1

Isabela Casagrande Jeremias

Investigao das alteraes imunolgicas em camundongos submetidos ao modelo

animal de sepse por ligao e perfurao cecal (CLP) com alteraes cerebrais

Tese apresentada Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Doutora em Cincias Programa de Cincias Mdicas rea de Concentrao: Processos Inflamatrios e Alrgicos Orientador: Prof. Dr. Francisco Garcia Soriano

So Paulo

2015

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Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

reproduo autorizada pelo autor

Jeremias, Isabela Casagrande Investigao das alteraes imunolgicas em camundongos submetidos ao modelo animal de sepse por ligao e perfurao cecal (CLP) com alteraes cerebrais / Isabela Casagrande Jeremias. -- So Paulo, 2015.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Programa de Cincias Mdicas. rea de Concentrao: Processos Inflamatrios e

Alrgicos.

Orientador: Francisco Garcia Soriano. Descritores: 1.Sepse 2.Inflamao 3.Encefalopatia associada a sepse

4.Linfcitos 5.Acetilcolina

USP/FM/DBD-270/15

3

Aos meus pais, Jaka e Rosinha,

e ao meu noivo, Sandro,

pelo incentivo, amor e dedicao.

4

AGRADECIMENTOS

Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo e ao programa de

Emergencias Clnicas, por fornecerem as condies para a realizao deste trabalho, e

aos professores e funcionrios dessa instituio, por todo o suporte necessrio.

FAPESP, Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo, pelo apoio

financeiro para a realizao desse projeto.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Francisco Soriano, Chico, pela amizade, ajuda,

compreenso, sabedoria e exemplo de profissionalismo. Muitssimo obrigada pela

oportunidade e pelo aprendizado oriundo de um pesquisador admiravelmente

completo!

Um agradecimento especial a Thas e Suely por todo apoio e constante ajuda

para a realizao deste trabalho. E a todas as pessoas que participaram de alguma

forma deste trabalho.

Aos funcionrios e amigos do LIM 51: Kelli, Denise, Hermes, Gerlado, Ftima.

Aos meus amigos e colegas de laboratrio Anne, Joleen, Wermerson, Vivian,

Ricardo, Rosangla, ndre, Mariana, por deixarem os trabalhos no laboratrio muito

mais divertidos.

De maneira muito especial Vanessa pela ajuda, companheirismo, momentos

alegres e pela grande amizade formada.

Aos meus mais antigos e preciosos amigos, por se importarem, por lembrarem de

mim e por tudo que aprendi durante o tempo em que estivemos perto. Sinto saudades.

Ao meu noivo, Sandro, que ficou ao meu lado, dando apoio e fora que preciso.

Obrigada pela alegria, companheirismo, ateno, principalmente, por todo amor

dedicado.

5

minha famlia, pelo amparo, pelo carinho e dedicao.

Aos meus pais, exemplos de dedicao, pelo amor, educao, presena constante,

confiana e pelo incentivo em cada nova etapa da minha vida.

Deus, especialmente pela vida.

6

Uma mente que se abre a uma nova idia

jamais voltar a seu tamanho original

Albert Einsten

7

Esta tese est de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta

publicao:

Universidade de So Paulo. Faculdade de Medicina. Diviso de Biblioteca e

Documentao. Guia de apresentao de dissertaes, teses e monografias. Elaborado

por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana,

Marinalva de Souza Arago, Suely Campos Cardoso, Valria Vilhena. 3a ed. So Paulo:

Diviso de Biblioteca e Documentao; 2011.

Referncias: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors

(Vancouver).

Abreviaturas dos ttulos dos peridicos de acordo com List of Journals Indexed in Index

Medicus.

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SUMRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS

RESUMO

ABSTRACT

1. Introduo ..................................................................................................................... 9

2. Objetivos ..................................................................................................................... 10

2.1 Geral ...................................................................................................................... 10

2.2 Especficos ............................................................................................................ 10

3. Reviso da Literatura .................................................................................................. 12

3.1 Sepse ..................................................................................................................... 12

3.1.1 Definio ........................................................................................................ 12

3.1.2 Epidemiologia ................................................................................................ 13

3.1.3 Fisiopatologia ................................................................................................. 14

3.1.4 Resposta imunolgica .................................................................................... 16

3.1.5 Imunodepresso .............................................................................................. 18

3.1.6 Encefalopatia sptica ...................................................................................... 20

3.1.6.1 Teste comportamental SHIRPA ............................................................. 22

3.1.6.2 S100 ...................................................................................................... 22

3.1.7 Ligao e perfurao cecal ............................................................................. 24

3.2 Interaes entre sistema nervoso central e sistema imunolgico ......................... 25

3.3 Acetilcolina ........................................................................................................... 28

3.3.1 Donepezila ...................................................................................................... 29

3.3.2 VAChT ........................................................................................................... 30

4. Materiais e Mtodos ................................................................................................... 32

4.1 Animais ................................................................................................................. 32

4.2 Experimentos ........................................................................................................ 33

4.2.1 Experimento Agudo ....................................................................................... 33

4.2.2 Experimento Crnico ..................................................................................... 34

2

4.2.3 Efeito da acetilcolina na evoluo tardia da sepse ......................................... 34

4.3 Ligao e perfurao cecal.................................................................................... 35

4.4 SHIRPA ................................................................................................................ 36

4.5 ELISA ................................................................................................................... 37

4.6 Histologia e Tunel ................................................................................................. 38

4.7 Isolamento de Linfcitos....................................................................................... 39

4.8 Caracterizao dos linfcitos ................................................................................ 40

4.9 Morte celular e ciclo celular ................................................................................. 40

4.10 Anlise estatstica ............................................................................................... 41

5. Resultados ................................................................................................................... 43

5.1 Experimento Agudo .............................................................................................. 43

5.1.1 Anlise da sobrevida nas diferentes gravidades do CLP................................ 43

5.1.2 Alteraes neurolgicas nas diferentes gravidades do CLP........................... 44

5.1.3 Perfil das clulas no bao de diferentes gravidades do CLP .......................... 47

5.1.4 Perfil inflamatrio nas diferentes gravidades do CLP ................................... 50

5.2 Experimento Crnico ............................................................................................ 51

5.2.1 Alteraes neurolgicas em sobreviventes do CLP ....................................... 51

5.2.2 Perfil das clulas do bao em sobreviventes do CLP ..................................... 55

5.2.3 Perfil inflamatrio em sobreviventes do CLP ................................................ 61

5.3 Efeito da acetilcolina na evoluo tardia da sepse ................................................ 62

5.3.1 Anlise da sobrevida nos animais com donepezila e VAChT KD ................. 62

5.3.2 Alteraes neurolgicas nos animais com donepezila e VAChT KD ............ 63

5.3.3 Perfil das clulas do bao nos animais com donepezila e VAChT KD ......... 67

5.3.4 Perfil inflamatrio nos animais com donepezila e VAChT KD..................... 73

6. Discusso .................................................................................................................... 75

6.1 Experimento Agudo .............................................................................................. 75

6.2 Experimento Crnico ............................................................................................ 79

6.3 Efeito da acetilcolina na evoluo tardia da sepse ................................................ 85

7. Concluso ................................................................................................................... 90

7. Referncias ................................................................................................................. 92

3

LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Curva de sobrevida nas diferentes gravidades de CLP ................................. 43

Figura 02. SHIRPA 6 horas aps o CLP em diferentes gravidades. .............................. 45

Figura 03. Os nveis plasmticos de S100 6 horas aps o CLP ................................... 46

Figura 04. Nveis de citocinas no hipocampo 6 horas aps o CLP ................................ 46

Figura 05. Peso do bao 6 horas aps o CLP ................................................................. 47

Figura 06. Caracterizao de linfcitos no bao 6 horas aps o CLP ............................ 48

Figura 07. Correlao entre os linfcitos e o S100 6 horas aps o CLP ...................... 49

Figura 08. Nveis de citocinas no bao 6 horas aps o CLP .......................................... 50

Figura 09. Nveis de citocinas no plasma 6 horas aps o CLP ....................................... 51

Figura 10. Teste comportamental SHIRPA 6 horas aps o CLP ................................... 52

Figura 11. Teste comportamental SHIRPA 15 dias aps o CLP .................................... 53

Figura 12. Os nveis plasmticos de S100 15 dias aps o CLP .................................... 54

Figura 13. Peso do bao 15 dias aps o CLP ................................................................. 55

Figura 14. Corte histolgico do bao, 15 dias aps o CLP ............................................ 56

Figura 15. Caracterizao de linfcitos no bao 15 dias aps o CLP ............................ 57

Figura 16. Correlao entre os linfcitos e o S100 15 dias aps o CLP ...................... 58

Figura 17. Morte celular no bao 15 dias aps o CLP ................................................... 59

Figura 18. Correlao entre a morte celular e o S100 15 dias aps o CLP .................. 59

Figura 19. Ciclo celular no bao 15 dias aps o CLP .................................................... 60

Figura 20. Curva de sobrevida aps CLP no experimento com donepezila ................... 62

Figura 21. Curva de sobrevida aps CLP no experimento VAChT KD ........................ 63

Figura 22. Teste comportamental SHIRPA 6 horas aps o CLP com donepezila ......... 64

Figura 23. Teste comportamental SHIRPA 6 horas aps o CLP no VAChT KD .......... 65

Figura 24. Peso do bao 15 dias aps o CLP com donepezila ....................................... 67

Figura 25. Peso do bao 15 dias aps o CLP no VAChT KD ........................................ 67

Figura 26. Caracterizao de linfcitos no bao 15 dias aps o CLP com donepezila .. 69

Figura 27. Caracterizao de linfcitos no bao 15 dias aps o CLP no VAChT KD ... 70

Figura 28. Morte celular no bao 15 dias aps o CLP com donepezila ......................... 71

Figura 29. Morte celular no bao 15 dias aps o CLP no VAChT KD .......................... 71

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LISTA DE TABELAS

Tabela 01. Citocinas no hipocampo 15 dias aps CLP. ................................................. 54

Tabela 02. Citocinas no bao 15 dias aps CLP. ........................................................... 60

Tabela 03. Citocinas no plasma 15 dias aps CLP. ........................................................ 61

Tabela 04. Citocinas no hipocampo 15 dias aps CLP com donepezila. ....................... 66

Tabela 05. Citocinas no hipocampo 15 dias aps CLP no VAChT KD. ........................ 66

Tabela 06. Citocinas no bao 15 dias aps CLP com donepezila. ................................. 72

Tabela 07. Citocinas no bao 15 dias aps CLP no VAChT KD. .................................. 73

Tabela 08. Citocinas no plasma 15 dias aps CLP com donepezila............................... 74

Tabela 09. Citocinas no plasma 15 dias aps CLP no VAChT KD. .............................. 74

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LISTA DE ABREVIATURAS

ACh acetilcolina

AChE enzima acetilcolinesterase

BHE barreira hematoenceflica

CARS sndrome da resposta compensatria sistmica

ChAT enzima colina acetiltransferase

CHT1 transportador de colina de alta afinidade

CLP ligao e perfurao cecal

CO2 dixido de carbono

DAMP padro molecular associado ao dano

DNA cido desoxirribonucleico

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

EPM erro padro da mdia

HE hematoxilia eosina

HMGB1 protena de alta mobilidade box 1

IL interleucina

IRAK quinase associada ao receptor de IL-1

IRF3 fator 3 de regulao do interferon

LBP protena ligante de lipopolissacardeo

LPS Lipopolissacardeo

MCP protena quimiottica de moncito

MD-2 protena de diferenciao mielide-2

MIP protena inflamatria de macrfago

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mRNA RNA mensageiro

MyD88 protena citoslica ativada pelo toll

NF-kB fator de transcrio nuclear -kB

PAMP padro molecular associado ao patgeno

PI iodeto de propdeo

RNA cido ribonucleico

SHIRPA SmithKline/Harwell/ImperialCollege/RoyalHospital/Phenotype Assessment

SIRS sndrome da resposta inflamatria sistmica

SNC sistema nervoso central

SPF livres de patgenos especficos

Th1 clulas T com padro de resposta pr-inflamatria

Th2 clulas T com padro de resposta anti-inflamatria

TIRAP protena adaptadora contendo Toll-IL-1R

TLR receptor do tipo toll

TNF- fator de necrose tumoral alfa

TOLL denominao da protena de reconhecimento de LPS

TRAF protena adaptadora associada ao receptor de TNF

TRAM molcula adaptadora relacionada a TRIF

TRIF protena adaptadora contendo o domnio TIR indutora de interferon

TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling

UTI unidade de terapia intensiva

VAChT transportador vesicular de acetilcolina

VAChT KD animais knockdown para VAChT

WT wild-type

7nAChR receptores -7 nicotnicos de acetilcolina

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RESUMO Jeremias, IC: Investigao das alteraes imunolgicas em camundongos submetidos ao modelo animal de sepse por ligao e perfurao cecal (CLP) com alteraes cerebrais [tese]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2015. A sepse caracterizada por um desequilbrio entre a resposta pr- e anti-inflamatria s infeces. Um dos principais componentes da resposta do hospedeiro no choque sptico so as interaes recprocas entre o sistema imune e o sistema nervoso central, desta forma o objetivo deste estudo foi investigar o desenvolvimento de alteraes neurolgicas e sua associao com alteraes imunolgicas em fases iniciais e tardias aps a sepse por ligao e perfurao cecal (CLP). Dividimos em trs experimentos: agudo, crnico e efeito da ACh na evoluo tardia da sepse. No experimento agudo utilizamos camundongos Balb/c, induzimos sepse por CLP em diferentes gravidades (leve, moderado e grave), 6 horas aps o CLP foi realizado teste comportamental SHIRPA e logo aps os animais foram sacrificados. No experimento crnico os camundongos Balb/c foram submetidos ao CLP leve, o SHIRPA foi realizado 6 horas e 15 dias aps o CLP e os animais foram sacrificados 15 dias aps o CLP. No experimento dos efeitos da ACh utilizamos camundongos Balb/c que receberam a droga donepezila (5 mg/kg/dia, oralmente) sete dias antes do CLP leve at o dia do sacrifcio e os camundongos homozigotos mutantes VAChT KD tambm submetidos ao CLP leve. O teste comportamental SHIRPA foi realizado 6 horas aps o CLP e os animais sacrficos 15 dias aps o CLP. O plasma, o bao e o hipocampo foram removidos em todos os experimentos. Os nveis do S100 foram medidos no plasma. Os baos foram pesados, e por citometria de fluxo foi caracterizado os linfcitos (linfcitos T citotxicos, linfcitos T auxiliares, linfcitos B, clulas T reguladoras e clulas Th17) e morte celular (Apoptose inicial, necrose e apoptose tardia). Os nveis de citocinas no bao, hipocampo e plasma foram determinados por ELISA. Nossos resultados mostram que no experimento agudo, 6 horas aps o CLP a encefalopatia diferente dependendo da gravidade da sepse, e o perfil de linfcitos no bao no alterado por nenhuma gravidade da sepse. No entanto, a ativao de clulas do bao foi indicada no nosso estudo por variaes na quantidade de citocinas no bao. No experimento crnico observamos que 15 dias aps o CLP os animais apresentam encefalopatia sptica, e esta est correlacionada com a diferenciao e morte celular de linfcitos do bao, o que leva a um alto perfil imunossupressor. No experimento da ACh mostramos que a estimulao da transmisso colinrgica, utilizando donepezila, diminui a inflamao, por aumentar linfcitos, morte linfocitria e diminuir citocinas pr-inflamatria. E, ao contrrio, a diminuio da transmisso colinrgica, experimento VAChT KD, observou-se uma diminuio de linfcitos, sem morte celular e aumento da inflamao. Desta forma, conclumos que a alterao neurolgica nos animais com sepse est associada com as alteraes imunolgicas tardias e que a ACh tem um importante papel no perfil imunolgico 15 dias aps o CLP. Descritores: sepse; inflamao; encefalopatia associada sepse; linfcitos; acetilcolina

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ABSTRACT Jeremias, IC: Investigation of changes immunological in mice submitted to model animal of sepsis by cecal ligature and puncture (CLP) with brain injure [thesis]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2015. Sepsis is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses to infection. One of the main components of the host response in septic shock are the reciprocal interactions between the immune system and the central nervous system, so the aim of this study was to investigate the development of neurological disorders and their association with immunological changes in early and late stages after sepsis by cecal ligation and puncture (CLP). We divided in three experiments: acute, chronic and chronic ACh. In acute experiment we use Balb/c mice, induce sepsis by CLP in different severities (mild, moderate and severe), 6 hours after CLP was conducted behavioral test SHIRPA and after the animals were sacrificed. In the chronic experiment Balb/c mice were subjected to CLP mild, the SHIRPA was performed 6 hours and 15 days after CLP, and animals were sacrificed 15 days after CLP. In chronic ACh experiment use Balb/c mice that received the drug Donepezil (5 mg/kg/day, orally) seven days before the CLP mild until the day of sacrifice and use too mice homozygous mutants KD VAChT also submitted to CLP mild. The SHIRPA behavioral test was performed 6 hours after CLP and the animals were sacrificed 15 days after CLP. The plasma, spleen and hippocampus were removed in all experiments. The levels of S100 were measured in plasma. The spleens were weighed, and flow cytometry was characterized lymphocytes (cytotoxic T lymphocytes, helper T lymphocytes, B lymphocytes, regulatory T cells and Th17 cells) and cell death (apoptosis initial, necrosis and DNA fragmentation). Cytokine levels in the spleen, hippocampus and plasma were determined by ELISA. Our results show that in the acute experiment, 6 hours after CLP encephalopathy is different depending on the severity of sepsis, since the profile of the spleen lymphocytes is not changed by any severity of sepsis. However, the spleen cell activation was shown in this study by variations in the quantity of cytokines in the spleen. In the chronic experiment we observed that 15 days after CLP animals have septic encephalopathy, and this correlates with cell differentiation and the death of spleen lymphocytes, which leads to a high immunosuppressive profile. Since in the chronic ACh experiment have shown that stimulation of cholinergic transmission, using donepezil, reduces inflammation by increasing lymphocytes, lymphocyte death and decreasing proinflammatory cytokine. And, conversely, the reduction in cholinergic transmission, KD VAChT experiment, we observed a decrease of lymphocytes, and increase cell death without inflammation. Thus, we conclude that the neurological deficits in animals with sepsis is associated with immunological late changes and ACh plays an important role in the immune profile 15 days after CLP. Descriptors: sepsis; inflammation; sepsis-associated encephalopathy; lymphocytes; acetylcholine

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1. Introduo

Sepse a principal causa de morte de pacientes em unidades de terapia intensiva e

causada pela ativao imune inadequada devido a bactrias e componentes bacterianos

liberados. Assim, a sepse caracterizada por um desequilbrio entre a resposta pr- e

anti-inflamatria s infeces. Quando a cascata da sepse acionada, uma resposta

sistmica desregulada ocorre, podendo progredir para insuficincia de mltiplos rgos

que inclui a encefalopatia sptica. A encefalopatia sptica uma complicao comum,

mas pouco compreendida, afetando 8-70% de pacientes spticos. Ela pode ser definida

como um distrbio cerebral resultante de sinalizao celular e metablica mediada por

componentes inflamatrios.

Os avanos recentes na compreenso da biologia de toxicidade de citocinas

levaram descoberta da "via anti-inflamatria colinrgica", que envolve a comunicao

bidirecional entre o crebro e o sistema imunolgico. A ativao desta via, quer por

estimulao eltrica do nervo vago ou atravs de abordagens farmacolgicas, foi

mostrado para melhorar significativamente patologias induzidas por modelos de

doenas mediadas por citocinas, incluindo a endotoxemia e sepse. Esta via

funcionalmente ligado ao bao atravs do ramo celaca comum do nervo vago e a

estimulao do nervo vago atenua a inflamao sistmica e protetor contra a sepse.

Sabendo que as interaes recprocas entre o sistema imune e o sistema nervoso

central so consideradas um dos principais componentes da resposta do hospedeiro no

choque sptico, a hiptese principal deste estudo que as alteraes cerebrais

decorrentes da sepse induziro disfuno do sistema imunolgico.

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2. Objetivos

2.1 Geral

Investigar o desenvolvimento de alteraes neurolgicas e sua associao com

alteraes imunolgicas em fases iniciais e tardias aps a sepse por ligao e perfurao

cecal (CLP).

2.2 Especficos

Avaliar as alteraes neurolgicas em fases iniciais e tardias aps a sepse.

Estratgia: Pela anlise do teste comportamental SHIRPA, os nveis plasmticos

de S100 e as citocinas no hipocampo, caracterizamos as alteraes neurolgicas.

Avaliar a alterao do perfil das clulas do bao em fases iniciais e tardias aps a

sepse:

Tamanho e peso do bao;

O perfil das populaes de linfcitos: T CD4, CD8, Treg, T17 e linfcitos B;

O perfil de citocinas no bao;

Estratgia: Atravs de anlise por citometria de fluxo caracterizamos e

quantificamos as diversas linhagens de linfcitos. E por ELISA quantificamos as

diversas citocinas no bao.

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Avaliar se a alterao no perfil das clulas imunolgicas do bao decorre de:

Apoptose;

Necrose;

Estratgia: Atravs de anlise por citometria de fluxo utilizamos marcadores que

nos indicaram a presena de apoptose ou necrose celular.

Avaliar o perfil inflamatrio sistmico em fases iniciais e tardias aps a sepse.

Estratgia: Atravs de anlise por Milliplex verificamos o perfil de diversas

citocinas no plasma.

Avaliar o efeito da acetilcolina no desenvolvimento de alteraes imunolgicas e sua

associao com danos cerebrais em fase tardia aps a sepse.

Estratgia: Atravs da utilizao de um inibidor da acetilcolinesterase e animais

homozigotos mutantes VAChT KD verificamos as alteraes imunolgicas atravs do

teste comportamental SHIRPA e perfil imunolgico atravs do perfil das clulas do

bao e as citocinas.

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3. Reviso da Literatura

3.1 Sepse

3.1.1 Definio

Na reunio de consenso da American College of Chest Physicians e da Society of

Critical Care Medicine, em 1991, a sepse foi definida como a sndrome da resposta

inflamatria sistmica (SIRS) associada a um quadro infeccioso (Bone et al., 1992).

A sepse caracterizada pelo desenvolvimento de alteraes clnicas,

hematolgicas, bioqumicas e imunolgicas associadas infeco, e quando complicada

pela disfuno orgnica denominada sepse grave. O choque sptico se refere a um

estado de falncia circulatria aguda com hipotenso arterial apesar da reposio

volmica, fazendo-se necessrio a terapia vasopressora para manuteno de uma

presso arterial a valores aceitveis (Vincent e Korhut, 2008; Barbeiro et al., 2011;

Lorigados et al., 2011; Melo et al., 2011).

Na sepse, a desregulao dos mecanismos imunolgicos pode resultar em uma

perda de controle da inflamao. A fase precoce da sepse caracterizada pela excessiva

ativao, no hospedeiro, da produo de mediadores inflamatrios aps o sistema de

reconhecimento de patgenos ser ativado. A excessiva produo de radicais livres e

enzimas causam danos teciduais em grande escala, leva a uma desregulao de vrios

sistemas do corpo. Atualmente, h evidncias de que a sepse uma condio que afeta

no s o sistema imunolgico, mas tambm outros sistemas biolgicos (Rittirsch et al.,

2008).

13

Por isso, a sepse uma enfermidade extremamente complexa, pelo desequilbrio

entre a resposta pr e anti-inflamatria induzindo ao longo do tempo uma falncia

mltipla de rgos, sendo uma causa importante de morbidade e mortalidade em todo o

mundo (Hotchkiss e Karl, 2003; Vandijck et al., 2006).

3.1.2 Epidemiologia

Nos Estados Unidos, dados de mortalidade indicam que a sepse est entre as 10

causas mais comuns de morte (Kung et al., 2008) indicando que ocorrem

aproximadamente 751.000 casos de sepse por ano (Remick, 2007) e se relata que o

choque sptico a causa de 6-15% das internaes em unidades de terapia intensiva

(UTI) (Antonelli et al., 2007). A taxa de mortalidade anual de 32,2% para sepse grave

e 54,1% para choque sptico (Vincent e Abraham, 2006), sendo que os ndices

aumentam continuamente nos pacientes de maior idade (Martin et al., 2003), isso ocorre

devido tendncia epidemiolgica nessa faixa etria onde h um aumento de pacientes

cronicamente doentes (O'brien et al., 2007).

No Brasil, atravs de estudos do Brazilian Sepsis Epidemiologic Study (BASES)

analisou por 8 meses os dados fornecidos por 5 hospitais dos estados de So Paulo e

Santa Catarina e mostrou que cerca de 25% dos pacientes internados nas UTIs

apresentaram diagnsticos de sepse grave e choque sptico, com uma mortalidade de

34,7% para sepse, 47,3% para sepse grave e 52,2% para choque sptico (Silva et al.,

2004). Outro estudo analisou em diferentes UTIs que a mortalidade por sepse foi de

16,7%, para sepse grave, 34,4% e para choque sptico, 65,3% (Sales e Andrade, 2006).

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A taxa de mortalidade em outro estudo foi de 21,4% para sepse, 30,9% para sepse grave

e 47,7% para choque sptico (Fernandes, 2008).

O Instituto Latino Americano de Sepse em sua campanha sobrevivendo a sepse

(Surviving Sepsis Campaign) apresentou em dezembro de 2014, no seu relatrio

trimestral, dados gerais de mortalidade de pacientes spticos no Brasil e no mundo. No

Brasil, a mortalidade de pacientes com sepse grave de 31,6% e no mundo 23,9%. No

entanto, pacientes com choque sptico no Brasil a mortalidade chega a 64,2% enquanto

no mundo de 37,4% (ILAS, 2014). Os dados mundiais so referentes a 2010 (Levy et

al., 2010).

Sepse e choque sptico representam a causa mais importante de morte em UTIs de

adultos, superando as doenas cardiovasculares (Nguyen et al., 2006). A grande

incidncia, associada gravidade da sepse seria por si s o suficiente para justificar o

aprofundamento no conhecimento de sua fisiopatologia e a tentativa de novas

possibilidades teraputicas.

3.1.3 Fisiopatologia

A maior causa de infeco na sepse por bactrias Gram positivas e Gram

negativas, mas a resposta inflamatria do hospedeiro tambm pode ser desencadeada

por fungos e vrus (Nduka e Parrillo, 2009). Sessenta por cento dos casos ocorre pela

invaso de bactrias Gram negativas e quarenta por cento so decorrentes de bactrias

Gram positivas (Angus et al., 2001a; Alberti et al., 2003; Hanna, 2003).

15

O lipopolissacardeo (LPS) e as exotoxinas so liberados normalmente durante a

replicao da bactria e/ou como consequncia de sua morte, devido lise da parede

celular. Diversos receptores foram encontrados nos ltimos anos, capazes de reconhecer

essas molculas e ativar assim, a resposta imune inata (Triantafilou e Triantafilou,

2002). Eles so reconhecidos por receptores encontrados em clulas do sistema imune

inato como neutrfilos polimorfonucleares, macrfagos e clulas dendrticas. Um dos

maiores avanos no entendimento do reconhecimento microbiano pelo sistema imune

inato tem sido a identificao de receptores do tipo Toll (TLRs), que agem como

sensores de alvos moleculares associados a patgenos, reconhecendo e disparando a

resposta do hospedeiro (Janeway e Medzhitov, 2002; Creagh e O'Neill, 2006; Opitz et

al., 2009).

A ativao dos macrfagos pelo LPS se d atravs da ligao protena ligante de

LPS (LBP) e interage com o CD-14 (protena da superfcie externa da membrana celular

de moncitos que facilita a ativao celular induzida pelo LPS). (Zhang e Morrison,

1993; Benjamini et al., 2002). O CD-14 em conjunto com a protena de diferenciao

mielide-2 (MD-2) uma pequena molcula sem regio transmembrana, participam da

apresentao de LPS para o receptor similar ao Toll e em 1998, Poltorak e

colaboradores, mostraram que a sinalizao pelo LPS transmitida pelo receptor Toll-

like-4 (TLR-4) o primeiro membro da famlia a ser caracterizado em mamferos

(Poltorak et al., 1998).

TLR-4 capaz de ativar vias de sinalizao distintas que envolvem diferentes

cofatores e molculas adaptadoras intermediando diversas respostas imunes. Uma das

vias de sinalizao a via de sinalizao TLR dependente de MyD88 (protena

citoslica ativada pelo toll) que ativada pela ligao direta do domnio TIR

citoplasmtico com a protena adaptadora contendo o domnio TIR (TIRAP), que

16

recruta a molcula adaptadora MyD88 e de quinases associadas ao receptor de IL-1

(IRAK). Aps autofosforilao das IRAK, a protena adaptadora associada ao receptor

de TNF (TRAF6) interage com complexos de protenas, ativando o complexo IkB-

quinase (IKK) e por fim, ativando o fator de transcrio nuclear kappa B (NF-kB)

(Kawai e Akira, 2006).

A outra via de sinalizao, a via de sinalizao independente de MyD88

envolve a protena adaptadora contendo domnio TIR indutora de interferon (TRIF)

ou a molcula adaptadora relacionada a TRIF (TRAM), que levam fosforilao do

fator 3 de regulao do interferon (IRF3), induzindo produo de interferon e molculas

co-estimulatrias (Medzhitov, 2001; Kawai e Akira, 2006; ONeill e Bowie, 2007).

Uma vez que os patgenos so identificados pelas clulas dendrticas cuja

funo apresentar antgeno aos linfcitos disparada a resposta imune adaptativa,

com consequente liberao de citocinas, resultando em uma sequncia de eventos

bioqumicos e clnicos (Hanna, 2003; Weighardt e Holzmann, 2007; Matsuda et al.,

2012).

3.1.4 Resposta imunolgica

A resposta imunolgica realizada pela sucesso dos mecanismos inatos e

adaptativos, ou seja, nas fases iniciais da infeco h um predomnio das respostas

inatas e nas fases mais tardias os linfcitos passam a gerar respostas imunolgicas

adaptativas (Kourilsky e Truffa-Bachi, 2001).

17

As clulas do sistema imune inato, as quais incluem moncitos, macrfagos e

neutrfilos compe a primeira linha de resposta infeco e leso (Wang e Deng,

2008). A imunidade inata resultante de um sistema inespecfico de defesa imunolgico

encontrado em organismos multicelulares. Durante a infeco, a imunidade inata faz o

reconhecimento de padres moleculares associados ao patgeno (PAMPs), tais como

LPS, peptideoglicano, RNA (cido ribonucleico) de fita dupla; ou padres moleculares

associados ao dano (DAMPs), tais como protena do choque trmico, cido rico,

anexinas, e HMGB1, usando receptores de reconhecimento como os TLR-2, TLR-4 e

TLR-9 (Brightbill et al., 1999; Wang et al., 1999; Li et al., 2003).

A sinalizao TLR pode induzir a produo de citocinas pr-inflamatrias e

aumento da expresso de molculas coestimuladoras, as quais so ativadas no apenas

pela imunidade inata, como tambm pela imunidade adquirida (Kaisho e Akira, 2002).

As clulas da imunidade inata infiltram nos tecidos infectados e liberam diversas

citocinas, como Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-), interleucina-1 (IL-1), IL-6, IL-

12 e quimiocinas como IL-8, protena inflamatria de macrfagos (MIP-1s e MIP-2) e

protena quimiottica de moncitos (MCP-1) (Baggiolini e Loetscher, 2000; Luster et

al., 2005; Wang e Deng, 2008). Em resposta a infeco ou dano causado pelos

microrganismos, o sistema imune inato responde imediatamente ao estmulo,

removendo os patgenos invasores e, aps sua eliminao, ocorre uma regresso do

quadro inflamatrio retornando a homeostase imunolgica. Os patgenos ou

mediadores pr-inflamatrios endgenos podem extravasar para a corrente sangunea,

ocasionando a sepse (Wang e Deng, 2008).

A principal diferena entre a resposta imunolgica inata e adaptativa que a

resposta adaptativa altamente especfica e desenvolve memria contra o germe

agressor. A expanso clonal dos linfcitos em resposta a um agente infeccioso

18

absolutamente necessria para gerao de uma resposta imunolgica eficiente. O

desenvolvimento de clones diferenciados em clulas efetoras leva de 3 a 5 dias. Os

linfcitos memorizam a estrutura do agente agressor e passam a responder mais

rpida e eficientemente no caso de haver uma reinfeco pelo mesmo patgeno

(Kourilsky e Truffa-Bachi, 2001).

Desta forma, a imunidade adquirida mediada por linfcitos T e B, tem alta

especificidade para microrganismos atravs da combinao dos receptores com

molculas dos patgenos. Alm disso, capaz de ativar fatores de transcrio e de

promover secreo de citocinas pr-inflamatrias junto s clulas T, alm de aumentar a

sntese de citocinas anti-inflamatrias (IL-4, IL-10, IL-13), modular a expresso de

receptores de citocinas e liberar receptores solveis e antagonistas, bem como atuar

sobre o sistema imune inato (Sikora et al., 2001; Faix, 2013). Contudo, este perodo de

tempo para desenvolver a resposta adaptativa bastante longo, e suficiente para que as

bactrias produzam graves danos ou a morte do hospedeiro, desta forma necessrio

um mecanismo de ao rpida, ou melhor, de ao imediata. Os mecanismos efetores da

imunidade inata so ativados imediatamente aps a invaso e tem papel importante na

defesa do hospedeiro, durante os estgios iniciais da infeco (Sikora et al., 2001).

3.1.5 Imunodepresso

A literatura tem discutido se a sepse caracterizada por curto perodo da SIRS e

seguido por um sustentado perodo de imunossupresso e resposta anti-inflamatria.

Roger Bone, em 1997, deu o nome de CARS (sindrome da resposta compensatria

19

sistmica) a essa resposta anti-inflamatria, a qual ele interpretou como uma tentativa

do organismo de contra-regular a SIRS, podendo, em determinados casos, se tornar

prevalente e ocasionar fenmenos de imunodepresso nos pacientes que apresentam

esse quadro, como por exemplo, respostas de hipersensibilidade alteradas e maiores

riscos de infeces secundrias e por germes oportunistas (Bone et al., 1997; Oberholzer

et al., 2002; Moine e Abraham, 2004)

A CARS caracterizada por defeito na apresentao de antgeno, paralisia de

macrfagos, anergia de clulas T, supresso de proliferao de clulas T, diminuio da

proliferao de clulas Th1 e aumento de apoptose das clulas B e T (da Silva e

Velasco, 2007).

A contribuio da apoptose na gnese da SIRS e da CARS tem sido muito

debatida. De modo geral, a apoptose das clulas efetoras do sistema imune, como

linfcitos e clulas dendrticas, um evento importante para a evoluo do quadro

sptico e tem sido muito estudada (Wolfrd et al., 2000; Kumar et al., 2001; Wu et al.,

2001). A eliminao de um grande nmero de clulas do sistema imune compromete a

defesa efetiva do hospedeiro. A apoptose na sepse foi alvo de estudos, demonstrando

que a preveno dos eventos apoptticos aumenta a sobrevida de maneira relevante em

modelos animais de sepse, uma vez que o aumento de apoptose, predominantemente em

rgos linfides, tem sido correlacionado ao surgimento da sndrome de disfuno de

mltiplos rgos (Rudinsky et al., 2000; Ver Elst et al., 2000; Tavernier et al., 2001;

Stromme et al., 2001; Saadeddin et al., 2002).

20

3.1.6 Encefalopatia sptica

Com a potencializao da inflamao causada pela ativao sistmica de

receptores TLR-4, caracterstico da falncia mltipla de rgos em modelo animal de

sepse, o crebro pode ser um dos primeiros rgos a serem afetados associados alta

morbidade e mortalidade. Este rgo imunologicamente ativo e influenciado por

reaes inflamatrias sistmicas e respostas, tais como as que resultem de doenas

sistmicas e sepse (Elenkov et al., 2005; Iacobone et al., 2009).

A fisiopatologia da disfuno do sistema nervoso central (SNC) decorrente da

sepse tem sido pouco estudada apesar da sua importncia na evoluo clnica dos

pacientes. A encefalopatia sptica considerada uma disfuno cerebral devido sepse

podendo ocorrer em 8-70% dos pacientes spticos, dependendo dos critrios clnicos

empregados (Sprung et al., 1990; Young et al., 1990), sendo a encefalopatia mais

comum nas UTIs (Bleck et al., 1993). O conceito de encefalopatia sptica como uma

entidade que no possa ser explicada pela disfuno, hipotenso, ou pela hipxia

heptica ou renal, relativamente nova, porm est claro que a sepse e suas reaes

podem ser associadas a um largo espectro de danos e disfunes cerebrais

(Papadopoulos et al., 2000).

Diversos fatores de risco tm sido descritos para a ocorrncia de encefalopatia

sptica e podem ser categorizados como: a) condio pr-existente do paciente (como p.

ex. idade, histria de depresso, doena heptica, doena renal); b) condio aguda do

paciente (como p.ex. overdose de drogas, febre) e c) fatores iatrognicos ou ambientais

(como p.ex. uso de sedativos, alimentao enteral, cateter venoso central) (Ebersoldt et

al., 2007). Em casos fatais, tm-se demonstrado proliferao de astrcitos e microglia

21

no crtex, infartos cerebrais, prpura cerebral, mltiplas hemorragias pequenas na

substncia branca e disseminao de microabsessos (Jackson et al., 1985). Nos

sobreviventes se tem demonstrado reduo do fluxo sanguneo cerebral, disfuno da

barreira hematoenceflica (BHE) e alterao de neurotransmissores (Bowton et al.,

1989; Descamps et al., 2003).

Alm destas manifestaes neurolgicas agudas observadas em pacientes

criticamente enfermos, demonstra-se que sobreviventes da terapia intensiva, incluindo

pacientes spticos, apresentam disfunes cognitivas de longo prazo (Angus et al.,

2001a; Hough e Curtis, 2005; Winters et al., 2010). O dano cognitivo em longo prazo

vem sendo relatado como uma sequela de sepse (Gunther et al., 2012; Semmler et al.,

2013). Estudos mostraram que a prevalncia de dano cognitivo moderado a grave

10,6% maior em pacientes sobreviventes de sepse grave (Iwashyna et al., 2010).

Semmler e colaboradores (2007) demonstraram em animais sobreviventes de sepse

perda neuronal no hipocampo e sub-regies do crtex pr-frontal e inervao

colinrgica reduzida de reas corticais, resultando em relevantes consequncias

funcionais, tais como, a perda de memria, uma alterao semelhante ao observado em

pacientes com doena de Alzheimer. Assim como para a encefalopatia, os mecanismos

associados a estas alteraes no so bem entendidos, mas podem incluir inflamao,

estresse oxidativo e disfuno energtica cerebral (Messaris et al., 2004).

22

3.1.6.1 Teste comportamental SHIRPA

O protocolo semi-quantitativo SHIRPA (SmithKline/ Harwell/ ImperialCollege/

RoyalHospital/ Phenotype Assessment) representa ferramenta desenvolvida no final da

dcada de 90 por importantes centros de pesquisa britnicos associados a uma

companhia farmacutica e inclui 40 diferentes testes em 3 classes amplas (estgios) de

rastreamento de funes neurolgicas bsicas, com diferentes graus de complexidade e

especializao. Apesar de bastante rica e ampla na abordagem das diferentes

modalidades do exame neurolgico, o protocolo SHIRPA ferramenta qualitativa e

baseada em gradaes por escores, o que torna o significado real de cada teste aplicado

examinador-dependente e passvel apenas de comparao com outros animais para

validao (Rogers et al., 1997; Rogers et al., 2001; Hatcher et al., 2001; Masuya et al.,

2005; Pinto et al., 2013).

Estudos utilizando o modelo experimental de sepse por ligao e perfurao cecal

(CLP) vem utilizando o teste comportamental SHIRPA para a avaliao do estado

neurolgico destes animais (Comim et al., 2011a; Chavan et al., 2012).

3.1.6.2 S100

A busca de marcadores perifricos gerais e especficos de leso cerebral tem

aumentado ao longo dos ltimos 10 anos. Um destes marcadores o S100, que uma

23

protena de ligao de clcio, expressa predominantemente por astrcitos no crebro dos

vertebrados (Donato, 2001).

A famlia das protenas S100 modula uma variedade de funes intracelulares,

incluindo homeostase do clcio, organizao citoesqueltica, progresso do ciclo

celular, crescimento e diferenciao celular (Donato, 2001; Heizmann et al., 2002).

Apesar de suas funes intracelulares, a liberao das S100s acontecem a partir de

diferentes tipos celulares durante processos inflamatrios, podendo ser utilizadas como

marcadores de atividade na doena (Frosch et al., 2000; Foell e Roth, 2004), sendo a

S100 associada a inflamao no SNC (Foell et al., 2007). Estes eventos celulares so

importantes na progresso da neurodegenerao (Tan et al., 2009). A resposta inata da

glia ao dano, patgeno ou estimulo de ativao de maneira geral conduziria a desfeschos

benficos, como a fagocitose ou produo de fatores de reparao ou proteo. No

entanto, quando a ao da microglia mantida gera superproduo de mediadores pr-

inflamatrios alterando a homeostase, o que resulta em progresso da doena

exacerbando a influncia de fatores que interferem na disfuno neuronal e na

progresso da neuropatologia (Lue et al., 2001; van Eldik et al., 2007; Fang et al.,

2010).

Nveis elevados de S100 refletem com preciso a presena de condies

neuropatolgicas incluindo leses traumticas na cabea (Biberthaler et al., 2006; Blyth

et al., 2009; Ruan et al., 2009), transtornos psiquitricos (Rothermundt et al., 2004;

Andreazza et al., 2007), insultos vasculares cerebrais (Missler et al., 1997) e doenas

neurodegenerativas (Griffin et al., 1989; Peskind et al., 2001; Netto et al., 2006),

enquanto que os nveis normais excluem de forma confivel a maioria das patologia do

SNC (Ingebrigtsen et al., 1999; Biberthaler et al., 2001; Biberthaler et al. 2006). O

24

aumento da S100 tem associao direta com a alta mortalidade e um preditor

independente de sobrevida na terapia intensiva (Iacobone et al., 2009).

3.1.7 Ligao e perfurao cecal

Estudos de sepse em humanos so difceis devido severidade da doena, a

necessidade de intervenes teraputicas imediatas e a heterogeneidade dos pacientes.

Vrios modelos experimentais tm sido desenvolvidos para os estudos dos aspectos

fisiopatolgicos e das consequncias sistmicas da sepse, assim como para a

investigao de agentes potencialmente teraputicos e seus mecanismos de ao. Para

esta proposta, deve-se utilizar um modelo animal que reproduza a vasodilatao,

hipotenso, aumento no dbito cardaco, resposta ao tratamento e mortalidade vistos em

pacientes spticos. Utiliza-se para tal finalidade o modelo de sepse abdominal, sepse

cutnea, sepse induzida pela administrao de LPS ou TNF. Porm os modelos que

induzem peritonite so mais amplamente utilizados. A peritonite pode ser induzida por

inoculao direta de bactrias ou contedo fecal na cavidade peritoneal e, entretanto o

modelo mais aceito na literatura, e que parece simular mais adequadamente o quadro

clnico de sepse chamado de CLP (Deitch, 2005; Hubbard et al., 2005; Rocha et al.,

2006; Rittirsch et al., 2007).

A CLP baseia-se na ligao do ceco logo abaixo da vlvula leo cecal, perfurao

do ceco com tamanho padronizado e liberao do contedo fecal para a cavidade

peritoneal, conforme classicamente descrito por Wichterman e colaboradores

(Wichterman et al., 1980). Desta maneira alm da peritonite se induz isquemia

25

mesentrica simulando as grandes sndromes clnicas de sepse abdominal (p. ex.

apendicite, isquemia mesentrica) (Hollenberg et al., 2001).

Representa vantagens como relativa simplicidade, reprodutibilidade e

possibilidade de controlar o grau de contaminao bacteriana na cavidade peritoneal, e

consequentemente, a mortalidade, pela mudana do tamanho da agulha e/ou nmero de

perfuraes realizadas no ceco. Em contrapartida, variabilidades na mortalidade podem

ser encontradas, mesmo quando protocolos iguais so usados, devido a fatores aos

quais, na maioria das vezes, no so considerados como, por exemplo, diferenas no

tamanho da inciso na pele e msculo, no comprimento ligado do ceco e volume de

contedo fecal extravasado para a cavidade peritoneal (Deitch, 2005; Hubbard et al.,

2005; Rocha et al., 2006; Rittirsch et al., 2007). Por isso, a padronizao do

procedimento de induo de sepse polimicrobiana por CLP tem relevante importncia

na consistncia e reprodutibilidade dos resultados.

3.2 Interaes entre sistema nervoso central e sistema imunolgico

A ideia da existncia de interaes entre os sistemas nervoso e imune

extremamente antiga. Aristteles, afirmava que a psique (alma) e o corpo reagiam

complementarmente um com o outro; para ele, uma mudana no estado da psique

produzia uma mudana na estrutura do corpo e, inversamente, uma mudana na

estrutura do corpo produzia uma mudana na estrutura da psique (Conti, 2000;

Besedovsky e Del Rey, 2007).

26

Blalock (1984) props que o sistema imune, alm da sua funo na defesa do

organismo, teria uma funo de rgo sensorial que serviria para detectar estmulos que

no poderiam ser ouvidos, vistos, cheirados, degustados ou sentidos. Ele sugeriu que o

sistema imune poderia funcionar como um Sexto Sentido capaz de detectar e levar o

organismo a responder a substncias estranhas tais como patgenos, tumores, alrgenos.

Por ter grande sensibilidade e especificidade sabe-se hoje que esse rgo sensorial

mobiliza o corpo a responder prontamente a esses desafios; esta capacidade sensorial

tem seu fundamento nas bases moleculares propostas para a anlise das interaes entre

os sistemas imune e neuroendcrino uma vez que os leuccitos individualmente no

esto diretamente conectados ao SNC (Blalock, 2005).

Estudos realizados pelo grupo de Tracey e colaboradores contriburam

enormemente para o conhecimento nessa rea (Rangwala et al., 1997; Tracey, 2002;

Wang et al., 2004; Pavlov et al., 2006; Tracey, 2007; Sloan et al., 2007; Rosas-Ballina e

Tracey, 2009; Tracey, 2009; Huston e Tracey, 2011). Descreveram inicialmente que a

ativao do nervo vago (eltrica ou com uso de agonistas colinrgicos) reduz a resposta

inflamatria em modelos experimentais de sepse; em trabalhos subsequentes, esse grupo

cunhou a teoria do Reflexo Inflamatrio. Como todo arco reflexo mediado pelo

sistema nervoso, composto por uma via de informao aferente, reas de integrao no

SNC e uma efetora eferente. De forma breve, verificou-se que mediadores inflamatrios

(citocinas) produzidos em tecidos perifricos notificam o SNC da presena de

inflamao no organismo, por ao direta em reas centrais ou por estimulao de

aferncias do nervo vago; nas reas centrais ocorre a integrao dos sinais e

desencadeamento da resposta inflamatria global, incluindo a ativao da via eferente

do parassimptico, mediado em especial, pelo nervo vago; o nervo vago, cujo

neurotransmissor acetilcolina (ACh) (via colinrgica), inerva vrios componentes ou

27

rgos do sistema imunolgico (sistema retculo endotelial), como linfonodos, fgado e

bao; a ativao do vago leva a reduo da produo de citocinas pelo bao de forma

significativa, e como consequncia uma reduo intensa da resposta inflamatria (em

modelos de inflamao sptica e assptica). No reflexo inflamatrio, o vago o

elemento mais importante no brao eferente.

No entanto, pouco se sabe sobre a regulao do crebro por vias eferentes do vago

baseada nos nervosos colinrgicos anti-inflamatrios. Os componentes anatmicos desta

via incluem os neurnios pr-ganglionares originrios do ncleo motor dorsal dos

neurnios vago e ps-ganglionares localizados nos gnglios do plexo mesentrico

celaco superior, que projeta para o bao atravs do nervo esplnico (Rosas-Ballina et

al., 2008).

Estudos em animais indicam que o neurotransmissor liberado pelo nervo vago, a

ACh, capaz de inibir a produo de citocinas pelos macrfagos localizados no bao,

ligando-se aos receptores do tipo nicotnico, mais especificamente, receptores -7

nicotnicos de ACh (7nAChR) (Pavlov et al., 2009; Olofsson et al., 2012).

Ainda que ambos os receptores para ACh, nicotnicos e muscarnicos, sejam

encontrados nos macrfagos, somente os 7nAChR exercem funo relevante na via

anti-inflamatria colinrgica (Wang et al., 2003; Pavlov et al., 2006; Bencherif et al.,

2011). Pesquisas com camundongos knockout para o 7nAChR mostraram claramente,

in vivo, o importante papel dessa subunidade na via anti-inflamatria colinrgica: esses

animais so mais sensveis a estmulos inflamatrios porque liberam maiores

quantidades de TNF-, IL-1, IL-6 no sangue quando comparados com animais

selvagens; no se observa significativa reduo da produo de citocinas no bao e no

fgado (TNF-, IL-1, IL-6, IL-8, e HMGB1) por meio da estimulao eltrica do nervo

vago; macrfagos peritoniais isolados desses animais no respondem ACh nem

28

nicotina, e quando estimulados, continuam a produzir TNF- mesmo na presena desses

ligantes (Wang et al., 2004; Rosas-Ballina et al., 2008).

3.3 Acetilcolina

A ACh o neurotransmissor das junes neuromusculares, sistema nervoso

autnomo e alguns neurnios do SNC. No sistema nervoso autnomo, o transmissor

das fibras pr e ps-ganglionares parassimpticas e fibras pr-ganglionares simpticas,

controlando inmeras funes mantenedoras da homeostase como a contrao da

musculatura gstrica, ritmo cardaco e secreo de alguns hormnios. No SNC, a ACh

parece estar envolvida em processos cognitivos como ateno, memria, aprendizado e

viglia (Gold, 2003; Pepeu e Giovaninni, 2004; Sarter et al., 2005).

A biossntese da ACh ocorre no citosol do terminal dos neurnios colinrgicos

onde a colina acetilada pela enzima colina acetiltransferase (ChAT) utilizando acetil-

CoA como doador de grupo acetil (Scagnelli et al., 1991; Ribeiro et al., 2006).

Liberao eficiente de ACh a partir de terminaes nervosas depende da sua

armazenagem em vesculas sinpticas, uma etapa dependente da atividade de um

transportador vesicular de acetilcolina (VAChT). O VAChT uma glicoprotena de

vesculas sinpticas que apresenta 12 domnios transmembrana e possui homologia com

os transportadores vesiculares de monoaminas (Parsons et al., 1993; Erickson et al,

1994; Roghani et al., 1994; Reimer et al., 1998).

Aps ser liberada no terminal sinptico, a ACh interage com seus receptores e

rapidamente degradada pela acetilcolinesterase (AChE), a colina novamente recaptada

29

para o terminal pr-sinptico pelo transportador de colina de alta afinidade (CHT1). A

inativao da acetilcolina realizada pela ao da AChE. Esta enzima catalisa a

converso da molcula de acetilcolina em acetato e colina (Yamamura e Snyder, 1973;

Collier e Ilson, 1977; Rand, 2007; Ribeiro et al., 2006).

A fim de estudar o papel da acetilcolina no desenvolvimento de alteraes

neurolgicas e imunolgicas em fase tardia aps a sepse, foram utilizadas duas

estratgias: aumentar ou diminuir os nveis de ACh, utilizando respectivamente:

donepezila e animais knockdown para o VAChT (VAChT KD).

3.3.1 Donepezila

Donepezila quimicamente conhecido como cloridrato de ()-2,3-diidro-5,6-

dimetoxi-2-[[1-(fenilmetil)-4-piperidinil]metil]-1H-inden-1-ona, sua frmula molecular

C24H29NO3 HCl, e seu peso molecular 415,96. Foi a segunda medicao aprovada

nos Estados Unidos para o tratamento de Alzheimer (Rogers et al., 1996).

Seus efeitos clnicos so resultantes da inibio da AChE, o que leva ao aumento

da concentrao extracelular de acetilcolina no crtex cerebral e hipocampo (Giacobini,

1993; Francis et al., 1999; Wilkinson, 1999). um inibidor reversvel de longa durao,

conhecido para melhorar a memria e a funo cognitiva (Hansen et al., 2008). Estudos

demonstraram que o uso crnico da donepezila modula positivamente receptores

colinrgicos nicotnicos, e tem capacidade neuroprotetora (Takada-Takatori et al.,

2008).

30

Os eventos adversos mais comuns da donepezila, bem como o de outros inibidores da

colinesterase, so nuseas, vmitos, diarreia e tontura, todos os quais so os sintomas

ligados hiperestimulao colinrgica (Rogers et al., 1998a; Burns et al., 1999). Estes

efeitos so dose-relacionados e depender em grande parte das concentraes plasmticas

(Imbimbo, 2001). Quando a donepezila administrada por via oral, ela bem absorvida e

atinge a concentrao mxima no plasma em 3-4 horas (Jann et al., 2002).

A donepezila vem sido utilizada em diversos ensaios clnicos, demonstrando

melhorar a funo cognitiva em pacientes para uma ampla gama de gravidade Alzheimer,

de muito leve, moderada a grave, mostrando tambm um possvel efeito anti-inflamatrio

(Rogers et al., 1996; Rogers et al., 1998b; Seltzer et al., 2004; Reale et al., 2005; Winblad

et al., 2006; Tsuno, 2009).

Diversos estudos em animais utilizaram donepezila para hiperestimular a

transmisso colinrgica e apresentaram uma melhora na neurognese hipocampal e na

funo cognitiva em roedores, mostrando seu efeito anti-inflamatrio (Kaneko et al.,

2006; Kotani et al., 2008; Narimatsu et al., 2009; Inanaga et al., 2010; Bruel-Jungerman

et al., 2011; Itou et al., 2011; Yu et al., 2015).

3.3.2 VAChT

Em 2006, Prado e colaboradores caracterizaram um camundongo geneticamente

modificado com diminuio (knockdown) na expresso do gene que codifica a protena

VAChT. O gene da protena VAChT fica no primeiro ntron do gene da protena ChAT.

importante ressaltar, entretanto, que a queda na transcrio de mRNA (RNA

31

mensageiro) foi especfica para a VAChT, no havendo alterao na expresso nos

nveis de mRNA para a ChAT.

A anlise do crtex cerebral, estriado, medula espinhal e hipocampo revelou que

animais VAChT KD homozigoto possuem uma diminuio de 65-70% na expresso da

VAChT, em relao aos animais VAChT wild type (WT). A reduo na expresso da

VAChT teve consequncia direta sobre a quantidade de ACh liberada no sistema

nervoso central (Prado et al., 2006; Lima et al., 2010; Pinheiro et al., 2015).

Diversos estudos vm utilizando os animais VAChT KD como uma forma de

diminuir a ACh liberada na fenda e consequentemente diminuir a transmisso

colinrgica (Guidine et al., 2008; Lima et al., 2010; Capettini et al., 2011; Schmid et al.,

2011; Roy et al., 2012; Rodrigues et al.,2013; Pinheiro et al., 2015).

32

4. Materiais e Mtodos

4.1 Animais

Foram utilizados camundongos Balb/c machos e camundongos homozigotos

mutantes VAChT KD e seus WTs, com 8 semanas, pesando 20-25 g, livres de

patgenos especficos (SPF) provenientes do Biotrio Central da Faculdade de

Medicina da Universidade de So Paulo. Mutantes VAChT KD utilizados neste estudo

foram geradas por ratos heterozigotos intercruzados. Estes camundongos mostraram

uma reduo de aproximadamente 65% nos nveis de VAChT no sistema nervoso e

tambm em outros rgos (Pinheiro et al., 2015), que est correlacionado com a reduo

dos nveis de ACh (Prado et al., 2006; Lima et al., 2010).

Os camundongos foram mantidos em gaiolas, em local com temperatura e ciclo de

luz controlado, recebendo gua e comida ad libitum, e permaneceram durante o

experimento no Biotrio de Manuteno do LIM 51 Disciplina de Emergncias

clnicas, sobre responsabilidade do bilogo Antnio dos Santos Filho.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e

Uso de Animais de Laboratrio publicado pelo US National Institutes of Health. Nosso

projeto recebeu aprovao do Comit de tica em Pesquisa da Faculdade de Medicina

da Universidade de So Paulo. Protocolo de Pesquisa no 289/12.

33

4.2 Experimentos

Este estudo foi divido em trs: Experimento Agudo, Experimento Crnico e

Efeito da acetilcolina na evoluo tardia da sepse.

4.2.1 Experimento Agudo

A fim de verificar o efeito da gravidade da sepse na interao entre SNC e sistema

imunolgico os camundongos Balb/c foram submetidos ao procedimento cirrgico para

induzir a sepse em diferentes gravidades (grave, moderado e leve), 6 horas aps foi

realizado o teste comportamental SHIRPA e logo aps os animais foram sacrificados

por inalao de dixido de carbono (CO2). O sangue foi colhido por puno cardaca, e

transferidos para tubos contendo EDTA, centrifugados e o plasma foi separado, para

dosagem de S100 e de citocinas. O crebro foi removido, hipocampo foi isolado e

congelado para posterior anlise de citocinas. Os baos foram colhidos em condies

asspticas, pesados, divididos em dois pedaos, um no qual foi congelado para posterior

anlise de citocinas e o outro, pesado e mantido em gelo at o isolamento dos linfcitos.

34

4.2.2 Experimento Crnico

Para conhecer o efeito crnico, os camundongos Balb/c foram submetidos ao

procedimento cirrgico para induzir a sepse (leve). O teste comportamental SHIRPA foi

realizado 6 horas e 15 dias aps o CLP. Aps os 15 dias os camundongos foram

sacrificados por inalao de CO2. O sangue foi colhido por puno cardaca, e

transferidos para tubos contendo EDTA, centrifugados e o plasma foi separado para

dosagem de S100 e citocinas. O crebro foi removido, hipocampo foi isolado e

congelado para posterior anlise de citocinas. Os baos foram colhidos em condies

asspticas, pesados, divididos em dois pedaos, um no qual foi congelado para posterior

anlise de citocinas e o outro, pesado e mantido em gelo at o isolamento dos linfcitos.

Outros animais foram sacrificados para obteno do bao para anlise histolgica

demonstrativa.

4.2.3 Efeito da acetilcolina na evoluo tardia da sepse

Com intuito de verificar o efeito da ACh no processo inflamatrio em fase tardia

da sepse utilizamos donepezila, um inibidor da acetilcolinesterase, e animais

homozigotos mutantes VAChT KD, que possuem uma diminuio da expresso da

VAChT.

Desta forma, camundongos Balb/c receberam a droga donepezila (5 mg/kg/dia,

oralmente) sete dias antes do procedimento cirrgico (CLP leve) at o dia do sacrifcio.

35

Alm disso, camundongos homozigotos mutantes VAChT KD foram submetidos ao

CLP leve. O teste comportamental SHIRPA foi realizado 6 horas aps o CLP. Aps os

15 dias os camundongos foram sacrificados por inalao de CO2. O sangue foi colhido

por puno cardaca, e transferidos para tubos contendo EDTA, centrifugados e o

plasma foi separado para dosagem de citocinas. O crebro foi removido, hipocampo foi

isolado e congelado para posterior anlise de citocinas. Os baos foram colhidos em

condies asspticas, pesados, divididos em dois pedaos, um no qual foi congelado

para posterior anlise de citocinas e o outro, pesado e mantido em gelo at o isolamento

dos linfcitos.

4.3 Ligao e perfurao cecal

Os animais foram anestesiados com uma mistura de cetamina (80 mg/kg) e

xilasina (10 mg/kg), intraperitoneal (i.p.). CLP foi induzida como descrito previamente

(Soriano et al., 2002). Sob condies asspticas, uma laparotomia mediana de 2 cm foi

realizada para permitir a exposio do ceco. 50% do ceco foi ligado e subsequentemente

perfurado por uma nica puno com uma agulha de calibre 21 na rea menos

vascularizada (CLP leve), ou 100% do ceco foi ligado e subsequentemente perfurado

trs vezes (CLP moderado) ou cinco vezes (CLP grave), todos com uma agulha calibre

21 na rea menos vascularizada. Em seguida, o ceco foi gentilmente comprimido at a

extruso de contedo fecal a partir dos locais de perfurao. O ceco foi devolvido para a

cavidade peritoneal e a laparotomia foi fechada com fio de seda 4,0. Os camundongos

sham-operados foram submetidos a todos os procedimentos cirrgicos, mas o ceco no

36

foi nem ligado, nem perfurado. Os animais foram devolvidos para suas gaiolas com

livre acesso a gua e comida. Os animais foram monitorados trs vezes por dia, e as

taxas de sobrevida foram determinadas para 360 horas (15 dias).

4.4 SHIRPA

Os animais foram submetidos ao teste comportamental SHIRPA, que foi

concebido como uma bateria de mltiplos testes usados para estudos longitudinais com

diretrizes e materiais padronizados (Rogers et al., 1997), afim de avaliar a presena de

alteraes cerebrais. O quadro primrio de SHIRPA consiste em uma srie de

observaes, reflexos e funes bsicas sensrio-motoras que fornece um perfil

funcional e comportamental pela observao avaliativa do desempenho individual.

O protocolo de SHIRPA foi usado para avaliar mudanas comportamentais

durante o curso da sepse. Para o propsito de anlise, os parmetros individuais

avaliados pelo SHIRPA foram agrupados em cinco categorias funcionais (estado

neuropsiquitrico, comportamento motor, funo autonmica, tnus e fora muscular;

reflexo e funo sensorial) de acordo com Lackner e colaboradores (2006),

determinando uma contagem global e cinco domnios de contagem. O reflexo e domnio

sensorial envolvem o posicionamento visual, reflexo auricular, reflexo corneal, presso

no dedo da pata, e reflexo de endireitamento. O estado neuripsiquitrico envolve

atividade espontnea, excitao de transferncia, escape ao toque, passividade

posicional, medo, irritabilidade, mordida e vocalizao. O comportamento motor

envolve atividade locomotora, posio corporal, tremores, maneira de andar, elevao

37

plvica, elevao da cauda, ondulao do tronco, manobra do arame, agarramento dos

membros, e geotaxia negativa. Funo autonmica envolve ritmo respiratrio,

fechamento da plpebra, irritao cutnea, cor da pele, ritmo cardaco, lacrimejao e

salivao. Envolve tnus muscular e fora, tnus corporal, tnus dos rgos, e tnus

abdominal.

4.5 ELISA

Utilizamos o teste imunoenzimtico ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay) para a determinao quantitativa de S100 em plasma de camundongos,

SEA567Mu (Cloud-Clone Corp). O plasma foi diludo 1:2 com PBS 0,01M.

Para a determinao nveis de citocinas 100mg dos tecidos congelados, bao e

hipocampo, foram pulverizado em nitrognio lquido. As amostras foram

homogeneizadas em Triton-X100 a 150 mM de NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 1% de

NP40, oxibato de sdio a 1%, 0,1% de SDS e inibidores de enzima proteoltica

(40ug/mL de fluoreto de fenil-metil-sulfonilo 1 mM, Sigma, St , Louis, MO). Depois da

separao de debris atravs da centrifugao durante 40 minutos a 10000 rpm, os

sobrenadantes foram recolhidos e a concentrao de protena foi determinada pelo

mtodo de Bradford (BioRad, Hercules, CA). As amostras foram mantidas a -80 at

serem analisadas.

A concentrao da interleucina-6 (IL-6), interleucina-1 (IL-1), fator de necrose

tumoral (TNF-) e interleucina-10 (IL-10), do bao e hipocampo do experimento

agudo foram realizadas com kit da R&D Systems (Minneapolis, MN, USA).

38

A concentrao das IL-1, IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, MIP-1,

MIP-1 e TNF-, no bao, no hipocampo e no plasma, foi determinada pela tecnologia

MilliPlex (# MCYTOMAG-70K, Merck KGaA, Darmstadt, Germany). Os ensaios

foram realizados de acordo com as instrues do fabricante. As amostras foram

analizadas no sistema MagPix, e os dados foram coletados pelo software Luminex

xPONENT.

4.6 Histologia e Tunel

Os cortes histolgicos foram utilizados para fins demonstrativos. Utilizamos

camundongos balb/c submetidos ao CLP leve. Os animais foram sacrificados 15 dias

aps o CLP, o bao foi coletado e perfundido com formol 10%. Os baos foram ento

processados e, a partir destes, produziu-se cortes histolgicos de 5m. As lminas

contendo os cortes histolgicos foram fixadas com lcool (absoluto, 95 e 70), lavadas

com gua corrente e incubadas com hematoxilina de Harris por um minuto para

colorao de ncleos (hematoxilia-eosina HE). Aps lavagem com gua corrente, as

lamnulas foram submetidas a banho com diferenciador (HCl 1%), banho de gua

corrente, e banho de gua amoniacal (hidrxido de amnia 1%), antes de nova lavagem

com gua corrente. Em seguida, as lamnulas foram submetidas segunda desidratao

com lcool 95 e incubadas com uma soluo de eosina + floxina (composio em

mL/L: eosina 1% 111,73; floxina 1% 11,17; lcool 95 871,51; cido actico glacial

5,59) por 35 segundos. A seguir, as lamnulas sofreram novas desidrataes com lcool

(trs vezes com lcool 95e quatro com absoluto) para, finalmente, passarem por

39

lavagem com xilol (trs vezes) e montagem em lmina com resina sinttica para

fixao.

Para a avaliao das clulas em apoptose, utilizou-se o mtodo de TUNEL

(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling), conforme o protocolo

do kit: In Situ Cell Death Detection Kit, POD (Ref. 11684817910, Version 13, Roche).

As imagens dos cortes histolgicos e do ensaio de TUNEL foram adquiridas por

cmera Nikon acoplada ao microscpio ptico Leica (Q500, iW, Cambridge, UK).

4.7 Isolamento de Linfcitos

A parte do baso destinada para o isolamento de linfcitos foi pesada e colocada

entre duas lminas autoclavadas fosca que foram gentilmente pressionadas em direes

opostas para dissociar o tecido. Quando o tecido do rgo comeou a dissociar, as

lminas foram mergulhadas em 8 mL de PBS numa placa de Petri at que apenas o

tecido conjuntivo se manteve. A suspenso de clulas foi transferida assepticamente

para um tubo de centrfuga de 15 mL estril. As suspenses de clulas do bao foram

centrifugadas a 400g durante 10 min e em seguida ressuspensas em PBS. Os eritrcitos

foram removidos a partir de suspenses de clulas de bao por uma breve exposio (5-

10 min) de 1 mL de Tris NH4Cl em gelo e as clulas foram em seguida centrifugadas a

400g durante 10 min e ressuspensas em 3 mL de PBS.

40

4.8 Caracterizao dos linfcitos

Foram caracterizados cinco tipos de linfcitos: Linfcitos T citotxicos (CD3+,

CD4-, CD8+); Linfcitos T auxiliares (CD3+, CD4+, CD8-); Linfcitos B (CD3+,

CD19+); Clulas T reguladoras (CD3+, CD4+, CD25+) e Clulas Th17 (CD3+, IL17+).

Os linfcitos T auxiliares e linfcitos T citotxicos (1106 clulas por mL) foram

incubados durante 30 min a 4C com anti-CD3 (conjugado com FITC), anti-CD4

(conjugada com PE) e anti-CD8 (conjugada com PE/Cy5) anticorpos diludos em PBS

contendo 2% de soro fetal bovino inativado. Outros linfcitos foram incubadas durante

30 min a 4C com os anticorpos anti-CD3 (conjugado com FITC), anti-CD4 (conjugada

com PE), anti-CD19 (conjugado com PE/Cy7), anti-CD25 (conjugado com APC/Cy7) e

anti-IL-17A (conjugado com APC), diludos em tampo de permeabilizao. Todas as

anlises foram realizadas em um citmetro de fluxo EasyCyte 8HT (Guava, Hayward,

CA) com um mnimo de 5000 eventos. As anlises foram executadas em Software

Express Pro Guava.

4.9 Morte celular e ciclo celular

Aps a isolao de linfcitos, as clulas foram lavadas com PBS gelado e

ressuspensas em tampo de ligao a 4C. A concentrao das clulas foi ajustada para

1x106 clulas/mL. Foi adicionado a 1,5mL desta suspenso, 100L de Alexa Fluor 647-

conjugado recombinante com Anexina V (BioLegend). As clulas foram incubadas por

41

15 minutos a temperatura ambiente no escuro. Imediatamente aps o perodo de

incubao, foi adicionado 5 L de iodeto de propdeo (PI) e as clulas foram analisadas

por citometria de fluxo.

Para a anlise de fragmentao do DNA, 1x106 clulas foram ressuspensas em

0,2mL de tampo de Lise (0,1% de citrato de sdio e 0,1% Triton X-100) contendo

50mg/mL de PI. As clulas foram incubadas no escuro, a 4C por 24 horas, e usadas

para a anlise de fragmentao do DNA.

No ciclo celular, 1x106 clulas foram fixadas em 1 mL de etanol 70% por 2 horas.

Aps este perodo, foram centrifugadas, lavadas em PBS e ressuspensas em 500L de

tampo contendo 0,1% citrato de sdio, 0,1% Triton X-100, 50g/mL de PI e 0,3mg/ml

de RNase. As clulas foram incubadas por 30 minutos 37 C e posteriormente foram

analisadas por citometria de fluxo.

4.10 Anlise estatstica

Os dados so apresentados como mdia erro padro da mdia (EPM). As

anlises foram realizadas utilizando InStat Statistical Software (GraphPad, La Jolla, CA,

EUA). Para anlise da curva de sobrevida foi utilizado o teste de Log rank. Para anlise

estatstica de comparao de mdias do teste comportamental SHIRPA, no experimento

agudo e utilizando animais VAChT KD foi utilizado o teste Kruskal-Wallis com post

hoc Dunns e nos experimentos crnico e com donepezila utilizou-se Mann Whitney. As

comparaes entre os grupos experimentais, nos experimentos agudo e VAChT KD,

foram realizadas utilizando o teste ANOVA com post hoc Tukey, nos experimentos

42

crnico e com donepezila utilizou-se o teste t. Por fim, para as correlaes utilizou-se o

teste de Person. Em todos os testes foram considerados como diferena significativa os

grupos que obtiverem p

43

5. Resultados

5.1 Experimento Agudo

5.1.1 Anlise da sobrevida nas diferentes gravidades do CLP

Os resultados da curva de sobrevida das diferentes gravidades de CLP esto

apresentados na Figura 01. Uma taxa de sobrevida de 100% do grupo sham foi

observada. O grupo CLP leve apresentou uma taxa de sobrevida de 90%, o grupo CLP

moderado 40% e no grupo CLP grave apenas 20% de sobrevida, no final dos cinco dias

at o 15 dia. A taxa de sobrevida foi significativa entre os grupos CLP moderado e

CLP grave em relao ao grupo sham. Alm disso, o grupo CLP grave foi diferente do

grupo CLP leve.

Figura 01. Curva de sobrevida nas diferentes gravidades de CLP. Os animais foram observados por 15 dias, e a mortalidade foi registrada a cada 8h. Teste Log-rank, n=10, * p 0,05 quando comparado com o grupo sham e # quando comparado ao CLP leve.

44

5.1.2 Alteraes neurolgicas nas diferentes gravidades do CLP

Para avaliao das alteraes neurolgicas foram realizados o teste

comportamental SHIRPA, a anlise do biomarcador srico, S100, e a dosagem de

algumas citocinas no hipocampo.

Figura 02 ilustra o desempenho dos camundongos Balb/c 6h aps a induo da

sepse nas cinco categorias funcionais distintas: reflexo e funo sensorial (A), estado

neuropsiquitrico (B), comportamento motor (C), funo autnoma (D) e tnus e fora

muscular (E). A soma das pontuaes de todas as categorias funcionais mostrada no

'Total' (F). Houve uma diminuio no reflexo e funo sensorial, estado

neuropsiquitrico e comportamento motor entre os grupos CLP moderado e CLP grave

em relao ao grupo sham. Estes mesmos grupos tambm mostraram um aumento na

funo autnoma. No entanto, no mostramos diferenas significativas entre os grupos

de acordo com o tnus e fora muscular. Finalmente, apresentamos uma diminuio na

soma das pontuaes de todas as categorias funcionais nos grupos CLP moderado e

CLP grave em relao ao grupo sham.

45

Figura 02. Teste comportamental SHIRPA 6 horas aps o CLP em diferentes gravidades. Aps 6h do CLP foi analisado o comportamento atravs do protocolo SHIRPA. Foi divido em cinco categorias funcionais distintas: reflexo e funo sensorial (A), estado neuropsiquitrico (B), comportamento motor (C), funo autnoma (D) e tnus e fora muscular (E). A soma dos escores de todas as categorias est representada como Total (F). Os dados esto apresentados com mdia EPM, 10 animais por grupo. Kruskal-Wallis test e post hoc Dunns, *p0,05 quando comparado com sham.

A Figura 03 mostra que os nveis plasmticos de S100 foram significativamente

aumentados nos grupos CLP moderado e CLP grave em relao ao grupo sham e ao

grupo CLP leve.

46

Figura 03. Os nveis plasmticos de S100 6 horas aps o CLP. Aps 6 horas do CLP os animais foram sacrificados, o plasma foi removido e os nveis de S100 foram medidos por ELISA. Os dados so apresentados como mdia EPM, dez camundongos por grupo. ANOVA e post hoc Tukey, *p0,05 quando comparado com o grupo sham e #p0,05 quando comparado ao grupo CLP leve.

Quantificamos as citocinas: IL-6, IL-1, TNF- e IL-10 no hipocampo. Estas

citocinas fornecem um perfil inflamatrio aps a CLP nos tecidos. Porm no hipocampo

(Figura 04) no observamos nenhuma diferena estatstica em nenhuma das citocinas

quantificadas.

Figura 04. Nveis de citocinas no hipocampo 6 horas aps o CLP. Aps 6 horas do CLP os animais foram sacrificados, o crebro foi removido, o hipocampo isolado e os nveis de IL-6 (A), IL-1 (B), TNF- (C) e IL-10 (D) foram medidos por ELISA. Os dados so apresentados como mdia EPM, dez animais por grupo. ANOVA e post hoc Tukey.

47

5.1.3 Perfil das clulas no bao de diferentes gravidades do CLP

Os baos dos camundongos foram removidos 6 horas aps o CLP, os pesos foram

registrados na Figura 05 (A), no apresentando diferena significativa entre os grupos.

A Figura 05 (B) mostra a relao entre o peso do bao/ peso do corpo, que tambm no

foi observado nenhuma diferena significativa. Os baos dos camundongos foram

processados e o nmero de clulas foi quantificado por citometria de fluxo, mostrado na

Figura 05 (C), onde no podemos verificar diferena estatstica entre os grupos.

Figura 05. Peso do bao 6 horas aps o CLP. Aps 6 horas do CLP os animais foram sacrificados, o bao foi coletado, pesado e por citometria de fluxo o nmero de clulas foi quantificado. (A) peso do bao (B) relao do peso do bao/peso do corpo (C) nmero de clulas no bao. Os dados so apresentados como mdia EPM, dez animais por grupo. ANOVA e post hoc Tukey.

Os linfcitos foram diferenciados e as contagens no bao dos animais esto

apresentadas na Figura 06: linfcito T citotxico (A); linfcitos T auxiliares (B);

linfcitos B (C); clulas T reguladoras (D) e clulas Th17 (E). No houve diferena

significativa em qualquer grupo em qualquer tipo de linfcito.

Na Figura 07, observamos que a correlao entre os linfcitos com o biomarcador

de encefalopatia sptica o S100 foi uma correlao significativa e positiva em linfcito

T citotxico e linfcito T auxiliar.

48

Figura 06. Caracterizao de linfcitos no bao 6 horas aps o CLP. Aps 6 horas do CLP os animais foram sacrificados, o bao foi removido e caracterizado cinco tipos de linfcitos por citometria de fluxo: linfcito T citotxico (A); linfcitos T auxiliares (B); linfcitos B (C); clulas T reguladoras (D) e clulas Th17 (E). Os dados so apresentados como mdia EPM, dez animais por grupo. ANOVA e post hoc Tukey.

49

Figura 07. Correlao entre os linfcitos e o S100 6 horas aps o CLP. Linfcito T citotxico (A); linfcitos T auxiliares (B); linfcitos B (C); clulas T reguladoras (D), clulas Th17 (E). Pearson, *p0,05.

Podemos observar nas citocinas quantificadas no bao (Figura 08) um aumento

significativo na quantidade de IL-6 aps a sepse no grupo CLP grave em relao ao

grupo sham e CLP leve. O nvel de IL-1 aumentou significativamente no grupo CLP

moderado e CLP grave quando comparados ao grupo sham e CLP leve. Os nveis de

TNF- no diferenciaram. No entanto, o nvel de IL-10, foi aumentado

50

significativamente no CLP moderado em relao ao sham e no CLP grave em

comparao com sham e CLP leve.

Figura 08. Nveis de citocinas no bao 6 horas aps o CLP. Aps 6 horas do CLP os animais foram sacrificados, o bao foi removido e os nveis de IL-6 (A), IL-1 (B), TNF- (C) e IL-10 (D) foram medidos por ELISA. Os dados so apresentados como mdia EPM, dez animais por grupo. ANOVA e post hoc Tukey, *p 0,05 quando comparado com o grupo sham e #p 0,05 quando comparado com o grupo CLP leve.

5.1.4 Perfil inflamatrio nas diferentes gravidades do CLP

O perfil inflamatrio nas diferentes gravidades do CLP foi observado atravs da

quantificao de algumas citocinas no plasma (Figura 09). Relatamos um aumento no

grupo CLP grave em relao ao sham, CLP leve e moderado em IL-1, IL-6, IL-10, IL-

12p40, MIP-1 e TNF-. Um aumento no grupo CLP grave em relao ao sham e CLP

leve foi observado em IL-4 e MIP-1. O grupo CLP moderado foi aumentado em

relao ao sham e CLP leve em IL-6 e em relao apenas ao sham em MIP-1 e MIP-

1.

51

Figura 09. Nveis de citocinas no plasma 6 horas aps o CLP. Aps 6 horas do CLP os animais foram sacrificados, o plasma isolado e os nveis de IL-1 (A), IL-1 (B), IL-4 (C), IL-6 (D), IL-10 (E), IL-12p40 (F), IL-12p70 (G), MIP-1 (H), MIP-1 (I) e TNF- (J), foram dosados por tecnologia MilliPlex. Os dados so apresentados como mdia EPM, cinco animais por grupo. ANOVA e post hoc Tukey, *p0,05 quando comparado com o grupo sham, #p0,05 quando comparado com o grupo CLP leve e p0,05 quando comparado com o grupo CLP moderado.

5.2 Experimento Crnico

5.2.1 Alteraes neurolgicas em sobreviventes do CLP

Em relao ao teste comportamental SHIRPA, seis horas aps a induo da sepse,

observamos na Figura 10 uma diminuio entre os grupos CLP leve em relao ao

grupo sham no reflexo e funo sensorial, estado neuropsiquitrico, comportamento

52

motor e o score total. Um aumento na funo autnoma, tambm foi observado. No

entanto, a categoria tnus e fora muscular no houve diferena estatstica.

A Figura 11 ilustra o teste comportamental SHIRPA 15 dias aps a induo da

sepse. Observamos que houve apenas uma diminuio significativa no reflexo e funo

sensorial no grupo CLP leve em relao ao grupo sham.

Figura 10. Teste comportamental SHIRPA 6 horas aps o CLP. Aps 6h do CLP foi analisado o comportamento atravs do protocolo SHIRPA. Foi divido em cinco categorias funcionais distintas: reflexo e funo sensorial (A), estado neuropsiquitrico (B), comportamento motor (C), funo autnoma (D) e tnus e fora muscular (E). A soma dos escores de todas as categorias est representada como Total (F). Os dados esto apresentados com mdia EPM, 10 animais por grupo. Mann Whitney, *p0,05.

53

Figura 11. Teste comportamental SHIRPA 15 dias aps o CLP. Aps 15 dias do CLP foi analisado o comportamento atravs do protocolo SHIRPA. Foi divido em cinco categorias funcionais distintas: reflexo e funo sensorial (A), estado neuropsiquitrico (B), comportamento motor (C), funo autnoma (D) e tnus e fora muscular (E). A soma dos escores de todas as categorias est representada como Total (F). Os dados esto apresentados com mdia EPM, 10 animais por grupo. Mann Whitney, *p0,05.

Os nveis plasmticos de S100 15 dias aps o CLP podem ser observados na

Figura 12. Mostramos que o grupo CLP encontra-se aumentado quando comparado com

o sham.

54

Figura 12. Os nveis plasmticos de S100 15 dias aps o CLP. Aps 15 dias do CLP os animais foram sacrificados, o plasma foi removido e os nveis de S100 foram medidos por ELISA. Os dados so apresentados como mdia EPM, dez camundongos por grupo. Teste t, *p 0,05.

Ns quantificamos as citocinas IL-1, IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-

12p70, MIP-1, MIP-1 e TNF- no hipocampo (Tabela 01) e observamos que o grupo

CLP foi significativamente aumentado somente em IL-6 quando comparado com o

grupo sham.

Tabela 01. Citocinas no hipocampo 15 dias aps CLP.

Nota: Os dados so apresentados com mdia EPM, cinco animais por grupo. Teste t, *p0,05.

55

5.2.2 Perfil das clulas do bao em sobreviventes do CLP

Ns observamos um aumento do peso do bao dos camundongos CLP leve 15

dias aps o CLP (Figura 13 A). A relao entre o peso do bao/ peso do corpo tambm

foi aumentada significativamente (Figura 13B) assim como o nmero de clulas que foi

quantificada por citometria de fluxo (Figura 13C). A Figura 13D ilustra o tamanho do

bao obtido.

Figura 13. Peso do bao 15 dias aps o CLP. Aps 15 dias do CLP os animais foram sacrificados, o bao foi coletado, pesado e por citometria de fluxo o nmero de clulas foi quantificado. (A) peso do bao, (B) relao do peso do bao/peso do corpo, (C) nmero de clulas no bao e (D) imagem do bao. Os dados so apresentados como mdia EPM, dez animais por grupo. Teste t, *p 0,05.

Na Figura 14 est representado o corte histolgico do bao dos camundongos 15

dias aps a induo da sepse por CLP. Observamos na imagem (A) um bao de um

camundongo CLP com a polpa branca bastante aumentada, muitos linfcitos presentes,

quando comparado com o bao do camundongo sham (B). Na imagem (C) mostramos a

56

presena de megacaricitos no bao do CLP, diferentemente do sham, imagem (D). Nas

imagens (E) CLP e (F) sham, observamos a marcao por Tunel, mostrando que a

apoptose esta mais evidente nos animais CLP.

Figura 14. Corte histolgico do bao, 15 dias aps o CLP. Corte histolgico corado ao HE: (A) CLP aumento 200x, (B) sham aumento 200x, (C) CLP aumento 400x, (D) sham aumento 400x. Marcao de apoptose ao mtodo de TUNEL: (E) CLP aumento 400x, (F) sham aumento 400x. As numeraes representam: 1- Polpa branca; 2- Polpa vermelha; 3- Megacaricitos; 4- clulas em apoptose.

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A caracterizao dos linfcitos no bao de camundongos 15 dias aps o CLP est

apresentada na Figura 15. Observamos um aumento significativo em linfcito T

citotxico, linfcitos T auxiliares, linfcitos B e clulas T reguladoras nos grupos CLP

leve comparados ao sham. No houve diferena significativa em clulas Th17.

A correlao dos linfcitos com o biomarcador de encefalopatia sptica, o S100,

pode ser observado na Figura 16. Mostramos uma correlao significativa e positiva em

linfcito t citotxico e linfcito T auxiliar. Uma correlao significativa e negativa em

Th17 tambm pode ser observada.

Figura 15. Caracterizao de linfcitos no bao 15 dias aps o CLP. Aps 15 dias do CLP os animais foram sacrificados, o bao foi removido e caracterizado cinco tipos de linfcitos por citometria de fluxo: linfcito T citotxico (A); linfcitos T auxiliares (B); linfcitos B (C); clulas T reguladoras