karina munhoz de paula alves coelho - … · twist1 in samples of 30 dysplastic compound nevus, 30...

KARINA MUNHOZ DE PAULA ALVES COELHO

AVALIAO DA EXPRESSO DOS GENES CADM1, TWIST1 e CDH1 POR

IMUNO-HISTOQUMICA EM LESES MELANOCTICAS

JOINVILLE

2017

KARINA MUNHOZ DE PAULA ALVES COELHO

AVALIAO DA EXPRESSO DOS GENES CADM1, TWIST1 e CDH1 POR


Dissertao de mestrado apresentada como

requisito parcial para a obteno do ttulo de

mestre em Sade e Meio Ambiente, na

Universidade da Regio de Joinville.

Orientador: Professor Dr. Paulo Henrique

Condeixa de Frana.

JOINVILLE

2017

AGRADECIMENTO

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) pela

concesso de bolsa (modalidade parcial) por meio do Programa de Suporte Ps-

Graduao de Instituies de Ensino Particulares.

Ao orientador Prof. Dr. Paulo Henrique Condeixa de Frana pelo grande

conhecimento transmitido. Sempre paciente, disponvel e disposto a ajudar.

Ao Dr. Herclio Fronza Jnior que participou de todas as etapas da construo deste

estudo contribuindo com seu conhecimento e entusiasmo pelo desenvolvimento

cientfico e pela pesquisa.

Aos membros da banca de avaliao, Dr. Caio Maurcio Mendes de Crdova e Dr.

Edson Sydney de Campos, que disponibilizaram do seu tempo para contribuir com

seus conhecimentos para a concluso deste estudo.

Ao Centro de Diagnsticos Antomo-Patolgicos (CEDAP) que contribuiu com as

amostras, estrutura e com o financiamento dos reagentes necessrios a este estudo.

A todos os membros da equipe do CEDAP que contriburam em diferentes fases

deste estudo.

RESUMO

Introduo: O melanoma maligno uma doena agressiva e sua incidncia est

aumentando no mundo. A predisposio gentica e a exposio a fatores

ambientais, principalmente a luz solar, so fatores de risco. A distino

histopatolgica entre nevos e melanomas pode ser difcil. Prev-se que a avaliao

da expresso imuno-histoqumica de alguns genes poderia contribuir para o

diagnstico diferencial de leses histogicamente questionveis. Objetivo: Investigar

se a avaliao da expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e

CDH1 (E-caderina), que participam dos mecanismos de adeso celular e transio

epitelial-mesenquimal, contribui para o diagnstico diferencial das leses

melanocticas de difcil diagnstico. Metodologia: Estudo transversal retrospectivo

baseado na avaliao da expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1,

TWIST1 e CDH1 por imuno-histoqumica em amostras de 30 nevos compostos

displsicos, 30 melanomas com menos de 1,0 mm de espessura e 30 melanomas

com mais de 1,0 mm de espessura, diagnosticados no perodo de 2013 a 2016, em

Joinville/SC. Foi utilizado um score que avaliou a intensidade da colorao e a

proporo de clulas coradas. Resultados: Em comparao aos nevos melanocticos

compostos displsicos, observou-se reduo significativa da expresso dos genes

CADM1 e CDH1 nos melanomas (abaixo e acima de 1,0 mm de espessura) e nos

melanomas de mais de 1,0 mm de espessura, respectivamente. Tambm se

verificou menor expresso dos genes CADM1 e CDH1 nos melanomas com mais de

1,0 mm de espessura em relao aos melanomas com menos 1,0 mm. O gene

TWIST1 no apresentou diferena significativa da expresso entre os grupos.

Concluso: Estes achados permitem concluir que a expresso imuno-histoqumica

do CADM1 tem potencial para contribuir como ferramenta auxiliar ao diagnsico

diferencial entre nevos melanocticos compostos displsicos e melanomas.

Palavras chave: Imuno-histoqumica, CADM1, TWIST, CDH1, melanoma, nevo

displsico.

ABSTRACT

Introduction: Malignant melanoma is an aggressive disease and its incidence is

increasing worldwide. Genetic predisposition and exposure to environmental factors,

especially sunlight, are risk factors. Histopathologic distinction between nevi and

melanoma can be difficult. It is anticipated that the evaluation of the

immunohistochemical expression of some genes could contribute to the differential

diagnosis of questionable histologically lesions. Objective: To investigate wether the

evaluation of the immunohistochemical expression of genes CADM1, TWIST1 and

CDH1 (E-cadherin), that take part in mechanisms of cell adhesion and epithelial-

mesenchymal transition, contributes to the differential diagnosis of melanocytic

lesions difficult to diagnose. Methodology: Retrospective cross-sectional study based

on immunohistochemical expression evaluation of genes CADM1, CDH1 and

TWIST1 in samples of 30 dysplastic compound nevus, 30 melanomas with less than

1.0 mm thick and melanomas with more than 1.0 mm thick, diagnosed between 2013

and 2016, in Joinville/SC. A score was used to evaluate color intensity and proportion

of cells stained. Results: There was a significant reduction in the expression of the

genes CADM1 and CDH1 in melanomas (below and above 1.0 mm thick) and in

melanomas of more than 1.0 mm in thickness, respectively, compared to dysplastic

melanocytic nevi. There was also lower expression of the genes CADM1 and CDH1

genes in melanomas greater than 1.0 mm thick compared to melanomas less than

1.0 mm. The gene TWIST1 showed no significant difference in expression between

groups. Conclusion: These findings allow us to conclude that the

immunohistochemical expression of CADM1 has the potential to contribute as an

auxiliary tool to the differential diagnosis between dysplastic compound nevus and

melanoma.

Key-words: immunohistochemstry, CADM1, TWIST, CDH1, cutaneous melanoma,

dysplastic nevus.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Melancitos humanos confinados camada basal da epiderme.

..........................................................................................................

20

Figura 2: Variao geogrfica da incidncia do melanoma no mundo.por

100.000 habitantes. .........................................................................

21

Figura 3: Nevo melanoctico juncional. Proliferao de clulas nvicas na

juno dermo-epidrmica. ...............................................................

22

Figura 4: Nevo melanoctico composto. Proliferao de clulas nvicas na

juno dermo-epidrmica e na derme. ............................................

23

Figura 5: Nevo melanoctico intradrmico. Proliferao de clulas nvicas

na derme..........................................................................................

23

Figura 6: Nevo melanoctico juncional displsico. Presena de atipias

celulares, hiperplasia melanoctica, fibrose lamelar, juno dos

cones epidrmicos...........................................................................

24

Figura 7: Melanoma de disseminao superficial. Presena de clulas

frequentemente migrando para a superfcie....................................

25

Figura 8: Leso assimtrica com bordas irregulares e pigmentao

variegada..........................................................................................

26

Figura 9: Fatores genticos e ambientais que contribuem para o

desenvolvimento do melanoma.......................................................

26

Figura 10: Paciente com mltiplos nevos displsicos. ..................................... 27

Figura 11: Radiao UV associada ao risco de melanoma pelo aumento

miR21...............................................................................................

29

Figura 12: Vias de controle da proliferao celular e

apoptose...........................................................................................

30

Figura 13: Vias de crescimento celular e de sobrevida..................................... 31

Figura 14: Aberraes moleculares na progresso do melanoma.................... 33

Figura 15: Via ERK durante a melanognese que impacta na expresso

fenotpica dos melanomas malignos................................................

36

Figura 16: Fatores de transcrio que controlam o mecanismo de transio

epitelial-mesenquimal -TEM (EMT) .................................................

37

Figura 17: Representao da expresso imuno-histoqumica dos nveis de

CADM1. Barra 1: melanoma cutneo; Barra 2: nevo displsico;

Barra 3: pele normal. Os melanomas mostram nveis mais baixos

de expresso de CADM1.................................................................

39

Figura 18: TWIST inibe a E-caderina que fundamental para o mecanismo

de TEM (EMT). ................................................................................

42

Figura 19: Modelo da via ERK1/2TWIST1MMP-1 na cascata do

melanoma. A ativao do ERK1/2 leva a um aumento na

transcrio do TWIST1.....................................................................

43

Figura 20: (A e B) Ausncia de expresso nuclear do TWIST1 em nevos

melanocticos intradrmicos. (C e D) Metstase de melanoma em

linfonodo mostrando imunorreatividade para TWIST1.....................

44

Figura 21: Aumento da expresso da N-caderina e diminuio da E-caderina

no melanoma invasivo. ....................................................................

46

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AJCC American Joint Committee on

Cancer

Comit Americano Conjunto sobre

Cncer

Akt Serine/threonine kinase 1 Serina/treonina quinase 1

BAD BCL2-associated agonist of

cell death

Agonista de BCL2 associado

morte celular

BCL2 B-cell lymphoma 2 Linfoma de clulas B 2

BRAF Rapidly accelerated

fibrosarcoma kinase B

Quinase B do fibrossarcoma

rapidamente acelerado

CADM1

CAPES

Cell adhesion molecule 1 Molcula de adeso celular 1

Coordenao de Aperfeioamento

de Pessoal de Nvel Superior

CCND1 Cyclin D1 Ciclina D1

CDK4 Cyclin-dependent kinase 4 Ciclina dependente de quinase 4

CDK6 Cyclin-dependent kinase 6 Ciclina dependente de quinase 6

CDKN2A Cyclin-dependent kinase

inhibitor 2

Inibidor de ciclina dependente de

quinase 2

CEDAP Centro de Diagnsticos Antomo-

Patolgicos

CEP Comit de tica em Pesquisa

CGH Comparative genomic

hybridization

Hibridizao genmica

comparativa

CNS Conselho Nacional de Sade

CONEP Comisso Nacional de tica em

Pesquisa

DNA Deoxyribonucleic acid cido desoxirribonucleico

FT-TEM Fatores indutores da transio

epitelial-mesenquimal

ErbB2 Receptor tyrosine kinase 2 Receptor de tirosina quinase 2

ErbB3 Receptor tyrosine kinase 3 Receptor de tirosina quinase 3

ERK Extracellular signalregulated Quinase regulada por sinal

https://cancerstaging.org/references-tools/deskreferences/pages/default.aspxhttps://cancerstaging.org/references-tools/deskreferences/pages/default.aspxhttps://en.wikipedia.org/wiki/Comparative_genomic_hybridizationhttps://en.wikipedia.org/wiki/Comparative_genomic_hybridizationhttp://conselho.saude.gov.br/

kinase extracelular

FISH Fluorescent in situ

hybridization

Hibridizao in situ fluorescente

GSK1120212 Trametinib

HDM2 Human double minute 2 Duplo minuto 2 humano

HGNC HUGO Gene Nomenclature Nomenclatura de genes HUGO

HRAS Harvey rat sarcoma viral

oncogene

Oncogene Viral do Sarcoma do

Rato Harvey

IGSF4A Immunoglobulin superfamily,

member 4c

Membro 4c da superfamlia de

imunoglobulina

IL-6 Interleukin 6 Interleucina 6

INCA Instituto Nacional do Cncer

KRAS Kirsten rat sarcoma viral

oncogene

Oncogene viral de sarcoma de rato

Kirsten

MAPK Mitogen activated kinase-like

protein

Protena tipo quinase ativada por

mitgenos

MDM2 Murine double minute 2 Duplo minuto 2 murino

MEK MAP kinase-ERK kinase MAP quinase-ERK quinase

Mel-CAM Melanoma cell adhesion

molecule

Molcula de adeso celular de

melanoma

microRNA Micro ribonucleic acid Micro cido ribonucleico

miR-21 Micro ribonucleic acid 21 Micro cido ribonucleico 21

MITF Microphthalmia-associated

transcription

Fator de transcrio associado

microftalmia

MMP2 Matrix metalloproteinase-2 Matriz metaloproteinase-2

MMP9 Matrix metalloproteinase-9 Matriz metaloproteinase-9

NADH Nicotinamide adenine

dinucleotide

Dinucletdeo de nicotinamida e

adenina

NADPH Nicotinamide adenine

dinucleotide phosphate

Fosfato de dinucleotdeo de

nicotinamida e adenina

NIH National Institutes of Health Institutos Nacionais de Sade

NRAS Neuroblastoma RAS viral

oncogene homolog

Homlogo do oncogene viral RAS

do neuroblastoma

http://www.lookformedical.com/definitions.php?q=Fator+de+Transcri%C3%A7%C3%A3o+Associado+%C3%A0+Microftalmia&lang=3http://www.lookformedical.com/definitions.php?q=Fator+de+Transcri%C3%A7%C3%A3o+Associado+%C3%A0+Microftalmia&lang=3https://en.wikipedia.org/wiki/Nicotinamide_adenine_dinucleotide_phosphatehttps://en.wikipedia.org/wiki/Nicotinamide_adenine_dinucleotide_phosphatehttps://www.nih.gov/

OMS Organizao Mundial da Sade

p14ARF Alternate reading frame protein

14

Protena 14 de fase de leitura

alternada

PI3K Phosphoinositide 3-kinase Fosfatidilinositol 3-quinase

p16INK4a Kinase a inhibitor 16 protein Protena 16 inibidora da quinase a

PCR Polymerase Chain Reaction Reao em Cadeia da Polimerase

PLX4032 Vemurafenib

PTEN Phosphatase and tensin

homolog

Homlogo de tensina e fosfatase

RAF Proto-oncogene,

serine/threonine kinase

Proto-oncogene, serina/treonina

quinase

SNAIL1 Snail family transcriptional

repressor 1

Repressor transcripcional 1 da

famlia caracol

SNAIL2 Snail family transcriptional

repressor 2

Repressor transcripcional 2 da

famlia caracol

SPSS Statistical Package for the

Social Sciences

Pacote Estatstico para as

Cincias Sociais

SYNCAM Synaptic adhesion molecule Molcula de adeso sinptica

TSLC1 Tumor suppressor in lung

cancer 1

Supressor de tumor 1 no cncer

de pulmo

TWIST1 Twist Family Basic helix-loop-

helix Transcription Factor 1

Fator 1 de transcrio bsico

hlice-ala-hlice da famlia

TWIST

TWIST2 Twist Family Basic helix-loop-

helix Transcription Factor 2

Fator 2 de transcrio bsico

hlice-ala-hlice da famlia

TWIST

UNIVILLE Universidade da Regio de

Joinville

UV Ultravioleta

UVA Ultravioleta A

UVB Ultravioleta B

UVC Ultravioleta C

ZEB1 Zinc Finger E-Box Binding Ligao dedo de zinco E-Box

https://en.wikipedia.org/wiki/Basic_helix-loop-helixhttps://en.wikipedia.org/wiki/Basic_helix-loop-helixhttps://en.wikipedia.org/wiki/Basic_helix-loop-helixhttps://en.wikipedia.org/wiki/Basic_helix-loop-helix

Homeobox 1 Homeobox 1

ZEB2 Zinc Finger E-Box Binding

Homeobox 2

Ligao dedo de zinco E-Box

Homeobox 2

SUMRIO

1 INTRODUO 15

2 OBJETIVOS 18

2.1 OBJETIVO GERAL 18

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 18

3 REVISO DE LITERATURA 19

3.1 LESES MELANOCTICAS 19

3.1.1 Conceito 19

3.1.2 Epidemiologia 19

3.1.3 Classificao 22

3.1.3.1 Nevos 22

3.1.3.2 Melanomas 24

3.1.4 Fatores de risco 26

3.1.4.1 Fatores de risco genticos 26

3.1.4.2 Fatores de risco ambientais 27

3.1.5 Patologia molecular 29

3.1.5.1 Patologia molecular dos melanomas 29

3.1.5.2 Patologia molecular dos nevos 32

3.1.5.3 Molculas de adeso celular 34

3.1.5.4 Mecanismo de transio epitelial-mesenquimal 34

3.2 DIAGNSTICO DAS LESES MELANOCTICAS 37

3.2.1 Patologia molecular como auxiliar no diagnstico 38

3.2.2 Marcadores de imuno-histoqumica 38

3.2.2.1 CADM1 39

3.2.2.2 TWIST1 41

3.2.2.3 CDH1 45

4 METODOLOGIA 47

4.1 TIPO DE ESTUDO 47

4.2 LOCAL DE ESTUDO 47

4.3 PERODO DO ESTUDO 47

4.4 AMOSTRAS E CRITRIOS DE INCLUSO 47

4.5 PROCEDIMENTOS METODOLGICOS 48

4.5.1 TCNICA DE IMUNO-HISTOQUMICA 48

4.5.2 LEITURA E INTERPRETAO DOS RESULATDOS 50

4.6 ANLISE ESTATSTICA 50

4.7 ASPECTOS TICOS 51

5 RESULTADOS E DISCUSSO 52

6 CONCLUSO 67

REFERNCIAS 68

15

1. INTRODUO

O melanoma maligno uma das doenas mais agressivas nos seres

humanos. O nmero estimado de mortes por melanoma de 48.000 por ano, em

todo o mundo (ZHANG; LI, 2012) e h um aumento na incidncia nas populaes

caucasianas (KISZNER et al., 2014).

O melanoma muito resistente quimioterapia convencional e apenas em

torno de 14% de pacientes com doena metasttica sobrevivem por 5 anos

(ZHANG; LI, 2012). A remoo cirrgica da leso primria, antes das metstases,

o principal tratamento e o mais eficaz, embora a abordagem teraputica do

melanoma metasttico j tenha terapias alvo (UGUEN et al., 2015).

A predisposio gentica e a exposio a fatores ambientais aumentam o

risco para melanoma. Indivduos com histrico familiar comprovado tem risco

significativamente maior para o desenvolvimento desta malignidade (JHAPPAN;

NOONAN; MERLINO, 2003). A exposio ocupacional, o estilo nutricional e

principalmente a exposio a luz solar so fatores ambientais relacionados ao

desenvolvimento do melanoma cutneo. Mudanas significativas na expresso de

micro cido ribonucleico (microRNA) em resposta exposio ambiental tm sido

relatadas (MELNIK, 2015).

A preciso do diagnstico do melanoma crtica para a conteno da

malignidade. Portanto, se pacientes com melanoma forem subdiagnosticados, eles

podem ser inadequadamente tratados e estarem em risco potencial para a

disseminao regional ou sistmica da doena (ZHANG; LI, 2012).

O exame histopatolgico permanece atualmente como "padro ouro" para o

diagnstico de leses melanocticas. No entanto, a distino histopatolgica

definitiva entre as leses benignas e as malignas, em alguns casos, pode ser difcil

(UGUEN et al., 2015). Apesar de vrias caractersticas histolgicas do melanoma

terem sido descritas, muitos critrios se sobrepem aos dos nevos displsicos e de

outras formas de nevos benignos, como os nevos de Spitz. Portanto, o nvel de

discordncia no diagnstico de certas leses melanocticas pode ser elevado,

mesmo quando examinados por patologistas experientes (KASHANI-SABET et al.,

2009). descrita uma discordncia interobservador relativa ao diagnstico de nevo

e melanoma variando de 2,3 a 25% das leses (UGUEN et al., 2015).

16

A expresso gnica pode ser til para a classificao de neoplasias, definio

de prognstico e ainda como um marcador preditivo para terapia (KASHANI-SABET

et al., 2009). Marcadores moleculares podem ser utilizados como ferramentas

diagnsticas nas leses melanocticas uma vez que nevos e melanomas diferem

pela ausncia ou presena de aberraes cromossmicas (UGUEN et al., 2015). As

vias de sinalizao celular, controle do ciclo celular e de apoptose, dentre outras,

tm sido implicadas no desenvolvimento do melanoma. Porm, h evidncia que

nevos benignos podem ser clonais e conter alteraes genticas predisponentes

para o melanoma, como exemplo a mutao BRAF-V600E (quinase B do

fibrossarcoma rapidamente acelerado, V600E). (KISZNER et al., 2014).

Ferramentas citogenticas, tais como hibridizao genmica comparativa

(CGH) e a hibridizao in situ por fluorescncia (FISH) foram desenvolvidas para

ajudar na classificao de leses melanocticas ambguas. No entanto, estes

mtodos moleculares requerem equipamentos apropriados e patologistas

qualificados, portanto, no so utilizados rotineiramente na maioria dos laboratrios

(KASHANI-SABET et al., 2009).

Ao contrrio, a imuno-histoqumica difundida e utilizada na maioria dos

centros de patologia. No entanto, nenhum dos marcadores isolados, ou mesmo um

conjunto deles, at o momento, suficiente para classificar inequivocamente uma

leso melanoctica como nevo ou melanoma (UGUEN et al., 2015).

Molculas de adeso celular, incluindo as caderinas, integrinas e as da

superfamlia das imunoglobulinas esto envolvidas em um ou mltiplos passos da

cascata de metstase (MCGARY; LEV; BAR-ELI, 2002). A E-caderina e a Molcula

de adeso celular 1 (CADM1) so molculas de adeso que tem demonstrado sua

expresso anormal nos melanomas (REES, 2012).

A perda da E-caderina representa a marca da transio epitelial mesenquimal

em tumores epiteliais e tambm evidente nos estgios tardios do melanoma,

especialmente em metstases nodais (CARAMEL et al., 2013).

A perda da expresso imuno-histoqumica do CADM1, que frequentemente

ocorre nos melanomas, indica que esta molcula de adeso poderia servir como um

marcador de melanoma em leses histologicamente questionveis (YOU; ZHANG;

ZHENG, 2012).

17

descrito que os nveis de CADM1 so inversamente relacionados aos nveis

de expresso do gene do fator 1 de transcrio hlice-ala-hlice bsico da famlia

Twist (TWIST1) que responsvel por regular genes envolvidos na adeso celular

(HARTSOUGH et al., 2015).

O TWIST1 est envolvido no processo de transio epitelial mesenquimal

(TEM) (KHAN et al., 2013) que um processo onde as clulas perdem as

propriedades de adeso e adquirem critrios mesenquimais, permitindo sua invaso

e migrao (BECK et al., 2015).

Portando, avaliar a expresso imuno-histoqumica em conjunto dos genes

CADM1, TWIST1 e CDH1 (E-caderina) em nevos e melanomas importante para

determinar se estas molculas podem auxiliar no diagnstico diferencial das leses

melanocticas.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khan%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23873099

18

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e CDH1

em leses melanocticas.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Investigar se a expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e

CDH1, nas leses melanocticas pode contribuir para o diagnstico diferencial entre

nevos melanocticos compostos displsicos e melanomas;

Analisar a expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e

CDH1, em relao a espessura dos melanomas;

19

3. REVISO DA LITERATURA

3.1 LESES MELANOCTICAS

3.1.1 Conceito

As leses melanocticas caracterizam-se pela proliferao de melancitos que

so clulas derivadas da crista neural (GRANT-KELS, 2007). Os melanancitos

esto na camada basal da epiderme ao lado de queratincitos na proporo de 1:30

(Figura 1). A principal funo dos melancitos proteger o cido desoxirribonucleico

(DNA) da radiao solar atravs da produo do pigmento melanina

(PAPADOGEORGAKIS, 2013).

As leses benignas da linhagem melanoctica so denominadas de nevos

melanocticos e as leses malignas de melanomas (BASTIAN, 2014). Os nevos

displsicos so descritos como sendo um continum entre nevo e melanoma porque

eles so morfologicamente e biologicamente intermedirios entre estas duas

entidades (GOLDSTEIN; TUCKER, 2013)

O diagnstico de nevo e melanoma comum na prtica anatomopatolgica.

Ainda assim, a familiaridade de tais proliferaes nem sempre est ligada ao

conforto interpretativo na determinao de suas propriedades biolgicas (WICK;

PATTERSON, 2005). O diagnstico diferencial entre nevo, nevo displsico e

melanoma, em muitos casos, pode ser desafiador (ZEMBOWICZ; PRIETO, 2010).

3.1.2 Epidemiologia

Os nevos so alteraes melanocticas cutneas comuns, tendo em mdia

entre 10 a 40 nevos por pessoa. Em contrapartida, o melanoma muito menos

frequente (MAGAA, 1994).

20

Figura 1. Melancitos humanos confinados camada basal da epiderme. Fonte: Adaptada de

PAPADOGEORGAKIS, 2013.

Os nevos displsicos so relativamente comuns na populao geral. Autores

tm descrito uma prevalncia variando de 2 a 53% em diferentes estudos,

dependendo do critrio diagnstico (clnico e histolgico). Uma estimativa mais

acurada considera estar presente entre 2 a 8% dos caucasianos, apresentando-se

frequentemente em indivduos com menos do que 30 a 40 anos de idade. A

frequncia de nevo displsico em pacientes com histria de melanoma muito mais

alta chegando a 59% (SILVA et al., 2011).

Apesar do melanoma no ser to frequente quanto os carcinomas de pele, ele

tem alta taxa de mortalidade, com mais de 2.000 mortes no Reino Unido, em 2011.

Na Irlanda do Norte, o nmero de melanomas aumentou de 103 casos por ano entre

1984-1992 para 258 casos por ano entre 2004-2009 (MCCOURT; DOLAN;

GORMLEY, 2014).

A American Cancer Society estima que para 2016, nos Estados Unidos da

Amrica (EUA), aproximadamente 87.110 novos melanomas sero diagnosticados,

sendo 52.170 em homens e 34.940 em mulheres (AMERICAN CANCER SOCIETY,

2017)

O melanoma cutneo representa aproximadamente 4% de todos os tumores

malignos da pele e sua frequncia est aumentando no Brasil e em muitos outros

pases (MINISTRIO DA SADE, 2016).

21

A distribuio global do melanoma demonstra a importncia da radiao

ultravioleta (UV) na patogenese desta doena. Pases que esto localizados em

latitudes mais perto da linha do Equador tem maiores taxas de melanoma em

pessoas de pele clara. Altitude elevada tambm um factor de risco para o

desenvolvimento de melanoma, presumivelmente, porque a radiao UV maior

devido a uma menor interferncia entre a energia solar e material particulado

presente na atmosfera. Embora a latitude e a altitude possuam um papel

fundamental para desenvolvimento do melanoma, o fototipo tambm um

componente importante para explicar as variaes na incidncia de melanoma em

todo o mundo. A Amrica Central, apesar de estar mais perto do equador do que a

Amrica do Norte, tem uma taxa de incidncia mais baixa presumivelmente devido o

predomnio de pele mais escura (Figura 2) (HAWRYLUK; FISHER, 2011)

Figura. 2 Variao geogrfica da incidncia de melanoma no mundo por 100.000 habitantes

Fonte: Adaptada de HAWRYLUK; FISHER, 2011.

Conforme estimativa do Instituto Nacional do Cncer (INCA), em 2016 no

Brasil, o melanoma afetar de 4 a 6 pessoas por 100.000 habitantes e com

incidncia mais alta nas regies sul e sudeste (COSTA; FERNANDES; BORGES,

2015).

22

Um estudo que avaliou as caractersticas dos melanomas em Joinville/SC, no

perodo de 2003 a 2014, encontrou uma incidncia elevada em comparao aos

ndices do Brasil. Uma das explicaes para esse achado que Joinville habitada

predominantemente por populao de pele clara que vive prximo ao litoral onde,

muitas vezes, tem atividades recreativas com exposio solar de modo intermitente,

numa rea com relativa rarefao da camada de oznio e com alto ndice de

radiao UV (STEGLISH, 2015).

3.1.3 Classificao

Os nevos so leses melanocticas benignas e os melanomas leses

melanocticas malignas (BASTIAN, 2014). O melanoma in situ e o lentigo maligno

so consideradas leses pr-malignas (MCCOURT; DOLAN; GORMLEY, 2014) e os

nevos displsicos so descritos como sendo leses intermedirias entre nevo e

melanoma (GOLDSTEIN; TUCKER, 2013).

3.1.3.1 Nevos

Os nevos podem ser adquiridos, que so os mais comuns e possuem trs

estgios histolgicos: juncional (Figura 3), composto (Figura 4) e intradrmico

(Figura 5). Os nevos podem ser congnitos que so aqueles presentes ao

nascimento e correspondem em torno de 1% de todos os nevos. H nevos

melanocticos fusiformes que se encontram na derme entre os feixes de colgenos e

excepcionalmente se associam com melanoma (MAGAA, 1994).

Figura 3. Nevo melanoctico juncional. Proliferao de clulas nvicas na juno dermo-

epidrmica. Fonte: MACKEE, 2012.

23

Figura. 4. Nevo melanoctico composto. Proliferao de clulas nvicas na juno dermo-

epidrmica e na derme. Fonte: MACKEE, 2012.

Figura. 5. Nevo melanoctico intradrmico. Proliferao de clulas nvicas na derme. Fonte:

MACKEE, 2012.

Os nevos ainda so classificados como displsicos baseados em

caractristcas clnicas e histopatolgicas (DUFFY; GROSSMAN, 2012a).

Segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS) e o National Institutes of

Health (NIH), o diagnstico histopatolgico de nevos displsicos baseado em

critrios maiores (mandatrios) e critrios menores (pelo menos dois precisam estar

presentes). Os critrios maiores so hiperplasia melanoctica contgua ou lentiginosa

e atipia focal melanoctica. Os critrios menores so fenmeno de ombro, fuso

epitelial dos cones, fibrose lamelar concntrica subepidrmica e infiltrado

inflamatrio linfoctico perivascular superficial (Figura 6) (SILVA et al., 2011).

24

Figura 6. Nevo melanoctico juncional displsico. Presena de atipias celulares, hiperplasia

melanoctica, fibrose lamelar, juno dos cones epidrmicos. Fonte: MACKEE, 2012.

A presena de 100 ou mais nevos com pelo menos um nevo com dimetro

maior do que 8 mm e um nevo com caractersticas clnicas de atipia, em pacientes

com antecedente familiar de melanoma cutneo, caracteriza a sndrome do nevo

atpico clssica, descrita por Clark (CLARK et al., 1978). No entanto, a definio

dessa sndrome controversa. Em 1992 o NHI definiu esta sndrome como sendo a

ocorrncia de melanoma em pelo menos um parente de primeiro ou segundo grau,

grande quantidade de nevos (mais de 50), sendo alguns clinicamente atpicos e com

caractersticas histolgicas distintas (REZZE; LEON; DUPRAT, 2010).

3.1.3.2 Melanomas

O melanoma compreende subtipos relacionados a diferentes caractersticas

clnicas, histolgicas e a localizaes anatmicas. A OMS baseia-se na classificao

proposta por Clark h quase 30 anos que utiliza aspectos morfolgicos para

diferenci-lo em quatro tipos principais: melanoma de disseminao superficial, o

mais frequente (Figura 7), lentigo maligno melanoma, melanoma nodular e

melanoma acral lentiginoso (BASTIAN, 2014).

25

Figura 7. Melanoma de disseminao superficial. Presena de clulas frequentemente

migrando para a superfcie. Fonte: WEEDON, 2010.

O Colgio Americano de Patologistas utiliza a classificao da OMS

modificada, que inclui os seguintes subtipos: melanoma de disseminao superficial,

melanoma nodular, lentigo maligno melanoma, melanoma lentiginoso acral,

melanoma lentiginoso de mucosa, melanoma desmoplsico neurotrpico, melanoma

com origem em nevo azul, melanoma com origem em nevo congnito gigante,

melanoma da infncia, melanoma nevoide, melanoma sem outra classificao

(FRISHBERG et al., 2009) (LAGA; MURPHY, 2010).

Os melanomas so caracterizados clinicamente pela presena de mcula

hipercrmica com variao na colorao e bordas irregulares (COSTA;

FERNANDES; BORGES, 2015). As leses pigmentadas so avaliadas pelo

mnemnico ABCDE (Figura 8) que inclui assimetria, irregularidade nos bordos,

variao na cor, dimetro maior que 5 mm e evoluo (SHIRAZI et al., 2015). A

sensibilidade do diagnstico clnico dos melanomas para dermatologistas

experientes relatada em torno de 70% (GARBE et al., 2012). A associao da

dermatoscopia pode aumentar a sensibilidade para 90% e apresentar com

especificidade de 50% (BOURNE et al., 2012).

Os critrios que formam a base do esquema de estadiamento incluem

espessura do tumor primrio, ulcerao, mitoses, metstases. A classificao T

baseia-se na espessura do tumor: menor ou igual a 1 mm, maior que 1 a 2 mm,

maior que 2 a 4 mm e superior a 4 mm (DUNCAN, 2009).

26

Figura 8. Leso assimtrica com bordas irregulares e pigmentao variegada. Fonte: MCCOURT; DOLAN; GORMLEY, 2014.

3.1.4 Fatores de risco

O risco significativo para o desenvolvimento de melanoma em humanos est

associado predisposio gentica e a exposio a fatores ambientais (Figura 9)

(JHAPPAN; NOONAN; MERLINO, 2003).

Figura 9. Fatores genticos e ambientais que contribuem para o desenvolvimento do melanoma. Fonte: PSATY et al., 2010.

3.1.4.1 Fatores de risco genticos

Em 1820, Norris descreveu o que atualmente considerado predisposio

familiar ao melanoma. Em 1978, Clark, relatou um aumento da incidncia de

27

melanoma cutneo em famlias com mltiplas leses melanocticas (Figura 10),

introduzindo o modelo de progresso do tumor de melanoma a partir de nevo

melanoctico. Na poca, Clark usou o termo sndrome B-K usando as iniciais dos

sobrenomes de pacientes. Atualmente, os termos sndrome do nevo displsico e

sndrome familiar do nevo displsico/melanoma tem sido utilizado. Em 1985, Elder

estendeu a teoria do nevo-melanoma'' para nevos displsicos espordicos como um

possvel precursor de melanoma espordico (SILVA et al., 2011).

Figura 10. Paciente com mltiplos nevos displsicos. Fonte: (PSATY et al., 2010)

Pode-se argumentar que o melanoma tem um componente gentico, uma vez

que os fatores de risco hereditrios, como caractersticas fsicas tais como pele

clara, cabelos ruivos, olhos azuis e a sndrome familiar do nevo displsico-

melanoma so determinados geneticamente (TSAO et al., 2012). Alm disso, a

histria pessoal de melanoma aumenta o risco para um segundo melanoma. Sabe-

se que de 1 a 8%, ou mais, dos pacientes com histria prvia de melanoma vo

desenvolver mltiplos melanomas primrios e o risco de um segundo melanoma

primrio aumenta para 19% entre pacientes com histria familiar positiva (PSATY et

al., 2010).

3.1.4.2 Fatores de risco ambientais

Dos fatores de risco ambientais para o desenvolvimento do melanoma, a luz

solar considerada a principal causa (BRESSAC-DE-PAILLERETS et al., 2002).

28

A radiao UV, que est associada ao desenvolvimento do melanoma, pode

ser classificada em UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) e UVC (100-280 nm). A

UVC e a maioria dos comprimentos de onda UVB so bloqueados pela camada de

oznio e apenas uma frao de UVB e UVA atinge a superfcie da Terra

(MCCOURT; DOLAN; GORMLEY, 2014).

O aumento dos melanomas que ocorreu nos ltimos anos foi associado com a

depleo da camada de oznio, que resulta em maior radiao UVB alcanando a

Terra. No entanto, estudos afirmam que a maioria dos melanomas, em torno de

92%, so decorrentes de danos indiretos ao DNA, causados pela radiao UVA,

supondo-se que a depleo da camada de oznio no a responsvel pelo

aumento radical dos melanomas nos ltimos anos (VOLKOVOVA et al., 2012).

Na leso direta ao DNA, a radiao UVB faz com que haja a formao de

ligaes covalentes entre os pares de bases de citosina e timina no DNA e forma

dmeros de pirimidina (dmero de ciclobutano). Na leso indireta ao DNA, h

absoro da radiao UVA por molculas fotossensibilizadoras que transferem

energia para molculas de oxignio que se transformam em oxignio singleto, que

altamente reativo (VOLKOVOVA et al., 2012). Diversas so as molculas

fotossensibilizadoras, dentre elas o dinucletdeo de nicotinamida e adenina (NADH)

e dinucleotdeo fosfato de nicotinamida adenina (NADPH), cido urocnico e

esteris (ANNA et al., 2007).

A eficcia dos protetores solares que agem somente contra a radiao UVB

discutida, uma vez que por evitar a queimadura, eles proporcionam maior tempo de

exposio solar aos raios UVA (WOODHEAD; SETLOW; TANAKA, 1999).

Fatores ambientais que aumentam o risco de melanoma, tais como a

radiao, esto associados com o aumento do micro cido ribonucleico (21miR-21)

que um oncomiR. O aumento da expresso de miR-21 tem sido observado durante

a transio de uma leso melanoctica benigna para o melanoma maligno. Mutaes

comuns no melanoma como genes BRAF e o homlogo do oncogene viral RAS do

neuroblastoma (NRAS) esto associadas ao aumento da expresso de miR-21, que

afeta genes alvo resultando em proliferao, diminuio da apoptose, instabilidade

gentica, aumento do estresse oxidativo, angiognese, invaso e metstase (Figura

11) (MELNIK, 2015).

29

Figura 11. Radiao UV associada ao risco de melanoma pelo aumento

miR21. Fonte: Adaptada de MELNIK, 2015.

3.1.5 Patologia molecular

3.1.5.1 Patologia molecular dos melanomas

Os mecanismos patognicos do desenvolvimento do melanoma no esto

totalmente estabelecidos, mas sabe-se que vrios genes e vias metablicas esto

ativados (PALMIERI et al., 2009).

A progresso do melanoma est associada com ativao de oncogenes e

com eventos epigenticos (YAJIMA et al., 2012). A ativao dos oncogenes pode

ocorrer por mutao gentica, deleo, amplificao ou translocao. Os eventos

epigenticos, que so mudanas reversveis e no provocam alteraes na

sequncia de DNA, geralmente resultam da modulao transcripcional por metilao

de DNA e/ou por alteraes na cromatina, como a modificao das histonas

(PALMIERI et al., 2009).

Os melanomas no mostram o mesmo cenrio primrio de eventos clonais,

mas alguns destes eventos so mais comuns do que outros. Algumas vias de

sinalizao so mais conhecidas e geralmente controlam a proliferao celular, a

apoptose e a senescncia celular (BENNETT, 2008).

A via proteno-quinase ativada por mitognio/quinase regulada por sinal

extracelular (MAPK/ERK) participa do controle da proliferao celular (PALMIERI et

al., 2009). Esta via de sinalizao regulada pelos receptores da tirosina quinase,

citocinas e receptores acoplados protena G (MOZURAITIENE et al., 2015).

30

A protena G RAS (HRAS, KRAS e NRAS) est localizada na membrana

plasmtica e ativa o RAF formando um complexo que leva fosforilao da protena

quinase ativada por mitognio (MAPK tambm conhecida como ERK) via ativao

da MEK. ERK, quando fosforilada, entra no ncleo e afeta a expresso de genes.

Isto conduz a mudanas que controlam a proliferao celular (Figura 12) (YAJIMA et

al., 2012).

Figura 12. Vias de controle da proliferao celular e apoptose. Fonte: PALMIERI et al., 2009.

ERK est hiperativada em 90% dos melanomas humanos por fatores de

crescimento e por alteraes genticas de fatores a montante, protenas RAS e

RAF. Os genes NRAS e BRAF esto mutados em 15 a 30% e em 50 a 70% dos

melanomas humanos, respectivamente (YAJIMA et al., 2012).

Na via de proliferao celular MAPK-ERK tem sido observado que os

melanomas possuem mutaes ou do NRAS ou do BRAF, mas no de ambos, alm

disso, aqueles com aumento do nmero de cpias de ciclina D1 (CCND1)

geralmente no apresentam as ativaes de NRAS e nem BRAF (BENNETT, 2008).

31

A ativao da via fosfatidilinositol 3-quinases (PI3K) desempenha um papel

significativo no melanoma, frequentemente em um cenrio da ativao concorrente

da via de sinalizao RAS/RAF/MEK/ERK (MOZURAITIENE et al., 2015).

O gene supressor de tumor homlogo de tensina e fosfatase (PTEN) codifica

um lipdeo e uma protena fosfatase que regulam o crescimento celular e a

sobrevida atravs da sinalizao do fosfatidilinositol 3-quinase/serina/treonina

quinase (PI3K/AKT). AKT um gene que envia sinais inibitrios que promovem o

crescimento e a sobrevida celular. No melanoma, nveis elevados de fosfo-AKT

podem correlacionar adversamente com a sobrevida do paciente (TSAO et al.,

2012). PTEN, contendo um domnio fosfatase, est inativado em 12% dos

melanomas atravs de mutao ou metilao (YAJIMA et al., 2012).

Figura 13. Vias de crescimento celular e de sobrevida. Fonte: (TSAO et al., 2012).

A senescncia celular, que uma barreira para o desenvolvimento do

melanoma, corresponde a uma interrupo irreversvel da proliferao de clulas

somticas que induzida por encurtamento dos telmeros e estresse oncognico

(BENNETT, 2008).

32

A reduo no comprimento dos telmeros parece exercer danos a

sinalizao do DNA pela ativao de protena p16CDKN2A. Portanto, os melanomas

no podem crescer indefinidamente sem um mecanismo para reduzir os telmeros.

A expresso e a atividade das telomerases de fato inibida na progresso do

melanoma (PALMIERI et al., 2009).

A via de supresso de tumor do inibidor da ciclina dependente de quinase 2A

(CDKN2A), gene envolvido na patognese do melanoma, codifica duas protenas,

p16INK4a e p14ARF. A perda da funo da p16INK4a promove ativao da ciclina

dependente de quinase (CDK4) e ciclina dependente de quinase 6 (CDK6)

resultando em hiperfosforilao da protena do retinoblastoma promovendo a

proliferao celular (Figura 12). A perda da funo no locus CDKN2A a anomalia

gentica mais frequente no melanoma familiar, cerca de 40% dos casos, e nos

pacientes sem histria ocorre em cerca de 8,2% dos indivduos (MOZURAITIENE et

al., 2015).

Nos melanomas a inativao da via de p53 supressora de tumor ocorre mais

frequentemente pela via CDKN2A devido a perda da funo de seu produto p14ARF

que previne a degradao da p53 pela protena E3 ubiquitina ligase MDM2 (Figura

12) (MOZURAITIENE et al., 2015). As mutaes diretas em p53 so infrequentes

nos melanomas; uma meta-anlise com 645 espcimes de melanoma revelou

mutao direta em apenas 85 dos casos (13,2%) (TSAO et al., 2012).

Os melanomas comumente resistem induo de apoptose e parecem estar

protegidos por mltiplos mecanismos que incluem a ativao das vias MAPK e

PI3K/AKT. No melanoma, a via MAPK antagoniza a apoptose por mltiplos

mecanismos que incluem a expresso anti-apopttica do BCL2 (B-cell lymphoma 2),

atravs do fator de transcrio associado microftalmia (MITF) e da supresso da

protena proapottica agonista de BCL2 da morte celular (BAD) (Figura 13) (TSAO

et al., 2012).

3.1.5.2 Patologia molecular dos nevos

Estudos relatam que existe clonalidade em 81% de nevos, sendo que destes

25% so displsicos. No entanto, a demonstrao de clonalidade no informa se o

nevo displsico se originou de novo ou de um nevo comum pr-existente, uma vez

http://www.lookformedical.com/definitions.php?q=Fator+de+Transcri%C3%A7%C3%A3o+Associado+%C3%A0+Microftalmia&lang=3

33

que em ambas as circuntncias as clulas se originariam a partir de uma nica

progenitora (Figura 14) (DUFFY; GROSSMAN; TANAKA, 2012a).

Figura 14. Aberraes moleculares na progresso do melanoma. Fonte: Adapatada de

MOZURAITIENE et al., 2015)

As mutaes BRAF ocorrem em mais de 80% dos nevos melanocticos,

sugerindo que estas alteraes somticas possam ocorrer cedo na melanognese

(MOZURAITIENE et al., 2015).

A mutao BRAF tem sido detectada em torno de 62 a 67% dos nevos

displsicos. No entanto, no h correlao entre mutao BRAF e a ativao da

MAPK (DUFFY; GROSSMAN; TANAKA, 2012b). A mutao V600E que prevalente

no melanoma, no cncer colorretal e no cancer de tireoide, no identificada com a

mesma frequncia nos nevos (TSAO et al., 2012).

Em contraste com os nevos congnitos, que comumente possuem a mutao

RAS, esta mutao raramente est presente nos nevos displsicos, sendo

identificada em apenas 1 de 19 casos e 1 de 18 casos, em dois estudos realizados

(DUFFY; GROSSMAN; TANAKA, 2012b).

Alguns nevos displsicos exibem alteraes em p16 ou p53. Um estudo

encontrou trs nevos displsicos com mutaes de p16 entre doze nevos

examinados. Diferenas significativas entre nevos displsicos e nevos comuns no

so observadas (DUFFY; GROSSMAN; TANAKA, 2012b). A mutaes no gene

Tp53 muito menor nos nevos displsicos do que nos melanomas. O acmulo da

protena p53 nos nevos displsicos tem sido reportado com uma frequncia muito

menor que nos melanomas, em torno de 5% a 15% (HUSSEIN; WOOD, 2002).

34

Na sndrome familiar do nevo displsico-melanoma as mutaes em CDKN2A

assim como CDK4 e ARF, tem sido demonstradas por participar do desenvolvimento

da doena (PSATY et al., 2010).

3.1.5.3 Molculas de adeso celular

As molculas de adeso celular participam de processos biolgicos

importantes como a diferenciao, crescimento, proliferao e migrao celular

(REES, 2012). As molculas de adeso celular como as caderinas, as integrinas e

as da superfamlia de imunoglobulinas participam dos processos de crescimento e

metstase do melanoma maligno (MCGARY; LEV; BAR-ELI, 2002).

A molcula de adeso clular do melanoma (Mel-CAM) pertence

superfamlia das imunoglobulinas. Mel-CAM no expressa em melancitos

normais, mas expressa em nevos benignos e em melanomas. A interao entre

Mel-CAM e seus receptores pode induzir sinais celulares necessrios para a

progresso do tumor. No entanto, a molcula de adeso celular do melanoma no

til na distino entre leses melanocticas benignas e malignas (FIGUEIREDO et

al., 2003).

Integrinas so protenas transmembrana que funcionam principalmente pela

migrao e aderncia a clulas na matriz extracelular, bem como a outras clulas. A

integrina avb3 esta associada com a progresso do melanoma e pode ser usada no

diagnstico para distinguir nevo benigno do melanoma maligno (FIGUEIREDO et al.,

2003).

A E-caderina uma molcula de adeso celular que est envolvida nas

interaes queratincito-melancito. A perda da expresso da E-caderina tem sido

relatada na progresso e metstase dos melanomas cutneos (ANNA et al., 2007).

A molcula de adeso celular 1 (CADM1) uma protena de adeso que tem

sido demonstrada estar reprimida em tecidos tumorignicos e sua expresso imuno-

histoqumica anormal tem sido relatada nos melanomas (REES, 2012).

3.1.5.4 Mecanismo de transio epitelial mesenquimal

Transio epitelial-mesenquimal (TEM) um termo que se refere a eventos

de desenvolvimento como os que ocorrem na gastrulao e na segregao da crista

35

neural quando as clulas emergem de um epitlio e se tornam isoladas (fibroblastos-

like) (BENNETT, 2008).

Este processo biolgico permite que uma clula epitelial, que interage com a

membrana basal, submeta-se a mltiplas alteraes bioqumicas que lhe permitam

assumir fentipo celular mesenquimal, que inclui aumento na capacidade migratria

e de invaso, resistncia apoptose e maior produo de componentes da matriz

extracelular (KALLURI; WEINBERG, 2009).

O mecanismo de TEM est associado capacidade de invasividade dos

cnceres, incluindo a do melanoma (BENNETT, 2008). No entanto, fundamental

entender que o mecanismo de TEM clssico, como descrito nos carcinomas e no

desenvolvimento embrionrio, no existe nos melanomas (PAPADOGEORGAKIS,

2013).

A linhagem melanoctica evolui a partir da crista neural com clulas

embrionrias reguladas pela TEM (CARAMEL et al., 2013) (TULCHINSKY et al.,

2013). Nas leses melanocticas o mecanismo de TEM refere-se transformao de

melancitos em vez de clulas epiteliais. Os melancitos transformados adquirem

um nmero muito grande de modificaes moleculares, incluindo a perda gradual de

molculas de adeso celular como as caderinas (PAPADOGEORGAKIS, 2013).

Uma das caractersticas do mecanismo de TEM, nas clulas epiteliais, a

regulao negativa da E-caderina que est relacionada ao aumento da expresso de

caderina mesenquimal neuronal (N-caderina), o que resulta em alterao da adeso

celular, onde as clulas epiteliais adquirem afinidade por clulas mesenquimais

atravs de interaes com N-caderina (LAMOUILLE; XU; DERYNCK, 2014).

Um paradoxo que os melancitos adquirem um fentipo que tanto a E-

caderina, um marcador de clulas epiteliais, como a vimentina, uma protena de

filamento intermedirio sintetizado principalmente por clulas de origem

mesenquimal, so fortemente expressas. Portanto, os melancitos no so nem

clulas epiteliais nem mesenquimais e podem ser melhor classificados como um tipo

de clula mista exibindo propriedades de ambas (PAPADOGEORGAKIS, 2013).

O mecanismo de TEM controlado por vrios fatores de transcrio, incluindo

TWIST1, TWIST2, o repressor transcripcional 1 da famlia snail (SNAIL1), repressor

transcripcional 2 da famlia snail (SNAIL2) e ligao dedo de zinco E-Box homeobox

36

1 (ZEB1) e ligao dedo de zinco E-Box homeobox 2 (ZEB2) (Figura. 15)

(TULCHINSKY et al., 2013).

A regulao das funes dos fatores indutores de transcrio da transio

epitelial-mesenquimal (FT-TEM) nos melanomas malignos diferente do epitlio

(CARAMEL et al., 2013). Estudos mostram que os melancitos normais so

positivos para SNAIL2 e ZEB2, mas negativos para ZEB1 e TWIST1 (TULCHINSKY

et al., 2013). SNAIL2 e ZEB2 se comportam como protenas supressoras de tumores

atravs da ativao de uma via de diferenciao de melancitos dependente de

MITF (Figura. 15) (CARAMEL et al., 2013).

Figura 15. Via ERK durante a melanognese que impacta na expresso fenotpica dos

melanomas malignos. Fonte: Adapatada de TULCHINSKY et al., 2013.

Ativao de NRAS/BRAF media a TEM em um estgio tardio do melanoma

(MOZURAITIENE et al., 2015). Em resposta a ativao de NRAS/BRAF, a TEM

sofre uma reorganizao em favor de TWIST1. Esta chave reversvel coopera com

BRAF na promoo da desdiferenciao e transformao neoplsica dos

melancitos. Esta chave resulta em perda de E-caderina e constitui um fator de mau

prognstico em pacientes com melanoma (Figura 16) (CARAMEL et al., 2013).

As alteraes das interaes de clulas com a matriz extracelular so

essenciais para a iniciao e progresso da TME. As alteraes nas integrinas

durante TME correlacionam-se com a expresso aumentada das proteases, tais

37

como metaloproteinase 2 (MMP2) e metaloproteinase (MMP9) (LAMOUILLE; XU;

DERYNCK, 2014).

Figura 16. Fatores de transcrio que controlam o mecanismo de transio epitelial-

mesenquimal -TEM (EMT). Fonte: Adapatada de (BENNETT, 2008).

3.2 DIAGNSTICO DE LESES MELANOCTICAS

O diagnstico histolgico das proliferaes melanocticas inerentemente

difcil, necessitando de integrao de mltiplos critrios arquiteturais e citolgicos.

Nenhum critrio isolado diagnstico desta entidade particular uma vez que critrios

similares podem ser encontrados em nevos benignos e melanomas. Estudos

38

complementares tem potencial para auxiliar na categorizao dos tumores

melanocticos (ZEMBOWICZ; SCOLYER, 2011).

3.2.1 Patologia molecular como auxiliar no diagnstico

A anlise histopatolgica dos tecidos corados por hematoxilina e eosina, em

correlao com o contexto clnico, o padro ouro para o diagnstico de melanoma.

No entanto, h um subgrupo de leses com achados histopatolgicos conflitantes.

Por este motivo, patologistas tem explorado tcnicas complementares para

aumentar a acurcia diagnstica das leses melanocticas. Mtodos citogenticos

podem ser usados para a distino entre nevos e melanomas, dentre eles o FISH e

o CGH (BUSAM, 2013).

Alm dos mtodos citogenticos, a imuno-histoqumica tem um papel

importante no diagnstico de leses melanocticas. No entanto, no h um nico

marcador, ou a combino deles que estabelea um diagnstico preciso de

melanoma ou nevo (PRIETO; SHEA, 2011).

3.2.2 Marcadores de imuno-histoqumica

Nas leses em que os critrios clnicos e histopatolgicos de melanoma

sobrepem aos do nevo, a imuno-histoqumica pode ser sugerida para auxiliar na

diferenciao destes casos de difcil diagnstico. (PALIT; INAMADAR, 2011).

Dentre os marcadores utilizados para a distino entre nevo e melanoma, o

HMB-45 e o Ki-67 tem sido descritos como sendo os mais teis. Quando o padro

de expresso intraepitelial ou periepitelial e quase completamente ausente na

derme profunda, estas leses so mais consistentes com nevo que com melanoma.

O Ki-67, que expressa o ndice proliferativo, geralmente menor que 1% nos nevos

e maior que 10% nos melanomas (PRIETO; SHEA, 2011).

Estudos tem mostrado que a perda da expresso imuno-histoqumica do

CADM1 frequentemente ocorre nos melanomas e pode servir como um marcador

para o diagnstico diferencial das leses melanocticas histologicamente

questinveis (YOU et al., 2012). H evidncias que o CADM1 regulado

negativamente pelo TWIST1 que pode agir como um supressor da invaso do

39

melanoma (HARTSOUGH et al, 2015). Na progresso do melanoma ocorre a perda

da funo de E-caderina e ganho na expresso de N-caderina (FERNANDES,

2011).

3.2.2.1 CADM1

O CADM1, um gene localizado no cromossomo 11q23.2, recebeu o nome

oficial de cell adhesion molecule 1 (CADM1) pelo Human Genome Organization

Gene Nomenclature Committee (LIANG et al., 2011) No entanto, este gene

conhecido tambm como: membro 4c da muperfamlia de imunoglobulina (IGSF4);

gene supressor de tumor 1, no cncer de pulmo (TSLC1); molcula de adeso

sinptica (SYNCAM) (NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY

INFORMATION, 2017).

A perda ou a reduo da expresso do CADM1 est envolvida na progresso

e metstase de diferentes tipos de neoplasias, incluindo o carcinoma de pulmo,

estmago, ovrio, pncreas, mama e leucemia de clulas T (YOU et al., 2014). No

melanoma descrita a sua expresso diminuda pelo mtodo de imuno-histoqumica

(Figura 17) (REES, 2012).

Figura 17. Representao da expresso imuno-histoqumica dos nveis de CADM1. Barra 1:

melanoma cutneo; Barra 2: nevo displsico; Barra 3: pele normal. Os melanomas mostram nveis

mais baixos de expresso de CADM1. Fonte: Adaptada de YOU et al., 2012

A CADM1 faz parte de uma ampla categoria de molculas de adeso celular

que facilitam as ligaes clula a clula e clula matriz extracelular. Elas so

40

capazes tambm de transmitir sinais mecnicos e qumicos atravs da membrana. A

sinalizao mediada pelas molculas de adeso importante na regulao de

muitos processos celulares incluindo a diferenciao, a proliferao e a migrao

celular (REES, 2012).

O CADM1 uma glicoprotena transmembrana com 442 aminocidos,

composta por um domnio extracelular do tipo imunoglobulina e um domnio

intracelular citoplasmtico (LIANG et al., 2011).

O domnio extracelular homlogo a outros da superfamlia das

imunoglobulinas de molculas de adeso celular (CAM) e funcionalmente serve

como mediador para a formao de homodmeros de CADM1 ou de heterodmeros

de outros membros das molculas de adeso celular. Estudos demonstraram que o

CADM1 est envolvido na adeso celular atravs de interaes homoflicas,

independentes de clcio e magnsio. Portanto, provvel que o CADM1 seja um

supressor de tumor pelo seu domnio extracelular melhorando a adeso entre

clulas, suprimindo a invaso e metstase (LIANG et al., 2011).

No entanto, existem evidncias que o domnio intracelular do CADM1 tambm

desempenha um papel importante na supresso tumoral, interagindo com protenas

citoplasmticas (LIANG et al., 2011). Acredita-se que CADM1 possa estar

relacionado com a actina do citoesqueleto citoplasmtico para uma ligao estvel

entre as clulas (YOU et al., 2010).

Os mecanismos exatos do CADM1 associados a supresso do crescimento

tumoral e de metstases no melanoma ainda permanecem elusivos (YOU et al.,

2014). Sabe-se que a perda da expresso do CADM1, tem como principal

mecanismo subjacente a hipermetilao do gene promotor ou a perda da

heterozigose, que frequentemente se correlaciona com pior prognstico das

neoplasias (VAN DER WEYDEN et al., 2012).

A perda da funo do CADM1 presumivelmente conduz a rompimentos na

adeso clula a clula e clula matriz extracelular, levando a uma proliferao

celular descontrolada e a distoro progressiva da arquitetura normal do tecido,

transformando nevos displsicos de um fentipo benigno para maligno (YOU et al.,

2012).

O CADM1 pode executar a funo supressora de tumores por desencadear a

resposta imunolgica citotxica dos linfcitos NK e T CD8 (MURAKAMI, 2005). Os

41

mecanismos pelos quais as clulas tumorais interagem com o sistema imunolgico

permanecem pouco compreendidos. Um estudo observou que os efeitos

supressores do CADM1 estavam ausentes em camundongos sem imunidade

mediada por linfcitos T. Portanto, os dados deste estudo sugerem que a funo do

CADM1 na supresso de metstases acontece pelos mecanismos de vigilncia

imunolgica (FARAJI et al., 2012).

O CADM1 inibe a ligao do receptor de tirosina quinase 2 com receptor de

tirosina quinase 3 (2ErbB2/ErbB3), sinalizando a morte celular, suprimindo o tumor.

O miR-214 suprime o CADM1 e aumenta a ligao ErbB2/ErbB3, observado no

cncer colorretal (MOMOSE et al., 2013).

Observou-se, em um estudo in vitro, que o CADM1 inibe a invaso de clulas

de melanoma atravs da supresso da matriz metaloproteinase. A degradao da

matriz extracelular e da membrana basal pode ser facilitada pelas metaloproteinases

que so enzimas proteolticas associadas invaso tumoral por facilitarem a

migrao de clulas tumorais atravs da matriz extracelular (YOU et al., 2014).

Os nveis de CADM1 so inversamente relacionados aos nveis de TWIST1,

que responsvel por regular genes envolvidos na adeso celular. Demonstrou-se

que o TWIST1 interage fisicamente com o promotor de CADM1 reduzindo seus

nveis, sugerindo que o CADM1 negativamente regulado pelo TWIST1

(HARTSOUGH et al, 2015).

A perda da funo de uma molcula de adeso celular como a CADM1 pode

induzir invaso e metstase, em clulas cancerosas, atravs da interveno no

mecanismo de transio epitelial-mesenquimal (EMT) (NATIONAL CANCER

CENTER RESEARCH INSTITUTE JAPAN, 2017).

Sabe-se que h perda da expresso do CADM1 no citoplasma de melanomas

e que esta perda est associada com estgios tardios do tumor e com o decrscimo

na sobrevida dos pacientes, apesar de nenhum mecanismo exato ainda ter sido

determinado (REES, 2012). Portanto, o CADM1 pode constituir um marcador

prognstico importante e um potencial alvo para o desenvolvimento de novas

terapias (YOU et al., 2014).

3.2.2.2 TWIST1

42

O gene TWIST1 est localizado no cromossomo 7p21.2 e conhecido

tambm como TWIST ou fator de transcrio TWIST (ONLINE MENDELIAN

INHERITANCE IN MAN, 2017). Ele um fator de transcrio basic helix-loop-helix

(bHLH) que forma tanto homodmeros quanto heterodmeros com outras protenas

bHLH para a construo de uma sequncia core E-box na regio do promotor de

genes alvo (SINGH; GRAMOLINI, 2009).

O TWIST um regulador nuclear na morfognese embriolgica (QIANG et al.,

2014) e participa do desenvolvimento da mesoderme, da miognese, da neurognse

e tambm age como um regulador de metstases (SINGH; GRAMOLINI, 2009).

conhecida a superexpresso do TWIST em tumores de diferentes origens,

como sarcomas, gliomas, carcinomas de clulas escamosas, carcinomas da mama e

melanoma (BECK et al., 2015). Esta superexpresso tem sido associada ao

aumento da migrao celular, invaso e metstase de neoplasias. O TWIST1 est

ativado na maioria dos melanomas e este achado correlaciona-se com pior

sobrevida dos pacientes (WEISS et al., 2012).

O TWIST est envolvido no processo de transio epitelial mesenquimal

(TEM) que desencadeia uma funo essencial nas metstases dos cnceres

(KHAN et al., 2013). Na TEM as clulas epiteliais perdem as propriedades de

adeso e adquirem critrios mesenquimais permitindo sua migrao e invaso

(BECK et al., 2015). O TWIST ativa a N-caderina e inibe a E-caderina que so

importantes para a TEM (Figura 18) (KHAN et al., 2013).

Figura 18. TWIST inibe a E-caderina que fundamental para o mecanismo de TEM (EMT).

Fonte: Adaptada de WANG; ZHOU, 2011.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khan%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23873099http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khan%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23873099https://www.researchgate.net/profile/Yifan_Wang7https://www.researchgate.net/researcher/39645975_Binhua_P_Zhou

43

Existem evidencias que a IL-6 induza a TEM e aumente a capacidade de

invaso das clulas tumorais de origem epitelial. No entanto, no se sabe se a IL-6

afeta tumores mesenquimais. Um estudo examinou os efeitos da IL-6 nas clulas de

melanoma e encontrou que a IL-6 pode aumentar seu potencial metasttico por

regular a expresso do TWIST e N-caderina (NA; LEE; SEOK, 2013).

Encontrou-se que RAS-RAF-MEK-ERK (via ERK1/2) sinaliza o aumento da

expresso de TWIST1 que aumenta as propriedades de invaso na derme e, pelo

menos em parte, eleva os nveis da matriz metaloproteinase (Figura 19)

(HARTSOUGH, et al, 2015). A hiperativao desta via comum em mltiplos tipos

de cncer, especialmente no melanoma, onde mutaes N-RAS ou B-RAF so

prevalentes (WEISS et al., 2012).

Figura 19. Modelo da via ERK1/2TWIST1MMP-1 na cascata do melanoma. A ativao do ERK1/2 leva a um aumento na transcrio do TWIST1. Fonte: Adapatada de (WEISS et al., 2012)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Na%20YR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24051540http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Na%20YR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24051540http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Seok%20SH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24051540

44

A superexpresso do TWIST tambm protege as clulas de cncer da morte

por apoptose (KHAN et al., 2013) atravs da inibio da p53 (BECK et al., 2015). O

TWIST pode afetar indiretamente a p53 atravs da modulao da via ARF/MDM/p53

(MAESTRO et al., 1999).

A associao da expresso do TWIST1 em leses metastticas de

melanoma, incluindo metstases nodais e a distncia, foi relatada. Observou-se

tambm que a colorao forte nuclear do TWIST est presente na maioria dos

melanomas primrios, enquanto que a expresso do TWIST geralmente negativa

em leses benignas (Figura 20) (PAPADOGEORGAKIS, 2013).

Figura 20. (A e B) Ausncia de expresso nuclear do TWIST1 em nevos melanocticos

intradrmicos. (C e D) Metstase de melanoma em linfonodo mostrando imunorreatividade para

TWIST1. (PAPADOGEORGAKIS, 2013).

Um estudo mostrou que (TGF) beta-1 se combinado com PLX4032, um

inibidor de BRAF, ou GSK1120212, um inibidor de MEK, aumenta substancialmente

a morte celular em linhagens de clulas de melanoma com mutao BRAF. Este

estudo sugere que o TWIST desempenha uma funo crucial mediando resistncia

s drogas inibidoras moleculares de BRAF e MEK (MENON et al., 2013). O

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khan%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23873099http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Menon%20DR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23848983

45

desenvolvimento de terapias alvo envolvendo o TWIST tem uma grande promessa

na teraputica do cncer (KHAN et al., 2013).

3.2.2.3 CDH1 (E-caderina)

O gene CDH1 tem o nome oficial de cadherin 1, pelo HGNC e sinnimo de E-

cadherin (HUGO GENE NOMENCLATURE COMMITTEE, 2017). Este gene est

presente no cromossomo 16 e codifica uma caderina clssica da superfamlia das

caderinas. Esta uma protena de adeso clula-clula que contm regio

extrecelular, transmembrana e citoplasmtica. A perda da funo deste gene

contribui para progresso, invaso e/ou metstases (NATIONAL CENTER FOR

BIOTECHNOLOGY INFORMATION, 2017).

Caderinas so glicoprotenas transmembrana clcio dependentes que

mediam a adeso clula-clula. A E-caderina est envolvida nas interaes

queratincito-melancito. A perda da expresso da E-caderina tem sido relatada na

progresso e metstase dos melanomas cutneos. A protena -catenina se liga a

E-caderina no citoesqueleto desempenhando um papel importante na adeso celular

(ANNA et al., 2007).

O TWIST1 suprime a E-caderina. (PAPADOGEORGAKIS, 2013). A perda da

E-caderina representa a marca da TEM em tumores epiteliais e tambm evidente

nos estgios tardios do melanoma, especialmente em metstases nodais

(CARAMEL et al., 2013). O mecanismo de transio epitelial mesenquimal (TEM)

nas clulas de melanoma ocorre pela modulao de genes especficos, reprimindo a

E-caderina e induzindo a N-caderina e proteases (BENNETT, 2008). Na progresso

do melanoma ocorre a perda da funo de E-caderina e ganho na expresso de N-

caderina (Figura 21) (FERNANDES, 2011).

A expresso de N-caderina facilita a ligao de clulas melanocticas com

fibroblastos e com clulas endoteliais, facilitando o extravasamento das clulas de

melanoma para a circulao. A E-caderina ativada retarda o crescimento e pode

reverter o fentipo invasivo de clulas do melanoma. Porm, no existem evidncias

de que a diminuio de E-caderina funcione como um promotor do melanoma

FERNANDES, 2011).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khan%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23873099

46

Figura 21. Aumento da expresso da N-caderina e diminuio da E-caderina no melanoma

invasivo. Fonte: Adapatada de MCGARY; LEV; BAR-ELI, 2002

47

4. METODOLOGIA

4.1 TIPO DE ESTUDO

Estudo transversal retrospectivo para a investigao da expresso imuno-

histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e CDH1.

4.2 LOCAL DO ESTUDO

O estudo foi realizado no Centro de Diagnsticos Antomo-Patolgicos

(CEDAP), Laboratrio de Anatomia Patolgica, localizado na cidade de Joinville em

Santa Catarina, credenciado pelo Colgio Americano de Patologistas e pela

Organizao Nacional de Acreditao. Possui uma equipe com 10 patologistas e 70

colaboradores e atua na rea de anatomia patolgica, incluindo a citopatologia,

histopatologia, imuno-histoqumica, imunofluorescncia e patologia molecular.

Atende pacientes principalmente da regio norte do estado, sendo que

aproximadamente metade so provenientes da rede pblica de sade. Devido a sua

abrangncia de atendimento, o CEDAP constitui um local apropriado para estudos

de leses melanocticas, inclundo os melanomas, que so prevalentes na regio

norte (STEGLISH, 2015).

4.3 PERODO DO ESTUDO

O estudo foi realizado em amostras coletadas nos anos de 2013, 2014, 2015

e 2016. A reavaliao histolgica e as anlises imuno-histoqumicas foram

realizadas no perodo de maio de 2016 a janeiro de 2017.

4.4 AMOSTRAS E CRITRIOS DE INCLUSO E EXCLUSO

Foram selecionadas amostras a partir dos diagnsticos registrados no banco

de dados do CEDAP. Os pacientes eram provenientes da rede pblica e privada e

todos tinham indicao clnica para a realizao do procedimento.

Inicialmente foram selecionadas 120 amostras consecutivas, todas com

acordo diagnstico de dois patologistas, sendo 40 amostras de melanomas com

48

menos de 1,0 mm de espessura, 40 melanomas com mais de 1,0 mm de espessura

e 40 nevos melanocticos compostos displsicos, com atipias moderadas. Foram

excludas as amostras que no apresentavam material suficiente para as anlises

subsequentes e as amostras que na reavaliao histolgica apresentaram critrios

diagnsticos duvidosos, totalizando 18 excluses (9 amostras de melanomas com

menos de 1,0 mm de espessura, 4 de melanomas com mais de 1,0 mm de

espessura e 5 de nevos melanocticos). Por fim, para fins do estudo foram includas

as 30 amostras consecutivas com diagnsticos mais recentes de cada grupo

Dentre os melanomas com menos de 1,0 mm de espessura, a mdia de idade

foi 51 17 anos. Conforme a classificao histolgica do Colgio Americano de

Patologistas, 27 eram de disseminao superficial e 3 melanomas sem outra

classificao. A mdia da espessura foi de 0,5 mm 0,3 mm. Dentre os melanomas

com mais de 1,0 mm de espessura, a mdia de idade foi 60 14 anos. Dez eram do

tipo histolgico de disseminao superficial, 14 do tipo nodular, 1 melanoma acral, 1

melanoma nevoide e 4 melanomas, sem outra classificao. A mdia da espessura

foi de 3,9 mm 3,8 mm. Dentre os nevos melanocticos compostos displsicos, com

atipias moderadas, a mdia de idade foi 40 13 anos e todos tinham a informao

clnica ou de anlise macroscpica de dimetro maior que 5,0 mm.

4.5 PROCEDIMENTOS METODOLGICOS

As lminas das amostras selecionadas, coradas por hematoxilina e eosina

foram reanalisadas microscopicamente para a confirmao do diagnstico

histolgico. Os blocos de parafina correspondentes foram analisados

macroscopicamente para avaliao da quantidade de material presente.

4.5.1 Tcnica de imuno-histoqumica

As amostras foram previamente fixadas em formalina a 10% e dispostas em

blocos de parafina. Foram realizados cortes com espessura de 4 micrmetros e

dispostos em lminas silanizadas e deixadas overnight em estufa a 60C para que

o material do corte aderisse lmina. A recuperao antignica foi feita no

49

equipamento PT-Link (Dako, Glostrup, Dinamarca) em soluo de recuperao

antignica em pH 9.0 (EnVision FLEX Target Retrieval Solution High pH (50x),

Dako). O processo de recuperao antignica foi realizado durante 20 minutos a

95C. Aps esta etapa e em todas as etapas subsequentes, as lminas foram

lavadas em tampo EnVision FLEX Wash Buffer (Dako), diludo 1:200 em gua

destilada, por 5 minutos. Os cortes foram demarcados com caneta hidrofbica. Para

todos os anticorpos a diluio utilizada foi determinada em testes em amostras

prvias.

Para a investigao da expresso do gene CADM1 foi realizado bloqueio por

20 minutos com 100 L de perxido de hidrognio a 3% (Dako). Foram adicionados

100 L do anticorpo CADM1, diludo 1:600 na soluo EnVision FLEX Antibody

Diluent (Dako), por 16 horas overnight. O anticorpo anti-CADM1 conjugado,

policlonal isotipo Ig de coelho, que reage na regio N-terminal da protena CADM1

(SynCAM humano) (ABBIOTEC, Le Plessis Robinson, Frana).

Para a investigao da expresso do gene TWIST1 foi realizado bloqueio por


100 L do anticorpo monoclonal, diludo 1:3000 na soluo EnVision FLEX Antibody

Diluent (Dako), por 16 horas overnight. O anticorpo anti-TWIST1 conjugado,

monoclonal (clone 10E4E6, Genetex, Irvine, Estados Unidos da Amrica) e

reconhece a regio entre os aminocidos 9 e 74 da protena TWIST1 humano.

Para a investigao da expresso do gene CDH1 (E-caderina) foi realizado

bloqueio por 5 minutos com 100 L de perxido de hidrognio a 3% (Dako). A

seguir, foram adicionados 100 L do anticorpo pronto para uso (Dako) e incubado

durante 20 minutos. O anticorpo anti-CDH1 monoclonal derivado de camundongo

(clone NCH-38, anti-humano) e reconhece os fragmentos de E-caderina de 120 KDa

e de 82 kDa. Na sequncia, foi adicionado o anticorpo secundrio EnVision FLEX

Mouse LINKER (Dako) e incubado por 15 minutos.

Aps estas etapas, em todas as reaes foram adicionados 100 L de

polmero EnVision FLEX/HRP (Dako), seguido de incubao durante 20 minutos.

Na sequncia, foram adicionados 100 L da soluo de cromgeno de

diaminobenzidina (EnVision FLEX DAB Cromgeno, Dako), com incubao

durante 20 minutos. As lminas foram contracoradas com hematoxilina de Gill e

50

montadas com meio de montagem (Dako), sendo identificadas com etiquetas com

cdigo de barras.

4.5.2 Leitura e interpretao dos resultados

A expresso do CADM1 e do CDH1 (E-caderina) foi avaliada no citoplasma e

na membrana celular. A expresso do TWIST1 foi avaliada no ncleo celular. As

lminas de imuno-histoqumica foram analisadas de modo cego, por dois

patologistas experientes, em relao aos dados clnicos e histolgicos dos

pacientes. O mtodo de leitura, interpretao dos resultados e definio dos scores

foi baseado em You et al. (2012). Foram analisadas a porcentagem de clulas

positivas e a intensidade da colorao em cada amostra.

Para a definio da porcentagem de clulas positivas, utilizou-se uma escala

de 0 a 4: 0 a 10% de clulas coradas classificou-se como 0; 11 a 25% como 1; 26 a

50% como 2; 51 a 75% como 3 e 76 a 100% como 4. A intensidade da colorao foi

graduada em uma escala de 0 a 3: resultado negativo foi classificado como 0; fraco

como 1; moderado como 2 e forte como 3. O score final foi obtido multiplicando-se o

resultado da porcentagem de clulas coradas pelo resultado da intensidade da

colorao. Na anlise final, um score menor do que 3 foi considerado negativo e

scores iguais ou superiores a 3 foram considerados positivos.

4.6 Anlise estatstica

A anlise estatstica para o clculo da diferena dos resultados

interobservadores foi realizada atravs do ndice de Kappa utilizando o programa

Statistical Package for the Social Sciences (SPSS).

A avaliao da significncia estatstica para cada marcador, TWIST1, CADM1

e CDH1, entre os grupos dos melanomas com menos de 1,0 mm de espessura, dos

melanomas com mais de 1,0 mm de espessura e dos nevos compostos displsicos

foi realizada atravs do teste Mann-Whitney com o Social Science Statistics

(http://www.socscistatistics.com). Valores de p menores que 0,05 foram

considerados estatisticamente significativos.

http://www.socscistatistics.com/

51

4.7 Aspectos ticos

O projeto de pesquisa foi avaliado e aprovado pelo Comit de tica em

Pesquisa (CEP) da Universidade da Regio de Joinville (UNIVILLE), conforme

diretrizes estabelecidas na Resoluo 466/2012 do Conselho Nacional de Sade

(CNS) e complementares, sob o parecer nmero 1.282.268.

As amostras selecionadas foram utilizadas exclusivamente para os fins

previstos na pesquisa. Aps a realizao do estudo, os blocos histolgicos foram

devolvidos ao biobanco CEDAP, onde permanecero armazenados por no mnimo

20 anos a partir do cadastro inicial do paciente, possibilitando que novos estudos

sejam realizados a medida que as tcnicas analticas evoluam e novos marcadores

moleculares surjam. Aps os 20 anos o descarte do material ser realizado, se

necessrio, conforme as normas do biobanco CEDAP, que foi aprovado pela

Comisso Nacional de tica em Pesquisa (CONEP) por meio do parecer 016/2016.

52

5. RESULTADOS E DISCUSSO

Conforme as normas do Programa de Ps-Graduao em Mestrado em

Sade e Meio Ambiente da UNIVILLE, este captulo ser apresentado na forma de

artigo cientfico, encaminhado para publicao no peridico Pathology - Research

and Practice (editora Elsevier; ISSN: 0344-0338).

53

AVALIAO DA EXPRESSO DOS GENES CADM1, TWIST1 E CDH1 POR


Resumo Introduo: O melanoma maligno uma doena agressiva e sua incidncia est

aumentando no mundo. A predisposio gentica e a exposio a fatores

ambientais, principalmente a luz solar, so fatores de risco. A distino

histopatolgica entre nevos e melanomas pode ser difcil. Prev-se que a avaliao

da expresso imuno-histoqumica de alguns genes poderia contribuir para o

diagnstico diferencial de leses histogicamente questionveis. Objetivo: Investigar

se a avaliao da expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e

CDH1 (E-caderina), que participam dos mecanismos de adeso celular e transio

epitelial-mesenquimal, contribui para o diagnstico diferencial das leses

melanocticas de difcil diagnstico. Metodologia: Estudo transversal retrospectivo

baseado na avaliao da expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1,

TWIST1 e CDH1 por imuno-histoqumica em amostras de 30 nevos compostos

displsicos, 30 melanomas com menos de 1,0 mm de espessura e 30 melanomas

com mais de 1,0 mm de espessura, diagnosticados no perodo de 2013 a 2016, em

Joinville/SC. Foi utilizado um score que avaliou a intensidade da colorao e a

proporo de clulas coradas. Resultados: Em comparao aos nevos melanocticos

compostos displsicos, observou-se reduo significativa da expresso dos genes

CADM1 e CDH1 nos melanomas (abaixo e acima de 1,0 mm de espessura) e nos

melanomas de mais de 1,0 mm de espessura, respectivamente. Tambm se

verificou menor expresso dos genes CADM1 e CDH1 nos melanomas com mais de

1,0 mm de espessura em relao aos melanomas com menos 1,0 mm. O gene

TWIST1 no apresentou diferena significativa da expresso entre os grupos.

Concluso: Estes achados permitem concluir que a expresso imuno-histoqumica

do CADM1 tem potencial para contribuir como ferramenta auxiliar ao diagnsico

diferencial entre nevos melanocticos compostos displsicos e melanomas.

Palavras chave: Imuno-histoqumica, CADM1, TWIST, CDH1, melanoma, nevo

displsico

54

EVALUATION OF EXPRESSION OF GENES CADM1, TWIST1 AND CDH1 BY

IMMUNOHISTOCHEMISTRY IN MELANOCYTIC LESIONS

Abstract

Introduction: Malignant melanoma is an aggressive disease and its incidence is

increasing worldwide. Genetic predisposition and exposure to environmental factors,

especially sunlight, are risk factors. Histopathologic distinction between nevi and

melanoma can be difficult. It is anticipated that the evaluation of the

immunohistochemical expression of some genes could contribute to the differential

diagnosis of questionable histologically lesions. Objective: To investigate wether the

evaluation of the immunohistochemical expression of genes CADM1, TWIST1 and

CDH1 (E-cadherin), that take part in mechanisms of cell adhesion and epithelial-

mesenchymal transition, contributes to the differential diagnosis of melanocytic

lesions difficult to diagnose. Methodology: Retrospective cross-sectional study based

on immunohistochemical expression evaluation of genes CADM1, CDH1 and

TWIST1 in samples of 30 dysplastic compound nevus, 30 melanomas with less than

1.0 mm thick and melanomas with more than 1.0 mm thick, diagnosed between 2013

and 2016, in Joinville/SC. A score was used to evaluate color intensity and proportion

of cells stained. Results: There was a significant reduction in the expression of the

genes CADM1 and CDH1 in melanomas (below and above 1.0 mm thick) and in

melanomas of more than 1.0 mm in thickness, respectively, compared to dysplastic

melanocytic nevi. There was also lower expression of the genes CADM1 and CDH1

genes in melanomas greater than 1.0 mm thick compared to melanomas less than

1.0 mm. The gene TWIST1 showed no significant difference in expression between

groups. Conclusion: These findings allow us to conclude that the

immunohistochemical expression of CADM1 has the potential to contribute as an

auxiliary tool to the differential diagnosis between dysplastic compound nevus and

melanoma.

Key-words: immunohistochemIstry, CADM1, TWIST, CDH1, cutaneous melanoma,

dysplastic nevus.

55

Introduo

O melanoma maligno uma das neoplasias mais agressivas nos seres

humanos. O nmero estimado de mortes por melanoma de 48.000 por ano, em

todo o mundo [1], e vem sendo relatado um aumento na incidncia nas populaes

caucasianas [2].

A determinao das causas para o desenvolvimento do melanoma

complexa, com fatores de genticos e ambientais influenciando o risco individual [3].

A exposio ocupacional, o estilo nutricional e principalmente a exposio luz solar

so fatores ambientais relacionados ao desenvolvimento do melanoma cutneo.

Mudanas significativas na expresso de microRNA em resposta exposio

ambiental tm sido relatadas [4].

A preciso do diagnstico do melanoma crtica para a conteno da

malignidade [1]. O exame histopatolgico o "padro ouro" para o diagnstico de

leses melanocticas. No entanto, a distino histopatolgica definitiva entre as

leses benignas e as malignas, em alguns casos, pode ser difcil. descrita uma

discordncia interobservador relativa ao diagnstico de nevos e melanomas

variando de 2,3 a 25% das leses [5].

Marcadores moleculares podem ser utilizados como ferramentas auxiliares ao

diagnstico das leses melanocticas [5]. Ferramentas citogenticas, tais como

Comparative Genomic Hybridization e Fluorescence in situ Hybridization, foram

desenvolvidas para ajudar na classificao de leses melanocticas ambguas. No

entanto, estes mtodos moleculares requerem equipamentos e patologistas

qualificados, portanto, no so utilizados rotineiramente [6]. Ao contrrio, a imuno-

histoqumica utilizada na maioria dos centros de patologia. Porm, apesar de

muitos marcadores terem sido estudados, apenas poucos deles parecem servir

como ferramentas auxiliares para o diagnstico diferencial de nevo e melanoma e,

at o momento, nenhum deles suficiente para distinguir inequivocamente uma

leso melanoctica [5].

descrito que a perda da expresso imuno-histoqumica do gene CADM1,

que ocorre nos melanomas, poderia servir como um marcador de melanoma em

leses histologicamente questionveis [7]. Os nveis de CADM1 so inversamente

relacionados aos nveis de TWIST1, que responsvel por regular genes envolvidos

56

na adeso celular [8]. O TWIST1 participa do processo de transio epitelial

mesenquimal (EMT) [9], que um processo em que clulas perdem as propriedades

de adeso e adquirem critrios mesenquimais permitindo a invaso e migrao [10].

Por sua vez, a perda da expresso da E-caderina tem sido relatada na progresso e

metstase dos melanomas cutneos [11].

O objetivo deste estudo foi avaliar se a anlise em conjunto da expresso

imuno-histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e CDH1 (E-caderina) pode

contribuir para o diagnstico diferencial de leses melanocticas.

Mtodos Tipo, local e perodo do estudo

Estudo transversal retrospectivo realizado no Centro de Diagnsticos

Antomo-Patolgicos (CEDAP), laboratrio de anatomia patolgica, localizado na

cidade de Joinville em Santa Catarina, Brasil. O estudo foi realizado em amostras

coletadas nos anos de 2013, 2014, 2015 e 2016. A reavaliao histolgica e as

anlises imuno-histoqumicas foram realizadas no perodo de maio de 2016 a janeiro

de 2017.

Amostras e critrios de incluso e excluso

Foram selecionadas amostras a partir dos diagnsticos registrados no banco

de dados do CEDAP. Os pacientes eram provenientes da rede pblica e privada e

todos tinham indicao clnica para a realizao do procedimento.

Inicialmente foram selecionadas 120 amostras consecutivas, todas com

acordo diagnstico de dois patologistas, sendo 40 amostras de melanomas com

menos de 1,0 mm de espessura, 40 melanomas com mais de 1,0 mm de espessura

e 40 nevos melanocticos compostos displsicos, com atipias moderadas. Foram

excludas as amostras que no apresentavam material suficiente para as anlises

subsequentes e as amostras que na reavaliao histolgica apresentaram critrios

diagnsticos duvidosos, totalizando 18 excluses (9 amostras de melanomas com

menos de 1,0 mm de espessura, 4 de melanomas com mais de 1,0 mm de

57

espessura e 5 de nevos melanocticos). Por fim, para fins do estudo foram includas

as 30 amostras consecutivas com diagnsticos mais recentes de cada grupo

Dentre os melanomas com menos de 1,0 mm de espessura, a mdia de idade

foi 51 17 anos. Conforme a classificao histolgica do Colgio Americano de

Patologistas, 27 eram de disseminao superficial e 3 melanomas sem outra

classificao. A mdia da espessura foi de 0,5 mm 0,3 mm. Dentre os melanomas

com mais de 1,0 mm de espessura, a mdia de idade foi 60 14 anos. Dez eram do

tipo histolgico de disseminao superficial, 14 do tipo nodular, 1 melanoma acral, 1

melanoma nevoide e 4 melanomas, sem outra classificao. A mdia da espessura

foi de 3,9 mm 3,8 mm. Dentre os nevos melanocticos compostos displsicos, com

atipias moderadas, a mdia de idade foi 40 13 anos e todos tinham a informao

clnica ou de anlise macroscpica de dimetro maior que 5,0 mm.

Imuno-histoqumica

As amostras foram previamente fixadas em formalina a 10% e dispostas em

blocos de parafina. Foram realizados cortes com espessura de 4 micrmetros e

dispostos em lminas silanizadas e deixadas overnight em estufa a 60C para que

o material do corte aderisse lmina. A recuperao antignica foi feita no

equipamento PT-Link (Dako, Glostrup, Dinamarca) em soluo de recuperao

antignica em pH 9.0 (EnVision FLEX Target Retrieval Solution High pH (50x),

Dako). O processo de recuperao antignica foi realizado durante 20 minutos a

95C. Aps esta etapa e em todas as etapas subsequentes, as lminas foram

lavadas em tampo EnVision FLEX Wash Buffer (Dako), diludo 1:200 em gua

destilada, por 5 minutos. Os cortes foram demarcados com caneta hidrofbica. Para

todos os anticorpos a diluio utilizada foi determinada em testes em amostras

prvias.

Para a investigao da expresso do gene CADM1 foi realizado bloqueio por


karina munhoz de paula alves coelho - … · twist1 in samples of 30 dysplastic compound nevus, 30...

Documents