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38ISSN 1517-1981

Outubro 2000ISSN 1678-0434Novembro, 2016

Influência da Temperatura eUmidade no Funcionamentode um Biossensor comMicrocantilever

ISSN

Novembro, 2016

1678-0434

38

São Carlos, SP2016

Alexandre MargaridoFernando M. Araujo MoreiraPaulo Sérgio de Paula Herrmann Jr

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Embrapa Instrumentação


Margarido, Alexandre Influência da temperatura e umidade no funcionamento de um biossensorcom microcantilever / Alexandre Margarido, Fernando M. Araujo-Moreira,Paulo Sérgio de Paula Herrmann Jr. -- São Carlos: Embrapa Instrumentação,2016. 28 p. – (Embrapa Instrumentação. Boletim de Pesquisa e desenvolvimento,ISSN: 1678-0434; 38).

1. Microscopio de força atômica. 2. MFA. 3. Microcantilever. 4. Biossensor.5. Amortecimento. I. Araujo-Moreira, Fernando M. II. Herrmann Junior, PauloSergio de Paula. III. Título. IV. Série.

© Embrapa 2016

M327i

CDD 21 ED. 543.0812502.82

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1ª edição1ª impressão (2016): tiragem 300

Alexandre MargaridoAlexandre Margarido

Todos os direitos reservadosA reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte,

constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610).Dados internacionais de Catalogação na publicação (CIP)


Sumário

Resumo ................................................................................................ 5

Abstract ............................................................................................... 6

Introdução ............................................................................................ 7

Materiais e Metodos.............................................................................. 10

Resultados e Discussões ....................................................................... 13

Conclusão .......................................................................................... 23

Referências ......................................................................................... 24

Resumo

O microscópio de força atômica (MFA) pode utilizar um microcantilever ( C) como biossensor, por meio de transdução de processos químicos ou físicos em uma resposta mecânica. Biossensores de mC permitem a detecção através da variação de sua frequência de ressonância ou pela indução de tensões superficiais que podem provocar torções na haste. Neste contexto, serão analisados o fator qualidade (Q), em detrimento ao amortecimento gerado pela camada funcional (funcionalização ou revestimento biológico) e o Drive Amplitude (mV) que exibe a energia necessária pelo sistema para manter a mesma amplitude de vibração, em condições diferentes de temperatura e umidade relativa (UR%). Foram testados os dois principais métodos de funcionalização citados na literatura, em que foi correlacionado o efeito da espessura da camada funcional com o desvio na frequência de ressonância. Foi comprovado que quanto mais fina e uniforme for a camada funcional, o biossensor terá um comportamento mais próximo a de um mC sem revestimento, que é considerado a condição ideal, pois é menos susceptível a mudanças ambientais.

Palavras-chave: Microscópio de força atômica, MFA, microcantilever, biossensor, amortecimento.

m

¹ Engenheiro da computação, Doutor, São Carlos, SP² Engenheiro elétrico, Doutor, Pesquisador, Embrapa Instrumentação, São Carlos, SP³ Engenheiro de materiais, Doutor, Professor, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP

Alexandre Margarido¹Fernando M. Araujo Moreira²Paulo Sérgio de Paula Herrmann Jr³


Abstract

The atomic force microscope (AFM) can use a microcantilever (mC) as biosensor transduction through chemical or physical means into a mechanical response. Biosensor of mC allow detection through the variation of its resonant frequency or the induction of surface tensions that may cause twisting of the rod. In this context, we will analyze the quality factor (Q) over the damping generated by the functional layer (functionalization or organic coating) and Drive Amplitude (mV) that displays the energy required by the system to maintain the same amplitude of vibration, under conditions different temperature and humidity (UR%). The two main functionalization methods cited in the literature were tested, it was correlated the effect of the thickness of the functional layer with the deviation in the resonance frequency. It was confirmed that the thin and uniform is the functional layer, the biosensor will have a behavior closer to that of an uncoated mC, which is considered the ideal condition, because it is less susceptible to environmental changes.

Index terms: Atomic Force Microscope, AFM, microcantilever, biosensor, damping.

The Influence of theTemperature and Humidityin a MicrocantileverBiosensor Response

Introdução

A microscopia de força atômica (AFM do inglês, Atomic Force Microscopy) é uma metodologia derivada da família do SPM, (do inglês, Scanning Probe Microscopy) que consiste na varredura de uma sonda sobre uma superfície. Tal técnica vem proporcionando grandes conquistas em nanociência e nanotecnologia, destacando-se por ser uma técnica que permite mapear a topografia de uma amostra condutora, semicondutora e isolante, bem como moléculas biológicas em solução, desde a escala micrométrica até a atômica (SINGAMANENI et al., 2008).

O princípio básico do AFM consiste no emprego de uma haste (microcantilever - mC) com uma agulha (tip) de um lado e uma parte refletiva na outra face. Normalmente a haste do mC pode receber uma fina camada de ouro, alumínio ou de outros materiais para aumentar a reflexão do laser para um fotodetector de quatro quadrantes (Figura 1). O feixe refletido atinge uma posição sensível do fotodetector, onde a distância percorrida é proporcional à deflexão da haste. Dessa forma, pode-se também estipular a deflexão com grande precisão por intermédio de interferometria da reflexão da haste (RAITERI; GRATTAROLA; BERGER, 2002).

Figura 1. Método de detecção da deflexão ótica. A deflexão do mC é detectada utilizando um feixe de laser, que é refletido pela superfície do microcantilever. Z, F, h, l e w são respectivamente o comprimento da haste, força detectada, espessura, comprimento e largura do mC respectivamente (STEFFENS et al., 2012).

A constante de mola “k” do mC, traduz a rigidez da haste, ou seja, representa uma medida de sua dureza, e é estritamente dependente à sua geometria e material, para microcantilevers retangulares pode ser calculado de acordo com a Equação 1: [1]

onde k é a constante de mola do mC (N/m), E é o modulo de Young (ESi3N4 = 3 * 1011 N*m-2), l é o comprimento, h a espessura (m) e w a largura (m) (IMAMURA et al., 2016; SINGAMANENI et al., 2008).

7Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever

A seletividade, sensibilidade, reprodutibilidade e a miniaturização de sensores bioquímicos são desejáveis para inúmeras aplicações industriais, o que, consequentemente, implica em uma elevada complexidade, funcionalidade e compacidade. Sensores comerciais comumente traduzem a sensibilidade em propriedades elétricas, neste trabalho será analisada a resposta mecânica de uma micro-haste de Nitreto de Silício (Si3N4), chamado microcantilever (mC), os quais são muito utilizados na técnica de MFA. Estas hastes podem ser revestidas em apenas uma das faces ou em ambas, com uma camada biosensitiva (funcionalização).

Um biossensor é um sensor que, quando exposto a um tipo particular de substância (a substância a analisar – analito alvo), transforma uma informação química, por exemplo, como a polaridade ou a diferença de concentração, em um sinal analiticamente mensurável, tal como resistência elétrica, condutividade, diferença de potencial, frequência de ressonância, entre outros. Esta transformação é chamada de transdução de sinal e é de importância central para o funcionamento de qualquer sensor e/ou biossensor (OLIVEIRA et al., 2013; STEFFENS et al., 2012; STEFFENS et al., 2014).

A tecnologia empregada nos biossensores de mC é uma técnica de detecção com sensibilidade extremamente alta (podendo chegar a ppt) e com amplas aplicações na física, química e biologia. A adsorção de moléculas na superfície do mC ou mudanças extremas no ambiente, como por exemplo, densidade e viscosidade, são fatores que alteram sua frequência de ressonância (BUCHAPUDI et al., 2011; FAEGH et al., 2015).

O fator qualidade (Q) é o fator que determina a resolução de leitura do MFA e depende dos mecanismos de amortecimento presentes no mC ou no meio físico. Para os microcantilevers de modo NC operados no ar, Q é tipicamente da ordem de algumas centenas, mas pode chegar a centenas de milhares em pressão efetiva negativa e a baixas temperaturas, onde os ruídos são minimizados (WIESENDANGER, 1994). A otimização de microcantilevers, possibilitou um aumento do fator Q para valores tão elevados como 10.000. A operação em frequências altas, da ordem de 1,5 MHz permite uma resolução de massa teórica de cerca de 20 ag/Hz (FINOT et al., 2008).

O fator Q tende a infinito quando o amortecimento sobre a haste é mínimo, e este amortecimento pode ser ocasionado pelas partículas presentes no ambiente (meio mais denso), pressão e temperatura. O fator Q pode ser calculado a partir da equação 2: [2]

onde (Hz) é a frequência de ressonância de um oscilador amortecido, c é a constante de amortecimento e m é a massa (g) do oscilador. Elevando-se o fator Q aumenta-se a sensibilidade das medições e valores na faixa de 100-1.000 são típicos para essas medidas (BHUSHAN, 2010).


O fator Q é também considerado a medida da largura da curva de ressonância e pode ser calculado dividindo-se o pico da frequência de ressonância w (Hz) pela largura à metade da potência máxima ( ) (Figura 2 (A)). O fator Q aumenta quanto mais estreito for o pico de ressonância (Figura 2 (B)), o que também aumenta a precisão da leitura equação 3 (Q CONTROL, 2011).

[3]

(A) (B)

Figura 2. (A) Fator Q em função da potência/média a meia altura e (B) comportamento do gráfico em função dos valores de Fator Q, adaptado de Q CONTROL (2011).

Em modo dinâmico, uma pequena alteração na massa do mC (∆m) provoca alteração na frequência de ressonância, que pode ser calculada por intermédio da equação 4: [4]

onde k é a constante de mola do mC (N/m), f0 e f1 são as frequências de ressonância inicial e após adsorção de massa (Hz), respectivamente. O mC é medido no MFA para obter a constante de mola (k) e frequência de ressonância e o fator Q antes da adição de massa. A frequência de ressonância e o fator Q são obtidos pelo ajuste dos dados dos espectros de vibração para a resposta da amplitude, comparado com um oscilador harmônico simples (BOWEN et al., 2010; SADER et al., 1999).

Quando ocorre adsorção na superfície de um microcantilever, a frequência de ressonância irá mudar de acordo com a lei de Hooke, que pode ser expressa pela equação 5:

[5]

onde é a massa adsorvida, que é muito menor que a massa efetiva do microcantilever, e são a variação da frequência de ressonância após a adsorção de massa e frequência de ressonância original, respectivamente (ONO et al., 2003).


ϫ

A adsorção mínima de massa detectável é dependente da alteração mínima detectável da fase do sistema de ressonância (valor fixo, onde o ruído térmico e eletrônico do circuito de realimentação do AFM é levado em consideração) que pode ser expresso pela equação 6:

[6]

O fator Q domina a resolução de detecção de massa, onde o ar e a umidade são fatores dominantes na determinação do fator Q. Diminuindo-se o amortecimento causado pelo ar, pode-se melhorar significativamente o valor de Q e, desse modo, melhorar a resolução de detecção de massa do mC ressonante. Aparentemente, diminuindo-se as dimensões do mC, pode-se diminuir o efeito de amortecimento do ar. Entretanto, uma área de superfície mínima é necessária para capturar especificamente os analitos alvos, que são de dimensão nanométrica. Alternativamente, estudos teóricos e experimentais indicaram que a utilização de modos de ressonância de ordem superior podem efetivamente aumentar o fator Q e a resolução de detecção de massa (LI; LEE, 2012).

Neste trabalho, foram avaliadas através do modo dinâmico de leitura em MFA, as alterações das respostas de frequência de ressonância em mC funcionalizados utilizando duas metodologias de fixação da enzima Álcool desidrogenase em diferentes condições de temperatura e UR%.

Materiais e métodos

Instrumentação utilizada

A resposta de frequência do microcantilever durante a excitação é medida TMutilizando um Veeco V MFA – Dimension . O laser emitido de um diodo é

colimado e apontado para a ponta do mC, este é refletido para um fotodetector de quatro quadrantes. A resposta de um espectro de ressonâncias da excitação

TMde um mC é analisado pelo software NanoScope . O AFM Dimension Veeco V é equipado com um conjunto de cerâmicas piezoelétricas responsáveis pela movimentação e excitação da haste do mC dentro de uma faixa de frequências determinada pelas características do mC e do meio físico em que se encontra. Por intermédio da reflexão do laser em um fotodetector, o equipamento encontra a frequência de ressonância e mantém a excitação nesta frequência.

Reagentes usados nos experimentos

Todos os reagentes foram adquiridos da Sigma–Aldrich e utilizados como descrito a seguir: Álcool Desidrogenase de “Saccharomyces cerevisiae” (A7011); “(3-Aminopropyl) triethoxysilane” 99 % (APTES) (440140); Solução de Glutaraldeído (GLD) Grade I, 25 % em água (G5882); “11-Amino-1-undecanethiol hydrochloride” 99% (TIOL) (674397), Etanol puro 200 proof, para biologia molecular (E7023) e J.T.Baker- 18078-TOLUENO, PA, ACS, 99,5 %. A água foi purificada pelo sistema Milli-Q (Millipore Co. 18,0 MW*cm-1).


Gás Nitrogênio 5.0 com pureza mínima de 99,999% e umidade inferior a 2ppm-mol, Nitrogênio Líquido com pureza mínima de 99,999% e umidade inferior a 2ppm.

Microcantilevers

Os microcantilevers compostos de Nitreto de Silício foram adquiridos da NT-MDT, modelo NSG-10 e NSG-03, conforme Tabela 1.

Tabela 1. Características físicas dos microcantilevers utilizados.

Procedimento de funcionalização do microcantilever

Os mC foram imersos em solução Piranha (70% H2SO4 conc. em 30% H2O2,

1:1) por 5 min seguido de 3 imersões em H2O Milli-Q a 18,2 MW por 5 min e exposição a UV 240nm por 20 min para remoção de contaminantes metálicos e orgânicos da superfície.

A enzima Álcool Desidrogenase foi utilizada como elemento sensor e tem como substrato principal o etanol, seguido de metanol e isopropanol. Para imobilização da enzima foram utilizados os reagentes:

3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES), Glutaraldehyde solution (GLD) 25% in H2O e 11-Amino-1-undecanethiol hydrochloride 99% (TIOL).

Para a imobilização da enzima na superfície do mC, é necessária a aplicação de um ou mais elementos (APTES, ouro, TIOL, glutaraldeído) de maneira que se estabeleça ligação covalente entre os componentes da camada funcional. Esta funcionalização foi realizada de duas maneiras distintas: pela formação de monocamadas auto organizadas (self assembled monolayer – SAM) e por ligações covalentes cruzadas entre os grupos amino do suporte com os grupos amino das biomoléculas, empregando-se reagentes bi ou multifuncionais (LOJOU; BIANCO, 2006).


Modelo do µC NSG10 NSG03

Comprimento do µC (C) [µm] 95 ± 5 135 ± 5

Largura do µC (L) [µm] 30 ± 3 30 ± 3

Espessura do µC [µm] 2.0 ±0.5 1.5 ±0.5

Frequência de ressonância (KHz) 140 - 390 47 - 150

Constante de mola (K) [N/m] 3,1 – 37,6 0,35 – 6,1

Ativação por APTES: pode ser realizada diretamente no mC, por vaporização

modificando a superfície. Ocorre à formação de compostos de silano em

monocamadas sobre a superfície oxidada do silício com o grupo silanol ativo (Si-

OH), formando uma terminação NH2, possibilitando ligações covalentes com o

grupo amino do glutaraldeído (GLD), estes passos estão mostrados na Figura 3

(VASHIST et al., 2014).

Imediatamente após a limpeza dos mC, foram ativados com 40mL de vapor de

APTES com trietilamina 100%, por 40 minutos em um dissecador de 1L,

previamente purgado com gás Nitrogênio por 10 minutos para a eliminação do

oxigênio (figura 3, parte tracejado).

Figura 3. Esquema ilustrando a ativação com o reagente APTES em SAM.

Ativação com TIOL: Para a ligação do Tiol os mC de silício receberam uma

camada de ouro de 20,0 nm pela técnica de sputtering, lavados em solução

piranha por 5 minutos, seguido de água milli-Q e etanol por 5 minutos. Em

seguida foram depositados em um recipiente com solução de TIOL a 1mM

solubilizado em etanol 200 proof com o pH ajustado para 8.0 com trietilamina,

conforme demonstrado na área tracejada da Figura 4. Os mC permaneceram

nessa solução por 24 horas a 25ºC para a formação de uma monocamada

densa e organizada, com terminais NH2 livres.

Figura 4. Esquema ilustrando a ativação do microcantilever com o reagente

TIOL em SAM.

Ligação com a enzima álcool desidrogenase

Com a superfície do mC ativada (apenas o recobrimento com o TIOL ou APTES),

a funcionalização envolvendo a enzima foi realizada de duas formas diferentes:


Ligação em camadas auto-organizadas

O mC foi submetido a uma solução de glutaraldeído a 2% em tampão 50 mM de

fosfato de sódio, pH 8,6 por 1h e após lavado com tampão para remover os

agentes não ligados. Em seguida foi mantido em uma solução de fosfato de

sódio pH 8,6 contendo a enzima na concentração de 26 mg/mL por 6 h a 25ºC.

Para finalizar, o mC foi lavado em tampão fosfato de sódio pH 8,6 para remoção

das enzimas não ligadas, formando assim monocamadas auto-organizadas

(SAM) com ligações covalentes, e armazenado a 8,0 ºC por 24 h antes de ser

utilizado.

Ligação covalente-cruzada

Foram depositados sobre a superfície do mC 10,0 (mL) da solução de tampão

fosfato de sódio pH 8,0 50,0 (mM) com enzima álcool desidrogenase na

concentração de 26,0 (mg/mL) acrescido de 2,0 (µL) de Glutaraldeído (25%),

foi diretamente adicionado sobre o mC ativado (APTES ou TIOL). Após 1 min o

microcantilever é removido da solução e mantido por 3h em temperatura

ambiente para finalizar a polimerização, seguido de armazenagem a 8,0 (ºC) por

24h. O tempo de exposição do mC ativado ao glutaraldeído com as enzimas

solubilizadas confere a espessura da camada funcional, fato este difícil de

controlar.

Resultados e discussões

Análise física do Microcantilever com MFA

O MFA utiliza o modo dinâmico para leituras de superfícies em modo de não

contato (NC) ou quasi non contact (quasi-NC ou tapping® mode) e também para

avaliar a condição de uso do mC antes de depois da varredura de uma amostra

para geração de imagem. A alteração na frequência de ressonância do mC indica

que ocorreu alteração de massa na superfície, sendo assim, pode ter adsorvido

material. Quando ocorre qualquer variação permanente na frequência de

ressonância original, o mC deve ser substituído, pois indica que a leitura da

superfície poderá não ocorrer de forma adequada.

O MFA Dimension Veeco V é equipado com um conjunto de cerâmicas

piezolétricas responsáveis pela movimentação e excitação do mC dentro de uma

faixa de frequências de 10 a 1000KHz. Através da reflexão do laser em um

fotodetector o equipamento identifica a frequência de ressonância e mantém a

excitação nesta frequência. Através da análise gráfica do valor de amplitude,

em volts (V), pela frequência (KHz) (Figura 5) é possível visualizar em tempo

real qualquer alteração na resposta de frequência de ressonância.


Figura 5. Tela mC Tune do software Nanoscope V, utilizada para verificar a

frequência de ressonância para um microcantilever.

Microcantilevers novos com constante de mola k acima de 20,0 N/m e com

comprimento de até 140,0 mm, possuem frequência de ressonância acima de

100 KHz, geralmente apresentando um único e bem definido pico de frequência

de ressonância (harmônico) dentro da faixa de frequências (50 a 1000 KHz)

como pode ser visualizado na Figura 6(A), modelo NSG10 Q=400 (3.1 a 37,6

N/m). No entanto, mC com constantes de mola baixas, tendem a formar mais de

um harmônico, Figura 6 (B), modelo NSG03 Q=359 (0,36 a 6,1 N/m) e mC para

aplicação em modo contato com constantes de mola muito baixas (NanoWorld

38763f17l497 Q=300 (0.001 a 0.1 N/m com comprimento de 400mm), (Figura

6(C)), formam naturalmente vários harmônicos, o que inviabiliza sua utilização

para aplicações em modo dinâmico.

(A) (B)

(C)

Figura 6. Resposta de ressonância de mC sem

revestimento na faixa de 50 a 1000MHz para

os modelos (A) NT-MDT NSG10, (B) NT-MDT

NSG03 e (C) NanoWorld 38763f17l497 de modo contato.


A aplicação de uma camada funcional bioativa gera um amortecimento para a vibração da haste, reduzindo o fator de qualidade Q e fazendo com que aumente o erro de leitura da frequência de ressonância devido ao alargamento da curva de ressonância (Figura 7(D)). Quanto maior este amortecimento, múltiplos harmônicos podem aparecer (Figura 7 (A), (B) e (C)). Múltiplos harmônicos próximos não são desejáveis (Figura 7 (B)), pois em aplicações como biossensor no modo dinâmico, ao se adsorver um analito alvo, a frequência de ressonância se altera podendo migrar de um pico para outro próximo, causando desvios na leitura.

(A) (B)

(C) (D)

Figura 7. Resposta da frequência de ressonância para mC funcionalizados. Nota-se que com valores de fator Q mais baixos, o espectro fica ruidoso e a ponta do pico deixa de ser estreita e tornando-se arredondada, com tendência de formação de vários harmônicos e diminuindo a acuracidade da leitura.

A funcionalização do mC aumenta a espessura e normalmente atua como um amortecedor, alterando a eficiência da excitação exigindo mais energia para manter a mesma amplitude de vibração (Drive Amplitude (mV)) e geralmente altera também a frequência de ressonância. Desta forma, o fator Q é reduzido e, por conseguinte, aumenta-se o erro de leitura.

Para melhores resultados de sensibilidade em biossensores operados em

condições ambiente, são preferencialmente utilizados mC de alta frequência

((tapping®) acima de 100 KHz) com comprimento entre 90-140 mm.


Fatores como temperatura, UR%, pressão e densidade do meio afetam diretamente a energia necessária para manter a amplitude de vibração, principalmente em mC com recobrimento funcional.

Comparações dos diferentes mC e modos de funcionalização

Foram comparados a energia necessária para manter a mesma amplitude (Drive Amplitude) e fatores de qualidade de mC novos sem recobrimento e mC funcionalizados sob diferentes condições: (A) ar e pressão atmosférica de 690,7mm, 25ºC de temperatura e umidade de 50% (condições ambiente); (B) Ar sob pressão atmosférica de 690,7mm, a 25ºC e umidade de 15%; (C) Gás de Nitrogênio 5.0 sob pressão atmosférica de 690,7mm, a 25 ºC e 25 ºC e umidade de 0,001% e (D) Vapor de Nitrogênio Líquido sob pressão atmosférica de 690,7mm, a 25 ºC e -2ºC e umidade de 0,001%.

Neste experimento, três diferentes métodos de funcionalização foram testados nas seguintes condições:

1 – Funcionalização por monocamadas auto-organizadas (SAM) pela ativação com vapor de APTES, seguido de Glutaraldeído e após, imersão em solução tampão contendo a enzima alcool desidrogenase (somente ligações covalentes);

2 – Funcionalização pela ativação com vapor de APTES, seguida imersão com solução tampão 50 mM de fosfato de sódio pH 8.6 com enzima álcool desidrogenase e Glutaraldeído (2%) por 1 min, com formação de ligação covalente cruzada.

3 – Funcionalização com aplicação de 20 nm de ouro sobre a superfície do mC, seguido de ativação com solução de TIOL a 1 mM solubilizado em etanol puro por 24h, seguido de solução tampão com glutaraldeído a 2% por 1 h, solução tampão pH 8.0 com enzima álcool desidrogenase por 6 h, formação de monocamadas auto-organizadas (SAM).

Nos experimentos em que o mC foi apenas limpo em água milli-Q (Millipore Co. 18,0 MW*cm-1) e etanol puro, não ocorreram à ligação nem do glutaraldeído e nem ativação com APTES/TIOL. Este fato foi facilmente verificado após a limpeza com água para remover os reagentes não ligados, sendo que o mC continuou com a mesma frequência de ressonância e fator Q originais. A oxidação da superfície do mC é necessária para a ligação do APTES.

Caracterização da superfície funcionalizada com a enzima Álcool Desidrogenase

Por intermédio de imagens de MFA, foi possível calcular a espessura da camada funcional. Com a utilização de uma lâmina metálica afiada, com dureza inferior ao substrato para não deformar a superfície do mC, fez-se um risco sobre a superfície funcionalizada até tocar a superfície, removendo dessa forma apenas uma parte da camada funcional. A imagem foi feita sobre o degrau que se formou possibilitando estimar a espessura da camada.


Para a funcionalização obtida com ativação via imersão, observou-se uma maior rugosidade e espessura média em torno de 19,39±4,7 nm (Figura 8), demonstrando que há fortes evidências da realização de ligação cruzada no momento da ativação, este fenômeno é descrito por Acres et al. (2012) e Vashist et al. (2014).

(A)

(B)

(C)

Figura 8. Microcantilever ativadocom solução de APTES a 2 %por imersão, com espessura médiaem torno de 19,39+-4,7 nm,imagem tratada pelo softwareGwyddion 4.2, planificada combase na região sem camadafuncional (risco). Em (A), vistasuperior, em (B), vista em 3D eem (C) um perfil da topografiacom a espessura de 10 pixels.


No gráfico da Figura 8(C), está destacada em vermelho a região onde foi

efetuado o risco pela lâmina afiada. Nota-se que a região onde a funcionalização

permaneceu inalterada (interface entre as duas superfícies) salienta-se um

acúmulo de material (azul). Esse aspecto forma-se devido à lâmina repuxar parte

da camada funcional ao realizar o risco.

A imagem obtida pelo perfil da topografia da camada funcional realizada por

meio de ativação por vapor de APTES apresentou uma distribuição bem

uniforme com espessura média de 14,7±1,2 nm (Figura 9), onde se constatou

o aspecto mais próximo de uma formação em monocamadas. A espessura de

cada passo da funcionalização pode ser estimada baseada em informações

disponíveis na literatura sobre os reagentes utilizados, sendo de: Ativação com

APTES: 7 Å - glutaraldeído: 3,0 Å - Enzima Álcool Desidrogenase: 90,6 Å,

Total: 97,9 Å (ACRES et al., 2012).

(A)

(B)

(C)

Figura 9. Microcantilever ativado

com vapor de APTES, com

espessura média em torno de

14,7+-1,2 nm. Em (A), vista

superior, em (B), vista em 3D e

em (C) um perfil da topografia

com a espessura de 10 pixels.


A espessura estimada de uma monocamada (SAM) com estes reagentes é no mínimo de 9,8 nm. Experimentalmente, o processo que mais se aproximou foi a funcionalização com ativação por intermédio de vapor de APTES (14,7±1,2 nm). Esta variação na espessura se deve ao fato tanto do APTES quanto ao glutaraldeído terem a possibilidade de formação de múltiplas camadas, e também deve se levar em consideração a presença de imperfeições na superfície do microcantilever. Constatou-se também na ativação por vapor de APTES uma melhor distribuição da camada funcional, com menos espaços, boa distribuição e baixa rugosidade.

Susceptibilidade à temperatura e umidade relativa para diferentes técnicas de funcionalização

Foram comparados mC novos (sem recobrimento) com mC funcionalizados por 3 diferentes métodos e analisados sob diferentes condições: (A) ar e pressão atmosférica de 690,7 mm, 25 ºC de temperatura e umidade relativa de 50 %; (B) Ar isento sob pressão atmosférica de 690,7 mm, a 25 ºC e umidade relativa de 15 %; e (C) Nitrogênio 5.0 com pureza mínima de 99,999 % e umidade relativa < 2 ppm-mol sob pressão atmosférica de 690,7 mm, a 25 ºC e (D) Vapor de Nitrogênio Líquido a -2 ºC com pureza mínima de 99,999 % e umidade relativa < 2 ppm.

Análise dos diferentes métodos de funcionalização

A seguir, são apresentadas tabelas para cada experimento, em que se variou as condições de temperatura e umidade relativa observando-se a variação da frequência de ressonância, fator qualidade, amplitude (RMS), Drive Amplitude e a área do gráfico para cada situação.

Microcantilever NSG10 – Novo, sem recobrimento

Na Tabela 2, os parâmetros e os resultados obtidos foram resumidos para cada experimento. Na Figura 10, observa-se a variação da frequência de ressonância nas diferentes condições de UR(%) e temperatura.

O equipamento de MFA está configurado para manter a mesma amplitude (RMS) amplitude, e para tal, o Drive Amplitude (mV) que corresponde a energia necessária para excitar o mC deve variar para se obter amplitudes próximas.

Tabela 2. Microcantilever NSG10 – sem recobrimento.


Meio Temp (ºC)

UR (%)

Frequência (KHz)

Fator Q

RMS Área da Curva de Ressonância

(U.A.)

Drive Amplitude

(mV) Ambiente 25 45 190,90 303 0,50 1043,58 31,13 AR 25 15 190,93 307 0,50 1034,47 28,54 Nitrogênio 5.0 25 0,001 190,94 321 0,51 1062,49 26,86 Nitrog. Liq -2 0,001 190,99 317 0,48 1040,16 25,32

Figura 10. Resposta do mC sem revestimento às condições de: ar-ambiente com

50 % de umidade relativa, ar com 15 % de umidade relativa, gás nitrogênio 5.0

e vapor de nitrogênio líquido.

Para mC novos, sem recobrimento, notou-se que a área do gráfico permaneceu

praticamente constante nas diversas condições testadas. Observa-se que a

diminuição da umidade relativa e temperatura proporciona uma redução no

amortecimento da vibração da haste, comprovada pela diminuição da energia

necessária para manter a mesma amplitude (Drive Amplitude) o que acarretou

em um pequeno aumento na frequência de ressonância e no fator Q (Tabela 2,

Figura 10).

Microcantilever NSG10 – Funcionalizado em monocamadas auto-organizadas

(SAM) ativação em vapor de APTES.

Na Tabela 3, os parâmetros e os resultados obtidos para o biossensor

funcionalizado por meio de SAM. Na Figura 11, observa-se a variação da

frequência de ressonância para as diferentes condições de UR(%) e

temperatura.

Tabela 3. Microcantilever NSG10 – funcionalizado por monocamadas (SAM).


Meio Temp (ºC) UR (%) Frequência

(KHz)

Fator Q RMS Área da Curva

de Ressonância

(U.A.)

Drive

Amplitude

(mV)

Ambiente 25 50 214,91 90 0,5 4832,88 29,30

AR 25 15 215,69 132 0,5 2996,70 26,25

Nitrogênio 5.0 25 0,001 215,69 139 0,5 3179,01 22,58

Nitrog. Liq -2 0,001 216,10 141 0,5 3199,74 21,06

Figura 11. Resposta do mC funcionalizado em camadas auto-organizadas (SAM) às condições de: ar-ambiente com 50 % de umidade relativa, ar com 15 % de umidade relativa, gas nitrogênio 5.0 e vapor de nitrogênio líquido.

A deposição de uma camada funcional organizada (SAM) comprovou que a variação da umidade relativa e a temperatura tiveram uma menor influência no amortecimento da haste, dentre os diferentes métodos de funcionalização é o comportamento que mais se assemelhou a um mC novo. A energia necessária para excitar o mC com a mesma amplitude de um mC sem recobrimento também se manteve próxima, indicando a melhor condição possível. O comportamento do gráfico (decaimento sem ruídos) apresentou-se bem similar ao de um mC novo não funcionalizado (Tabela 3, Figura 11).

Microcantilever NSG10 – ativado por vapor de APTES e funcionalizado por Ligação Covalente Cruzada

Na Tabela 4, os parâmetros e os resultados obtidos para o biossensor funcionalizado por meio ligação covalente cruzada (mais espesso). Na Figura 12, observa-se a variação da frequência de ressonância para as diferentes condições de UR(%) e temperatura.

Tabela 4. Microcantilever NSG10- ligação covalente cruzada.


Meio Temp

(ºC)

UR (%) Frequência

(KHz)

Fator

Q

RMS Área da Curva

de Ressonância

(U.A.)

Drive

Amplitude

(mV)

Ambiente 25 50 169,40 93 0,57 3272,18 4166

AR 25 16 169,32 134 0,52 2928,03 1943

Nitrogênio

5.0 25 0,001 169,54 166 0,51 3102,41 1478

Nitrog. Liq -2 0,001 169,52 141 0,51 1298,24 2125

Figura 12. Resposta do mC funcionalizado com ligações covalentes cruzadas às

condições de: ar-ambiente com 50 % de umidade relativa, ar com 15 % de

umidade relativa, gás nitrogênio 5.0 e vapor de nitrogênio líquido.

A partir da aplicação de uma camada funcional desorganizada (mais espessa),

notou-se que a UR(%) e temperatura tiveram uma grande influência no

amortecimento da haste exigindo maior quantidade de energia do sistema para

manter a mesma amplitude de vibração. Com isso, pode-se visualizar que o

comportamento do gráfico (decaimento) apresenta oscilações próximas à base

(tende a gerar mais harmônicos), o que torna menos precisa a leitura de

frequência do mC (Tabela 4, Figura 12).

Microcantilever NSG10 – revestido com 20nm de ouro e funcionalizado por

SAM com Tiol

Na Tabela 5, os parâmetros e os resultados obtidos para o biossensor revestido

com 20nm de ouro e funcionalizado por meio de SAM. Na Figura 13, observa-se

a variação da frequência de ressonância para as diferentes condições de UR(%)

e temperatura.

Tabela 5. Microcantilever NSG10 - com recobrimento de ouro e funcionalizado

em monocamadas (SAM), ativado com Tiol.


Meio Temp

(ºC)

UR (%) Frequência

(KHz)

Fator

Q

RMS Área da Curva de

Ressonância

(U.A.)

Drive

Amplitude

(mV)

Ambiente 25 50 226,00 93 0,5 3876,88 782,80

AR 25 16 227,79 249 0,51 1945,46 376,00

Nitrogênio 5.0 25 0,001 227,94 272 0,5 1675,74 368,00

Nitrog. Liq -2 0,001 228,26 372 0,54 1706,94 673,50

Figura 13. Resposta do mC revestido de ouro e funcionalizado em camadas auto-organizadas às condições de: ar-ambiente com 50% de umidade relativa, ar com 15% de umidade relativa, gás nitrogênio 5.0 e vapor de nitrogênio líquido.

Ao depositar-se 20,0 nm de ouro pela técnica de sputtering na superfície do µC, somado à camada funcional, o efeito da UR(%) e temperatura tornaram-se ainda mais drásticos para a variação de frequência de ressonância devido à formação de um bi-metal com o aumento da espessura, constatado também pela energia exigida para excitar o mC com a mesma amplitude (Driver amplitude).

Observou-se que quanto mais espessa a camada depositada sobre o mC o AFM necessitou de mais energia para manter aproximadamente a mesma amplitude, comprovando que a deposição em monocamadas sem a deposição de ouro na superfície obteve resultados mais próximos de um mC novo, sendo assim, melhor aplicado para biossensores.

Os resultados experimentais estão de acordo com os experimentos realizados por Chen et al.(1995).

Conclusão

Ao modificar a superfície da haste do microcantilever com camadas funcionais biotativas, confeccionadas com os mesmos reagentes, mas de técnicas diferentes, obtivemos comportamentos distintos de acordo com as condições a que foram aplicados.

Microcantilevers mais longos com menores constantes de mola são mais propensos às interferências do ambiente como umidade relativa e temperatura. Os experimentos mostraram que a camada funcional com estrutura organizada em monocamadas, gera um menor amortecimento superficial fazendo com que o comportamento seja mais parecido ao da mesma haste sem revestimento,


com picos de resposta de frequência de ressonância bem definidos e com decaimento estável sem oscilações próximo à base, e sem a geração de outros harmônicos. Para os biossensores, ficou comprovado que a umidade relativa do ambiente é um fator determinante no amortecimento do microcantilever, tendo maior influência em revestimentos com maior espessura que possibilita maior adsorção. A funcionalização com deposição de ouro demonstrou que é necessário mais energia para se manter a mesma amplitude de vibração, e também tornou mais susceptível a mudanças na temperatura e umidade relativa. Quanto mais fina e organizada a camada funcional, preferencialmente sem a aplicação de camadas metálicas, a resposta melhor se assemelha a um µC novo, com pico de frequência de ressonância bem definido, alto fator Q e baixo ruído.

Agradecimentos

Este trabalho teve apoio da Embrapa Instrumentação, CNPq processo: 141267/2013-5

Ao Prof. Dr. Rubens Bernardes Filho e as técnicas Silviane Zanni Hubinger, Luis Aparecido de Godoy e Joana Bresolin pelo apoio, dedicação e atenção.

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