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Kit iQ-Check

Listeria monocytogenes II Catálogo #: 357-8124

Guia do Usuário

Teste para detecção por PCR em tempo real de Listeria

monocytogenes em amostras de alimento e ambiente.

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ÍNDICE

I. Introdução

II. Tecnologia iQ-Check Listeria monocytogenes II

III. Componentes do Kit

IV. Vida útil e armazenamento

V. Material necessário, mas não fornecido

VI. Precauções e recomendações

VII. Protocolo

A. Enriquecimento de amostra

B. Extração de DNA

C. PCR em tempo real

D. Análise de dados

VIII. Confirmação de resultados positivos

IX. Confirmação de colônias únicas usando iQ-Check

X. Realizações e validações de teste

XI. Referências

ANEXO A: Guia de Cálculo de Mistura de PCR

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I. INTRODUÇÃO

Frequentemente, os métodos bacteriológicos convencionais são longos e tediosos. Em

comparação, o IQ-Check Listeria monocytogenes II é um teste qualitativo simples e rápido, que

permite a detecção de sequências de DNA específicas, exclusivas para Listeria monocytogenes

encontradas em amostras ambientais e de produtos alimentícios. Usando a reação em cadeia de

polimerase (PCR) em tempo real, sequências específicas de DNA de Listeria monocytogenes são

amplificadas e detectadas de forma simultânea por meio de sondas fluorescentes. Até 94 amostras

podem ser processadas, com risco de contaminação minimizado e um procedimento fácil de usar.

O uso deste teste possibilita a obtenção de resultados dentro de poucas horas após o pré -

enriquecimento da amostra. O usuários destinados ao uso deste kit são profissionais treinados de

laboratório que realizam testes para detectar o Listeria monocytogenes

II. A TECNOLOGIA iQ-Check Listeria monocytogenes II

O kIt IQ-Check Listeria monocytogenes II é um teste baseado na amplificação do gene e detecção

por PCR em tempo real. Reagentes de PCR prontos para uso contêm iniciadores de DNA e uma

sonda específica para Listeria monocytogenes, bem como DNA polimerase e nucleotídeos. A detecção e análise de dados são otimizadas para uso com um instrumento de PCR em tempo real

Bio-Rad, tais como os sistemas Chromo4™, MiniOpticon™ ou CFX96™.

PCR é uma técnica poderosa usada para gerar muitas cópias do DNA-alvo. Durante a reação de PCR,

diversos ciclos de aquecimento e resfriamento possibilitam a desnaturação do DNA, por calor,

seguida da ligação dos iniciadores à região-alvo. A DNA polimerase usa, então, estes iniciadores e os deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs) para ampliar o DNA, criando cópias do DNA-alvo. Estas

cópias são chamadas de amplicons (fragmentos amplificados).

Na PCR em tempo real, sondas específicas são usadas para detectar o DNA durante a amplificação,

ao hibridizar com os amplicons. Estas sondas são ligadas a um fluoróforo que fluoresce apenas quando hibridizado à sequência-alvo; nos kits iQ-Check Listeria monocytogenes, FAM é o fluoróforo

ligado à sonda hibridizando à sequência específica de DNA de Listeria monocytogenes Na

ausência do DNA-alvo, nenhuma fluorescência será detectada, e a amostra determinada será

negativa. À medida que aumenta a quantidade de amplicons com cada rodada de amplificação,

aumenta também a intensidade da fluorescência. Durante cada ciclo de PCR, na etapa de

anelamento, o sistema de PCR em tempo real mede esta fluorescência, enquanto o software

associado marca a intensidade da fluorescência versus o número de ciclos. Este método

possibilita uma determinação simples da presença de Listeria monocytogenes em uma amostra.

Para monitorar uma amplificação de DNA bem sucedida em cada tubo de reação, um “controle interno” de

DNA sintético é incluído na mistura de reação. Este controle é amplificado com uma sonda específica ao

mesmo tempo que a sequência de DNA-alvo de Listeria monocytogenes, e detectado por um segundo

fluoróforo.

Este teste possibilita a detecção de Listeria monocytogenes em amostras de ambiente e produtos

alimentícios previamente enriquecidos por cultura (23h ± 1h, a 30°C) em caldo Listeria Special Broth

(LSB) ou (25h ± 1h a 30°C) em caldo half fraser. Isso inclui as 4 principais etapas a seguir:

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III. COMPONENTES DO KIT

ID de Referência Reagente Quantidade Fornecida

A Reagente de lise 1 frasco (20 ml)

B Sondas fluorescentes 1 tubo (0.55 ml) C Mistura de amplificação 1 tubo (4.4 ml)

D Controle negativo de PCR 1 tubo (0.5 ml)

E Controle positivo de PCR 1 tubo (0.25 ml)

F Microesferas de lise 1 frasco (17.6 g)

O Kit IQ-Check Listeria monocytogenes II contém quantidade suficiente de reagentes para 96 testes.

IV. VIDA ÚTIL E ARMAZENAMENTO

Assim que recebido, o kit deve ser armazenado entre +2°C e +8°C. Reagentes armazenados entre

+2°C e +8°C podem ser usados até a data de validade indicada no tubo de reagente. A vida útil do

reagente de lise é de 6 meses, assim que misturado com as microesferas (beads) de lise.

V. MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO

Equipamentos:

• Sistema de PCR em tempo real Bio-Rad, ex. Sistemas Chromo4™ ou MiniOpticon™.

Veja o guia de usuário de PCR em tempo real para os kits iQ-Check (Chromo4™/MiniOpticon™,

#: 93269, Rev. C - iQ™5, #: 93270, Rev. A - iCycler iQ™, #: 93271, Rev.

A, CFX96™/MiniOpticon™, #: 93893b V1.0 Rev A).

• Mastigador Stomacher® ou equivalente para homogeneizar as amostras de teste.

• Incubadora, capaz de manter 30°C ± 2°C.

• Termobloco seco, para tubos de 1,5 ml (100°C ± 5°C) e Desruptor de Célula, tal como “Desruptor

Genie”* (Scientific Industries), Bio-Rad cat #: 359-1456 ou agitador-incubador para placas de poço

profundo, tal como “Thermomixer” (Eppendorf).

• Centrifuga de bancada (máximo 10,000-12,000 g, para tubos de 1,5 ml).

• Aparelho agitador de tubos vórtex.

• Placa de agitação magnética.

• Micropipetas de 20 μl, 200 μl e 1000 μl.

• Pipetas Combitip ou pipetadores de repetição equivalentes.

* Entre em contato com a Bio-Rad para informação detalhada sobre os instrumentos recomendados

por nosso departamento técnico.

Nota: Recomendamos o uso de uma fonte de alimentação universal (UPS) com o termociclador.

Suprimentos

• Para placas de PCR, tubos, selos e tampas de vedação, veja o guia de usuário do sistema de PCR

ENRIQUECIMENTO EXTRAÇÃO DE DNA PCR EM TEMPO REAL ANÁLISE & INTERPRETAÇÃO DE DADOS

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em tempo real para os kits iQ-Check.

• Meio de pré-enriquecimento: caldo half fraser * (Ex. Bio-Rad cat.#: 356-4604 para 500 g; 355-5797

para frascos 225 ml x 6; 355-5788 para bolsas 2.3 L x 5).

• Meio de pré-enriquecimento: Caldo LSB (Bio-Rad cat. #: 355-5703 para frascos 225 ml x 6, 356-

4703 para 500 g).

• Meio de pré-enriquecimento (opcional): Caldo TCS (Triptona-caseína-soja) (Ex.. Bio-Rad cat.#:

355-3454 para tubos 10 ml x 25).

• Ágar RAPID’L.mono*, (Bio-Rad cat. #: 356-3694 para placas 90 mm x 20; 355-5294 para 190 ml

mais suplemento).

• Bolsa Stomacher com filtro incorporado.

• Pipetas de 1 ml e 10 ml.

• Ponteiras com filtro, estéreis para micropipetas de 20 μl, 200 μl e 1000 μl.

• Tubos estéreis de tampa de rosca, cônicos, de 1,5 ml (Ex. Bio-Rad cat.#: 224-0110).

• Placa de poço profundo 1 ml, Bio-Rad cat. #: 359-0132.

• Filme pré-perfurado de vedação, tal como “X-Pierce™ Sealing Films”, (Excell Scientific).

• Ponteiras para pipetas Combitip ou pipetadores de repetição equivalente, estéreis, pacote

individual.

• Tubos de ensaio estéreis de 2 ml e 5 ml.

• Luvas sem pó.

• Água destilada estéril.

• Alvejante 5%.

• Agente descontaminante, tal como DNA AWAY® ou RNase AWAY®.

* pode ser usado fora do escopo de validação de AOAC-RI.

VI. PRECAUÇÕES E RECOMENDAÇÕES PARA OS MELHORES RESULTADOS

• Este teste deve ser realizado por pessoal treinado adequadamente.

• Amostras de alimento e culturas de enriquecimento devem ser manejadas como material

potencialmente infeccioso e eliminadas de acordo com as regras e regulamentações locais.

• Mulheres grávidas, crianças, idosos e indivíduos com problemas imunológicos não devem

manejar Listeria monocytogenes devido à elevada taxa de infecção e fatalidade associada a

esses grupos.

• Todo material potencialmente infeccioso devem ser autoclavado antes do descarte.

• A qualidade dos resultados depende da conformidade estrita com a Boa Prática Laboratorial,

principalmente em relação à PCR:

- Os equipamento de laboratório (pipetas, tubos, etc.) não devem circular de uma estação de

trabalho para outra.

- É fundamental o uso de um controle positivo e um controle negativo para cada série de

reações de amplificação.

- Não use reagente após a data de validade.

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- Use o agitador vórtex para os reagentes do kit antes de usá-los para garantir a

homogeneidade.

- Verifique periodicamente a exatidão e precisão das pipetas, bem como o funcionamento

correto dos instrumentos.

- Troque as luvas com frequência, principalmente se suspeitar que estejam

contaminadas.

- Limpe os espaços de trabalho com, pelo menos, alvejante 5%, e agente

descontaminante como o DNA AWAY® periodicamente.

- Use luvas sem pó e evite impressões digitais no selo de vedação óptica. Não escreva nas tampas dos tubos. Ambos irão interferir na aquisição de dados.

• Aconselha-se veemente seguir os requisitos gerais descritos na norma EN ISO 22174:2005

“Microbiologia de alimento e ração animal – Reação em cadeia de polimerase (PCR) para detecção

de patógenos em alimento - Requisitos gerais e definições”.

VII. PROTOCOLO

Recomenda-se veemente a leitura de todo o protocolo antes de iniciar o teste.

A tabela a seguir delineia os diferentes protocolos que podem ser usados, dependendo da aplicação e do

escopo da validação:

Protocolo Enriquecimento Caldo Certificação Escopo

Standard 25h ± 1h, 30°C Half Fraser VALIDAÇÃO NF Todas as amostras de ambiente e produtos

alimentícios

Standard 23h ± 1h, 30°C LSB VALIDAÇÃO NF Todas as amostras de ambiente e produtos

alimentícios

Easy 25h ± 1h, 30°C LSB VALIDAÇÃO NF Todas as amostras de ambiente e produtos

alimentícios

Easy 23h ± 1h, 30°C,

3h -5h, 30°C

Half Fraser, TCS VALIDAÇÃO NF Amostras de ambiente

Easy 25h ± 1h, 30°C LSB AOAC-RI peito de peru, cachorro-quente, salmão

defumado, e queijo cottage

A. Enriquecimento de Amostra

O meio de enriquecimento deve estar na temperatura adequada de incubação antes do uso.

Protocolo Standard

- Homogenize 25 g de amostra em 225 ml de caldo LSB pré-aquecido ou caldo half fraser, em bolsa

de stomacher com filtro incorporado.

- Incube sem agitar por 25 horas ± 1 hora em half fraser ou 23 horas ± 1 hora em LSB*, a 30°

C.

- Colete 1,5 ml de amostra decantada, enriquecida usando uma pipeta descartável de 1 ml, em um

tubo cônico de 1,5 ml com tampa de rosca. Veja a Extração de DNA abaixo.

Protocolo Easy, apenas para uso com LSB (todas as amostras)

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- Homogenize 25 g de amostra em 225 ml de caldo LSB pré-aquecido, em bolsa de stomacher com

filtro incorporado.

- Incube sem agitar por 25 horas ± 1 hora em LSB*, a 30° C.

- Colete 100 μl de amostra decantada, enriquecida em um tubo cônico de 1,5 ml com tampa de rosca,

contendo o reagente de lise. Veja a Extração de DNA abaixo.

* No método certificado pela VALIDAÇÃO NF, também é possível realizar o teste iQ-Check a partir do

LSB enriquecido que está armazenado a 2°C - 8°C por até 72 horas.

Protocolo Easy para amostras de ambiente apenas

- Homogenize 25 g de amostra em 225 ml de caldo half fraser pré-aquecido, em bolsa de stomacher

com filtro incorporado.

- Incube sem agitar por 23 horas ± 1 hora em half fraser, a 30° C.

- Misture a suspensão, colete 1ml e adicione-o a 10 ml de caldo TCS (pré-aquecido a 30°C).

- Incube sem agitar por 3h a 5h a 30°C.

- Colete 100 μl de amostra decantada, enriquecida em um tubo cônico de 1,5 ml com tampa de rosca,

ou em um poço de uma placa de poço profundo, contendo o reagente de lise. Veja o “protocolo Easy”

de Extração de DNA abaixo.

Nota: Não agite a suspensão antes de coletar a amostra, e evite coletar grandes fragementos de resto

de alimento. Para amostras de alimento com um sobrenadante gorduroso, colete a amostra apenas

abaixo desta camada.

B. Extração de DNA

antes de iniciar o teste:

Pré-aqueça o termobloco Ligue o termobloco e deixe-o em 95°C - 100°C

Prepare o reagente de lise

Reconstitua o reagente de lise final como a seguir:

• Coloque todo o conteúdo do reagente F (beads de lise) no reagente A

(reagente de lise) com cuidado.• O reagente de lise misturado com as beads de lise (reagentes A + F) tem uma

vida útil de 6 meses, quando armazenado a 4°C.

Protocolo Standard

1 - Centrifugue a amostra enriquecida de 1,5 ml coletada em 10,000-12,000 g por 5 minutos. Descarte todo o

sobrenadante.

2 - Adicione 250 μl do reagente de lise final (reagentes A + F) à pellet.

Nota: Primeiro, agite levemente o reagente de lise com a mão para ressuspender as microesferas (beads). Pipete o

reagente de lise enquanto está agitando em velocidade média em uma placa de agitação magnética, para mantê-lo em

suspensão e coletar as microesferas. Use os produtos de consumo com uma ponteira ampla o suficiente para

possibilitar a pipetagem do reagente de lise homogeneizado.

3 - Ressuspenda o pellet pipetando o reagente para cima e para baixo no tubo.

4 - Coloque o tube no Desruptor de Célula por 3 min ± 1min.

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5 - Coloque o tubo no termobloco a 95°C - 100°C por 15 minutos.

6 - Agite no agitador de tubos vórtex em velocidade elevada.

7 - Centrifugue a 10,000-12,000 g por 5 minutos.

Protocolo Easy

1 - Separe uma alíquota de 100 μl do reagente de lise homogeneizado (reagentes A + F) para os tubos de

tampa de rosca de 1,5 ml ou em uma placa de Poço profundo que será usada para a extração de DNA.

Nota: Primeiro, agite levemente o reagente de lise com a mão para ressuspender a resina. Pipete o reagente de

lise enquanto está agitando em velocidade média em uma placa de agitação magnética, para mantê-lo em

suspensão e coletar as microesferas. Use os produtos de consumo com uma ponteira ampla o suficiente para

possibilitar a pipetagem do reagente de lise homogeneizado.

2 - Adicione 100 μl de amostra enriquecida. Misture a solução ao pipetar para cima e para baixo no tubo. Vede a

placa de poço profundo com o filme de vedação pré-perfurado.

3 - Coloque o tubo no Desruptor de Célula por 3 min ± 1min (tubos apenas).

4 - Coloque o tubo no termobloco a 95°C - 100°C por 15 minutos ou a placa de poço profundo no agitador-

incubador a 1,300 rpm, a 95°C - 100°C por 15 a 20 minutos.

5 - Apenas para tubos, agite no agitador vórtex em velocidade alta, por alguns segundos, então, centrifugue a

10,000-12,000 g por 2 minutos ao menos. Não é necessária a centrifugação para placas de poço profundo.

Para ambos os protocolos de extração:

• Abra os tubos com cuidado para evitar qualquer contaminação cruzada possível.

• Resfrie a placa de poço profundo antes de pipetar diretamente pelo filme de vedação pré-perfurado.

• Para a reação de amplificação, use 5 μl do sobrenadante obtido, contendo o extrato de DNA* (não use o

vórtex antes de coletar 5 μl de amostra).

• O sobrenadante remanescente e/ou sua diluição podem ser armazenados por até 1 ano a -20°C. Antes de reutilizar o sobrenadante ou sua diluição, sempre deixe-o descongelar, então, centrifugue o tubo a 10,000- 12,000 g por 5 minutos.

*Nesta etapa:

Para amostras que apresentam inibição em um teste anterior, realize uma diluição 1/10, em água

estéril destilada usando10 μl de extrato de DNA. Então, use 5 μl da diluição adequada para

amplificação.

Se decidir parar o procedimento temporariamente, este é o ponto de parada recomendado.

C. PCR em tempo real

1. Configuração de instrumento e softwarePara a configuração de instrumento e software, siga as instruções no guia de usuário do sistema de

PCR em tempo real para os kits iQ-Check.

2. Preparação de mistura de PCR

2.1 Prepare uma mistura de PCR contendo a solução de amplificação (reagente C) e as sondas

fluorescentes (reagente B) de acordo com o guia de cálculo de mistura de PCR encontrado no

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Anexo A. Para encontrar os volumes corretos para uso, adicione o número total de amostras e

controles a ser analisado, e encontre os volumes correspondentes na tabela. Ao menos um

controle positivo e um negativo devem ser incluídos em cada corrida de PCR.

2.2 Após a preparação, a mistura de PCR (reagente B + C) deve ser usada imediatamente,

caso contrário é estável por 1 hora a 4°C

2.3 Pipete 45 μl desta mistura de PCR em cada poço de acordo com a configuração da sua placa.

Adicione 5 μl da amostra ou reagente D (controle negativo) ou reagente E (controle positivo). Vede os poços com o filme óptico ou tampas ópticas.

É importante evitar a formação de bolhas no fundo dos poços, pipete com cuidado. Para eliminar

as bolhas, centrifugue a placa de PCR vedada ou as tiras de PCR (giro rápido).

2.4 Coloque a placa ou tiras no termociclador. Certifique-se em colocar a placa corretamente:

Poço A1 no canto esquerdo superior.

Feche o módulo de reação.

3. Início de PCRPara iniciar a corrida de PCR, siga as instruções no guia de usuário do sistema de PCR em tempo real

para os kits iQ-Check.

D. Análise de Dados

Os dados podem ser analisados diretamente no final da corrida de PCR ou mais tarde ao abrir o

arquivo de dados armazenados. Siga as instruções no guia de usuário do sistema de PCR em tempo

real correspondente para os kits iQ-Check, para abrir os arquivos de dados e configurar os parâmetros

de análise de dados.

1. Interpretação de Resultados

Uma vez que os parâmetros de análise de dados foram estabelecidos, os resultados são interpretados

ao analisar os valores Ct de cada amostra (o ciclo no qual a curva de amplificação cruza o limiar).

Também é possível usar o software iQ-Check Analysis (cat. #: 359-3135) para uma interpretação

automatizada e geração de relatório de todos os dados (veja o guia de usuário do iQ-Check Analysis).

Uma análise automatizada completa está disponível com o Software Opticon Monitor, para os sistemas

Chromo4™ e MiniOpticon™ (veja o Guia de Usuário do Chromo4™ e MiniOpticon™ para os kits iQ-

Check, #: 93269, Rev. C). O CFX Manager™ IDE possibilita uma análise automatizada completa para o

CFX 96™ e o Mini Opticon™, #: 93893b V1.0 Rev A.

1.1 Controles:

Antes de interpretar os resultados da amostra, é necessário verificar os controles positivos e negativos.

Para que o experimento seja válido, os controles devem ter os seguintes resultados, conforme

sumarizado na tabela abaixo, caso contrário, a reação de PCR precisa ser repetida.

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Listeria monocytogenes

Detecção (FAM) Detecção de Controle Interno

Controle Negativo Ct = N/A* 28 ≤ Ct ≤ 40

Controle Positivo 26 ≤ Ct ≤ 36 Não significativo

* O software indica um valor Ct de N/A (não aplicável) quando a fluorescência de uma amostra não se

eleva, de forma significativa, acima do ruído de fundo, e portanto, não cruza o limiar.

1.2 Amostras:

Uma amostra positiva para Listeria monocytogenes deve ter um valor Ct ≥ 10 para o fluoróforo de

FAM.

Se o valor Ct estiver abaixo de 10, verifique se como dados brutos, a curva é uma curva de

amplificação regular (com uma linha base reta, seguida de um rápido aumento da fluorescência, e

então, uma diminuição). Se a curva parecer correta, pode ser considerada uma amostra positiva para

Listeria monocytogenes

Se não houver nenhum valor Ct (Cq=N/A) para FAM, ou a curva não for uma curva típica de

amplificação, o controle interno para aquela amostra deve, então, ser analisado:

• Esta amostra é considerada como amostra negativa para Listeria monocytogenes se não houver um

valor Ct em FAM, e o controle interno apresentar um Ct ≥ 28.

• Se o controle interno também não apresentar um valor Ct (Ct = N/A), então, não é possível

interpretar o resultado. Provavelmente, tal resultado indica uma inibição da reação de PCR. A

amostra precisa ser diluída (1/10 em água estéril destilada), e a PCR repetida (veja a seção VII.B.

Extração de DNA).

• Se o valor Ct para o controle interno for < 28, não é possível interpretar o resultado. Verifique se o

limiar foi colocado corretamente, ou se a curva como dados brutos é uma curva de amplificação

regular. Se a curva não apresentar uma forma característica, será necessário repetir o teste de

PCR.

A interpretação dos resultados da amostra é sumarizada na tabela a seguir:

Listeria monocytogenes

Detecção (FAM) Detecção de controle Interno Interpretação

Ct ≥ 10 Não significativo Positivo

Ct = N/A Ct ≥ 28 Negativo

Ct = N/A Ct = N/A Inibição**

** Quando ambos, detecção de controle interno e Listeria monocytogenes, apresentarem um valor Ct = N/A, a amostra deve ser

testada novamente, porém diluída 1/10.

VIII. CONFIRMAÇÃO DE RESULTADOS POSITIVOS

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No âmbito do método certificado por VALIDAÇÃO NF, todos os resultados positivos do iQ-CheckListeria monocytogenes II precisam ser confirmados em uma das três formas:

1 - Usando testes padrão descritos nos métodos normatizados CEN ou ISO de colônias (inc luindo

a etapa de purificação) Para o teste de confirmação, é necessário iniciar a partir do caldo de

enriquecimento.

2 - Usando o RAPID’L.mono. de meio cromogênico. Isole 100 μl do caldo enriquecido (Half Fraser ou

LSB) em RAPID'L.mono.

A presença de colônias características de Listeria monocytogenenes é suficiente para confirmar a

presença de Listeria monocytogenenes

3 - Usar qualquer outro método certificado por VALIDAÇÃO NF baseado em um princípio diferente

daquele usado no teste de PCR para Listeria monocytogenenes II iQ-Check. O protocolo validadodeste segundo método deve ser seguido por completo; a confirmação é realizada a partir do caldo

de enriquecimento, ao usar o Caldo half Fraser.

No caso dos resultados que não estiverem de acordo, entre o iQ-Check Listeria monocytogenes II e

uma das opções de confirmação listadas acima, o laboratório deve seguir as etapas necessárias para

garantir a validade dos resultados.

É possível armazenar o caldo enriquecido a 2°C - 8°C, LSB por até 72 horas e half fraser por até 48

horas, após a incubação a 30°C, antes de realizar as confirmações.

No âmbito do método validado por AOAC-RI, um resultado positivo do iQ-Check Listeria

monocytogenes II é considerado positivo presuntivo e é recomendado ser confirmado de acordocom método padrão USDA MLG (disponível online emhttp://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_8_05.pdf) ou

método padrão FDA BAM (disponível online

athttp://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/Bacteriol

ogicalAnalyt icalManualBAM/ucm071400.htm).

IX. CONFIRMAÇÃO DE COLÔNIAS ÚNICAS USANDO IQ-Check

iQ-Check Listeria monocytogenes II pode também ser usado para confirmar colônias únicasisoladas de Listeria monocytogenes em placas de ágar, tal como RAPID’L.mono.

1. Pegue uma colônia isolada, de uma placa de ágar, seletiva ou não-seletiva, com um palito ou alça

estéril, ou outro consumível adaptado (por ex., ponta da pipeta).

2. Ressuspenda a colônia em 100 μl de sal triptona ou água estéril destilada em um tubo da

microcentrífuga. Homogenize usando um agitador vórtex.

3. Use 5 μl do sobrenadante com 45 μl da mistura de PCR (veja a seção VII.C PCR em tempo real) e

siga o resto do protocolo do iQ-Check Listeria monocytogenes II para a interpretação de dados eresultados.

http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_8_05.pdf)http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/Bacteriol

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X. REALIZAÇÕES E VALIDAÇÕES DE TESTE

O kit iQ-Check Listeria monocytogenes II é específico para a detecção de Listeria monocytogenes. Com

este kit é possível detectar amostra de 1-10 UFC/25 g, de acordo com o enriquecimento recomendado.

VALIDAÇÃO NF

BRD 07/10 – 04/05

MÉTODOS DE ANÁLISE ALTERNATIVOS

PARA AGRONEGÓCIO

http://nf-validation.afnor.org

iQ-Check Listeria monocytogenes II é validado por VALIDAÇÃO NF

como um método alternativo ao método de referência NF EN ISO

11290-1/A1 (2005) para a detecção de Listeria monocytogenes em

todos os produtos para consumo humano e amostras de ambiente. No

escopo de certificação AFNOR, os tamanhos de amostra maiores que

25 g não foram testados. A validação seguiu o protocolo da Norma NF

EN ISO 16140: 2003, e inclui o uso dos sistemas iCycler iQ™,

Chromo4™, iQ™5, MiniOpticon™ e CFX96™.

Os softwares associados são Opticon Monitor (V3.1 e subsequentes),

o software de sistema iCycler iQ™ Optical (V2.0 e subsequentes), o

software de sistema iQ™5 Optical (V1.0 e subsequentes) e o CFX

Manager IDE (V1.0 e subsequentes). Número de certificado: BRD

07/10 – 04/05 Válido até: consulte o certificado disponível no site da

Certificação AFNOR:

Validação AOAC R iQ-Check Listeria monocytogenes II (protocolo Easy protocol) é validado

pelo Instituto de Pesquisa AOAC pelo Programa do Método Testado por

Desempenho para a detecção de Listeria monocytogenes em peito de

peru, cachorro-quente, salmão defumado, e queijo cottage. Um

resultado positivo com iQ-Check deve ser considerado presuntivo e é recomendada sua confirmação pelos métodos de referência padrão

(veja 3, 4 e 5 na seção XI.) Certificado no. 010802.

Validação NordVal iQ-Check Listeria monocytogenes II é validado por NordVal para:

- Enriquecimento em half Fraser seguido do protocolo de lise padrão.

- Enriquecimento em Listeria Specific Broth (LSB)

seguido do protocolo de lise padrão.

- Enriquecimento em Listeria Specific Broth (LSB) seguido de

um protocolo de extração simplificada, não precisando mais da

primeira etapa de centrifugação.

Número de certificado: 037. Válido até: consulte o certificado

disponível no website de NordVal:.

http://www.nmkl.og/NordVal/NordValMetoder.htm

XI. REFERÊNCIAS

1 Mongaud, J, Vicente, M.F., Chonovort, J., Pereira, J.M., Geoffrey, C., Gicquel-Sanzey, B., Baquero, F., Perez-Diaz, J.C.

and Cossart, P. 1988. Expression in Escherichia coli and sequence analysis of the lysteriolysin O determinant of Listeria

monocytogenes. Infection and Immunity, 56, 766-772.

http://nf-validation.afnor.org/http://www.nmkl.og/NordVal/NordValMetoder.htm

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2 Norma ISO 11290-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the

detection and enumeration of Listeria monocytogenes. Part 1: Detection method. 2004.

3 AOAC International. AOAC Official Method 993.12 – Listeria monocytogenes in Milk and Dairy Products –

Selective Enrichment and Isolation Method (Final Action 1996).

4 United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service. Microbiology

Laboratory Guidebook – Chapter 8.05. Isolation and Identification of Listeria monocytogenes from

Red Meat, Poultry, Egg and Environmental Samples (August 1, 2006). Disponível online em

www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_8_05.pdf.

5 - United States Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition.

Bacteriological Analytical Manual - Chapter 10. Listeria monocytogenes (January 2003). Online em

http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-10.html

Nota ao comprador: licença limitada

O uso deste produto é abrangido por uma ou mais das seguintes reivindicações de patentes dos Estados e patente correspondente fora dos

Estados Unidos: 5,079,352, 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155, 5,677,152 (reivindicações 1 a 23 apenas) e 5,773,258 (reivindicações 1 e 6 apenas),

e reivindicações fora dos Estados Unidos correspondentes à Patente dos Estados Unidos No. 4,889,818. A compra deste produto inclui uma

imunidade limitada, não-transferível contra ações judiciais sob as reivindicações de patente anteriores para uso somente desta quantidade de

produto exclusivamente em teste de Alimento, teste de Ambiente, e microbiologia industrial, incluindo o relatório de resultados das atividades por

uma taxa ou outra contraprestação comercial, e também para a pesquisa do próprio comprador. Nenhum direito sob qualquer reivindicação de

patente (tal como as reivindicações do Processo de 5’ Nuclease na Patente dos Estados Unidos Nos 5,210,015 e 5,487,972) é expressamente

veiculado, de forma implícita, ou por impedimento. informação adicional sobre licenças de compra pode ser obtida ao entrar em contato com o

Diretor de Aquisição de Licença, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, EUA.

ANEXO A - Guia de Cálculo de Mistura de PCR

Para encontrar os volumes corretos para uso ao preparar a mistura de PCR, adicione o número total de

amostras e controles a ser analisado, e encontre os volumes correspondentes de reagente B e reagente

C na tabela.

Número total de

amostras &

controles

Reagente B

(μl)

Reagente C

(μL)

Número total de

amostras & controles

Sondas

Reagente B

(μl)

Amplificação

mistura Reagente

C (μL)

1 5 40 49 265 2100

2 11 86 50 270 2200

3 16 130 51 275 2200

4 22 173 52 281 2200

5 27 216 53 286 2300

6 32 259 54 292 2300

7 38 302 55 297 2400

8 43 346 56 302 2400

9 49 389 57 308 2500

10 54 432 58 313 2500

11 59 475 59 319 2500

12 65 518 60 324 2600

13 70 562 61 329 2600

14 76 605 62 335 2700

15 81 648 63 340 2700

16 86 691 64 346 2800

17 92 734 65 351 2800

18 97 778 66 356 2900

19 103 821 67 362 2900

http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_8_05.pdfhttp://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-10.html

14 © Bio-Rad

20 108 864 68 367 2900

21 113 907 69 373 3000

22 119 950 70 378 3000

23 124 994 71 383 3100

24 130 1000 72 389 3100

25 135 1100 73 394 3200

26 140 1100 74 400 3200

27 146 1200 75 405 3200

28 151 1200 76 410 3300

29 157 1300 77 416 3300

30 162 1300 78 421 3400

31 167 1300 79 427 3400

32 173 1400 80 432 3500

33 178 1400 81 437 3500

34 184 1500 82 443 3500

35 189 1500 83 448 3600

36 194 1600 84 454 3600

37 200 1600 85 459 3700

38 205 1600 86 464 3700

39 211 1700 87 470 3800

40 216 1700 88 475 3800

41 221 1800 89 481 3800

42 227 1800 90 486 3900

43 232 1900 91 491 3900

44 238 1900 92 497 4000

45 243 1900 93 502 4000

46 248 2000 94 508 4100

47 254 2000 95 513 4100

48 259 2100 96 518 4100

Nos Estados Unidos, para assistência técnica, ligue para (800) 4BIORAD Selecione a opção 2 para suporte técnico e opção e opção 2

novamente para Food Science Division. Para fazer um pedido, ligue para (800) 4BIORAD e aperte a opção 1 para atendimento ao cliente

Pedidos também podem ser enviados por fax para (800) 879-2289

Bio-Rad Laboratories

2000 Alfred Nobel Drive Hercules

California 94547 - EUA

Ligação Gratuita: 1-(800) 424-6723

Fax: (510) 741-5800

Rev. F - 02/2015

Código: 808464-BR