in detail the endocytosis and intracellular trafficking of nanoparticles are essential for understanding cellular

mechanisms, which in turn help to select its biomedical applications. In this context, this review aims to conceptualize the

main routes of endocytosis used to study the internalization of nanomaterials in eukaryotic cells. In addition, we discuss

some intracellular trafficking of nanomaterials to aid in studies of the cellular processing and development of new

therapeutic tools.

Keywords: endocytosis nanoparticle, intracellular trafficking

ARTIGO ORIGINAL | ORIGINAL ARTICLE

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12 ANEXO 5 – Comitê de Ética