leandra macedo de araÚjo gomes - bem-vindo · acreditaram na minha vontade de vencer e me apoiaram...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO

LEANDRA MACEDO DE ARAÚJO GOMES

Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Cnidoscolus

quercifolius Pohl (Euphorbiaceae) em roedores

PETROLINA

2014

LEANDRA MACEDO DE ARAÚJO GOMES

Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Cnidoscolus

quercifolius Pohl (Euphorbiaceae) em roedores

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Vale do São Francisco, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais do Semiárido, para obtenção do título de Mestre em Recursos Naturais do Semiárido. Orientador: Prof. Dr. Julianeli Tolentino de Lima Co-orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida

PETROLINA

2014

Gomes, Leandra Macedo de Araújo

G633e

Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Cnidoscolus quercifolius Pohl (EUPHORBIACEAE) em roedores/Leandra Macedo de Araújo Gomes. – Petrolina, 2014.

184f.

Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) - Universidade Federal do Vale do São Francisco, Petrolina, 2014.

Orientador: Prof. Dr. Julianeli Tolentino de Lima.

1. Plantas da Caatinga – Medicina popular. 2. Plantas medicinais – Usos e costumes. 3. Euphorbiaceae - Atividade anti-inflamatória. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.

CDD 615.537

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas SIBI/UNIVASF

Bibliotecário: Lucídio Lopes de Alencar

Dedico este trabalho aos meus pais

Orlandino Macedo Gomes e Marinalva

Macedo de Araújo, ao meu irmão José

Gustavo Macedo de Araújo Gomes,

meus avós, familiares e amigos que

acreditaram na minha vontade de vencer

e me apoiaram em todos os momentos,

sempre cheios de amor para me ofertar.

AGRADECIMENTOS

Externalizar os sentimentos e transformá-los em palavras, não é

uma tarefa fácil, e durante esses dois longos anos de realização do mestrado

serei eternamente grata a todos aqueles que passaram por minha vida e

deixaram um pouquinho de si. Talvez faltem palavras para expressar o quanto

sou grata a cada um que cruzou o meu caminho e que de alguma forma

contribuiu para o meu crescimento pessoal e profissional.

Ao meu orientador Prof. Dr. Julianeli Tolentino de Lima ao qual

tenho respeito e admiração pelo seu caráter e honestidade, eu agradeço por

todo o acolhimento e todas as oportunidades geradas.

Ao meu co-orientador Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva

Almeida pelo qual tenho imenso carinho e afeição, agradeço de todo coração

por ter-me “adotado” e acreditado nos meus sonhos. Obrigada por ser esse

“grande homem” que acolhe, se esforça e se dedica tanto aos seus alunos,

merecendo todo o nosso respeito e admiração.

Ao Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do

Semiárido, e a todos os professores inseridos no programa, por todo

conhecimento que foi compartilhado, contribuindo significativamente na minha

formação.

A todos os integrantes da equipe do Núcleo de Estudos e Pesquisas

de Plantas Medicinais – NEPLAME.

Aos meus anjos enviados por Deus para me ajudar a realizar meus

experimentos: Viviane Barreto, Thayne Andrade, Sarah Raquel, Tâmara

Diniz, Juliane Cabral, Fernanda Granja, Suzana Rabêlo, Jamile Maiara e

Noádya Rebeca, Igor Menezes, Rafael Libório, Alessandra Marques.

A professora Dra Maria Helena Tavares de Matos e a aluna Jamile

Maiara pela confecção e coloração das lâminas, e por todo apoio e motivação

durante esse período.

A professora Dra Rosemairy L. Mendes e a sua fantástica equipe

de alunos: Érica M. Lavor, Mariana Gama, Osmar Galvão e Tales.

A grande família UNIVASF os meus agradecimentos a essa

instituição que foi a minha segunda casa durante seis anos (quatro de

graduação e dois de mestrado) influenciando significativamente na formação

do meu caráter ético e profissional.

A toda equipe do Biotério por toda ajuda nas horas de aflição, por

toda paciência e por todos os bons momentos vividos: Leonardo Neves, Euda

Freire, Helenildo Senna e Jean Gomes.

A todos os vigilantes da universidade, por toda a ajuda,

compromisso e segurança transmitidos.

A todos os funcionários terceirizados da UNIVASF pela paciência e

disposição para ajudar, em especial, Geralda Coelho, Francisca e Neide.

Aos Técnicos dos laboratórios da UNIVASF: Ana Paula, Amanda,

Sílvio Alan, Fernando, Amanda Leal, Geisa Lopes e Alberto.

A minha querida turma de mestrando 2012.1, em especial aos

colegas: Igor Menezes, Martapoliana, Anne, Suzana Rabêlo, Larissa

Macêdo, Rafael Libório e Eliatânia, por todo o companheirismo.

Aos funcionários da EMBRAPA Dr. Viseldo Ribeiro de Oliveira

pela coleta e identificação da espécie e ao Sr. João Macedo pela pulverização

das cascas da espécie do presente estudo.

À Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES), pela bolsa de mestrado.

Ao grande criador da vida Deus, sem a presença dele em minha

vida eu nada seria. Obrigada Senhor por me permitir viver cada momento que

vivi durante o mestrado, obrigada por seu amor infinito por mim, por me guiar e

me conduzir para o melhor caminho, por tudo sou grata a ti!

Aos meus pais amados Orlandino Macedo Gomes e Marinalva

Macedo de Araújo por todo o amor, carinho e dignidade a mim ofertados.

Tenho muito orgulho de ser filha de pais humildes e que não tiveram

oportunidades de estudar na vida, mas que fizeram e fazem todos os sacríficos

possíveis para que eu possa estudar. E ao meu irmão José Gustavo Macedo

de A. Gomes por todo o apoio e força que me foi dada durante esse percurso.

À minha doce e amada Aline Braga pela sua amizade!

E todos os meus familiares e amigos, não irei citar nomes para não

correr o risco de esquecer alguém. Sou uma pessoa abençoada e de muita

sorte, pois tenho os melhores amigos e a melhor família.

Á todos vocês muito obrigada!!

Consagre ao Senhor tudo o que você faz, e

os seus planos serão bem-sucedidos.

Provérbios 16:3

RESUMO

A espécie Cnidoscolus quercifolius (faveleira) é uma planta pertencente ao

bioma Caatinga, sendo utilizada popularmente no combate a inflamações em

geral. O presente trabalho avaliou o efeito antinociceptivo e anti-inflamatório do

extrato etanólico bruto das cascas (Cqc-EtOH) e das folhas (Cqf-EtOH) de

C. quercifolius, bem como realizou o estudo toxicológico dos extratos. A

atividade antinociceptiva foi investigada através dos testes de contorções

abdominais induzidas por ácido acético, teste da formalina e o teste da placa

quente. A avaliação da atividade anti-inflamatória foi realizada utilizando-se

dois modelos experimentais: peritonite e edema de pata, ambos induzidos por

carragenina. O estudo toxicológico dos extratos foi realizado através do estudo

de toxicidade aguda. Os resultados obtidos através da avaliação

antinociceptiva demonstram que os extratos possuem efeito antinociceptivo

marcante. Cqc-EtOH e Cqc-EtOH reduziram significativamente a nocicepção

dos animais no teste das contorções abdominais e o tempo da lambida da pata

no teste da formalina, bem como aumentaram o tempo em que os animais

permaneceram na placa quente. Os extratos Cqc-EtOH e Cqf-EtOH

apresentaram também marcante atividade anti-inflamatória. Nos resultados da

toxicidade aguda nenhuma alteração significativa foi observada nos animais

que receberam os extratos nas doses de 2,0 e 5,0 g/kg pelas vias

intraperitoneal e oral, respectivamente. Conclui-se que Cnidoscolus quercifolius

possui atividades antinociceptiva e anti-inflamatória, corroborando com o uso

na medicina popular. Além disso, os estudos de toxicidade demostram

nenhuma toxicidade, demonstrando que há segurança no uso dos extratos,

contribuindo assim, para o desenvolvimento de pesquisas farmacológicas e

toxicológicas futuras com a espécie.

Palavras-chave: Atividade anti-inflamatória; Atividade antinociceptiva;

Cnidoscolus quercifolius; Euphorbiaceae; Toxicidade aguda.

ABSTRACT

The species Cnidoscolus quercifolius (faveleira) is a plant from the Caatinga

biome, commonly used to combat inflammation. This study evaluated the

antinociceptive and anti-inflammatory effect of the crude ethanol extract from

barks (Cqb - EtOH) and leaves (Cql - EtOH) of C. quercifolius and performed

the toxicological study of the extracts. The antinociceptive activity was

investigated through the induced writhing acetic acid, formalin test and hot plate

test. The evaluation of the anti-inflammatory activity was performed using two

experimental models: peritonitis and paw edema, both induced by carageenan.

The toxicological study for the extracts was performed using the acute toxicity

study. The results obtained by the evaluation of antinociceptive activity

demonstrate that the extracts have a marked antinociceptive effect. Cqb-EtOH

and Cql-EtOH extracts significantly reduced nociceptive activity on the animals

tested for the writhing and the time of paw licking in the formalin test and

increased the time that the animals remained on the hot plate. The Cqb-EtOH

and Cql-EtOH extracts also showed marked anti-inflammatory activity. The

results of the acute toxicity showed no significant changes in the animals that

received the extracts at doses of 2.0 and 5.0 g/kg by intraperitoneal and oral

routes respectively. It’s possible to conclude that Cnidoscolus quercifolius has

antinociceptive and anti-inflammatory activities, corroborating the use in folk

medicine. In addition, toxicity studies demonstrate no toxicity, indicating security

in the use of the extracts, contributing to the development of pharmacological

and toxicological studies to further species.

Palavras-chave: Anti-inflamatory activity; Antinociceptive activity; Cnidoscolus

quercifolius; Euphorbiaceae; Acute toxicity.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Fotografia de Cnidoscolus quercifolius..................................................34

Figura 2 - Distribuição fitogeográfica de Cnidoscolus quercifolius.........................35

Figura 3 - Desenho esquemático de um nociceptor..............................................38

Figura 4 - Representação das terminações nervosas livres, Fibras Aβ, Aδ e C...39

Figura 5 – Fotografia da exsicata de Cnidoscolus quercifolius..............................56

Figura 6 - Camundongo observado no teste de contorções abdominais...............61

Figura 7 - Camundongo observado no teste da formalina.....................................62

Figura 8 - Camundongo observado no teste da placa quente...............................63

Figura 9 - Camundongos observados no teste do Rota-Rod.................................64

Figura 10 - Volume da pata mensurado utilizando o aparelho pletismômetro no

modelo do edema de pata induzido por carragenina............................................66

Figura 11 - Efeito antinociceptivo do Cqc-EtOH, da indometacina e da morfina, no

teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético em

camundongos.........................................................................................................72

Figura 12 - Efeito antinociceptivo do Cqc-EtOH, da indometacina e da morfina na

primeira e segunda fase do teste da formalina em

camundongos.........................................................................................................74

Figura 13 - Efeito antinociceptivo do Cqc-EtOH no teste da placa quente em

camundongos.........................................................................................................75

Figura 14 - Efeito sobre a coordenação motora do Cqc-EtOH e do diazepam no

teste de Rota-Rod em camundongos....................................................................76

Figura 15 - Efeito do Cqc-EtOH e da dexametasona sobre a migração leucitária

na cavidade peritoneal após a administração de carragenina em

camundongos.........................................................................................................77

Figura 16 - Efeito anti-inflamatório do Cqc-EtOH e da indometacina, no edema de

pata induzida por carragenina em camundongos..................................................78

Figura 17 - Consumo de alimentos pelos animais tratados com Cqc-EtOH.........80

Figura 18 - Consumo de água pelos animais tratados com Cqc-EtOH.................80

Figura 19 - Variação de peso dos animais tratados com Cqc-EtOH.....................81

Figura 20 - Fotomicrografias de cortes histológicos do fígado de animais tratados

com Cqc-EtOH.......................................................................................................87

Figura 21 - Fotomicrografias de cortes histológicos do pâncreas de animais

tratados com Cqc-EtOH.........................................................................................88

Figura 22 - Fotomicrografias de cortes histológicos dos rins de animais tratados

com Cqc-EtOH.......................................................................................................89

Figura 23 - Efeito antinociceptivo do Cqf-EtOH, da indometacina e da morfina, no

teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético em

camundongos.........................................................................................................90

Figura 24 - Efeito antinociceptivo do Cqf-EtOH, da indometacina e da morfina na

primeira e segunda fase do teste da formalina em

camundongos.........................................................................................................92

Figura 25 - Efeito antinociceptivo do Cqf-EtOH no teste da placa quente em

camundongos.........................................................................................................93

Figura 26 - Efeito sobre a coordenação motora do Cqf-EtOH e do diazepam no

teste de Rota-Rod em camundongos....................................................................94

Figura 27 - Efeito do Cqf-EtOH e da dexametasona sobre a migração leucitária na

cavidade peritoneal após a administração de carragenina em

camundongos.........................................................................................................95

Figura 28 - Efeito anti-inflamatório do Cqf-EtOH e da indometacina, no edema de

pata induzida por carragenina em camundongos..................................................96

Figura 29 - Consumo de alimentos pelos animais tratados com Cqf-EtOH...........98

Figura 30 - Consumo de água pelos animais tratados com Cqf-EtOH..................98

Figura 31 - Variação de peso dos animais tratados com Cqf-EtOH......................99

Figura 32 - Fotomicrografias de cortes histológicos do fígado de animais tratados

com Cqf-EtOH.....................................................................................................105

Figura 33 - Fotomicrografias de cortes histológicos do pâncreas de animais

tratados com Cqf-EtOH.......................................................................................106

Figura 34 - Fotomicrografias de cortes histológicos dos rins de animais tratados

com Cqf-EtOH.....................................................................................................107

LISTA DE QUADRO E TABELAS

Quadro 1 - Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os

principais metabólitos secundários da espécie Cnidoscolus quercifolius

(Euphorbiaceae).....................................................................................................59

Tabela 1 - Identificação das principais classes de constituintes químicos presentes

no extrato etanólico bruto das cascas e folhas de Cnidoscolus quercifolius

................................................................................................................................71

Tabela 2 - Parâmetros hematológicos de camundongos tratados com extrato

etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius........................................82

Tabela 3 - Parâmetros bioquímicos de camundongos tratados com extrato

etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius........................................84

Tabela 4 - Peso dos órgãos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto

das cascas de Cnidoscolus quercifolius.................................................................85

Tabela 5 - Parâmetros hematológicos de camundongos tratados com extrato

etanólico bruto das folhas de Cnidoscolus quercifolius........................................100

Tabela 6 - Parâmetros bioquímicos de camundongos tratados com extrato

etanólico bruto das folhas de Cnidoscolus quercifolius........................................102

Tabela 7 - Peso dos órgãos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto

das folhas de Cnidoscolus quercifolius ................................................................103

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Aα Fibras nervosas mielinizadas do tipo A-alfa

Aβ Fibras nervosas mielinizadas do tipo A-beta

Aδ Fibras nervosas mielinizadas do tipo A-delta

AA Ácido araquidônico

AAS Ácido acetilsalicílico

ACTH Corticotropina

AINES Anti-inflamatórios não esteroides

ALT Alanina aminotrasnferase

AMPc Monofosfato de 3,5 - adenosina cíclico

ANOVA Análise de variância

AST Aspartato aminotransferase

ATP 1,4,5- Trifosfato de Adenosina

CD31 Cluster of Differentiation 31

CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais

CHCM Concentração de hemoglobina corpuscular média

CGRP Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina

Cqc-EtOH Extrato etanólico das cascas de Cnidoscolus quercifolius

Cqf-EtOH Extrato etanólico das folhas de Cnidoscolus quercifolius

COX Cicloxigenase

CT Corticosteróides

EDTA Ácido etileno diamino tetra-acético

FDA Food and Drug Administration

GC Glicocorticoides

HCM Hemoglobina corpuscular média

HVASF Herbário Vale do São Francisco

IASP International Association for the Study of Pain

ICAM Intercellular Adhesion Molecules

IFNʏ Interferon Gama

IL Interleucina

IL-1β Interleucina-1 beta

IL-6 Interleucina-6

IKK Proteína quinase do IkB

IkB Proteína inibidora do NFkB

iNOS Sintase de Óxido Nítrico Induzível

JAM-3 Molécula de adesão juncional-3

LOX Lipoxigenase

OMS Organização Mundial da Saúde

NFkB Fator nuclear kappa B

NMDA N-metil-D-aspartato

NO Óxido nítrico

PAF Fator de agregação plaquetária

PG Prostaglandina

PGE2 Prostaglandina E2

PGF2α Prostaglandina F2 alfa

PGI2 Prostaciclina

PKA Proteína cinase A

PKC Proteína cinase C

PLA2 Fosfolipase A2

PNPIC Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares

QPN Química de Produtos Naturais

RGC Receptor Guanylate Cyclase

SG Substância Gelatinosa

SNC Sistema Nervoso Central

SUS Sistema Único de Saúde

TGO Transaminase glutâmico oxalacética

TGP Transaminase glutâmico pirúvica

TGFβ Fator transformador do crescimento beta

TNF Fator de necrose tumoral

TNF-α Fator de necrose tumoral-α

TRVP-1 Transient Receptor Potential cation channel, subfamily V, member 1

TXA2 Tromboxano

UNIVASF Universidade Federal do Vale do São Francisco

VCAM-1 Moléculas de Adesão Vascular

VCM Volume corpuscular médio

VR Vanilloid Receptor

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................. 23

2. OBJETIVOS.................................................................................... 26

2.1. Objetivo geral................................................................................... 27

2.2. Objetivos específicos....................................................................... 27

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA...................................................... 28

3.1. Produtos naturais............................................................................. 29

3.2. O bioma Caatinga............................................................................ 31

3.3. Considerações sobre a família Euphorbiaceae............................... 32

3.4. Considerações sobre o gênero Cnidoscolus................................... 33

3.5. Considerações sobre a espécie Cnidoscolus quercifolius Pohl....... 34

3.6. Considerações sobre a dor ............................................................. 36

3.6.1. Dor e nocicepção............................................................................. 36

3.6.2. Nociceptores.................................................................................... 37

3.6.3. Fibras e vias nociceptivas................................................................ 38

3.6.4. Mecanismo da dor central................................................................ 40

3.6.5. Mecanismo da dor periférica: dor inflamatória................................. 41

3.6.6. Drogas analgésicas......................................................................... 41

3. 7. Modelos experimentais para avaliação da atividade

antinociceptiva.................................................................................

43

3.7.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético....................... 43

3.7.2. Teste da formalina........................................................................... 44

3.7.3. Teste da placa quente..................................................................... 44

3. 8. Considerações sobre inflamação................................................. 45

3.8.1 Eventos vasculares.......................................................................... 46

3.8.2 Eventos celulares............................................. ……………….……. 47

3.8.3 Mediadores químicos …………………………………………………. 48

3.9. Drogas anti-inflamatórias................................................................. 49

3.9.1. Anti-inflamatórios não esteroides.................................................... 49

3.9.2. Anti-inflamatórios esteroides........................................................... 50

3.10. Modelos experimentais.................................................................... 52

3.10.1. Edema de pata induzido por carragenina........................................ 52

3.10.2. Edema de orelha induzido por óleo de cróton................................. 53

3.10.3. Peritonite induzida por carragenina................................................. 54

4. PARTE EXPERIMENTAL ............................................................... 55

4.1. Material vegetal................................................................................ 56

4.1.1. Coleta de Cnidoscolus quercifolius Pohl.......................................... 56

4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto das cascas e folhas de

Cnidoscolus quercifolius Pohl..........................................................

57

4.3. Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos das

cascas e folhas de Cnidoscolus quercifolius Pohl...........................

57

4.4. Animais............................................................................................ 60

4.5. Testes de atividade antinociceptiva................................................. 60

4.5.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido

acético..............................................................................................

60

4.5.2. Teste da formalina........................................................................ 61

4.5.3. Teste da placa quente..................................................................... 63

4.6. Teste de coordenação motora......................................................... 64

4.6.1. Teste do rota-rod........................................................................... 64

4.7. Testes de atividade anti-inflamatória............................................... 65

4.7.1. Migração de leucócitos na cavidade peritoneal............................... 65

4.7.2. Edema de pata induzido por carragenina........................................ 65

4.8. Toxicidade aguda............................................................................. 67

4.8.1. Análise comportamental.................................................................. 67

4.8.2. Análises de parâmetros hematológicos e bioquímicos.................... 67

4.8.3. Análise histopatológica dos órgãos.................................................. 68

4.9. Análise estatística............................................................................ 69

5. RESULTADOS................................................................................ 70

5.1. Triagem fitoquímica......................................................................... 71

5.2. Resultados da atividade farmacológica do extrato das cascas de

Cnidoscolus quercifolius..................................................................

72

5.2.1 Atividade antinociceptiva do extrato das cascas de Cnidoscolus

quercifolius.......................................................................................

72

5.2.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético....... 72

5.2.1.2 Teste da formalina........................................................................... 73

5.2.1.3 Teste da placa quente..................................................................... 75

5.2.2. Avaliação da coordenação motora do extrato das cascas de


76

5.2.2.1 Teste do rota-rod........................................................................... 76

5.2.3. Atividade anti-inflamatória do extrato das cascas

de Cnidoscolus quercifolius.............................................................

77

5.2.3.1 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal............................... 77

5.2.3.2 Teste do edema de pata induzido por carragenina......................... 78

5.2.4. Toxicidade aguda do extrato das cascas

de Cnidoscolus quercifolius.............................................................

78

5.2.4.1. Avaliação comportamental dos camundongos................................ 79

5.2.4.2. Consumo de alimento e água.......................................................... 79

5.2.4.3. Variação do peso corporal............................................................... 80

5.2.4.4 Parâmetros hematológicos.............................................................. 81

5.2.4.5. Parâmetros bioquímicos.................................................................. 83

5.2.4.6. Peso dos órgãos.............................................................................. 85

5.2.4.7. Análise macroscópica e histológica................................................ 86

5.3. Resultados da atividade farmacológica do extrato das folhas de


90

5.3.1. Atividade antinociceptiva do extrato das folhas de Cnidoscolus

quercifolius.......................................................................................

90

5.3.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético....... 90

5.3.1.2 Teste da formalina........................................................................... 91

5.3.1.3 Teste da placa quente..................................................................... 93

5.3.2. Avaliação da coordenação motora do extrato das folhas de


94

5.3.2.1 Teste do rota-rod........................................................................... 94

5.3.3. Atividade anti-inflamatória do extrato das folhas de


95

5.3.3.1 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal............................... 95

5.3.3.2 Teste do edema de pata induzido por carragenina......................... 96

5.3.4. Toxicidade aguda do extrato das folhas de


96

5.3.4.1. Avaliação comportamental dos camundongos................................ 97

5.3.4.2 Consumo de alimento e água.......................................................... 97

5.3.4.3. Variação do peso corporal............................................................... 98

5.3.4.4. Parâmetros hematológicos.............................................................. 99

5.3.4.5. Parâmetros bioquímicos.................................................................. 101

5.3.4.6. Peso dos órgãos.............................................................................. 103

5.3.4.7. Análise macroscópica e histológica................................................. 104

6. DISCUSSÃO.................................................................................... 108

7. CONCLUSÕES................................................................................ 116

REFERÊNCIAS............................................................................... 118

APÊNDICES.................................................................................... 133

ANEXOS.......................................................................................... 182

1. INTRODUÇÃO

24 GOMES, L.M.A. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Cnidoscolus quercifolius Pohl (Euphorbiaceae) em roedores.

1. INTRODUÇÃO

A ingestão de plantas para o alívio e a cura das doenças foi uma das

primeiras formas de utilização dos produtos naturais pela humanidade

(VIEGAS-JÚNIOR et al., 2006). Assim, as plantas medicinais têm sido

utilizadas ao longo do tempo, sendo vários os procedimentos clínicos

registrados com as mesmas. Embora a medicina alopática tenha obtido um

grande avanço a partir da segunda metade do século XX, ainda existem alguns

entraves na sua utilização pelas populações menos favorecidas

economicamente. Dessa maneira, o uso de plantas medicinais se destacou

entre as populações carentes dos países em desenvolvimento, devido a sua

fácil obtenção e a grande tradição do uso de plantas medicinais (VEIGA-

JÚNIOR et al., 2005).

O Brasil se destaca abrigando aproximadamente 14% da

diversidade de plantas do mundo, sendo considerado o país com a maior

diversidade biológica do planeta (PEIXOTO; AMORIM, 2003). Nesse sentido, a

biodiversidade brasileira é considerada uma importante fonte para a descoberta

de novos fármacos e/ou fitofármacos, contribuindo assim, para o avanço das

pesquisas multidisciplinares e para o desenvolvimento tecnológico nacional,

ressaltando que a diversidade dos biomas brasileiros é ainda muito pouco

explorada como uma fonte de substâncias de interesse farmacológico

(BARREIRO; BOLZANI, 2009).

Dentre os biomas brasileiros, destaca-se a Caatinga, por se

encontrar na lista dos biomas que mais sofreram com a interferência humana e

é um dos menos estudados no Brasil (CASTELLETTI et al., 2003). A espécie

selecionada para este estudo foi Cnidoscolus quercifolius, conhecida

popularmente como “faveleira”, uma das plantas pertencentes ao bioma

Caatinga, que se destaca pela sua extraordinária resistência à seca. Esta

espécie apresenta grande importância para o desenvolvimento da região

semiárida em virtude de sua alta disseminação e completa adaptação às

condições adversas dessa região. É popularmente utilizada para recuperar

áreas degradadas, para a alimentação animal e humana, para a medicina


popular, para serrarias como fonte de energia e para diversos outros usos

(NETO et al., 2009).

Em relação ao uso na medicina popular, Cnidoscolus quercifolius é

usada para combater a inflamação (LORENZI; MATOS, 1998). O processo

inflamatório consiste na resposta orgânica mais precoce diante de lesão

tissular ou infecção. Perante um trauma tissular, ocorre o acúmulo local de

prostaglandinas, tromboxanos e outros mediadores químicos que ocasionam

uma alteração no limiar de nociceptores, com consequente hiperalgia. A dor é

uma modalidade sensorial que em muitos casos representa o único sintoma

para o diagnóstico de várias doenças. Ela tem muitas vezes uma função

protetora (ALMEIDA et al., 2001; KUMMER; COELHO, 2002).

Em levantamento bibliográfico realizado nos principais bancos de

dados sobre estudos com plantas medicinais, não foram encontrados registros

de estudos com essa espécie e sua ação antinociceptiva e anti-inflamatória.

Nesse sentindo, é de suma importância a realização do presente estudo no

intuito de avaliar os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatórios da espécie.

Assim, a presente pesquisa buscou realizar a avaliação da atividade

antinociceptiva e anti-inflamatória do extrato etanólico bruto da espécie

Cnidoscolus quercifolius, bem como o estudo de sua toxicidade, no intuito de

assegurar sua utilização e servir de parâmetros para o desenvolvimento de

futuros medicamentos fitoterápicos.


2. OBJETIVOS


2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Contribuir para o estudo farmacológico de espécies de família

Euphorbiaceae nativas da Caatinga, através da avaliação da atividade

antinociceptiva e anti-inflamatória de Cnidoscolus quercifolius Pohl em

camundongos.

2.2. Específicos

Realizar a triagem fitoquímica para a identificação das principais classes

de constituintes químicos presentes nos extratos;

Avaliar o potencial antinociceptivo do extrato etanólico bruto das cascas

e folhas da espécie Cnidoscolus quercifolius Pohl;

Avaliar o potencial anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das cascas

e folhas da espécie Cnidoscolus quercifolius Pohl;

Investigar os possíveis mecanismos de ação envolvidos nos extratos e a

participação dos sistemas de neurotransmissão;

Avaliar o perfil de segurança, através do estudo da toxicidade aguda, do

extrato etanólico bruto das cascas e folhas da espécie.


3. FUNDAMENTAÇÃO

TEÓRICA


3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 Produtos naturais

O uso dos produtos naturais pela humanidade transcorre desde

tempos imemoriais. Assim, uma das primeiras formas de utilização dos

produtos naturais para o alívio e a cura de doenças, foi pela ingestão de ervas

e folhas. Nas civilizações Oriental e Ocidental, no desenvolvimento de suas

histórias, utilizaram os recursos naturais na medicina e no controle de pragas.

Já na medicina tradicional chinesa, até hoje muitas espécies e preparados

vegetais medicinais são estudados na busca pelo entendimento de seu

mecanismo de ação e no isolamento dos princípios ativos (VIEGAS-JUNIOR

et al., 2006).

O termo "produtos naturais" usualmente está associado com a

produção de metabólitos secundários produzidos por um organismo, que na

maioria dos casos funciona como mecanismo de defesa contra herbívoros,

microorganismos, insetos e plantas competidoras. Uma variedade de produtos

naturais, originados principalmente a partir das plantas, contêm vários

componentes ativos e são usados por milhares de anos pela população em

diversos países e regiões do mundo (MAJEED et al., 2012).

Estima-se que 40% dos medicamentos disponíveis na terapêutica

atual foram desenvolvidos de fontes naturais, desses, 25% são provenientes de

plantas, 13% de microrganismos e 3% de animais. Somente no período entre

1983-1994, aproximadamente 39% dos fármacos aprovados pela agência

americana de controle de medicamentos e alimentos (FDA), foram

desenvolvidos a partir de produtos naturais. Além disso, um terço dos

medicamentos mais prescritos e vendidos no mundo foi desenvolvido a partir

de produtos naturais (CRAGG et al., 1997).

Nesse sentindo, os produtos naturais têm servido como importante

fonte de medicamentos durantes séculos, e cerca de metade dos produtos

farmacêuticos, como os fármacos, em uso hoje são derivados dos produtos

naturais (ZHANG et al., 2013). Assim, a terapêutica moderna, baseada no uso


de medicamentos com ações específicas sobre receptores, enzimas e canais

iônicos, não teria sido possível sem a contribuição dos produtos naturais

(CALIXTO, 2003).

Em meio aos diversos reinos da natureza, o reino vegetal é o que

tem contribuído de forma mais significativa para o fornecimento de metabólitos

secundários, a grande maioria destes de grande valor agregado, devido às

suas aplicações em medicamentos, cosméticos, alimentos e agroquímicos

(PHILLIPSON; ANDERSON, 1989).

Assim, as plantas além do seu uso na medicina popular, têm

contribuído ao longo dos anos para a obtenção de vários fármacos, até hoje

amplamente utilizados na clínica (FARNSWORTH, 1980). Um exemplo

relevante a ser considerado é a morfina (analgésico de ação no sistema

nervoso central) e a codeína (antitussígeno), ambas são produtos obtidos a

partir do ópio da Papaver somniferum (SIMÕES; PETROVICK, 2010).

Os metabólitos secundários produzidos pelas plantas têm a função

de modular seus próprios metabolismos, possuindo uma constituição complexa

e, consequentemente, também podem alcançar alvos terapêuticos de doenças

humanas. Assim, a grande maioria dos princípios ativos de relevância

farmacológica encontradas nos extratos vegetais é proveniente dos metabólitos

secundários (FERREIRA; PINTO, 2010).

Nesse sentindo, os produtos naturais são usados como matéria-

prima na síntese de moléculas complexas de interesse farmacológico. Através

deles os pesquisadores puderam compreender fenômenos complexos

relacionados à biologia celular e molecular e à eletrofisiologia, permitindo que

enzimas, receptores, canais iônicos e outras estruturas biológicas fossem

identificados (SHU, 1998).

Assim, o Brasil por possuir uma riqueza na sua biodiversidade e,

sendo o detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não

pode abdicar de sua vocação para os produtos naturais. Assim, a Química de

Produtos Naturais (QPN) é, dentro da Química brasileira, a área mais antiga,

agregando um número elevado de pesquisadores (PINTO et al., 2002).

É importante que o Brasil progrida no uso das plantas medicinais, a

partir de uma campanha de esclarecimento público, incluindo a classe médica,

para mostrar a segurança e eficácia das plantas medicinais de uso tradicional,


como uma alternativa terapêutica. É também relevante, que os químicos de

produtos naturais se envolvam com o estudo de plantas medicinais, desde o

trabalho de identificação do princípio ativo ao controle de qualidade dos

produtos oferecidos ao consumidor (FERREIRA; PINTO, 2010).

3.2 O bioma Caatinga

A Caatinga brasileira compreende aproximadamente 750.000 km2 de

área geográfica e possui uma população de 20 milhões de habitantes, sendo

considerada uma das regiões semiáridas de maior densidade populacional do

mundo. O Bioma tem grande potencial para o desenvolvimento de novas

pesquisas científicas em vários aspectos, tais como fauna, flora, recursos

hídricos e minerais, além dos aspectos ecológicos e climáticos. Isso é

justificado pelo fato de ser uma região altamente habitada e por possuir

inúmeras características próprias e particulares (FREIRE, 2009).

A vegetação da Caatinga ocupa uma área de aproximadamente 7%

do território brasileiro e está presente nos estados da Bahia, Piauí, Ceará, Rio

Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe e a porção norte de

Minas Gerais. É importante ressaltar, que a preservação da biodiversidade da

Caatinga é de relevante importância, tanto para o ecossistema como para o

sustento das famílias da região, estas que sofrem com o longo período de

estiagem (BARBOSA et al., 2009).

Nesse sentido, por estarem inseridas em uma região com baixas

precipitações pluviométricas, temperaturas elevadas, solos cristalinos, baixa

umidade e alta incidência solar suas espécies são notavelmente adaptadas

(FREIRE, 2009). A Caatinga pode ser caracterizada por uma vegetação baixa,

composta principalmente por árvores e arbustos adaptados às condições

xerofíticas por meio da microfilia, da caducidade e de espinhos, entre outras

modificações morfológicas típicas desses ambientes (PRADO, 2003).


3.3 Considerações sobre a família Euphorbiaceae

Dentre as diversas famílias de espécies vegetais da Caatinga

podemos destaca a família Euphorbiaceae. Essa família é constituída por 62

gêneros e 765 espécies, entre os quais 500 são endêmicas (FORZZA et al.,

2010). As plantas desta família possuem folhas simples ou compostas, em

geral possuem laticíferos, em maior ou menor quantidade e na maioria das

vezes, glândulas no pecíolo ou no limbo (SILVA et al., 2012).

No Brasil, a família possui cerca de 70 gêneros e 100 espécies,

sendo mais frequentemente encontrados os seguintes vegetais: Croton

(“sangue-de-dragão”), Manihot ("mandioca"), Joannesia (“ánda-açu” ou “purga-

de-cavalo”); Jathropha ("pinhão-do-paraguai"); Euphorbia ("coroa-de-cristo”),

Poinsettia (“flor-de-papagaio”) Acalypha (PANTOJA, 2010).

Assim, a família é considerada de grande importância econômica

entre as Angiospermas (SÁTIRO; ROQUE, 2008), reunindo algumas espécies

de interesse econômico, destacando-se a espécie Hevea brasiliensis Müll. Arg.

(seringueira), Manihot esculenta Crantz (mandioca ou cassava), Ricinus

comunis L. (mamona) e Croton cajucara L. (sacaca) (GIULIETTI, 2009). É

relevante destacar ainda, que a família Euphorbiaceae é a segunda família

mais representativa em número de espécies na Caatinga, distribuída em

trópicos e subtrópicos (SANTOS et al., 2005).

É característica desta família, a ocorrência de vários metabólitos

secundários (RANDAU et al., 2002). Uma classe de metabólitos secundários

presentes na família são os diterpernos, os mesmos são considerados o grupo

de substâncias mais característico e complexo da família (SALATINO et al.,

2007).

Dessa forma, as plantas da família Euphorbiaceae são detentoras de

várias atividades biológicas. A espécie Croton urucurana, cujos óleos voláteis

possuem em torno de 83 compostos distintos, apresenta atividades

anticâncerígena, anti-inflamatória, antioxidante, antirreumática e

antiulcerogênica (SIMIONATTO et al., 2007). Pera glabrata possui atividade

antifúgica, devido às altas taxas de cafeína, além de ser também utilizada no

tratamento para a perda da memória decorrente da doença de Alzheimer


(CARDOSO-LOPES et al., 2009). Dentre os diversos gêneros pertecencentes a

essa família, podemos destacar o Cnidoscolus, relatado no tópico a seguir.

3.4 Considerações sobre o gênero Cnidoscolus

O gênero Cnidoscolus Pohl compreende cerca de 50-75 espécies,

distribuídas excepcionalmente na América tropical e concentradas,

principalmente, no México e Nordeste do Brasil (WEBSTER, 1994). É um

gênero bem representado no Brasil (aproximadamente 18 espécies),

especialmente na região Nordeste (com cerca de 10 espécies), sendo esta

região um dos prováveis centros de diversidade de Cnidoscolus (MACBRIDE,

1951).

Uma das características das espécies pertencentes ao gênero

Cnidoscolus é a presença de tricomas urticantes (Cnidoscolus, do grego:

knide = urtiga, skolos = ponta), que se concentram em quase todas as suas

partes vegetativas e florais. A característica distinta deste gênero é a presença

de tricomas urticantes que, quando estimulada pelo contato com a pele, pode

causar dor intensa e localizada (MELO; SALES, 2008).

Na Caatinga, o gênero Cnidoscolus se faz presente, através de

quatro espécies utilizadas na medicina popular: C. infestus Pax & K.,

Hoffm.; C. pubescens Pohl, C. quercifolius Pohl e C. urens L. Arthur. Essas

espécies possuem diversas propriedades medicinais, dentre elas, atividade

antitumoral, anti-inflamatória para o sistema genito-urinário, antisséptica e no

tratamento de infecções renais, dermatológicas e lesões oftalmológicas,

contusões, fraturas, feridas, verrugas, disenteria, hemorragia, apendicite e

reumatismo (AGRA et al., 2008). Outro fato relevante, é que várias espécies do

gênero Cnidoscolus possuem atividade antioxidante, dentre elas, as raízes de

C. infestus e as folhas de C. pubescens (SOBRINHO et al., 2011).

Existem relatos na literatura da presença de alcaloides no gênero

Cnidoscolus (AWOYINKA et al., 2007; YAKUBU et al., 2008). Outros

metabólitos também foram encontrados no gênero, tais como: as cumarinas, os

terpenoides, as xantinas e as antocianinas (TAVARES; AMORIM, 2010). Foram


identificados e isolados três novos terpenoides das cascas da espécie

C. quercifolius, que foram denominados: um bis-nor-diterpeno, filacantona e

dois triterpenos 3β-O-cinamoil-lupeol e 3β-O-dihidrocinamoil-lupeol (LEMOS et

al., 1991).

3.5 Considerações sobre a espécie Cnidoscolus quercifolius Pohl

Pertencente à família Euphorbiaceae, Cnidoscolus quercifolius Pohl

(Figura 1) está presente nos estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte,

Paraíba, Pernambuco, Bahia e dentre outros (DUQUE, 2004). A espécie é

conhecida popularmente como faveleira, sendo uma árvore de porte pequeno e

muito conhecida por possuir tricomas urticantes distribuídos por toda a planta

(MAIA-SILVA et al., 2012).

Figura 1. Fotografia de Cnidoscolus quercifolius Pohl.

Esta espécie é uma planta oleaginosa, xerófila, decídua, heliófila e

pioneira, que atinge de 4 a 8 m de altura, dotada de copa alongada ou

arrendondada e rala, possuindo um tronco curto e ramificado desde a base,

mais ou menos cilíndrico, com casca fina, lenticelada e quase lisa, de 20 a

35 cm de diâmetro. Na medicina popular do Nordeste, a decocção, a infusão e


maceração das cascas e entrecascas do caule são empregadas contra

inflamações ovarianas e inflamações gerais (LORENZI; MATOS, 1998).

A faveleira destaca-se por sua grande capacidade de tolerância à

seca. Suas raízes são tuberosas e armazenam nutrientes, utilizados durante a

estação seca, período em que ocorre a floração e a frutificação dessa espécie.

Suas inflorescências são compostas por flores pequenas e brancas (MAIA-

SILVA et al., 2012). Essa espécie é utilizada na medicina popular para

combater a inflamação (LORENZI; MATOS, 1998).

Figura 2. Distribuição fitogeográfica de Cnidoscolus quercifolius Pohl

(Disponível em: http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2013).

RO

RR

CE RN

PB PE

AL SE

BA

MG

AC

AM PA

AP

MT TO

MA PI

ES

RJ

RS SC

PR

MS


3.6 Considerações sobre a dor

3.6.1 Dor e nocicepção

A palavra “dor” na língua portuguesa é derivada do latim “dolore” e

significa sofrimento; na língua inglesa “pain”, do grego: poiné, pena. Há uma

distinção entre os termos dor e nocicepção feita pelos fisiologistas, onde a

nocicepção se refere aos sinais que chegam ao sistema nervoso central

resultante da ativação dos receptores sensoriais especializados, denominados

nociceptores, que fornecem informações sobre a lesão tecidual ocasionada por

estímulos nocivos, daí a origem da nomenclatura. Diferentemente, “a dor é uma

experiência emocional desagradável, que geralmente acompanha a

nocicepção” (FEIN, 2011).

A definição de dor descrita pela Associação Internacional para o

Estudo da Dor (IASP) como uma “experiência emocional, com sensação

desagradável, associada à lesão tecidual presente, potencial ou descrita como

tal” (LAPA et al., 2003). No Brasil, estima-se que cerca de 50 milhões de

pessoas padeçam de algum tipo de dor (FORNI et al., 2012).

Quando o sujeito experimental não pode definir verbalmente a

resposta de dor, como no caso dos animais, torna-se preferível a utilização do

termo “Resposta Nociceptiva” por englobar as respostas comportamentais e

neurofisiológicas da dor, dissociando-as do caráter cognitivo-afetivo da

resposta. Dessa forma, apesar dos animais não apresentarem a capacidade de

comunicar verbalmente a ocorrência da dor, quando são submetidos a um

estímulo nociceptivo, eles exibem respostas comportamentais, motoras e

fisiológicas semelhantes às observadas em humanos (LAPA et al., 2003).

O sistema sensorial, que engloba visão, olfato, tato, audição e

gustação, tem a função de informar o cérebro sobre os ambientes externo e

interno do corpo. A dor, por ser considerada uma percepção sensorial, constitui

um sistema de alarme, para proteção do organismo de uma eventual lesão

tecidual, por meio da ativação de mecanismos que envolvem vias reflexas

periféricas, espinhais e supraespinhais (CARLINI; MENDES, 2011).


3.6.2 Nociceptores

Os nociceptores são terminações neuronais livres dos neurônios de

primeira ordem, cuja função é preservar a homeostasia tecidual, assinalando

uma injúria potencial ou real (KLAUMANN et al., 2008). A função básica dos

nociceptores é de transmitir informações aos neurônios de ordem superior

sobre a lesão tecidual ocasionada por estímulos térmicos, mecânicos ou

químicos que provocam lesão tecidual, resultando em sensação de dor.

Existem várias possibilidades para explicar como estes diferentes estímulos

resultariam na sensação de dor, dentre elas, a de que os nociceptores

individuais são sensíveis a todos esses estímulos diferentes e a outra é que

existem vários tipos de nociceptores, e cada um é sensível a um estímulo

específico (FEIN, 2011).

Os nociceptores estão descritos em quatro classes: os mecânicos,

térmicos, polimodais e silenciosos. Os nociceptores mecânicos respondem a

pressão intensa; os nociceptores térmicos respondem a temperaturas

extremas, quentes (> 45 °C) ou frias (< 5 °C) e possuem fibras A mielinizadas,

em conjunto esses nociceptores de fibra A δ-β são denominados

mecanotérmicos. Os nociceptores polimodais respondem aos estímulos

nocivos mecânicos, térmicos ou químicos. Os nociceptores silenciosos são

ativados por estímulos químicos, mediadores inflamatórios, e respondem a

estímulos mecânicos e térmicos somente depois de serem ativados (FEIN,

2011).


Figura 3. Desenho esquemático do nociceptor (FEIN, 2011, Disponível em:

http://www.dol.inf.br/nociceptores).

3.6.3 Fibras e vias nociceptivas

Os nociceptores (Figura 4) são responsáveis por transmitir o sinal

nociceptivo da periferia para os neurônios secundários que estão localizados

no corno dorsal da medula, estes que transmitem as informações para os

centros integrativos do Sistema Nervoso Central (SNC) através de vias

ascendentes da medula espinhal. As fibras são divididas em três categorias: a

primeira são as fibras sensoriais primárias Aα e Aβ mielinizadas e de condução

rápida, responsáveis pela informação proprioceptiva (toque leve e pressão); na

segunda estão os neurônios de corpos celulares de pequeno e médio diâmetro,

formados pelas fibras C amielinizadas de condução lenta, e por fim, as fibras

Aδ mielinizadas de condução rápida. Em condições normais apenas as fibras C

e Aδ transmitem informações nociceptivas (CARLINI; MENDES, 2011).


Figura 4. Representação das terminações nervosas livres, Fibras Aβ, Aδ e C

(RANG et al., 2007).

Os corpos celulares das fibras aferentes nociceptivas situam-se nos

gânglios da raiz dorsal: as fibras entram na medula espinal através das raízes

dorsais, terminando na substância cinzenta do corno posterior. A maioria das

fibras aferentes nociceptivas termina na região superficial do corno posterior,

com as fibras C e algumas fibras Aδ inervando os corpos celulares nas lâminas

I e II, enquanto outras fibras A penetram mais profundamente no corno

posterior (lâmina V). As células nas lâminas I e V dão origem às principais vias

de projeção do corno posterior ao tálamo (RANG et al., 2007).

A informação nociceptiva é transmitida da medula espinhal para o

tálamo e para o córtex por cinco vias ascendentes: os tratos espinotalâmico,

espinoreticular, espinomesencefálico, cervicotalâmico, espinohipotalâmico

(PINTO, 2000). O tálamo e o córtex são regiões finais da projeção das vias de

nocicepção. O tálamo é um dos responsáveis por informar que existe sensação

nociceptiva, e o córtex é responsável pela discriminação do tipo de sensação

nociceptiva e por identificar, de forma pouco fiel, de onde provém

(SOUZA, 2005).

Os neurônios cruzam a linha média da medula espinhal e ascendem

em direção ao tálamo, através do fascículo anterolateral que contém os feixes


espinotalâmico e espinorreticular para penetrar na substância cinzenta, após o

impulso ser integrado no sistema medular, o impulso nociceptivo caminha por

feixes ascendentes. O feixe espinotalámico dirige-se ao tálamo para o

complexo ventrobasal, núcleo posterior e núcleos intralaminares, as

informações processadas nessas áreas são transmitidas ao córtex e o feixe

espinorreticular vai à formação reticular. Há também um sistema descendente

que tem origem no córtex e na formação reticular, que desce anatomicamente

pelo funículo dorso lateral e faz sinapse com os neurônios da lâmina II na

medula espinhal, com função inibitória (CAVALCANTI; MADALENA, 2003).

Já o feixe espinomesencefálico é formado por axônios de neurônios

de projeção das lâminas I e IV que se projetam até os núcleos parabraquiais da

formação reticular. O feixe espinocervical tem origem nas Lâminas III e IV e

projeta-se para o tálamo através do trato cervicotalâmico. O Trato

espinohipotalâmico compreende axônios das lâminas I, V e VIII. Estas se

projetam diretamente no hipotálamo (KLAUMANN et al., 2008).

3.6.4 Mecanismo central da dor

As lesões teciduais periféricas induzem a liberação de

neurotransmissores, como substância P, somatotastina, peptídeo relacionado

ao gene da calcitonina, neurocinina-A, glutamato e aspartato. Essas

substâncias estão relacionadas com a ativação de potenciais pós-sinápticos

excitatórios e dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) (ROCHA

et al., 2007).

A sensibilização central é induzida por impulsos sensoriais

conduzidos pelas fibras C, estas quando são estimuladas podem liberar os

neurotransmissores, aminoácidos excitatórios e os neuropeptídios (substância

P, glutamato, etc). O glutamato por sua vez, após sua liberação, ativa os

receptores NMDA, provocando a despolarização da célula pós-sináptica e a

liberação de um segundo mensageiro, além de ativar receptores

metabotrópicos que ativam enzimas intracelulares através da fosfolipase C

(CAVALCANTI; MADALENA, 2003).


3.6.5 Mecanismo da dor periférica (dor inflamatória)

A dor inflamatória tem como função indicar a ocorrência de uma

lesão tissular, assim reduz a propagação do agente etiológico e previne lesões

tissulares futuras (LAPA et al., 2003). Logo após uma lesão tecidual ou

inflamação, nociceptores são ativados e inicia-se uma cascata de

sensibilização periférica com eventos celulares e subcelulares

(KLAUMANN et al., 2008). Os mediadores liberados ativam cascatas de

segundos mensageiros, influenciando canais iônicos, enzimas e proteínas de

sinalização intracelular nos nociceptores, levando ao aumento da excitabilidade

do neurônio, diminuindo o limiar de disparo e aumentando a frequência de

potenciais de ação produzidos durante uma estimulação supralimiar

(BASBAUM; WOOLF, 1999).

As células lesadas e fibras aferentes primárias liberam uma série de

mediadores químicos, incluindo substância P e neurocinina A que têm efeitos

diretos sobre a excitabilidade de fibras sensoriais e simpáticas, além de

promover a vasodilatação com extravasamento de proteínas plasmáticas e o

recrutamento de células inflamatórias: mastócitos, macrófagos, linfócitos e

plaquetas contribuem para a formação de um ambiente complexo, composto

por mediadores inflamatórios, como íons hidrogênio, bradicinina, histamina,

íons potássio, citocinas, serotonina, fator de crescimento neural, óxido nítrico e

produtos das vias da ciclo-oxigenase e lipo-oxigenase do metabolismo do ácido

araquidônico (KLAUMANN et al., 2008).

3.6.6 Drogas analgésicas

As drogas utilizadas para o tratamento da dor tanto de classificação

aguda como crônica, são na grande maioria as drogas adjuvantes, que

possuem ações farmacológicas diversas, entre elas estão os antidepressivos,

anticonvulsivantes, anestésicos locais, agonistas dos receptores adrenérgicos

e moduladores gabaérgicos, entre outros, os fármacos anti-inflamatórios não


esteroides (AINES) e os opioides. Nesse sentindo, vale ressaltar que as drogas

clinicamente utilizadas para combater a dor, possuem ação limitada

dependendo do tipo de dor e produzem efeitos colaterais relevantes, que

restringem sua utilização (CARLINI; MENDES, 2011).

Os fármacos opioides são amplamente utilizados para promover o

alívio da dor, sendo considerados importantes por atuarem no sistema nervoso

central, exercendo os seus efeitos através de três receptores opioides (µ, ƙ, ᵹ).

Essa classe de fármacos é importante para o tratamento da dor crônica.

Existem algumas consequências devido ao uso dos opiáceos, dentre elas, a

depressão respiratória, sonolência, diminuição da motilidade gastrointestinal,

náuseas e diversas alterações do sistema endócrino e do sistema nervoso

autônomo (ALMEIDA et al., 2001). O sistema opioide endógeno tem várias

funções fisiológicas, incluindo a regulação da dor, através da inibição da

resposta dolorosa, modulação das funções gastrointestinal, endócrinas,

autonômicas e de aprendizado e da memória (ÁLVAREZ; FARRÉ, 2005).

Os medicamentos anti-inflamatórios não-esteroides (AINEs) são

utilizados no combate a dor e são amplamente utilizados no mundo, seus

efeitos farmacológicos são devido à inibição de uma enzima chamada ciclo-

oxigenase (COX), que existe em três isoformas, a COX-1, COX-2 e a COX-3

(ABDEL-AZIZ et al., 2011). A administração de AINES em longo prazo pode

causar úlceras gastrointestinais, sangramentos e desordens renais, devido à

inibição não seletiva das isoformas constitutiva (COX-1) e induzível (COX-2).

Os fármacos inibidores seletivos da COX-2 podem causar efeitos

cardiovasculares e adversos importantes, dentre eles, o

aumento do risco de infarto agudo do miocárdio, acidente vascular encefálico,

insuficiência cardíaca, insuficiência renal e hipertensão arterial (BATLOUNI,

2010).

Os opioides atuam excitando os neurônios na substância cinzenta

periaquedutal e no núcleo reticular paragigantocelular, que, por sua vez, se

projetam ao bulbo rostroventral, que inclui o núcleo magno da rafe e a partir

dele os neurônios contendo 5-hidroxitriptamina e encefalina vão à substância

gelatinosa do corno posterior e exercem influência inibitória sobre a

transmissão, além disso, eles atuam também no corno posterior e nas

terminações periféricas de neurônios aferentes nociceptivos. Já os AINES


atuam perifericamente diminuindo a produção de prostaglandinas, além dos

efeitos periféricos, eles também atuam na região central, possivelmente na

medula espinal, tendo em vista que, as lesões inflamatórias aumentam a

liberação de prostaglandinas na medula, causando facilitação da transmissão

das fibras de dor aferentes para os neurônios de retransmissão no corno

posterior (RANG et al., 2007).

3. 7. Modelos experimentais para avaliação da atividade antinociceptiva

3.7.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético

O teste de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em

camundongos é descrito como um modelo típico de estudo da dor inflamatória,

a ser utilizado como uma triagem para avaliação de analgésicos ou anti-

inflamatórios. Assim, a irritação local que é produzida pela injeção

intraperitoneal do ácido acético provoca a liberação de vários mediadores, tais

como a substância P, bradicininas, prostaglandinas, bem como das citocinas

pró-inflamatórias tais como IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α (PINHEIRO et al., 2011).

O modelo das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético é

um modelo geral, não seletivo, para estudos de drogas antinociceptivas

(COUTO et al., 2011). O ácido acético induz o aumento do nível de PGE2 e

PGF2α no fluido peritoneal, que é responsável pela produção de dor. Por isso,

pode concluir-se que qualquer agente que reduz o número de contorções irá

demonstrar efeito analgésico, por inibição da síntese de prostaglandina, um

mecanismo periférico de inibição da dor (ALI et al., 2012).


3.7.2. Teste da formalina

A injeção subcutânea de formalina, em camundongos, determina o

aparecimento de várias respostas motoras bem caracterizadas, cuja

quantificação permite que se avalie a intensidade da resposta nociceptiva

(LAPA et al., 2003).

Assim, o teste da formalina é um método de avaliação

comportamental utilizado para medir a efetividade de agentes antinociceptivos,

sendo composto por duas fases. A primeira inicia-se logo após a injeção de

formalina e se estende pelos primeiros 5 minutos (dor neurogênica ou aguda),

estando relacionada com a estimulação química direta dos nociceptores das

fibras aferentes do tipo C e, em parte, das fibras do tipo Aδ, está associada à

liberação de aminoácidos excitatórios, óxido nítrico e substância P. A segunda

ocorre entre 15 e 30 min após a injeção de formalina e está relacionada com a

liberação de vários mediadores pró-inflamatórios, como bradicinina,

prostaglandinas e serotonina, entre outros. O intervalo entre a primeira e a

segunda fase (período de quiescência) é resultado de uma inibição da

transmissão nociceptiva através de circuitos supra-espinhais e espinhais

(HUNSKAAR; HOLE, 1987).

3.7.3. Teste da placa quente

O teste da placa quente (hot plate) é utilizado para avaliar a latência

dos animais a estímulos térmicos. Foi inicialmente descrito por Woolfe;

Macdonald (1944) como modelo específico para a detecção de substâncias

analgésicas de efeito central. Neste teste, os animais são colocados

individualmente numa placa quente de temperatura constante (55 ± 0,5 0C) e

após a obtenção dos valores basais os animais são tratados, posteriormente

decorridos 30, 60 e 120 da administração da droga a resposta é novamente

avaliada (CARLINI; MENDES, 2011; LAPA et al., 2003).


O modelo da placa quente avalia a participação de mecanismos

centrais na antinocicepção, sendo seletivo para componentes analgésicos tipo

opióide (PIRES et al., 2004). Este modelo utiliza a temperatura como estímulo

nociceptivo, assim, os nociceptores (fibras C e Aδ, principalmente) são

estimulados após a ativação dos receptores vaniloides, em especial, os

receptores do tipo VR-1, que possuem limiar de ativação em 43 ºC, e os

receptores do tipo VRL-1, que possuem limiar de ativação em 52 ºC. Os

recepetores VR-1 e VRL-1 são importantes na avaliação da resposta a

estímulos térmicos nocivos, permitindo uma resposta quando a temperatura

aumenta (SILVA et al., 2013).

3. 8. Considerações sobre inflamação

A palavra inflamação, ou flogose, tem origem do latim inflamare, ou

do grego phlogos, que significa pegar fogo. A inflamação é considerada um

mecanismo defensivo de relevante importância contra inúmeras agressões,

sendo então, uma reação dos tecidos vascularizados a um agente agressor,

caracterizada morfologicamente pela saída de líquidos e de células do sangue

para o interstício (BRASILEIRO - FILHO, 2009).

A inflamação faz parte de um mecanismo de defesa do hospedeiro

contra os estímulos que causam lesões, mas quando esse processo não é

controlado, pode causar danos ao organismo do indivíduo (DIA et al., 2014). Os

sinais cardinais que identificam a inflamação são: o calor, rubor (vermelhidão),

tumor (edema), dor e a perda da função, dentre os quais os quatro primeiros

foram descritos por Cornelius Celsus (ALESSANDRI et al., 2013). Esses sinais

são aparentes no local em que a reação inflamatória foi induzida o processo

inflamatório pode ser desencadeado por agentes infecciosos, agentes físicos

(radiação, queimadura, trauma), químicos (substâncias cáusticas), isquemia e

interações antígeno-anticorpo. A resposta inflamatória pode ser dividida em

aguda (caracterizada por vasodilatação localizada e aumento da

permeabilidade vascular), subaguda (ocorre a infiltração de leucócitos e células


fagocitárias) e crônica (ocorre degeneração tecidual e fibrose) (CARVALHO,

2004).

A resposta inflamatória ocorre através de uma reação inata,

englobando os eventos ocorridos no local do tecido, e a resposta imune que

tornando a resposta de defesa mais específica. Assim, a reação inata envolve

os eventos que ocorrem localmente no interior dos tecidos e podem ser

divididos em vasculares e celulares (SILVA, 2007).

3.8.1. Eventos vasculares

Os eventos vasculares são de relevante importância, devido à sua

capacidade para promover no local da lesão um aumento na concentração de

mediadores de origem plasmática, dentre eles os componentes do sistema

complemento, da coagulação, do sistema fibrinolítico e das cininas. Esses

eventos compreendem a vasodilatação, com consequente aumento do fluxo

sanguíneo no local, o aumento da permeabilidade vascular e a exsudação

plasmática (SILVA, 2007).

Os fenômenos vasculares são representados por algumas

modificações hemodinâmicas que ocorrem na microcirculação, essas são

conduzidas pelos mediadores liberados durante os fenômenos irritativos

(BRASILEIRO - FILHO, 2009). Inicialmente, após a ocorrência de uma lesão,

ocorre a vasodilatação, que é caracterizada por vermelhidão e ardor no local da

lesão. Essa vasodilatação ocorre com o propósito de facilitar a migração de

mediadores e células inflamatórias para o local da lesão tissular (SHERWOOD;

TOLIVER-KINSKY, 2004).

A vasodilatação arteriolar é produzida por ação da histamina e

mantida por prostaglandinas, leucotrienos e PAF, aumentando assim, o fluxo

de sangue para a área agredida. Em seguida, as vênulas menores dilatam-se e

as maiores sofrem pequena constrição, aumentando a pressão hidrostática na

microcirculação. Concomitantemente com o aumento da permeabilidade

vascular, ocorre a exsudação de plasma para o interstício, promovendo a


hemoconcentração local e o aglomeramento das hemácias, tornando o sangue

mais viscoso e a circulação mais lenta (BRASILEIRO - FILHO, 2009).

As alterações vasculares na inflamação dependem do equilíbrio de

forças para direcionar o líquido para o interior do espaço vascular ou para fora

dele, tais como: pressão hidrostática, pressão oncótica, pressão osmótica e

fluxo linfático (HANSEL; RENEE, 2007). Assim a resposta inflamatória

desempenha um papel importante na regulação do sistema vascular,

integrando diversas respostas mecânica e bioquímica, liberando substâncias

vasoativas, citocinas, fatores de crescimento e hormônios (ALLER et al., 2007).

3.8.2. Eventos celulares

Os eventos celulares são desencadeados com o propósito de

promover a saída de leucócitos do leito vascular para o local em que ocorreu a

inflamação. Esse fenômeno ocorre simultaneamente com os eventos

vasculares e segue algumas fases como captura, rolamento dos leucócitos

pelo endotélio, adesão firme e transmigração (SILVA, 2007).

Nesse sentindo, a partir de respostas da imunidade inata e

adaptativa ocorre à migração de leucócitos para o sítio de inflamação. A

migração de neutrófilos, monócitos e células “natural killer” é iniciada através

de respostas inatas e pela origem de mediadores inflamatórios no local, tais

como, quimiocinase, citocinas específicas e a partir da imunidade adaptativa

através da migração de Linfócitos T para o local da inflamação

(NOURSHARGH; MARELLI-BERG, 2005).

O processo de migração se inicia quando os leucócitos ocupam a

periferia do vaso, sendo em seguida capturados, aderindo frouxamente ao

endotélio e deslocando-se sobre a superfície endotelial (fenômeno de captura e

rolamento), posteriormente são ativados e aderem firmemente ao endotélio

(fenômeno da adesão), e finalmente, migram através da parede das vênulas,

passando entre as células endoteliais (migração). A captura, o rolamento e a

adesão dos leucócitos são mediados por moléculas de adesão na superfície do

endotélio e dos leucócitos, naturalmente expressas na membrana ou com


expressão aumentada após ativação do endotélio ou leucócito. Assim, as

moléculas de adesão existentes no endotélio são ICAM-1 e 2, VCAM-1, CD31,

selectinas e as JAM-3 (BRASILEIRO – FILHO, 2009).

A migração de leucócitos a partir do sistema vascular ocorre através

de um processo de múltiplos passos, ditada pela ativação sequencial de

proteínas adesivas e os seus ligantes nos leucócitos e no endotélio das células.

Os monócitos, os linfócitos e os leucócitos polimorfonucleares migram por

mecanismos semelhantes, diferindo apenas em suas respostas (WAGNER;

ROTH, 2000).

3.8.3. Mediadores químicos

A reação inflamatória é resultado da produção no local de origem do

processo inflamatório de inúmeros mediadores, a partir de fontes humorais ou

celulares. Esses mediadores químicos são os responsáveis pela uniformidade

quase estereotipada da reação inflamatória, independente da natureza do

agente agressor (CARVALHO, 2004).

Vários mediadores são liberados no tecido lesionado, incluindo o

citocinas, quimiocinas, eicosanoides, aminas biogênicas, neuropeptídeos, entre

outros. No local da inflamação, esses mediadores exercem efeitos vasculares,

tais como, a vasodilatação, estase vascular e aumento da permeabilidade

vascular, promove a migração de leucócitos da circulação para o tecido

inflamado e coordena as respostas de defesa (ROTH et al., 2009).

Nesse sentindo, os mediadores devem ser liberados nos momentos

certos para que os fenômenos subsequentes atinjam o objetivo de defesa

(eliminação ou contenção da agressão) e de reparo (regeneração ou

cicatrização), havendo uma cronologia adequada para que os mecanismos pró-

inflamatórios antecedam os anti-inflamatórios, possibilitando que a inflamação

aconteça e seja resolvida ou terminada (BRASILEIRO - FILHO, 2009).

Assim, os principais mediadores pró-inflamatórios são: histamina

(receptores H1), PAF, bradicinina, prostaglandinas, Leucotrienos, taquicininas,

IL-1, TNFα, IL-17, IFNϒ, anafilatoxinas e as proteases plasmina e tripsina. Os


principais mediadores anti-inflamatórios são: histamina (receptores H2),

prostaglandinas e tromboxanos A2, lipoxinas, resolvinas D e E, neuroproteínas,

acetilcolina, IL-10, TGFβ, antiproteases: α1-antitripsina e α2-macroglobulina,

glicocorticoides e endorfinas (BRASILEIRO - FILHO, 2009).

Após o reconhecimento dos estímulos inflamatórios os mediadores

liberam uma cascata de citocinas, as quais desempenham um papel essencial

no desenvolvimento da dor inflamatória, bem como outros eventos

inflamatórios. As citocinas participantes no processo inflamatório após uma

lesão são: o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), responsável por promover a

liberação de outras citocinas, destacando-se a interleucina 1-beta (IL-1β), que

promove a produção de prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos e a

interleucina 8 (IL-8) (BASBAUM; JULIUS, 2006; VERRI et al., 2006).

3.9. Drogas anti-inflamatórias

3.9.1. Anti-inflamatórios não esteroides

As terapias anti-inflamatórias têm focado em estratégias para reduzir

ou neutralizar a ação dos mediadores pró-inflamatórios, bem como inibir o

recrutamento e ativação de leucócitos (ALESSANDRI et al., 2013). Dentre eles,

destacam-se os AINEs, esses estão entre os mais usados de todos os

fármacos. Seus principais efeitos terapêuticos são: anti-inflamatório

(modificação da reação inflamatória), analgésico (redução da dor inflamatória)

e antipirético (redução da temperatura corporal patologicamente elevada)

(RANG et al., 2007).

Os anti-inflamatórios não-esteroides interferem na síntese de

prostaglandinas e leucotrienos, e são excelentes bloqueadores da dor e do

edema inflamatório, mas com menor ação na exsudação celular. São

conhecidos dois grupos: os inibidores da COX-1 e inibidores da COX-2. Os

inibidores da síntese de leucotrienos têm seus receptores utilizados como anti-


inflamatórios nos casos de inflamações alérgicas, principalmente asma

(BRASILEIRO - FILHO, 2009).

O principal mecanismo de ação dos AINEs é a inibição da COX, e

consequentemente das prostaglandinas. Estas provocam vasodilatação,

eritema e hiperalgia quando liberadas em resposta ao trauma. O eritrema e o

edema resultam da propriedade vasodilatadora da PGE2 e da PGI2, principais

produtos da COX-2 do macrófago e do endotélio vascular, os efeitos anti-

inflamatórios decorrem da inibição da COX-2 e da síntese de PGE2 e PGI2

pelos macrófagos e pelo endotélio vascular (SAKATA, 2008).

A COX é responsável pela conversão de ácido araquidônico a

prostaglandinas, tromboxanos e outros mediadores lipídicos envolvidos na

inflamação. Os efeitos anti-inflamatórios dos AINEs são decorrentes da sua

capacidade de inibir a forma indutível da COX (isto é, a COX-2). A forma

constitutiva da enzima, a COX-1, é responsável pela produção de

prostaglandinas envolvidas na citoproteção gástrica, na agregação plaquetária

e na auto-regulação do fluxo sanguíneo renal. Por conseguinte, os AINEs, que

inibem tanto a COX-1 e COX-2 (por exemplo, o ASS) podem resultar tanto em

uma diminuição de inflamação e os efeitos colaterais de comprometimento de

plaquetas, renais e as funções gastrointestinais (WAGNER; ROTH, 2000).

No intuito de diminuir os efeitos colaterais dos anti-inflamatórios

convencionais, manter suas propriedades analgésicas e anti-inflamatórias, os

inibidores seletivos da COX-2 foram formulados. Esses, em sua dose

terapêutica, inibem apenas a isoforma COX-2, sem interferência na atividade

COX-1, os coxibes, como por exemplo, o rofecoxibe®, etoricoxibe®,

lumiracoxibe® e firocoxibe® (LEES et al., 2004; SAKATA, 2008).

3.9.2. Anti-inflamatórios esteroides

Os corticosteroides são hormônios esteroides sintetizados pela

cortex da adrenal, exercendo efeito sobre muitos sistemas orgânicos, bem

como possuindo ação anti-inflamatória (SAKATA, 2008). De forma primária, a

produção de glicocorticoides é regulada pelo hormônio adrenocorticotrófico


(ACTH). Os corticoides podem ser divididos em duas classes principais, os

mineralocorticoides, assim denominados por estarem envolvidos com a

regulação do equilíbrio de íons, e os glicorticoides, que participam da regulação

do metabolismo de carboidratos e de outras vias metabólicas (POIAN;

CARVALHO-ALVES, 2006).

Os corticosteroides possuem efeito analgésico intrínseco, tornando-

os úteis no combate à dor aguda ou crônica. A prescrição dessa classe de

medicamentos torna-se especial em situações nas quais o processo

inflamatório se manifesta como importante agente patogênico da dor em

questão, ou seja, nas dores reumáticas, naquelas associadas aos traumas, em

algumas dores neuropáticas, em dores causadas por tumores e em especial

nas de acometimento ósseo, entre outras situações (SAKATA, 2008).

Os glicocorticoides atuam por vários mecanismos no processo

inflamatório, dentre eles: estabilizam membranas, diminuindo a fagocitose e a

exocitose dos fagócitos; reduzem a permeabilidade vascular e a ativação de

células endoteliais, bloqueando parcialmente a expressão de moléculas de

adesão e têm ação antifibrogênica (BRASILEIRO - FILHO, 2009).

Os glicocorticoides inibem as citocinas pró-inflamatórias, como as

interleucinas IL2 e IL12, o interferon gama (INFg) e o fator de necrose tumoral,

bem como moléculas de adesão, como a lipocortina-1, moléculas de adesão

vascular (VCAM-1) e moléculas de adesão intercelular (ICAM) e enzimas,

como a sintase induzida pelo óxido nítrico (INOS), a ciclooxigenase (COX 2) e a

fosfolipase (A2). No processo inflamatório, os glicocorticoides produzem ação

moduladora sobre a taxa de expressão de fatores de transcrição, como o fator

nuclear kappa B (NFkB), proteína inibidora do NFkB (IkB) e a proteína quinase

do IkB (IKK), além dos efeitos genômicos dos glicocorticoides, os quais

determinam redução da ação histamínica, diminuição da síntese de

prostaglandinas e da ativação do plasminogênio (LONGUI, 2007). Os glicocorticoides suprimem a expressão da COX 2, promovem a

inibição da fosfolipase A2, bloqueiam a liberação de ácido araquidônico e

consequentemente da síntese de prostaglandinas mediada pela COX 2. Esses

efeitos contribuem para as ações anti-inflamatórias dos glicocorticoides

(GILMAN et al., 2006; HANSEL; DINTZIS, 2007).


Os glicocorticoides possuem um amplo espectro de indicações

terapêuticas e dignósticas, podendo ser utilizados de forma substitutiva em

casos de insuficiência adrenocortical ou no diagnóstico de doenças como a

síndrome de Cushing, além de serem empregados no tratamento agudo da

hipoglicemia e da hipercalcemia. Esses também induzem a maturação celular

(pneumócito tipo II), a diferenciação celular (linhagens da crista neural) e a

morte celular por apoptose, o que permite seu uso no tratamento de tumores,

especialmente os de linhagem hematopoiética. Os glicocorticoides têm papel

central no tratamento de doenças, nas quais estejam envolvidos mecanismos

imunes e inflamatórios (LONGUI, 2007).

É importante ressaltar, que o uso prolongado dos glicocorticoides

constitui num fator de risco elevado. Os efeitos adversos são geralmente mais

graves quando o uso é sistêmico, quando comparado com o uso tópico. Os

principais efeitos adversos são: a cicatrização retardada, o aparecimento de

petéquias e eritemas na pele, acne, glaucoma, osteoporose e outros

(SCHACKE et al., 2002).

3.10. Modelos experimentais para avaliação da atividade anti-inflamatória

3.10.1. Edema de pata induzido por carragenina

O edema é ocasionado pela injeção subcutânea de carragenina na

pata de ratos ou camundongos, que promove o aumento agudo e progressivo

do volume da pata injetada. Esse edema é proporcional à intensidade da

resposta inflamatória, constituindo um parâmetro útil na avaliação da atividade

anti-inflamatória de novos compostos (LAPA et al., 2003).

Na atividade anti-inflamatória avaliada pelo modelo, o edema é

induzido pela administração de 0,1 mL/animal de carragenina 1% na região

subplantar do camundongo. O volume é mensurado pelo aparelho de

hidroplestismômetro no tempo de 0 e intervalos de 1, 2, 3, 4 e 5 horas após a

injeção. O modelo experimental demonstra um elevado grau de


reprodutibilidade. A resposta inflamatória induzida pela carragenina é

caracterizada por uma resposta bifásica com formação de edema acentuado

resultante da produção rápida de vários mediadores inflamatórios, tais como

histamina, serotonina e bradicinina (primeira fase), e subsequentemente

liberação de prostaglandinas e óxido nítrico (segunda fase), com pico em 3 h,

produzido pela COX 2 e óxido nítrico sintase (iNOS), respectivamente

(THOMAZZI et al., 2010).

3.10.2. Edema de orelha induzido por óleo de cróton

O modelo de edema induzido na orelha de camundongos, através da

administração do óleo de cróton, é utilizado para avaliar a atividade de agentes

anti-inflamatórios de uso tópico, bem como anti-inflamatórios esteroides de uso

sistêmico. Primeiramente o anti-inflamatório é aplicado topicamente nas

orelhas dos camundongos e, após um período de absorção (geralmente 1 h)

aplica-se na orelha direita o agente irritante diluído em acetona, enquanto a

orelha esquerda é tratada apenas com o veículo. O edema é medido através

da diferença de peso entre as orelhas (LAPA et, al., 2003).

O edema de orelha induzido por óleo de cróton representa um

modelo usado para estudar atividade anti-inflamatória de drogas esteroides e

não esteroides. No teste são aplicados topicamente 10 µL de óleo de cróton

(2,5% em acetona), tendo como controle a orelha contralateral administrado

com o mesmo volume de acetona. Após 4 h os animais devem ser sacrificados

e removidos discos de 5 mm de diâmetro das orelhas e pesados. A diferença

entre o peso das orelhas é tomada como o edema induzido por óleo de cróton

(BRAGGIO et al., 2002).


3.10.3. Peritonite induzida por carragenina

O modelo de peritonite induzida pela injeção intraperitoneal (i.p.) de

carragenina permite avaliar drogas anti-inflamatórias. A injeção i.p. de

carragenina induz a migração de leucócitos para o local, cuja quantificação

permite avaliar a influência de drogas no desenvolvimento deste parâmetro da

resposta inflamatória, sendo sensível a anti-inflamatórios esteroides, além da

presença de vários mediadores inflamatórios pode ser avaliada e dosada no

exsudato inflamatório assim obtido (LAPA et al., 2003).

O recrutamento de células durante a inflamação depende da

liberação de mediadores locais, que são responsáveis pelas alterações

vasculares no local do processo inflamatório, bem como pelo recrutamento das

células de defesa. A inflamação induzida pela carragenina envolve a migração

celular, a exsudação e a produção de mediadores plasmáticos, tais como NO,

prostaglandina E2, a IL-1β, IL-6 e TNF-α. Esses mediadores são responsáveis

por recrutar neutrófilos (THOMAZZI et al., 2010).


4. PARTE EXPERIMENTAL


4. PARTE EXPERIMENTAL

4.1. Material vegetal

4.1.1 Coleta de Cnidoscolus quercifolius Pohl

As folhas e cascas de Cnidoscolus quercifolius Pohl foram coletadas

no município Petrolina, na Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária -

Embrapa Semiárido, em fevereiro de 2012, em uma área de Caatinga dentro

da instituição, cujas coordenadas geográficas são: latitude 09003’55,30’’’

longitude 040020’06,90’’’ e altitude 374 m. O material foi identificado pelo

engenheiro florestal Dr. Viseldo Ribeiro de Oliveira da EMBRAPA. Uma

exsicata da espécie foi depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF)

da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) sob a

identificação de número 19202 (Figura 5).

Figura 5. Exsicata de Cnidoscolus quercifolius Pohl coletada em Petrolina-PE.


4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto das folhas de Cnidoscolus

quercifolius Pohl

O material vegetal (folhas e cascas) foi dessecado em estufa com ar

circulante à temperatura média de 40 °C por um período de 72 horas. Após a

secagem e completa estabilização (eliminação de água, inativação de enzimas,

etc.) o material foi pulverizado em moinho, obtendo-se um material vegetal

seco e pulverizado (folhas – 0,482 kg; cascas – 1,481 kg).

O material seco e pulverizado foi submetido à maceração exaustiva

com etanol 95% em um percolador. Foram realizadas várias extrações com

intervalos de 72 hs entre cada extração até completo esgotamento da droga. A

solução extrativa obtida passou por um processo de destilação do solvente em

evaporador rotativo à pressão reduzida a uma temperatura média de 50 °C.

Após este processo de evaporação do solvente, obteve-se o extrato

etanólico bruto de Cnidoscolus quercifolius (Cq-EtOH). A partir de 0,482 kg do

pó seco das folhas foi obtido 0,063 kg do extrato etanólico bruto das folhas de

Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH) (13,07% de rendimento em relação ao

peso seco da planta), enquanto a partir de 1,481 kg do pó seco das cascas foi

obtido 0,392 kg do extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus

quercifolius (Cqc-EtOH) (26,46% de rendimento em relação ao peso seco da

planta).

4.3. Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos de

Cq-EtOH

A presente avaliação fitoquímica é uma triagem, cujo objetivo é

sistematizar e/ou rastrear, os principais grupos de constituintes químicos que

compõem um extrato vegetal. Trata-se de um exame rápido e superficial

através de reagente de coloração ou precipitação que revela a presença de

metabólitos secundários em um extrato. Essa triagem fitoquímica preliminar,

com o intuito de estabelecer a possível natureza química dos compostos


existentes foi realizada com o extrato etanólico bruto das cascas e folhas da

espécie Cnidoscolus quercifolius. Foram realizados testes para as classes

específicas de constituintes químicos, tais como saponinas, esteroides,

alcaloides, flavonoides e taninos.

A análise qualitativa dos grupos fitoquímicos presentes no extrato

etanólico bruto das cascas e folhas de C. quercifolius, foram avaliados em

placas de cromatografia em camada delgada de gel de sílica 60 F254 com

suportes de alumínio, aplicada com uma micropipeta, e eluiu-se em diferentes

sistemas de solventes, conforme descritos em Wagner; Bladt (1996), buscando

destacar os principais grupos de metabólitos secundários (Quadro 1).


Quadro 1. Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os

principais metabólitos secundários da espécie Cnidoscolus quercifolius

(Euphorbiaceae).

Adaptado de Wagner; Bladt, 1996.

Classe química Sistema eluente Revelador

Alcaloides Tolueno: acetato de etila:

dietilamina (70:20:10)

Dragendorff

Antocianinas Acetato de etila: ácido

fórmico: ácido acético glacial:

água (100:11:11: 26)

anisaldeído

sulfúrico

Cumarinas Tolueno: éter etílico (1:1

saturado com ácido acético a

10%)

KOH etanólico

10%

Derivados

Antracênicos

Acetato de etila: metanol:

água (100:13,5:10)

KOH etanólico

10%

Flavonoides Acetato de etila: ácido

fórmico: ácido acético glacial:

água

(100: 11: 11: 26)

NEU

Lignanas Clorofórmio: metanol: água

(70:30:4)

Vanilina fosfórica

Mono e diterpenos Tolueno: acetato de etila

(93:7)

Vanilina sulfúrica

Naftoquinonas Tolueno: ácido fórmico (99:1) KOH etanólico

10%

Saponinas Clorofórmio: ácido acético:

metanol: água (64:32:12:8)

Anisaldeído

sulfúrico

Triterpenos e

esteroides

Tolueno: clorofórmio: etanol

(40:40:10)

Lieberman-

Burchard


4.4. Animais

Para os testes farmacológicos foram utilizados camundongos albinos

Swiss (Mus musculus) machos e de ambos os sexos para o teste de toxicidade

aguda, pesando entre 30–40 g, todos provenientes do Biotério Setorial da

UNIVASF, Campus Petrolina. Antes dos experimentos, todos os animais foram

mantidos em gaiolas de polipropileno com ventilação e temperatura (22 ± 2 °C)

controladas, em um ciclo claro-escuro de 12/12 h, com a fase de luz iniciando

às 6:00 e terminando às 18:00 hs, com livre acesso à ração tipo “pellets”

(Labina®) e água (disponível em frascos de plástico com bicos apropriados).

Antes dos experimentos os animais foram privados de alimento por 12 hs e

transferidos do Biotério para o laboratório de fisiologia 48 horas antes do

experimento.

No período de adaptação os animais apenas foram manipulados

durante a limpeza das caixas. Todos os procedimentos foram conduzidos de

acordo com os princípios éticos na experimentação animal, sendo aprovados

pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal

do Vale do São Francisco - UNIVASF sob o número 0030/82012.

4.5. Testes de atividade antinociceptiva

4.5.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético

Baseado no método descrito Collier et al. (1968) com algumas

adaptações o teste das contorções abdominais foi realizado, com o objetivo de

avaliar o Cqc-EtOH e o Cqf-EtOH. Assim, foram utilizados seis grupos com seis

camundongos para cada extrato (Cqc-EtOH e Cqf-EtOH).

A resposta nociceptiva foi induzida através da administração de

ácido acético via intraperitoneal (i.p.) em volume de 0,1 mL/10 g. Os

camundongos foram tratados com Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg i.p.) ou


Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg i.p.) e os animais do grupo controle negativo

receberam solução fisiológica 0,9% administrados por via intraperitoneal (i.p.)

30 minutos antes da administração do ácido acético. A Indometacina (20mg/kg)

e a morfina (10 mg/kg) foram usados como drogas padrões, sendo

administradas por i.p. 30 minutos antes do agente indutor da nocicepção.

O movimento de contorção abdominal é uma resposta caracterizada

pela contração e rotação do abdomem, seguida pela extensão de uma ou

ambas as patas traseiras. As contorções foram registradas entre 5 - 15 min

após a administração do ácido acético por via intraperitoneal (i.p.) (LAPA et al.,

2003).

Figura 6. Camundongo observado no teste de contorções abdominais após a

injeção do ácido acético.

4.5.2. Teste da formalina

Foi utilizado o método descrito por Hunskaar; Hole (1987), com

algumas adaptações. A nocicepção foi induzida através da administração da


solução de formalina (2,5% em salina 0,9%) por via subplantar (s.p.) na pata

posterior direita, em um volume de 20 μL/pata. Foram utilizados seis

camundongos em seis grupos para cada extrato. Os animais foram tratados

com Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg), Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg),

veículo (salina), indometacina (20 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) todos por i.p. 60

minutos antes da injeção da formalina.

Os camundongos foram observados em uma câmara com um

espelho montado em três lados para permitir a visão das patas, e o tempo (em

segundos) gasto lambendo e mordendo a pata injetada foi medido como um

indicador de dor (Figura 7) (ALMEIDA et al., 2011). As respostas nociceptivas

causadas pela formalina são bifásicas, sendo divididas em uma primeira fase,

que ocorre durante os 5 min iniciais e, uma segunda fase, que acontece entre

15 e 30 min após a injeção de formalina. A primeira fase é descrita como

neurogênica, é ativada pelas fibras do tipo C. A segunda fase possui caráter

mais prolongado, sendo atribuída à liberação de mediadores inflamatórios

(CARLINI; MENDES, 2011).

Figura 7. Camundongo observado no teste da formalina.


4.5.3. Teste da placa quente

No teste da placa quente os camundongos foram divididos em cinco

grupos com seis animais cada para cada extrato. Os mesmos foram

previamente selecionados 24 horas antes do teste, no aparelho de placa

quente (Insight, Brasil), na temperatura de 55 ± 0,5 °C. Assim, aqueles animais

que apresentaram um tempo de reação (definido como latência para levantar

ou lamber as patas) maior que vinte segundos foram automaticamente

excluídos.

Os animais que foram selecionados receberam o pré-tratamento

com Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg i.p.), Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg

i.p.), veículo (salina i.p.) e morfina (10 mg/kg i.p.). No teste os animais são

colocados individualmente numa placa quente de temperatura constante

(55± 0,5 °C) (Figura 8) e o tempo de latência foi medido em 30, 60, 90 e 120

min após os pré-tratamentos (LAPA, et al., 2003; KURIAN, R. et al., 2006). No

intuito de proteger o animal de possíveis lesões teciduais, foi escolhido um

tempo de corte de 20 s.

Figura 8. Camundongo observado no teste da placa quente.


4.6. Teste de coordenação motora

4.6.1. Teste do rota-rod

Os animais utilizados foram previamente selecionados 24 hs antes

da realização do teste. Aqueles que permaneceram por um período igual a

180 s estavam aptos para participar do teste (ALMEIDA, 2006). Os

camundongos que foram selecionados receberam o tratamento com Cqc-EtOH

(100, 200 e 400 mg/kg i.p.), Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg i.p.), veículo

(salina i.p.) e diazepam (2,5 mg/kg i.p.). Assim, os camundongos foram

divididos em cinco grupos com seis animais para cada extrato.

Os animais foram colocados na barra giratória de 2,5 cm de

diâmetro girando a 7 rotações por minuto – R.P.M. (Figura 9), em seguida foi

registrado o tempo de permanência do animal na barra giratória (em

segundos), com três reconduções, no máximo, à barra (LAPA et al., 2003).

Figura 9. Camundongos observados no teste do rota-rod.


4.7. Testes de atividade anti-inflamatória

4.7.1. Migração de leucócitos na cavidade peritoneal

Para a realização do teste foram utilizados cinco grupos com seis

animais para cada extrato. Os animais receberam Cqc-EtOH (100, 200 e

400 mg/kg i.p.), Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg i.p.), veículo (salina i.p.) e

dexametasona (2 mg/kg, i.p.) e após 30 min receberam a solução de

carragenina (i.p.) (LAPA et al., 2003).

Os animais foram eutanasiados 4 hs após o estímulo e a migração

de leucócitos foi avaliada, sendo colhidas as células da cavidade peritoneal

com 3 mL de solução salina contendo 1 mM de EDTA. Imediatamente, uma

breve massagem foi realizada, e em seguida foi coletado o fluido peritoneal,

que foi centrifugado (3000 R.P.M. por 6 min) em temperatura ambiente. O

sobrenadante foi descartado e 300 μL de EDTA foi adicionado ao precipitado,

do qual foi retirado uma alíquota de 10 μL. Foi adicionado 200 μL de solução

de Turk à alíquota e o total de células foi contado em uma câmara de

Neubauer, em um microscópio óptico. Os resultados foram expressos como

número de leucócitos/mL (MELO et al., 2011).

4.7.2. Edema de pata induzido por carragenina

O teste do edema de pata induzido por carragenina 2% consiste em

injetar um volume de 20 μL/animal na região subplantar (s.p.), da pata direita

do camundongo (WINTER; RISLEY; NUSS, 1962). Posteriormente, para avaliar

a medida do volume das patas é necessário imergir a pata direita até o maléolo

lateral em um hidropletismômetro elétrico (PanLab LE 7500, Espanha)

(Figura 10) (LAPA et, al., 2003).

Os camundongos foram divididos em cinco grupos de seis animais

para cada extrato. Os animais foram tratados com Cqc-EtOH (100, 200 e


400 mg/kg i.p.), Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg i.p.), veículo (salina) e

indometacina (20 mg/kg) todos por i.p. 30 minutos antes da injeção da

carragenina. Antes da administração da carragenina (s.p.), foi avaliado o

volume basal da pata, posteriormente as medidas foram realizadas em 1, 2, 3,

4 e 5 horas (HUANG et al., 2012). Finalmente, para calcular a inibição do

edema, o volume da pata direita após a injeção da carragenina (VB) foi

subtraído pelo volume da pata direita anterior à injeção da carragenina (VA) e

dividido pelo (VA), pela seguinte fórmula: (VB-VA)/VA.

Figura 10. Volume da pata mensurado utilizando o aparelho pletismômetro no

modelo do edema de pata induzido por carragenina.


4.8. Toxicidade aguda

No intuito de investigar a toxicidade aguda, os camundongos foram

divididos em seis grupos de 6 machos e 6 fêmeas (n = 12). Assim, o grupo

controle recebeu o veículo (salina), os demais grupos receberam pré-

tratamento com Cqc-EtOH e Cqf-EtOH, na dose de 2,0 g/kg e 5,0 g/kg por via

intraperitoneal e via oral, respectivamente. Posteriormente, os animais foram

observados durante 14 dias para avaliar a presença de mortes e sinais de

toxicidade. Outros parâmetros tais como: peso corporal, consumo de alimento

e água foram avaliados diariamente, durante todo o estudo.

4.8.1. Análise comportamental

A análise comportamental foi realizada seguindo metodologia

descrita por Almeida et al. (1999), baseado na observação de alguns

parâmetros específicos (piloereção, ptose palpebral, contorções abdominais,

convulsões, catatonia, tremores, paralisia das patas dianteiras, sedação,

ambulação aumentada, resposta ao toque diminuída, movimentação intensa

das vibrissas, agressividade, estereotipia e analgesia), logo após a

administração de Cq-EtOH. No primeiro dia, tais parâmetros foram avaliados

nos tempos de 0,5, 1, 2, 3 e 4 h após administração do extrato. Nos demais

dias, a avaliação comportamental foi feita diariamente até o último dia da

toxicidade aguda.

4.8.2. Análises de parâmetros hematológicos e bioquímicos

Os parâmetros hematológicos e bioquímicos sanguíneos foram

avaliados seguindo a metodologia descrita por Vasconcelos et al. (2007) e

Araújo et al. (2008) com modificações. O sangue foi retirado através do plexo

braquial para análise laboratorial dos parâmetros hematológicos: contagem de


eritrócitos (106/mm3), hemoglobina (g/dL), hematócrito (%), volume corpuscular

médio (VCM, μ3), hemoglobina corpuscular média (HCM, g), concentração de

hemoglobina corpuscular média (CHCM,%), leucócitos (103/mm3), linfócitos

(%), monócitos (%) e plaquetas (103/mm3). Os parâmetros bioquímicos

analisados em amostras de soro foram glicose (mg/dL), colesterol (mg/dL),

triglicérides (mg/dL), AST/TGO (U/L), ALT/TGP (U/L), uréia (mg/dL) e creatinina

(mg/dL). As amostras foram levadas para laboratórios privados do município de

Petrolina-PE.

4.8.3. Análise histopatológica dos órgãos

Foram retirados fragmentos (medindo aproximadamente: 1,0 cm

x 1,0 cm) dos seguintes órgãos: rim, fígado, pâncreas, pulmão, baço, coração

e estômago, lavados imediatamente em solução salina (soro fisiológico) e a

seguir para se proceder à fixação os mesmos foram imersos em solução de

formol tamponado a 10% (tampão fosfato 0,1 M pH 7,2) por 12 h. A seguir, os

fragmentos foram imersos em álcool a 70% e transportados ao Laboratório de

Biologia Celular, Histologia e Citologia, no Campus de Ciências Agrárias da

UNIVASF. Os tecidos (rim, fígado e pâncreas) foram escolhidos para realizar a

análise histopatológica, devido apresentarem alterações macroscópicas

importantes. Esses foram desidratados em concentrações crescentes de etanol

(Dinâmica, São Paulo, Brasil), clarificados em xileno (Dinâmica, São Paulo,

Brasil) e inclusos em parafina (Dinâmica, São Paulo, Brasil). Em seguida,

secções de 5 µm de cada bloco foram cortados em micrótomo (EasyPath, São

Paulo, Brasil) montadas em lâminas de vidro e coradas pelo método HE

(Hematoxilina-Eosina). A análise histopatológica foi realizada pela docente do

Colegiado de Ciências Farmacêuticas Dra Rosemairy L. Mendes.


4.9. Análise estatística

Os dados obtidos foram analisados através do programa GraphPad

Prism, versão 4.0, e expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m.).

Diferenças estatisticamente significativas entre os grupos foram calculadas

pela aplicação de uma análise de variância (ANOVA) one-way seguido do teste

de Dunnett, ou pelo teste t de Student não pareado, conforme exigido pelo

protocolo experimental. Foram considerados significativos valores de p < 0,05.


5. RESULTADOS


5. RESULTADOS

5.1. Triagem fitoquímica

A análise fitoquímica preliminar (Tabela 1) indicou reação positiva

para presença de cumarinas, flavonoides, monoterpenos/diterpenos e

naftoquinonas no Cqc-EtOH, enquanto, o Cqf-EtOH demonstrou reação

positiva para cumarinas, derivados antracênicos, flavonoides, lignanas e

triterpenos/esteroides. Não foram detectados no Cqc-EtOH os seguintes

constituintes: alcaloides, antocianinas, derivados antracânicos, lignanas,

saponinas e triterpenos/esteroides. O Cqf-EtOH evidenciou reação negativa

para alcaloides, antocianinas, monoterpenos/diterpenos, naftoquinonas e

saponinas.

Tabela 1. Identificação das principais classes de constituintes químicos

presentes no extrato etanólico bruto das cascas e folhas de Cnidoscolus

quercifolius (Euphorbiaceae).

Classe Química Cqc-EtOH Cqf-EtOH

Alcaloide - -

Antocianinas - -

Cumarinas ++ +

Derivados Antracênicos - +

Flavonoides ++ +

Lignanas - +

Monoterpenos/diterpenos + -

Naftoquinonas + -

Saponinas - -

Triterpenos/esteroides - +++

(-): ausência do constituinte, (+): leve presença do constituinte, (++): moderada

presença do constituinte, (+++): intensa presença do constituinte.


5.2. Resultados da atividade farmacológica do extrato das cascas de

Cnidoscolus quercifolius

5.2.1 Atividade antinociceptiva do extrato das cascas de


5.2.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético

Os resultados mostrados na Figura 11 demonstram que a

administração do Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) proporcionou a

inibição das contorções induzidas pelo ácido acético quando comparados com

grupo controle (p<0,01). As porcentagens de inibição foram de 83,7%, 81,4% e

88,1%, respectivamente. Os fármacos indometacina e morfina apresentaram

89,6% e 100%, respectivamente, de redução de contorções quando

comparados com o controle. Não houve diferença estatística entre as doses de

Cqc-EtOH, quando comparadas entre si (p<0,01).

Figura 11: Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto das cascas de

Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), indometacina

(20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), no teste das contorções abdominais em

camundongos. Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n=6.

**p < 0,01 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo

teste de Dunnet).

Controle 100 200 400 INDO MORF0

10

20

30

Cqc-EtOH (mg/kg)

** **** **

**

Nú

mero

de c

on

torç

ões


5.2.1.2 Teste da formalina

O tempo de lambida da pata diminui significativamente com o pré-

tratamento com Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.), quando comparado ao

grupo controle em ambas as fases (p<0,01) no teste da formalina (Figura 12).

As porcentagens de inibição para Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) na

primeira fase foram de 31,62%, 51,10% e 68,33%, respectivamente. Já na

segunda fase as porcentagens foram de 66,08%, 78,26% e 73,97%,

respectivamente. O fármaco padrão morfina reduziu em ambas as fases o

estímulo da dor (p<0,01), enquanto a indometacina inibiu apenas na segunda

fase o estímulo da dor. Assim, houve diferença significativa entre as doses de

Cqc-EtOH na primeira e na segunda fase (p< 0,01).



Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), indometacina

(20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), na primeira e segunda fase do teste da

formalina em camundongos. Valores são expressos em média ± erro padrão da

média, n=6. *p<0,05, **p<0,01, significativamente diferente do grupo controle

(ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).


10

20

30

40

50

60

Primeira Fase

**

**

**

*

Cqc-EtOH (mg/kg)

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)


50

100

150

200

Segunda fase

****

****

**

Cqc-EtOH (mg/kg)

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)

a)

b)


5.2.1.3 Teste da placa quente

Os resultados demonstrados na Figura 13 apontam que no teste da

placa quente, os animais tratados com Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.)

não mostraram aumento no tempo de latência, assim não houve diferença

significante, com exceção da dose de 400 mg/kg no tempo de 30 min que

aumentou o tempo de latência (p<0,05). Os animais tratados com a morfina

(10 mg/kg) demonstraram um aumento significativo no tempo de latência em

30, 60, 90 e 120 min (p<0,05).

30 60 90 1200

5

10

15

20Controle

Cqc-EtOH 100 mg/kg

Cqc-EtOH 200 mg/kg

Cqc-EtOH 400 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

**

*

*

*

*

Tempo (min)

Tem

po d

e L

atê

ncia

(s)


Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), morfina

(10 mg/kg), no teste da placa quente em camundongos. Valores são

expressos em média ± erro padrão da média, n=6. *p<0,05, **p<0,01,

significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de

Dunnet).


5.2.2. Avaliação da coordenação motora do extrato das cascas de


5.2.2.1 Teste do rota-rod

Não houve alteração no tempo de permanência na barra giratória

para os animais que receberam o pré-tratamento com Cqc-EtOH (100, 200 e

400 mg/kg, i.p.) em relação ao grupo controle (Figura 14). Já o fármaco padrão

utilizada, diazepam (2,5 mg/kg) reduziu o tempo de permanência dos animais

na barra giratória significativamente (p<0,01). Não houve diferença significativa

entre as doses de Cqc-EtOH quando comparadas entre si (p<0,05).

Figura 14: Avaliação da coordenação motora do extrato etanólico bruto das

cascas de Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg),

diazepam (2,5 mg/kg), no teste de rota-rod em camundongos. Valores são

expressos em média ± erro padrão da média, n=6. **p<0,01 significativamente

diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).

0

50

100

150

200Controle

Cqc-EtOH 100 mg/kg

Cqc-EtOH 200 mg/kg

Cqc-EtOH 400 mg/kg

Diazepam 2,5 mg/kg

0,5 h 1 h 2 h

** ****

Tem

po

no

ro

ta-r

od

(s)


5.2.3. Atividade anti-inflamatória do extrato das cascas de


5.2.3.1 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal

A administração do extrato etanólico bruto das cascas (Cqc-EtOH

100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) 1 h antes da injeção de carragenina (1%, i.p.,

0.25 mL) inibiu a migração de leucócitos (p<0,01) quando comparado ao grupo

controle (Figura 15). As doses de Cqc-EtOH quando comparadas entre si

apresentaram diferença estatística (p<0,01). A droga de referência

dexametasona (2 mg/kg, i.p.) também promoveu redução significante na

migração de leucócitos (p<0,01).

Figura 15: Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das cascas de

Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg) e dexametasona

(2 mg/kg), no teste da migração de leucócitos na cavidade peritoneal em


**p<0,01 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo

teste de Dunnet).

Controle 100 200 400 DEXA0

50

100

150

200

250

** **

** **

Cqc-EtOH (mg/ml)

Leu

có

cit

os x

10

2/m

m3


5.2.3.2 Teste edema de pata induzido por carragenina

No pré-tratamento com o Cqc-EtOH (i.p.) apenas a dose de

200 mg/kg inibiu durante todo o período do experimento (p<0,01), enquanto a

dose de 100 mg/kg inibiu apenas a partir da 3 h até 5 h (p<0,01), após o uso da

carragenina para induzir o edema (Figura 16). A droga padrão utilizada foi a

indometacina (20 mg/kg, i.p.) que inibiu o volume do edema de pata (p<0,01)

durante as 5 h de realização do experimento.

Figura 16: Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das cascas de

Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg) e indometacina

(20 mg/kg), no teste do edema de pata induzido por carragenina em



teste de Dunnet).

5.2.4. Toxicidade aguda do extrato das cascas de Cnidoscolus quercifolius

Na avaliação da toxicidade aguda do extrato etanólico bruto das

cascas de Cnidoscolus quercifolius, não foram observadas mortes dos animais,

0 1 2 3 4 50.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25Controle

Cqc-EtOH 100 mg/kg

Cqc-EtOH 200 mg/kg

Cqc-EtOH 400 mg/kg

Indometacina 20 mg/kg

****

**

*

**

**

**

**

**

**

**

**

**

Tempo (horas)

Vo

lum

e d

o e

dem

a d

e p

ata

(m

L)


que receceberam a dose 2,0 g/kg administrada pela via intraperitoneal, como

também dos animais que receberam a dose 5,0 g/kg administrada pela via oral.

5.2.4.1. Avaliação comportamental dos camundongos

Na avaliação comportamental foi observado que os animais que

receberam a dose de 2,0 g/kg i.p. (fêmeas e machos) apresentaram contorções

abdominais, ptose palpebral, resposta ao toque diminuída e ambulação

diminuída. Na dose de 5 g/kg v.o os animais (fêmeas e machos) apresentaram

as seguintes alterações comportamentais: ambulação diminuída, ptose

palpebral e diarreia.

5.2.4.2. Consumo de água e alimento

Durante a análise o consumo de água pelos camundongos tratados

com Cqc-EtOH em todos os grupos não mostrou alterações significativas,

exceto o grupo de fêmeas que receberam a dose de 2,0 g/Kg por via

intraperitoneal. A quantidade de água consumida no final do experimento foi de

33,00 ± 1,71 mL para o grupo controle fêmeas, enquanto o grupo tratado com a

dose de 2,0 g/kg i.p. foi de 24,71 ± 1,08 mL (p<0,05) (Figura 17).

Em relação ao consumo de alimentos pelos animais não houve

alterações relevantes, apenas as fêmeas que receberam o Cqc-EtOH na dose

de 2,0 g/Kg i.p. e os machos que receberam a dose de 5,0 g/kg v.o,

respectivamente, apresentaram resultados significativos. O consumo de ração

no final do experimento foi de 30,07 ± 0,73 g para o grupo controle machos e

de 25,43 ± 1,00 g para o grupo controle fêmeas, enquanto o grupo tratado com

a dose de 2,0 g/kg (fêmeas) e 5,0 g/kg (machos) foi de 16,93 ± 1,33 g e 24,07

± 0,92 g respectivamente (p<0,05) (Figura 18).


Figura 17: Consumo de alimentos pelos animais tratados com extrato etanólico

bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius durante 14 dias (n= 6 por grupo).

Figura 18: Consumo de líquidos pelos animais tratados com extrato etanólico

bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius durante 14 dias (n= 6 por grupo).

5.2.4.3. Variação do peso corporal

O peso corporal dos camundongos do dia 1 ao dia 14 (Figura 19)

apresentou diferença estatística apenas nos grupos fêmeas nas doses de

2,0 g/kg por i.p. e 5,0 g/kg v.o. A média do peso corporal dos camundongos do

grupo controle fêmeas ao término do experimento foi de 30,87 ± 0,24 g,

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 155

10

15

20

25

30

35

40Controle machos

Cqc-EtOH machos 2 g/kg


Controle fêmeas

Cqc-EtOH fêmeas 2 g/kg


Tempo (dias)

Co

nsu

mo

de R

ação

(g

)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1515

25

35

45

55Controle machos



Controle fêmeas



Tempo (dias)

Co

nsu

mo

de l

íqu

ido

(m

L)


enquanto as dos grupos fêmeas tratados com 2,0 g/kg por i.p. e 5,0 g/kg v.o.

foram de 28,82 ± 0,18 g e 29,46 ± 0,09.

Figura 19: Variação de peso dos animais tratados com extrato etanólico bruto

das cascas de Cnidoscolus quercifolius durante 14 dias (n= 6 por grupo).

5.2.4.4. Parâmetros hematológicos

Nos valores avaliados para os parâmetros hematológicos (eritrócitos,

hemoglobina, hematócritos, concentração de hemoglobina corpuscular média

(CHCM), basófilos, eosinófilos, leucócitos, linfócitos, monócitos e neutrófilos)

apenas os parâmetros de volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina

corpuscular média (HCM) e neutrófilos apresentaram diferença estatística

(p<0,05), os demais grupos não apresentaram diferença significativa. Os

resultados estão expressos na Tabela 2.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1420

25

30

35

40

45

50Controle machos

Cqc-EtOH machos 2g/kg

Cqc-EtOH machos 5g/kg

Controle fêmeas

Cqc-EtOH fêmeas 2g/kg

Cqc-EtOH fêmeas 5g/kg

Tempo (dias)

Peso

(g

)


Tabela 2. Parâmetros hematológicos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto das cascas de

Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 2 g/kg, i.p. e 5 g/kg, v.o.) e solução salina 0,9% em dose única e avaliados durante 14 dias

(n=6 por grupo).

Parâmetros

Grupos

Controle Machos

2 g/kg Machos 5 g/kg Machos Controle Fêmeas

2 g/kg Fêmeas 5 g/kg Fêmeas

Eritrócitos (106/mm3) 8,04 ± 0,33 8,25 ± 0,09 8,10 ± 0,35 10,00 ± 1,33 6,94 ± 1,03 7,91 ± 0,17

Hemoglobina (g/dL) 12,74 ± 0,53 13,40 ± 0,21 12,94 ± 0,59 17,18 ± 2,63 10,76 ± 1,57 13,02 ± 0,30

Hematócrito (%) 36,28 ± 1,90 38,58 ± 0,61 37,10 ± 1,79 49,30 ± 7,45 30,84 ± 4,50 36,48 ± 1,21

VCM (μ3) 45,80 ± 0,73 47,20 ± 0,80 45,80 ± 0,66 49,20 ± 1,02 44,40 ± 0,74* 47,00 ± 0,70

HCM (μg) 16,14 ± 0,12 16,32 ± 0,13 16,04 ± 0,25 17,00 ± 0,38 15,52 ± 0,14* 16,44 ± 0,08

CHCM (%) 34,90 ± 0,33 34,30 ± 0,47 34,96 ± 0,29 34,78 ± 0,66 35,00 ± 0,61 35,74 ± 0,61

Basófilos (%) 0,52 ± 0,09 0,36 ± 0,05 0,34 ± 0,09 0,70 ± 0,21 0,42 ± 0,15 0,54 ± 0,10

Eosinófilos (%) 0,08 ± 0,02 0,02 ± 0,02 0,06 ± 0,02 0,04 ± 0,02 0,08 ± 0,04 0,10 ± 0,05

Leucócitos (103/mm3)

8,94 ± 1,71 7,30 ± 1,33 6,14 ± 1,48 10,30 ± 2,27 4,92 ± 1,24 6,92 ± 0,88

Linfócitos (%) 93,00 ± 0,50 93,96 ± 0,24 90,42 ± 1,21 93,24 ± 0,62 89,62 ± 2,25 90,48 ± 1,20

Monócitos (%) 0,74 ± 0,11 0,46 ± 0,09 0,70 ± 0,09 0,52 ± 0,09 0,38 ± 0,10 0,56 ± 0,10

Neutrófilos (%) 6,00 ± 0,61 5,18 ± 0,20 8,12 ± 1,01 5,00 ± 0,73 8,66 ± 1,68* 8,32 ± 1,06*

Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Teste t de Student p<0,05, comparado ao controle.

83 GOMES, L.M.A. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Cnidoscolus quercifolius pohl (Euphorbiaceae) em roedores.

5.2.4.5. Parâmetros bioquímicos

Os parâmetros bioquímicos demonstrados na Tabela 3 apontam que

houve um decréscimo nos valores de triglicerídeos no grupo machos nas doses

de 2 g/kg i.p., 5 g/kg v.o. e fêmeas 2 g/kg i.p., de glicose no grupo machos na

dose 5 g/kg v.o e 2 g/kg fêmeas, bem como nos níveis de AST/TGO no grupo 2

g/kg machos e 5 g/kg fêmeas. Os demais resultados não mostraram diferenças

significativas.


Tabela 3. Parâmetros bioquímicos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius

(Cqc-EtOH 2 g/kg, i.p. e 5 g/kg, v.o.) e solução salina 0,9% em dose única e avaliados durante 14 dias (n=6 por grupo).

Parâmetros Grupos

Controle Machos



Glicose (mg/dL) 153,7 ± 13,87 157,2 ± 22,86 83,8 ± 20,53* 142,0 ± 5,94 88 ± 12,51* 107,6 ± 27,27

Colesterol (mg/dL)

324,8 ± 45,70 243,6 ± 33,52 295,6 ± 16,55 292 ± 41,21 271,2 ± 17,55 380 ± 38,22

Triglicerídeos (mg/dL)

454,8 ± 35,05 234,8 ± 31,01* 355,6 ± 39,89* 406,4 ± 22,33 340 ±17,85* 443,2 ± 55,58

AST/TGO (U/L) 200,7 ± 19,83 105,1 ± 24,83* 274,2 ± 68,59 329,6 ± 34,32 392 ± 64,46 182,1 ± 39,34*

ALT/TGP (U/L) 63,44 ± 4,96 77,8 ± 15,56 70,16 ± 18,10 94,08 ± 23,00 101,7 ± 25,60 95,16 ± 27,99

Creatinina (mg/dL)

0,54 ± 0,04 0,48 ± 0,03 0,54 ± 0,02 0,61 ± 0,04 0,7 ± 0,08 0,62 ± 0,12



5.2.4.6. Peso dos órgãos

No resultado da análise dos pesos dos órgãos dos animais, não houve diferença significativa quando comparados com

o controle (Tabela 4).

Tabela 4. Peso dos órgãos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius (Cqc-

EtOH 2 g/kg, i.p. e 5 g/kg, v.o.) e solução salina 0,9% em dose única e avaliados durante 14 dias (n=6 por grupo).

Parâmetros Grupos

Controle Machos

2 g/kg Machos 5 g/Kg Machos Controle Fêmeas 2 g/kg

Fêmeas 5 g/Kg

Fêmeas

Baço (g) 0,14 ± 0,02 0,13 ± 0,00 0,14 ± 0,01 0,10 ± 0,01 0,14 ± 0,02 0,09 ± 0,01

Coração (g) 0,17 ± 0,01 0,17 ± 0,00 0,15 ± 0,03 0,13 ± 0,00 0,12 ± 0,02 0,13 ± 0,00

Estômago (g) 0,48 ± 0,06 0,51 ± 0,04 0,40 ± 0,08 0,41 ± 0,01 0,31 ± 0,06 0,42 ± 0,05

Fígado (g) 1,53 ± 0,08 1,64 ± 0,02 1,59 ± 0,06 1,26 ± 0,04 1,32 ± 0,06 1,20 ± 0,04

Rim (g) 0,22 ± 0,01 0,23 ± 0,00 0,21 ± 0,01 0,16 ± 0,01 0,17 ± 0,01 0,14 ± 0,01

Pâncreas (g) 0,28 ± 0,03 0,28 ± 0,03 0,23 ± 0,04 0,22 ± 0,00 0,21 ± 0,04 0,20 ± 0,01

Pulmão (g) 0,22 ± 0,00 0,23 ± 0,00 0,23 ± 0,00 0,22 ± 0,00 0,23 ± 0,01 0,20 ± 0,00

Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Teste t de Student p< 0,05, comparado ao controle.


5.2.4.7. Análise Macroscópica e Histológica

Na análise macroscópica dos órgãos os animais tratados com 2 g/kg

Cqc-EtOH por via i.p. apresentaram fígado com consistência endurecida,

aderido ao diafragma e apenas um animal macho tratado na dose 5 g/kg v.o.

apresentou esplenomegalia, porém a análise histológica dos órgãos (fígado,

pâncreas e rins) não apresentaram sinais de toxicidade e lesões.

Na análise histológica do fígado dos animais tratados com Cqc-EtOH

não foi identificada alteração (Figura 20). O parênquima do órgão mostrou-se

ausente de lesões (Figura 20 - B, C, E e F) com estruturas conservadas,

semelhante aquelas encontradas no grupo controle (Figura 20A e 20D).

O pâncreas do animal tratado apresenta o parênquima muito bem

preservado (Figura 21). Observa-se a presença de Ilhotas pancreáticas (Figura

21A e 21C) e ácinos pancreáticos em bom estado de conservação em todos os

grupos.

A análise histológica dos rins mostrou estruturas preservadas e

ausência de sinais de nefrotoxicidade (Figura 22).


Figura 20. Fotomicrografias de cortes histológicos do fígado de animais tratados com extrato etanólico bruto das cascas de

Cnidoscolus quercifolius: (A e D) controle, (B e E) Cqc-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C e F) Cqc-EtOH (5 g/kg v.o.). VC= ramo da veia

centrolobular; H= Hepatócito (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 100 X).


Figura 21. Fotomicrografias de cortes histológicos do pâncreas de animais tratados com extrato etanólico bruto das cascas de

Cnidoscolus quercifolius: (A e D) controle, (B e E) Cqc-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C e F) Cqc-EtOH (5 g/kg v.o.). AP= Ácinos pancreático;

IP= Ilhotas pancreáticas (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 100 X).


Figura 22. Fotomicrografias de cortes histológicos dos rins de animais tratados com extrato etanólico bruto das cascas de

Cnidoscolus quercifolius: (A e D) controle, (B e E) Cqc-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C e F) Cqc-EtOH (5 g/kg v.o.) TR=Túbulos Renais;

CR= Corpúsculo Renal (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 100X).


5.3. Resultados da atividade farmacológica do extrato das folhas de


5.3.1 Atividade antinociceptiva do extrato das folhas de


5.3.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético

A administração do Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.), 30 min

antes da administração do ácido acético, promoveu a inibição as contorções

induzidas pelo ácido acético quando comparados com o grupo controle

(p<0,01) (Figura 23). Os resultados mostrados demonstram que as

porcentagens de inibição foram de 71,3%, 79,4% e 98,7%, respectivamente. As

drogas padrão indometacina e morfina apresentaram 94% e 100%,

respectivamente, de redução de contorções quando comparados com o

controle.

Figura 23: Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto das folhas de

Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), indometacina

(20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), no teste das contorções abdominais em



teste de Dunnet).


10

20

30

40

Cqf-EtOH (mg/kg)

****

****

**

Nú

mero

de c

on

torç

ões


5.3.1.2 Teste da formalina

No teste da lambida da pata induzida pela formalina, o pré-

tratamento com Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.), reduziu o tempo de

lambida da pata significativamente, quando comparado ao grupo controle em

ambas as fases (p<0,01) (Figura 24). As porcentagens de inibição para Cqf -

EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) na primeira fase foram de 44,28%, 29,05% e

36,27%, respectivamente. Já na segunda fase as porcentagens foram de

60,11%, 75,58% e 79,46%, respectivamente. O fármaco padrão morfina

reduziu em ambas as fases o estímulo da dor (p<0,01), enquanto a

indometacina inibiu apenas na segunda fase o estímulo da dor. Houve

diferença significativa entre as doses de Cqf-EtOH na primeira e na segunda

fase.



Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), indometacina

(20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), na primeira e segunda fase do teste da

formalina em camundongos. Valores são expressos em média ± erro padrão da

média, n=6. *p<0,05, *p<0,01, significativamente diferente do grupo controle

(ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).


10

20

30

40

50

60

**

**

Primeira fase

***

Cqf-EtOH (mg/kg)

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)


50

100

150

200

****

**

Segunda fase

****

Cqf-EtOH (mg/kg)

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)

b)

a)


5.3.1.3 Teste da placa quente

Os resultados demonstrados na Figura 25 revelam que no teste da

placa quente, os animais tratados com Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.)

não mostraram aumento no tempo de latência, com exceção da dose de

400 mg/kg no tempo de 90 e 120 minutos (p<0,05). Os animais tratados com a

morfina (10 mg/kg) demonstraram um aumento evidente no tempo de latência

em 30, 60, 90 e 120 min (p<0,01).


Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), morfina (10 mg/kg),

no teste da placa quente em camundongos. Valores são expressos em média

± erro padrão da média, n=6. **p<0,01 significativamente diferente do grupo

controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).

30 60 90 1200

5

10

15

20Controle

Folhas -EtOH 100 mg/kg

Folhas-EtOH 200 mg/kg

Folhas - EtOH 400 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

****

****

****

Tempo (min)

Tem

po

de L

atê

ncia

(s)


5.3.2. Avaliação da coordenação motora do extrato das folhas de


5.3.2.1 Teste do rota-rod

No teste do rota-rod não houve alteração no tempo de permanência

na barra giratória para os animais que receberam o pré-tratamento com Cqf-

EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) em relação ao grupo controle (Figura 26),

não havendo valores significantes (p>0,05). Já o fármaco padrão utilizada

diazepam (2,5 mg/kg) reduziu o tempo de permanência dos animais na barra

giratória significativamente (p<0,01). Não houve diferença significativa entre as

doses de Cqf-EtOH quando comparadas entre si.

Figura 26: Efeito na coordenação motora do extrato etanólico bruto das folhas

de Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), diazepam

(2,5 mg/kg), no teste do rota-rod em camundongos. Valores são expressos em

média ± erro padrão da média, n=6. **p<0,01 significativamente diferente do

grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).

0

50

100

150

200Controle

Cqf-EtOH 100 mg/kg

Cqf-EtOH 200 mg/kg

Cqf-EtOH 400 mg/kg

Diazepam 2,5 mg/kg

0,5 h 1 h 2 h

** ** **

Tem

po

no

ro

ta-r

od

(s)


5.3.3. Atividade anti-inflamatória do extrato das folhas de


5.3.3.1 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal

O pré-tratamento com o extrato etanólico bruto das folhas (Cqf-EtOH

100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) 1 h antes da injeção de carragenina (1%, i.p.,

0.25 mL) inibiu a migração de leucócitos (p<0,01) quando comparado ao grupo

controle (Figura 27). As doses de Cqf-EtOH quando compradas entre si

apresentou diferença estatística (p<0,01). O fármaco de referência

dexametasona (2 mg/kg, i.p.) também promoveu redução significante na

migração de leucócitos (p<0,01).

Figura 27: Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das folhas de

Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg) e dexametasona

(2 mg/kg), no teste da migração de leucócitos na cavidade peritoneal em


*p<0,05, **p<0,01, significativamente diferente do grupo controle (ANOVA

seguido pelo teste de Dunnet).

Controle 100 200 400 DEXA0

50

100

150

200

250

**

*

** **

Cqf-EtOH (mg/kg)

Leu

có

cit

os x

10

2/m

m3


5.3.3.2 Teste edema de pata

No teste de edema de pata induzido por carragenina em

camundongos foi possível observar que no pré-tratamento com o (Cqf-EtOH

100, 200 e 400 mg/kg, i.p.), apenas a dose de 100 mg/kg proporcionou a

inibição do edema de pata a partir da 4 h (p<0,05) e 5 h (p<0,01) (Figura 28). A

droga padrão utilizada foi a indometacina (20 mg/kg, i.p.) inibiu o edema de

pata (p<0,01) durante as 5 h de realização do experimento.

Figura 28: Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das folhas de

Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg) e indometacina

(20 mg/kg), no teste do edema de pata induzido por carragenina em


*p<0,05, **p<0,01, significativamente diferente do grupo controle (ANOVA

seguido pelo teste de Dunnet).

5.3.4. Toxicidade aguda do extrato das folhas de Cnidoscolus quercifolius

Durante o período de observação no estudo da toxicidade aguda das

folhas do dia 1 ao dia 14, o extrato não ocasionou a morte de nenhum animal

0 1 2 3 4 50.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25Controle

Cqf-EtOH 100 mg/kg

Cqf-EtOH 200 mg/kg

Cqf-EtOH 400 mg/kg

Indometacina 20 mg/kg

** * ** **

*

**

*

Tempo (horas)

Vo

lum

e d

o e

dem

a d

e p

ata

(m

L)


após os mesmos receberem as doses de 2,0 g/kg por via intraperitoneal e 5,0

g/kg por via oral, indicando baixa toxicidade do extrato.

5.3.4.1. Avaliação comportamental dos camundongos

Durante a triagem comportamental os animais que receberam a

dose de 2,0 g/kg i.p. de Cqf-EtOH (fêmeas e machos) apresentaram as

seguintes alterações comportamentais: contorções abdominais, ambulação

diminuída e ptose palpebral. Na dose de 5 g/kg os animais não demostraram

alterações no comportamento.

5.3.4.2. Consumo de alimento e água

Durante a análise do consumo de água pelos camundongos tratados

com Cqf-EtOH, houve diferença estatística apenas nos grupos de 2,0 g/kg por

via intraperitoneal (machos e fêmeas), os demais grupos não demonstraram

diferença significativa. As quantidades de água consumidas no final do

experimento pelos grupos controles machos e fêmeas foram respectivamente

de: 30,21 ± 1,40 mL e 30,93 ± 1,12 mL. Já o grupo tratado com a dose de

2,0 g/kg por via intraperitoneal machos consumiu uma média de 38,86

± 2,04 mL e o consumo feito pelo grupo de fêmeas que recebeu a mesma

dose foi de 25,93 ± 1,32 mL (p<0,05) (Figura 30).

Em relação ao consumo de alimentos, apenas o grupo de fêmeas

que receberam o Cqf-EtOH na dose de 2,0 g/Kg i.p. mostrou diferença

significativa, o consumo de ração no final do experimento foi para esse grupo

foi de 16,21 ± 1,44 g e o consumo para o grupo controle fêmeas foi de 25,43

± 1,16 g (p<0,05) (Figura 29).


Figura 29: Consumo de alimentos pelos animais tratados com extrato etanólico

bruto das folhas de Cnidoscolus quercifolius durante 14 dias (n= 6 por grupo).

Figura 30: Consumo de líquidos pelos animais tratados com extrato etanólico

bruto das folhas de Cnidoscolus quercifolius durante 14 dias (n= 6 por grupo).

5.3.4.3. Variação do peso corporal

O peso corporal dos camundongos apresentou diferença estatística

apenas nos seguintes grupos: 2 g/kg i.p. (machos e fêmeas) e 5 g/kg v.o

(machos). Os demais grupos não apresentaram diferenças significativas. Ao

término do experimento a média do peso corporal dos camundongos do grupo

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 155

10

15

20

25

30

35

40Controle machos

Cqf-EtOH machos 2 g/kg


Controle fêmeas

Cqf-EtOH fêmeas 2 g/kg


Tempo (dias)

Co

nsu

mo

de R

ação

(g

)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1515

20

25

30

35

40

45

50Controle machos



Controle fêmeas



Tempo (dias)

Co

nsu

mo

de l

íqu

ido

(m

L)


controle machos foi de 33,27 ± 0,20 g, do grupo controle fêmeas foi de 38,98

± 0,13 g, enquanto as dos grupos machos e fêmeas ambos tratados com

2,0 g/kg foram de 38,26 ± 0,41 g e 35,22 ± 0,23 g respectivamente, e por fim, o

grupo de machos que receberam a dose de 5 g/kg por via oral foi de 38,26

± 0,41 g (p<0,05). A variação de peso ao longo do experimento pode ser vista

na Figura 31.

Figura 31: Variação de peso dos animais tratados com extrato etanólico bruto

das folhas de Cnidoscolus quercifolius durante 14 dias (n= 6 por grupo).

5.3.4.4. Parâmetros hematológicos



(CHCM), basófilos, eosinófilos, leucócitos, linfócitos, monócitos e neutrófilos,

apenas os seguintes parâmetros mostraram diferença significativa: os valores

de eosinófilos mostraram uma diminuição nos grupos 2 g/kg machos e um

aumento no grupo 5 g/kg fêmeas, os valores de leucócitos mostraram um

aumento na dose de 2 g/kg machos, bem como, os valores de neutrófilos

apresentaram um decréscimo nos animais que receberam a dose de 2 g/kg i.p.

(machos), apresentando assim diferença estatística (p<0,05). Os demais

grupos não apresentaram diferença significativa. Os resultados estão

expressos na Tabela 5.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1420

25

30

35

40

45

50Controle machos

Cqf-EtOH machos 2g/kg

Cqf-EtOH machos 5g/kg

Controle fêmeas

Cqf-EtOH fêmeas 2g/kg

Cqf-EtOH fêmeas 5g/kg

Tempo (dias)

Peso

(g

)


Tabela 5. Parâmetros hematológicos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus

quercifolius (Cqf-EtOH 2 g/kg, i.p. e 5 g/kg, v.o.) e solução salina 0,9% em dose única e avaliados durante 14 dias (n= 6 por grupo).

Parâmetros Grupos

Controle Machos

2 g/kg Machos 5 g/kg Machos Controle Fêmeas 2 g/kg Fêmeas 5 g/kg Fêmeas

Eritrócitos 5,74 ± 1,21 8,08 ± 0,20 7,91 ± 0,31 7,93 ± 0,22 7,64 ± 0,17 8,14 ± 0,08

Hemoglobina 9,14 ± 1,92 13,12 ± 0,52 12,88 ± 0,45 12,78 ± 0,29 12,20 ± 0,32 13,28 ± 0,12

Hematócrito 25,32 ± 5,29 37,30 ± 1,24 37,06 ± 1,19 35,26 ± 0,93 32,62 ± 1,10 37,20 ± 0,65

VCM 45,20 ± 0,73 46,20 ± 0,86 45,60 ± 0,81 44,60 ± 0,24 44,00 ± 0,44 46,20 ± 0,73

HCM 15,90 ± 0,11 16,16 ± 0,25 16,26 ± 0,12 16,02 ± 0,073 15,98 ± 0,18 16,22 ± 0,18

CHCM 35,94 ± 0,29 35,16 ± 0,74 34,70 ± 0,48 35,82 ± 0,31 35,96 ± 0,16 35,26 ± 0,42

Basófilos 1,20 ± 0,29 0,58 ± 0,08 0,94 ± 0,34 0,56 ± 0,14 0,38 ± 0,08 0,56 ± 0,04

Eosinófilos 0,30 ± 0,07 0,12 ± 0,02* 0,48 ± 0,27 0,08 ± 0,02 0,02 ± 0,02 0,18 ± 0,03*

Leucócitos 3,68 ± 0,55 6,20 ± 0,45* 5,76 ± 1,32 4,46 ± 1,24 7,14 ± 0,68 4,84 ± 0,71

Linfócitos 91,36 ± 1,38 95,24 ± 1,07 89,80 ± 1,71 93,66 ± 1,14 94,10 ± 0,77 94,14 ± 0,35

Monócitos 0,40 ± 0,07 0,24 ± 0,05 0,36 ± 0,09 0,38 ± 0,06 0,40 ± 0,044 0,54 ± 0,16

Neutrófilos 6,66 ± 1,11 3,14 ± 0,66* 6,34 ± 0,91 4,44 ± 0,51 5,08 ± 0,67 4,14 ± 0,24

Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Testet de Student p<0,05, comparado ao controle.


5.3.4.5. Parâmetros bioquímicos

Os parâmetros bioquímicos revelaram um decréscimo no valor de

AST/TGO no grupo 2 g/kg i.p. (machos), de triglicerídeos nos animais que

receberam a dose de 5 g/kg v.o. (fêmeas) e de glicose nas doses 2 g/kg

(machos e fêmeas) i.p. e 5 g/kg fêmeas. Os demais parâmetros não

demonstraram diferenças significativas. Os resultados estão expressos na

Tabela 6.


Tabela 6. Parâmetros bioquímicos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius

(Cqf-EtOH 2 g/kg, i.p. e 5 g/kg, v.o.) e solução salina 0,9% em dose única e avaliados durante 14 dias (n=6 por grupo).

Parâmetros

Grupos

Controle Machos



Glicose (mg/dL) 250,5 ± 16,68 108,0 ± 21,49* 213,0 ± 24,80 253,5 ± 12,58 177,0 ± 21,42* 115,5 ± 40,35*

Colesterol (mg/dL) 115,8 ± 7,66 101,2 ± 9,88 126,0 ± 3,88 94,40 ± 11,18 98,00 ± 3,30 106,8 ± 10,06

Triglicerídeos (mg/dL)

327,6 ± 147,4 256,8 ± 191,6 198,0 ± 113,9 470,4 ± 154,7 159,6 ± 38,40 86,40 ± 35,63*

AST/TGO (U/L) 212,0 ± 26,99 133,4 ± 16,64* 200,5 ± 33,72 208,7 ± 31,25 222,6 ± 27,98 227,5 ± 61,26

ALT/TGP (U/L) 48,80 ± 16,20 78,20 ± 37,81 70,20 ± 23,40 60,80 ± 14,23 102,6 ± 32,21 57,10 ± 32,61

Creatinina (mg/dL)

0,27 ± 0,025 0,21 ± 0,02 0,22 ± 0,01 0,23 ± 0,01 0,22 ± 0,01 0,29 ± 0,02



5.3.4.6. Peso dos órgãos

No resultado da análise dos pesos dos órgãos dos animais, houve diferença significativa nos valores do peso do baço e

do fígado na dose de 2 g/kg i.p. (machos e fêmeas), bem como no rim e pâncreas apenas grupo 2 g/kg i.p. machos de Cqf-EtOH

quando comparados com o controle (Tabela 7).

Tabela 7. Peso dos órgãos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius (Cqf-

EtOH 2 g/kg, i.p. e 5 g/kg, v.o.) e solução salina 0,9% em dose única e avaliados durante 14 dias (n=6 por grupo).

Parâmetros Grupos

Controle Machos 2 g/kg Machos 5 g/kg Machos Controle Fêmeas 2 g/kg Fêmeas 5 g/kg Fêmeas

Baço (g) 0,10 ± 0,00 0,20 ± 0,01* 0,12 ± 0,01 0,12 ± 0,00 0,22 ± 0,00* 0,12 ± 0,01

Coração (g) 0,15 ± 0,01 0,18 ± 0,00 0,14 ± 0,00 0,16 ± 0,00 0,14 ± 0,00 0,15 ± 0,00

Estômago (g) 0,35 ± 0,03 0,42 ± 0,05 0,40 ± 0,02 0,49 ± 0,03 0,46 ± 0,02 0,45 ± 0,03

Fígado (g) 1,37 ± 0,05 1,90 ± 0,07* 1,45 ± 0,10 1,36 ± 0,02 1,64 ± 0,04* 1,34 ± 0,06

Rim (g) 0,19 ± 0,00 0,23 ± 0,01* 0,19 ± 0,01 0,19 ± 0,00 0,18 ± 0,01 0,18 ± 0,00

Pâncreas (g) 0,23 ± 0,01 0,33 ± 0,01* 0,20 ± 0,01 0,25 ± 0,00 0,31 ± 0,02 0,24 ± 0,00

Pulmão (g) 0,22 ± 0,00 0,25 ± 0,01 0,31 ± 0,08 0,24 ± 0,01 0,24 ± 0,01 0,25 ± 0,01

Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Testet de Student p<0,05, comparado ao controle.


5.3.4.7. Análise Macroscópica e Histológica

Na análise macroscópica dos órgãos, cinco fêmeas tratadas com

Cqf-EtOH na dose de 2 g/kg apresentaram fígado e baço com alterações de

consistência e duas com alteração na consistência e coloração do pâncreas,

enquanto o grupo de machos que receberam a mesma dose cinco

apresentaram alterações de consistência no fígado e no pâncreas e um no

baço. Nos grupos 5 g/kg v.o. fêmeas e machos não apresentaram nenhum

órgão com alteração macroscópica.

O fígado dos animais tratados com Cqf-EtOH não apresentaram

alterações na análise histológica (Figura 32). Ausência de lesões nos

hepatócitos, porém ocorreu apenas uma discreta hiperemia.

Na análise histológica os pâncreas dos animais que receberam o

Cqf-EtOH não apresentaram alterações, estando o parênquima bem

preservado (Figura 33). Observa-se a presença de ilhotas pancreáticas e

ácinos pancreáticos em bom estado de conservação em todos os grupos.

Na análise histológica dos rins observam-se túbulos renais e

corpúsculo renal (Figura 34) com estruturas preservadas e ausência de sinais

de toxicidade.


Figura 32. Fotomicrografias de cortes histológicos do fígado de animais tratados com extrato etanólico bruto das folhas de

Cnidoscolus quercifolius: (A e D) controle, (B e E) Cqf-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C e F) Cqf-EtOH (5 g/kg v.o.). VC= ramo da veia

centrolobular; H= Hepatócito (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 100 X).


Figura 33. Fotomicrografias de cortes histológicos do pâncreas de animais tratados com extrato etanólico bruto das folhas de

Cnidoscolus quercifolius: (A e D) controle, (B e E) Cqf-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C e F) Cqf-EtOH (5 g/kg v.o.). AP= Ácinos pancreático;

IP= Ilhotas pancreáticas (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 100 X).


Figura 34. Fotomicrografias de cortes histológicos dos rins de animais tratados com extrato etanólico bruto das folhas de

Cnidoscolus quercifolius: (A e D) controle, (B e E) Cqf-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C e F) Cqf-EtOH (5 g/kg v.o.) TR=Túbulos Renais; CR=

Corpúsculo Renal (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 100X).


6. DISCUSSÃO


6. DISCUSSÃO

No presente estudo, foi possível demonstrar pela primeira vez, o

efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Cqc-EtOH e Cqf-EtOH de

Cnidoscolus quercifolius, através de diversos testes farmacológicos para

avaliar as respostas nociceptivas e inflamatórias, geradas por diferentes

estímulos nocivos. Essa atividade antinociceptiva e anti-inflamatória

apresentadas por Cqc-EtOH e Cqf-EtOH, provavelmente estão associadas com

a diversidade de constituintes químicos que foram identificados na análise

fitoquímica preliminar dos extratos (Tabela 2).

Em relação aos constituintes presentes em Cqc-EtOH e Cqf-EtOH,

destaca-se a presença de flavonoides em ambos os extratos. Assim, as

atividades farmacológicas provavelmente estão relacionadas à presença desta

classe de substâncias, visto que esses possuem atividade anti-inflamatória,

devido à inibição da COX, da formação de granulação e do aumento da

permeabilidade capilar observado no início do processo inflamatório, além de

diminuir os riscos para úlceras gástricas (CARVALHO, 2004; SIMÕES et al.,

2010). No Cqf-EtOH há presença de triterpenos/esteroides que atuam na

reação imunológica e revelam efeitos bastante promissores quando utilizados

como anti-inflamatórios (CARVALHO, 2004; HUANG et al., 2012).

O primeiro teste realizado para avaliar a atividade antinociceptiva foi

o teste das contorções abdominais. Este modelo é empregado para o

screening inicial de novas moléculas com potencial analgésico, devido à sua

baixa especificidade, pois o teste é sensível à substâncias analgésicas de ação

central e/ou periférica (CARLINI; MENDES, 2011). O ácido acético, ao penetrar

na cavidade peritoneal dos camundongos, provoca dor inflamatória através da

indução da permeabilidade capilar e da liberação de substâncias endógenas

que excitam as terminações nervosas (KURIAN et al., 2006). A dor é gerada

através da liberação de mediadores endógenos como a bradicinina, serotonina,

capsaicina, além do envolvimento da liberação das ciclo-oxigenase através do

ácido araquidônico e da biossíntese de prostaglandinas (MELO et al., 2008).

Os nociceptores são sensíveis à ação de drogas anti-inflamatórias não

esteroides, como o ácido acetilsalicílico, e a analgésicos opioides, como a


morfina, daí ser considerado como um método inespecífico de nocicepção

(ROCHA et al., 2007).

A administração dos extratos Cqc-EtOH e Cqf-EtOH propiciou a

redução das contorções abdominais, após a aplicação do ácido acético de

maneira significativa. Os resultados apresentados na Figura 11 (pág. 71)

apontam que quando os animais foram previamente tratados com Cqc-EtOH

(100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) as porcentagens de inibição foram de 83,7%,

81,4% e 88,1%, respectivamente, enquanto o pré-tratamento com Cqf-EtOH

(100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) demonstrados na figura 23 (pág. 90), promoveu as

porcentagens de inibição de: 71,3%, 79,4% e 98,7%, respectivamente. O grupo

controle para Cqc-EtOH e Cqf-EtOH apresentou 22,50 ± 2,90 e 39,00 ± 0,81 de

contorções respectivamente, indicando que Cqc-EtOH e Cqf-EtOH apresentem

agentes antinociceptivos.

No intuito de distinguir se o efeito do Cq-EtOH é de ação central ou

periférica, foi realizado o teste da lambida da pata induzida pela formalina.

Esse modelo atua promovendo um estímulo químico que induz a uma resposta

espontânea de dor, sendo o teste dividido em duas fases distintas, que refletem

diferentes tipos de dor (HUNSKAAR; HOLE, 1987). A primeira fase começa

imediatamente após a injeção da formalina e perdura por cerca de cinco

minutos. Essa fase é seguida por um período de quiescência, de cerca 5-

10 min, após o qual se desenvolve a segunda fase da resposta, que se inicia

20-25 min após a injeção (PERAZA et al., 2007).

Cqc-EtOH e Cqf-EtOH diminuíram o tempo de lambida nas duas

fases, porém, o efeito foi mais significativo para ambos os extratos na segunda

fase, conforme demonstrado nas Figuras 12 (pág. 73) e 24 (pág. 91),

respectivamente. A diminuição do tempo das lambidas nas duas fases é

característica de drogas que atuam em nível central e a possibilidade de

interação com os receptores opioides. A primeira fase é mais sensível aos

analgésicos opiodes, porém a indometacina e o ácido acetilsalicílico

respondem melhor na segunda fase (SÁ et al., 2012). Assim, os extratos

apresentaram efeitos na segunda fase, apontando um possível efeito anti-

inflamatório.

O teste da placa quente realizado com Cqc-EtOH e Cqf-EtOH

demonstrou que os extratos apresentaram efeitos em algumas doses,


aumentando o tempo de permanência dos animais na placa aquecida. Cqc-

EtOH aumentou o tempo de latência na dose de 400 mg/kg em 30 minutos,

conforme a Figura 13 (pág. 74) e Cqf-EtOH aumentou a latência na dose de

400 mg/kg no tempo de 90 e 120 minutos, como demonstrado na Figura 25

(pág. 92). Os extratos, especialmente Cqf-EtOH, nessas doses específicas

possivelmente exercem efeito antinociceptivo central, visto que esse teste

revela resposta de reflexo particularmente espinhal, com ação de drogas

analgésicas que atuam em nível central (LE BARS, 2001). A resposta eficaz

nessas doses dos extratos indica que há participação na estimulação térmica,

associada com a neurotransmissão central, em que o calor ativa nociceptores

(fibras Aδ e C) pela condução do impulso ao longo do corno dorsal da medula

espinhal até os centros corticais (PINHEIRO et al., 2011).

Analisando os resultados, percebe-se que os dois extratos

apresentam atividade antinociceptiva, com mecanismos de ação semelhantes,

com excesão para a dose de 400 mg/kg de ambos os extratos, principalmente

para o Cqf-EtOH, pois essas doses apresentaram mecanismo de ação central,

não descartando também a participação no mecanismo de ação periférica

dessas doses. As demais doses dos extratos apresentaram ação periférica. A

provável causa para que os extratos apresentem mecanismos de ação

diferentes, é devido ao fato de que foram utilizados extratos brutos com vários

constituintes químicos, ao passo que utilizar apenas substâncias isoladas

proporcionaria um aprimoramento maior do estudo.

Nardi et al. (2006) estudando a atividade antinociceptiva do extrato

etanólico das cascas de Croton celtidifolius (Euphorbiaceae), encontrou como

resultado, 75,9% de inibição ao administrar a dose 300 mg/kg v.o. no teste de

contorções abdominais. Já no teste da formalina, ao administrar a mesma

dose, a percentagem de inibição do extrato na primeira e segunda fase foram

de 11,6% e 76,2%, respectivamente.

Os testes para avaliar a atividade antinociceptiva envolvem uma

resposta motora, assim, drogas que promovam relaxamento muscular ou

sedação, levando à incoordenação motora, podem interferir com a resposta

sem serem necessariamente analgésicas, e o teste permite uma interpretação

mais acurada dos resultados obtidos nos testes de antinocicepção

(LAPA et al., 2003). Nesse sentindo, a coordenação motora dos animais após


receberem Cqc-EtOH e o Cqf-EtOH foi avaliada através do teste do rota-rod.

Os resultados revelaram que os extratos não alteraram a coordenação dos

camundongos na barra giratória, conforme demonstrado nas Figuras 14 (pág.

75) e 26 (pág. 93). O teste consiste em colocar os animais sobre uma barra

giratória a uma velocidade constante e mede o efeito de relaxamento muscular

ou de incoordenação motora produzido por efeito de drogas (ALMEIDA, 2006).

Outro fato relevante, é que ao receber o extrato bruto de uma planta, o animal

está recebendo muitas substâncias diferentes, que podem induzir efeitos

inespecíficos, como por exemplo, diminuir a atividade motora do animal

(CARLINI; MENDES, 2011).

A atividade antinociceptiva evidenciada nos testes das contorções

abdominais e da formalina, envolvem mecanismos anti-inflamatórios (COSTA-

SOUZA, 2010). Nesse sentindo, buscando avaliar a possibilidade dos extratos

possuírem atividade anti-inflamatória, foram realizados dois testes: o primeiro

foi o da peritonite induzida por carragenina e o segundo foi o teste de edema

de pata induzida por carragenina.

O teste da peritonite induzida pela carragenina tem por objetivo,

investigar a migração de leucócitos para a cavidade peritoneal. Após a

administração da carragenina na cavidade peritoneal, ocorrem vários eventos,

tais como a migração de neutrófilos e leucócitos para a cavidade peritoneal,

além de promover a vasodilatação, o aumento da permeabilidade vascular e a

liberação de mediadores inflamatórios como TNF-α, IL-1β, prostanoides e

componentes do sistema complemento (PINHEIRO et al., 2011).

Cq-EtOH e Cqf-EtOH inibiram a migração de leucócitos em todas as

doses conforme Figuras 15 (pág. 76) e 27 (pág. 94), respectivamente,

provavelmente os extratos contêm substâncias que atuam no bloqueio da

síntese dos mediadores responsáveis pela quimiotaxia dos leucócitos, não

sendo possível estabelecer o mecanismo envolvido. Alguns fármacos anti-

inflamatórios diminuem a migração leucocitária, dentre eles, os anti-

inflamatórios esteroides como a dexametasona e alguns anti-inflamatórios não

esteroides como a indometacina (SCHIMMER; PARKER, 2001; COSTA –

E - SOUSA et al., 2010).

O segundo teste realizado para avaliar a atividade anti-inflamatória,

foi o teste de edema de pata. Esse modelo é composto por duas fases, sendo a


primeira avaliada entre 1 ou 1,5 horas após a injeção de carragenina, é

caracterizada pela formação de um edema não fagocítico, enquanto que a

segunda fase 2-5 hs após a injeção, sendo caracterizada por um aumento da

formação do edema, que permanece por até 5 horas (KHAN et al., 2009).

Assim, Cqc-EtOH inibiu o edema de pata significativamente em todas as horas

apenas na dose de 200 mg/kg, enquanto a dose de 100 mg/kg inibiu apenas a

partir da 3 h até 5 h. Enquanto, Cqf-EtOH inibiu o edema de pata apenas na

dose de 100 mg a partir da 4 h e 5 h. A primeira fase é resultante da ação

sequencial e integrada de vários mediadores inflamatórios, como a histamina,

serotonina, bradicinia, PAF, substância P nas primeiras 1 -1,5 horas, logo após

a segunda fase é mantida pela liberação de prostaglandinas, atingindo o pico

entre 4-6horas (LAPA et al., 2003). Os extratos atuaram no combate à

inflamação provavelmente através da inibição da atuação das prostaglandinas.

García-Rodríguez et al. (2014) estudando a atividade anti-

inflamatória de Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh (Euphorbiaceae), ao

administrar a dose de 500 mg/kg i.p. do extrato etanólico bruto das folhas no

teste do edema de pata, observaram que o mesmo não apresentou atividade

anti-inflamatória, enquanto que na administração do extrato da fase acetato de

etila, os resultados observados foram de 28,78% (p<0,05) de inibição do

edema após 3 horas da administração da carragenina.

As plantas medicinais podem produzir várias atividades biológicas

em seres humanos, porém, pouco se conhece sobre a toxicidade de algumas

espécies de uso na medicina tradicional. Nesse sentido, o principal critério

para uso de plantas medicinais deve ser a segurança (MUKINDA;

SYCE, 2007).

Foi observado no presente estudo que a administração do extrato

bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius não demonstrou toxicidade,

quando avaliados aspectos macroscópicos e microscópicos de alguns órgãos

(fígado, pâncreas e rim), somente algumas alterações nos parâmetros

hematológicos (neutrófilos) na dose de 2 g/kg i.p. e 5 g/kg v.o. O extrato bruto

das folhas também não demonstrou toxicidade, apresentando alterações

discretas nos parâmetros hematológicos (leucócitos) 2 g/kg i.p. machos. Os

extratos não ocasionaram a morte dos animais em até 24 horas após

receberem as doses de 2 g/kg i.p e 5 g/kg v.o.


A perda de peso corporal é um sinal característico observado na

maioria dos animais expostos a substâncias tóxicas, essa diminuição do peso

geralmente se manifesta dentro de alguns dias após a exposição, e resulta

numa redução substancial do tecido adiposo e do tecido muscular

(SANGEETHA et al., 2013). Durante 14 dias o peso corporal foi avaliado,

registrando um decréscimo no peso corporal dos animais apenas nos grupos

de fêmeas que receberam do Cqc-EtOH as doses de 2,0 g/kg i.p. e 5,0 g/kg

v.o., bem como nos animais que receberam o Cqf-EtOH nas doses de

2,0 g/kg i.p (fêmeas) e 5,0 g/kg v.o (machos).

No presente estudo, durante a avaliação comportamental dos

animais que receberam Cqc-EtOH na dose de 2 g/kg i.p, foram observadas

contorções abdominais, ptose palpebral, resposta ao toque diminuída e

ambulação diminuída, enquanto na dose de 5 g/kg os animais apresentaram

ambulação diminuída, ptose palpebral e diarreia. Na avaliação comportamental

de Cqf-EtOH foram observadas alterações apenas na dose de 2 g/kg i.p, tais

como contorções abdominais, ambulação diminuída e ptose palpebral. Os

comportamentos descritos na triagem comportamental servem para facilitar a

investigação da possível atividade do extrato no sistema nervoso central, bem

como indicar os efeitos do mesmo no comportamento dos animais

(ALMEIDA, 2006).

Na avaliação da toxicidade de plantas medicinais é de fundamental

importância avaliar as alterações hematológicas, visto que essas permitem a

detecção de alterações fisiopatológicas de animais em diferentes condições de

estresse e são capazes de indicar a toxicidade induzida por hemólise

(NUSSEY et al., 1995; GAYATHRI et al., 2010).



(CHCM), basófilos, eosinófilos, leucócitos, linfócitos, monócitos e neutrófilos),

após a administração de Cqc-EtOH os valores não mostraram variação

significativa, apenas o volume corpuscular médio (VCM) e hemoglobina

corpuscular média (HCM) na dose de 2 g/kg i.p. fêmeas e os neutrófilos na

dose de 5 g/kg v.o fêmeas que houve diferença estatística. Já na administração

de Cqf-EtOH provocou nos animais a diminuição dos valores de eosinófilos e

neutrófilos, bem como um aumento de leucócitos no grupo 2 g/kg i.p. machos.


Nos resultados dos parâmetros bioquímicos houve uma diminuição

nos valores de triglicerídeos dos animais machos que receberam o Cqc-EtOH

nas doses de 2 g/kg i.p. e 5 g/kg v.o., de glicose, no grupo machos na dose

5 g/kg v.o. e 2 g/kg i.p. fêmeas e nos níveis de ALT/TGP na dose 2 g/kg i.p. e

5 g/kg v.o. (fêmeas), enquanto a administração de Cqf-EtOH na dose de

2 g/kg i.p. machos provocou uma diminuição de AST/TGO.

A administração de Cqc-EtOH mostrou alteração macroscópica

apenas no fígado de animais tratados com 2 g/kg i.p e no baço de animais

tratados com 5 g/kg v.o. A análise macroscópica dos órgãos revelou que as

fêmeas tratadas com Cqf-EtOH na dose de 2 g/kg i.p apresentaram alterações

no fígado, baço e pâncreas, enquanto os machos que receberam a mesma

dose apresentaram alterações no fígado, pâncreas e baço. Os animais que

receberam a dose de 5 g/kg v.o não apresentaram nenhum órgão com

alteração macroscópica. Os órgãos que mostraram diferença significativa foram

o baço, o fígado, rim e pâncreas na dose 2 g/kg i.p.

Em relação ao estudo histopatológico do tecido hepático, não foram

observadas alterações nos animais tratados com os extratos de C. quercifolius.

O parênquima do órgão mostrou-se ausente de lesões em todos os grupos,

tanto para os animais que receberam Cqc-EtOH, quanto para os que

receberam Cqf-EtOH, conforme figuras 20 (pág. 86) e 29 (pág. 106),

confirmando que os extratos não ocasionaram toxicidade às células hepáticas.

O estudo histopatológico do órgão pâncreas dos animais tratados

com Cqc-EtOH e Cqf-EtOH demonstrou que os extratos não ocasionaram

lesões pancreáticas, pois todos os grupos apresentaram o parênquima muito

bem preservado, Ilhotas pancreáticas e ácinos pancreáticos em bom estado de

conservação em todos os grupos, conforme figuras 21 (pág. 87) e 30

(pág. 107). A análise histológica dos rins também não demonstrou sinais de

toxicidade, pois podem ser observados túbulos renais e corpúsculo renal com

estruturas preservadas e sem ausência de sinais de nefrotoxicidade nas figuras

22 (pág. 88) e 31 (pág. 108). Dessa forma, o estudo da toxicidade aguda indica

que o extrato etanólico bruto das cascas e folhas de Cnidoscolus quercifolius

não apresentou toxicidade, porém, outros estudos com diferentes metodologias

devem ser realizados, com o intuito de determinar uma melhor segurança dos

extratos.


7. CONCLUSÕES


7. CONCLUSÕES

Diante dos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir

que os extratos brutos das cascas e folhas da espécie Cnidoscolus quercifolius

apresentaram atividades antinociceptiva e anti-inflamatória relevantes nas

doses testadas. Cqc-EtOH e Cqf-EtOH demonstraram efeito antinociceptivo

envolvendo mecanismos centrais e periféricos, que podem está relacionados

aos receptores opioides, além de possuírem atividade anti-inflamatória,

comprovadas pela diminuição da migração leucocitária e provavelmente

envolve a inibição da síntese de mediadores pró-inflamatórios.

Em relação à segurança de C. quercifolius, pode-se afirmar que os

extratos são de baixa toxicidade, pois não houve mortes dos animais que

receberam os extratos nas doses de 2,0 e 5,0 g/kg por via intraperitoneal e

oral, respectivamente. Cqc-EtOH e o Cqf-EtOH não ocasionou toxicidade aos

animais durante a toxicidade aguda. Foram encontradas algumas alterações

hematológicas e bioquímicas no estudo, que ainda estão sendo investigadas

para melhor esclarecer a sua importância clínica, bem como, faz-se necessário

a realização de outros ensaios de toxicidade sub-crônica e crônica no intuito de

determinar o perfil de segurança dos extratos para que os mesmos possam se

tornar agentes seguros para uso terapêutico.

Dessa forma, todos os resultados apresentados nesse trabalho são

considerados inéditos para a espécie em estudo, contribuindo assim, para os

estudos farmacológicos e toxicológicos de plantas pertencentes ao Bioma

Caatinga, em especial para às espécies da família Euphorbiaceae. Outro fato

relevante é a contribuição do presente trabalho para o surgimento de novas

pesquisas científicas com a espécie C. quercifolius, bem como com outras

espécies da Caatinga utilizada na medicina popular.


REFERÊNCIAS


REFERÊNCIAS

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APÊNDICES

134

APÊNDICE A – Artigo I

Artigo I:

ANTINOCICEPTIVE ACTIVITY OF THE ETHANOLIC EXTRACT

FROM BARKS AND LEAVES OF Cnidoscolus quercifolius

(EUPHORBIACEAE) IN MICE

135

ARTIGO I

Artigo submetido à:

Revista: Indian Journal of Pharmacology

Título: Antinociceptive activity of the ethanolic extract from barks and leaves of

Cnidoscolus quercifolius (Euphorbiaceae) in mice

Autores: Leandra Macedo de Araújo Gomes, Sarah Raquel Gomes de Lima-

Saraiva, Thayne Mayra Dantas de Andrade, Juliane Cabral Silva, Tâmara

Coimbra Diniz, Viviane Nunes Sousa Barreto, Lucindo José Quintans-Júnior,

Jullyana Siqueira de Sousa Quintans, Julianeli Tolentino de Lima, Jackson

Roberto Guedes da Silva Almeida.

136

Antinociceptive activity of the ethanolic extract from barks and

leaves of Cnidoscolus quercifolius (Euphorbiaceae) in mice

Leandra Macedo de Araújo Gomes1; Sarah Raquel Gomes de Lima-Saraiva2;

Thayne Mayra Dantas de Andrade1; Juliane Cabral Silva1, Tâmara Coimbra

Diniz1; Viviane Nunes Sousa Barreto1; Lucindo José Quintans-Júnior3, Jullyana

Siqueira de Sousa Quintans2, Julianeli Tolentino de Lima1, Jackson Roberto

Guedes da Silva Almeida1,*

1Federal University of San Francisco Valley, 56.304-205, Petrolina,

Pernambuco, Brazil

2Federal University of Pernambuco, 50.670-901, Recife, Pernambuco, Brazil

3Federal University of Sergipe, 49.100-000, São Cristóvão, Sergipe, Brazil

Running title: Antinociceptive activity of Cnidoscolus quercifolius

*Correspondence to: Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, E-mail:

[email protected]

137

ABSTRACT

Objectives: To evaluate the antinociceptive effect of the ethanolic extract from

barks (Cqb-EtOH) and leaves (Cql-EtOH) of Cnidoscolus quercifolius in mice

using experimental models of nociception.

Material and Methods: The antinociceptive activity was evaluated by writhing,

hot-plate and formalin tests. Additionally, the rota-rod test was used to evaluate

motor coordination.

Results: In the acetic acid-induced writhing test, the Cqb-EtOH (100, 200 and

400 mg/kg, i.p.) reduced the number of writhing by 83.70, 81.40 and 88.10%,

respectively, while Cql-EtOH reduced by 71.30, 79.40 and 98.70%,

respectively. In the formalin test, the extracts reduced the paw licking time in the

first and second phases, but the best results were observed in the second

phase (inflammatory pain), reducing by 66.08, 78.26 and 73.97%, as well as

60.11, 75.58 and 79.46% for Cqb-EtOH and Cql-EtOH, respectively. In the hot

plate test, the extracts increased the reaction time when compared to control

only at dose of 400 mg/kg. Using the rota-rod test, mice treated did not

demonstrate any significant motor performance changes.

Conclusions: It can be concluded that extracts from the barks and leaves of C.

quercifolius have antinociceptive activity which supports the popular use of this

plant to treat pain.

KEY WORDS: Cnidoscolus quercifolius; Euphorbiaceae; pain; inflammation.

Running title: Antinociceptive activity of Cnidoscolus quercifolius

138

Introduction

Medicinal plants are used over the years by humanity in order to promote

healing for diseases and pain relief, with several clinical procedures registered

with them. So, while allopathic medicine has obtained a breakthrough from the

second half of the XX century, there are still some barriers in their use by

disadvantaged populations. Thus, the use of medicinal plants stood out among

the poorest people in developing countries due to its easy to obtain and great

tradition of using medicinal plants.[1]

Many ethnopharmacological studies in Brazil have shown that a large

number of plant species are used by the local population to treat their diseases

particularly the family Euphorbiaceae, which has great medicinal use, as well as

the highly cited genus Cnidoscolus, popularly known as “urtiga” or “favela”. This

genus has 50 to 75 representatives, which are predominantly concentrated in

tropical America, almost exclusively in Mexico and northeastern Brazil.[2,3] The

distinct feature of this genus is the presence of stinging trichomes that, when

stimulated by contact with skin, can cause severe and localized pain.[4]

In the Caatinga biome, this genus is represented by four Cnidoscolus

medicinal species (C. infestus, C. pubescens, C. quercifolius and C. urens),

which are utilized for a variety of indications, including as an anti-inflammatory,

an antitumor agent for the genito-urinary system, an antiseptic and to treat

kidney infections, dermatological and ophthalmic lesions, bruises, fractures,

wounds, warts, dysentery, hemorrhage, appendicitis and rheumatism.[3, 5-7]

Cnidoscolus quercifolius is a species known as “faveleira” and “faveleira”,

and is a deciduous species, heliophytic, which occurs in xerophytic woods and

exhibits irregular dispersion. The species has been used in reforestation of

139

eroded areas of different soil habitats in the Caatinga. C. quercifolius also has

high economic value to be used as a food source for local populations and

livestock.[8] Several species of the genus Cnidoscolus are used in folk medicine

for treatment of diseases, including pain and inflammation.[7]

In our continuing search of the pharmacological properties of species

from the Caatinga biome, in the present paper we demonstrate the

antinociceptive effects of crude ethanol extracts from barks and leaves of C.

quercifolius in experimental models in mice.

Materials and methods

Drugs and chemicals

Acetic acid, formaldehyde, indomethacin and polyoxyethylenesorbitan

monolated (Tween 80) were purchased from Sigma (USA) and morphine was

obtained from União Química (Brazil). All drugs and extracts were administered

intraperitoneally (i.p.) in volumes of 0.1 mL/10 g (mice).

Plant material

The barks and leaves of C. quercifolius Pohl. were collected in the city of

Petrolina (Coordinates: S 09º03’55”; W 40º20’06”), State of Pernambuco, Brazil,

in February of 2012. The sample was identified by a biologist from EMBRAPA

Semiárido. A voucher specimen (19202) was deposited at the Herbarium Vale

do São Francisco (HVASF) of the Federal University of San Francisco Valley.

Extraction

140

The barks and leaves were dried and pulverized (1481 g and 482 g,

respectively), and macerated with ethanol 95% at room temperature for 72 h.

The solution was filtered and concentrated under reduced pressure in a rotatory

evaporator at 50 °C, producing 0.392 g of crude ethanol extract of barks (Cqb-

EtOH, 13.07% yield on dry weight of the plant) and 0.063 g of crude ethanol

extract of leaves (Cql-EtOH, 26.46% of yield on dry weight of the plant).

Animals

Adult male albino Swiss mice (30-40 g) were used throughout this study.

The animals were randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h

light/dark cycle with free access to food and water. Mice were used in groups of

six animals each, according to the requirements of individual experiments. All

tests were carried out by the same visual observer. Experimental protocols and

procedures were approved by Federal University of San Francisco Valley

Animal Care and Use Committee by number 0030/82012.

Pharmacological experiments

Acetic acid-induced writhing in mice

This test was performed as described by Collier et al.[9] with

modifications. Male mice (n= 6) were intraperitoneally pre-treated 30 min before

the nociceptive agent, acetic acid 0.9% (v/v, 0.1 ml/ 10 kg). Vehicle (saline +

drops of tween 80), Cqb-EtOH and Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.),

indomethacin (20 mg/kg, i.p.) and morphine (10 mg/kg, i.p.) were administered

before acetic acid injection. Following the injection of acetic acid, the intensity of

141

nociceptive behavior was quantified by counting the total number of writhes

occurring between 5 and 15 min after injection of the acetic acid.

Formalin test

The method used was described by Hunskaar and Hole[10] with some

modifications. Twenty microliters of 2.5% formalin was injected subcutaneously

into the right hind paw of male mice. The time (in seconds) spent in licking and

biting responses of the injected paw was taken as an indicator of pain response.

Responses were measured for 0-5 min (first phase, neurogenic phase) and 15-

30 min after formalin injection (second phase, inflammatory phase). Cqb-EtOH

and Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.), indomethacin (20 mg/kg, i.p.) and

morphine (10 mg/kg, i.p.) were administered 60 min before the formalin

injection. Control animals received the same volume of saline with drops of

tween 80. Mice were observed in the chambers with a mirror mounted on three

sides to allow view of the paws.

Hot plate test

Mice were divided into five groups of six mice each. Mice were pre-

selected on the hot plate at 55 ± 0.5 oC. Licks on the rear paws were the

parameters of observation. Animals showing a reaction time (latency for licking

the hind feet or jumping) greater than 20 s were discarded. The mice were then

treated with Cqb-EtOH and Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.), vehicle

(saline + drops of tween 80 i.p.) and morphine (10 mg/kg i.p.). The animals

were placed individually on a hot plate with constant temperature (55 ± 0.5 °C)

and the latency was measured at 30, 60, 90 and 120 min after administration of

142

extracts and morphine.[11] In order to protect the animal from potential tissue

damage, was chosen a cutoff time of 20 s.

Motor coordination test (rota-rod test)

A rota-rod treadmill device (Insight, Brazil) was used for the evaluation of

motor coordination.[12] Initially, 24 h before the test, mice capable of remaining

on the rota-rod apparatus longer than 180 s (7 rpm) were selected. Thirty

minutes after administration of Cqb- EtOH and Cql-EtOH (100, 200 and 400

mg/kg, i.p.), vehicle (saline + drops of tween 80) or diazepam (DZP, 2.5 mg/kg,

i.p.), each animal was tested in the rota-rod apparatus for 0.5, 1 and 2 h post-

treatment, and time (s) the rats were able to remain on top of the bar was

recorded for 180 s.

Statistical analysis

The data are expressed as the means ± S.E.M., and statistical

significance was determined using an analysis of variance (ANOVA) followed by

Dunnett’s test. All analysis was performed with the GraphPad Prism 4.0

program. Values were considered significant at p < 0.05.

Results

Acetic acid-induced writhing in mice

The intraperitoneal administration of Cqb-EtOH (100, 200 and 400

mg/kg) decreased significantly (p < 0.01) the number of writhing movements

induced by the administration of the acetic acid when compared with the control

143

group (Figure 1). The inhibitions of writhes in percentage were 83.70, 81.40 and

88.10%, respectively.

INSERT FIGURE 1

The administration of Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg) also

decreased significantly (p < 0.01) the number of writhing movements (Figure 2).

The inhibitions of writhes in percentage were 71.30, 79.40 and 98.70%,

respectively.

INSERT FIGURE 2

Formalin test

The results of the formalin test are shown in Figures 3 and 4. Cqb-EtOH

caused a significant inhibition of both neurogenic and inflammatory phases in

the licking induced by formalin. The result was most significative in the

inflammatory phase. Cqb-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.) decreased by

31.62, 51.10 and 68.33%, respectively, the paw licking time in the first phase,

as well as 66.08, 78.26 and 73.97%, respectively, the second phase of the

formalin test.

INSERT FIGURE 3

The Cql-EtOH extract also caused a significant inhibition of both

neurogenic and inflammatory phases in the formalin test. The result was most

144

significative in the inflammatory phase. Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.)

decreased by 44.28, 29.05 and 36.27%, respectively, the paw licking time in the

first phase, as well as 60.11, 75.58 and 79.46%, respectively, in the second

phase of the formalin test.

INSERT FIGURE 4

Hot plate test

In the hot plate test, significant effect was observed only at dose of 400 mg/kg

of Cqb-EtOH in the time of 30 min (p < 0.05), while the administration of Cql-

EtOH showed an increase in latency time for the dose of 400 mg/kg at 90 and

120 minutes after administration (Figures 5 and 6).

INSERT FIGURE 5

INSERT FIGURE 6

Motor coordination test (rota-rod test)

In this test, Cqb-EtOH and Cql-EtOH did not impair motor coordination at

0.5, 1 and 2 h post-administration. Diazepam (2.5 mg/kg) caused a significant

decrease in time that the animals remained on the rota-rod apparatus,

compared to the control group (Figures 7 and 8).

INSERT FIGURE 7

INSERT FIGURE 8

145

Discussion

This study showed for the first time the antinociceptive effect of crude

extracts obtained from bark and leaves of Cnidoscolus quercifolius in different

nociceptive responses generated by different noxious stimuli. Three

experimental models were used to assess the antinociceptive activity and a

model was used to assess motor coordination.

In folk medicine in the Northeast of Brazil, the decoction, infusion and

maceration of the stem bark and inner bark of C. quercifolius are used against

ovarian inflammation and general inflammation.[13]

The first test conducted to evaluate the antinociceptive activity was the

abdominal writhing test. This model is employed for the initial screening of new

molecules with potential analgesic. Due to its low selectivity, most agents cause

a change in the number of writhes, as other models should be tested. Pain is

generated through the release of endogenous mediators such as bradykinin

and serotonin, besides the involvement of cyclooxygenase release of

arachidonic acid through the biosynthesis of prostaglandins.[14] Thus, the

administration of Cq-EtOH from barks and leaves can cover hypothesized to act

by inhibiting prostaglandin synthesis.

To distinguish between the central and peripheral antinociceptive action

of the extracts, the formalin test was performed. This model acts to promote a

chemical stimulus that induces a spontaneous response to pain, being divided

into two distinct phases, which reflect different types of pain.[10] The first phase

(neurogenic pain) starts immediately after injection and lasts for approximately

five minutes, this stage is followed by a quiescent period of about 5-10 minutes,

after which develops a second phase (inflammatory pain) response, which

146

starts 15-30 minutes after injection.[10] In this experiment, the Cqb-EtOH and

Cql-EtOH decreased the licking time in both phases, but the effect was more

significant for both extracts in the second phase. The decrease of licking time in

both phases is characteristic of drugs acting at the central level and the

possibility of interaction with opioid receptors. The first stage is more sensitive

to opioid analgesics, but indomethacin and acetylsalicylic acid respond better in

the second phase.[15] The extracts showed effects in the second phase,

indicating a possible anti-inflammatory effect.

The evaluation of Cqb-EtOH and Cql-EtOH administration with the hot

plate showed that the extracts presented effect in the hot plate test. The Cqb-

EtOH extract increased the latency time at dose of 400 mg/kg after 30 minutes.

The Cql-EtOH extract increased the latency time at dose of 400 mg/kg after 90

and 120 minutes. As the hot plate test is a specific central antinociceptive test, it

is possible that Cqb-EtOH and Cql-EtOH exerts an antinociceptive effect at

least in part through central mechanisms. This result is similar to what was

observed in the formalin test with Cqb-EtOH and Cql-EtOH inhibiting of both

phases of nociception.

Finally, to assess whether Cqb-EtOH and Cql-EtOH produces a loss of

motor coordination in animals, a rota-rod test was performed. The results

revealed that the extracts did not produce changes in motor coordination of

treated animals.

It can be concluded that the Cqb-EtOH and Cql-EtOH have

antinociceptive activity, its effect is probably mediated by inhibition of peripheral

and central mediators, however, the extracts did not affect motor coordination of

animals. Thus, our results confirm that Cnidoscolus quercifolius has therapeutic

147

potential to act in combating of pain, corroborating its popular use. Other

studies are underway to enable us to understand the precise mechanisms of

action of Cqb-EtOH and Cql-EtOH.

Acknowledgements

The authors are grateful to the Brazilian agencies CNPq, CAPES and

FACEPE for financial support.

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Figure 1: Effect of ethanolic extract of barks of Cnidoscolus quercifolius (Cqb-

EtOH 100, 200 and 400 mg/kg), indomethacin (INDO 20 mg/kg) and morphine

(MORPH 10 mg/kg), on acetic acid induced writhing test in mice. Values are

mean ± S.E.M. *p < 0.05, significantly different from control, ANOVA followed

Dunnett’s test (n = 6, by group).

Control 100 200 400 INDO MORPH0

10

20

30

Cqb-EtOH (mg/kg)

** **** **

**

Nu

mb

er

of

wri

thin

gs

150

Figure 2: Effect of ethanolic extract of leaves of Cnidoscolus quercifolius (Cql-


(MORPH 10 mg/kg), on acetic acid induced writhing test in mice. Values are

mean ± S.E.M. *p < 0.05, significantly different from control, ANOVA followed

Dunnett’s test (n = 6, by group).


10

20

30

40

Cql-EtOH (mg/kg)

****

****

**

Nu

mb

er

of

wri

thin

gs

151



(MORPH 10 mg/kg), on formalin test (first and second phase) in mice. Values

are mean ± S.E.M. *p < 0.05, significantly different from control; ANOVA

followed Dunnett’s test (n = 6, by group).


10

20

30

40

50

60

First phase

**

**

**

*

Cqb-EtOH (mg/kg)

Lic

kin

g t

ime (

s)


50

100

150

200

Second phase

****

****

**

Cqb-EtOH (mg/kg)

Lic

kin

g t

ime (

s)

152



(MORPH 10 mg/kg), on formalin test (first and second phase) in mice. Values

are mean ± S.E.M. *p < 0.05, significantly different from control; ANOVA

followed Dunnett’s test (n = 6, by group).


10

20

30

40

50

60

**

**

First phase

***

Cql-EtOH (mg/kg)

Lic

kin

g t

ime (

s)


50

100

150

200

****

**

Second phase

****

Cql-EtOH (mg/kg)

Lic

kin

g t

ime (

s)

153


EtOH 100, 200 and 400 mg/kg) and morphine (MORPH 10 mg/kg), on hot plate

test in mice. Values are mean ± S.E.M. *p < 0.05, significantly different from

control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, by group).


EtOH 100, 200 and 400 mg/kg) and morphine (MORPH 10 mg/kg), on hot plate

test in mice. Values are mean ± S.E.M. *p < 0.05, significantly different from

control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, by group).

30 60 90 1200

5

10

15

20Control

Cqb-EtOH 100 mg/kg

Cqb-EtOH 200 mg/kg

Cqb-EtOH 400 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

**

*

*

*

*

Time (min)

Late

ncy t

ime (

s)

30 60 90 1200

5

10

15

20Control

Cql-EtOH 100 mg/kg

Cql-EtOH 200 mg/kg

Cql-EtOH 400 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

****

**

****

**

Time (min)

Late

ncy t

ime (

s)

154


EtOH 100, 200 and 400 mg/kg) and diazepam (2.5 mg/kg), on motor

coordination test in mice (rota-rod test). Values are mean ± S.E.M. *p < 0.05,

significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, by

group).


EtOH 100, 200 and 400 mg/kg) and diazepam (2.5 mg/kg), on motor

coordination test in mice (rota-rod test). Values are mean ± S.E.M. *p < 0.05,

significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, by

group).

0

50

100

150

200Control

Cqb-EtOH 100 mg/kg

Cqb-EtOH 200 mg/kg

Cqb-EtOH 400 mg/kg

Diazepam 2.5 mg/kg

0.5 h 1 h 2 h

** ****

Tim

e (

s)

on

Ro

ta-r

od

0

50

100

150

200Control

Cql-EtOH 100 mg/kg

Cql-EtOH 200 mg/kg

Cql-EtOH 400 mg/kg

Diazepam 2.5 mg/kg

0.5 h 1 h 2 h

** ** **

Tim

e (

s)

on

Ro

ta-r

od

(s)

155

APÊNDICE B – Carta de submissão

156

APÊNDICE C – Artigo II

Artigo II:

PHYTOCHEMICAL SCREENING AND ANTI-INFLAMMATORY

ACTIVITY OF Cnidoscolus quercifolius (EUPHORBIACEAE) IN

MICE

157

ARTIGO II

Artigo submetido à:

Revista: Pharmacognosy Research

Título: Phytochemical screening and anti-inflammatory activity of Cnidoscolus

quercifolius (Euphorbiaceae) in mice

Autores: Leandra Macedo de Araújo Gomes, Thayne Mayra Dantas de

Andrade, Juliane Cabral Silva, Julianeli Tolentino de Lima, Lucindo José

Quintans-Júnior, Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida.

158

Phytochemical Screening and Anti-inflammatory Activity of

Cnidoscolus quercifolius (Euphorbiaceae) in Mice

LMA Gomes1; TMD Andrade1; JC Silva1, JT Lima1, LJ Quintans-Júnior2,

JRGS Almeida1,*

1Center of Studies and Research of Medicinal Plants (NEPLAME), Federal

University of San Francisco Valley, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil

2Department of Physiology, Federal University of Sergipe, 49.100-000, São

Cristóvão, Sergipe, Brazil

Correspondence Address:

J R G S Almeida

Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Universidade Federal

do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil

E-mail: [email protected]; Phone/Fax: +55-87-21016862

159

ABSTRACT

Background: Cnidoscolus quercifolius is a species popularly known as

“faveleira”, and belonging to the Caatinga biome (semi-arid vegetation, Brazil),

where is used in folk medicine as an anti-inflammatory. Objective: To evaluate

the anti-inflammatory effect of the ethanolic extract from barks (Cqb-EtOH) and

leaves (Cql-EtOH) of Cnidoscolus quercifolius in mice using experimental

models of inflammation. Material and Methods: The preliminary phytochemical

analysis of the ethanolic extract was performed. The anti-inflammatory activity

was evaluated by paw edema induced by carrageenan and leukocytes

migration to the peritoneal cavity induced by carrageenan methods. Results: A

preliminary analysis of Cqb-EtOH revealed that it contained coumarins,

flavonoids, monoterpenes/diterpenes and naphthoquinones, while the Cql-EtOH

showed positive reaction to coumarins, anthracene derivatives, flavonoids,

lignans and triterpenes/steroids. Cqb-EtOH and Cql-EtOH (100, 200 and 400

mg/kg) inhibited significantly (p < 0.01) the increase in the edema volume after

administration of carrageenan. In the peritonitis test, acute pre-treatment with

Cqb-EtOH and Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg) inhibited the leukocyte

migration. Conclusions: It can be concluded that extracts from the barks and

leaves of C. quercifolius have anti- inflammatory activity which supports the

popular use of this plant to treat inflammation. Thus, extracts has significant

anti-inflammatory properties, which are related probably to inhibition of release

of mediators of the inflammatory process.

Key words: Cnidoscolus quercifolius; Euphorbiaceae; inflammation, medicinal

plants.

160

Introduction

The Euphorbiaceae family is considered of big economic importance among the

Angiosperms.[1] It is characteristic of this family the occurrence of various

secondary metabolites, among which stand out alkaloids, flavonoids, tannins

and coumarins.[2] Another important class of secondary metabolites present in

species of this family are the diterpenes, as they are considered the most

characteristic group of substances in this complex family.[3]

Inside the family Euphorbiaceae is the genus Cnidoscolus, which is well

represented in Brazil (about 18 species), especially in the northeastern (about

10 species), and this region is one of the probable centers of diversity of

Cnidoscolus.[4] In relation to the phytochemistry, there are reports of the

presence of alkaloids and terpenoids in the genus Cnidoscolus.[5] [6] Chemical

investigation of C. phyllacanthus had led to isolation of three new terpenoids

from the barks: a bis-nor-diterpene, phyllacantone and two triterpenes, 3β-O-

cinnamoyl-lupeol and 3β-O-dihidrocinnamoyl-lupeol.[7]

Cnidoscolus quercifolius Pohl. is a species popularly known as “faveleira” and

“faveleira”, the tree is known to possess stinging trichomes distributed

throughout the plant. This species produces latex, which is widely used for

medicinal purposes. It´s roots are tuberous and store nutrients used during the

dry season, a period when flowering and fruiting of this species occurs.[8]

Regarding use in folk medicine, C. quercifolius is used to fight inflammation.[9]

161

The inflammation is the earliest organic response before tissue damage or

infection. Before a tissue injury, the local accumulation of prostaglandins,

thromboxanes and other chemical mediators cause a change in the threshold

nociceptors, resulting in hyperalgesia.[10] [11] The inflammatory process is part of

a mechanism of host defense against stimuli that cause injuries, but when this

process is not controlled, can damage the health of the individual.[12] The

cardinal signs that identify the inflammation are heat, flushing (redness), tumor

(swelling), pain and loss of function, of which the first four were described by

Cornelius Celsus.[13]

Considering the large consumption in our region and scarcity of chemical and

pharmacological studies about this species, in our continuing search of the

pharmacological properties of species from the Caatinga biome, in this paper

we demonstrate the anti-inflammatory effects of crude ethanol extracts from

barks and leaves of C. quercifolius in experimental models in mice.

Materials and methods

Plant material

The barks and leaves of C. quercifolius Pohl. were collected in the city of

Petrolina (Coordinates: S 09º03’55”; W 40º20’06”), State of Pernambuco, Brazil,

in February of 2012. The sample was identified by a biologist from EMBRAPA

Semiárido. A voucher specimen (19202) was deposited at the Herbarium Vale

do São Francisco (HVASF) of the Federal University of San Francisco Valley.

162

Preparation of the extracts

The barks and leaves were dried and pulverized (1481 g and 482 g,

respectively), and macerated with ethanol 95% at room temperature for 72 h.

The solution was filtered and concentrated under reduced pressure in a rotatory

evaporator at 50 °C, producing 0.392 g of crude ethanol extract of barks (Cqb-

EtOH, 13.07% yield on dry weight of the plant) and 0.063 g of crude ethanol

extract of leaves (Cql-EtOH, 26.46% of yield on dry weight of the plant).

Animals

Adult male albino Swiss mice (30-40 g) were used throughout this study. The

animals were randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h

light/dark cycle with free access to food and water. Mice were used in groups of

six animals each, according to the requirements of individual experiments. All

tests were carried out by the same visual observer. Experimental protocols and

procedures were approved by Federal University of San Francisco Valley

Animal Care and Use Committee by number 0030/82012.

Preliminary phytochemical screening

Preliminary phytochemical analyses of the extracts were performed as

described by Wagner and Bladt,[14] seeking to highlight the major groups of

secondary metabolites. It was evaluated the presence of alkaloids,

anthocyanins, coumarins, anthracene derivatives, flavonoids, lignans, mono

and diterpenes, naphthoquinones, saponins, steroids and terpenoids.

163

Pharmacological experiments

Carrageenan-induced hind paw edema

The test of paw edema induced by carrageenan 2% consists of injecting a

volume of 20 µl/animal in the subplantar region (s.pl.), the right paw of the

mouse.[15] Subsequently, to assess the extent of the volume of the paws

immersed itself right paw to the lateral malleolus in an electric plethysmometer.

The mice were divided into five groups of six animals each. The animals were

treated with Cqb-EtOH and Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.), vehicle

(saline) and indomethacin (20 mg/kg, i.p.) 30 minutes before the injection of

carrageenan. The mice pedal volume up to the ankle joint was measured using

plethysmometer (PanLab LE 7500, Spain) before (VA, baseline) the intraplantar

administration of carrageenan and 1, 2, 3, 4 and 5 h after (VB), as described

previously.[16] The inhibition of the edema paw was calculated by (VB-VA)/VA,

where VA is the volume of the right hind paw before carrageenan injection, and

VB is the volume of the right hind paw after carrageenan injection.

Leukocyte migration to the peritoneal cavity

The animals were divided into five groups of six animals each. Leukocyte

migration was induced by injection of carrageenan (1%, i.p., 0.25 mL) into the

peritoneal cavity 1 h after administration of Cqb-EtOH and Cql-EtOH (100, 200

and 400 mg/kg i.p.), vehicle (saline, i.p.) and dexamethasone (2 mg/kg, i.p.), the

solution of carrageenan was administered 30 minutes later of pre-treatments.

The migration of leukocytes was measured 4 hours after stimulation, and the

animals euthanized and cells were harvested from the peritoneal cavity with 3

164

ml of saline containing 1 mM EDTA. Immediately, a short massage was

performed and then the peritoneal fluid was collected, it was centrifuged (3000

rpm for 6 min) at room temperature. The supernatant was discarded and 300 μl

of EDTA was added to the precipitate, which was removed at a rate of 10 μl.

200 μl solution Turk at the rate and total cells were counted in a Neubauer

chamber, in an optical microscope was added. The results were expressed as

the number of leukocytes/ml.[17]

Statistical analysis

The data are expressed as the means ± S.E.M., and statistical significance was

determined using an analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s test.

All analysis was performed with the GraphPad Prism 4.0 program. Values were

considered significant at p < 0.05.

Results

Preliminary phytochemical screening

The preliminary phytochemical analysis indicated a positive reaction for the

presence of coumarins, flavonoids, monoterpenes/diterpenes and

naphthoquinones in Cqb-EtOH, while the Cql-EtOH showed positive reaction to

coumarins, anthracene derivatives, flavonoids, lignans and triterpenes/steroids.

However, Cqb-EtOH showed negative for the presence of alkaloids,

anthocyanins, anthracene derivatives, lignans, saponins and

triterpenes/steroids and Cql-EtOH negative for alkaloids, anthocyanins,

165

monoterpenes/diterpene quinones, saponins and triterpenes/steroids. The

results are presented in the Table 1.

INSERT TABLE 1

Carrageenan-induced hind paw edema

The paw edema induced by carrageenan test revealed an anti-inflammatory

effect of the extracts. Pre-treatment with Cqb-EtOH (i.p.) significantly inhibited

at all times only at the dose of 200 mg/kg (p < 0.01), whereas a dose of 100

mg/kg inhibited only from 3 h to 5 h (p < 0.01) after using the carrageenan

induced edema (Figure 1).

INSERT FIGURE 1

The paw edema induced by carrageenan in mice was reduced after pre-

treatment with the Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.). The edema was

significantly inhibited only at a dose of 100 mg from 4 h (p < 0.01) and 5 h (p <

0.01) (Figure 2).

INSERT FIGURE 2

Leukocyte migration to the peritoneal cavity

The i.p. administration of Cqb-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg), 1 h before

injection of carrageenan (1%, i.p., 0.25 ml) inhibited leukocyte migration (p <

0.01) when compared to the control group (Figure 3).

166

INSERT FIGURE 3

Pre-treatment with crude ethanolic extract of leaves (Cql-EtOH 100, 200 and

400 mg/kg, i.p.) 1 h before carrageenan injection also inhibited leukocyte

migration (p < 0.01) when compared to the control group (Figure 4).

INSERT FIGURE 4

Discussion

In the present study, we demonstrate for the first time, the anti-inflammatory

effects of crude ethanol extract of the barks and leaves of C. quercifolius

through various inflammatory responses. This anti-inflammatory effects

presented by Cqc-EtOH and Cqf-EtOH, are probably associated with a variety

of chemical constituents that were identified in the preliminary phytochemical

analysis of the extracts (Table 1).

In the evaluation of anti-inflammatory activity, the paw edema test was

performed. This model consists of two stages, the first being evaluated between

1 to 1.5 hours after carrageenan injection is characterized by the formation of a

non-phagocytic edema, whereas the second stage 2-5 hours after injection, is

characterized by increased formation of edema, which remains to 5 hours.[18]

Inflammation induced by carrageenan involves three distinct phases of release

of the mediators. In the first phase occurs liberation of serotonin and histamine

(0–2 h), in the second phase kinins are liberated (3 h), and prostaglandin in the

167

third phase (after 4 h).[19] Thus, the Cqb-EtOH inhibited paw edema significantly

at all times only at the dose of 200 mg/kg, while the dose of 100 mg/kg inhibited

only from 3 h to 5 h, while the Cql-EtOH inhibited paw edema at a dose of only

100 mg from 4 h to 5 h.

The inflammation produced by injection of carrageenan into the peritoneal

cavity is slow and prolonged, making it possible to evaluate the leakage of

liquid, as well as cell migration, besides the participation of cytokines, enzymes,

and chemical mediators, such as nitric oxide, prostaglandin E2, IL-1β, IL-6 and

TNF-α, by utilizing different phlogistic agents.[20] In the test of carrageenan-

induced peritonitis, Cqb-EtOH and Cql-EtOH inhibited the leukocyte migration at

all tested doses. Probably the extracts contain substances that act in blocking

the synthesis of mediators responsible for leukocyte chemotaxis, and it is not

possible to establish the mechanism involved.

The present study has demonstrated that crude ethanol extracts of the barks

and leaves of C. quercifolius has significant anti-inflammatory properties, which

are related probably with inhibition of release of mediators of the inflammatory

process, such as prostaglandins, histamine and neutrophils.

Conclusion

It can be concluded that extracts from the barks and leaves of C. quercifolius

have anti-inflammatory activity, which supports the popular use of this plant to

treat inflammation.

168

Acknowledgements

The authors are grateful to the Brazilian agencies CNPq, CAPES and FACEPE

for financial support.

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171

APÊNDICE D – Carta de submissão

172

APÊNDICE E – Certificado

173

APÊNDICE F – Resumo

VIII Jornada de Iniciação Científica

II Jornada de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação

II Mostra de pós-Graduação

21 a 23 de novembro de 2013

ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DAS CASCAS DE

Cnidoscolus quercifolius (EUPHORBIACEAE)

Leandra Macedo de Araújo Gomes1,2, Thayne Mayra Dantas de Andrade2, Sarah Raquel Gomes de Lima Saraiva3, Viviane Nunes Sousa Barreto2, Tâmara Santos Diniz2, Juliane Cabral Silva2, Jackson R. G. S. Almeida1,2, Julianeli T. de Lima1,2

1

Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do Semiárido, Campus Petrolina, Av. José de Sá Maniçoba, S/N, centro - Petrolina – PE CEP: 56304-205. 2 Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Laboratório de Bioquímica e Fisiologia,

Universidade Federal de Vale do São Francisco.

3 Laboratório de Produtos Naturais, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade

Federal de Pernambuco.

Introdução A planta conhecida popularmente como faveleira, de nome científico

Cnidoscolus quercifolius (Euphorbiaceae), é uma das espécies pertencentes ao bioma

caatinga, que se destaca pela sua extraordinária resistência à seca. Seu emprego

popular consiste em recuperar áreas degradadas, na alimentação animal e humano,

na medicina popular, serrarias e como fonte de energia, dentre outros usos (NETO et

al., 2009).

Em relação à dor, esta é uma modalidade sensorial que em muitos casos

representão o único sintoma para o diagnóstico de várias doenças. Ela tem muitas

vezes uma função protetora. Já o processo inflamatório consiste na resposta orgânica

mais precoce diante de lesão tissular ou infecção. Perante um trauma tissular, o

acúmulo local de prostaglandinas, tromboxanos e outros mediadores químicos

ocasionam uma alteração no limiar de nociceptores, com consequente hiperalgia

(ALMEIDA; NAVARRO; BARBOSA-FILHO, 2001; KUMMER & COELHO, 2002).

Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antinociceptiva e motora do extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius. Em levantamento bibliográfico realizado nos principais bancos de dados sobre estudos com plantas medicinais, não foram encontrados registros de estudos com essa espécie e sua ação antinociceptiva.

Materiais e Métodos O material vegetal foi coletado no município de Petrolina, na Empresa

Brasileira de Pesquisas Agropecuárias - Embrapa Semiárido. A coleta e identificação

VIII JIC/

II JOINT/

II Mostra de Pós-graduação

174

foram realizadas por um botânico, e a exsicata da espécie foi depositada no Herbário

Vale do São Francisco (HVASF), no Centro de Referência para Recuperação de Áreas

Degradadas (CRAD) na UNIVASF sob a identificação de número 19202.

O material vegetal (cascas) foi levado à estufa à temperatura média de 40 °C

por um período de 72 horas. Após a secagem e completa estabilização o material foi

pesado e pulverizado. O material vegetal seco e pulverizado foi submetido à

maceração exaustiva com etanol 95% em um recipiente de aço inoxidável. Foram

feitas várias extrações num intervalo de 72 horas entre cada extração até completo

esgotamento da droga. A solução extrativa obtida passou por um processo de

destilação do solvente em evaporador rotativo a uma temperatura média de 50 °C.

Após este processo de evaporação do solvente, obteve-se o EEB.

Foram utilizados grupos de camundongos (n=6) (Mus musculus) Swiss,

machos, albinos, pesando entre 30–40 gramas, todos provenientes do Biotério da

UNIVASF e foram mantidos em gaiolas coletivas com alimentação e água ad libitum. A

atividade antinociceptiva do EEB cascas (100; 200 e 400 mg/kg i.p) foi avaliada

através do teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, teste da

lambida da pata induzida pela formalina e pelo teste da placa quente, enquanto a

avaliação da coordenação motora foi feita pelo teste de Rota-Rod. Indometacina (20

mg/kg i.p.), morfina (10 mg/kg i.p.) e Diazepam (2,5 mg/kg i.p.) foram utilizadas como

drogas padrão. Os grupos controle receberam solução salina. A análise dos dados foi

feita no programa GraphPadPrism

Resultados e Discussão

Durante a realização do teste das contorções abdominais, os números de

contorções diminuíram significativamente (p<0,01) em relação ao grupo controle, após

a administração por via i.p. dos EBB das cascas de C. quercifolius. No EBB das

cascas, os efeitos foram similares nas doses 100 mg/kg (83,7% de inibição), 200

mg/kg (81,4% de inibição) e 400 mg/kg (88,1% de inibição).

CONTROLE 100 200 400 INDO MORF0

10

20

30

Cq-EtOH (mg/kg)

** **** **

**NÚ

ME

RO

DE

CO

NT

OR

ÇÕ

ES

Figura 01: Efeito antinociceptivo do Cq-EtOH de Cnidoscolus quercifolius no teste das

contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos. Foram

utilizadas indometacina e morfina como controle positivo. Os valores são significantes

quando *P<0,05; **P<0,01 e ***P<0,001; ANOVA + Dunnet.

175

No teste da formalina o tempo de lambida da pata diminuiu na primeira e na

segunda fase após a administração do EEB das cascas, sendo as melhores respostas

obtidas na segunda fase na dose de 200 mg/kg (78,26% de inibição). Em relação ao

teste da placa quente o EEB das cascas não proporcionou o aumento do tempo de

latência. E por fim, o EEB das cascas não provocou alteração na coordenação motora

dos camundongos no teste do Rota-Rod.

Conclusões Os resultados obtidos demonstram que as cascas da espécie Cnidoscolus

quercifolius possui atividade antinociceptiva, atuado possivelmente na dor inflamatória,

sendo seu mecanismo de atuação provavelmente a nível periférico. Outros estudos

ainda são necessários para caracterizar o mecanismo de ação preciso dos extratos. A

coordenação motora dos animais não foi alterada pela administração do extrato.

Agradecimentos Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e

a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Referências ALMEIDA, R. N.; NAVARRO, D. S.; BARBOSA-FILHO, J. M. Plants with central analgesic activity. Revista Phytomedicine, Stuttgart, v. 8, n. 4, p. 310-322, jul. 2001. Disponível em: http://artigocientifico.uol.com.br/uploads/artc_1146349999_70.pdf. Acesso em: 16 jan. 2012. KUMMER, C. L.; COELHO, T. C. R. B. Antiinflamatórios Não Esteróides Inibidores da Ciclooxigenase-2 (COX-2): Aspectos Atuais. Revista Brasileira Anestesiologia, Botafogo-RJ, v. 52, n. 4, p.498-512, jul./ago. 2002. Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/rba/v52n4/v52n4a14.pdf. Acesso em: 16 jan. 2012. NETO, J. P. et al. AVALIAÇÃO DA AÇÃO CLASTOGÊNICA DO ÓLEO DE Cnidoscolus phyllacanthus (Mart.) Pax. et K. Hoffm EM CÉLULAS MEDULARES. Revista de Biologia e Farmácia, Campina Grande, v. 3, n. 1, p. 6-22, mar. 2009.

176

APÊNDICE G – Certificado

177

APÊNDICE H – Resumo

cvfcvcv

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E DA COORDENAÇÃO MOTORA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DAS FOLHAS DE

Cnidoscolusquercifolius(EUPHORBIACEAE)

1L.M. DE A. GOMES,1S.R.G. DE L. SARAIVA, 1T.M.D. DE ANDRADE, 1J.C.SILVA, 1T.S. DINIZ, 1V.N.S. BARRETO, 1J.R.G. DA S. ALMEIDA; 1J.T.

DE LIMA.

1Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Laboratório de Bioquímica e Fisiologia, Universidade Federal de Vale do São Francisco.

[email protected]

RESUMO A espécie Cnidoscolusquercifolius(Euphorbiaceae) é conhecida

popularmente como faveleira e pertence ao bioma Caatinga. O presente

trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antinociceptiva e motora doEEB

(Extrato Etanólico Bruto) das folhas de C. quercifolius. Foram utilizados grupos

de camundongos (n=6) (Mus musculus). A atividade antinociceptiva do EEB

das folhas foi avaliada através do teste das contorções abdominais induzidas

pelo ácido acético, teste da lambida da pata induzida pela formalina e pelo

teste da placa quente. A coordenação motora foi avaliada pelo Teste de Rota-

Rod.Os resultados obtidos demonstraram que a espécie C.quercifoliuspossui

atividade antinociceptiva e a coordenação motora dos animais não foi alterada

pela administração do extrato.

INTRODUÇÃO

A espécie Cnidoscolusquercifolius(faveleira) é uma das plantas pertencentes ao bioma caatinga, que se destaca pela sua extraordinária resistência à seca. Seu emprego popular consiste em recuperar áreas degradadas, na alimentação animal e humano, na medicina popular, serrarias e como fonte de energia, dentre outros usos (NETO et al., 2009).

Segundo Lorenzi (1998) a faveleira é uma espécie pertencente à família Euphorbiaceae, trata-se de uma planta oleaginosa, xerófila, decídua, heliófila e pioneira. Atinge 4 a 8 metros de altura, dotada de copa alongada ou

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21 a 25 de novembro de 2011UFPE Recife & Mar Hotel

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II3º Encontro Brasileiro para Inovação Terapêutica

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arrendondada e rala. Tronco curto e ramificado desde a base, mais ou menos cilíndrico, com casca fina, lenticelada e quase lisa, de 20 a 35 cm de diâmetro.

Em relação à dor, esta é uma modalidade sensorial que em muitos casos representão o único sintoma para o diagnóstico de várias doenças. Ela tem muitas vezes uma função protetora. Já o processo inflamatório consiste na

resposta orgânica mais precoce diante de lesão tissular ou infecção. Perante um trauma tissular, o acúmulo local de prostaglandinas, tromboxanos e outros mediadores químicos ocasionam uma alteração no limiar de nociceptores, com consequente hiperalgia(ALMEIDA; NAVARRO; BARBOSA-FILHO, 2001; KUMMER & COELHO, 2002).

Nesse sentido, o presente trabalho realizou a avaliação da atividade

farmacológica do extrato da espécie Cnidoscolusquercifolius, abordando

aspectos deatividadeantinociceptiva e da coordenação motora. Em

levantamento bibliográfico realizado nos principais bancos de dados sobre

estudos com plantas medicinais, não foram encontrados registros de estudos

com essa espécie e sua ação antinociceptiva.

OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade

antinociceptiva e motora do extrato etanólico bruto das folhas de Cnidoscolusquercifolius. MATERIAIS E MÉTODOS

O material vegetal foi coletado no município de Petrolina, na Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecuárias - Embrapa Semiárido. A coleta e identificação foram realizadas por um botânico, e a exsicata da espécie foi depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF), no Centro de Referência para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD) na UNIVASF sob a identificação de número 19202.

O material vegetal (folhas) foi levado à estufa à temperatura média de 40 °C por um período de 72 horas. Após a secagem e completa estabilização o material foi pesado e pulverizado. O material vegetal seco e pulverizado foi submetido à maceração exaustiva com etanol 95% em um recipiente de aço inoxidável. Foram feitas várias extrações num intervalo de 72 horas entre cada extração até completo esgotamento da droga. A solução extrativa obtida passou por um processo de destilação do solvente em evaporador rotativo a uma temperatura média de 50 °C. Após este processo de evaporação do solvente, obteve-se o EEB.

Foram utilizados grupos de camundongos (n=6) (Mus musculus) Swiss, machos, albinos, pesando entre 30–40 gramas, todos provenientes do Biotério da UNIVASF e foram mantidos em gaiolas coletivas com alimentação e água ad libitum.Aatividadeantinociceptiva do EEB folhas (100; 200 e 400 mg/kg i.p) foi avaliada através do teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, teste da lambida da pata induzida pela formalina e pelo teste da placa quente, enquanto a avaliação da coordenação motora foi feita pelo teste de Rota-Rod. Indometacina (20 mg/kg i.p.), morfina (10 mg/kg i.p.) e Diazepam (2,5 mg/kg i.p.) foram utilizadas como drogas padrão. Os grupos controle

179

receberam solução salina. A análise dos dados foi feita no programa

GraphPadPrism RESULTADOS E DISCUSSÃO

Durante a realização do teste das contorções abdominais, os números

de contorções diminuíram significativamente (p<0,01) em relação ao grupo

controle, após a administração por via i.p. do EBB das folhas de C.quercifolius.

Os efeitos foram maiores nas doses de 400 mg/kg (98,7% de inibição), 200

mg/kg (79,4% de inibição) e 100 mg/kg (71,3% de inibição), conforme ilustrado

na figura 01.


10

20

30

40

Cq-EtOH (mg/kg)

**

****

****

**

Núm

ero

de c

onto

rções

FIGURA 01: Efeito antinociceptivo do EEB das folhas da espécie C.quercifolius(Euphorbiaceae) no teste das contorções abdominais induzida pelo ácido acético. Os valores são significantes quando *P<0,05; **P<0,01 e ***P<0,001; ANOVA + Dunnet.

No teste da formalina o tempo de lambida da pata diminuiu na primeira e

na segunda fase após a administração do EEB das folhas, sendo as melhores

respostasobtidas na segunda fase na dose de 400 mg/kg (79,46% de inibição).

Em relação ao teste da placa quente o EEB das folhas na dose de 400

mg/kg proporcionou o aumento do tempo de latência significativamente (p<

0,05), dados apresentados na figura 2. E por fim, o EEB das folhas não

provocou alteração na coordenação motora dos animais no teste do Rota-Rod.

180

30 60 90 1200

5

10

15

20Controle

Folhas -EtOH 100 mg/kg

Folhas-EtOH 200 mg/kg

Folhas - EtOH 400 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

****

**

*

Tempo (min)

Tem

po d

e L

atê

ncia

(s)

FIGURA 02: Efeito antinociceptivo do EEB das folhas da espécie C.quercifolius(Euphorbiaceae) no teste da placa quente. Os valores são significantes quando *P<0,05; **P<0,01 e ***P<0,001; ANOVA + Dunnet. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos demonstram que as folhas da espécie

Cnidoscolusquercifoliuspossui atividade antinociceptiva, atuado possivelmente

na dor inflamatória, sendo seu mecanismo de atuação provavelmente a nível

periférico, com exceção da dose de 400 mg/kg que apresentou resposta tanto a

nível periférico como a nível central. Outros estudos ainda são necessários

para caracterizar o mecanismo de ação preciso dos extratos. A coordenação

motora dos animais não foi alterada pela administração do extrato.

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALMEIDA, R. N.; NAVARRO, D. S.; BARBOSA-FILHO, J. M. Plantswith central analgesicactivity. Revista Phytomedicine, Stuttgart,v. 8, n. 4, p. 310-322, jul. 2001. Disponível em: http://artigocientifico.uol.com.br/uploads/artc_1146349999_70.pdf. Acesso em: 16 jan. 2012.

KUMMER, C. L.; COELHO, T. C. R. B.Antiinflamatórios Não Esteróides Inibidores da Ciclooxigenase-2 (COX-2): Aspectos Atuais. Revista Brasileira Anestesiologia, Botafogo-RJ, v. 52, n. 4, p.498-512, jul./ago. 2002. Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/rba/v52n4/v52n4a14.pdf. Acesso em: 16 jan. 2012.

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LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. 2. ed. Nova Odessa: Editora Plantarum, 1998.

NETO, J. P. et al.AVALIAÇÃO DA AÇÃO CLASTOGÊNICA DO ÓLEO DE Cnidoscolusphyllacanthus (Mart.) Pax. et K. HoffmEM CÉLULAS MEDULARES. Revista de Biologia e Farmácia, Campina Grande, v. 3, n. 1, p. 6-22, mar. 2009.

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ANEXOS

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ANEXO A - Protocolo de aprovação do Comitê de Ética

184

ANEXO B - Protocolo para avaliação da triagem farmacológica

leandra macedo de araÚjo gomes - bem-vindo · acreditaram na minha vontade de vencer e me apoiaram...

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